WO2006098326A1 - 生体材料用複合体およびその製造方法 - Google Patents

生体材料用複合体およびその製造方法 Download PDF

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WO2006098326A1
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Masanobu Kamitakahara
Masao Tanihara
Chikara Ohtsuki
Shinichi Ogata
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National University Corporation NARA Institute of Science and Technology
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    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic

Definitions

  • the present invention relates to a composite for biomaterial containing chemically synthesized collagen and a calcium phosphate compound, and a method for producing the same.
  • a composite for biomaterial has a composition similar to that of a living body, is a molded body of a hard tissue material that is compatible with the living body, and is used as an artificial bone or the like.
  • Patent Document 1 A technique for obtaining a compact with physical properties approximating that of a living bone (composite of apatite, which is an inorganic substance, and collagen, which is an organic substance) by drying and pressing is proposed (Patent Document 1). reference). Furthermore, since the molded body obtained by this technique was a composite having a Young's modulus comparable to that of soft living bone, this was improved to obtain a composite having a Young's modulus similar to that of hard living bone.
  • Neo et al. M. Neo et al
  • bioactive ceramics meaning an inorganic substance that can directly bond to bone
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 7-101708
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 11-199209
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-276207
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-321500
  • Non-Patent Document 1 "L” Hench and J. Wilson, “An Introduction to Bioceramics", Singapore, World “Scienne” TIFFIC 'publishing Co. Pte. Ltd., 1993, p. 1-24
  • Non-Patent Literature 2 L'Hench, R'S plinter, W'WC Allen and T.K'Greenleaf. K. Greenlee ), “Journa 1 of Biomedical Materials Research” ⁇ 1971, 2nd, p. 117—141, titled “Bonding mechanism 'At' the interface” ⁇ Ob ⁇ Ceramics ⁇ Prosthetics ⁇ Mate Rino 'Nores (Bonding mechanism at the interface or ceramics prosthetic materials)'
  • Non-patent literature 3 M.
  • Non-Patent Literature 4 M. Neo, T. Nakamura, C. Ohtsuki, T ⁇ Kokubo, and Tyamamoto ( ⁇ Yamamoto), “Journal of Biomedical Materials Research”, 1993, Vol. 27, p. 999—1006
  • the collagens used in these documents are all collected from animals such as swine pigs.
  • artificial bones synthesized from these collagens are used in humans, etc.
  • Pathogen infection and undesirable side effects may occur (for example, see Masao Tanihara, “Chemical synthesis of collagen using amino acids”, FRAGRANCE JOURNAL, July 2004 issue).
  • chemically synthesized collagen in place of natural collagen collected from animals.
  • Artificial bones made of a complex comprising such chemically synthesized collagen and a calcium phosphate compound.
  • it has physical properties similar to those of living organisms and has excellent properties as biomaterials such as bone replacement, tissue reconstruction ability, and strength. It is necessary to consider whether there is no problem of becoming brittle and collapsing, and whether it will be recognized as a foreign substance in the living body and cause any inconvenience.
  • the present invention provides a composite for biomaterials that is free from pathogen infection and undesirable side effects.
  • syntheticly synthesized collagen with a sequence that does not exist in nature, and creating a complex containing this and a calcium phosphate compound, the thermal stability, degradation rate, and / Or cell adhesion A complex is obtained.
  • the composite of the present invention is particularly suitable for artificial bones because of its high biocompatibility, durability, and mechanical strength.
  • a composite having excellent mechanical properties can be produced by a simple method.
  • FIG. 1 A photograph of the film taken with a digital microscope after immersion.
  • FIG. 2 Scanning electron microscope (SEM) photograph of the film after immersion.
  • FIG. 3 is a diagram showing a thin film X-ray diffraction pattern of a film before and after immersion.
  • FIG. 4 is a diagram showing elemental analysis results of an energy dispersive X-ray (EDX) spectrometer before and after immersion.
  • EDX energy dispersive X-ray
  • FIG. 7 SEM photograph of the surface of the porous material after immersion.
  • n is an integer from:! to 18
  • p and q are independently 0 or 1
  • a is an integer from:! to 10000
  • b and c are each independently an integer from:! to 10000
  • Y is independently Pro, Hyp or formula
  • R ′ is hydrogen or C canorequinole
  • X is a divalent group.
  • n an integer of 1 to 20
  • Z represents an amino acid residue or peptide chain composed of 1 to 10 amino acids
  • r represents an integer from 1 to 20,
  • R represents a linear or branched alkylene group having 2 to 12 carbon atoms
  • a biomaterial complex comprising a polypeptide (random polymer) containing a unit represented by the formula (II) and a calcium phosphate compound.
  • a is an integer from 1 to 10000, for example.
  • b is', 0-: 10000.
  • c is, for example, '0-10000.
  • the complex of the present invention is preferably one or more selected from Z selected from Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, His, Ala, Val, Leu, Arg, Pro, Tyr and lie. It is an amino acid residue or peptide chain composed of the above amino acids.
  • Z is Gly, Sar, Ser, Glu, Asp, Lys, Arg-Gly-Asp, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lie-Lys-Val-Ala-Val , Val—Pro—Gly—Val—Gly, Asp—Gly—Glu—Ala, Gly—lie—Ala—Gly, His—Ala—Val, It is an amino acid residue or peptide chain selected from Glu-Arg-Leu-Glu, Lys-Asp-Pro-Lys-Arg-Leu and Arg-3 ⁇ 4er-Arg-Lys.
  • Particularly preferred composites of the present invention are those in which the Y force is independently Hyp or formula
  • R ' is hydrogen or C canolequil
  • X is a divalent group.
  • a highly preferred complex of the present invention has the formula ( ⁇ )
  • s is an integer greater than or equal to 10,
  • Y is independently Hyp or formula
  • R ' is hydrogen or C canolequil
  • X is a divalent group.
  • s is, for example, 10 200000.
  • R ' is hydrogen or C canolequil
  • X is a divalent group.
  • the divalent group is-
  • Y in two different peptide units may be integrated to form a siloxane bond.
  • the present invention provides formulas (i) to (m)
  • n is an integer from:! to 18
  • p and q are independently 0 or 1
  • a is an integer from:! to 10000
  • b and c are each independently an integer from:! to 10000 Y is an expression
  • R ' is hydrogen or C canolequil
  • X is a divalent group.
  • n an integer of 1 to 20
  • Z represents a peptide chain consisting of 1 to 10 amino acid residues
  • r represents an integer from 1 to 20,
  • R represents a linear or branched alkylene group having 2 to 12 carbon atoms
  • a polypeptide comprising a unit represented by:
  • a positive cotton effect is observed at 220 to 230 nm, and a negative cotton effect is observed at 195 to 205 nm. It is confirmed that That is, this means that the three polypeptides of interest form collagen-like fibers in whole or in part.
  • the polypeptide can form a siloxane bond (one Si-O-Si-) by forming Y in two different peptide units. Polypeptides cross-linked by siloxane bonds are also thought to form triple helix structures.
  • the “calcium phosphate compound” means a compound containing Ca and PO.
  • the calcium phosphate compound is preferably hydroxyapatite, that is, Ca (PO 4) (OH), but the calcium phosphate compound is a lattice.
  • the lattice defect means that a part of Ca, PO and / or OH is lost.
  • Examples of chemical species that can be obtained include Cl, HCO, and CO.
  • the present invention provides formulas (i) to (m)
  • n is an integer from:! to 18
  • p and q are independently 0 or 1
  • a is an integer from:! to 10000
  • b and c are each independently an integer from! to 10000
  • Y is each independently a Pro, Hyp or formula
  • R ′ is hydrogen or C canorequinole
  • X is a divalent group.
  • n represents an integer of 1 to 20
  • Z represents a peptide chain consisting of 1 to 10 amino acid residues
  • r represents an integer from 1 to 20,
  • R represents a linear or branched alkylene group having 2 to 12 carbon atoms
  • the method for producing the complex of the present invention is characterized in that the composite for biomaterial of the present invention is obtained by precipitating a calcium phosphate compound on the surface of a polypeptide by immersing in a concentrated simulated body fluid. provide.
