KR20160129982A

KR20160129982A - 홍합접착단백질 유래 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더 및 이의 제조방법

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Publication number: KR20160129982A
Application number: KR1020150061487A
Authority: KR
Inventors: 김동명; 윤장호; 이해욱; 박건섭; 신용주; 김형조; 강호창; 최종훈; 김지은; 차형준; 최봉혁; 김도형
Original assignee: 강호창; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2016-11-10

Abstract

본 발명은 약물이 적재된 홍합접착단백질 기반의 도파-Fe(Ⅲ) 복합체를 이용한 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 골 바인더는 카테콜 화합물-금속 배위복합체, 특히 홍합접착단백질 기반의 도파-Fe(Ⅲ) 복합체를 이용하여 제조됨으로써, 생체적합성이 우수하고, 적재된 약물의 배출속도를 제어할 수 있고, 강한 골 접착력을 가지므로, 치주질환의 예방 또는 치료에 효과가 있고, 골질이 불량한 환자의 임플란트 시술에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

홍합접착단백질 유래 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더 및 이의 제조방법{Mussel adhesive protein-derived bone binder for preventing or treating periodontal disease and method for preparing the same}

본 발명은 약물이 적재된, 홍합접착단백질 기반의 도파-Fe(Ⅲ) 복합체를 이용한 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 골 바인더를 포함하는 골 지지체에 관한 것이다.

치아에서 발생하는 통상적인 질환으로 충치 및 치주질환이 있다. 대한 치과의사협회의 보고에 따르면 우리 나라 성인들의 80% 이상이 잇몸병을 갖고 있다고 한다. 치주질환은 위장계 질환, 지질대사 질환 및 뇌졸중과 같은 질병과 직, 간접적으로 상관성이 있는 것으로 보고되고 있다. 치주질환의 유발원인은 한가지만으로는 설명할 수 없으며 통상 복합적인 원인에 의해 나타나는 만성질환이라고 볼 수 있다. 치은염 및 치주염을 포함하는 치주질환은 세균에 의해 야기되는 치아지지 조직의 염증상태로서, 출혈, 치주낭의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 인하여 치아의 상실을 가져오는 질환이다. 이러한 치주질환은 세균의 집락형성, 세균의 치주조직 침투 및 치주조직이 파괴되는 과정으로 진행된다. 구체적으로, 불량한 구강 위생상태로 인하여 구강 세균이 서식하면 세균막을 형성하여 염증이 생기고 가끔 잇몸에서 피가 나고 구취가 나며, 이러한 상태로 더 진행되면 치아와 잇몸 사이의 벌어진 틈이 더 깊어져서 치주낭이 생기고, 여기에 치주질환을 일으키는 세균들이 번식하여 치주염이 발생된다. 치주염이 진행되면 칫솔질과 같은 약한 자극에도 잇몸에서 피가 나기도 하며 붓고, 종종 급성염증으로 변화되어 통증을 유발한다. 이러한 염증은 골을 생성하는 기능은 저하시키고, 골을 흡수하는 기능은 증가시켜 치조골이 점점 소실되고 파괴되어 결국 치아를 상실하게 된다.

치과 재료 분야는 매년 전 세계적으로 시장 규모가 증가하는 분야로, 이는 고령화 인구 증가에 따른 치과 재료 수요의 증가에 의한 것이다. 노년 인구가 증가함에 따라 치조골 이식을 필요로 하는 치주 질환이 증가하여 골 이식재의 수요가 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 치과용 골 이식재는 약골의 결손 부위를 물리적으로 채우고, 뼈 형성을 촉진하기 위한 목적으로 사용되는 치과 재료로, 그 중에서도 이종골 이식재(bone graft material)는 동물 또는 타 생명체에서 유래한 골 이식재를 가리킨다. 골 바인더는 골 이식재가 이식된 부위에서 움직이지 않게 하고, 뼈세포나 주변의 다양한 성장인자들이 이식재에 잘 붙도록 해 뼈의 성장을 빨리 형성되도록 한다. 그러나, 환자의 골 상태에 따라서 골질이 좋지 않고 골밀도가 낮거나 상악동 같은 골질이 취약한 부위에서의 골 이식술은 실패율이 높은 편이다. 지금까지 골 이식재의 이탈을 막고, 뼈 형성 세포의 유도를 위해 '본드' 역할을 하는 바인더 대신 '차단막'을 주로 사용해왔으나, 2차 수술을 하게 될 경우 강도나 제형면에서 많은 문제점이 존재하였다. 특히, 임플란트에 사용할 경우, 구강 내에 수분이 많이 존재하기 때문에 점도가 높은 고분자 물질로 바인더를 만들어도 그 효과가 충분치 않은 문제가 있다. 따라서, 따라서 골질이 불량한 노년층의 치조골에서 임플란트 시술에 성공적으로 기능할 수 있는 골 바인더의 개발이 절실히 요구되고 있다.

