KR20140121864A - 지혈용 상처 드레싱 - Google Patents

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Abstract

지혈용 상처 드레싱이 기재된다. 드레싱은 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료, 및 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함한다. 드레싱은 효소적 활성을 필요로 하지 않고 지혈을 가속화시킬 수 있다. 특히, 드레싱은 외인성 트롬빈의 작용에 의존하지 않으며, 실온에서 용액 중에서 장기간 저장될 수 있다. 드레싱의 제조방법 및 출혈을 제어하기 위한 드레싱이 또한 기재된다.

Description

지혈용 상처 드레싱{HAEMOSTATIC WOUND DRESSING}
본 발명은 지혈용 상처 드레싱, 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트 및 지혈제, 드레싱의 제조방법, 및 출혈, 특히 예컨대 수술 실행에서 일어날 수 있는 중증의 출혈을 제어하기 위한 드레싱의 용도에 관한 것이다.
수술적 절차 동안 사용을 위한 몇몇 국소 지혈제가 현재 이용가능하다. 흡수성 젤라틴 스펀지, 예컨대 젤폼(Gelfoam)은 돼지 젤라틴으로부터 만들어진다. 젤폼은 혈액 중에서 그것의 중량의 40배 이상을 흡수할 수 있고, 그것의 초기 용적의 대략 200%로 확장된다. 스펀지의 표면은 응고 캐스케이드의 접촉 활성화 경로를 통해 혈소판 활성화를 야기한다. 대안의 젤라틴계 생성물인 플로실(Floseal)은 가교된 젤라틴 과립을 포함하며, 따라서 그들은 젤폼과 거의 동일한 정도로 팽창되지 않는다.
써지셀(Surgicel)과 같은 산화된 셀룰로스 시트는 알파-셀룰로스로부터 유래되며, 젤폼으로서 응고 캐스케이트의 접촉 활성화 경로에서의 동일한 지점에서 작용한다. 혈액으로 포화될 때, 시트는 젤라틴 덩어리로 빠르게 팽창된다. 마이크로피브릴라 콜라겐(Microfibrillar collagen), 예컨대, 어바텐(Avitene)은 소 피부로부터 유래된 콜라겐을 사용한다. 이는 가루 또는 시트 형태로 된다. 이는 혈액 표면에 단단히 결합되며, 최소 팽창을 야기한다. 이는 접촉 활성화를 야기하지만, 또한 혈소판을 직접적으로 활성화시킨다.
국소 지혈제는 종종 트롬빈과 함께 사용되는데, 이는 피브리노겐으로부터 피브린을 만들고 혈소판 활성화를 촉진함으로써, 혈액의 응고를 가속화시킨다. 정제된 소 또는 인간 트롬빈, 또는 재조합 인간 트롬빈이 사용된다. 그러나, 소 트롬빈은 특히 소 인자 V에서 소 항원으로 오염된다. 이 항원에 대해 만들어진 항체는 인간 인자 V와 교차반응되며, 생명을 위협하는 출혈을 야기하고, 일부 상황에서 아나필락시스(anaphylaxis) 및 사망을 야기한다. 인간 트롬빈은 이들 위험을 최소화하기 위한 노력에서 공여자의 혼주혈장(pooled plasma)으로부터 단리되었지만, 혈액매개 병원체, 특히 바이러스를 전염시킬 가능성이 있다. 최근에, 재조합 인간 트롬빈이 개발되었고, FDA에 의해 사용이 승인되었다. 이는 최소로 항원성인 이점을 가지며, 바이러스 전염의 위험을 옮기지 않는다. 그러나, 이는 유전적으로 변형된 중국 햄스터 난소 세포주를 사용하여 만들어지며, 따라서 생산하는 것이 상대적으로 비싸다.
정제된 소, 및 재조합 인간 트롬빈 제제는 실온에서 분말로서 저장되는데, 이는 사용 전 식염수에 의해 용액을 이용하여 재구성되어야 한다. FDA-승인된 정제된 인간 트롬빈은 용액으로서 포장되지만, 이는 실온에서 24시간까지만 저장될 수 있고; 장기간 저장은 냉동을 필요로 한다(Lew and Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008:2(4) 593-599).
트롬빈을 사용하는 것의 추가적인 단점은 효소가 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는데 시간이 걸리고, 따라서 혈액의 응고가 가속화되기 전 약간의 지연이 있다는 것이다.
따라서 빠르고 효과적으로 중증의 출혈을 중단시킬 수 있고, 트롬빈을 사용하는 것의 상기 단점 중 하나 이상을 극복하는 국소 지혈제를 제공할 필요가 있다.
본 발명에 따르면, 지혈용 상처 드레싱이 제공되는데, 이는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료, 및 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 하기를 포함한다: 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산이며, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(여기서, Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임).
피브리노겐은 2개의 말단 도메인(D-도메인)을 포함하는데, 이들 각각은 피브리노겐-결합 펩타이드에 결합될 수 있다. 예를 들어, 혈장 또는 혈액 중에서 피브리노겐이 펩타이드와 접촉될 때, 피브리노겐-결합 펩타이드 및 피브리노겐을 포함하는 공중합체가 형성되는데, 이는 피브린 응혈(fibrin clot)의 특징을 가진다. 따라서 본 발명의 지혈용 상처 드레싱에서 피브리노겐-결합 펩타이드의 존재는 지혈을 가속화시킨다.
본 발명의 지혈용 상처 드레싱은 놀랍게도 트롬빈 중에 침지된 통상적인 젤라틴 패드보다 유의하게 더 양호한 지혈 특성을 갖는 것이 발견되었다.
본 발명의 지혈용 상처 드레싱은 외인성 트롬빈의 작용에 의존하지 않는다. 피브리노겐-결합 펩타이드는 합성적으로 만들어질 수 있고, 따라서 최소로 항원성이며, 바이러스 전염 위험을 옮기지 않고, 포유류 세포주에서 발현된 재조합 단백질보다 더 저렴하게 만들어질 수 있으며, 실온에서 용액 중에서 장기간 저장될 수 있다.
본 발명의 지혈용 상처 드레싱은 지혈을 가속화하기 위한 효소적 활성을 필요로 하지 않으며, 따라서 피브리노겐과 접촉 즉시 지혈을 가속화한다.
