CN104114198B - 止血伤口敷料 - Google Patents

止血伤口敷料 Download PDF

Info

Publication number
CN104114198B
CN104114198B CN201380007527.0A CN201380007527A CN104114198B CN 104114198 B CN104114198 B CN 104114198B CN 201380007527 A CN201380007527 A CN 201380007527A CN 104114198 B CN104114198 B CN 104114198B
Authority
CN
China
Prior art keywords
xaa
peptide
amino acid
dressing
colloid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201380007527.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104114198A (zh
Inventor
格雷格·沃克
萨拉·玛格丽特·米德尔顿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Haemostatix Ltd
Original Assignee
Haemostatix Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haemostatix Ltd filed Critical Haemostatix Ltd
Publication of CN104114198A publication Critical patent/CN104114198A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104114198B publication Critical patent/CN104114198B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/22—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing macromolecular materials
    • A61L15/32—Proteins, polypeptides; Degradation products or derivatives thereof, e.g. albumin, collagen, fibrin, gelatin
    • A61L15/325—Collagen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/425—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0036—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/0047—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L24/0073—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material with a macromolecular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/04—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices containing macromolecular materials
    • A61L24/10—Polypeptides; Proteins
    • A61L24/108—Specific proteins or polypeptides not covered by groups A61L24/102 - A61L24/106
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
    • A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