  • simulated body fluid means a solution containing ions with the following molar concentrations (Table 1). The concentration of ions in the simulated body fluid is about the same as the concentration of these ions in human plasma. However, human plasma has a chloride ion (CD concentration of 103. OmM and a bicarbonate ion (HCO-) concentration of 27. OmM.
  • the concentration of each ion is 1.:! To 5.0 times, for example 1. It is also possible to use a solution that is five times higher (concentrated simulated body fluid). In this specification, a solution in which the concentration of each ion in the simulated body fluid is increased 1.5 times is referred to as “1.5SBF”.
  • the temperature is not particularly limited as long as the synthetic collagen is not denatured, but is preferably 10 to 80 ° C, more preferably 20 to 40 ° C.
  • the ability of the chemically synthesized polypeptide used in the present invention to form a triple helix structure It is confirmed by measurement of a circular dichroism spectrum that this structure is stable at 10 to 80 ° C.
  • the temperature when immersed in SBF or the like is also not particularly limited, but is preferably 10 to 80 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The longer the time of immersion in SBF or the like, and the higher the concentration of the concentrated simulated body fluid, the greater the amount of precipitated calcium phosphate compound. In addition, the amount of calcium phosphate compound that precipitates after being immersed in SBF for a long time and replaced with new SBF increases. If desired, the composite obtained as described above can be made into a porous material by freeze-drying or the like.
  • any one of solutions 1 to 3 having the following composition can be used instead of the simulated body fluid or the concentrated simulated body fluid (Table 2).
  • the pH of the simulated body fluid or the concentrated simulated body fluid, or the solution used instead thereof is in the range of pH 5 to 9, preferably in the range of ⁇ 7 ⁇ 2 to 7.5.
  • n is an integer from:! to 18
  • p and q are independently 0 or 1
  • Y is independently Pro, Hyp or formula
  • R ′ is hydrogen or C canorequinole
  • X is a divalent group.
  • n an integer of 1 to 20
  • Z represents a peptide chain consisting of 1 to 10 amino acid residues
  • r represents an integer from 1 to 20
  • R represents a linear or branched alkylene group
  • polypeptide containing the peptide unit represented by these is meant. Details of chemically synthesized collagen in which Y is Pro or Hyp are described in JP-A-2003-321500. Briefly described, the “chemically synthesized collagen” described herein is
  • n is an integer from:! to 18
  • p and q are independently 0 or 1
  • Y each independently represents Pro or Hyp
  • n an integer of 1 to 20
  • Z represents a peptide chain consisting of 1 to 10 amino acid residues
  • r represents an integer from 1 to 20,
  • R represents a linear or branched alkylene group
  • an organic solvent containing isocyanatopropyltriethoxysilane or glycidoxypropyltrimethoxysilane preferably an organic solvent that does not react with silane coupling agent or chemically synthesized collagen, such as toluene, THF, etc.
  • C alkyl is a straight chain having 1 to 6 carbon atoms or
  • Branched chains such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropylinole, n-butyl, tert-butyl, n_pentyl and n_hexyl.
  • the Si content is various factors such as, but not limited to, the amount of complexation with a calcium phosphate compound, the degradation rate of the complex in vivo, the use and shape of the biomaterial. Depending on the reaction rate to artificial collagen, etc., it may vary in the range of 0-100%, preferably 5-80%, more preferably 10-50% with respect to the OH group of artificial collagen .
  • the composite for biomaterial of the present invention is particularly excellent in biocompatibility or biocompatibility, for example, an artificial bone, an artificial tooth root, a bone repair agent, a bone filler, a jaw bone reconstruction base material and It can be used as a living implant material such as an artificial joint immobilization material.
  • the complex of the present invention can be used in the form of granules or in the form of Balta.
  • the range of the particle size is preferably about 0.1 to about 10 mm.
  • a balta having a size substantially the same as the size of the application portion is suitable.
  • the weight ratio of polypeptide: calcium phosphate compound is 1: 9 to 9: 1, preferably 2: 8 to 8: 2.
  • Some biomaterial composites are preferred. Since living bone is made of about 30 wt% collagen and about 70 wt% apatite, the weight ratio of polypeptide: calcium phosphate compound is not good when manufacturing artificial bones with similar mechanical strength to living bone. A biomaterial composite that is approximately 3: 7 is preferred.
  • the weight percent of the calcium phosphate compound is about 1 to 90% by weight, preferably about 10 to 90% by weight, more preferably A biomaterial composite of 25-75% by weight is desirable.
  • the complex of the present invention After the complex of the present invention is embedded in a living body, new bone grows on the surface of the complex and becomes ossified. Since the composite of the present invention has a calcium phosphate compound layer and is not recognized as a foreign material in the bone, it is advantageous as a biomaterial such as an artificial bone as soon as it adheres to the bone.
  • the complex of the present invention may contain, for example, one or more physiologically or pharmacologically acceptable active ingredients, carriers and / or additives.
  • active ingredient include, but are not limited to, bactericides or disinfectants, anti-inflammatory agents, anti-inflammatory agents, analgesics, antipruritic agents, anti-ulcer agents, antiallergic agents, antiviral agents, antifungal agents, Antibiotics, emollients, pressure ulcers / skin treatments, vitamins, and herbal medicines are included.
  • hemostatic components such as fibrin for hemostasis by a blood coagulation factor
  • an acid component for example, acetic acid, citrate, tartaric acid, malic acid, etc.
  • base Components inorganic bases such as ammonia, sodium, potassium, magnesium and calcium, and organic bases such as triethylamine, ethanolamine and triethanolamine
  • organic bases such as triethylamine, ethanolamine and triethanolamine
  • the biomaterial or the medical material may be a composite material of the polypeptide (or a composition containing the polypeptide) and an organic or inorganic base material.
  • the substrate usually has biocompatibility and biocompatibility.
  • Examples of the inorganic substrate include metal oxides such as silica, zirconium, and titania, calcium phosphates such as hydroxyapatite, metals such as anoleminium, stainless steel, titanium, and a titanium alloy, and ceramics.
  • Examples of the organic substrate include polysaccharides or derivatives thereof (polysaccharides such as alginate, chitin, chitosan, hyanorenoic acid, polygalactosamine, curdlan, punoreran, xanthan, dextran, cellulose, methylcellulose, Cylcellulose, carboxymethyloselenolose or salts thereof, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorerose, senorelose etheroles such as hydroxypropinoremethinoresenellose, cellulose esters such as senorelose acetate, etc.), protein (Gelatin, casein, albumin, etc.), polypeptide (polylysine, polyglutamine, polyglutamic acid, etc.), vinyl alcohol resin (polybulal alcohol resin, ethylene vinyl alcohol) Copolymer), polyvinyl pyrrolidone resin, acrylic resin (poly (meth) acrylic acid, (meth) acrylic
  • the substrate may be non-biodegradable or bioerodible, but when used as a biomaterial, it is advantageous to have a biodegradability in the living body.
  • a biodegradable substrate can be composed of a biodegradable resin.
  • biodegradable resins include various resins, for example, the above-mentioned polysaccharides or derivatives thereof, polyesters (hydroxycarboxylic acids such as glycolic acid, lactic acid, 3-hydroxybutyric acid, 4-hydroxybutyric acid, and 3-hydroxypropionic acid). Homopolymer or copolymer of lactic acid-glycolic acid copolyester, etc. And rubonic acid, propionic acid, rataton, etc. (copolyester etc. with butaguchi ratataton, force prolatathone, etc.).
  • These base material materials can be used alone or in combination of two or more kinds, and may be a composite base material using two or more kinds of materials.
  • the biomaterial of the present invention can be prepared by applying the polypeptide to at least the surface of such a substrate.
  • the polypeptide can be applied to the entire body of a substrate in a granular or one-dimensional shape that can be applied to a part of a base material that is applied to a living body (a part that comes into contact with body fluid or blood as well as a body tissue).