KR 10-1999-0034590

본 발명자들은 치과용 골 바인더에 대해 탐색하던 중, 약물이 적재된, 홍합접착단백질 기반의 도파-Fe(Ⅲ) 복합체를 포함하는 골 바인더가 생체적합성이 우수하고, 적재된 약물의 배출속도를 제어할 수 있고, 강한 골 접착력을 가지므로, 치주질환의 예방 또는 치료에 효과가 있고, 골질이 불량한 환자의 임플란트 시술에 유용하게 사용될 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 홍합접착단백질 및 약물을 포함하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 골 바인더를 포함하는, 골 지지체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 골 바인더 또는 상기 골 지지체를 포함하는, 임플란트 키트를 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은

홍합접착단백질 및 약물을 포함하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 골 바인더를 포함하는, 골 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 골 바인더 또는 상기 골 지지체를 포함하는, 임플란트 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 홍합접착단백질은 홍합에서 유래한 접착단백질로, 바람직하게는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 또는 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus) 에서 유래한 홍합접착단백질 또는 이의 변이체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하고, 전체 티로신 잔기의 10 ~ 100%가 카테콜 화합물로 변환된 것이 바람직하다. 대부분의 홍합접착단백질의 전체 아미노산 서열에서 티로신이 차지하는 비중은 약 1 ~ 50 %일 수 있다. 홍합접착단백질 내의 티로신은 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 카테콜 화합물인 도파(DOPA)로 변환될 수 있다. 그러나 대장균에서 생산된 홍합접착단백질은 티로신 잔기들이 변환되어 있지 않으므로, 별도의 효소 및 화학적 처리 방법에 의하여 티로신을 도파로 변환시키는 수정 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 홍합접착단백질에 포함된 티로신 잔기를 도파로 수정하는 방법은 당업계에 알려진 방법을 사용할 수 있으며 특별히 제한되지 않는다.

상기 카테콜 화합물는 디하이드록시기를 포함하는 화합물로, 가교작용을 통해 홍합접착단백질에 접착력을 부여하는 화합물을 의미한다. 구체적으로는, 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체 등일 수 있으며, 도파인 것이 바람직하다.

상기 카테콜 화합물은 금속과 배위 결합하여 카테콜 화합물-금속의 배위복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 상기 카테콜 화합물-금속의 복합체는 도파(DOPA)-Fe(Ⅲ) 복합체일 수 있다. 상기 홍합접착단백질에 존재하는 도파 및 Fe(Ⅲ)은 배위 결합을 통해 가교를 형성하는데, 도파와 Fe(Ⅲ)은 우리 몸 속에 이미 존재하는 물질이기 때문에 생체적합성이 우수한 장점이 있다.

상기 금속은 카테콜 화합물과 배위결합을 할 수 있는 임의의 금속으로, 전형 금속 또는 전이 금속일 수 있다. 예로, 상기 금속은 배위결합이 가능한 철(iron), 티타늄(titanium), 바나듐(vanadium), 크롬(chrome), 망간(manganese), 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 지르코늄(zirconium), 니오브(niobium), 몰리브덴(molybdenum), 테크네튬(technetium), 루테늄(ruthenium), 로듐(rhodium), 팔라듐(palladium), 은(silver), 하프늄(hafnium), 탄탈(tantalum), 텅스텐(tungsten), 레늄(rhenium), 오스뮴(osmium), 이리듐(iridium), 백금(platium) 및 금(gold) 등일 수 있으며, 철(Ⅲ)인 것이 바람직하다.

상기 홍합접착단백질은 바람직하게는 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (b) 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드, (c) 서열번호 6의 아미노산 서열이 1 내지 10회 연속하여 연결된 폴리펩타이드 및 (d) 상기 (a)의 폴리펩타이드, (b)의 폴리펩타이드 및 상기 (c)의 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상이 융합된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 (c)에서 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 또한 상기 (d)에서 융합된 폴리펩타이드는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명에서 홍합접착단백질의 변이체(mutants)는 바람직하게는 홍합접착단백질의 접착력을 유지하는 전제하에 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단이나 아미노말단에 추가적인 서열을 포함하거나 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것이거나 홍합접착단백질을 이루는 타이로신 잔기 총수의 1 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 100%가 3,4-디하이드록시페닐-L-알라닌(DOPA)로 치환된 것일 수 있다.

상기 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 RGD(Arg Gly Asp, 서열번호 8), RGDS(Arg Gly Asp Ser, 서열번호 9), RGDC(Arg Gly Asp Cys, 서열번호 10), RGDV(Arg Gly Asp Val, 서열번호 11), RGDSPASSKP(Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro, 서열번호 12), GRGDS(Gly Arg Gly Asp Ser, 서열번호 13), GRGDTP(Gly Arg Gly Asp Thr Pro, 서열번호 14), GRGDSP(Gly Arg Gly Asp Ser Pro, 서열번호 15), GRGDSPC(Gly Arg Gly Asp Ser Pro Cys, 서열번호 16) 및 YRGDS(Tyr Arg Gly Asp Ser, 서열번호 17)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 홍합접착단백질의 카르복실말단 또는 아미노말단에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 홍합접착단백질의 변이체는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 홍합접착단백질은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 외부 유전자를 발현할 수 있는 용도로 제작된 통상의 벡터에 발현 가능하도록 삽입하여, 유전공학적인 방법으로 대량 생산할 수 있다. 상기 벡터는 단백질을 생산하기 위한 숙주세포의 종류 및 특성에 따라 적절히 선택하거나, 신규로 제작할 수 있다. 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 방법 및 형질전환체로부터 재조합 단백질을 생산하는 방법은 통상의 방법으로 용이하게 실시할 수 있다. 상기한 벡터의 선택, 제작, 형질전환 및 재조합 단백질의 발현 등의 방법은, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시할 수 있으며, 통상의 방법에서 일부의 변형도 본 발명에 포함된다.

상기 약물은 항균제 또는 항염증제 또는 이의 조합일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항균제는 클로르헥시딘, 헥사메딘, 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 스피라마이신, 반코마이신, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 이미페넴 및 후시딕산품 등 일 수 있다. 바람직하게는 상기 항균제는 치과용으로 많이 사용되는 클로르헥시딘, 헥사메딘, 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 스피라마이신, 반코마이신 등일 수 있다.

상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 등 일 수 있다.

