KR20100052499A - 콜라겐-관련 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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마벨 알라미노 세자스
브루스 이. 메리아노프
토마스 마탈레나스
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Abstract

본 발명은 콜라겐 모방 삼중 나선 및 이의 피브릴로의 비-공유적 자기-조립이 가능한, N- 및 C-말단에 소수성 아미노산기를 갖는 콜라겐-관련 폴리펩티드(CRP) 및 이의 합성, 사용 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

콜라겐-관련 펩티드 및 이의 용도{Collagen-related peptides and uses thereof}
본 발명은 N- 및 C-말단에 소수성 아미노산기를 갖는 콜라겐-관련 펩티드(CRP)에 관한 것이며 콜라겐 모방 3량체(collagen mimetic trimer) 및 이의 피브릴 및 이의 합성, 사용 방법 및 조성물에 관한 것이다.
포유류에서 가장 풍부한 단백질인 콜라겐은 신체 내에 넓게 분포되어 있으며 콜라겐의 로프형 삼중 나선 및 조립된 피브릴의 강성은 콜라겐이 본질적인 구조적 역할을 수행할 수 있게 하여, 조직에 기계적 강도를 제공하는 것을 돕는다. 가장 풍부한 피브릴 콜라겐인 타입 I, II 및 III은 피부, 뼈, 연골, 힘줄, 인대, 혈관 및 눈의 유리체에서 발생한다. 더욱 복잡한 비-피브릴 콜라겐, 예를 들어, 타입 IV 및 VI는 2차원 및 3차원 네트워크를 형성하여, 신체의 세포간 조직을 지지하며 상피 및 내피 세포층이 부착할 수 있는 기저막의 기본적 구성요소이다.
일반적으로, 피브릴 콜라겐은 서로 감겨서 삼중-나선을 형성하는 3개의 별도의 펩티드 가닥을 포함한다(문헌[Rich A and Crick FHC, J. Mol . Biol ., 1961, 3, 483-506]). 기하학적 구속 및 콜라겐 삼중-나선의 안정성은 매 세번째의 아미노산이 글리신 (Gly 또는 G)이어서, 반복적인 -GXY- 서열을 생성할 것을 요구하며, 여기서 X 및 Y는 각각 빈번히 프롤린 (Pro 또는 P) 및 하이드록시프롤린(Hyp 또는 O)을 나타낸다. 콜라겐 삼중 나선은 전형적으로 길이가 300 ㎚를 넘으며 1000 개의 아미노산을 초과한다. 그러한 콜라겐 삼중 나선의 조립으로부터 생성되는 피브릴은 길이가 1 ㎛를 초과한다.
건강하고 손상되지 않은 조직에서, 콜라겐은 혈관 벽 및 이의 주위 조직을 지지하며 내피세포층에 의해 가려지므로, 혈류 내에서 순환하며 응고 과정을 조절하는 혈소판과 접촉할 수 없다. 그러나, 기계적 외상 또는 질병을 가진 혈관벽에서 죽상경화판의 파열의 결과로 발생하는 혈관벽의 손상은 내피 세포층을 제거하고 콜라겐이 혈소판 및 기타 혈액 혈장 단백질과 상호작용하는 것을 허용할 수 있으므로 응집 및 부착을 위해 혈소판을 활성화시킬 수 있다. 이들 과정은 응고 반응에 필수적이며, 본 기술 분야에서 잘 이해된다.
삼중 나선 형태
콜라겐은 이들 단백질의 특별한 구조적 특징 및 생물학적 중요성 때문에 오랫동안 과학자들을 매료시켜 왔다. 콜라겐 삼중 나선의 구조, 안정성 및 기능에 대한 연구는합성 콜라겐-관련 펩티드의 사용에 의해 촉진되었다 (문헌[Feng Y, Melacini G, Taulane JP and Goodman M, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 10351-10358]; 문헌 [Fields GB and Prockop DJ, Biopolymers 1996, 40, 345-357] 및 그 안에서 인용된 참고문헌; 문헌[Holmgren SK, Taylor KM, Bretscher LE and Raines RT, Nature 1998, 392, 666-667]; 문헌[Jenkins CL and Raines RT, Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 49-59]; 및 문헌[Shah NK, Ramshaw JAM, Kirkpatrick A, Shah C and Brodsky, B. Biochemistry 1996, 35, 10262-10268]). 예를 들어, 특이적 인식 모티프를 포함하는 합성 삼중-나선 펩티드의 사용은 콜라겐의 수용체-결합 특성이 상세히 조사될 수 있도록 하였다. 부가적으로, 콜라겐의 삼중-나선 형태는 혈소판 및 다른 콜라겐 수용체에 의한 콜라겐의 인식에 있어서 선결조건일 수 있다. 더욱이, 소정의 삼중-나선 서열은 반복되는 트리플렛(triplet) 글리신-프롤린-하이드록시프롤린(GPO) 서열을 포함하는, GpVI와 같은 혈소판 수용체와 직접 상호작용할 수 있다. 간단한 콜라겐-관련 펩티드의 경우, (GPO)10 서열은 58 내지 70℃의 융점을 가진, 열적으로 안정한 삼중-나선을 형성한다. 하이드록시프롤린 아미노산은 물에 의해 매개되는 수소 결합의 형성을 촉진함으로써 그리고 입체전자 효과를 제공함으로써 삼중-나선 구조를 안정화시킨다.
더욱이, 국제특허 공개 WO07/052067호는 타입 III 콜라겐 도메인을 커버하며 혈소판의 본 빌레브랜드(von Willebrand) 인자의 A3 도메인에 대한 친화성에 기초한 혈소판 부착 활성을 가진 일련의 짧은 삼중-나선 콜라겐 펩티드를 개시한다. 국제특허 공개 WO07/017671호는 펩티드 간의 가교결합없이 혈소판을 활성화시킬 수 있는 GPO 반복을 함유하는 3량체 펩티드를 개시한다. 국제특허 공개 WO06/098326호는POG 폴리펩티드 및 인산칼슘 화합물로부터 제조된 합성 콜라겐 필름을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005206542호는 폴리펩티드 서열 Pro-X-Gly 및 Y-Z-Gly (여기서, X 및 Z는 프롤린 (Pro) 및 하이드록시프롤린 (Hyp)을 나타내며 Y 는 카르복실기를 가진 아미노산 잔기를 나타냄)를 포함하는 콜라겐 조직 구조를 개시한다. 일본 특허 공개 제2005126360호는 콜라게나제 억제를 위해 고체상 합성에 의해 제조되는 폴리펩티드 서열 Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (여기서 Y는 Gln, Asn, Leu, Ile, Val 또는 Ala을 나타내며; Z는 Ile 또는 Leu을 나타냄)를 함유한 화장품 및 식품 조성물을 개시한다. 미국 특허 공개 제2003/162941호 (JP 2003321500호에 대응함) 는 삼중 나선 구조를 가진, 서열 Pro-Y-Gly (여기서 Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄)를 가진 콜라겐성 폴리펩티드를 개시한다. 미국 특허 제5,973,112호 (WO99/10381호에 해당함) 는 서열 Xaa-Xbb-Gly (여기서 Xaa는 아미노산 잔기를 나타내며; 및 Xbb는 4(R)-플루오로-L-프롤린 (Flp), 4(S)-플루오로-L-프롤린, 4,4-다이플루오로프롤린, 또는 아세틸, 메실 또는 트라이플루오로메틸 변형 하이드록시프롤린을 나타냄)의 트라이펩티드 콜라겐 모방체를 개시한다. 콜라겐 모방체 (Pro-Flp-Gly)10는 콜라겐-관련 삼중 나선 Pro-Pro-Gly 및 Pro-Hyp-Gly에 비해 증가된 안정성을 나타냈다.
자기 조립
분리된 콜라겐 리간드 서열에서 삼중-나선 구조 형성을 유도하기 위하여 몇몇 전략이 이용되었다(국제특허 공개 WO98/007752호에 대응하는 미국 특허 제6,096,863호, 및 그 안의 참고문헌에서 토의됨). 분리된 콜라겐 서열에서 삼중-나선 구조 형성은 콜라겐성 서열의 양쪽 말단에 많은 Gly-Pro-Hyp 반복을 추가하여 유도될 수 있다. 그러나, Gly-Pro-Hyp 반복으로 이루어진 펩티드 서열이 50%를 초과할 때조차, 생성된 삼중-나선은 생리학적 조건에서 생존하기에 충분한 열적 안정성을 갖지 않을 수 있다. 3개의 펩티드 사슬의 C-말단 영역 사이에 공유 결합을 도입하여 삼중-나선 구조의 실질적 안정화가 이루어질 수 있지만, 생성된 "분지형" 삼중-나선 펩티드 화합물의 큰 크기(90개 내지 125개의 아미노산 잔기)는 이들의 합성과 정제를 어렵게 만든다(미국 특허 제6,096,863호 및 그 안의 참고문헌에서 토의됨). 덴드리머 조립 또는 공유 가교결합을 통해 올리고머화된 CRP는 고정화되지 않고서 혈소판 응집을 효과적으로 유도할 수 있는 반면, (POG)10 서열을 가진 것들과 같은 덜 조직화된 CRP는 이러한 특성이 부족하다 (문헌[Rao GHR, Fields CG, White JG and Fields GB, J. Biol. Chem. 1994, 269, 13899-13903]; 문헌[Morton LF, Hargreaves PG, Farndale RW, Young RD and Barnes MJ, Biochem. J. 1995, 306, 337-344]; 문헌[Knight CG, Morton LF, Onley DJ, Peachey AR, Ichinohe T, Okuma M, Farndale RW and Barnes MJ. Cardiovasc. Res. 1999, 41, 450-457]). 자기-조립이 가능한 CRP의 이용가능성과 유용성은 그들의 제조 용이성, CRP 구조의 단순함 및 안정성 및 응집 활성에 대한 능력에 좌우되었다. 합성이 어렵고 상대적으로 복잡할 수 있지만, 마이크로미터 규모의 CRP-계 물질이 시스테인 노트(knot)를 이용한 공유적으로 부착된 삼중-가닥 실체의 자기-조립으로부터 얻어졌다 (문헌[Koide T, Homma DL, Asada S and Kitagawa K, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5230-5233]; 및, 문헌[Kotch F and Raines RT, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2006, 103, 3028-3033]).
따라서, 펩티드 배열 및 피브릴 개시 및 증식을 촉진하는 콜라겐-유사 구조 모티프를 구축하는 간단한 방법이 여전히 요구된다. 구체적으로, 쉽게 합성할 수 있으며 콜라겐-모방 특성을 가진 3량체로의 비-공유적 자기-조립이 가능한 상대적으로 짧은 단일-가닥 CRP가 요구된다.
본 발명은 넓게는 콜라겐-모방 특성을 가진 3량체로의 비-공유적 자기-조립이 가능한 콜라겐 관련 폴리펩티드(CRP)에 관한 것이다.
CRP는 각 단부에 N-말단 및 C-말단 합성 또는 천연 소수성 아미노산을 가지며, 여기서 상기 아미노산은 피브릴 증식을 개시하여 콜라겐-유사 피브릴을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 I의 CRP에 관한 것이다:
B-(Z)m-X
상기 식에서,
Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 트리플렛이며;
J는 독립적으로 각각의 트리플렛 Z를 위해 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
예를 들어, 만일 Z가 Gly-Pro-J이고 m이 8이면, 8개의 J 치환기의 각각은 독립적으로 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로, 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 개시된 CRP는 혈소판 응집을 개시하기 위해 그리고 출혈 질환의 치료 및 진단을 위해 사용될 수 있는 합성 콜라겐의 구성에서 유용하다. 본 발명의 CRP는 조성물에서 지혈제로서 또한 유용하다.
도 1은 혈소판 응집 자극에 대하여 콜라겐과 비교한, 서열 번호 25를 가진 CRP, 서열 번호 26을 가진 CRP, 서열 번호 27을 가진 CRP, 서열 번호 28을 가진 CRP, 서열 번호 34를 가진 CRP 및 서열 번호 35를 가진 CRP의 활성을 나타내는 투여량 반응 곡선.
본 발명은 넓게는 콜라겐-모방 특성을 가진 3량체로의 비-공유적 자기-조립이 가능한 CRP에 관한 것이다.
CRP는 각 말단에 N-말단 및 C-말단 합성 또는 천연 소수성 아미노산을 가지며, 여기서 상기 아미노산은 피브릴 증식을 개시하여 콜라겐-유사 피브릴을 형성할 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 I의 CRP에 관한 것이다:
B-(Z)m-X
상기 식에서,
Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 트리플렛이며;
J는 독립적으로 각각의 트리플렛 Z를 위해 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
예를 들어, 만일 Z가 Gly-Pro-J이고 m이 8이면, 8개의 J 치환기의 각각은 독립적으로 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로, 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐-Gly, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 CRP는 3량체로의 비-공유적 자기-조립이 가능하다. 생성된 CRP 3량체는 비-공유적인, 방향족-스태킹(aromatic-stacking) 및 정렬된 소수성 상호작용에 의해서 콜라겐-유사 피브릴로의 더욱 고도의 정렬된 자기-조립이 또한 가능하다.
본 발명의 실시 형태는 복수의 본 발명의 CRP를 포함하는 콜라겐-유사 피브릴 물질을 포함한다.
본 발명의 실시 형태는 복수의 본 발명의 CRP를 포함하는 콜라겐-유사 피브릴 물질을 포함하며, 여기서 CRP는 복수의 CRP 3량체의 형태로 콜라겐-유사 피브릴 물질 중에 존재한다.
본 발명의 실시 형태에서, CRP 3량체는 동종3량체(homotrimer)이며, 여기서 3개의 CRP는 상동성이다.
본 발명의 실시 형태에서, CRP 3량체는 이종3량체(heterotrimer)이며, 여기서 3개의 CRP는 이종성이다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택된 트리플렛이며, 여기서 J는 적어도 4개의 연속하는 트리플렛 Z 에서 Hyp이다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 J는 독립적으로 각 트리플렛 Z를 위해 Hyp, fPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 J는 독립적으로 각 트리플렛 Z를 위해 Hyp 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 m은 10이다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸, 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 B는 F5Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 하이드록시, 메틸, 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 B는 F5Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 하이드록시, 메틸, 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨) 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 B는 F5-Phe, Phe 및 Leu로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 X는 Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸, 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 실시 형태는 화학식 I의 CRP이며, 여기서 X는 Phe이다
본 발명의 실시 형태는 하기로부터 선택된 화학식 I의 CRP이다:
서열 번호 1: B-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)n-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 2: B-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)p-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임];
서열 번호 3: B-(Gly-Pro-Hyp)12-(Gly-Pro-J)q-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수임];
서열 번호 4: B-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)n-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 5: B-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)p-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임];
서열 번호 6: B-(Pro-Hyp-Gly)12-(Pro-J-Gly)q-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수임];
서열 번호 7: B-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)n-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 8: B-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)p-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임]; 또는
서열 번호 9: B-(Hyp-Gly-Pro)12-(J-Gly-Pro)q-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수임].
대안적 실시 형태에서, 화학식 I의 CRP는 하기로부터 선택된다:
서열 번호 10: B-(Gly-Pro-J)n-(Gly-Pro-Hyp)4-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 11: B-(Gly-Pro-J)p-(Gly-Pro-Hyp)8-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임];
서열 번호 12: B-(Gly-Pro-J)q-(Gly-Pro-Hyp)12-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수임];
서열 번호 13: B-(Pro-J-Gly)n-(Pro-Hyp-Gly)4-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 14: B-(Pro-J-Gly)p-(Pro-Hyp-Gly)8-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임];
서열 번호 15: B-(Pro-J-Gly)q-(Pro-Hyp-Gly)12-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수임];
서열 번호 16: B-(J-Gly-Pro)n-(Hyp-Gly-Pro)4-X [여기서, n은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11로부터 선택된 정수임];
서열 번호 17: B-(J-Gly-Pro)p-(Hyp-Gly-Pro)8-X [여기서, p는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7로부터 선택된 정수임]; 또는
서열 번호 18: B-(J-Gly-Pro)q-(Hyp-Gly-Pro)12-X [여기서, q는 0, 1, 2 또는 3로부터 선택된 정수임].