용어 "비콜로이드성 다공성 드레싱 재료"는 본 명세서에서 상처를 뒤덮거나, 드레싱하거나 또는 보호하기 위해 국소적으로 적용될 수 있는 임의의 비콜로이드성 다공성 재료를 지칭하기 위해 사용된다. 이러한 재료의 예는 시트, 패드, 스펀지, 발포체(foam), 필름, 거즈, 메쉬, 과립 및 비드를 포함한다. 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 상처에 대한 국소 적용에 적합하지만, 신체 내로 주사에 적합하지 않은 재료를 포함한다. 특히, 과립 또는 비드는 폐 모세혈관상을 통과하기에는 너무 크다. 적어도 대다수의 과립 또는 비드는 6㎛ 초과인 최대 치수를 가진다. 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 임의의 적합한 화학물질을 포함할 수 있다. 예는 젤라틴, 면, 레이온, 폴리에스터, 콜라겐, 알기네이트, 및 산화된 셀룰로스를 포함한다. 젤라틴이 바람직하다.
트롬빈은 서열 NH2-GPRV-(서열번호 3) 및 NH2-GHRP-(서열번호 4)를 각각 노출하기 위한 피브리노겐의 α 및 β쇄의 아미노 말단으로부터 펩타이드를 절단한다(피브리노펩타이드 A 및 B를 방출). 본 발명의 지혈용 상처 드레싱의 피브리노겐-결합 펩타이드는 따라서 피브리노겐에 대한 트롬빈의 작용에 의해 노출된 서열과 서열이 다르다. 바람직하게는 적어도 일부(더 바람직하게는, 모두)의 피브리노겐-결합 펩타이드는 아미노 말단 단부에서 서열 NH2-GPRP-(서열번호 5)를 포함한다.
바람직하게는, 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각 길이로 4 내지 60, 바람직하게는 4 내지 30, 더 바람직하게는 4 내지 10개의 아미노산 잔기이다.
각각의 피브리노겐-결합 펩타이드의 아미노-말단 단부는 피브리노겐 분자에서 "구멍"에 결합될 수 있다(Weisel, Fibrinogen and Fibrin, Advances in Protein Chemistry, 2005, Vol. 70, pp. 247-299). 따라서, 각각의 펩타이드의 아미노-말단 단부에서 4개의 아미노산 잔기에 대해 카복시-말단인 피브리노겐-결합 펩타이드의 어떤 서열은, 이 서열이 피브리노겐에 대한 펩타이드의 아미노-말단의 결합을 저해하지 않는 한 중요하지 않다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태에서, 펩타이드가 피브리노겐에서 펩타이드의 결합 부위에 대해 고친화도로 맞물리도록 충분히 길다는 것을 보장하기 위하여 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 적어도 5개의 아미노산 잔기 길이이다. 따라서, 각각의 피브리노겐 결합 펩타이드는 길이로 5 내지 60, 5 내지 30, 또는 5 내지 10개 아미노산 잔기인 것이 특히 바람직하다. 각각의 이러한 피브리노겐-결합 펩타이드의 아미노-말단 단부로부터 다섯 번째 아미노산 잔기는 글라이신 잔기인 것이 바람직하다. 다른 실시형태에서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 길이로 적어도 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개 아미노산 잔기일 수 있다. 각각의 피브리노겐 결합 펩타이드는 길이로 60개 이하 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 길이로 30개 이하의 아미노산 잔기인 것이 바람직하다.
바람직하게는 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 합성 펩타이드이다.
바람직하게는 피브리노겐 결합 펩타이드는 10-9 내지 10-6M, 예를 들어 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 이상의 nM의 해리상수로 피브리노겐에 결합된다. 약 100nM의 해리상수가 바람직하다.
피브리노겐-결합 펩타이드는 각각 동일한 서열을 가질 수 있으며, 바람직하게는 각각은 아미노-말단 단부에서 서열번호 1의 서열을 포함한다. 대안적으로, 각각의 펩타이드가 그것의 아미노-말단 단부에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 한, 피브리노겐-결합 펩타이드는 상이한 서열의 펩타이드를 포함할 수 있다.
다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 다수의 담체는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 비공유적으로 고정되며, 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각 담체에 고정되며, 바람직하게는 공유적으로 고정된다.
예를 들어, 혈장 또는 혈액 중에서 피브리노겐이 담체에 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드와 접촉될 때, 그것은 펩타이드에 결합된다. 각각의 피브리노겐 분자가 2개의 펩타이드에 결합될 수 있기 때문에, 피브리노겐 분자는 담체를 통해 비공유적으로 가교되고, 피브린 응혈의 특징을 갖는 피브리노겐 및 담체를 포함하는 공중합체가 형성된다.
담체는 가용성 또는 불용성 담체일 수 있지만, 혈소판은 아니다. 담체는 출혈 상처 부위에 대한 국소 투여에 적합하여야 한다. 담체는 가용성 또는 불용성 중합체, 예를 들어 단백질, 다당류, 또는 합성의 생체에 적합한 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜, 또는 이들 중 어떤 것의 조합을 포함할 수 있다. 알부민은 바람직한 단백질 담체이다.
불용성 담체는 마이크로입자(고체, 중공 또는 다공성 마이크로입자, 바람직하게는 실질적으로 구체의 마이크로입자를 포함함)일 수 있다. 마이크로입자는 임의의 적합한 물질, 예를 들어 가교된 단백질로 형성될 수 있다. 적합한 단백질은 알부민(혈청-유래 또는 재조합, 서열에서 인간 또는 비인간)이다. 본 발명에서 불용성 담체로서 사용에 적합한 마이크로입자는, 예를 들어 WO 92/18164호에서와 같은 잘 공지된 분무 건조 기술을 사용하여 분무 건조 인간 혈청 알부민(HSA)에 의해 형성될 수 있다. 담체로서 마이크로입자의 사용에 대한 대안은 리포좀, 합성 중합체 입자(예컨대 폴리락트산, 폴리글라이콜산 및 폴리(락트/글라이콜)산), 또는 세포막 단편을 포함한다.