    • A61L26/0028—Polypeptides; Proteins; Degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/25—Peptides having up to 20 amino acids in a defined sequence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/418—Agents promoting blood coagulation, blood-clotting agents, embolising agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/606—Coatings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/04—Materials for stopping bleeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/18—Modification of implant surfaces in order to improve biocompatibility, cell growth, fixation of biomolecules, e.g. plasma treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明描述了止血伤口敷料。所述敷料包含非胶体多孔敷料材料和固定到所述非胶体多孔敷料材料的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly‑Pro‑Arg‑Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly‑His‑Arg‑Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。所述敷料能够加速止血，不需要酶活性。具体而言，所述敷料不依赖于外源性凝血酶的作用，并且可在室温下长期储存于溶液中。本发明还描述了制备所述敷料的方法和所述敷料控制出血的用途。

Description

止血伤口敷料
本发明涉及止血伤口敷料、用于形成止血伤口敷料的试剂盒和止血剂、制备所述敷料的方法和所述敷料控制出血，尤其是例如可在外科实践中发生的几种出血的用途。
手术过程中使用的几种局部止血剂目前可用。吸收性明胶海绵，例如Gelfoam，由猪明胶制成。Gelfoam可吸收超过其重量40倍的血液并且扩大到其初始体积的约200％。海绵表面通过凝血级联的接触活化途径引起血小板活化。替代性明胶性产品Floseal包括已经交联的明胶颗粒，以致它们不会膨胀到与Gelfoam几乎相同的程度。
氧化纤维素片，例如Surgicel，源自α-纤维素并且在凝血级联的接触活化途径中与Gelfoam同时作用。血液饱和时，所述片迅速膨胀成凝胶状物质。微纤维胶原，例如Avitene，使用源自牛皮的胶原。其呈粉末或片形式。其与血液表面紧紧结合并且引起极小膨胀。其引起接触活化，但是也直接活化血小板。
局部止血剂常常连同由纤维蛋白原生成纤维蛋白并促进血小板活化的凝血酶一起使用，从而加速血液凝固。使用纯化牛或人凝血酶或重组人凝血酶。然而，牛凝血酶受牛抗原，尤其是牛因子V污染。对这种抗原产生的抗体可与人因子V交叉反应并导致致命性出血，并且在一些情况下，导致过敏反应和死亡。为了将这些风险减到最低，已经从供体的混合血浆分离出人凝血酶，但是有传播血源性病原体，尤其是病毒的可能。最近，已经研发了一种重组人凝血酶并且经FDA批准使用。其具有最低抗原性的优势并且不带病毒传播的风险。然而，其使用经基因改良的中国仓鼠卵巢细胞系制成，所以生产相对昂贵。
纯化牛和重组人凝血酶制剂在室温下呈粉末储存，使用之前必须用盐水复水为溶液。经FDA-批准的纯化人凝血酶呈溶液包装，但是在室温下这只可储存长达24小时；长期储存需要冷冻(Lew和Weaver，Biologics：Targets&Therapy 2008：2(4)593-599)。
使用凝血酶的另一缺点是酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白需要时间，所以在加速血液凝固之前稍有延迟。
因此，需要提供可迅速有效地终止严重出血，并且克服以上使用凝血酶的一种或多种缺点的局部止血剂。
根据本发明，提供了一种止血伤口敷料，其包含非胶体多孔敷料材料和固定到所述非胶体多孔敷料材料的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
纤维蛋白原包含两个各自可与纤维蛋白原结合肽结合的末端结构域(D-结构域)。例如在血浆或血液中，纤维蛋白原接触所述肽时，形成包含纤维蛋白原结合肽和纤维蛋白原，具有纤维蛋白凝块特征的共聚物。因此本发明的止血伤口敷料中纤维蛋白原结合肽的存在加速止血。
已经惊人地发现本发明的止血伤口敷料具有比浸在凝血酶中的常规明胶衬垫明显更好的止血性。
本发明的止血伤口敷料不依赖于外源性凝血酶的作用。纤维蛋白原结合肽可经合成制备，所以抗原性最低，不带病毒传播的风险，可比在哺乳动物细胞系中表达的重组蛋白质更便宜地制备，并且可在室温下长期储存于溶液中。