또 다른 실시 형태에서, 화학식 I의 CRP는 하기로 부터 선택된다:
서열 번호 19: B-(Gly-Pro-J)r-(Gly-Pro-Hyp)4-(Gly-Pro-J)s-X [여기서, r 및 s는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택된 정수이며, (Gly-Pro-J)r, (Gly-Pro-J)s 및 (Gly-Pro-Hyp)4의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음];
서열 번호 20: B-(Gly-Pro-J)t-(Gly-Pro-Hyp)8-(Gly-Pro-J)u-X [여기서, t와 u는 각각 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수이며, (Gly-Pro-J)t, (Gly-Pro-J)u 및 (Gly-Pro-Hyp)8의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음];
서열 번호 21: B-(Pro-J-Gly)r-(Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-J-Gly)s-X [여기서, r과 s는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택된 정수이며, (Pro-J-Gly)r, (Pro-J-Gly)s 및 (Gly-Pro-Hyp)4의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음];
서열 번호 22: B-(Pro-J-Gly)t-(Pro-Hyp-Gly)8-(Pro-J-Gly)u-X [여기서, t와 u는 각각 1, 2, 3, 4, 5 또는 6으로부터 선택된 정수이며, (Pro-J-Gly)t, (Pro-J-Gly)u 및 (Gly-Pro-Hyp)8의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음];
서열 번호 23: B-(J-Gly-Pro)r-(Hyp-Gly-Pro)4-(J-Gly-Pro)s-X [여기서, r과 s는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택된 정수이며, (J-Gly-Pro)r, (J-Gly-Pro)s 및 (Gly-Pro-Hyp)4의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음]; 또는
서열 번호 24: B-(J-Gly-Pro)t-(Hyp-Gly-Pro)8-(J-Gly-Pro)u-X [여기서, t와 u는 각각 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6으로부터 선택된 정수이며, (J-Gly-Pro)t, (J-Gly-Pro)u 및 (Gly-Pro-Hyp)8의 조합은 (Z)15를 초과하지 않음].
소정의 실시 형태에서, 화학식 I의 CRP는 하기로 부터 선택된다:
서열 번호 25: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe;
서열 번호 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe;
서열 번호 27: Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe;
서열 번호 31: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe;
서열 번호 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe; 및
서열 번호 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe.
본 발명의 토의에서, 소정의 다른 폴리펩티드 서열은 하기를 포함한다:
비교 서열 번호 28: Gly-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly;
비교 서열 번호 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly;
참고 서열 번호 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-Gly)5;
참고 서열 번호 34: (Pro-Hyp-Gly)10; 및
비교 서열 번호 35: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Ph.
예로서, 서열 번호 25를 가진 화학식 I의 CRP는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00001
본 발명은 추가로 콜라겐-유사 피브릴 물질을 형성하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 복수의 화학식 I의 CRP를 선택하는 단계, 및 복수의 3량체, 초분자 복합체 및 콜라겐-유사 피브릴의 형성을 개시하고 증식하기에 유리한 수성 조건 하에서 복수의 CRP를 혼합하는 단계를 포함한다.
본 방법의 일 실시 형태에서, 복수의 CRP 3량체는 복수의 동종3량체, 이종3량체 또는 이의 혼합물로부터 선택된다.
본 방법의 실시 형태에서, 콜라겐-유사 피브릴 물질은 복수의 초분자 복합체 또는 콜라겐-유사 피브릴로부터 선택된다.
본 방법의 실시 형태에서, 유리한 수성 조건은 약 50℃ 미만의 온도의 물에서 또는 염 수용액에서 복수의 콜라겐-관련 펩티드를 혼합하는 것을 추가로 포함한다.
본 방법의 실시 형태에서, 염 수용액은 완충된 염수, 인산염 완충 용액, 행크 균형 염 용액(Hank's balanced salts solution), 인산염-완충된 염수, 트리스 완충된 염수, 헤페스(Hepes) 완충된 염수 및 이의 혼합물로부터 선택된다.
본 방법의 실시 형태에서, 염 수용액은 PBS이다.
정의
본 발명의 실시 형태와 관련하여, 본 명세서 전반에 제공된 하기 정의 및 기타는 당업자의 지식 내에서, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "트리플렛"은 3개의 아미노산 Gly, Pro 및 J를 가진 세트 Gly-Pro-J, 3개의 아미노산 Pro, J 및 Gly를 가진 세트 Pro-J-Gly, 및 3개의 아미노산 J, Gly 및 Pro를 가진 세트 J-Gly-Pro에 의해 정의되는 바와 같이, 3개의 아미노산의 세트를 말한다.
용어 "동종3량체"는 화학식 I의 세 개의 동일한 CRP에 의해 형성된 삼중 나선을 말한다.
용어 "이종3량체"는 화학식 I의 CRP에 의해 형성된 삼중 나선을 말한다.
용어 "3량체"는 화학식 I의 세 개의 CRP에 의해 형성된 삼중 나선을 말한다.
용어 "초분자 복합체"는 콜라겐-유사 피브릴 및 피브릴 구조를 비롯한 다양한 형태의 조립된 CRP 3량체를 말한다.
용어 "Ala" 또는 "A"는 아미노산 알라닌을 말하며; "Cha"는 모방 아미노산 사이클로헥실-알라닌을 말하며; "Chg"는 모방 아미노산 사이클로헥실-글리신을 말하며; "F5-Phe"는 모방 아미노산 1,2,3,4,5-F5-페닐-알라닌을 말하며; "fPro"는 모방 아미노산 (4R)-플루오로프롤린을 말하며; "Gly" 또는 "G"는 아미노산 글리신을 말하며; "Hyp" 또는 "O"는 모방 아미노산 (4R)-하이드록시프롤린을 말하며; "Met"는 아미노산 메티오닌을 말하며; "mPro"는 모방 아미노산 (4S)-메틸프롤린을 말하며; "Phe" 또는 "F"는 아미노산 페닐알라닌을 말하며; "Pro" 또는 "P"는 아미노산 프롤린을 말하며; 및, "Tyr"은 아미노산 티로신을 말한다.
본 발명의 토의
소정의 자기-조립 단량체가 개시되어 있으며, 여기서 메타-치환된 페닐렌 다이옥삼산 다이에틸 에스테르 단량체는 고체상 x-선에 의하면 H-결합(말단-대-말단(end-to-end))을 통해 나선 사슬로 자기-조립하며, 이웃한 나선들은 π-스태킹에 의해 측면-대-측면(side-to-side)으로 배열되는 것으로 나타났다 (문헌[Blay G, Fernandez I, Pedro JR, Ruiz-Garcia R, Munoz MC, Cano J and Carrasco R, Eur. J. Org . Chem . 2003, 1627-1630]). 자기-조립하는 CRP 3량체에 대한 본 발명의 발명자들에 의한 초기 디자인은 (GPO)10 서열의 N- 및 C-말단 둘 모두에 페닐 옥삼산 에스테르 아미드기를 부착하여 수소 결합에 의한 말단-대-말단 조립을 촉진하는 것과 관련되었다.
그러나, 벤젠과 헥사플루오로벤젠 사이의 강한 비공유 방향족-스태킹 상호작용으로 인하여(문헌[Hunter CA and Sanders JKM, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 5525-5534]; 문헌[Gdaniec M, Jankowski W, Milewska MJ and
Figure pct00002
T, Angew . Chem. Int . Ed . 2003, 42, 3903-3906 (또한, 그 안에 인용된 Ref 9 및 10)]; 및, 문헌[Lozman OR, Bushby RJ and Vinter JG, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 2001, 1446-1453]), 본 발명의 발명자들은 방향족-스태킹(말단-대-말단 및 측면-대-측면) 및 정렬된 소수성 상호작용이 본 발명의 CRP 3량체를 콜라겐-유사 피브릴 및 섬유로의 더 고도로 정렬된 자기-조립이 가능하게 만들 것으로 가정하였다.
그 결과, 수소 결합 자기-조립 디자인은 방향족 및 소수성 기 사이의 상호작용이 π-스태킹 및 정렬된 소수성 상호작용에 의한 말단-대-말단 자기-조립을 위해 이용되는 본 발명의 디자인으로 발전하였다. 본 발명의 선형 CRP의 서열은 비공유 수단에 의해 3량체로의, 그리고 이어서 초분자 복합체 및 피브릴로의 자기-조립이 가능하다. 다른 사람들은 콜라겐 서열이 Tyr, Phe 및 Leu과 같은 방향족 및 소수성 아미노산 잔기를 특이적으로 함유한 텔로펩티드 영역을 포함한다는 것에 주목하였다. 삼중 나선 자기-조립을 위한 그러한 방향족 및 소수성 잔기의 중요성이 나타나있다 (문헌[Helseth DL, Jr. and Veis A, J. Biol. Chem., 1981, 256, 7118-7128]; 문헌[Prockop DJ and Fertala A, J. Biol. Chem. 1998, 273, 15598-15604]; 및, 문헌[Traub W, FEBS Letters 1978, 92, 114-120]).
따라서, 본 발명의 CRP 3량체에 의해, 예를 들어, 서열 번호 25: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe를 갖는 CRP 3량체에 의해 피브릴 증식을 개시하는 능력이 조사되었다. 하기 실시예 3에서 나타난 바와 같이, 계산 분자 모델링을 이용하여 서열 번호 25를 갖는 2개의 머리-대-꼬리(head-to-tail) CRP 3량체 사이의 계면을 평가하였다. XED (확장된 전자 분포(extended electron distribution)) 힘의 장을 이용하여 두 삼중 나선을 서로를 향해 당겼다. 삼중 나선이 서로 접근함에 따라, 페닐/펜타플루오로페닐 쌍이 면-대-면 (face-to-face, FTF) 배향을 취하여, -55.2 kcal/㏖의 총 계면 결합 에너지를 생성하였다. 방향족 고리가 모서리-대-면(edge-to-face) 배향으로 위치되었을 경우, 다시-최소화된 조립체는 면-대-면 배향으로 되돌아갔다.
서열 번호 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe 및 서열 번호 27: Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe 서열을 가진 유사한 CRP 3량체들의 계면을 또한 조사하였다. 비교적으로, 서열 번호 26의 경우에는, 관찰되는 대칭 FTF 상호작용이 없이 더 낮은 계면 에너지가 관찰되었다(총 에너지 -49.2 kcal/㏖). 결합 에너지의 추가적인 감소가 서열 번호 27 (총 에너지 -32.5 kcal/㏖)에 대해 발생하였다. 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체의 반대쪽 말단들 사이의 강한 상호작용 및 서열 번호 26 및 서열 번호 27을 가진 CRP 3량체들의 반대쪽 말단들 사이의 상호작용은, CRP 3량체들 사이의 방향족-스태킹 및 정렬된 소수성 상호작용으로 인해 본 발명의 CRP 3량체가 피브릴 증식을 개시하는 능력에 대한 본 발명자들의 가설을 지지한다.
모델링 작업은 피브릴 증식을 개시하는 것에 대해 CRP 3량체의 말단-대-말단 계면을 조사하였지만, 본 발명의 범주는 CRP 3량체 내의 상이한 위치의 CRP 간의 말단-대-말단 배향에서 소수성 상호작용이 발생하는 엇갈린 계면과 같은 다른 가능한 계면 및 콜라겐 텔로펩티드의 경우에서처럼 소수성 상호작용에 의해 허용되는 인접한 CRP 3량체와의 측면-대-측면 상호작용을 포함하고자 한다.
CRP 형태
전술한 비제한적인 실시 형태에 더하여, 본 발명은 또한 화학식 I로 나타내어지는 임의의 조합의 서열로 이루어지는 CRP 및 그의 동종3량체 및 이종3량체를 포함한다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같이 CRP의 전체 길이는 26개의 아미노산 내지 최대 47개의 아미노산의 범위일 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, CRP의 전체 길이는 최대 32개의 아미노산일 수 있다.
본 명세서에서 개시되는 바와 같이 CRP는 중합되거나 효과인자(effector) 분자, 라벨, 마커, 약물, 독소, 담체 또는 수송 분자 또는 표적화 분자, 예를 들어, 항체 또는 그의 결합 단편 또는 다른 리간드와 같으나 이로 제한되지 않는 펩티드 또는 비펩티드 커플링 파트너에 연결될 수 있다. 펩티드 및 비펩티드 커플링 파트너에 CRP 폴리펩티드를 커플링시키는 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에서 개시되는 바와 같은 CRP는 고체 표면 또는 불용성 지지체 상에 코팅될 수 있다. 지지체는 미립자 또는 예를 들어, 플레이트, 시험관, 비드, 볼(ball), 필터, 천, 중합체 또는 막을 비롯한 고체 형태일 수 있다. 고체 표면 또는 불용성 지지체에 CRP 폴리펩티드를 고정하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 지지체는 단백질, 예를 들어, 혈장 단백질 또는 조직 단백질, 예를 들어, 면역글로불린 또는 피브로넥틴일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 지지체는 합성일 수 있으며, 예를 들어, 생체적합성, 생분해성 중합체일 수 있다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글리콜리드, 폴리락티드, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠, 및 폴리우레탄을 포함한다. 본 발명의 다른 태양은 불활성 중합체에 부착된 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 접합체(conjugate)를 제공한다.
CRP의 한쪽 말단에 반응성 기를 포함시키면 불활성 담체에의 화학적 커플링을 허용하여, 얻어지는 생성물이 혈류 내로 들어가지 않고 만성 상처 또는 급성의 외상적 손상 부위와 같은 병리학적 병변에 전달될 수 있다.
본 발명의 CRP는 화학적 합성에 의해, 예를 들어, 잘 확립된, 표준 액체 또는, 바람직하게는 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생성될 수 있으며, 그 일반적인 설명은 널리 이용가능하고(예를 들어, 문헌[J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)], 문헌[M. Bodanzsky and A. Eodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)]; 문헌[J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press, Oxford 1991]; 문헌[Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California], 문헌[G. A. Grant, (Ed. ) Synthetic Peptides, A User's Guide. W. H. Freeman & Co., New York 1992], 문헌[E. Atherton and R.C. Sheppard,Solid Phase PeptideSynthesis, A Practical Approach. IRL Press 1989] 및 문헌[G.E. Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis (Methods in Enzymology Vol. 289). Academic Press, New York and London 1997] 참고), 또는 이들은 용액에서, 액체상 방법에 의해 또는 고체상, 액체상 및 용액 화학의 임의의 조합에 의해 제조될 수 있다.
CRP 구조적 변형
본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP는 예를 들어, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자, 당, 인산염, 및/또는 다른 그러한 분자를 첨가함으로써 화학적으로 변형될 수 있으며, 여기서 분자 또는 분자들은 자연적으로는 야생형 콜라겐 단백질에 부착되어 있지 않다. CRP의 적합한 화학적 변형 및 화학적 합성에 의해 CRP를 제조하는 방법은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 또한 본 발명에 의해 포함된다. 동일한 유형의 변형이 CRP상의 몇몇 부위에서 동일하거나 다른 정도로 존재할 수 있다. 더욱이, 변형은 CRP 골격, 임의의 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯하여, CRP 서열 내의 어느 곳에서든 일어날 수 있다. 따라서, 주어진 CRP는 많은 유형의 변형을 포함할 수 있다.