적어도 대다수의 담체는 바람직하게는 6㎛ 미만의 최대 치수를 가진다.
이론에서 담체 분자 당 피브리노겐-결합 펩타이드의 수에 대한 상한은 없다. 최적의 수는 다수의 인자, 예컨대 담체의 특성, 및 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착하기 위한 각 담체 상에서의 반응기의 수에 의존할 가능성이 있다. 그러나, 평균적으로 담체 분자 당 100개까지의 피브리노겐-결합 펩타이드가 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 평균적으로 담체 분자 당 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 5개 피브리노겐-결합 펩타이드가 있다. 바람직한 범위는 담체 분자 당 10 내지 20개 피브리노겐-결합 펩타이드이다.
바람직하게는 피브리노겐-결합 펩타이드는 담체에 공유적으로 고정된다.
담체는 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착시키는 반응기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 담체는 그것의 표면 상에 티올 모이어티 또는 아민 모이어티를 포함할 수 있다. 담체가 단백질이라면, 티올 또는 아민 모이어티는 아미노산, 예를 들어 시스테인 또는 리신의 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 반응기는 담체에 첨가될 수 있다. 이는 담체가 HSA와 같은 단백질로부터 형성된다면 특히 유리하다. 예를 들어, 담체는 담체 상에서 1차 아민기와 반응할 수 있는 2-이미노티올란(2-IT)과 같은 시약을 사용하여 티올화될 수 있다. 대안적으로, 시스타민은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재에서 담체 상의 카복실기에 결합된 다음, 도입된 이황화결합이 환원적으로 절단된다.
바람직한 실시형태에서, 피브리노겐-결합 펩타이드는 스페이서를 통해 담체에 공유적으로 고정된다. 바람직한 스페이서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)과 같은 친수성 중합체를 포함하는, 비펩타이드 스페이서이다. 바람직한 실시형태에서, 티올-반응기(예를 들어, 말레이미드기)에 연결된 피브리노겐-결합 펩타이드를 각각 포함하는 다수의 펩타이드 컨쥬게이트는 티올화된 담체와 반응된다(예를 들어 상기 기재한 바와 같은 2-IT 또는 시스타민을 사용하여 제조됨).
담체가 드레싱 재료에 고정되기에 충분히 길도록 드레싱 재료와 담체의 수용액 또는 현탁액을 접촉시킴으로써 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 담체가 비공유적으로 고정될 수 있다. 바람직한 방법에서, 담체는 드레싱 재료에 침지된다.
다른 실시형태에서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 선택적으로 스페이서를 통해 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 직접적으로 공유적으로 고정된다. 바람직한 스페이서는 비펩타이드 스페이서이며, 바람직하게는 PEG와 같은 친수성 중합체를 포함한다.
이러한 실시형태에서, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 바람직하게는 과립 또는 비드를 포함한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 과립 또는 비드는 중합체 물질, 예를 들어 젤라틴과 같은 단백질을 포함한다.
비콜로이드성 드레싱 재료는 피브리노겐-결합 펩타이드를 부착시키는 반응기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 드레싱 재료는 그것의 표면 상에서 티올 모이어티 또는 아민 모이어티를 포함할 수 있다. 드레싱 재료가 단백질이라면, 티올 또는 아민 모이어티는 아미노산, 예를 들어 시스테인 또는 리신의 측쇄에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 반응기는 드레싱 재료에 첨가될 수 있다. 이는 드레싱 재료가 젤라틴과 같은 단백질로부터 형성된다면, 특히 유리하다. 예를 들어, 드레싱 재료는 드레싱 재료 상의 1차 아민기와 반응할 수 있는 2-이미노티올란(2-IT)과 같은 시약을 사용하여 티올화될 수 있다. 대안적으로 시스타민은 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재에서 드레싱 재료 상의 카복실 기와 결합될 수 있고, 그 다음 도입된 이황화 결합을 환원적으로 절단할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 피브리노겐-결합 펩타이드는 스페이서를 통해 비콜로이드성 드레싱 재료에 공유적으로 고정된다. 바람직한 스페이서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)과 같은 친수성 중합체를 포함하는, 비펩타이드 스페이서이다. 바람직한 실시형태에서, PEG 스페이서에 의해 티올-반응기(예를 들어, 말레이미드기)에 연결된 피브리노겐-결합 펩타이드를 각각 포함하는 다수의 펩타이드 컨쥬게이트는 티올화된 드레싱 재료와 반응된다(예를 들어 상기 기재한 바와 같은 2-IT 또는 시스타민을 사용하여 제조함).
본 발명의 지혈용 상처 드레싱은 건조 형태에서 바람직하게는 냉동 건조된 형태에서 있을 수 있다. 이하의 실시예 5는 본 발명의 지혈용 상처 드레싱이 냉동 건조 후의 재수화 후 피브리노겐을 공중합하는 능력을 보유한다는 것을 나타낸다.
바람직하게는 상처 드레싱은 멸균이다. 본 발명의 지혈용 상처 드레싱은 상처에 투여할 준비가 된 멸균 상처 드레싱으로서 제공될 수 있다.
본 발명에 따라 상처에 상처 드레싱의 적용을 위한 설명서와 함께 포장된 본 발명의 지혈용 상처 드레싱이 추가로 제공된다.
또한 본 발명에 따라, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료, 및 별개로 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 지혈제를 포함하는 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트가 제공되되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(여기서 Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함한다.
키트는 상처에 드레싱 재료의 적용 전 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 지혈제를 적용하기 위한 설명서 및/또는 상처에 지혈용 상처 드레싱의 적용을 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 따라 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 지혈제가 제공되되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu); 또는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(여기서 Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함하고, 지혈제는 상처에 드레싱 재료의 적용 전 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 지혈제를 적용하기 위한 설명서와 함께 포장된다.
유리하게는, 지혈제는 용액 중에서, 현탁액 중에서, 또는 건조 형태, 예를 들어 동결건조된 형태에서 있을 수 있다. 이하의 실시예 3은 본 발명의 지혈제가 추출 후 피브리노겐을 동결건조된 본 발명의 지혈용 상처 드레싱으로 공중합하는 능력을 보유한다는 것을 입증한다. 실시예 6은 본 발명의 지혈제가 37℃에서 적어도 6개월 동안 용액 중에서 안정적이라는 것을 나타낸다. 따라서, 원한다면, 본 발명의 지혈제는 용액에서 저장될 수 있고, 그에 의해 사용 전 용액으로 재구성될 필요를 회피할 수 있다.