  • a three-dimensional shape base material that can be applied to at least one surface can be applied to the living body (full surface, inner surface, outer surface, etc.). That's fine.
  • the solution or suspension of the polypeptide is applied to or spread on or impregnated on the surface of the substrate, and then dried to obtain a biomaterial whose surface is coated with the polypeptide.
  • a biomaterial holding the polypeptide may be prepared by impregnating a porous substrate with a polypeptide solution or suspension.
  • the polypeptide supported on the substrate can be converted into a cross-linking agent (particularly, darioxal, dartalaldehyde, succinaldehyde, malealdehyde, if necessary). May be crosslinked with physiologically acceptable crosslinking agents such as dialdehydes such as dextran dialdehyde and aldehyde starch.
  • physiologically acceptable crosslinking agents such as dialdehydes such as dextran dialdehyde and aldehyde starch.
  • the ratio of the crosslinking agent may be 1 to 20 parts by weight, preferably 1 to about 10 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the polypeptide as described above.
  • the amount of the polypeptide applied to the base material varies greatly depending on the form of the biomaterial and cannot be specified unconditionally. However, it is generally about 0.:! To 500 parts by weight (for example, 1 part to 100 parts by weight of the base material). ⁇ 300 parts by weight), preferably about 5 to 200 parts by weight (for example, 10 to 100 parts by weight).
  • the composite of the present invention may be used as it is for the intended purpose, but in particular, when used for medical purposes, it is preferably used after being sterilized or sterilized.
  • sterilization or sterilization methods include wet heat steam sterilization method, gamma ray sterilization method, ethylene oxide gas sterilization method, chemical sterilization method and ultraviolet sterilization method. Numa wire sterilization method and ethylene oxide gas sterilization method are preferred because they have high sterilization efficiency and little effect on the complex.
  • the composite of the present invention is suitable as an artificial bone material.
  • a composite having a porosity of 0 to 50% is suitable as a material for filling a dense and high-strength bone defect.
  • a composite with a porosity of 50 to 99% is suitable as a material for supplementing light bone force and bone.
  • These composites are used in any shape such as prismatic shape, cylindrical shape, block shape.
  • a through-hole may be formed to join this artificial bone and human bone with a bolt and nut.
  • these materials can be impregnated with a promoter (for example, bone morphogenetic protein, bone morphogenetic peptide, etc.) in order to promote cell entry.
  • a promoter for example, bone morphogenetic protein, bone morphogenetic peptide, etc.
  • the composite of the present invention provides a biomaterial that is extremely excellent in operability, such as an artificial bone.
  • the complex of the present invention is slightly hardened as compared with the collagen before the phosphate-based ruthenium compound is precipitated on the collagen surface, but the easy deformability of the collagen is sufficiently maintained. For example, when the composite was sandwiched with tweezers, the composite did not collapse, and it deformed without collapsing when force was applied. Further, when a forceful composite was deformed by applying force, the precipitated calcium phosphate compound did not peel off.
  • the biomaterial containing the composite of the present invention when used as, for example, an artificial bone, it can be freely deformed according to the shape of the bone defect portion. Furthermore, the resulting material can be easily cut using scissors or the like, and thus can be easily molded, for example, during surgery. This is a technical problem that it is not easy to form the material or deform it according to the shape of the defect site at the time of surgery when the artificial bone including the dense ceramic body is very hard. It is a remarkable effect that can solve the problem.
  • Trp L Tribtophan residue
  • amino acid sequence of the peptide chain is described according to a conventional method, with the N-terminal amino acid residue positioned on the left side and the C-terminal amino acid residue positioned on the right side.
  • H- (Pro-Hyp-Gly) 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-ethyl 3- (3-dimethylamino Using propyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC′HCl), a polypeptide was synthesized in the same manner as in Example 1 of JP-A-2003-321500. Specifically, H- (Pro-Hyp-Gly)