상기에 나타난 바와 같이, 본 명세서에 개시된 CRP는 구조적으로 변형될 수 있다. 구조적으로 변형된 CRP는 3차원 형상 및 생물학적 활성 둘 모두에 있어서 본원에서 개시된 CRP와 사실상 유사하며, 바람직하게는 CRP 서열 내의 활성 기의 3차원 배열과 아주 흡사한 반응성 화학적 부분의 공간적 배열을 포함한다. 유사한 구조의 다른 화학적 기로 아미노산의 화학적 기를 대체함으로써 추가의 변형이 또한 이루어질 수 있다.
부가적으로, 본원에서 개시된 CRP는 구조적으로 변형되어 하나 이상의 D-아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, CRP는 CRP의 아미노산 서열 내의 하나 이상의 L-아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기로 대체된 거울상 이성질체일 수 있거나 또는 상기에 개시된 L-아미노산 서열과 비교할 때 역순으로 배열된 D-아미노산으로 이루어진 폴리펩티드인 역상-D 폴리펩티드일 수 있다 (문헌[Smith CS, et al., Drug Development Res., 1988, 15, pp. 371-379]). 적합한 구조적으로 변형된 폴리펩티드의 제조 방법이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
CRP 조성물
본 발명의 CRP는 단리 및/또는 정제되고 이어서 원하는 대로 사용될 수 있다. 본 발명의 실시 형태에서, CRP는 본 기술 분야에 알려진 하나 이상의 부형제를 포함하지만 이로 한정되지 않는 선택적 성분 하나 이상을 포함할 수 있는 약학 조성물 또는 의료 장치로 사용하기 적합한 조성물과 같은 조성물 중에 사용될 수 있다. 그러한 비제한적인 실시 형태에 더하여, 본 발명은 또한 화학식 I로 나타내어지는 임의의 조합의 서열로 이루어지는 CRP뿐만 아니라 그의 동종3량체 및 이종3량체를 그러한 조성물 중에 포함한다.
소정의 폴리펩티드가 다양한 약학 조성물, 의료 장치, 및 조합 생성물에서의 사용에 대해 개시되었다. 예를 들어, 국제특허 공개 WO07/044026호는 손상된 연골의 회복을 위한 콜라겐 모방 펩티드-폴리에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트 하이드로젤 스캐폴드를 개시한다. 미국 특허 공개 제2006/073207호는 다양한 의학적 용도를 위한 소 콜라겐/엘라스틴/소듐 헤파리네이트 무정형 코아세르베이트 조성물을 개시한다. 미국 특허 공개 제2005/147690호는 혈관 이식편으로 사용하기 위한 콜라겐/엘라스틴/헤파린 임베디드(embedded) 표면을 가진 변형된 폴리우레탄 필름을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005060550호는 분자량이 100,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진, 폴리펩티드 서열 Pro-Y-Gly (여기서 Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄)를 함유한 기재에 부착하기 위한 조성물을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005060315호는 분자량이 100,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진 폴리펩티드 서열 Pro-Y-Gly (여기서, Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄) 및 비타민 C를 함유한 약학 조성물을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005060314호는 분자량이 100,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진 폴리펩티드 서열 Pro-Y-Gly (여기서, Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄)를 함유한 화장품 조성물을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005058499호는 콜라게나제에 의해 분해될 수 있으며, 분자량이 100,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진, 서열 Pro-Y-Gly (여기서 Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄)의 폴리펩티드로 함침된 부직포 조성물을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005058106호는 콜라게나제에 의해 분해될 수 있으며, 분자량이 100,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진, 폴리펩티드 서열 Pro-Y-Gly (여기서 Y는 Pro 또는 Hyp를 나타냄)를 함유한 식용 조성물을 개시한다. 일본 특허 공개 제2005053878호는 콜라게나제에 의해 분해될 수 있으며, 분자량이 70,000 내지 600,000인 삼중-나선 구조를 가진, 서열 Pro-X-Gly 및 Pro-Y-Gly-Z-Ala-Gly (여기서 X는 Pro 또는 Hyp를 나타내며; Y는 Gln, Asn, Leu, Ile, Val 또는 Ala를 나타내며; Z는 Ile 또는 Leu을 나타냄)를 가진 폴리펩티드를 개시한다. 국제특허 공개 WO98/52620호는 임플란트 보철로서 사용하기 위한 생체적합성 벌크 재료의 표면 또는 표면들에 공유적으로 결합된 서열 Gly-Pro-Nleu을 가진 생중합체 화합물을 개시한다. 미국 특허 제6,096,863호는 친유성 부분 및 콜라겐-유사 서열 R2O2C(CH2)2CH(CO2R1)NHCO(CH2)2CO(Gly-Pro-Hyp)0-4-[펩티드]-(Gly-Pro-Hyp)0-4을 가진 펩티드 부분을 가진 펩티드-양친매성 물질 복합체를 개시하며, 여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 고체상 합성을 통해 제조된, 1 내지 20개의 하이드로카르빌 기이다. 미국 특허 제6,096,710호 및 제6,329,506호는 반복 아미노산 트리플렛 Gly-Xp-Pro, Gly-Pro-Yp, Gly-Pro-Hyp 및 Gly-Pro-Pro을 가진 삼중 나선 합성 콜라겐 유도체를 개시하며, 여기서 Xp 및 Yp는 N-치환된 아미노산으로부터 선택된 펩토이드 잔기이다.
본 발명은 다양한 태양에서 선택적으로 다른 분자, 펩티드, 폴리펩티드 및 특이적 결합 구성원에 결합된, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP로 확장될 뿐만 아니라, 그러한 CRP를 포함하는 약학 조성물, 의약품, 약물, 의료 장치 또는 이의 성분, 또는 기타 조성물을 포함한다. 그러한 약학 조성물, 의약품, 약물, 의료 장치 또는 이의 성분, 또는 기타 조성물은 진단, 치료 및/또는 예방 목적을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 그러한 조성물의 제조에 있어서 그러한 CRP의 용도 및 그러한 CRP를 원하는 선택적 부형제 및 다른 선택적 성분과 혼합하는 것을 포함하는 그러한 조성물의 제조 방법으로 확장된다. 적합한 부형제의 예에는 본 기술 분야에 잘 알려진 비히클, 담체, 완충제, 안정화제 등 중 임의의 것이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
조성물이 약학 조성물인 실시 형태에서, 당해 조성물은 그러한 CRP에 더하여, 두번째 약학적 활성 제제를 함유할 수 있으며, 여기서 생성되는 조합 생성물은 본 기술 분야에서 약학적으로 허용가능한 것으로 알려진 것들과 같은 부형제와 추가로 혼합될 수 있다. 그러한 적합한 부형제의 예는 예를 들어, 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Fifth Edition,October 2005, Pharmaceutical Press, Eds. Rowe RC, Sheskey PJ and Weller P)]에 개시된다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며 그러한 CRP 또는 두번째 약학적 활성 제제의 효능을 방해하지 않아야 한다. 본 발명의 그러한 조성물은 원하는 부위에 국소화된 방식으로 투여되거나 또는 CRP 또는 두번째 약학적 활성 제제가 특정 세포 또는 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다. 적합한 두번째 약학적 활성 제제에는 지혈제 (예를 들어, 트롬빈, 피브리노겐, ADP, ATP, 칼슘, 마그네슘, TXA2, 세로토닌, 에피네프린, 혈소판 인자 4, 인자 V, 인자 XI, PAI-1, 트롬보스폰딘 등 및 이의 조합), 항감염제(예를 들어,항체, 항원, 항생제, 항바이러스 제제 등 및 이의 조합), 진통제 및 진통제 조합, 또는 항염증 제제(예를 들어, 항히스타민 등)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
그러한 조성물의 광범위한 용도에서, 조성물은 예를 들어, 약학적 제형으로서 또는 상처 드레싱의 성분으로서와 같이, 지혈제로서 상처 부위에 국소 적용될 수 있다. 조성물은 치료할 상태에 따라 단독으로 또는 사실상 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 조합되어 투여될 수 있다. 단독의 또는 상처 드레싱을 비롯한 그러한 CRP를 포함하는 용품 또는 장치 내의, 그러한 CRP는, 예를 들어, 외부 환경으로부터 내용물을 보호하는 적합한 용기에 밀봉된, 키트로 제공될 수 있다. 그러한 키트는 사용 설명서를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP는 예를 들어, 도로 교통 사고 또는 전쟁터 손상 후의 급성 외상에서, 치명적인 혈액 손실을 달리 야기할 상처에 국소 적용됨으로써, 지혈을 자극하는 데 유용할 수 있다. 그러한 상처 부위에서 지혈을 자극하는 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP로 이루어지는 조성물과 그 부위를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 선택적으로 기재를 포함하여 CRP가 지혈을 유도하고 유지하기에 충분한 양으로 기재 표면에 존재하도록 할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP는 궤양과 같은 만성 상처에서 지혈을 자극하는 데 유용할 수 있다. 제안된 기작에 관하여 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 CRP가 먼저 세포 부착을 향상시키도록 작용할 수 있으며, 이어서 활성화된 혈소판 과립 내용물의 방출이 혈류로부터 그리고 근처의 손상 조직으로부터 세포의 이동을 자극할 수 있어서 상처 치유 과정에 기여하는 것으로 여겨진다. 개체에서 그러한 만성 상처 부위에서 지혈을 자극하는 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP로 이루어지는 조성물과 그 부위를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 조성물은 선택적으로 기재를 포함하여 CRP가 지혈을 유도하기에 충분한 양으로 기재 표면에 존재하도록 할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 그러한 CRP는 출혈 질환을 진단하는 것을 비롯한 많은 실험실 및 임상 현장에서 중요한 시약으로서 널리 유용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP는 합성 콜라겐의 구성에서 유용할 수 있으며 콜라겐은 그 후 혈소판 응집을 개시하는 데 이용될 수 있다. 다른 예에서, 그러한 CRP는 혈소판 응집 및 활성화 및/또는 혈액 응고를 억제하는 시험 화합물의 조사 또는 스크리닝에서 유용할 수 있다. 추가 예에서, 그러한 CRP는 혈소판의 활성화 및/또는 응집에 대한 연구를 위한 시약으로서 유용할 수 있다. 혈소판을 활성화 및/또는 응집하는 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP로 혈소판을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 혈소판은 혈액 혈장의 존재 하에서 시험관 내(in vitro)에서 처리될 수 있다. 처리된 혈소판, 즉, 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP와의 접촉 후의 혈소판의 활성은 예를 들어, 인자 또는 제제, 시험 조성물 또는 관심 물질의 존재 또는 부재 하에서, 본 기술 분야에서 예상되는 적합한 대조군 실험을 이용하여, 측정되거나 결정될 수 있다. 혈소판 활성화 및/또는 응집에 대한 인자의 효과는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP로 혈소판을 처리하고 혈소판 활성화 및/또는 응집에 대한 인자의 효과를 결정하는 것을 포함하는 방법에 의해 결정될 수 있다. 혈소판 활성화 및/또는 응집은 인자의 존재 또는 부재 하에서 또는 상이한 농도의 인자를 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 그러한 CRP는 또한 혈소판 질환의 진단에서, 예를 들어, 혈소판 응집시험에서 시약으로서 동물 조직으로부터 추출된 콜라겐 피브릴을 일상적으로 사용하는 진단에서, 또는 혈소판 기능 분석기 및 다른 장비에서처럼 고정된 콜라겐 제제에서 유용할 수 있다. 예를 들어, 그러한 CRP는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP로 처리된 샘플에서 혈소판의 활성화 및/또는 응집을 결정함으로써, 혈소판 활성 또는 기능을 조사하기 위하여 또는 혈소판 활성의 기능장애를 진단하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP는 개체로부터 얻은 혈액 샘플과 접촉된 후, 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 혈소판 응집이 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 그러한 CRP는 예를 들어 다른 생물활성 분자의 생산 및 방출에 기여함으로써, 세포 부착을 직접 확실히 하기 위해서뿐만 아니라 혈소판을 국소적으로 응집시키고 활성화시키기 위해 작용하는 생물활성 표면 코팅으로서 유용할 수 있다. 한 가지 방법은, 예를 들어, 지지체에서 또는 그 근처에서 혈소판을 응집 및/또는 활성화시키기 위하여, 고체 또는 반고체 지지체 상에 고정될 수 있는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP와 혈소판을 혈장의 존재 하에서 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 CRP는 또한 출혈 질환의 치료에서 널리 유용할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP가 불활성 중합체 지지체와 같은 고체 또는 반고체 지지체 상에 흡착되거나 또는 그 안에 또는 그 위에 달리 함유된 일 실시 형태에서, 생성된 지지체는 자가면역성 혈소판감소증으로부터 또는 암 치료에서와 같은 골수의 치료적 절개로부터 뿐만 아니라, 글랜즈만(Glanzmann) 병과 같은 다른 원인으로부터의 출혈 질환으로부터 야기될 수 있는 혈소판 부족의 경우에 혈소판 수혈에 대한 부가법 또는 대안의 역할을 하는 데 있어서 유용할 수 있다. 이 실시 형태에서, 고체 또는 반고체 지지체 상에 흡착되거나 또는 그 안에 또는 그 위에 달리 함유된 그러한 CRP는, 예를 들어, 혈소판 부족을 갖거나 및/또는 상기에 개시한 바와 같은 의학적 상태를 가질 수 있는 개체들과 같은, 이를 필요로 하는 개체들에 투여될 수 있다.
고체 또는 반고체 지지체 상에 흡착되거나 또는 그 안에 또는 그 위에 달리 함유된 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP는 또한 대동맥류에서 혈전 형성을 유도하는 데 있어서 유용할 수 있다. 예를 들어, 그러한 CRP는 조직을 고정하기 위해 및/또는 팽창된 동맥의 추가 확장을 방지하기 위해 색전 코일의 외부 상에 코팅될 수 있다. 이 실시 형태에서, 개체의 손상된 혈관 조직에서의 혈전 형성은 불활성 중합체 지지체와 같은 고체 또는 반고체 지지체 상에 흡착되거나 또는 그 안에 또는 그 위에 달리 함유된 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP와 혈관 조직을 접촉시켜 유도될 수 있다. 적합한 불활성 중합체 지지체의 예는 스텐트, 색전 코일 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 개체는 예를 들어, 팽창된 동맥 또는 기타 혈관 및/또는 대동맥류와 같은 의학적 문제를 앓고 있을 수 있다. 일 실시 형태에서, 지지체는 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 리포좀으로 이루어지는 불활성 중합체 지지체일 수 있으며, 이는 지지체에 흡착되는 본 CRP로 코팅된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 본 발명의 그러한 CRP는 배아 줄기 세포의 지시된 분화를 위해 상기 콜라겐-관련 펩티드로 보충된 화학적으로 한정된 3차원 중합체 매트릭스를 포함하는 조성물에서 추가로 유용할 수 있다. 모든 목적을 위해 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된 국제특허 공개 WO07/075807호는, 배아 줄기 세포의 지시된 분화를 지지하는 콜라겐 IV 폴리펩티드로 보충된 화학적으로 한정된 3차원 중합체 매트릭스를 포함하는 조성물을 개시한다.
본 발명의 또 다른 실시 형태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 그러한 CRP를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는, 본 발명의 CRP를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 대상에서 지혈 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 폴리펩티드 조성물은 투여 동안 선택적으로 기재를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 전형적으로 대상에게 효과를 나타내기에 충분한 요법(regimen)에 따라 투여될 수 있다. 투여될 실제 양, 및 투여 속도 및 시간 과정은 예를 들어, 치료할 질병 또는 상태의 특성 및 위중도와 같은 몇몇 인자에 의존적일 것이다. 조성물은 치료할 질병 또는 상태에 따라, 단독으로 또는 동시에 또는 순차적으로 다른 치료의 부가적 요법과 조합되어 투여될 수 있다.