본 발명은 출혈, 특히 중증의 출혈을 제어하는 방법을 추가로 제공하며, 이는 상처에 본 발명의 지혈용 상처 드레싱을 투여하는 단계를 포함한다.
용어 "중증의 출혈"은 본 명세서에서 개입(수술적 또는 내시경적) 또는 사건을 중단시키거나 또는 제어하기 위한 폐쇄된 공간의 감압을 필요로 하는 출혈, 혈역학적 요소(hemodynamic compromise)(혈액, 혈액 대용액(fluid replacement), 심근변력작용(inotropic support) 또는 수술적 개입)를 야기하는 출혈, 또는 수동 압력, 부식요법(cauterization) 또는 봉합과 같은 통상적인 개입에 의해 제어될 수 없는 출혈을 포함하는 것으로 사용된다.
본 발명에 따르면, 또한 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 고정시키는 단계를 포함하는, 지혈용 상처 드레싱의 제조방법이 제공되되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(여기서 Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함한다.
다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 공유적으로 또는 비공유적으로 고정될 수 있다.
바람직하게는 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 다수의 담체를 고정시킴으로써 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 고정되되, 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각의 담체에 고정된다.
이러한 방법은 각 담체에 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 고정시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는 다수의 담체는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 비공유적으로 고정되며, 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각의 담체에 바람직하게는 공유적으로 고정된다.
담체에, 선택적으로 스페이서(바람직하게는 예를 들어, PEG와 같은 친수성 중합체를 포함하는, 비펩타이드 스페이서)를 통해 피브리노겐-결합 펩타이드를 공유적으로 고정시키기 위한 적합한 방법은 상기 기재되어있다.
비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 담체를 비공유적으로 고정시키기 위한 적합한 방법은 상기 기재되어 있다.
비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에, 선택적으로 스페이서(바람직하게는 예를 들어 PEG와 같은 친수성 중합체를 포함하는, 비펩타이드 스페이서)를 통해 직접적으로 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드를 공유적으로 고정시키기 위한 적합한 방법은 상기 기재되어 있다.
또한 본 발명에 따라 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 지혈제를 적용하는 단계를 포함하는 지혈용 상처 드레싱의 제조방법이 제공되되, 지혈제는 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하고, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(여기서 Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(여기서 Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함한다.
지혈제가 드레싱 재료에 고정되기에 충분히 길도록, 예를 들어 드레싱 재료와 지혈제의 수용액 또는 현탁액을 접촉시킴으로써, 지혈제는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 비공유적으로 적용될 수 있다. 바람직한 방법에서, 지혈제는 드레싱 재료에 침지된다.
본 발명의 특히 바람직한 지혈용 상처 드레싱은 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드(펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Pro-Gly- (서열번호 6)를 바람직하게 포함하는 각각의 펩타이드)가 비펩타이드 스페이서(적합하게는 폴리에틸렌 글라이콜과 같은 친수성 중합체)를 통해 각각의 담체에 공유적으로 고정된 다수의 가용성 담체(바람직하게는 가용성 단백질 담체, 예컨대 알부민 담체)를 포함한다. 담체는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료(바람직하게는 젤라틴, 예컨대 젤라틴 패드를 포함하거나, 또는 레이온 또는 폴리에스터를 포함함)에 비공유적으로 고정된다. 이러한 지혈용 상처 드레싱의 예는 이하의 실시예 2, 3 및 4에서 기재된다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 지혈용 상처 드레싱은 비펩타이드 스페이서(적합하게는 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글라이콜)를 통해 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료(바람직하게는 젤라틴, 예컨대 젤라틴 과립을 포함함)에 직접적으로 공유적으로 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드(펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Pro-Gly-을 바람직하게 포함하는 각각의 펩타이드)를 포함한다. 이러한 지혈용 상처 드레싱의 예는 이하의 실시예 5에 기재된다.
본 발명의 실시형태는 이제 수반되는 도면을 참조로 하여 단지 예로서 기재된다:
도 1은 담체에 공유적으로 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드의 바람직할 예의 구조를 도시한 도면(본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 다수의 이러한 피브리노겐-결합 펩타이드는 담체에 공유적으로 고정된다 - 단지 담체에 고정된 단일 피브리노겐-결합 펩타이드는 도면에서 나타낸다);
도 2a는 문헌[Adams et al, J Thromb Thrombolysis, 2009, 28(1):1-5]에 따른 출혈 스코어의 할당을 위한 계획을 도시한 도면;
도 2b는 본 발명의 바람직한 실시형태에 따른 출혈용 상처 드레싱의 출혈 활성의 평가 결과를 나타내는 그래프를 도시한 도면;
도 3은 본 발명의 동결건조된 및 비동결건조된 지혈용 상처 드레싱으로부터 회복된 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드와 담체의 응고 활성(clotting activity)의 비교 결과를 도시한 도면;
도 4는 본 발명의 추가 바람직한 실시형태에 따른 지혈용 상처 드레싱의 지혈 활성의 평가 결과를 도시한 도면; 및
도 5는 37℃에서 6개월까지 동안 용액 중에서 HSA 담체에 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드의 안정성 시험 결과를 도시한 도면.
본 발명의 지혈용 상처 드레싱 및 지혈제에 대해 "응혈(clot) 형성" 및 "응고 활성"에 대한 언급은 드레싱 또는 지혈제 및 피브리노겐의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 공중합체의 형성에 대한 언급인데, 이는 피브린 응혈의 특징을 가진다.
실시예 1
알부민 담체에 대한 피브리노겐-결합 펩타이드의 컨쥬게이션
본 실시예는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 링커에 의해 말레이미드기(Mal)에 연결된 서열 GPRPG의 피브리노겐-결합 펩타이드의 알부민 담체에 대한 컨쥬게이션을 기재한다. 얻어진 생성물을 "페프로스탯(PeproStat)"으로서 지칭한다.