本发明的止血伤口敷料不需要酶活性来加速止血，所以与纤维蛋白原接触就立即加速止血。
本文使用术语“非胶体多孔敷料材料”指可局部施加以覆盖、包扎或保护伤口的任何非胶体多孔材料。此类材料的实例包括片、衬垫、海绵、泡沫、膜、纱布、网、颗粒和珠。非胶体多孔敷料材料包括适合向伤口局部施加，但不适合注入体内的材料。具体而言，颗粒或珠太大而不能通过肺毛细血管床。至少大部分颗粒或珠的最大尺寸大于6μm。非胶体多孔敷料材料可包含任何适合化学品。实例包括明胶、棉花、人造丝、聚酯、胶原、藻酸盐和氧化纤维素。优选明胶。
凝血酶从纤维蛋白原的α和β链的氨基端裂解肽(释放出纤维蛋白肽A和B)以分别暴露出序列NH2-GPRV-(SEQ ID NO：3)和NH2-GHRP-(SEQ ID NO：4)。因此本发明止血伤口敷料的纤维蛋白原结合肽在序列上与纤维蛋白原上通过凝血酶作用暴露的序列不同。优选至少一些(更优选全部)纤维蛋白原结合肽在氨基末端包含序列NH2-GPRP-(SEQ ID NO：5)。
优选纤维蛋白原结合肽各自长度为4-60个，优选4-30个，更优选4-10个氨基酸残基。
每个纤维蛋白原结合肽的氨基末端均能够与纤维蛋白原分子中的“孔”结合(Weisel，Fibrinogen and Fibrin，Advances in Protein Chemistry，2005，第70卷，第247-299页)。因此，在每个肽氨基末端的4个氨基酸残基的羧基端的纤维蛋白原结合肽任何序列并不关键，只要该序列不抑制所述肽的氨基末端与纤维蛋白原的结合。
在本发明的一些优选实施方案中，每个纤维蛋白原结合肽至少为5个氨基酸残基长以确保所述肽足够长以高亲和力与其在纤维蛋白原中的结合位点结合。因此，特别优选每个纤维蛋白原结合肽长度为5-60个、5-30个或5-10个氨基酸残基。优选从每个此类纤维蛋白原结合肽的氨基末端第5个氨基酸残基为甘氨酸残基。在其它实施方案中，每个纤维蛋白原结合肽可能长度为至少6、7、8、9、10或11个氨基酸残基。优选每个纤维蛋白原结合肽长度不长于60个氨基酸残基，更优选长度不长于30个氨基酸残基。
优选每个纤维蛋白原结合肽为合成肽。
优选地，纤维蛋白原结合肽与纤维蛋白原结合，解离常数介于10-9至10-6M之间，例如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400nM或更大。优选约100nM的解离常数。
纤维蛋白原结合肽可能各自具有相同序列，优选各自在氨基末端包含SEQ ID NO：1的序列。可选地，纤维蛋白原结合肽可能包含具不同序列的肽，只要每个肽在其氨基末端包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
所述多个纤维蛋白原结合肽可共价或非共价固定到非胶体多孔敷料材料。
根据本发明的一个优选实施方案，多个载体非共价固定到非胶体多孔敷料材料，并且多个纤维蛋白原结合肽固定，优选共价固定到每个载体。
例如在血浆或血液中，纤维蛋白原接触固定到载体的纤维蛋白原结合肽时，其与肽结合。因为每个纤维蛋白原分子可结合两个肽，所以纤维蛋白原分子变成经载体非共价交联，并且形成包含载体和纤维蛋白原，具有纤维蛋白凝块特征的共聚物。
载体可为可溶性或不溶性载体，但不是血小板。载体应适合向出血伤口部位局部施用。载体可包含可溶性或不溶性聚合物，例如蛋白质、多糖或合成生物相容性聚合物，例如聚乙二醇或任何这些的组合。白蛋白为优选蛋白质载体。
不溶性载体可为微粒(包括实心、空心或多孔微粒，优选大体球形微粒)。微粒可由任何适合物质，例如交联蛋白质形成。适合的蛋白质为白蛋白(在序列上为血清来源或重组、人或非人类)。例如WO 92/18164中，适合在本发明中用作不溶性载体的微粒可通过使用众所周知的喷雾干燥技术，喷雾干燥人血清白蛋白(HSA)形成。使用微粒作为载体的替代方案包括脂质体、合成聚合物颗粒(例如聚乳酸、聚乙醇酸和聚(乳酸/乙醇酸))或细胞膜碎片。
至少大部分载体优选最大尺寸小于6μm。
理论上，每个载体的纤维蛋白原结合肽数量没有上限。最佳数量很可能取决于许多因素，例如载体的性质和每个载体上连接纤维蛋白原结合肽的反应基团数量。然而，优选平均每个载体分子多达100个纤维蛋白原结合肽。优选地，平均每个载体分子有至少3个，优选至少5个纤维蛋白原结合肽。优选范围为每个载体分子10-20个纤维蛋白原结合肽。
优选地，纤维蛋白原结合肽共价固定到载体。
载体可包含允许连接纤维蛋白原结合肽的反应基团。例如，载体可在其表面包含硫醇部分或胺部分。如果载体为蛋白质性，则可由氨基酸例如半胱氨酸或赖氨酸的侧链提供硫醇或胺部分。可选地，可向载体添加反应基团。如果载体由蛋白质，例如HSA形成，这特别有利。例如，可使用能够与载体上的伯胺基反应的试剂例如2-亚氨基硫烷(2-IT)硫醇化载体。可选地，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下，使胱胺与载体上的羧基偶联，接着还原裂解引入的二硫键。