  • Example 1 150 / i L of the polypeptide aqueous solution obtained in Example 1 was placed on a polystyrene petri dish and air-dried at room temperature for 24 hours to prepare a chemically synthesized collagen film (hereinafter referred to as “film before immersion”). Called).
  • film before immersion a chemically synthesized collagen film
  • CaCl calcium chloride
  • film after immersion A photograph of the film after immersion with a digital microscope VHX-100 (manufactured by Keyence Corporation, using a VH-Z450 high magnification zoom lens) is shown in FIG. In addition, a photograph of the film after immersion taken with a scanning electron microscope (SEM) (S-3500N, manufactured by Hitachi, Ltd.) is shown in FIG.
  • SEM scanning electron microscope
  • pre-immersion porous body The pre-immersion film of Example 2 was freeze-dried, immersed in ImL of 10vol% isocyanatopropyltriethoxysilane (IPTS) in THF, and held at 36.5 ° C for 24 hours. . After washing with THF, it was air-dried for 24 hours to obtain a porous body (hereinafter referred to as “pre-immersion porous body”).
  • Figures 5 and 6 show the SEM photograph and EDX spectrum of the surface of the porous body before immersion, respectively.
  • 0. ImolZL of calcium chloride (CaCl 3) water was added to the porous body before immersion.

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Abstract

　本発明は、病原体感染や好ましくない副作用（たとえば拒絶反応）が起きるおそれの無い生体材料用複合体を提供することを目的とする。本発明は、式（Ｉ）～（III） [-(OC-(CH2)m-CO)p-(Pro-Y-Gly)n-]a (I); [-(OC-(CH2)m-CO)q-(Z)r-]b (II); [-NH-R-NH-]c (III) 〔式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｙ、ｎ、Ｚ、ｒ、Ｒ、ａ、ｂおよびｃは本明細書において定義したとおりである。〕で表されるペプチドユニットを含むポリペプチドおよびリン酸カルシウム系化合物を含んでなる生体材料用複合体を提供する。また、本発明の複合体は生体適合性が高く、かつ耐久性および機械的強度が高いので、特に人工骨に適している。さらに、本発明の複合体の製造方法によれば、機械的特性に優れた複合体を簡便な方法によって製造することができる。

Description

明 細 書
生体材料用複合体およびその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、化学合成コラーゲンとリン酸カルシウム系化合物を含む生体材料用複 合体、およびその製造方法に関する。このような生体材料用複合体は生体と類似し た組成を有し、生体と融和する硬組織材料の成形体であり、人工骨等として用いられ る。
背景技術
[0002] 従来の無機素材からなる生体内に植入する生体材料は、骨と直接結合することは 可能である力 もろく、弾性率が骨と比べて高すぎるという欠点があった（たとえば非 特許文献:!〜 4参照)。また、有機材料のみを用いた場合は、骨と直接結合せず、さ らに強度が弱レ、うえに周辺組織との癒着が起こり、組織誘導再生法において骨組織 などの生体組織の再建が遅れることになつていた。これを解決するものとして、たとえ ば、特開平 7— 101708号公報には、コラーゲン溶液にリン酸を加えた混合溶液を、 水酸化カルシウムの懸濁液中へ徐々に加え、生じた沈澱を濾過、乾燥して加圧成形 することによって、生物の骨に近似した物性の成形体 (無機物であるアパタイトと有機 物であるコラーゲンの複合体)を得る技術が提案されてレ、る（特許文献 1参照）。さら に、この技術で得られる成形体は、軟らかい生体骨と同程度のヤング率を有する複 合体であったため、これを改良して、硬い生体骨と同程度のヤング率を有する複合 体を得る技術として、特開平 11— 199209号公報に、コラーゲンを含有するリン酸水 溶液とカルシウム塩を含有する水溶液とを、反応容器内に同時滴下し、生じた沈澱 物を加圧成形することによって、コラーゲンとリン酸カルシウムとの複合体を得る技術 が提案されてレ、る（特許文献 2参照)。
[0003] これらのコラーゲン/リン酸カルシウム複合体は、生物の骨に近似した物性を有し、 骨置換、組織再建能、強度等の生体材料としての特性に優れる一方で、生体内に植 入した場合に、経時的に脆くなり、崩壊してしまうという問題があった。これを解決する ため、特開 2001— 276207では、コラーゲン/リン酸カルシウム複合体を得る際、加 圧成形時または加圧成形後のいずれかの工程において架橋剤を作用させて、得ら れる複合体を架橋させることによって、充分な強度を保持させつつ、生体内に植入し た場合の耐崩壊性を向上させている（特許文献 3参照)。
一方、ネオら（M. Neo et al)は、生体活性セラミックス (骨と直接結合可能な無機物 を意味する。）と骨の間の反応を研究および報告している。これによると、結晶化ガラ ス A—Wをラットの脛骨に 2週間坦入した場合、当該ガラスと体液の反応によりガラス 表面にヒドロキシアパタイト層が形成され、骨（細胞）は当該ガラス一ヒドロキシァパタ イト複合体を異物と認識しなレ、ことが報告されてレ、る（非特許文献 4参照）。
特許文献 1：特開平 7— 101708号公報
特許文献 2：特開平 11 - 199209号公報
特許文献 3：特開 2001— 276207号公報
特許文献 4 :特開 2003— 321500号公報
非特許文献 1 :エル 'エル'ヘンチ（し L. Hench)およびジエイ'ウィルソン（J. Wilson) 著、「アン'イントロダクション'トウ'バイオセラミクス (An Introduction to Bioceramics)」 、シンガポール国、ワールド 'サイエンティフィック 'パブリツシング（World Scientific Pu blishing Co. Pte. Ltd.) , 1993年、 p. 1— 24
非特許文献 2 :エル 'エル'ヘンチ（し L. Hench)、アール 'ジエイ'スプリンター（R. J. S plinter)、ダブリュー'シー 'アレン (W. C. Allen)およびティ一'ケ一'グリーンリーフ. K. Greenlee)著、「ジャーナル'ォブ'バイオメディカル'マテリアルス'リサーチ（Journa 1 of Biomedical Materials Research)ヽ 1971年、第 2卷、 p. 117— 141、タイトル「ボン デイング ·メカニズム 'アト 'ジ 'インターフェイス ·ォブ ·セラミクス ·プロステテイツク ·マテ リノ'ノレス (Bonding mechanism at the interface or ceramics prosthetic materials)」 非特許文献 3 :ェム'ャルコ（M. Jarcho)、ジヱイ 'エル'ケィ（J. L. Kay)、アール'エイ チ 'グーマー（R. H. Gumaer)およびェイチ'ピー'ドロベック（H. P. Drobeck)著、「ジ ヤーナル'ォブ'バイオェナジエティタス（Journal of Bioenergetics)」、 1977年、第 1卷 、 p. 79 - 92,タイトル「ティシュー、セルラ^ ~ ·アンド'サブセルラー 'ィベンツ ·アト 'ボ ーン一セラミック 'ハイドロキシァノ タイト'インターフェイス (Tissue, cellular and subcel lular events at bone-ceramic hydroxyapatite interface)」 非特許文献 4 :ェム'ネオ（M. Neo)、ティ一'ナカムラ（T. Nakamura)、シ一'ォォツキ（ C. Ohtsuki)、ティ^ ~ ·コクボ（Τ· Kokubo)およびティー'ャマモト（Τ· Yamamoto)著、「 ジャーナル'ォブ'バイオメディカル'マテリアルス'リサーチ（Journal of Biomedical Ma terials Research)」、 1993年、第 27卷、 p. 999— 1006
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力 ながら、これらの文献で用いられてきたコラーゲンはいずれもゥシゃブタなど の動物から採取されたものであり、これらのコラーゲンから合成された人工骨をヒト等 に用いた場合、病原体感染や好ましくない副作用（たとえば拒絶反応）が起きるおそ れがある（たとえば、谷原正夫著、「アミノ酸を利用したコラーゲンの化学合成につい て」、 FRAGRANCE JOURNAL, 2004年 7月号参照）。このおそれを克服するために は、動物から採取した天然コラーゲンに代えて化学合成コラーゲンを使用することが 考えられるが、そのような化学合成コラーゲンとリン酸カルシウム系化合物からなる複 合体で形成された人工骨が実用化されるためには、生物の骨に近似した物性を有し 、骨置換、組織再建能、強度等の生体材料として優れた特性を有するかどうか、生体 内に植入した場合に経時的に脆くなり、崩壊してしまうという問題が生じないかどうか 、生体内において異物として認識され、何らかの不都合が生じることがないかどうかな どを検討する必要がある。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、鋭意検討を行った結果、特定の化学合成コラーゲンとリン酸カルシ ゥム系化合物から得られる複合体が、人工骨として実用化可能な優れた諸性質を有 している事実を見いだし、本発明を完成するに至った。