인간 혈청 알부민을 반응 완충제(50mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산[EDTA], pH 8.0±0.2) 중에서 50㎎/㎖로 희석시켰고, 60배 몰과량의 2-이미노티올란 하이드로클로라이드의 첨가에 의해 티올화시켰다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 티올화된 알부민을 20mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, 1mM EDTA pH 7.2 ±0.2(여과 완충제)를 사용하여 접선 유동 정용여과에 의해 미반응 2-이미노티올란 하이드로클로라이드로부터 분리시켰다.
여과 완충제 중에서 50㎎/㎖의 농도에서 펩타이드(GPRPG-PEG12-말레이미드)를 용해시키고, 1㎎ 알부민 당 0.95㎎ 펩타이드의 비에서 티올화된 알부민을 첨가함으로써 펩타이드 컨쥬게이션을 수행한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 과량의 펩타이드를 4℃에서 적어도 16시간 동안 10 내지 14KD 분자량 컷오프로 투석막을 사용하여 60배 과량의 트리스(Tris)-완충 식염수(TBS; 20mM 트리스, 150mM 염화나트륨 pH 7.2 ±0.2)에 대해 투석함으로써 제거하며, 완충제는 한번 바꾼다. 회수한 페프로스탯을 TBS 중에서 5㎎/㎖로 희석시켰고, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균여과시켰으며, 분배하였고, 4℃에서 저장하였다.
최종 생성물의 단백질 함량을 280㎚에서 흡광도를 측정함으로써 추정하며, 여기서 E(280, 1%) = 5.3이다.
최종 생성물의 활성을 시그마 아멜룽(Sigma Amelung) KC4 코어귤로미터(coagulometer)를 사용하여 조사한다. 간단히 설명하면, 0.5㎎/㎖에서 30㎕ 시험 샘플을 3㎎/㎖에서 100㎕ 정제된 인간 피브리노겐에 첨가하고, KC4는 6초 미만에 응혈 형성을 기록한다.
최종 생성물의 분자량을 미염색 단백질 사다리의 밴드 프로파일과 비교하여 쿠마씨(Coomassie)로 염색한 4 내지 15% 트리스-글라이신 사전성형된 겔을 사용하여 환원된 샘플의 SDS-PAGE에 의해 추정한다.
생성물 프로파일
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실시예 2
젤라틴 패드 상에 사전 침지 시킨 페프로스탯의 지혈 활성 연구
페프로스탯의 지혈 활성을 헤파린처리한 토끼 모델을 사용하여 결정하였다. 그러나, 이 모델을 사용하기 전, 생성물이 토끼에서 활성이라는 것 및 특히 페프로스탯(GPRP-)의 피브리노겐-결합 서열이 토끼 피브리노겐에 결합된다는 것을 결정하는 것은 중요하였다. 이는 알부민 마이크로입자에 GPRPG 펩타이드를 컨쥬게이션함으로써 행해졌는데, 이는 그 다음에 FITC-표지된 토끼 피브리노겐과 함께 인큐베이션시켰다. 입자에 대한 형광 피브리노겐 결합을 그 다음에 유세포분석기를 사용하여 측정할 수 있다. 이 방법에 의해, 토끼 피브리노겐에 대한 페프로스탯의 결합은 인간 피브리노겐의 결합과 유사하였다는 것을 나타내었다. 이는 트롬빈이 피브리노겐으로부터의 피브리노펩타이드 A를 절단할 때 노출된 적절한 토끼 및 인간 피브리노겐 결합 서열이 동일하다는 것을 나타내는 공개된 데이터를 확인한다.
페프로스탯에서 피브리노겐 결합 서열(GPRP)은, 피브리노펩타이드 A가 트롬빈의 작용에 의해 피브리노겐으로부터 절단될 때 노출된 서열 GPR로부터 유래된다. 서열에서 4번째 아미노산(프롤린)은 해당 위치에서 발린 잔기를 가지는 인간 피브리노겐에서 천연 절단된 서열보다 피브리노겐에 대해 더 높은 친화도를 부여한다(Laudano and Doolittle Biochemistry 1980, 19: 1013-1019). Laudano 및 Doolittle은 모든 종이 말단의 GPR 서열을 공유하는 한편, 피브리노겐에 대한 친화도에 영향을 미치는 것으로 알려진 위치 4에서 아미노산 내 변이가 있다는 것을 나타내었다. 서열 데이터는 토끼 피브리노겐이 위치 4에서 발린 잔기를 가지며, 따라서 토끼 및 인간 피브리노겐은 본 발명자들이 발견한 바와 같이 GPRP와 유사한 친화도를 갖는 것으로 예상된다는 것을 나타낸다.
토끼 간 마모 손상 모델을 사용하여 젤라틴 패드 상에 침지된 페프로스탯, 트롬빈 또는 식염수의 비교적 지혈 효과를 평가하였다. 1000IU/㎏에서 헤파린을 투약한 토끼에서 지혈 활성을 결정하였다.
메스 블레이드를 사용하여 젤라틴 패드를 2.0 x 3.0㎝로 절단하였다. 각각의 처리를 위해, 패드 샘플을 시험 용액(페프로스탯, 트롬빈 또는 식염수 용액)의 1.5㎖ 분액 중에서 침지시켰다. 그 다음에 그것을 회수하였고, 장갑을 낀 손가락 사이에서 짜내어 기포를 배출시킨 다음, 필요할 때까지 용액에 되돌렸다.
편평한 표면 마모 스톤(Dremel, part no. 85602 USA)을 지니는 드레멜(Dremel) 핸드 드릴(모델 395 타입 5, USA;10,000-35,000rpm)을 사용하여 간엽의 표면을 마모시킴으로써 표면성 순환 병변(직경 10.3㎜, 깊이 2 내지 3㎜)을 만들었다. 상처를 나간 혈액을 사전 칭량한 건조 면봉으로 15초 동안 수집하였다. 수집한 혈액의 중량을 출혈 중증도의 측정으로서 사용하였다. 면봉의 제거 후, 사전침지시킨 시험 패드를 적용하였고, 습윤 거즈를 사용하여 30초 동안 처리한 상처에 가벼운 압력을 적용하였다.