상기 치주질환은 풍치라고도 하며, 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis) 또는 치주염(periodontitis)일 수 있다. 치은염은 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 말하며, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다.

상기 골 바인더는 구개골, 상악골, 하악골, 악관절, 치조골 또는 치주낭 등에 접착할 수 있다.

상기 골 바인더는 총 중량% 대비 1 내지 50중량%의 홍합접착단백질을 포함함으로써, 수중뿐 아니라 움직임을 반복하는 잇몸뼈나 턱뼈 등에 우수한 접착력을 나타낼 수 있다.

또한, 상기 골 바인더는 약물의 방출 속도를 제어할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 골 바인더를 겔, 하이드로겔 또는 전기방사 섬유의 형태로 제형화하여, 팽윤 특성 및 약물의 방출 속도를 조절할 수 있다.

상기 골 바인더는 겔, 하이드로겔, 섬유, 분말, 크림, 팩, 시트, 오일 등으로 제형화할 수 있고, 바람직하게는 겔, 하이드로겔, 섬유로 제형화할 수 있다.

상기 겔 제형은 (1) 홍합접착단백질, 약물 및 잔탄검의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (2) 상기 혼합용액을 30~50℃에서 20~30시간 동안 가열하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다. 이 때, 상기 홍합접착단백질 0.1~10 중량%, 약물 0.1~10 중량% 및 잔탄검 0.1~10 중량%을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 하이드로겔 제형은 (1') 홍합접착단백질, 약물, 비닐피롤리돈(vinyl prrrolidone) 및 메타아클릴레이트(methacrylate)의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; (2') 상기 혼합용액에 AIBN(azobisisobutyronitrile) 및 가교제를 가하고 40~80℃에서 중합한 후, 메탄올로 세척하는 단계; 및 (3') 상기 세척된 중합체를 30~50℃에서 2~4일 동안 건조하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 가교제는 EGDMA(ethyleneglycol dimethacrylate), 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린, 하이드록시에틸아닐린 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 EGDMA를 사용할 수 있다.

상기 전기방사 섬유 제형은 (1") 홍합접착단백질, 약물, 폴리감마글루탐산(polygammaglutamic acid, γ-PGA) 및 히알루론산의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (2") 상기 혼합용액을 전기방사하는 단계;를 포함하여 제조될 수 있다.

상기 전기방사 조건으로는 전압 8~25kV, 방사거리 5~20cm 및 주사기 펌프의 유체속도 0.2~5ml/h의 조건에서 수행될 수 있다.

상기 제형의 제조에 사용할 수 있는 용매는 특별히 제한된 것은 아니며, 증류수, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), TFE(trifluoro ethylene), 아세톤(acetone), MC(methylene chloride), THF(tetrahydro furan), 아세트산(acetic acid), 포름산(formic acid) 등을 사용할 수 있다.

상기 골 지지체는 생체활성 물질을 포함할 수 있다.

상기 생체활성 물질은 항염증, 항산화 또는 골생성 효과를 갖는 천연 및 인공물질일 수 있다. 일 예로, 나노수산화아파타이트, 금 나노입자, 펩타이드, 효소, 전사인자, 소분자약물, 리포좀, 뉴클레오티드, 독소, 항원성 펩티드, 항체, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 선천성(native) 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 프리온(prions), 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것이 바람직하고, 나노수산화아파타이트인 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 골 바인더 또는 상기 골 지지체를 포함하는, 임플란트 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 약물이 적재된 카테콜 화합물-금속의 배위복합체를 포함하는 골 바인더는 생체적합성이 우수할 뿐 아니라, 약물의 방출속도를 제어할 수 있고, 우수한 골 접착력을 나타내므로, 골질이 불량한 환자의 임플란트에 유용하게 사용될 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 따른 골 바인더는 약물이 적재된 카테콜 화합물-금속 배위복합체, 특히 홍합접착단백질 기반의 도파-Fe(Ⅲ) 복합체를 이용하여 제조됨으로써, 생체적합성이 우수하고, 적재된 약물의 배출속도를 제어할 수 있고, 강한 골 접착력을 가지므로, 치주질환의 예방 또는 치료에 효과가 있고, 골질이 불량한 환자의 임플란트 시술에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 재조합 홍합접착단백질 RGD fp-151의 SDS-PAGE 결과 및 동결건조품의 이미지를 나타내는 도이다.
도 2는 실시예 2-1에 따른 RGD fp-151을 포함하는 약물방출제어용 겔(gel)의 제조과정을 나타내는 도이다.
도 3은 실시예 2-1에 따른 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔의 UV 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 4는 실시예 2-1에 따른 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔의 점도를 나타내는 도이다.
도 5는 실시예 2-1에 따른 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔의 시간에 따른 클로르헥시딘 방출 양을 나타내는 도이다.
도 6은 실시예 2-2에 따른 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 팽윤도(swelling ratio)를 나타내는 도이다.
도 7은 실시예 2-2에 따른 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 건조시간에 따른 팽윤도(swelling ratio)를 나타내는 도이다.
도 8은 실시예 2-2에 따른 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 플라즈마 처리에 따른 팽윤도(swelling ratio)를 나타내는 도이다.
도 9는 실시예 2-2에 따른 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 세포독성을 나타내는 도이다.
도 10은 실시예 2-3에 따른 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 광학이미지를 나타내는 도이다.
도 11은 실시예 2-3에 따른 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타내는 도이다.
도 12는 실시예 2-3에 따른 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 응집력을 나타내는 도이다.
도 13은 실시예 3에 따른 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 표면고정된 골 지지체에 대하여 (a) 골 지지체의 SEM 이미지 및 (b) 표면고정된 나노수산화아파타이트의 SEM 이미지를 나타내는 도이다.
도 14는 실시예 3에 따른 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 표면고정된 골 지지체에 대한 XRD 측정결과를 상용 제품(Bio-oss로부터 구매)인 대조군의 XRD 측정결과와 비교하여 나타내는 도이다.
도 15는 실시예 3에 따른 나노-HA가 표면고정된 골 지지체의 기공률에 따른 (a) 주사전자현미경(SEM) 이미지 및 (b) 압축강도를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 도파(DOPA)-함유 재조합 홍합접착단백질(RGD-fp151)의 준비