지혈 상태를 치료하기 위한 이러한 방법에 따라, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CRP 조성물은 단독으로 또는 부형제 및 다른 선택적 성분과 조합되어 사용되어 지혈을 제공할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 그러한 CRP는 지혈제로서 사용하기 위해 적합한 기재와 배합될 수 있다. 지혈제 CRP 조성물은 다양한 형태일 수 있으며, 분말, 섬유, 필름 또는 폼(foam)을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
CRP-함유 폼은 예를 들어 동결건조 또는 초임계 용매 발포와 같은 공정에 의해 제조될 수 있다. 이들 공정의 상세 설명은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 문헌[S. Matsuda, Polymer J., 1991, 23(5), 435-444] (동결건조) 및 유럽 특허 출원 제EP 464,163 B1호 (초임계 용매 발포)에서 개시된다. 일반적으로, 본 발명의 CRP를 함유한 동결건조된 폼은 CRP 및 본 기술 분야에 알려져 있는 임의의 선택적 성분, 예를 들어, 가소제를 용해에 충분한 온도 하에서 적합한 용매 중에 용해시킨 후, CRP-함유 용액을 주형에 부어서 제조될 수 있다. CRP는 CRP-함유 용액의 총 중량을 기준으로, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.3 ㎎/㎖의 양으로 CRP-함유 용액 중에 존재할 수 있다. 적합한 가소제는 글리세롤; 폴리에틸렌 글리콜; 글리세린; 프로필렌 글리콜; 글리세롤의 모노아세테이트; 글리세롤의 다이아세테이트; 글리세롤의 트라이아세테이트 및 이의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않으며, CRP-함유 폼의 최종 건조 중량을 기준으로, 약 0.5% 내지 약 15%의 범위 또는 약 1% 내지 약 5% 범위의 양으로 사용될 수 있다. CRP에 대한 가능한 해로운 영향을 최소화하기 위하여, 용해 온도는 약 50℃를 초과하지 않아야 한다. 용해는 물에서 또는 염 수용액, 예를 들어, 완충된 염수, 인산염 완충 용액, 행크 균형 염 용액, 인산염 완충된 염수(PBS), 트리스 완충된 염수, 헤페스 완충된 염수, 및 이의 혼합물에서를 포함하지만 이로 한정되지 않는 유리한 수성 상태 하에서 실시될 수 있다.
일 실시 형태에서, 용매는 약 6 내지 약 8의 pH 범위로 완충될 수 있다. 주형을 원하는 양의 용액으로 충전한 후, 주형을 동결건조기로 옮기고, 동결건조기는 생성된 폼으로부터 용매를 제거하기 위하여 용액을 동결한 후 진공 건조한다. 생성된 폼의 두께는, 예를 들어, 주형 내의 용액의 양, 용액 중의 CRP의 농도 등에 따라 변할 수 있지만, 전형적으로 생성된 폼은 두께가 약 0.5 ㎜ 내지 약 10 ㎜ 범위, 또는 약 1 ㎜ 내지 약 5 ㎜ 범위이고, 기공 크기가 약 1 마이크로미터 내지 약 500 마이크로미터 범위일 수 있다. 폼은 출혈 부위의 지혈 문제를 해결하는 데 사용하기 적합할 수 있는 다양한 크기로 제조될 수 있다.
CRP-함유 필름은 예를 들어, 적합한 용매로부터 필름을 주조하는 것과 같은 공정에 의해 제조될 수 있다. 이러한 공정의 설명은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 문헌[Bagrodia S and Wilkes GL, "Effects of Solvent Casting Copolymer Materials As Related to Mechanical Properties, " J Biomed Mater Res., 1976 (Jan), 10(1), 101-11]에 개시된다. 이러한 실시 형태에 따라, 본 발명의 CRP는 예를 들어, 가소제와 같은 본 기술 분야에 알려진 임의의 선택적 성분과 함께, 충분한 양의 수성 용매 중에 용해될 수 있다. CRP는 용액의 총 중량을 기준으로, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.3 ㎎/㎖의 양으로 용액에 존재할 수 있다. 적합한 가소제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세롤의 모노아세테이트, 글리세롤의 다이아세테이트, 글리세롤의 트라이아세테이트 및 이의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않으며, CRP-함유 필름의 최종 건조 중량을 기준으로, 약 0.5% 내지 약 15%의 범위 또는 약 1% 내지 약 5% 범위의 양으로 사용될 수 있다.
적합한 수성 용매의 예에는 물, 혼화성 유기 용매, 알코올 또는 이의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 적합한 혼화성 유기 용매 및 알코올의 예에는 아세톤, 에탄올, 아이소프로판올, 프로판올, 메탄올 등 및 이의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. CRP에 대한 가능한 해로운 영향을 최소화하기 위하여, 용해 온도는 약 50℃를 초과하지 않아야 한다. 이어서 CRP-함유 용액은 예를 들어, 적가식으로, 또는 그렇지 않다면 주조 기재 상의 원하는 표면적을 커버하기에 적합한 양을 부어서 첨가될 수 있다.
적합한 주조 기재의 예에는 CRP-함유 필름을 쉽게 방출할 물질을 포함하는 것들이 포함되며, 그리고 유리, 금속, 테프론-코팅된 용기 등으로 제조된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않을 수 있다. 그러한 기재의 크기와 형상은 조성물의 필요에 따라 변할 수 있다. 용매는 이어서 증발에 의해 또는 공기 건조에 의해 CRP-함유 용액으로부터 제거될 수 있으며, 이어서 선택적으로 생성된 필름은 진공 건조를 통해서와 같은 다양한 방법에 의해 건조되어 임의의 잔류 용매를 제거할 수 있다. 만일 두꺼운 필름이 필요하면, CRP-함유 용액 층 하나 이상을 앞서 주조된 필름의 위쪽 표면의 위에 주조하여 공정을 반복할 수 있다. 생성된 필름의 두께는 예를 들어, 주조 기재 상에 부어지는 용액의 양, 용액 중의 CRP의 농도 등에 따라 변할 수 있지만, 전형적으로 각 필름 층의 두께는 약 50 마이크로미터 내지 약 150 마이크로미터 범위일 수 있다. 폼과 관련하여 상기한 바와 같이, 필름은 또한 다양한 크기로 제조될 수 있다.
CRP-함유 분말은 본 발명의 CRP로 이루어지는 섬유, 필름, 또는 폼을 본 기술 분야에 잘 알려진 공정을 사용하여 수동으로 또는 기계로 분쇄(grinding)하거나 미분화(pulverizing)하여 얻을 수 있다. CRP 섬유, 필름 또는 폼을 분말로 분쇄하거나 미분화하는 예시적 기술은 막자사발과 막자, 회전식 블레이드, 또는 볼 밀과 같은 충격 분쇄기를 이용하는 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. CRP를 분말로 분쇄하기 위한 이들 및 다른 수단은 실온에서 이루어지거나, 또는 극저온 분쇄 공정의 경우 CRP의 어는점 미만의 온도에서 이루어질 수 있다. 생성된 CRP-함유 분말은 선택적으로 체에 걸러서 입자 크기가 약 1 마이크로미터 내지 약 2000 마이크로미터 범위, 또는 약 10 마이크로미터 내지 약 500 마이크로미터 범위인 분말을 얻을 수 있다.
CRP-함유 분말, 필름, 및/또는 폼은 지혈제로서 출혈 부위에 직접 적용되어 지혈을 향상시키거나 야기할 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 CRP는 기재 성분과 조합되어 적용될 수 있으며, 그러한 실시 형태에서 CRP는 이하에서 CRP-지혈제 성분으로 불린다. 기재는 개체 내로 이식하기에 적합한 기재일 수 있으며, 또는 비이식성 기재일 수 있다.
적합한 이식성 기재의 예에는 의료 장치, 예를 들어, 봉합 나사못, 봉합사, 스테이플, 외과용 택, 클립, 플레이트, 스크류, 및 필름; 조직 공학 스캐폴드, 예를 들어, 부직 펠트, 직조 메쉬 또는 천; 폼; 및 분말이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 이러한 이식성 기재는 신체에서의 이식에 적합한 임의의 물질로 이루어질 수 있으며 생체적합성, 생체흡수성 중합체, 예를 들어, 지방족 폴리에스테르, 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(L-라이신 및 폴리(글루탐산), 코폴리(에테르-에스테르), 폴리알킬렌 옥살레이트, 예를 들어, 1 내지 10개 탄소 원자의 알킬기 길이를 가진 것들, 폴리옥사아미드, 티로신 유도 폴리카르보네이트, 폴리(이미노카르보네이트), 폴리오르토에스테르, 폴리옥사에스테르, 폴리에스테르아미드, 아민기를 함유한 폴리옥사에스테르, 폴리(안하이드라이드), 폴리포스파젠, 생분자(생중합체, 예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 및 젤라틴, 및 다당류, 예를 들어, 전분, 알긴산염, 펙틴, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스의 염, 산화된 재생 셀룰로오스 등을 포함), 및 이의 공중합체 및 블렌드(blend)뿐만 아니라, 면, 리넨, 실크, 나일론, 예를 들어, 나일론 6-6 및 방향족 폴리아미드, 예를 들어, 이.아이.듀폰 디 네모아 앤드 컴퍼니(E. I. du Pont de Nemours and Company)로부터 상표명 "케브라르(KEVLAR)" 또는 노멕스(NOMEX)로 판매되는 것, 폴리에스테르, 예를 들어, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 플루오로중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 플루오르화된 폴리(에틸렌-프로필렌) (FEP) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PFA), 폴리올레핀, 예를 들어, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리우레탄 및 이의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 비흡수성 물질을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "생체흡수성"은 신체 조직에 노출될 경우 상대적으로 짧은 기간 내에 효소적 또는 가수분해적 반응을 통해 쉽게 분해되는 물질을 말한다. "분해"는 물질이 사실상 신체에 의해 대사되거나 제거될 수 있는 작은 단편으로 부서지는 것을 의미한다. 완전한 생체흡수가 약 12개월 내에 일어나야 하지만, 생체흡수는 예를 들어, 약 9개월 내에, 약 6개월 내에 또는 약 3개월 내에 또는 그 미만에 완료될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 폴리(이미노카르보네이트)는 문헌[Handbook of Biodegradable Polymers ,edited by Domb, et. al., Hardwood Academic Press, pp. 251-272 (1997)]에서 켐니체르(Kemnitzer)와 콘(Kohn)에 의해 개시된 중합체들을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위하여, 코폴리(에테르-에스테르)는 문헌[the Journal of Biomaterials Research, Vol. 22, pages 993-1009, 1988 by Cohn and Younes], 및 문헌[Polymer Preprints (ACS Division of Polymer Chemistry), Vol. 30(1), page 498, 1989 by Cohn]에서 개시된 코폴리에스테르-에테르 (예를 들어, PEO/PLA)를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위하여, 폴리알킬렌 옥살레이트는 미국 특허 제4,208,511호; 미국 특허 제4,141,087호; 미국 특허 제4,130,639호; 미국 특허 제4,140,678호; 미국 특허 제4,105,034호; 및 미국 특허 제4,205,399호에 개시된 것들을 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 티로신 유도된 폴리카르보네이트는 문헌[Pulapura et al., Biopolymers, Vol. 32, Issue 4, pgs 411-417], 및 문헌[Ertel et al., J. Biomed. Mater. Res., 1994, 28, 919-930]에 개시된 중합체들을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위하여, 폴리포스파젠, L-락티드, D,L-락티드, 락트산, 글리콜리드, 글리콜산, 파라-다이옥사논, 트라이메틸렌 카르보네이트 및 엡실론-카프로락톤으로부터 제조된 공단량체, 3량체 및 더 높은 차수의 혼합된 단량체 기반 중합체는 문헌[Allcock in The Encyclopedia of Polymer Science, Vol. 13, pages 31-41, Wiley Intersciences, John Wiley & Sons, 1988] 및 문헌[Vandorpe, et al in the Handbook of Biodegradable Polymers,edited by Domb, et al, Hardwood Academic Press, pp. 161-182 (1997)]에 의해 개시된 것을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위하여, 폴리에스테르아미드는 미국 특허 출원 제20060188547호 및 미국 특허 제5,919,893호에 개시된 중합체를 포함하는 것으로 이해된다. 폴리안하이드라이드는 화학식 HOOC-C6H4-O-(CH2)m-O-C6H4-COOH(여기서 m은 2 내지 8의 정수임)의 이산으로부터 유래된 것, 및 최대 12개 탄소 원자의 지방족 알파-오메가 이산과의 그 공중합체를 포함한다. 폴리옥사에스테르, 폴리옥사아미드, 및 아민 및/또는 아미도기를 함유한 폴리옥사에스테르는 하기 미국 특허 중 하나 이상에서 개시된다: 제5,464,929호; 제5,595,751호; 제5,597,579호; 제5,607,687호; 제5,618,552호; 제5,620,698호; 제5,645, 850호; 제5,648,088호; 제5,698,213호; 제5,700,583호; 및 제5,859,150호. 본 발명의 목적을 위하여 폴리오르토에스테르는 문헌[Handbook of Biodegradable Polymers,edited by Domb, et al, Hardwood Academic Press, pp. 99-118 (1997)]에서 헬러(Heller)에 의해 개시된 중합체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 목적을 위하여, 폴리우레탄은 미국 특허 제6,326,410호; 제6019996호; 제5571529호; 및 제4,960,594호에 개시된 중합체를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 목적을 위하여, 지방족 폴리에스테르는 락티드(락트산 D-, L- 및 메소 락티드 포함), 글리콜리드(글리콜산 포함), 엡실론-카프로락톤, p-다이옥사논 (1,4-다이옥산-2-온), 트라이메틸렌 카르보네이트(1,3-다이옥산-2-온), 트라이메틸렌 카르보네이트의 알킬 유도체, 예를 들어, 미국 특허 제5,412,068호에 개시된 것들, 델타-발레로락톤, 베타-부티로락톤, 감마-부티로락톤, 엡실론-데카락톤, 하이드록시부티레이트, 하이드록시발레레이트, 1,4-다이옥세판-2-온 (그 2량체 1,5,8,12-테트라옥사사이클로테트라데칸-7,14-다이온 포함), 1,5-다이옥세판-2-온, 6,6-다이메틸-1,4-다이옥산-2-온 및 이의 조합의 단일중합체 및 공중합체를 포함하지만 이로 한정되지 않는 것으로 이해된다.
일 실시 형태에서, 지방족 폴리에스테르는 탄성중합체성 공중합체이다. "탄성중합체성 공중합체"는 실온에서 그 원래 길이의 적어도 약 두배로 반복하여 신장될 수 있으며 응력의 즉각적인 이완시에 대략 그 원래 길이로 되돌아가는 물질로 정의된다. 적합한 생체흡수성, 생체적합성 탄성중합체는 엡실론-카프로락톤과 글리콜리드의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어, 약 30:70 내지 약 70:30 범위, 또는 약 35:65 내지 약 65:35 범위, 또는 약45:55 내지 35:65 범위의 엡실론-카프로락톤 대 글리콜리드의 몰비를 가진 것들); 엡실론-카프로락톤과, L-락티드, D-락티드, 이의 블렌드 또는 락트산 공중합체를 비롯한 락티드의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어, 약 35:65 내지 약 65:35 범위, 또는 약 45:55 내지 30:70 범위의 엡실론-카프로락톤 대 락티드의 몰비를 갖는 것들); p-다이옥사논(1,4-다이옥산-2-온)과, L-락티드, D-락티드 및 락트산을 포함하는 락티드의 탄성중합체성 공중합체 (예를 들어, 약 40:60 내지 약 60:40 범위의 p-다이옥사논 대 락티드의 몰비를 갖는 것들); 엡실론-카프로락톤과 p-다이옥사논의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어, 약 30:70 내지 약 70:30 범위의 엡실론-카프로락톤 대 p-다이옥사논의 몰비를 갖는 것들); p-다이옥사논과 트라이메틸렌 카르보네이트의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어, 약 30:70 내지 약 70:30 범위의 p-다이옥사논 대 트라이메틸렌 카르보네이트의 몰비를 갖는 것들); 트라이메틸렌 카르보네이트와 글리콜리드의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어,약 30:70 내지 약 70:30 범위의 트라이메틸렌 카르보네이트 대 글리콜리드의 몰비를 갖는 것들); 트라이메틸렌 카르보네이트와, L-락티드, D-락티드, 이의 블렌드 또는 락트산 공중합체를 비롯한 락티드의 탄성중합체성 공중합체(예를 들어, 약 30:70 내지 약 70:30 범위의 트라이메틸렌 카르보네이트 대 락티드의 몰비를 갖는 것들) 및 이의 블렌드로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 탄성중합체성 공중합체는 약 35:65 내지 약 65:35 범위의 엡실론-카프로락톤 대 글리콜리드의 몰비를 가진 엡실론-카프로락톤과 글리콜리드이다. 또 다른 실시 형태에서, 탄성 중합체성 공중합체는 약 35:65의 몰비를 가진 엡실론-카프로락톤과 글리콜리드이다.