각각의 간에 대해 순차적으로 7개 상처를 수행하였고, 시험 패드를 7개 부위에 거쳐서 무작위화하였다. 각각의 시험 패드 상에서 34회 시험을 수행하였다.
시험 패드를 여전히 제자리에 둔 채로 수분 거즈의 제거 시, 상처를 1, 3, 6, 9 및 12분에 지혈에 대해 평가하였고, 여기서 1분은 시험 패드가 상처에 적용될 때로부터의 시간을 지칭한다. 출혈 스코어 0, 1, 2, 3, 4 및 5는 도 3a에서 나타내는 계획에 따른 수술에 의해 할당된다.
결과
스코어 0(즉, 출혈 없음)을 각 시점에 성공적인 지혈로서 판단한다. 성공으로서 간주되는 34회 처리의 백분율(n= 34 토끼)을 각 시점에 대해 계산하였다. 결과를 도 3b에 나타낸다.
결과는 젤라틴 패드 상에서 침지된 5㎎/㎖의 농도에서의 페프로스탯이 젤라틴 패드 상에서 침지된 식염수 또는 트롬빈(125단위/㎖)보다 유의하게 더 양호한 지혈제라는 것을 나타낸다.
실시예 3
젤라틴 패드 상에서 페프로스탯의 동결건조
패드의 흡수 용량을 결정하기 위해, 40㎠ 젤라틴 패드를 10㎖의 탈이온수 중에서 침지시켰다. 모든 공기를 제거하기 위해 패드를 문지르고 재침지시킴으로써 흡광도를 최대화한 후, 2㎖의 물을 남겼다. 따라서, 40㎠ 패드의 용량은 8㎖인 것으로 계산하였다.
10㎎/㎖에서 페프로스탯을 아미콘 울트라 원심분리(Amicon Ultra) 필터 장치를 사용하여 탈염시켰고, 2.5㎎/㎖로 희석시켰다. 40㎠ 젤라틴 패드를 2.5㎎/㎖에서 8㎖ 페프로스탯 중에서 침지시켰으며, 그 다음에 패드를 장갑을 낀 손가락을 통해 짜내어 기포를 제거하였다. 패드를 용액 중에 남겨두었고, 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어서 모든 용액이 흡수되는 것을 보장하였다.
그 다음에 벤치-탑 동결건조기를 사용하여 패드를 동결건조시켰다.
동결건조기의 선반을 -36℃에서 평형을 유지시켰고, 패드를 사전 냉동시킨 선반 상에 두었으며, 270분의 기간에 걸쳐 -20℃까지의 온도로 만든 열처리 단계를 실시하였다.
진공을 800mTorr로부터 감소시키고 동시에 온도를 20℃로 증가시키면서 800분에 걸쳐 1차 건조를 수행하였다.
동결건조된 패드를 데시케이터에 저장하였다.
동결건조시키지 않은 페프로스탯와 함께 동결 건조 후 패드로부터 회수한 페프로스탯의 응고 활성과 비교에 의해 동결건조의 성공을 분석하였다.
40㎎ 페프로스탯을 함유하는 40㎠ 패드는 동결건조 후 전체 440㎎의 무게가 나가는 것을 발견하였다.
25㎎을 패드로부터 절단하였고, 칭량 보트(weighing boat)에 넣었다. 1㎖ 10mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨 완충제, pH 7.2±0.2 중에서 패드를 철저히 침지시킴으로써 건조 페프로스탯을 패드로부터 추출한 다음, 얻어진 용액을 패드 밖으로 짜내었다. 4가지 별개의 경우에 대해 추출 절차를 수행하였다. 용액 중의 회수한 페프로스탯의 단백질 함량을 표준 페프로스탯의 희석으로부터 구성한 검량선으로부터 5㎛ C8 대칭 역상 HPLC를 사용하여 측정하였다.
추출한 단백질의 분석은 단백질의 90% 내지 95%가 패드로부터 회수되었다는 것을 나타내었다.
샘플의 응고 활성을 응혈을 형성하는데 걸린 시간을 측정하는 시그마 아멜룽 KC-4 코어귤로미터를 사용하여 측정하였다. 용리된 페프로스탯의 응고 활성 분석을 비동결건조된 펩프로스텟의 응고 활성 분석과 비교하였다.
결과
결과를 도 4에 나타낸다.
0.5㎎/㎖에서 KC-4 코어귤로미터에서 시험할 때, 비동결건조된 페프로스탯과동결건조된 패드로부터의 펩프로스텟의 응고 활성 간에 유의한 차이가 없었다.
실시예 4
레이온/ 폴리에스터 다공성 드레싱 상에 침지시킨 페프로스탯의 지혈 활성
폴리에스터/레이온 배합물 상에 침지시킨 5㎎/㎖에서의 0.5㎖ 페프로스탯의 지혈 활성을 다음과 같은 혈액 임피던스를 사용하여 측정하였다:
폴리에스터/레이온 거즈의 이중층을 2.5㎝의 내부 직경을 지니는 유니버셜(Universal) 용기 위로 신장시켰고, 개방관을 뒤덮는 거즈의 면적을 표시하였다. 거즈를 관으로부터 제거하였고, 5㎎/㎖에서 0.5㎖ 페프로스탯을 표시한 원에 적용하였으며; 0.5㎖ 물을 대조군으로서 동일한 방법으로 표시한 제2 드레싱에 적용하였다.
유니버셜 용기를 칭량하였고, 침지시킨 거즈를 관의 입구를 거쳐서 신장시켰다. 4 x 0.5㎖ 시트레이트 처리된 전혈을 침지시킨 거즈에 순차적으로 적용하였고, 거즈를 통한 혈액 이동을 관 내의 혈액 중량에 의해 측정하였다.
결과
거즈 + 페프로스탯을 통과한 혈액의 평균 중량은 0.009g ±0.016g(n=3)이었고, 도 5에서의 대표적인 도면에서 도시되는 바와 같이 대조군 거즈(n=3)를 통과한 0.695g ±0.721g과 비교하였다.