発明の効果
[0007] 本発明により、病原体感染や好ましくない副作用のおそれがない生体材料用複合 体が提供される。また、天然には存在しない配列の化学合成コラーゲンを合成し、こ れとリン酸カルシウム系化合物を含む複合体を作成することにより、天然のコラーゲン 力 得られる複合体とは異なる熱安定性、分解速度および/または細胞接着性を有 する複合体が得られる。また、本発明の複合体は生体適合性が高ぐかつ耐久性お よび機械的強度が高いので、特に人工骨に適している。さらに、本発明の複合体の 製造方法によれば、機械的特性に優れた複合体を簡便な方法によって製造すること ができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]浸漬後フィルムをデジタルマイクロスコープで撮影した写真。
[図 2]浸漬後フィルムの走査型電子顕微鏡（SEM)写真。
[図 3]浸漬前および浸漬後フィルムの薄膜 X線回折パターンを示す図。
[図 4]浸漬前および浸漬後フィルムのエネルギー分散型 X線 (EDX)分光装置による 元素分析結果を示す図。
[図 5]浸漬前多孔体の表面の SEM写真。
[図 6]浸漬前多孔体の表面の EDXスペクトル。
[図 7]浸漬後多孔体の表面の SEM写真。
[図 8]浸漬後多孔体の表面の EDXスペクトル。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明は、その一つの態様において、
式（Iト（III)
[化 1]
[- (0C- (CH2) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (oc- (c¾) m-co) q- (z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III) 〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して:!〜 10000の整数であり
Yは、それぞれ独立して、 Pro、 Hypまたは式
[化 2]
Figure imgf000006_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸で構成されるアミノ酸残基またはペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]；匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリペプチド（ランダムポリマー）と、リン酸カルシウム系化合 物を含んでなる生体材料用複合体 (以下、「本発明の複合体」という。）を提供する。 上記にぉレヽて、 aは、たとえは、、 1〜： 10000の整数である。 bは、たとえば'、 0〜： 10000 である。 cは、たとえば'、 0〜： 10000である。
[0010] 本発明の複合体は、好ましくは Zが Gly、 Sar、 Ser、 Glu、 Asp、 Lys、 His、 Ala, V al、 Leu, Arg、 Pro、 Tyrおよび lieから選択された 1種またはそれ以上のアミノ酸で 構成されるアミノ酸残基またはペプチド鎖である。
[0011] 本発明の複合体は、好ましくは p = 0、 q = 0、および c = 0である。
[0012] さらに好ましくは、上記において、 Zが Gly、 Sar、 Ser、 Glu、 Asp、 Lys、 Arg-Gly -Asp, Tyr-Ile -Gly- Ser-Arg, lie - Ly s - Val - Ala - Val , Val— Pro— Gl y— Val— Gly、 Asp— Gly— Glu— Ala、 Gly— lie— Ala— Gly、 His— Ala— Val、 Glu― Arg— Leu— Glu、 Lys― Asp― Pro― Lys― Arg— Leuおよび Arg— ¾er— Arg— Lysから選択されたアミノ酸残基またはペプチド鎖であるものである。
特に好ましい本発明の複合体は、上記において、 Y力 それぞれ独立して、 Hypま たは式
[化 3]
Figure imgf000007_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基であるものである。
さらに非常に好ましい本発明の複合体は、式 (Γ)
[化 4]
H- (Pro-Y-Gly) s-0H ( ) 〔式中、
sは 10以上の整数であり、
Yは、それぞれ独立して、 Hypまたは式
[化 5]
Figure imgf000007_0002
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表す。〕 で表されるペプチドユニットを含むポリペプチドと、リン酸カルシウム系化合物を含ん でなるものである。上記において、 sは、たとえば、 10 200000である。
上記において、特に Yが式
[化 6]
Figure imgf000008_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表す場合が好ましい。特に好ましくは、上記において、二価基は、 -
CONHC アルキル一または一 C アルキル（OH)CH OC アルキル一、さら
1-6 1-6 2 1-6 に好ましくは CONHCH -CONHCH CH -CONHCH CH CH
2 2 2 2 2 2
-CONHCH CH CH CH—、一 CH CH(OH)CH〇一、一 CH CH(OH)CH
2 2 2 2 2 2 2 2
OCH一、 -CH CH(OH)CH OCH CH—または一 CH CH(〇H)CH OCH
2 2 2 2 2 2 2 2
CH CH—である。
2 2
[0016] なお、本発明の複合体は、上記において、 2つの異なるペプチドユニット中の Yが 一体となって、シロキサン結合を形成していてもよい。
[0017] 本発明は、他の態様において、式 (i)〜（m)
[化 7]
[- (0C- (C ) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[-(0C-(CH2) m-C0) (Z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III)
〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して:!〜 10000の整数であり Yは式
[化 8]
Figure imgf000009_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]:匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドの円二色性スぺ タトルを 10〜80°Cの範囲の温度で測定すると、 220〜230nmに正のコットン効果、 195〜205nmに負のコットン効果が観察され、 3重らせん構造を形成していることが 確認される。すなわちこれは、 3本の当該ポリペプチドがその全体または一部におい て、コラーゲン様繊維を形成していることを意味する。
[0018] 上記ポリペプチドは、 2つの異なるペプチドユニット中の Yがー体となって、シロキサ ン結合（一 Si— O— Si—）を形成することができる。シロキサン結合により架橋された ポリペプチドも 3重らせん構造を形成していると考えられる。
[0019] 本明細書において、「リン酸カルシウム系化合物」は、 Caおよび POを含む化合物 、たとえば Ca (PO ) (OH) 、 CaHPO 、 CaHPO · 2Η〇、 a— Ca (PO ) 、 β
10 4 6 2 4 4 2 3 4 2
- Ca (PO ) 、 Ca (PO ) OH、 Ca O (PO ) 、 Ca (PO ) (OH) 、 Ca (PO ) 、 C
3 4 2 5 4 3 4 4 2 10 4 2 3 2 a P〇 、 Ca (H PO ) 、 Ca P O、 Ca (H PO ) · Η〇、 Ca H (PO ) - 5H〇であ
2 2 7 2 4 2 2 2 7 2 4 2 2 8 2 4 6 2 る。生体親和性の観点から、リン酸カルシウム系化合物は、好ましくはヒドロキシァパ タイト、すなわち Ca (PO ) (OH) であるが、該リン酸カルシウム系化合物は、格子
10 4 6 2
欠陥を有し得る。ここで、格子欠陥とは、 Ca、 POおよび/または OHの一部が脱落
4
、置換等していることを意味し、カルシウムが置換され得る化学種として、 Na、 K、 Mg など、 POが置換され得る化学種として、 HCO 、 CO 、 HPOなど、 OHが置換され
4 3 3 4
得る化学種として Cl、 HCO 、 COなどが挙げられる。
3 3
本発明は、さらに他の態様において、式 (i)〜（m)
[化 9]
[- (0C- (C ) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (0C- (CH2) m-C0) (Z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III)
〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して:!〜 10000の整数であり Yは、それぞれ独立して、 Pro、 Hypまたは式
[化 10]
Figure imgf000010_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1 - 6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、 nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]:匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリペプチドを、 CaCl水溶液、好ましくは 0. 001〜5. 0M
2