적합한 비이식성 기재의 예는 붕대 및 상처 드레싱을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "붕대"는 신체의 질병 부위 또는 상처 부위를 감거나 둘러싸기 위해 사용되는 천 또는 다른 물질의 조각을 의미한다. 붕대는 상처에 직접 배치되거나 상처에 상처 드레싱을 고정하기 위해 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상처 드레싱"은 상처에 직접 배치되며 상처를 보호하고; 치유를 촉진하거나; 및/또는 수분을 제공하거나, 보유하거나 또는 제거할 목적으로 작용하며, 선택적으로 붕대를 이용하여 제자리에 유지되는 천 또는 물질의 조각을 의미한다.
비이식성 기재는 천, 폼, 거즈, 필름, 접착 붕대, 하이드로콜로이드, 젤 및 이의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 이들 비이식성 기재는 (이식없이) 신체에 적용하기 적합한 임의의 물질로 이루어질 수 있으며 생체적합성, 생체흡수성 중합체, 예를 들어, 지방족 폴리에스테르, 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(L-라이신) 및 폴리(글루탐산), 코폴리(에테르-에스테르), 폴리알킬렌 옥살레이트, 예를 들어, 1 내지 10개 탄소 원자를 가진 알킬기를 가진 것들, 폴리옥사아미드, 티로신 유도된 폴리카르보네이트, 폴리(이미노카르보네이트), 폴리오르토에스테르, 폴리옥사에스테르, 폴리에스테르아미드, 아민기를 함유한 폴리옥사에스테르, 폴리(안하이드라이드), 폴리포스파젠, 생분자(콜라겐, 엘라스틴, 및 젤라틴과 같은 생중합체, 및 다당류, 예를 들어, 전분, 알지네이트, 펙틴, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스의 염, 산화된 재생 셀룰로오스 등을 포함) 및 이의 공중합체와 블렌드를 포함하지만 이로 한정되지 않으며, 또한 비생체흡수성 물질은 면, 리넨, 실크, 나일론, 예를 들어, 나일론 6-6 및 방향족 폴리아미드, 예를 들어, 이.아이. 듀폰 디 네모아 앤드 컴퍼니 로부터 상표명 "케브라르" 또는 "노멕스"로 판매되는 것, 폴리에스테르, 예를 들어, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 플루오로중합체, 예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 플루오르화된 폴리(에틸렌-프로필렌) (FEP) 및 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PFA), 폴리올레핀, 예를 들어, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌, 폴리우레탄 및 이의 조합을 포함한다. 이들 물질은 상기에 개시된 바와 같이 정의된다.
CRP-지혈제 성분은 딥 코팅, 스프레이 코팅, 동결건조 코팅, 및 정전기적 코팅 기술과 같은 종래의 코팅 기술을 통해 그러한 기재의 표면에 적용될 수 있다. 이들 코팅법의 상세 설명은 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며 예를 들어, 미국 특허 제6,669,980호; 문헌[Yun JH, et al., 40(3) ASAIO J.M, 401-5 (Jul.-Sep. 1994)]; 및 문헌[Krogars K, et al, Eur J Pharm Sci., 2002 (Oct.), 17 (1-2), 23-30]에 개시된다. 일반적으로, 원하는 양의 CRP-지혈제 성분을 함유한 용액을 제조할 수 있으며 선택된 코팅 기술을 통해 원하는 기재 표면에 적용할 수 있다. 이어서 기재를 공기 건조, 진공 오븐에서의 진공 건조, 또는 동결건조를 포함하지만 이로 한정되지 않는 종래의 건조 방법을 통해 건조시킬 수 있다. CRP는 혈액 응고, 혈소판 응집 등과 같은 원하는 지혈 특성을 달성하기에 필요한 양으로 사용되어야 하지만, 일반적으로 CRP는 기재의 코팅 목적을 위하여 기재의 약 0.01 ㎎/㎠ 내지 약 1 ㎎/㎠ 범위, 또는 약 0.1 ㎎/㎠ 내지 약 0.5 ㎎/㎠ 범위, 또는 약 0.4 ㎎/㎠ 범위의 양으로 존재한다.
기재가 주사형 또는 분무형 젤 또는 젤-형성 액체인 다른 실시 형태에서, 분말 또는 콜라겐-유사 피브릴 물질 형태일 수 있는 CRP-지혈제 성분은 본 기술 분야에 알려진 종래의 혼합 기술을 통해 주사형 또는 분무형 젤 또는 액체와 배합될 수 있다. 주사형 또는 분무형 젤 또는 젤-형성 액체는 염 수용액 및 젤화 물질로 이루어질 수 있다.
적합한 염 수용액의 예는 생리학적 완충 용액, 염수, 물, 완충된 염수, 인산염 완충 용액, 행크 균형 염 용액, PBS, 트리스 완충된 염수, 헤페스 완충된 염수, 및 이의 혼합물을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, 염 수용액은 인산염 완충 용액 또는 PBS일 수 있다.
적합한 젤화 물질의 예는 단백질, 예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 트롬빈, 피브로넥틴, 젤라틴, 피브린, 트로포엘라스틴, 폴리펩티드, 라미닌, 프로테오글리칸, 피브린 글루(fibrin glue), 피브린 클롯(fibrin clot), 혈소판 풍부 혈장(PRP) 클롯, 혈소판 결핍 혈장(PPP) 클롯, 자기-조립 펩티드 하이드로젤, 및 아텔로콜라겐; 다당류, 예를 들어, 전분, 펙틴, 셀룰로오스, 알킬 셀룰로오스(예를 들어, 메틸셀룰로오스), 알킬하이드록시알킬 셀룰로오스 (예를 들어, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스), 하이드록시알킬 셀룰로오스 (예를 들어, 하이드록시에틸 셀룰로오스), 셀룰로오스 설페이트, 카르복시메틸 셀룰로오스의 염, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시에틸 셀룰로오스, 키틴, 카르복시메틸 키틴, 히알루론산, 히알루론산의 염, 알긴산염, 가교결합된 알긴산염, 알긴산, 프로필렌 글리콜 알긴산염, 글리코겐, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 커들란, 펙틴, 풀루란, 잔탄, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 카르복시메틸 덱스트란, 카르복시메틸 키토산, 키토산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 카라기난, 키토산, 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 폴리-N-글루코사민, 폴리만누론산, 폴리글루쿠론산 폴리글루쿠론산), 및 유도체; 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 및 기타, 예를 들어, 폴리(N-아이소프로필아크릴아미드), 폴리(옥시알킬렌), 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체, 폴리(비닐 알코올), 폴리아크릴레이트, 모노스테아로일 글리세롤 코-석시네이트/폴리에틸렌 글리콜(MGSA/PEG) 공중합체 및 이의 공중합체 및 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 개시된 셀룰로오스 물질을 정의함에 있어서, 용어 "알킬"은 구체적 실시 형태를 위하여 달리 나타내지 않으면, 약 1 내지 약 7개 탄소 원자를 함유한 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 탄화수소 사슬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, tert-부틸, 펜틸, 아이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 2,3-다이메틸부틸, 네오헥실, 또는 헵틸을 말한다.
일 실시 형태에서, 젤화 물질은 다당류로 이루어진다. 다른 실시 형태에서, 젤화 물질은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스로 이루어진다.
주사형 또는 분무형 젤 또는 액체는 유효량의 젤화 물질을 염 수용액에 용해시켜 초기 젤을 형성함으로써 제조될 수 있다.
젤화 물질의 "유효량"은 주사형 또는 분무형 젤 또는 액체가 영향을 받는 영역 내에 주사되거나 영역 위에 분무될 수 있고 적용 후 사실상 제자리에 남아 있도록 하기에 충분히 필요한 젤화 물질의 양으로 정의된다. 젤화 물질의 유효량은 예를 들어, 선택된 젤화 물질, 원하는 CRP의 양 등에 따라 변하겠지만, 당업자는 과도한 실험없이 젤화 물질의 유효량을 쉽게 결정할 수 있다. 젤화 물질이 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스인 일 실시 형태에서, 젤화 물질은 용액의 총중량을 기준으로, 약 0.1% 내지 약 5% 범위, 또는 약 0.5% 내지 약 3% 범위의 양으로 존재할 수 있다.
CRP-지혈제 성분은 이어서 스패튤라를 이용한 수동 혼합, 자기 교반, 또는 모터 및 회전 패들 또는 블레이드를 이용한 기계적 혼합을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본 기술 분야에 알려진 임의의 종래의 혼합 기술에 의해 초기 젤과 배합될 수 있다. CRP에 대한 가능한 해로운 영향을 최소화하기 위하여, 혼합 온도는 약 50℃를 초과하지 않아야 한다. CRP-지혈제는 출혈 부위에 적용될 때 지혈을 유도하기에 효과적인 양으로 생성된 젤 중에 존재하며, 전형적으로 최종 젤의 총 중량을 기준으로 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 1 ㎎/㎖ 범위, 또는 약 0.3 ㎎/㎖이다. 일 실시 형태에서, 주사형 또는 분무형 젤 또는 액체는 주사 전에 젤 형태일 수 있으며, 대안적인 실시 형태에서는, 주사형 또는 분무형 젤 또는 액체는 주사 전에는 액체 형태이지만 원하는 위치에 투여시에는 젤 형태이고 사실상 제자리에 남아 있을 수 있다.
CRP-지혈제 성분이 분말 형태인 실시 형태에서는, CRP는 본 기술 분야에 알려진 임의의 적합한 분말 담체와 배합될 수 있다. 일 실시 형태에서, 담체는 예를 들어, 문헌[Maa YF, et al., SJ Curr Pharm Biotechnol., 2000 (Nov.), 1(3), 283-302]에 개시된 방법을 이용하여 분말 입자상에 분무 코팅될 수 있다. CRP-지혈제 성분은 총 분말 중량을 기준으로, 약 0.5% 내지 약 100% 범위, 또는 약 2% 내지 약 10% 범위의 양으로 분말 중에 존재할 수 있다.
적합한 분말 담체의 예에는 다당류, 예를 들어, 전분, 펙틴, 셀룰로오스, 알킬 셀룰로오스 (예를 들어, 메틸셀룰로오스), 알킬하이드록시알킬 셀룰로오스 (예를 들어, 에틸하이드록시에틸 셀룰로오스), 하이드록시알킬 셀룰로오스 (예를 들어, 하이드록실에틸 셀룰로오스), 셀룰로오스 설페이트, 카르복시메틸 셀룰로오스의 염, 카르복시메틸 셀룰로오스, 카르복시에틸 셀룰로오스, 키틴, 카르복시메틸 키틴, 히알루론산, 히알루론산의 염, 알긴산염, 가교결합된 알긴산염, 알긴산, 프로필렌 글리콜 알긴산염, 글리코겐, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 커들란, 펙틴, 풀루란, 잔탄, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 카르복시메틸 덱스트란, 카르복시메틸 키토산, 키토산, 헤파린, 헤파린 설페이트, 헤파란, 헤파란 설페이트, 더마탄 설페이트, 케라탄 설페이트, 카라기난, 키토산, 전분, 아밀로스, 아밀로펙틴, 폴리-N-글루코사민, 폴리만누론산, 폴리글루쿠론산, 만니톨, 다공성 화산암, 폴리에스테르, 및 이의 공중합체 및 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일반적 CRP 합성
본 발명의 CRP는 다양한 고체상 또는 용액 기술에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, CRP를 다른 방법(예를 들어, 용액 방법)에 의해 제조한 후 후속 커플링을 위해 지지체 물질에 부착할 수 있지만, 고체상 폴리펩티드 합성(SPPS) 기술과 같은 표준 고체상 유기 합성 기술을 이용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 CRP를 합성하고, 이어서 지지체 물질에 부착하고, 다양한 시약과 커플링한 후, 다양한 기술을 이용하여 지지체 물질로부터 제거할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, CRP를 지지체 물질 상에서 합성하고, 시약과 커플링한 후, 다양한 기술을 이용하여 지지체 물질로부터 제거한다.
CRP (올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질)의 제조를 위하여, 고체상 펩티드 합성은 초기 CRP 사슬을 부착에 적절한 작용기를 함유한 지지체 물질(전형적으로, 불용성 중합체 지지체)에 결합시키는 공유 부착 단계(즉, 고정)를 포함한다. 이어서, 고정된 CRP는 N-보호되고 측쇄-보호된 아미노산을 C에서 N 방향으로 단계적으로 첨가하는 것을 포함하는 일련의 첨가(탈보호/커플링) 사이클에 의해 연장된다. 일단 사슬 조립이 달성되면, 보호기를 제거하고 CRP를 지지체로부터 절단한다. 일부 경우에, 보호기를 제거하기 전에 다른 기를 CRP에 첨가한다.
전형적으로, SPPS는 핸들을 사용하여 초기 아미노산 잔기를 작용화된 지지체 물질에 부착함으로써 시작된다. 핸들(즉, 링커)은 한쪽 말단에서는 부드럽게 절단가능한 보호기의 특징을 포함하며 다른쪽 말단에서는 작용화된 지지체 물질에의 커플링을 허용하도록 활성화될 수 있는 작용기, 종종 카르복실기를 포함하는 2작용성 스페이서이다. 공지의 핸들은 산-불안정-p-알콕시벤질(PAB) 핸들, 광불안정 o-니트로벤질 에스테르 핸들, 및 문헌[Albericio et al., J. Org. Chem., 55, 3730-3743 (1990)] 및 그 안에 인용된 참고문헌, 및 미국 특허 제5,117,009호 (바라니(Barany)) 및 제5,196,566호 (바라니 등)에 개시된 것과 같은 핸들을 포함한다.
예를 들어, 만일 지지체 물질이 아미노-작용성 단량체로 제조되면, 전형적으로, 적절한 핸들은 단일 단계에서 아미노-작용화된 지지체 상에 정량적으로 커플링되어 폴리펩티드 사슬 조립을 위한 잘 정의된 구조의 일반적인 시작점을 제공한다. 핸들 보호기는 제거되며 N'-보호된 제1 아미노산의 C-말단 잔기는 정량적으로 핸들에 커플링된다. 일단 핸들이 지지체 물질에 커플링되고 초기 아미노산이 핸들에 부착되면, 일반적인 합성 사이클이 진행된다. 합성 사이클은 일반적으로 지지체 물질 상의 아미노산의 N-보호된 아미노기의 탈보호, 세척, 및, 필요하다면, 중화 단계, 그 다음, N-보호된 아미노산의 카르복실-활성화된 형태와의 반응으로 이루어진다. 사이클은 관심 CRP를 형성하기 위하여 반복된다. 작용화된 불용성 지지체 물질을 이용한 고체상 펩티드 합성 방법이 잘 알려져 있다.