실시예 5
고정된 피브리노겐-결합 펩타이드에 의한 젤라틴 담체의 지혈 특성
이 실시예는 본 발명의 2가지 상이한 지혈용 상처 드레싱의 제조 및 그것의 지혈 특성을 기재한다. 드레싱은 둘 다 PEG 링커를 통해 각각의 담체에 공유적으로 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 지니는 다수의 젤라틴 담체를 포함한다. 이 예에서, 젤라틴 담체(또는 과립)는 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료를 제공한다.
제1 드레싱을 준비하기 위해, 2-이미노티올란을 사용하여 젤라틴 담체에 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드-PEG 링커 컨쥬게이트를 공유적으로 부착시켰다. 제2 드레싱을 준비하기 위해, 시스타민 모이어티를 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)의 존재에서 젤라틴의 카복실기에 컨쥬게이션시킨 다음, 도입된 이황화 결합의 환원적 절단으로 피브리노겐-결합 펩타이드의 부착을 위한 유리 티올을 만들었다.
2- 이미노티올란을 사용하여 GPRPG - PEG -12- Mal 과 컨쥬게이션된 젤라틴 과립의 제조
아민 잔기를 변형시키는 2-이미노티올란을 사용하여 젤라틴 과립을 티올화시켰다. 사용한 방법은 문헌[Kommareddy S, Amiji M, 2005, Bioconjugate Chem 16: 1423-1432]의 방법이었다.
1g의 젤라틴 과립을 칭량하였고, 실온에서 10분 동안 롤러 믹서 상에서 혼합에 의해 50mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, 0.1M EDTA pH 8.0 ±0.2를 함유하는 40㎖의 완충제 중에서 수화시켰다. 102g의 2-이미노티올란을 수화된 젤라틴에 첨가하였고, 1시간 동안 롤러 믹서 상에서 혼합하였다. 그 다음에 과립을 500rpm-RCF 28에서 2분 동안 교반시켰고, 상청액을 제거하였으며, 용적을 20mM 인산나트륨, 0.15M NaCl, 0.1 M EDTA pH 7.2±0.2로 대체하였다. 이것을 4회 반복하여 2-이미노티올란을 제거하였다.
엘만(Ellman) 분석을 수행하여 젤라틴 상에 도입된 -SH 기의 수를 측정하였다. 엘만 시약 5,5' 다이티오비스(2-나이트로벤조산)는 약알칼리 조건 하에서 설프하이드릴과 반응하여 고도의 발색성 화합물인 5-티오-2 나이트로벤조산(TNB)을 방출하였다(Ellman GL. (1959) Arch Bichem.Biophys.82 70-77).
-SH기의 정량화 후, 50㎎/㎖에서 2.5㎖ GPRPG-PEG-12-Mal를 과립에 첨가하였고, 1시간 동안 롤러 혼합하였다. 그 다음에 과립을 증류수로 4회 세척하여 과량의 펩타이드를 제거하였다. 과립의 슬러리를 플라스틱 용기에 넣었고, 37℃에서 15시간 동안 인큐베이션에 의해 건조시켰다.
EDC / 시스타민 화학을 사용하여 GPRPG - PEG -12- Mal 과 컨쥬게이션된 젤라틴 과립의 제조
2.2g의 젤라틴 과립을 칭량하였고, 롤러 믹서 상에서 80㎖의 50mM MES 완충제, pH 6.0 중에서 15분 동안 수화시켰다. 625㎎의 시스타민, 350㎎의 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필) 카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 130㎎의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 칭량하였고, 수화된 과립에 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 롤러 믹서 상에서 2시간 동안 남긴 다음, 2개의 50㎖ 관으로 분할하였다. 그 다음에 과립을 세척하였고, 4 x 40㎖ 용적의 MES 완충제로 500rpm에서 교반시켰다. 200㎕의 1M 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP) 저장액을 각 관에 첨가하였으며, 롤러 믹서 상에서 주위 온도에서 10분 동안 두었다. 4 용적의 MES로 반복 세척한 후 엘만 분석으로 유리 -SH를 결정하였다.
50㎎/㎖에서 7.2㎖의 GPRPG-PEG-12-Mal을 10.45㎖의 N-에틸-말레이미드와 혼합한 다음 8.8㎖의 혼합물을 각 관에 첨가하였다. 반응물을 롤러 믹서 상에서 주위 온도에서 1시간 동안 두었다.
반응물을 세척하였고 4용적의 밀리큐(Milli-Q) 워터와 함께 800rpm에서 교반시켜 과량의 펩타이드 및 N-에틸-말레이미드를 제거하였다. 그 다음에 과립을 플라스틱 박스에 부었고, 네스코필름(Nescofilm)으로 덮었으며, 네스코필름을 뚫고, 다음과 같은 건조를 위해 벤치-탑 동결건조기에 넣었다:
컨쥬게이션된 과립에 대한 건조 과정
동결건조기의 선반을 -36℃에서 평형을 유지시켰고, 젤라틴 과립을 사전 냉동시킨 선반 상에 두었으며 270분의 기간에 걸쳐 온도를 -20℃까지 만드는 열 처리 단계를 실시하였다. 20℃의 온도에서 동시에 증가시키면서 800분에 걸쳐 800 mTorr로부터 진공을 감소시키는 1차 건조를 수행하였다. 시험 전 동결건조된 과립을 데시케이터에 저장하였다.
플러그 붕해 시험에서 건조 젤라틴 과립의 시험
100㎎의 건조 컨쥬게이션된 젤라틴 과립을 3㎖ 주사기에 채운 다음, 주사기 커넥터를 사용하여 0.5㎖ 트리스-완충 식염수(TBS)(0.02M 트리스, 0.15M NaCl, pH 7.2±0.2)를 첨가하여 과립을 현탁시켰다. 500u/㎖ 또는 0.5㎖ TBS에서 0.5㎖ 트롬빈을 100㎎ "블랭크"(비컨쥬게이트된 젤라틴 과립)에 첨가하였다. 주사기 커넥터를 사용하여, TBS를 다른 3㎖ 주사기로부터 각 제형으로 통과시켜 그것을 현탁시켰다. 각각의 현탁액을 그 다음에 대략 40회 주사기 사이에서 그것을 통과시킴으로써 혼합하였다.