먼저, 홍합접착단백질 fp-151(서열번호 1)은 자연에 존재하는 홍합접착단백질 fp-1 (Genbank No. Q27409)의 아미노산 서열에서 6회 반복 연결된 데카펩타이드(AKPSYPPTYK)로 이루어진 fp-1(Mytilus mussel foot protein type 1) 변이체를 합성하고, 2개의 fp-1 변이체 사이에 Mgfp-5의 유전자(Genbank No. AAS00463)를 삽입한 후, 대장균으로부터 제조하였다. 상기 홍합접착단백질 fp-151의 제조는 국제특허공개 WO2005/092920에 나타낸 바와 동일하며, 상기 특허문헌은 전체 참조로 본원에 포함된다. 상기 제조된 홍합접착단백질 fp-151의 카르복실 말단(C 말단)에 RGD(Arg Gly Asp)를 포함하는 아미노산을 연결함으로써 홍합접착단백질 RGD-fp151를 제조하였다.

그 후, 티로시나제((mushroom tyrosinase, SIGMA) 효소를 이용한 시험관내(in vitro) 효소 반응을 수행하여, 상기 홍합접착단백질 RGD fp-151의 티로신 잔기를 DOPA(dihydroxyphenylalanine)로 변환하였다. 구체적으로는, 1.50mg/mL의 RGD fp-151 용액 및 100μg/mL의 티로시나제를 버퍼 용액(100 mM 인산나트륨, 20mM 붕산, 25mM 아스코르브산, pH 6.8)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1% 아세트산 용액을 이용하여 투석하였다. 홍합접착단백질 RGD fp-151의 수정 효율 분석하기 위해 아미노산 조성 분석을 수행한 결과, 전체 티로시나제 잔기 중 약 50%가 DOPA로 전환되었음을 확인하였고, SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacryl Amide Gel Electrophoresis)를 수행한 결과 순도 90% 이상의 DOPA-함유 재조합 홍합접착단백질을 제조하였음을 확인하였다.

또한, Fe(Ⅲ)-DOPA 복합체를 제조하가 위하여, 상기 DOPA-함유 재조합 홍합접착단백질 용액에 FeCl₃용액을 가하여 Fe:DOPA가 1:3의 몰(molar) 비가 되도록 혼합함으로써, Fe(Ⅲ)-DOPA 함유-재조합 홍합접착단백질 RGD fp-151를 제조하였다.

상기 실시예 1에 따른 재조합 홍합접착단백질 RGD fp-151의 SDS-PAGE 결과 및 동결건조품의 이미지를 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 홍합접착단백질을 이용한 약물방출제어용 골 바인더의 제조

2-1 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 겔 제형의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 RGD fp-151을 이용하여 약물방출제어용 겔(gel)을 제조하였다. 먼저 증류수(0.2mg/mL)에 용해된 홍합접착단백질 RGD fp-151 0.5 wt%, 잔탄검 2.0 wt%, 클로르헥시딘디하이드로클로라이드(chlorhexidine dihydrochloride) 1.0 wt% 및 증류수에 20%가 용해된 클로르헥시딘디하이드로클로라이드 1.0 wt%을 증류수 95.5wt%에 혼합하여 용해하였다. 그 후, 상기 혼합 용액을 40℃에서 예열된 오븐에서 24시간 동안 유지하여 어닐링(annealing)한 후, 상온에서 7 일 동안 유지함으로써 겔화하였다.

상기 실시예 2-1에 따른 RGD fp-151을 포함하는 약물방출제어용 겔의 제조과정을 도 2에 나타내었다.

2-2 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔 제형의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 RGD fp-151을 이용하여 약물방출제어용 하이드로겔(hydrogel)을 제조하였다. 먼저 유기용매인 메틸 메타아클릴레이트(methyl methacrylate, MMA)를 정제하기 위하여, 50mL MMA 및 50mL NaOH를 분액깔대기에 넣어 혼합한 후 하층을 버리고, 다시 증류수와 혼합한 후 하층을 버리는 과정을 3회 반복 실시하였다. 그 후, 수분을 제거하기위 하여 MgSO₄를 소량 첨가하였고, 감압증류하였다. 정제된 MMA는 바이알에 넣고 봉합하여 보관하였다.

상기 정제된 메틸 메타아클릴레이트(MMA) 및 비닐 피롤리돈(VP)을 1:99의 질량비(w/w%)로 혼합하고, 정제된 개시제 AIBN 0.2 wt%, 가교제 EGDMA 0.2 wt% 및 홍합접착단백질 RGD fp-151를 가하여 혼합 용액을 제조하였고, 이를 질소분위기 하에서 60℃에서 24시간 동안 중합하였다. 생성물을 메탄올(MeOH)로 수 회 세척한 후, 40℃로 예열된 진공오븐에서 3일 동안 건조함으로써 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔을 제조하였다. 또한, 이와 별도로, 상기 혼합용액에 클로르헥시딘디하이드로클로라이드 용액을 혼합한 후, 상기 중합 과정을 실시함으로써 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 하이드로겔을 제조하였다.