SPPS 기술을 이용하여 지지체 물질 상에서 CRP를 합성하는 경우, Fmoc 방법은 염기-불안정 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 보호기를 이용한 온화한 직교 기술(mild orthogonal technique)의 사용을 포함한다. Fmoc 아미노산은 플루오레닐메틸 석신이미딜 카르보네이트 (Fmoc-OSu), Fmoc 클로라이드, 또는 [4-(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐옥시)페닐]다이메틸설포늄 메틸 설페이트 (Fmoc-ODSP)를 이용하여 제조될 수 있다. Fmoc기는 다이메틸포름아미드(DMF) 또는 N-메틸피롤리돈 중의 피페리딘을 이용하여, 또는 DMF중의 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU)을 이용하여 제거될 수 있다. Fmoc 제거 후, 지지된 수지의 유리된 N1-아민은 자유로우며 중화 단계의 개입없이 지질의 즉각적인 부착에 대해 준비가 되어 있다. 원하는 CRP의 고정된 소수성 유사체는 이어서 예를 들어, 실온에서 트라이플루오로아세트산(TFA)을 이용하여 제거될 수 있다. 그러한 Fmoc 고체상 폴리펩티드 합성 방법이 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 복합체의 제조를 위해 다양한 지지체 물질이 이용될 수 있다. 이들은 무기 또는 유기 물질일 수 있으며 다양한 형태(예를 들어, 막, 입자, 구형 비드, 섬유, 젤, 유리 등)일 수 있다. 예로는 다공성 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리다이메틸아크릴아미드, 면, 종이 등이 포함된다. 작용화된 폴리스티렌, 예를 들어, 아미노작용화된 폴리스티렌, 아미노메틸 폴리스티렌, 아미노아실 폴리스티렌, p-메틸벤즈하이드릴아민 폴리스티렌 또는 폴리에틸렌 글리콜-폴리스티렌 수지가 또한 이 목적을 위해 사용될 수 있다.
구체적인 CRP 합성
본원의 설명에 기초하여, 당업자는 본 발명을 완전히 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 하기의 구체적인 실시 형태는 단지 예시적인 것으로 이해되어야 하며, 어떤 방식으로도 본 내용의 나머지를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.
재료 및 방법: Fmoc-아미노산, HBTU/HOBT, DIEA, NMP 및 DCM은 어플라이드 바이오시스템즈, 인크.(Applied Biosystems, Inc)로부터 구매하였다. 피페리딘은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구매하였다. Fmoc-Gly-Wang 수지는 바켐(Bachem)으로부터 그리고 Fmoc-Phe-Wang 수지는 노바바이오켐(Novabiochem)으로부터 입수하였다. MALDI-TOF 질량 분광법은 매트릭스로서 α-시아노-4-하이드록시신남산을 사용하여 지연 추출 레이저-탈착 질량 분광계(Delayed Extraction laser-desorption mass spectrometer)와 결합된 어플라이드 바이오시스템즈 보이져-드 프로(Applied Biosystems Voyager-DE PRO) 생물분광계 워크스테이션을 이용하여 엠-스캔 인크(M-Scan Inc.)에서 실시하였다. 아미노산 분석은 벡크만(Beckman) 6300 Li-기반 아미노산 분석기를 이용하여 유.씨.데이비스(U.C. Davis)의 분자 구조 설비에서 실시하였다. 입수한 CRP는 90% 초과로 순수하였으며 폴리펩티드 함량은 각 실험을 위한 용액을 제조하도록 고려되었다. 부가적으로, CRP 농도는 214 ㎚ (PBS에서 ε = 6.0 × 104 M-1㎝-1 ) 또는 215 ㎚ (물에서 ε = 6.5 × 104 M-1㎝-1)에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 전자 현미경 실험을 위한 모든 폴리펩티드 여과는 와트만(Whatman)으로부터의 뉴클리포어(Nuclepore) 필터 (0.4-㎛; 폴리카르보네이트 막)를 이용하여 실시하였으며, 나머지 여과는 팰(Pall)로부터의 아크로디스크(Acrodisc) 시린지 필터 (0.45-㎛; 폴리테트라플루오로에틸렌 막)를 이용하여 행하였다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 약어는 하기와 같다:
Figure pct00003
실시예 1
서열 번호 25: (F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
비교 서열 번호 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly
비교 서열 번호 35: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe
서열 번호 25를 가진 CRP와 서열 번호 29를 가진 비교 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 가진 비교 폴리펩티드를 표준 FastMoc 화학에 의해 합성하고, 역상 HPLC에 의해 정제하고, 특성화하였다.
서열 번호 25를 가진 CRP를 FastMoc 화학(0.1 mmol 규모) 및 Fmoc-Phe-Wang 수지 (0.74 mmol/g, 100-200 메쉬)를 이용하여 ABI 431 합성기에서 합성하였다. CRP를 TFA/트라이아이소프로필실란/물(95:2.5:2.5)을 이용하여 2시간 동안 수지로부터 절단하였다. HPLC 정제를, 페노메넥스(Phenomenex) C-18 역상 컬럼(25 × 5 ㎝)에서, 50 ㎖/min의 유량에서 60분에 걸쳐 10% 내지 95% B (A: 0.2% TFA/H2O; B: 0.16% TFA/MeCN)의 선형 구배를 이용하여 실시하였다. CRP를 32% 전체 수율로 백색 분말로서 얻었다. 서열 번호 25: (F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe에 대하여: MALDI-TOF-MS (M+Na)+에서 C138H185F5N32O43에 대한 계산치 3096.3; 측정치 3096.8. 서열 번호 35: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)5-Phe를 가진 비교 폴리펩티드를 서열 번호 25: (F5)-Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe를 가진 CRP와 유사하게 합성하였다.
서열 번호 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly를 가진 비교 폴리펩티드를 FastMoc 화학 (0.1 mmol 규모) 및 Fmoc-Gly-Wang (0.7 mmol/g, 100-200 메쉬)을 이용하여 ABI 433A 합성기에서 합성하였다. 비교 폴리펩티드를 95% TFA를 이용하여 2시간 동안 수지로부터 절단하였다. HPLC 정제를, 두 개의 비닥(Vydac) C-18 역상 컬럼(25 × 2.5 ㎝)에서, 6 ㎖/min의 유량에서 90분에 걸쳐 0% 내지 100% B의 단계 구배 (A: 0.1% TFA/H2O; B: 0.1% TFA를 함유한 80% MeCN/H2O)를 이용하여 실시하였다. 비교 폴리펩티드를 34% 전체 수율로 백색 분말로서 얻었다. 서열 번호 29: Ac-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly에 대하여: MALDI-TOF-MS (M+Na)+에서 C124H177N31O43에 대한 계산치 2811.3; 측정치 2812.2.
원편광 이색성 (CD) 분광법
서열 번호 25를 가진 CRP 및 서열 번호 29를 가진 비교 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 가진 비교 폴리펩티드의 용액들 (물 중에 0.25 mM 및 0.013 mM)을 24시간 동안 4℃에서 보관하고 3량체 형성에 대해 모니터하였다. CD 스펙트럼을 25℃에서 100 ㎚/min의 스캔 속도로 10 또는 20 스캔을 신호 평균함으로써 0.1 ㎝ 경로 길이 셀을 이용하여 제이스코(Jasco) J-710 장비에서 측정하였다. 서열 번호 25를 가진 CRP 및 서열 번호 29를 가진 비교 폴리펩티드는 CD 분광법 (θmax = 225 ㎚)에 의해 삼중-나선 구조를 취한 것으로 나타났다. CD 용융 곡선은 펠티에르(Peltier) 온도 조절 시스템을 구비한 아비브(Aviv) 215 분광계에서 얻었다. 225 ㎚에서의 타원율을 20℃ 내지 100℃에서, 1℃/min의 속도, 3℃의 증분, 5분의 평형화 시간 및 0.1 ㎝ 경로 길이를 이용하여 모니터하였다.
서열 번호 25를 가진 CRP 동종3량체는 약 57℃의 T m 을 갖는 것으로 결정되었다. 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체에 대한 결과는 온도-의존성1H NMR 연구에 의해 확인하였으며, 여기서는 프롤린의 d-H (원래는 d 3.0ppm 내지 3.5 ppm)에 대한 특징적인 다운필드 이동(downfield shift)이 약 55℃ 내지 약 65℃에서 일어났다 (평형화로). 따라서, 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체는 실온 초과에서 안정하였다. 비교하여, 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체에 대한 열 안정성은, 한쌍의 다이설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된 3개의 펩티드 가닥을 가진 최근에 개시된 콜라겐-모방 화합물에 대한 열 안정성 (T m = 47℃)보다 약간 더 높았다 (문헌[Kotch F and Raines RT, Proc . Natl . Acad . Sci USA 2006, 103, 3028-3033]). 서열 번호 29를 가진 참고 폴리펩티드 3량체 (T m 70℃)와 비교하여 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체의 더 낮은 용융 온도는 페닐 및 펜타플루오로페닐기에 의한 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체의 말단에서의 일부 구조적 파괴("마모(fraying)")로 인한 것일 수 있다.
동적 광 산란 ( DLS )
DLS 측정은 633 ㎚ 레이저(He-Ne, 4.0 mW) 및 173°에서의 후방산란 검출을 구비한 맬번 제타사이저 젠(Malvern Zetasizer Zen) 1600 장비에서 실시하였다. 서열 번호 25를 가진 CRP 및 서열 번호 29를 가진 참고 폴리펩티드의 용액 (물 중의 0.5 ㎎/㎖)을 10분 동안 70℃에서 가열하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 고온 여과하고 용액이 실온에 도달했을 때(시간 = 0) 및 24시간 후에 플라스틱 큐벳(1.0 ㎝)에서 측정하였다.
DLS 측정을 행하여 25℃ 물 중의 서열 번호 25를 가진 CRP 및 서열 번호 29를 가진 비교 폴리펩티드에 의해 형성된 초분자 복합체의 크기를 결정하였다. 서열 번호 25를 가진 CRP의 신선한 용액은 3 ㎚와 190 ㎚ 크기의 두 가지 종을 함유하였으며, 이들은 24시간 후, 약 1000 ㎚의 크기를 가진 응집체 물질로 집중되었다. 대조적으로, 서열 번호 29를 가진 비교 폴리펩티드는 약 4 ㎚ 및 100 ㎚ 크기의 두 가지 종을 나타냈으며, 이들은 동일한 시간동안 증가하지 않았다. 이러한 결과는 가정된 페닐-펜타플루오로페닐 방향족-스태킹 기작이 서열 번호 25를 가진 CRP가 초분자 복합체를 형성하는 것을 촉진하였음을 시사한다.
투과 전자 현미경 (TEM)
서열 번호 25를 가진 CRP의 초분자 복합체의 크기 및 형태를 또한 TEM 필립스(Philips) EM 300으로 촬영한 TEM 이미지에 의해 평가하였다. 서열 번호 25를 가진 CRP의 수용액(0.05 ㎎/㎖)을 0.4 ㎛ 필터를 통해 여과하였으며 탄소 필름으로 코팅된 구리 격자 상에 침착시켰다. 용액을 40℃에서 건조하고 이미지를 80 ㎸에서 기록하였다. 쥐 동맥을 2% 글루타르알데히드로 염색하고 TEM을 위해 에폭시 블록 내에 두었다. 에폭시 블록 내의 동맥의 얇은 섹션(약 200 ㎚ 내지 500 ㎚ 크기)을 다이아몬드 절단 도구를 이용하여 절단하였다. 섹션을 구리 격자 상에 놓고 이미지를 60 ㎸에서 기록하였다. 각 실험에서, 쥐 동맥 조직에서 발견되는 콜라겐 피브릴(평균 직경: 0.05 ㎛)과 흡사한, ㎛ 길이의, 복합 피브릴 (평균 직경: 0.26 ㎛)이 관찰되었다. 서열 번호 25를 가진 CRP에 대한 피브릴 치수는 각 방향에서 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체 적어도 100개의 말단-대-말단(선형) 및 측면-대-측면(측면) 조립체의 조합을 필요로 하였다.
양성자 NMR 분광법
서열 번호 25를 가진 CRP (24시간 동안 4℃에서 항온처리된 D2O 중의 1 mM)의 양성자 NMR 스펙트럼을 삼중 공명(1H, 13C, 15N), 삼중 축, 구배 프로브를 구비한 DMX-600 NMR 분광계(미국 매사추세츠주 01821-3991 빌레리카 소재의 브루커 바이오스핀, 인크.(Bruker Biospin, Inc))에서 수집하였다. 재순환 지연 시간 및 혼합 시간 동안 사전포화시켜, 1차원 NOESY를 이용하여 데이타를 수집하였다. 온도를 10℃의 증분으로 상승시켰으며 스펙트럼은 15분 평형화 후에 측정하였다.
실시예 2
서열 번호 25: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
서열 번호 26: Phe-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
서열 번호 27: Leu-(Gly-Pro-Hyp)10-Phe
서열 번호 28: Gly-(Gly-Pro-Hyp)10-Gly.
서열 번호 25를 가진 CRP, 서열 번호 26을 가진 CRP, 및 서열 번호 27을 가진 CRP 및 서열 번호 28을 가진 비교 폴리펩티드를 표준 FastMoc 화학에 의해 합성하고, 역상 HPLC에 의해 정제하고, 특성화하였다.
펩티드 합성
서열 번호 25를 가진 CRP, 서열 번호 26을 가진 CRP 및 서열 번호 27을 가진 CRP 및 서열 번호 28을 가진 비교 폴리펩티드를 FastMoc 화학 (0.1 mmol 규모) 및 Fmoc-Phe-Wang 수지 (0.74 mmol/g, 100 내지 200 메쉬) 또는 Fmoc-Gly-Wang 수지 (0.66 mmol/g, 100-200 메쉬)를 이용하여 ABI 431 합성기에서 합성하였다. CRP 및 폴리펩티드를 TFA/트라이아이소프로필실란/물 (95:2.5:2.5)로 2시간 동안 수지로부터 절단하였다. 20 ㎖/min의 유량에서 15분에 걸쳐 5% 내지 95% B (A: 0.05% TFA/물; B: 0.05% TFA/MeCN)의 선형 구배를 이용하여 RP-HPLC (조르박스(Zorbax) 300 SB-C18, 21.2 × 150 ㎜, 60℃)에 의해 정제를 실시하였다. 60℃에서 조르박스 300 SB-C18 컬럼 (3.5 ㎛ 4.6 × 150 ㎜) 및 1 ㎖/min의 유량으로 20분에 걸친 5% 내지 95% B (A: 0.02% 포름산/물; B: 0.02% 포름산/MeCN)의 선형 구배를 이용하여 피니간(Finnigan) LCQ 검출기에 결합된 어질런트(Agilent) 1100 상에서 LC/MS에 의해 분획을 분석하였다.
표 1에 나타난 바와 같이, 순수한 (90% 초과) 물질을 함유한 분획을 배합하고 동결건조하여 백색 분말로서 펩티드를 얻었다. 펩티드 함량은 215 ㎚에서의 흡광도를 측정하고 참고 펩티드 서열 번호 34: (Pro-Hyp-Gly)10 (판매사: 펩티즈 인터내셔널(Peptides International))에 대해 결정된 소멸 계수 (ε = 6.5 × 104 M-1 ㎝-1)를 이용하여 결정하였다. 계산 및 측정 MS 값은 MALDI-TOF-MS (M+Na)+를 이용하여 결정하였다.