CaCl水溶液、たとえば 1. OM CaCl水溶液に浸漬し、次いで擬似体液（SBF)ま
2 2
たは濃厚擬似体液に浸漬することによりポリペプチドの表面にリン酸カルシウム系化 合物を析出させて、本発明の生体材料用複合体を得ることを特徴とする、本発明の 複合体の製造方法を提供する。
本明細書において、「擬似体液（simulated body fluid; SBF)」は、以下のモル濃度 のイオンを含む溶液を意味する（表 1)。力かる擬似体液中のイオン濃度は、ヒトの血 漿中のこれらのイオンの濃度とほぼ同じである。ただし、ヒトの血漿は、塩化物イオン（ CD濃度が 103. OmMであり、そして重炭酸イオン（HCO―)濃度が 27. OmMで
3
ある点で擬似体液と異なる。合成コラーゲンの表面上でのリン酸カルシウム系化合物 の析出を促進するために、前記表 1の各イオンの相対比率を維持したまま、各イオン の濃度を 1. ：!〜 5. 0倍、たとえば 1. 5倍に高めた溶液 (濃厚擬似体液）を使用するこ ともできる。本明細書において、擬似体液の各イオンの濃度を 1. 5倍に高めた溶液 を「1. 5SBF」と表す。
[表 1] 表 1
Figure imgf000012_0001
[0022] 上記の複合体の製造方法にぉレ、て、 CaCl水溶液に浸漬する場合の温度は、化
2
学合成コラーゲンが変性しない温度であれば特に限定されないが、好ましくは 10〜 80°C、さらに好ましくは 20〜40°Cである。本発明において使用される化学合成ポリ ペプチドは 3重らせん構造を形成している力 この構造は 10〜80°Cにおいて安定で あることが円二色性スペクトルの測定により確認される。また、 SBF等に浸漬する場合 の温度も、特に限定されるわけではなレ、が、好ましくは 10〜80°C、さらに好ましくは 2 0〜40°Cである。 SBF等に浸漬する時間が長いほど、および濃厚擬似体液の濃度 が高いほど、析出するリン酸カルシウム系化合物の量は多くなる。さらに、 SBF等に 長時間浸漬した後に、新たな SBFに交換しても析出するリン酸カルシウム系化合物 の量は多くなる。所望により、上記のようにして得られた複合体を凍結乾燥などにより 多孔体とすることも可能である。
[0023] 上記の複合体の製造方法において、擬似体液または濃厚擬似体液の代わりに、た とえば以下の組成を有する溶液 1〜3のいずれかを用いることもできる（表 2)。また、 擬似体液もしくは濃厚擬似体液、またはこれらの代わりに使用される溶液の pHは、 p H5〜9の範囲であり、好ましくは ρΗ7· 2〜7· 5の範囲である。
[表 2] 表 2 (単位： mM)
Figure imgf000013_0002
本明細書において、「ィ匕学合成コラーゲン」とは、化学的に合成されたポリペプチド であって、式（Iト（III)
[化 11]
[- (0C- (CH2) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (oc- (c¾) m-co) q- (z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III) 〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
Yは、それぞれ独立して、 Pro、 Hypまたは式
[化 12]
Figure imgf000013_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1 - 6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、 Rは直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]；匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるペプチドユニットを含むポリペプチドを意味する。 Yが Proまたは Hypであ る化学合成コラーゲンの詳細については、特開 2003— 321500に記載されている。 簡単に記載すると、本明細書に記載の「化学合成コラーゲン」は、
(i)式 (Iト (III)
[化 13]
[- (0C- (C ) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (0C- (CH2) m-C0) (Z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III)
〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
Yは、それぞれ独立して、 Proまたは Hypを表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]；匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるペプチドユニットを含むポリペプチドを、通常、溶媒 (水および/または有 機溶媒）中、脱水縮合剤（たとえば、ジイソプロピルカルポジイミド (DIPC)、 1—ェチル - 3 - (3—ジメチルァミノプロピル）—カルボジイミド (EDC=WSCI)、 1—ェチル— 3— (3—ジメチルァミノプロピル）一カルボジイミド塩酸塩 (WSCI ' HC1)、ジシクロへキシノレ カルポジイミド (DCC)のようなカルポジイミド系縮合斉 lj、 0 - (7—ァザべンゾトリァゾー ノレ _ 1—ィル）_ 1 , 1 , 3， 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフェート、〇 —ベンゾトリアゾール _ 1 _ィル一 N， N, Ν', N'—テトラメチルゥロニゥムへキサフル ォロホスフェート、ベンゾトリアゾール一1—ィル一ォキシ一トリス一ピロリジノホスホニ ゥムへキサフルォロホスフェート、ベンゾトリァゾール一 1—ィルートリス（ジメチルァミノ )ホスホニゥムへキサフルォロリン化物塩 (ΒΟΡ)のようなフルォロホスフェート系縮合剤 、ジフヱニルホスホリルアジド等）の存在下で、所望によりさらに縮合助剤（または脱水 助剤）（たとえば、 Ν—ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、 Ν—ヒドロキシトリアゾール 類（たとえば 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール等の Ν—ヒドロキシベンゾトリアゾール類 等）、トリアジン類、 2—ヒドロキシイミノー 2—シァノ酢酸ェチルエステル等）の存在下 で、式 (I)〜（III)のペプチドユニットを縮合させる工程；そして所望により
(ii)末端に Si(OR' ) (式中、 R'は上記定義のとおり）を有するシランカップリング剤（
3
たとえば、イソシアナ一トプロピルトリエトキシシランゃグリシドキシプロピルトリメトキシ シラン等)を含む有機溶媒 (好ましくはシランカップリング剤とも化学合成コラーゲンと も反応しない有機溶媒、たとえばトルエン、 THF等）中に、上記縮合したペプチドュ ニットを浸漬し、次いで加水分解を行う工程
により製造され得る。
[0026] 本明細書において、「C アルキル」は、 1から 6個の炭素原子を有する直鎖または
1 -6
分枝鎖であり、たとえばメチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピノレ、 n—ブチル、 ter t—ブチル、 n_ペンチルおよび n_へキシルが挙げられる。
[0027] 本明細書において、 Si含量は様々な要因、たとえば、これに限るものではないが、 リン酸カルシウム系化合物との複合化量、複合体の生体内での分解速度、生体材料 の用途および形状、ならびに人工コラーゲンに対する反応率等に依存して、人工コラ 一ゲンの一OH基に対して 0〜100%、好ましくは 5〜80%、さらに好ましくは 10〜5 0%の範囲で変化し得る。 [0028] 本発明の生体材料用複合体は、特に、生体親和性または生体適合性に優れてい るために、たとえば、人工骨、人工歯根、骨修復剤、骨充填剤、顎骨再建基材および 人工関節固定化材などの生体埋植材料として利用できる。本発明の複合体は、顆粒 の形態またはバルタの形態で使用され得る。本発明の複合体を顆粒の形態で使用 する場合、その粒径の範囲は、約 0. 1〜約 10mmが好適である。本発明の複合体を バルタの形態で使用する場合、適用部分の大きさとほぼ同じ大きさのバルタが好適 である。
[0029] 本発明の生体材料用複合体を人工骨として使用するとき、ポリペプチド：リン酸カル シゥム系化合物の重量比が 1： 9〜9： 1、好ましくは 2： 8〜8： 2である生体材料用複合 体が好ましレ、。生体骨は約 30重量％コラーゲンと約 70重量％アパタイトからできて いるため、生体骨に類似の力学強度を有するように人工骨を製造するとき、ポリぺプ チド：リン酸カルシウム系化合物の重量比がおよそ 3： 7である生体材料用複合体が 好ましレ、。また、骨細胞への接着性を有するように人工骨を製造するとき、リン酸カル シゥム系化合物の重量％が約 1〜90重量％、好ましくは約 10〜90重量％、さらに好 ましくは 25〜75重量％である生体材料用複合体が望ましい。
[0030] 本発明の複合体が生体内に埋入された後、当該複合体の表面に新生骨が生長し 、そして骨化する。本発明の複合体はリン酸カルシウム系化合物の層を有し、骨に異 物として認識されないので、骨と接着しやすぐ生体材料、たとえば人工骨として有利 である。
[0031] 別の態様において、本発明の複合体は、たとえば 1種以上の生理学的または薬理 学的に許容される活性成分、担体および/または添加剤等を含んでいてもよい。該 活性成分の例として、たとえばこれに限るものではないが、殺菌剤または消毒剤、抗 炎症剤、消炎，鎮痛剤、鎮痒剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗ウィルス剤、抗真菌 剤、抗生物質、皮膚軟化剤、褥瘡 ·皮膚治療剤、ビタミン剤、漢方薬等が含まれる。 また、活性成分として、 1種以上の止血成分 (血液凝固因子により止血するためのフ イブリン等）、または細胞増殖促進作用、血管新生作用および Zまたは細胞接着性 作用を有するポリペプチドまたはその塩等を含んでレ、てもよレ、。
[0032] さらに必要により、酸成分 (例えば、酢酸、クェン酸、酒石酸、リンゴ酸など）、塩基 成分（アンモニア、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの無機塩基、トリ ェチルァミン、エタノールァミン、トリエタノールァミンなどの有機塩基）を含んでいても よい。