2-3 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유 제형의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 RGD fp-151을 이용하여 약물방출제어용 전기방사 섬유(fiber)를 제조하였다. 먼저 홍합접착단백질 RGD fp-151을 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol, HFIP) 2~15wt% 용매에 교반시켜 완전히 용해한 후, 추가로 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA) 용매를 가해 용해함으로써, 홍합접착단백질 RGD fp-151용액을 제조하였다. 마찬가지로. 폴리감마글루탐산(Polygammaglutamic acid, γ-PGA)을 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol, HFIP) 2~15wt% 용매에 교반시켜 완전히 용해한 후, 추가로 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA) 용매를 가해 용해함으로써, γ-PGA 용액을 제조하였다. 또한. 히알루론산(Hyaluronic acid)을 헥사플루오로이소프로판올(Hexafluoroisopropanol, HFIP) 2~15wt% 용매에 교반시켜 완전히 용해하여 히알루론산 용액을 제조하였다.

그 후, 상기 제조한 i) 홍합접착단백질 용액, ⅱ) γ-PGA 용액, 및 ⅲ) 히알루론산 용액을 각각 (1~98% / 1~98% / 1~98%)의 비율로 혼합한 후, 이를 알루미늄 호일위에 전기방사 하였다. 또한, 이와 별도로, 상기 혼합용액에 클로르헥시딘디하이드로클로라이드 용액을 첨가하고 균일하게 혼합한 다음 전기방사하였다. 공정인자로는 전압 8~25kV, 방사거리 5~20cm, 주사기 펌프의 유체속도 0.2~5ml/h로 고정시켰고, 17~23G 크기의 바늘(needle)을 사용하였다. 생성된 나노섬유룰 알루미늄 호일에서 수거한 후, 밀봉하여 보관하였다.

실시예 3. 홍합접착단백질 RGD fp-151 기반의 골 바인더를 포함하는 골 지지체의 제조

상기 실시예 2에서 제조한 홍합접착단백질 RGD fp-151 기반의 골 바인더 및 생체활성 물질을 포함하는 골 지지체를 제조하였다.

먼저, 돼지골 이식재에 상기 실시예 2에서 제조한 골 바인더를 혼합하고, 분산제인 TEP(triethyl phosphate) 및 결합제인 PVB(polyvinyl butyral)을 추가로 혼합한 후, 에탄올(EtOH) 용매에 용해시켰다. 그 후, 상기 혼합물을 볼밀링하여 슬러리를 준비하였고, 이를 폴리우레탄 스펀지 주형에 주입하고, 잉여의 슬러리를 제거한 후, 건조하여 골 지지체를 제조하였다. 그 후, 상기 제조된 골 지지체에 생체활성 물질인 나노수산화아파타이트(nano hydroxyapatite) 용액을 도포하고, 건조함으로써, 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 표면고정된 골 지지체를 제조하였다.

실험예 1. 홍합접착단백질을 이용한 약물방출제어용 골 바인더의 특성분석

1-1 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 겔의 특성분석

상기 실시예 2-1에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔의 UV 스펙트럼을 측정하였고. 이를 대조군인 클로사이트(closite)와 비교하여 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 클로르헥시딘을 포함하는 약물방출제어용 겔의 UV 스펙트럼은은 대조군인 클로사이트의 UV 스펙트럼과 거의 유사한 양상을 나타내었다.

또한, 상기 실시예 2-1에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔의 점도를 브룩필드 점도계를 이용하여 측정하였고, 이를 대조군인 클로사이트(closite) 및 페리오크린(periocline)과 비교하여 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 약물방출제어용 겔(RGD fp-151 미포함)의 점도는 2.45 Paㆍs^-1을 나타내어, 대조군인 클로사이트(closite)의 2.53 Paㆍs^-1와 유사한 값을 나타냈으나, 페리오크린의 24.81 Paㆍs^-1에 비해서는 낮은 값을 보였다. 그러나, 홍합접착단백질 RGD fp-151를 첨가한 경우, DOPA-함유 RGD-fp151 (1.5mg)는 2.92 Paㆍs^-1, 및 Fe(Ⅲ)-DOPA-함유 RGD-fp151 (1.5mg)은 2.93 Paㆍs^-1을 나타내어 점도가 향상된 것을 알 수 있다.

또한, 상기 실시예 2-1에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 약물방출제어용 겔로부터의 클로르헥시딘의 방출 양을 측정하기 위하여, 37℃에서 투석을 수행한 후, 24시간 마다 시료를 채취하여 254nm 파장에서 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 이를 대조군인 클로사이트(closite)와 비교하여 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 약물방출제어용 겔은 대조군인 클로사이트(closite)와 거의 유사한 시간 당 약물 방출양을 나타내는 것을 알 수 있다.

1-2 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 특성분석

상기 실시예 2-2에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 팽윤도(swelling ratio)를 측정하였다. 건조된 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔을 물과 PBS(phosphate buffer saline)의 용액에 각각 첨가한 후, 24, 48 및 72 시간 동안 침지하였다. 과량의 물을 제거한 후, 팽윤된 하이도로겔의 중량을 측정하였고, 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

팽윤도를 하기와 같이 정의하였다.

팽윤도(Sw)= [(Wt - Wd)/Wd],

여기서 Wt는 시간 t에서 팽윤된 하이드로겔의 중량이고, Wd는 건조된 하이드로겔의 중량을 나타낸다.

도 6에 나타난 바와 같이, 하이드로겔의 팽윤도는 용매인 물 또는 PBS에 따라 거의 차이가 없었으며, 또한 침지 후 24시간부터 72시간 사이에는 거의 유사한 값을 나타내었다.