Figure pct00004
CRP 분석
CD 분광법: 서열 번호 25를 가진 CRP, 서열 번호 26을 가진 CRP 및 서열 번호 27을 가진 CRP 및 서열 번호 28을 가진 비교 폴리펩티드의 용액들 (물 중의 0.25 mM 및 0.013 mM)을 24시간 동안 4℃에서 보관하고 삼중 나선 형성에 대해 모니터하였다. CD 스펙트럼을 25℃에서 100 ㎚/min의 스캔 속도로 10 또는 20 스캔을 신호 평균함으로써 0.1 ㎝ 경로 길이 셀을 이용하여 제이스코 J-710 장비에서 측정하였다. CD 용융 곡선은 펠티에르 온도 조절 시스템을 구비한 아비브 215 분광계에서 얻었다. 225 ㎚에서의 타원율을 20℃ 내지 100℃에서, 1℃/min의 속도, 3℃의 증분, 5분의 평형화 시간 및 0.1 ㎝ 경로 길이를 이용하여 모니터하였다.
25℃에서 세 가지 CRP(물 중의 0.25 mM)의 CD 스펙트럼은 콜라겐 삼중 나선의 특징적인 225 ㎚ (θmax) 밴드를 나타냈다. 서열 번호 25을 가진 CRP, 서열 번호 26을 가진 CRP 및 서열 번호 27을 가진 CRP에 의해 형성된 삼중 나선의 열 안정성을 또한 20℃ 내지 100℃에서, 3℃의 증분 및 5분의 평형화 시간으로 225 ㎚에서의 타원율을 모니터함으로써 비교 연구하였다. 세 가지 CRP의 용융 온도는 매우 유사하여(56℃ 내지 59℃의 범위) 그들의 N-말단에서의 구조적 차이와는 별도로, 그들이 모두 안정한 3량체를 형성하였음을 나타냈다.
실시예 3
서열 번호 31: F5Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
서열 번호 32: Phe-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
서열 번호 33: Leu-(Gly-Pro-Hyp)9-Phe
하기에 보다 완전히 개시된 바와 같이, 본 발명의 CRP 3량체를 위한 모델 구조를 서열 번호 30: (Pro-Hyp-Gly)4-(Pro-Hyp-Ala)-(Pro-Hyp-Gly)5 을 가진 콜라겐-유사 폴리펩티드 3량체의 X-선 구조로부터 제작하였다 (문헌[Bella J, Eaton M, Brodsky B and Berman HM, Science 1994, 266, 75-81]). 서열 번호 30을 가진 콜라겐-유사 폴리펩티드 3량체를 N-말단(Pro-위치)에서 F5Phe를 그리고 C-말단(Gly-위치)에서 Phe를 포함하도록 돌연변이시켜 서열 번호 31을 가진 CRP (서열 번호 25와 유사하지만 하나의 GPO 반복이 없음)를 제공하였다. 서열 번호 32를 가진 폴리펩티드 및 서열 번호 33을 가진 폴리펩티드를 각각 Phe 및 Leu를 이용하여 유사하게 제조하였다.
계산 화학
서열 번호 30을 가진 콜라겐-유사 폴리펩티드의 결정 구조를 모델링을 위한 출발점으로 사용하였다. 이 구조는 중앙에 알라닌 잔기를 함유하였으며, 이 잔기를 먼저 글리신으로 돌연변이시켰다. 이어서 화학식 I의 CRP의 B 단위 및 X 단위 각각 하나를 서열 번호 30을 가진 삼중 나선의 각 가닥의 N-말단과 C-말단에 추가하였다. C-말단에서, 서열 번호 30의 Gly 잔기를 Phe로 대체하였다(서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33을 위하여). N-말단에서, Pro-Hyp 단편을 단일 F5Phe (서열 번호 31), Phe (서열 번호 32) 및 Leu (서열 번호 33)으로 대체하였다.
서열의 특성으로 인하여, 서열 번호 31을 가진 CRP, 서열 번호 32를 가진 CRP 및 서열 번호 33을 가진 CRP의 각각은 (서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27에 비교할 때) 하나 적은 GPO 모티프 반복을 함유하였으나, 서열 번호 25, 서열 번호 26 및 서열 번호 27의 분자 모델링에 적합하였다. 변형에 의해 야기되는 임의의 긴장(strain)을 완화시키기 위하여, 마크로모델(Macromodel) 9.0 (MacroModel 9.0, 2005, 미국 오레곤주 97201 포트랜드 스윗 1180 1500 에스더블유 퍼스트 애브뉴 소재의 슈뢰딩거, 인크(
Figure pct00005
, Inc.))을 이용하여, 제한된 골격, OPLS-AA 힘의 장(문헌[Jorgensen WL and Tirado-Rives J, J. Am . Chem . Soc . 1988, 110, 1657-1666]), GB/SA 물 (문헌[Qui D, Shenkin PS, Hollinger FP and Still CW, J. Phys. Chem. A., 1997, 101, 3005-3014])을 이용하여 각각의 CRP 3량체를 최소화하였다. 그 다음, 3량체 중앙 축을 따라 두 개의 3량체 단위를 배열시켜 각각의 CRP 3량체를 동일한 서열의 CRP 3량체와 짝을 지었다. 이 단계에서, 소수성 인식 단위의 대략적인 배열을 제공하도록 주의하였다.
서열 번호 31, 서열 번호 32 또는 서열 번호 33을 가진 배열된 CRP 3량체 쌍의 각각을, 각각의 배열된 3량체 쌍이 0.01 rms 미만으로 최소화되는 XED 힘의 장을 이용하여 자기-조립 및 피브릴 증식에 대해 평가하였다 (제한없는 공액 구배; 문헌[Hunter CA, Sanders JKM, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5525-5534]; 문헌[Vinter JG, J. Comp.-Aid. Mol. Design, 1994, 8, 653-668]; 문헌[Vinter JG, J. Comp.-Aid. Mol. Design, 1996, 10, 417-426]; 및, 문헌[Chessari G, Hunter CA, Low CMR, Packer MJ, Vinter JG and Zonta C, Chem. Eur. J., 2002, 8, 2860-2867]). 모든 카르복실레이트 및 암모늄 이온을 완전 하전의 1/8로 하전하여 부분적인 용매화 효과의 원인이 되도록 하였다. 최소화 후에, 두 개의 삼중 나선 단위 사이의 상호작용 에너지(IE)를 계산하였으며 이는 쿨롱 및 반데르발스 성분 둘 모두로 이루어졌다. 이 에너지는 각각의 삼중 나선 단위 사이의 모든 분자간 개념을 포함하였다. 분자내 개념 및 동일한 삼중-나선 번들 중의 가닥 사이의 에너지는 포함시키지 않았다. 인식 요소의 몇몇 조합에 대한 결과가 표 2에 요약된다.
서열 번호 31을 가진 배열된 CRP 3량체 쌍을 위한 모델링된 계면 에너지가 (표2, 항목 1)에 나타난다. 3개의 방향족 고리 쌍이 면-대-면 배향을 취하였으며 하나의 수소 결합이 계면에서 관찰되었다. 방향족을 모서리-대-면 배열로 재배향하고 이어서 다시-최소화시킴으로써 구조를 시험하였다(표 2, 항목 2). 생성된 계면 구조는 유사한 계면 에너지를 갖는 면-대-면 상호작용으로 되돌아갔다. 서열 번호 32를 가진 CRP 3량체 쌍의 계면은 모서리-대-면 (표 2, 항목 3)을 나타내거나 또는 변위된 각진 면-대-면 상호작용을 나타냈다. 서열 번호 33을 가진 CRP 3량체 쌍의 전체적인 계면 에너지는 더 낮았다 (표 2, 항목 4).
Figure pct00006
표 2에 나타난 바와 같이, 서열 번호 31을 가진 폴리펩티드, 서열 번호 32를 가진 폴리펩티드 및 서열 번호 33을 가진 폴리펩티드는 다양한 정도로 말단-대-말단 조립하기 위한 구조적 요건을 가진다. 유사하게, 서열 번호 25를 가진 폴리펩티드, 서열 번호 26을 가진 폴리펩티드 및 서열 번호 27을 가진 폴리펩티드는 또한 유사하게 말단-대-말단 조립하기 위한 구조적 요건을 가질 것이다.
실시예 4
혈소판 응집 연구
서열 번호 25를 가진 CRP가 콜라겐의 생물학적 기능을 모방하는 능력을 인간 혈소판 응집 분석에서 평가하였다. 건강한 지원자로부터의 인간 혈소판-풍부 혈장 (PRP) 농축물을 바이올로지컬 스페셜티즈, 인크(Biological Specialties, Inc)(미국 펜실베이니아주 콜마)로부터 구매하였다. 24시간 된 PRP는 콜라겐 및 서열 번호 25를 가진 CRP에 대해 상당히 약화된 반응을 나타냈으므로, PRP는 5시간 보다 오래되지 않았다. PRP를 15분 동안 730 g에서 원심분리하였다. 생성된 혈소판 펠렛을 1 U/㎖ 아피라제(apyrase) (V 등급, 시그마-알드리치)를 함유한 CGS 완충제 (13 mM 시트르산나트륨, 30 mM 글루코스, 120 mM NaCl, pH 6.5)에서 두번 세척하고 티로드 완충제(Tyrode's buffer) (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.76 mM Na2HPO4, 5.5 mM 덱스트로스, 5.0 mM 헤페스, 0.2% BSA, pH 7.4) 중에 재현탁하였다. "세척된" 혈소판을 3 × 108 혈소판/㎖로 희석하고 사용 전에 37℃에서 45분을 초과하여 유지하였다.
분석을 위하여, 105 ㎕의 세척된 혈소판, 2 mM CaCl2 및 2.5 mM의 피브리노겐을 96 웰 미세적정 플레이트에 첨가하였다. 연속적인 농도의 천연 콜라겐 피브릴 (말 유형 I; 인간 콜라겐 서열과 92% 동일성; 미국 펜실베이니아주 하버타운 소재의 크로노-로그 코포레이션(Chrono-log Corp.)) 또는 시험 펩티드를 첨가하여 혈소판 응집을 개시하였다. 완충제를 한 세트의 대조군 웰에 첨가하였다. 분석 플레이트를 연속하여 교반하고 간헐적으로 마이크로플레이트 판독기 (소프트맥스(Softmax), 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 몰에큘러 디바이스(Molecular Devices))에 넣어 0분 및 화합물 용액의 첨가 후 5분에 광학 밀도 (650 ㎚)를 판독하였다. 응집은 0분 및 5분 측정값 사이의 광학 밀도의 감소로서 계산하여 응집 퍼센트로 표현하였다.
혈소판 응집 연구를 위한 펩티드 제제를 위한 조건이 표 3에 나타나있다. 펩티드는 2 ㎎/㎖의 농도로 PBS (pH 7) 또는 물 (최종 pH 5)에 용해시켰다. 일부 샘플을 10분 동안 수조 (70℃)에서 가열하고, 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하고 24시간 또는 7일 동안 4℃에서 항온처리하였다. 여과 전 및 후의 215 ㎚에서의 UV 측정은 펩티드가 손실되지 않았음을 나타냈다. PBS (pH 7) 또는 물 중의 서열 번호 25를 가진 CRP의 일부 시험 용액을 24시간 또는 7일 동안(4℃) 항온처리하였으며, 다른 샘플은 변성시키고 (H+F) 4℃에서 재어닐링하였다.
Figure pct00007
서열 번호 25를 가진 CRP의 상이한 용액들이 혈소판 응집을 유도하였으나, 더 짧은 항온처리 및 "H+F" 샘플은 감소된 효능을 나타냈다. 서열 번호 25를 가진 CRP (미처리, PBS에서 7일 동안 숙성됨; EC50 = 0.37 ㎍/㎖)는 말 유형 I 콜라겐 (EC50 = 0.25 ㎍/㎖)과 효능이 거의 동일한 반면, 서열 번호 34 (Pro-Hyp-Gly)10를 가진 30-머 참고 폴리펩티드는 혈소판을 응집시키지 못했다. 서열 번호 34 (Pro-Hyp-Gly)10의 펩티드는 펩티즈 인터내셔널, 인크로부터 구매하였다.
이들 결과는 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체가 시간이 지남에 따라 적절한 길이와 형태의 응집체로 자기-조립하여 (아마도 혈소판 콜라겐 수용체에서) 혈소판 인식을 위한 구조적 요건을 충족시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 비공유 수단에 의해 서열 번호 25를 가진 짧은 (8 ㎚) CRP가 CRP 3량체로, 이어서 콜라겐-모방 특성을 가진 콜라겐-유사 피브릴로 자기-조립하는 것이 관찰되었다. 주목할만하게, CD, DLS 및 TEM 데이터에 의해 결정할 때, 마이크로미터-길이의, 삼중-나선-함유, 복합체 피브릴이 형성되었다. 또한, 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체는 콜라겐과 유사하게 혈소판 응집을 유도하는 능력을 가진 기능성 단백질-유사 물질로서 작용하였다. 화학식 I의 CRP를 위한 방향족-방향족 및 소수성-소수성 인식 모티프는 콜라겐-모방 펩티드를 위한 자기-조립에 대한 직접적인 접근법을 제공하며 생물학적 기능성 피브릴 구조로 조립할 수 있는 CRP 3량체를 제공한다.
실시예 5
콜라겐 또는 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체에 의해 유도된 혈소판 응집의 억제는 인테그린 GPIIb/IIIa 길항제 엘라로피반(elarofiban)을 이용하여 얻어졌다 (문헌[Hoekstra WJ, et al. J. Med. Chem. 1999, 42, 5254-5265]). 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체 및 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집을 엘라로피반,GPIIb/IIIa 억제제에 의해 억제하었다.
세척된 혈소판을 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체와 콜라겐의 첨가 전에 5분 동안 다양한 엘라로피반 투여량(10 nM, 100 nM 및 1000 nM)과 함께 항온처리하였다. 혈소판 응집의 투여량-의존성 억제가 관찰되었다. 이러한 데이타는 콜라겐뿐만 아니라 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체가 GPIIb/IIIa 신호화를 야기함으로써 혈소판 응집을 활성화시켰음을 시사한다.
실시예 6
콜라겐 또는 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체, 서열 번호 26을 가진 CRP 3량체, 서열 번호 27을 가진 CRP 3량체, 서열 번호 28을 가진 CRP 3량체 및 서열 번호 34를 가진 CRP 3량체에 의해 유도되는 혈소판 응집을 실시예 4에 개시된 방법에 의해 실시하였다. 본 발명의 실시 형태에 따라, 도 1은 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체, 서열 번호 26을 가진 CRP 3량체 및 서열 번호 27을 가진 CRP 3량체가 다양한 정도로 혈소판의 응집을 자극하였으며, 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체 및 서열 번호 26을 가진 CRP 3량체가 보다 더 강력하였음을 나타낸다. 서열 번호 28을 가진 참고 폴리펩티드, 서열 번호 34를 가진 참고 폴리펩티드 및 서열 번호 35를 가진 참고 폴리펩티드는 혈소판 응집을 자극함에 있어서 효과적이지 못했다. 콜라겐 및 서열 번호 25를 가진 CRP 3량체, 서열 번호 26을 가진 CRP 3량체 및 서열 번호 27을 가진 CRP 3량체에 대해 얻어진 도 1의 EC50 값 (± SEM) ㎍/㎖)이 표 4에 나타나있다.
Figure pct00008
실시예 7
비장 손상 모델에서의 CRP 코팅 및 PBS 대조군 코팅 PCL/PGA 폼
단계 A. CRP 현탁액
서열 번호 25를 가진 CRP를 pH 7.4를 가진 인산염 완충된 염수("PBS")에 0.33 ㎎ CRP/㎖ PBS의 농도로 용해시키고, 이어서 현탁액을 7일 동안 4℃에서 항온처리하여 시험 현탁액을 제조하였다.