젤라틴 슬러리를 제3의 3㎖ 주사기에 첨가하였고, 주사기 플런저를 사용하여 플러그를 형성하였다. 그 다음에 0.2㎖의 혈장을 플러그에 주사하였고, 3분 동안 그대로 두었다. 주사기의 바닥을 절단하였고, 플러그를 0.9% 식염수를 함유하는 50㎖관에 밀어넣었다. 그 다음에 관을 10분까지 동안 교반 혼합기 상에서 혼합하였다. 그 다음에 플러그를 다름과 같이 10분의 기간에 걸쳐 스코어링하였다:
0 = 완전히 붕해된 플러그; 2 = 작은 덩어리가 존재(2 내지 5㎜ 크기); 5 = 더 큰 덩어리가 존재(5 내지 8㎜ 크기); 8 = 큰 플러그 완전체, 부식의 징후; 10 = 완전히 완전체 플러그.
결과
Figure pct00002
결과는 본 발명의 컨쥬게이트된 젤라틴 과립을 사용하여 형성된 플러그의 기계적 내구성이 트롬빈과 혼합된 비컨쥬게이트된 과립과 동일하다는 것을 나타낸다.
실시예 6
용액 중에서 담체에 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드의 안정성
본 실시예는 37℃에서 용액 중에서 담체에 고정된 피브리노겐-결합 펩타이드의 안정성 시험 결과를 기재한다.
페프로스탯(피브리노겐-결합 펩타이드를 포함, 각각의 서열 GPRPG는 HSA 담체에 고정됨)을 37℃에서 6개월 동안 용액 중에서 저장하였다. 시점 0에서 그리고 저장 기간 동안의 다양한 시간에, 저장 용액의 샘플을 다음과 같이 피브리노겐과 공중합체를 형성하는 능력에 대해 분석하였다:
피브리노겐을 10mM HEPES, 0.15M NaCl, pH 7.3+/1 0.2 내지 6㎎/㎖ 중에서 희석시켰다. 5㎎/㎖에서 25㎕ 페프로스탯을 400㎕의 희석시킨 피브리노겐에 첨가하였고, 페프로스탯과 피브리노겐의 공중합체를 포함하는 시각적 응혈의 형성에 걸린 시간을 기록하였다.
결과를 도 5에 나타내었고, 이는 페프로스탯이 37℃에서 적어도 6개월 동안 안정적이라는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Haemostatix Limited Haemostatix Limited <120> Haemostatic Wound Dressing <130> P/67374.WO01 <150> GB 1201751.3 <151> 2012-02-01 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Gly Pro Arg Xaa 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Gly His Arg Xaa 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Pro Arg Val 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly His Arg Pro 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 5 Gly Pro Arg Pro 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 6 Gly Pro Arg Pro Gly 1 5

Claims (28)

  1. 지혈용 상처 드레싱으로서, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료, 및 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는,
    상기 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는
    상기 펩타이드의 아미노-말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산인 아미노산 서열임)를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 비공유적으로 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 다수의 담체가 고정되고, 각각의 담체에 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드가 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  4. 제3항에 있어서, 상기 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각의 담체에 공유적으로 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 비펩타이드 스페이서에 의해 상기 담체에 공유적으로 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비펩타이드 스페이서는 친수성 중합체를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  7. 제6항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜을 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체는 가용성 담체인 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  9. 제1항에 있어서, 상기 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 공유적으로 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  10. 제9항에 있어서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드가 비펩타이드 스페이서에 의해 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 공유적으로 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  11. 제10항에 있어서, 상기 비펩타이드 스페이서는 친수성 중합체를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  12. 제11항에 있어서, 상기 친수성 중합체는 폴리에틸렌 글라이콜을 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  13. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 시트, 패드, 스펀지, 발포체(foam), 필름, 거즈, 메쉬 또는 과립 또는 비드를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  14. 제13항에 있어서, 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 과립을 포함하며, 대다수의 상기 과립은 6㎛ 초과인 최대 치수를 가지는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  15. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료는 젤라틴, 면, 레이온, 폴리에스터, 콜라겐, 알기네이트 또는 산화된 셀룰로스를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  16. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 건조 형태인 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  17. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 형태인 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  18. 선행하는 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각 4 내지 60개의 아미노산 잔기 길이인 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상처에 상기 상처 드레싱의 적용을 위한 설명서와 함께 포장된 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈을 제어하기 위한 것인, 지혈용 상처 드레싱.
  21. 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트로서, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료, 및 별개로, 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 지혈제를 포함하되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트.
  22. 제21항에 있어서, 상처에 상기 드레싱 재료의 적용 전 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 상기 지혈제를 적용하기 위한 설명서를 더 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상처에 상기 지혈용 상처 드레싱의 적용을 위한 설명서를 더 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱의 형성을 위한 키트.
  24. 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하는 지혈제로서, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는,
    상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는
    상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함하고,
    상기 지혈제는 상처에 상기 드레싱 재료의 적용 전 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 상기 지혈제를 적용하기 위한 설명서와 함께 포장된 것인 지혈제.
  25. 출혈을 제어하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 지혈용 상처 드레싱을 상처에 투여하는 단계를 포함하는, 출혈의 제어방법.
  26. 지혈용 상처 드레싱을 제조하는 방법으로서, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 고정시키는 단계를 포함하되, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는,
    상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는
    상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함하는, 지혈용 상처 드레싱의 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 다수의 담체를 고정시킴으로써 상기 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 고정되되, 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드는 각각의 담체에 고정된 것인, 지혈용 상처 드레싱의 제조방법.
  28. 지혈용 상처 드레싱을 제조하는 방법으로서, 비콜로이드성 다공성 드레싱 재료에 지혈제를 적용하는 단계를 포함하되, 상기 지혈제는 다수의 담체 및 각각의 담체에 고정된 다수의 피브리노겐-결합 펩타이드를 포함하며, 각각의 피브리노겐-결합 펩타이드는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-Pro-Arg-Xaa(서열번호 1)(Xaa는 Val 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 Pro, Sar 또는 Leu임); 또는 상기 펩타이드의 아미노 말단 단부에서의 아미노산 서열 Gly-His-Arg-Xaa(서열번호 2)(Xaa는 Pro 이외의 임의의 아미노산임)를 포함하는 것인, 지혈용 상처 드레싱의 제조방법.
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