상기 실시예 2-2에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 팽윤도(swelling ratio)를 건조시간에 따라 측정하였다. 건조는 40℃로 예열된 진공오븐에서 1~4일 동안 수행하였고, 건조된 하이드로겔에 대해 침지 후 각각 24시간 및 48시간에서 무게와 길이를 재서 팽윤도를 측정하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 하이드로겔의 팽윤도는 건조 시간에 따라 증가 경향을 나타내다가 건조 3일째부터 포화된 값을 나타내었고. 물 또는 PBS의 용매에 따라서는 거의 차이를 나타내지 않았다. 또한, 침지 후 24시간 이후에 최대 팽윤도에 도달하였다.

상기 실시예 2-2에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 팽윤도(swelling ratio)를 플라즈마 처리에 따라 측정하였다. 플라즈마 처리는 50, 150, 250W에서 15분 동안 수행하였고, 건조된 하이드로겔에 대해 침지 후 24시간 에서 무게와 길이를 재서 팽윤도를 측정하였다. 이의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 하이드로겔의 팽윤도는 플라즈마를 처리하지 않은 대조군과 비교할 때, 플라즈마를 처리한 실험군에서 큰 차이를 나타내지 않았고, 이 결과로부터 플라즈마 처리에 의해 하이드로겔의 팽윤도가 증가하지 않음을 알 수 있다,

상기 실시예 2-2에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 하이드로겔의 세포독성을 측정하였다. 먼저 세포배양배지에 하이드로겔을 24시간 동안 처리한 후, 하이드로겔이 담겨있던 배양배지에 NIN3T3 세포주를 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT 어세이를 이용하여 세포독성을 평가하였고, 이의 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 하이드로겔 처리군의 세포 생존율은 대조군인 하이드로겔 무처리군과 비교할 때 큰 차이를 나타내지 않았고, 90% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 이 결과로부터 본 발명의 하이드로겔의 낮은 세포독성을 알 수 있다.

1-3 홍합접착단백질 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 특성분석

상기 실시예 2-3에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 광학이미지를 도 10에 나타내었고, 주사전자현미경(SEM) 이미지를 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유는 나노크기의 섬유 집합체이기 때문에 높은 비표면적을 가지며, 3차원적 다공성 부직포 구조인 것을 알 수 있다.

상기 실시예 2-3에서 제조한 RGD fp-151를 포함하는 전기방사 섬유의 응집력을 평가하였다. 먼저, 각각 0.25g의 골이식재 시료 및 1 cm×2 cm 크기의 전기방사 시료에 400μL 생리식염수를 가한 후, 이들을 하나로 뭉치고 핀셋으로 들어올렸다. 이의 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 골이식재 시료가 부착된 전기방사 섬유가 핀셋에 의해 잘 들어올려 지는것을 확인하였고, 이 결과로부터 골이식재 시료에 대한 전기방사 섬유의 강한 응집력을 알 수 있다.

실험예 2. 골 지지체의 특성 분석

2-1 형태학적 및 구조적 특성 분석

상기 실시예 3에 따른 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 표면고정된 골 지지체에 대하여 (a) 골 지지체의 SEM 이미지 및 (b) 표면고정된 나노수산화아파타이트의 SEM 이미지를 도 13에 나타내었다.

도 13의 (a)에 나타난 바와 같이, 골 지지체의 기공 크기는 약 400 μm 이상이고, 기공률은 74.17 ± 0.43%으로 나타났으며, 독립 기공은 거의 없으며 대부분 상호 연결된 기공을 나타내었다.

또한 도 13의 (b)에 나타난 바와 같이, 골 지지체의 표면에 약 15 μm의 두께의 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 균일하게 고정되어 있는 것을 확인하였다.

상기 실시예 3에서 제조한 나노수산화아파타이트(나노-HA)가 표면고정된 골 지지체에 대한 XRD 측정결과를 상용 제품(Bio-oss로부터 구매)인 대조군과 비교하여 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 골 지지체는 대조군의 골 지지체와 동일한 XRD 측정결과를 나타내었고, 동일한 나노수산화아파타이트(나노-HA) 구조를 가졌음을 알 수 있다.

2-2 중금속 성분 분석

상기 실시예 3에서 제조한 나노-HA가 표면고정된 골 지지체에 대한 ICP 분석을 통해 중금속의 함량을 분석하였고, 이의 결과를 표 1에 나타내었다.

	As	Cd	Pb	Hg
측정값 (ppm)	N.D	N.D	N.D	N.D
MDL	0.5	0.5	5.0	1.0

여기서, N.D는 측정 불가, MDL은 검출한계를 의미한다.

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 골 지지체에서 중금속(As, Cd, Pb 및 Hg) 성분이 거의 검출되지 않았음을 알 수 있다.

2-3 기계적 특성 분석

먼저, 골 지지체의 기공률(P)을 하기 식 (1) 및 (2)에 따라 계산하였다.

(1) Db (g/㎤) = M (g) / V (㎤)

(2) P (%) = (1-Db/Dth) x 100, 여기서 P는 기공률, Db는 벌크(bulk) 밀도, Dh는 이론 밀도, M은 질량, 및 V는 부피를 나타낸다.

또한, 골 지지체의 압축 강도를 하기 식 (3)에 따라 계산하였다.

(3) K = 4F/πd², 여기서 F는 시편의 파절시 최대하중(N), d는 시편의 직경(mm)을 나타낸다.

상기 실시예 3에 따른 나노-HA가 표면고정된 골 지지체의 기공률에 따른 (a) 주사전자현미경(SEM) 이미지 및 (b) 압축강도를 도 15에 나타내었다.