단계 B. PCL/PGA 기재 폼의 제조
3 ㎜ 두께의 폴리(엡실론-카프로락톤-코-글리콜리드) ("PCL/PGA 폼")를, 동결 건조기(에프티에스 시스템즈(FTS Systems), 모델 TD3B2T5100)에서 약 3시간 동안 약 5 내지 약 -5℃의 온도 조건 하에 11.4 ㎝ × 11.4 ㎝ (4.5" × 4.5") 알루미늄 주형 내에서 1,4-다이옥산 중의 35/65 (㏖/㏖) PCL/PGA의 3 중량% 용액 50 그램을 동결건조하여 제조하였다. 생성된 PCL/PGA 폼을 주형으로부터 제거하고, 이어서 몇개의 5.1 ㎝ × 5.1 ㎝ (2" × 2") 정방형으로 절단하였다.
단계 C. 폴리펩티드 코팅된 폼의 제조
상기의 단계 B에서 개시된 절차에 따라 제조된 PCL/PGA 폼 정방형을 5.1 ㎝ × 5.1 ㎝ (2" × 2") 알루미늄 주형 내에 넣었다. 상기 단계 A에서 개시한 절차에 따라 제조한 CRP 현탁액을 균질해 보일 때까지 혼합한 후, 폼의 상부 표면을 사실상 커버하도록 7 ㎖의 현탁액을 주형에 부었다. 이어서 주형을 동결 건조기 (에프티에스 시스템즈, 모델 TD3B2T5100)에 넣고, -50℃로 사전냉각하고, 약 44시간 동안 -25℃에서 동결건조하였다.
단계 D. PBS 코팅된 대조군 폼의 제조
상기 단계 B에 개시된 절차에 따라 제조된 3 ㎜ 두께의 PCL/PGA 폼을 함유한 5.1 ㎝ × 5.1 ㎝ (2" × 2") 주형에 폼의 상부 표면을 사실상 커버하도록 7 ㎖의 PBS를 첨가하여 PBS 코팅된 폼을 제조하였다. 주형을 동결 건조기 (에프티에스 시스템즈, 모델 TD3B2T5100)에 넣고, -50℃로 사전냉각하고, 약 44시간 동안 -25℃에서 동결건조하였다.
CRP 코팅된 폼 및 PBS 코팅된 대조군 폼을 이어서 후속 시험을 위하여 몇개의 2 ㎝ × 3 ㎝ 조각으로 절단하였다.
비장 손상 모델
2개의 선형 열상 (각각 1 ㎝ 길이 및 0.3 ㎝ 깊이였음)을 돼지의 비장에 만들었다. 상처를 약 3초 내지 5초 동안 출혈되게 둔 후, 단계 C에 따라 제조된 CRP 코팅된 폼 조각을 하나의 상처의 표면에 손으로 적용하고(시험군 1), 단계 D에 따라 제조된 PBS 코팅된 대조군 폼 조각을 다른 상처의 표면에 손으로 적용하였다(시험군 2). 이어서 유사한 하방 압력을 30초 동안 시험 부위 각각에 인가하였다. 코팅된 폼 조각을 제거한 후, 지혈이 달성되었는지 결정하기 위하여 각각의 상처를 시각적으로 평가하였다. 필요하다면, 유사한 유형의 깨끗한 코팅된 폼 조각으로 30초 간격동안, 각 상처에 각각 압력을 재인가하였다. 각 상처에 대한, 지혈, 출혈의 중단을 달성하기 위한 시간이 하기 표 5에 나타나있다.
Figure pct00009
결과는 CRP 코팅된 폼이 대조군 폼보다 적은 시간 내에 지혈을 달성하기에 유용하였음을 나타낸다.
전술한 설명은 본 발명의 원리를 교시하며, 실시예는 예시의 목적을 위하여 제공되지만, 본 발명의 실시는 하기의 청구범위 및 이의 등가물의 범주 내에 드는 모든 보통의 변화, 개조 및/또는 변형을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 상기 설명에서 개시된 모든 문헌, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 모든 목적을 위해 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
<110> Ethicon, Inc. <120> COLLAGEN-RELATED PEPTIDES AND USES THEREOF <130> ETH5349WOPCT <150> US60/953,354 <151> 2007-08-01 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 343 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Completely Synthetic Amino Acid Sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(343) <223> Xaa = Hyp <220> <221> VARIANT <222> (1)..(343) <223> n = an integer selected from 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or 11 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(343) <223> p = an integer selected from 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 <220> <221> VARIANT <222> (1)..(343) <223> q = an integer selected from 0, 1, 2 or 3 <400> 1 Asx Gly Pro His Tyr Pro Gly Pro Asn Xaa Asx Gly Pro His Tyr Pro 1 5 10 15 Gly Pro Pro Xaa Asx Gly Pro His Tyr Pro Gly Pro Gln Xaa Asx Pro 20 25 30 His Tyr Pro Gly Pro Gly Asn Xaa Asx Pro His Tyr Pro Gly Pro Gly 35 40 45 Pro Xaa Asx Pro His Tyr Pro Gly Pro Gly Gln Xaa Asx His Tyr Pro 50 55 60 Gly Pro Gly Pro Asn Xaa Asx His Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Pro Xaa 65 70 75 80 Asx His Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Gln Xaa Asx Gly Pro Asn Gly Pro 85 90 95 His Tyr Pro Xaa Asx Gly Pro Pro Gly Pro His Tyr Pro Xaa Asx Gly 100 105 110 Pro Gln Gly Pro His Tyr Pro Xaa Asx Pro Gly Asn Pro His Tyr Pro 115 120 125 Gly Xaa Asx Pro Gly Pro Pro His Tyr Pro Gly Xaa Asx Pro Gly Gln 130 135 140 Pro His Tyr Pro Gly Xaa Asx Gly Pro Asn His Tyr Pro Gly Pro Xaa 145 150 155 160 Asx Gly Pro Pro His Tyr Pro Gly Pro Xaa Asx Gly Pro Gln His Tyr 165 170 175 Pro Gly Pro Xaa Asx Gly Pro Arg Gly Pro His Tyr Pro Gly Pro Ser 180 185 190 Xaa Asx Gly Pro Thr Gly Pro His Tyr Pro Gly Pro Xaa Asx Pro Gly 195 200 205 Arg Pro His Tyr Pro Gly Pro Gly Ser Xaa Asx Pro Gly Thr Pro His 210 215 220 Tyr Pro Gly Pro Gly Xaa Asx Gly Pro Arg His Tyr Pro Gly Pro Gly 225 230 235 240 Pro Ser Xaa Asx Gly Pro Thr His Tyr Pro Gly Pro Gly Pro Xaa Phe 245 250 255 Phe Gly Pro His Tyr Pro Phe Phe Gly Pro His Tyr Pro Phe Leu Gly 260 265 270 Pro His Tyr Pro Phe Gly Gly Pro His Tyr Pro Gly Ala Cys Gly Pro 275 280 285 His Tyr Pro Gly Pro His Tyr Pro Gly Pro His Tyr Pro Ala Pro His 290 295 300 Tyr Pro Gly Phe Phe Gly Pro His Tyr Pro Phe Phe Gly Pro His Tyr 305 310 315 320 Pro Phe Leu Gly Pro His Tyr Pro Phe Pro His Tyr Pro Gly Phe Phe 325 330 335 Gly Pro His Tyr Pro Pro His 340

Claims (46)

  1. 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드로 이루어지며, 폼(foam), 분말, 섬유 또는 필름의 형태인 조성물.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 상기 콜라겐-관련 펩티드를 추가로 포함하며, 콜라겐-관련 펩티드는 복수의 콜라겐-관련 펩티드 3량체의 형태로 존재하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 동종3량체인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 이종3량체인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 조성물은 폼 형태이며, 폼의 총 건조 중량을 기준으로 약 0.1% 내지 약 15%의 가소제를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 가소제는 글리세롤; 폴리에틸렌 글리콜; 글리세린; 프로필렌 글리콜; 글리세롤의 모노아세테이트; 글리세롤의 다이아세테이트; 글리세롤의 트라이아세테이트; 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 조성물은 두께가 약 0.5 ㎜ 내지 약 10 ㎜인 폼의 형태인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 조성물은 기공 크기가 약 1 마이크로미터 내지 약 500 마이크로미터인 폼의 형태인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 조성물은 두께가 약 50 마이크로미터 내지 약 150 마이크로미터인 필름의 형태인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 조성물은 분말의 형태이며, 분말은 입자 크기가 약 1 마이크로미터 내지 약 2000 마이크로미터인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 다당류; 만니톨; 다공성 화산암; 폴리에스테르; 및 이의 공중합체 및 혼합물로부터 선택된 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 다당류는 전분; 펙틴; 셀룰로오스; 알킬기가 약 1 내지 약 7개 탄소 원자를 갖는 알킬 셀룰로오스; 알킬기가 약 1 내지 약 7개 탄소 원자를 갖는 알킬하이드록시알킬 셀룰로오스; 알킬기가 약 1 내지 약 7개 탄소 원자를 갖는 하이드록시알킬 셀룰로오스; 셀룰로오스 설페이트; 카르복시메틸 셀룰로오스의 염; 카르복시메틸 셀룰로오스; 카르복시에틸 셀룰로오스; 키틴; 카르복시메틸 키틴; 히알루론산; 히알루론산의 염; 알긴산염; 가교결합된 알긴산염; 알긴산; 프로필렌 글리콜 알긴산염; 글리코겐; 덱스트란; 덱스트란 설페이트; 커들란; 펙틴; 풀루란; 잔탄; 콘드로이틴; 콘드로이틴 설페이트; 카르복시메틸 덱스트란; 카르복시메틸 키토산; 키토산; 헤파린; 헤파린 설페이트; 헤파린; 헤파란 설페이트; 더마탄 설페이트; 케라탄 설페이트; 카라기난; 키토산; 전분; 아밀로스; 아밀로펙틴; 폴리-N-글루코사민; 폴리만누론산; 폴리글루쿠론산; 및 이의 공중합체 및 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  13. 개체의 적어도 하나의 출혈 부위에 제1항의 조성물을 적용하는 단계로 이루어진, 지혈이 필요한 개체에서 지혈을 향상시키는 방법.
  14. (a) 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드; 및
    (b) 기재로 이루어진 조성물.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  15. 제14항에 있어서, 복수의 상기 콜라겐-관련 펩티드를 추가로 포함하며, 콜라겐-관련 펩티드는 복수의 콜라겐-관련 펩티드 3량체의 형태로 존재하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 동종3량체인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 이종3량체인 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 기재는 사람 신체 내로 이식하기에 적합한 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 기재는 봉합 나사못, 봉합사, 스테이플(staple), 외과용 택(tack), 클립(clip), 플레이트, 스크류, 필름; 조직 공학 스캐폴드; 폼 또는 분말인 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 기재는 지방족 폴리에스테르, 폴리(아미노산), 코폴리(에테르-에스테르), 알킬기가 약 1 내지 약 10개 탄소 원자를 가진 폴리알킬렌 옥살레이트, 폴리아미드, 티로신 유도 폴리카르보네이트, 폴리(이미노카르보네이트), 폴리오르토에스테르, 폴리옥사에스테르, 폴리아미도에스테르, 아민기를 함유한 폴리옥시에스테르, 폴리(안하이드라이드), 폴리포스파젠, 콜라겐, 엘라스틴, 젤라틴, 다당류, 및 이의 공중합체 및 블렌드(blend)로 이루어진 군으로부터 선택된 중합체로 구성되는 조성물.
  21. 제14항에 있어서, 기재는 면, 리넨, 실크, 나일론, 폴리에스테르, 플루오로중합체, 폴리올레핀, 폴리우레탄 및 이의 공중합체 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 물질로 구성되는 조성물.
  22. 제14항에 있어서, 기재는 사람 신체 내로 이식되지 않는 기재인 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 기재는 붕대, 접착 붕대, 상처 드레싱인 조성물.
  24. 제14항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드는 기재의 총 표면적을 기준으로, 약 0.01 ㎎/㎠ 내지 약 1 ㎎/㎠의 양으로 조성물 중에 존재하는 조성물.
  25. 제14항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드는 기재의 총 표면적을 기준으로, 약 0.1 ㎎/㎠ 내지 약 0.5 ㎎/㎠의 양으로 조성물 중에 존재하는 조성물.
  26. 제14항에 있어서, 기재는 엡실론-카프로락톤과 글리콜리드의 공중합체로 구성된 폼인 조성물.
  27. 개체의 출혈 부위에 제14항의 조성물을 적용하는 것으로 구성되는, 지혈이 필요한 개체에서 지혈을 향상시키는 방법.
  28. 개체의 출혈 부위에 제26항의 조성물을 적용하는 단계로 이루어지는, 지혈이 필요한 개체에서 지혈을 향상시키는 방법.
  29. a) 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드; 및
    b) 젤화제로 이루어지며,
    콜라겐-관련 펩티드는 젤의 총 중량을 기준으로 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 10 ㎎/㎖의 양으로 젤 중에 존재하는 젤.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  30. 제29항에 있어서, 복수의 상기 콜라겐-관련 펩티드를 추가로 포함하며, 콜라겐-관련 펩티드는 복수의 콜라겐-관련 펩티드 3량체의 형태로 존재하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 동종3량체인 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 콜라겐-관련 펩티드 3량체는 이종3량체인 조성물.
  33. 개체의 출혈 부위에 제29항의 젤을 적용하는 단계로 이루어지는, 지혈이 필요한 개체에서 지혈을 향상시키는 방법.
  34. a) 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드; 및
    b) 적어도 하나의 부형제로 이루어지는 조성물.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  35. 제1항의 조성물로 이루어지는 의료 장치.
  36. 제14항의 조성물로 이루어지는 의료 장치.
  37. 제29항의 조성물로 이루어지는 의료 장치.
  38. 제34항의 조성물로 이루어지는 의료 장치.
  39. 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드를, 개체의 원하는 부위에서 혈소판 응집을 개시하기에 효과적인 양으로 사용하는 단계를 포함하는, 출혈 질환 치료가 필요한 개체에서 출혈 질환을 치료하는 방법.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  40. (a) 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드를, 개체로부터의 혈소판을 함유한 혈액 또는 혈장과 배합하여 혼합물을 형성하는 단계;
    이어서,
    (b) 상기 혼합물에서의 혈소판 응집을 평가하기 위하여 혈소판 응집계에 혼합물을 첨가하는 단계를 포함하는, 출혈 질환 진단이 필요한 개체에서 출혈 질환을 진단하는 방법.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  41. (a) 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드; 및
    (b) 약학적 활성 제제로 이루어지는 조성물.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  42. 제41항에 있어서, 약학적 활성 제제는 지혈제, 항감염제, 진통제, 항염증제제, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 지혈제는 트롬빈, 피브리노겐, ADP, ATP, 칼슘, 마그네슘, TXA2, 세로토닌, 에피네프린, 혈소판 인자 4, 인자 V, 인자 EI, PAI-1, 트롬보스폰딘 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 항감염제는 항체, 항원, 항생제, 항바이러스 제제, 및 이의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  45. 제42항에 있어서, 항염증제제는 항히스타민인 조성물.
  46. 하기 화학식 I의 콜라겐-관련 펩티드로 보충된 화학적으로 한정된 3차원 중합체 매트릭스를 포함하는 조성물.
    [화학식 I]
    B-(Z)m-X
    상기 식에서,
    Z는 Gly-Pro-J, Pro-J-Gly 및 J-Gly-Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    J는 Hyp, fPro, mPro 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    m은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택된 정수이며;
    B 및 X는 독립적으로 F5-Phe, Phe (선택적으로 페닐 상에서 플루오로, 클로로, 브로모, 하이드록시, 메틸 또는 CF3로 일치환되거나 이치환됨), Tyr, 3,4-(OH)2-Phe, MeO-Tyr, 페닐글리신, 2-나프틸-Ala, 1-나프틸-Ala, Trp, Cha, Chg, Met, Leu, Ile 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택된다.
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