[0033] また、生体材料または医用材料は、前記ポリペプチド（またはポリペプチドを含む組 成物）と有機または無機基材との複合材料であってもよい。基材は、通常、生体親和 性、生体適合性を有している場合が多い。
[0034] 無機基材としては、シリカ、ジルコユア、チタニアなどの金属酸化物、ヒドロキシァパ タイトなどのリン酸カルシウム、ァノレミニゥム、ステンレススチール、チタンまたはチタン 合金などの金属、セラミックスなどが例示できる。
[0035] 有機基材としては、例えば、多糖類またはその誘導体 (アルギン酸塩、キチン、キト サン、ヒアノレロン酸、ポリガラクトサミン、カードラン、プノレラン、キサンタン、デキストラ ンなどの多糖類、セルロース、メチルセルロース、ェチルセルロース、カルボキシメチ ノレセノレロースまたはその塩、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロー ス、ヒドロキシプロピノレメチノレセノレロースなどのセノレロースエーテノレ類、セノレロースァ セテートなどのセルロースエステル類など）、タンパク質（ゼラチン、カゼイン、アルブミ ンなど）、ポリペプチド（ポリリジン、ポリグルタミン、ポリグルタミン酸など）、ビニルアル コール系樹脂（ポリビュルアルコール系樹脂、エチレン ビニルアルコール共重合体 など）、ポリビエルピロリドン系樹脂、アクリル系樹脂（ポリ（メタ）アクリル酸、（メタ）アタリ ル酸共重合体などの (メタ）アクリル酸系樹脂など）、ハロゲン含有樹脂（ポリテトラフル ォロエチレンなどのフッ素系樹脂、ポリ塩ィ匕ビニルなどの塩化ビエル系樹脂など）、ポ リウレタン系樹脂、シリコーン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリアミド系樹脂 (ナイロン 6,ナイロン 66など）などが挙げられる。
[0036] 基材は非生体内分解性または生体内崩壊性であってもよレ、が、生体材料として利 用する場合、生体内で分解吸収性を有するのが有利である。このような生体内分解 性基材は生体内分解性樹脂で構成できる。生体内分解性樹脂としては、種々の樹 脂、例えば、前記多糖類またはその誘導体、ポリエステル (グリコール酸、乳酸、 3 _ ヒドロキシ酪酸、 4—ヒドロキシ酪酸、 3—ヒドロキシプロピオン酸などのヒドロキシカル ボン酸の単独または共重合体（乳酸—グリコール酸コポリエステルなど）、ヒドロキシカ ルボン酸、プロピオン酸、ラタトン等（ブチ口ラタトン、力プロラタトンなど）とのコポリエス テルなど）が挙げられる。
[0037] これらの基材用材料は単独でまたは二種以上組み合わせて使用でき、二種以上の 材料を用いた複合基材であってもよレ、。
[0038] このような基材の少なくとも表面に前記ポリペプチドを適用することにより、本発明の 生体材料を調製できる。前記ポリペプチドは、基材のうち生体に対する適用部位 (体 組織に限らず体液や血液と接触する部位）に適用すればよぐ粉粒状や一次元的形 状の基材では、基材全体に適用してもよぐ二次元的形状の基材では少なくとも一方 の面に適用してもよぐ三次元的形状の基材では、生体に対する適用部位 (全面、内 面、外面など）に適用すればよい。例えば、前記ポリペプチドの溶液または懸濁液を 、基材の表面に塗布または散布ほたは含浸）した後、乾燥することにより、基材の表 面がポリペプチドで被覆された生体材料を得ることができる。また、多孔質基材にポリ ペプチドの溶液または懸濁液を含浸させ、ポリペプチドを保持した生体材料を調製し てもよい。
[0039] さらに、ポリペプチドと架橋剤とを含む組成物を用いることにより、基材に担持された ポリペプチドは、必要により、架橋剤（特に、ダリオキザール、ダルタルアルデヒド、スク シンアルデヒド、マレアルデヒドなどのジアルデヒド類、デキストランジアルデヒド、アル デヒドデンプンなどの生理学的に許容可能な架橋剤）により架橋していてもよい。架 橋剤の割合は、前記と同様、ポリペプチド 100重量部に対して 1〜20重量部、好まし くは 1〜： 10重量部程度であってもよい。
[0040] 基材に対するポリペプチドの適用量は、生体材料の形態により大きく異なり一概に 特定できないが、通常、基材 100重量部に対して、約 0.：!〜 500重量部（例えば、 1 〜300重量部）、好ましくは約 5〜200重量部（例えば、 10〜100重量部）程度であ つてもよい。
[0041] 本発明の複合体は、そのまま目的とする用途に用いてもよいが、特に、医療用途等 に用いる場合には、殺菌または滅菌処理に付してから用いることが好ましい。殺菌ま たは滅菌処理法としては、湿熱蒸気滅菌法、ガンマ線滅菌法、エチレンオキサイドガ ス滅菌法、薬剤殺菌法および紫外線殺菌法等が例示されるが、湿熱蒸気滅菌法、ガ ンマ線滅菌法およびエチレンオキサイドガス滅菌法は、滅菌効率が高ぐしかも該複 合体に与える影響が少なレ、ので好ましレ、。
[0042] 本発明の複合体は、人工骨材料として適している。特に、気孔率が 0〜50%の複 合体は、緻密質で、高強度の骨の欠陥を補填するための材料として適している。一 方、気孔率が 50〜99%の複合体は、軽荷重の力、かる骨を補填するための材料とし て適している。これらの複合体は、角柱状、円柱状、ブロック状など任意の形状に成 形して使用される。また、この人工骨と、人骨とをボルト一ナットなどによって接合する ために、貫通孔を形成してもよレ、。さらに、これらの材料において、細胞の進入を促 進するために、促進剤（たとえば、骨形成タンパク質、骨形成ペプチドなど）を含浸し ておくこともできる。
[0043] また好ましレ、態様にぉレ、て、本発明の複合体は、操作性に極めて優れた生体材料 、たとえば人工骨を提供する。好ましい態様において、本発明の複合体は、リン酸力 ルシゥム系化合物がコラーゲン表面に析出する前のコラーゲンと比較するとやや硬 化しているものの、コラーゲンが有する易変形性は十分に維持される。たとえば、ピン セットで該複合体を挟持したとき該複合体は崩壊せず、かつ、力を加えると崩壊する ことなく変形した。さらに、力かる複合体に力を加えて変形させたとき、析出したリン酸 カルシウム系化合物は剥離しなかった。このような力学的特性から、本発明の複合体 を含む生体材料は、たとえば人工骨として使用するとき、骨欠損部の形状に応じて自 由に変形させて使用することができる。さらに、得られた材料はハサミ等を使用するこ とで容易に切断され得、したがって、たとえば手術時に、容易に成形することができる 。これは、従来のセラミックスの緻密体を含んでなる人工骨が非常に硬ぐ手術時に おいて該材料を形成すること、または欠損部位の形状に合わせて変形させることが 容易でないという技術的な課題を解決し得る、顕著な効果である。
[0044] 本明細書において、各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ala : L—ァラニン残基
Arg： L -アルギニン残基
Asn： L -ァスパラギン残基
Asp： L _ァスパラギン酸残基 Cys:L システィン残基
Gin :L グノレタミン残基
Glu:L グノレタミン酸残基
Gly:グリシン残基
His :L_ヒスチジン残基
Hyp :L ヒドロキシプロリン残基
lie :L—イソロイシン残基
Leu :L ロイシン残基
Lys:L リジン残基
Met :L_メチォニン残基
Phe： L—フエ二ルァラニン残基
Pro :L プロリン残基
Sar:サルコシン残基
Ser:L セリン残基
Thr:L—トレオニン残基
Trp:L トリブトファン残基
Tyr:L チロシン残基
Val:L バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、 N末端のアミノ酸残基を左側に位置さ せ、 C末端のアミノ酸残基を右側に位置させて、ペプチド鎖のアミノ酸配列を記述す る。
実施例
[0045] 以下に実施例によりさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれに限定される ものではない。
[0046] 〔実施例 1〕
ポリペプチドの合成
H- (Pro -Hyp -Gly) — OH、ジメチルスルホキシド、ジイソプロピルェチルアミ
10
ン、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt)、 1—ェチル 3— (3—ジメチルァミノ プロピル）—カルボジイミド塩酸塩（EDC 'HCl)を用いて、特開 2003— 321500の 実施例 1と同様にポリペプチドを合成した。具体的には、 H- (Pro-Hyp-Gly)
10 OHで示されるペプチド 5mgを 2mLのジメチルスルホキシドに懸濁し、 20°Cで撹 拌した。この混合液に、ジイソプロピルェチルァミンを 0. 90mM、 1—ヒドロキシベン ゾトリァゾーノレを 0. 98mM (l _ェチル _ 3_ (3—ジメチルァミノプロピル）一カルボ ジイミド塩酸塩（EDC'HCl)を 1. 80mMとなるように添カロし、さらに 20°Cで 48時間 撹拌を続けて、当該ポリペプチドを製造した。得られたポリペプチドの分子量は約 2. OkDa以上であった。分子量はアマシャム'バイオサイエンス製の Gel Filtration LMW Calibration Kitおよび Gel Filtration HMW Calibration Kitを標準物質として使用し、 异出した。
[0047] 〔実施例 2〕
複合体の作成
実施例 1で得られたポリペプチドの水溶液を、ポリスチレン製のペトリディッシュ上に 150 /i Lとり、これを室温で 24時間風乾し、化学合成コラーゲンのフィルムを作成した (以下「浸漬前フィルム」という）。これに、 lmol/Lの塩化カルシウム（CaCl )水溶液
2
5mLを添加し、 36. 5°Cで 24時間保持した。塩化カルシウム水溶液を除去し、 2mL の超純水で 3回洗浄した後、 10mLの 1. 5SBF (pH = 7. 40)に 7日間浸漬して、ァ パタイトを当該フィルム表面に析出させた。次いで、 1. 5SBFを除去し、風乾すると所 望の複合体のフィルムを得た（以下「浸漬後フィルム」という）。当該浸漬後フィルムを 、デジタルマイクロスコープ VHX— 100 (株式会社キーエンス製、 VH— Z450高倍 率ズームレンズ使用）で撮影した写真を図 1に示す。また、浸漬後フィルムを走査型 電子顕微鏡 (SEM) (S - 3500N, 日立製作所製)で撮影した写真を図 2に示す。