도 15의 (a)에 나타나나 바와 같이, 기공률이 68%이하인 경우는 독립된 기공이 형성되어 상호 연결된 기공의 양이 감소되는 것으로 나타났다.

또한, 도 15의 (b)에 나타난 바와 같이, 기공률이 감소함에 따라 압축강도는 점점 증가하는 경향을 나타내었다. 결론적으로, 기공률이 감소함에따라 압축강도는 증가하나 독립 기공이 형성되어 상호 연결된 기공의 양은 감소되는 결과를 나타내었다.

본 발명의 골 지지체의 기공률에 따른 압축강도를 표 2에 나타내었다.

기공률(%)	압축강도 (Mpa)
88.7 ± 0.50	1.81 ± 0.78
78.2 ± 0.54	20.5 ± 4.21
74.17 ± 0.43	25.03 ± 1.52
71.62 ± 0.82	28.4 ± 2.14
68.11 ± 0.25	33.4 ± 5.29

상기 결과로부터 본 발명의 골 지지체는 기공이 매우 잘 발달되고, 압축강도가 우수함을 알 수 있다.

2-4 비-세포독성 평가

상기 실시예 3에서 제조한 나노-HA가 표면고정된 골 지지체에 대해 비-세포독성 시험을 평가하였다.

먼저, 4g 골 지지체을 20mL 생리식염수 및 면실유에서 용출한 용출물을 시험액으로 사용하였다. 그 후, L-929 세포를 이용한 세포 배양에 기반하여 하기 평가실험을 수행하였다. 37℃에서 5% CO₂ 및 95% 공기의 습한 분위기에서 L-929 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS; Invitrogen), 50μg/mL 스트렙토마이신(Sigma Aldrich) 및 50 unit/mL 페니실린(Sigma Aldrich)으로 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM; Invitrogen)에서 배양하고 유지하였다. L-929 세포의 증식은 6-웰 플레이트(well plat)를 이용하여 분석하고, MTT 분석에 의해 결정하였다. 먼저, 웰 당 1×10⁵개의 세포를 6-웰 플레이트(well plat)에 분주하여 48시간 동안 배양한 후, 상기 용출물을 50%, 25%, 12.5%, 6.3%, 3.1%, 1.5% 로 희석하여 배양된 세포에 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 인산완충용액으로 세척하고 MTT 분석을 통해 정량화하였다.

상기 평가결과, 본 발명의 나노-HA가 표면고정된 골 지지체는 L-929 세포의 생존율 및 세포 증식에 어떠한 영향을 끼치지 않은 것으로 나타났다. 이 결과는나노-HA가 표면고정된 골 지지체를 L-929 세포 세포에 24시간 동안 처리해도, 아무런 영향을 끼지치 않는다는 것을 나타낸다.

2-5 동물 골이식 평가

상기 실시예 3에서 제조한 나노-HA가 표면고정된 골 지지체에 대해 동물 골이식 시험을 평가하였다. 대조군으로는 "의료기기의 생물학적 안전에 관한 공통기준규격" 에서 제시한 폴리에틸렌(polyethylene)을 사용하였고, 시험 시료와 대조군인 폴리에틸렌을 2mm 직경과 6mm 길이의 원주형으로 제작한 후, EO 가스로 멸균하였다.

먼저, 토끼를 호흡마취하고, 시험 동안 토끼의 맥박 및 심박수를 확인하여, 토끼의 건강 상태를 확인하였다. 이식 부위인 토끼의 뇌경골을 삭모하고, 베타딘으로 소독한 후, 뇌경골의 피질 부분을 노출시키고, 드릴을 이용하여 골 지지체를 삽입할 수 있는 적당한 구멍을 내었다. 본 발명의 골 지지체를 대조군과는 평행적으로 반대편에 이식한 후, 노출된 경골의 피질부분을 덮어 봉합하여 토끼를 안정시켰다. 그 후, 12주 동안 이식하였고, 시험기간 동안 토끼를 관찰하고, 국소 또는 전신 부작용이 없는지를 확인하였다. 시험 종료 후, 토끼를 안락사시키고 시험 부위를 노출시켜 주변 조직의 괴사나 변형 여부를 육안으로 관찰하였다. 그 후, 주변조직의 상태를 확인하고, 이식부위를 수거한 후, 10% 포르말린 용액으로 처리해 조직병리학적 H&E 염색을 수행하였다.

상기 평가결과, 본 발명의 나노-HA가 표면고정된 골 지지체를 이식한 경우, 대조군인 폴리에틸렌을 이식한 경우에 비해, 뼈 재생이 1.5배 활성화된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 본 발명의 골 지지체내의 홍합접착단백질 RGD fp-151 기반의 골 바인더가 골 이식재를 고정해 줄 뿐 아니라 뼈 재생까지 도운 것을 알 수 있다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION Kang, Ho Chang <120> Mussel adhesive protein-derived bone binder for preventing or treating periodontal disease and method for preparing the same <130> DPP20102958KR <150> KR2009-0078666 <151> 2009-08-25 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-151 <400> 1 Met Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala 20 25 30 Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro 35 40 45 Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ser Ser Glu 50 55 60 Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His Tyr His Ser 65 70 75 80 Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr Lys Gly Lys 85 90 95 Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys Asn Ser Gly 100 105 110 Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg Lys Gly Tyr 115 120 125 Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Ala Lys Pro Ser 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Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro 130 135 140 Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Leu 165 170 <210> 4 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-3 <400> 4 Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp 20 25 30 Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-5 <400> 5 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment sequence derived from FP-1 <400> 6 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1510 1514 1519 <210> 7 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP-1 <400> 7 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys 20 25 30 Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr 35 40 45 Tyr Lys Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 50 55 60 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 1 <400> 8 Arg Gly Asp 1 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 2 <400> 9 Arg Gly Asp Ser 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 3 <400> 10 Arg Gly Asp Cys 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 4 <400> 11 Arg Gly Asp Val 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RGD Group 5 <400> 12 Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 13 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Claims

홍합접착단백질 및 약물을 포함하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 홍합접착단백질은 티로신 잔기가 카테콜 화합물로 변환된 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 2항에 있어서,
상기 카테콜 화합물은 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA), 도파 퀴논(Dopa o-quinone), 토파(2,4,5-trihydroxyphenylalanine, TOPA), 토파 퀴논(Topa quinone) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 2항에 있어서,
상기 카테콜 화합물은 금속과 배위 결합하여 카테콜 화합물-금속의 배위복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 4항에 있어서,
상기 카테콜 화합물-금속의 배위복합체는 도파(DOPA)-Fe(Ⅲ) 복합체인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 4항에 있어서,
상기 금속은 철(iron), 티타늄(titanium), 바나듐(vanadium), 크롬(chrome), 망간(manganese), 코발트(cobalt), 니켈(nickel), 지르코늄(zirconium), 니오브(niobium), 몰리브덴(molybdenum), 테크네튬(technetium), 루테늄(ruthenium), 로듐(rhodium), 팔라듐(palladium), 은(silver), 하프늄(hafnium), 탄탈(tantalum), 텅스텐(tungsten), 레늄(rhenium), 오스뮴(osmium), 이리듐(iridium), 백금(platium) 및 금(gold)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 홍합접착단백질은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 홍합접착단백질은 상기 홍합접착단백질의 카르복실말단(carboxyl-terminal) 또는 아미노말단(amino-terminal)에 RGD를 포함하는 3 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드가 연결된 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 약물은 항균제 또는 항염증제인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 9항에 있어서,
상기 항균제는 클로르헥시딘, 헥사메딘, 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 스피라마이신, 반코마이신, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 이미페넴 및 후시딕산품으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 치주질환은 치은염 또는 치주염인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 골 바인더는 구개골, 상악골, 하악골, 악관절, 치조골 또는 치주낭에 접착하는 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 골 바인더는 총 중량 대비 1 내지 50 중량%의 홍합접착단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 골 바인더는 약물의 방출속도를 제어하는 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
제 1항에 있어서,
상기 골 바인더는 겔, 하이드로겔, 섬유, 분말, 크림, 팩, 시트 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 제형인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더.
(1) 홍합접착단백질, 약물 및 잔탄검의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (2) 상기 혼합용액을 30~50℃에서 20~30시간 동안 가열하는 단계;를 포함하는, 겔 제형의 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
제 16항에 있어서,
상기 (1)단계에서, 홍합접착단백질 0.1~10 중량%, 약물 0.1~10 중량% 및 잔탄검 0.1~10 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
(1') 홍합접착단백질, 약물, 비닐피롤리돈(vinyl prrrolidone) 및 메타아클릴레이트(methacrylate)의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; (2') 상기 혼합용액에 AIBN(azobisisobutyronitrile) 및 가교제를 가하고 40~80℃에서 중합한 후, 메탄올로 세척하는 단계; 및 (3') 상기 세척된 중합체를 30~50℃에서 2~4일 동안 건조하는 단계;를 포함하는, 하이드로겔 제형의 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
제 18항에 있어서,
상기 (2')단계에서, 가교제는 EGDMA(ethyleneglycol dimethacrylate), 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산, 도파민, 에피네프린 및 하이드록시에틸아닐린인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
(1") 홍합접착단백질, 약물, 폴리감마글루탐산(polygammaglutamic acid, γ-PGA) 및 히알루론산의 혼합물을 용매에 용해시키는 단계; 및 (2") 상기 혼합용액을 전기방사하는 단계;를 포함하는, 전기방사 섬유 제형의 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
제 20항에 있어서,
상기 (2")단계에서, 전기방사는 전압 8~25kV, 방사거리 5~20cm 및 주사기 펌프의 유체속도 0.2~5ml/h의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
제 16항, 제 18항 및 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용매는 증류수, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 디메틸포름아마이드(dimethyl formamide), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide), TFE(trifluoro ethylene), 아세톤(acetone), MC(methylene chloride), THF(tetra hydro furan), 아세트산(acetic acid) 및 포름산(formic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 것인, 치주질환의 예방 또는 치료용 골 바인더의 제조방법.
제 1항의 골바인더를 포함하는, 골 지지체.
제 23항에 있어서,
상기 골 지지체는 생체활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 지지체.
제 24항에 있어서,
상기 생체활성 물질은 나노수산화아파타이트, 금 나노입자, 펩타이드, 효소, 전사인자, 소분자약물, 리포좀, 뉴클레오티드, 독소, 항원성 펩티드, 항체, 호르몬, 운반 단백질, 면역글로불린, 구조 단백질, 운동 기능 단백질, 수용체, 신호(signaling) 단백질, 저장 단백질, 막 단백질, 막횡단(transmembrane) 단백질, 내부(internal) 단백질, 외부(external) 단백질, 분비 단백질, 바이러스 단백질, 선천성(native) 단백질, 당 단백질, 절단된 단백질, 이황화 결합을 갖는 단백질, 단백질 복합체, 화학적으로 개질된 단백질, 프리온(prions), 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골 지지체.
제 1항의 골 바인더 또는 제 23항의 골 지지체를 포함하는, 임플란트 키트.