[0048] 浸漬前および浸漬後フィルムにつレ、て、薄膜 X線回折パターン (RINT2200VZP C_LR、リガク製、 X線発生源： Cu、エネルギー： 40kV/30mA、 X線入射角 1° ) を調べた。結果を図 3に示す。また、浸漬前および浸漬後フィルムについて、ェネル ギー分散型 X線 (EDX)分光装置 (EMAX ENERGY EX— 400、堀場製作所製） により分析した。結果を図 4に示す。図 1、図 2、図 3および図 4から、化学合成コラー ゲン一ヒドロキシアパタイト複合体が生成していることが分かる。 〔実施例 3〕
シラノール基を有する複合体の合成
実施例 2の浸漬前フィルムを凍結乾燥に付し、次レ、で ImLの 10vol%イソシアナ一 トプロピルトリエトキシシラン（IPTS)の THF溶液に浸漬し、 36. 5°Cで 24時間保持し た。 THFで洗浄した後、 24時間風乾し、多孔体を得た（以下、「浸漬前多孔体」とい う）。浸漬前多孔体の表面の SEM写真および EDXスぺクトノレを、それぞれ図 5およ び図 6に示す。次いで、浸漬前多孔体に、 0. ImolZLの塩化カルシウム（CaCl )水
2 溶液 ImLを添カ卩し、 36. 5°Cにて 24時間保持した。塩ィ匕カルシウム水溶液を除去し た後、超純水で洗浄し、 ImLの 1. 5SBF (pH = 7. 25)に 7日間浸漬して、アパタイト を当該フィルム表面に析出させた。次いで、 1. 5SBFを除去し、風乾すると所望の生 成物（以下、浸漬後多孔体という）を得た。浸漬後多孔体の表面の SEM写真および EDXスペクトルを、それぞれ図 7および図 8に示す。図 7および図 8から、化学合成コ ラーゲンーヒドロキシアパタイト複合体が生成していることが分かる。また、図 2と図 7を 比較することにより、シラノール基を導入した化学合成コラーゲンの方により多くのヒド ロキシアパタイトが析出していることが分かる。

Claims

請求の範囲
[1] 式 (Iト (III)
[化 1]
[- (0C- (CH2) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (0C- (CH2) m-C0) (Z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III)
〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して 0〜： 10000の整数であり Yは、それぞれ独立して、 Pro、 Hypまたは式
[化 2]
Figure imgf000023_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸で構成されるアミノ酸残基またはペプチド鎖を表し、 rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]:匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、 p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリマーとしてのポリペプチドと、リン酸カルシウム系化合物 を含んでなる生体材料用複合体。
少なくとも 1個の Yが
[化 3]
Figure imgf000024_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
である、請求項 1に記載の生体材料用複合体。
[3] Zが Gly、 Sar、 Ser、 Glu, Asp、 Lys, His, Ala, Val, Leu, Arg, Pro, Tyrおよ び lieから選択された 1種またはそれ以上のアミノ酸で構成されるアミノ酸残基または ペプチド鎖である請求項 1または 2に記載の生体材料用複合体。
[4] Zが Gly、 Sar、 Ser、 Glu, Asp、 Lys, Arg -Gly -Asp, Tyr— Ile— Gly— Ser— Arg、 He - Lys - Val - Ala - Val , Val - Pro - Gly - Val - Gly, Asp -Gly -Glu -Ala, Gly— lie—Ala— Gly、 His -Ala -Val, Glu - Arg - Leu - Glu, Lys -A sp_Pro_Lys _Arg_Leuおよび Arg_ Ser_Arg_Lysから選択されたアミノ酸 残基またはペプチド鎖である、請求項 3に記載の生体材料用複合体。
[5] p = 0、 q = 0、および c = 0である、請求項 1〜4のいずれかに記載の生体材料用複 合体。
[6] Y力 それぞれ独立して、 Hypまたは式
[化 4] 0— X— Si (OR') 3
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基である、請求項：!〜 5のレ、ずれか 1項に記載の生体材料用複合体。 ポリペプチドが式 (Γ)
[化 5]
H-(Pro-Y-Gly)s-0H ( ) 〔式中、
sは 10〜200000の整数であり、
Yは、それぞれ独立して、 Hypまたは式
[化 6]
Figure imgf000025_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表す。〕
で表されるペプチド単位を含むものである、請求項:!〜 6のいずれか 1項に記載の生 体材料用複合体。
[8] Yが式
[化 7] 0— X— S i (OR' ) 3
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキノレであり、そして
1 - 6
Xは二価基である。 ]
で表される、請求項：!〜 7のいずれか 1項に記載の生体材料用複合体。
Xがー CONHCH -CONHCH CH CONHCH CH CH CO
2 2 2 2 2 2
NHCH CH CH CH CH CH (〇H) OCH CH CH (OH)〇CH CH
2 2 2 2 2 2 2 2 CH CH (〇H) OCH CH CH または CH CH (〇H)〇CH CH CH C
2 2 2 2 2 2 2 2 2
H一である、請求項:!〜 8のいずれか 1項に記載の成体材料用複合体。
2
2つの異なるペプチドユニット中の Yがー体となって、シロキサン結合を形成してい てもよい、請求項 8または 9に記載の生体材料用複合体。
リン酸カルシウム系化合物が Ca (PO ) (OH) である、請求項 1〜10のいずれ力、
10 4 6 2
1項に記載の生体材料用複合体。
ポリペプチド：リン酸カルシウム系化合物の重量比が 1： 9〜9： 1である、請求項：!〜 11のいずれか 1項に記載の生体材料用複合体。
式（Iト（III)
[化 8]
[- (0C- (CH2) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (0C- (CH2) m-C0) (Z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III)
〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、
aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して 0〜： 10000の整数であり
Yは、それぞれ独立して、式 0— X-S i (OR' ) 3
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1 - 6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]；匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリマーとしてのポリペプチド。
2つの異なるペプチドユニット中の Yがー体となって、シロキサン結合を形成してレ、 てもよレ、、請求項 13に記載のポリペプチド。
式（Iト（III)
[化 10]
[- (0C- (CH2) m-C0) p- (Pro-Y-Gly) n -] a ( I )
[- (oc- (c¾) m-co) q- (z) r -] b (II)
[-HN-R-NH-] 。 （III) 〔式中、
mは:!〜 18の整数であり、
pおよび qは互いに独立して 0または 1であり、 aは:!〜 10000の整数であり、 bおよび cはそれぞれ独立して 0〜： 10000の整数であり
Yは、それぞれ独立して、 Pro, Hypまたは式
[化 11]
Figure imgf000028_0001
[式中、
R'は水素もしくは C ァノレキルであり、そして
1-6
Xは二価基である。 ]
で示される基を表し、
nは 1〜20の整数を表し、
Zは 1〜： 10個のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を表し、
rは 1〜20の整数を表し、
Rは炭素数 2〜： 12の直鎖状または分岐鎖状アルキレン基を表し、
aと bとの害 ij合は a/b = 100/0〜30/70 (モノレ]:匕）であり、
p = lおよび q = 0であるとき c = aであり、
p = 0および q= lであるとき c = bであり、
p = lおよび q= lであるとき c = a + bであり、そして
p = 0および q = 0であるとき c = 0である。〕
で表されるユニットを含むポリペプチドを、 CaCl水溶液に浸漬し、次いで擬似体液
2
または濃厚擬似体液に浸漬することにより請求項 1に記載の生体材料用複合体を得 ることを特徴とする、生体材料用複合体の製造方法。 辦 ()嗨Mi ¾j Λ62
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
差替え用紙 （MM26) 3
Figure imgf000031_0001
2Θ (CuKa) /度（degree)
差替え用紙（規則 26) 4/8
) (I ¾ [U SUΛ図
Figure imgf000032_0001
ェネルキー（Energy) / keV
'差眷ぇ用鉞（規則 26) 5/8
Figure imgf000033_0001
差替え用紙（規則 ) 6/8
Figure imgf000034_0001
2 4 6 8 エネノレギ—— (Energy) / keV
差替え用紙（規則 26) 7/8
Figure imgf000035_0001
差眷ぇ用紙（規則 26)
Figure imgf000036_0001
エネルキ一（Energy) / keV 差眷ぇ用紙 mm)
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