在一个优选实施方案中，纤维蛋白原结合肽经间隔区共价固定到载体。优选间隔区为非肽间隔区，例如包含亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)。在一个优选实施方案中，各自包含通过PEG间隔区与硫醇-反应基团(例如，马来酰亚胺基团)连接的纤维蛋白原结合肽的多种肽偶联物与硫醇化载体(例如，使用如上所述的2-IT或胱胺制备而成)反应。
可通过使载体的水溶液或悬浮液与敷料材料接触足够长时间使载体非共价固定到非胶体多孔敷料材料，以致载体变成固定到敷料材料上。在一种优选方法中，将载体浸在敷料材料上。
在其它实施方案中，每个纤维蛋白原结合肽任选地经间隔区直接共价固定到非胶体多孔敷料材料。优选的间隔区为非肽间隔区，优选包含亲水性聚合物例如PEG。
在此类实施方案中，非胶体多孔敷料材料优选包含颗粒或珠。在一个特别优选的实施方案中，颗粒或珠包含聚合物质，例如蛋白质(例如明胶)。
非胶体敷料材料可包含允许连接纤维蛋白原结合肽的反应基团。例如，敷料材料可在其表面包含硫醇部分或胺部分。如果敷料材料为蛋白质性，则可由氨基酸例如半胱氨酸或赖氨酸的侧链提供硫醇或胺部分。可选地，可向敷料材料添加反应基团。如果敷料材料由蛋白质，例如明胶形成，这特别有利。例如，可使用能够与敷料材料上的伯胺基反应的试剂例如2-亚氨基硫烷(2-IT)硫醇化敷料材料。可选地，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下，使胱胺与敷料材料上的羧基偶联，接着还原裂解引入的二硫键。
在优选实施方案中，纤维蛋白原结合肽经间隔区共价固定到非胶体敷料材料。优选间隔区为非肽间隔区，例如包含亲水性聚合物例如聚乙二醇(PEG)。在一个优选实施方案中，各自包含通过PEG间隔区与硫醇-反应基团(例如，马来酰亚胺基团)连接的纤维蛋白原结合肽的多种肽偶联物与硫醇化敷料材料(例如，使用如上所述的2-IT或胱胺制备而成)反应。
本发明的止血伤口敷料呈干燥形式，优选呈冻干形式。以下实施例5显示本发明的止血伤口敷料在冻干后保持再水合后共聚纤维蛋白原的能力。
优选伤口敷料无菌。本发明的止血伤口敷料可作为准备好向伤口施用的无菌伤口敷料提供。
根据本发明进一步提供了与向伤口施加伤口敷料的说明书包装在一起的本发明止血伤口敷料。
根据本发明进一步提供了用于形成止血伤口敷料的试剂盒，其包含非胶体多孔敷料材料，和单独地，包含多个载体和固定到每个载体的多个纤维蛋白原结合肽的止血剂，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ IDNO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
试剂盒可进一步包含在向伤口施加敷料材料之前将所述试剂施加到非胶体多孔敷料材料上的说明书和/或向伤口施加止血伤口敷料的说明书。
还根据本发明提供了包含多个载体和固定到每个载体的多个纤维蛋白原结合肽的止血剂，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸，并且其中所述试剂与在向伤口施加敷料材料之前将所述试剂施加到非胶体多孔敷料材料上的说明书包装在一起。
有利的是，止血剂可呈溶液、悬浮液或干燥形式，例如冻干形式。以下实施例3证明本发明的止血剂在从本发明的冻干止血伤口敷料萃取到溶液中后，保持共聚纤维蛋白原的能力。实施例6显示本发明的止血剂在37℃下，呈溶液稳定至少6个月。因此，若需要，可将本发明的止血剂呈溶剂储存，从而避免在使用之前复水成溶液的需要。
本发明进一步提供了控制出血，尤其是严重出血的方法，其包括向伤口施用本发明的止血伤口敷料。
本文使用术语“严重出血”以包括需要干预(手术或内窥镜检查)或封闭空间减压以终止或控制所述事件的出血，引起血液动力学危害(需要血液、补液、强心剂或手术干预)的出血或无法通过常规干预例如手法压迫、烧灼或缝合控制的出血。
根据本发明还提供了一种制备止血伤口敷料的方法，其包括将多个纤维蛋白原结合肽固定到非胶体多孔敷料材料，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
多个纤维蛋白原结合肽可共价或非共价固定到非胶体多孔敷料材料。
优选地通过将多个载体固定到非胶体多孔敷料材料将多个纤维蛋白原结合肽固定到非胶体多孔敷料材料，其中多个纤维蛋白原结合肽固定到每个载体上。
此类方法可进一步包括将多个纤维蛋白原结合肽固定到每个载体上。
优选地，多个载体非共价固定到非胶体多孔敷料材料，并且多个纤维蛋白原结合肽优选共价固定到每个载体上。
以上描述了任选经间隔区(优选非肽间隔区，例如包含亲水性聚合物(例如PEG))将纤维蛋白原结合肽共价固定到载体上的适合方法。
以上描述了将载体非共价固定到非胶体多孔敷料材料的适合方法。
以上描述了任选经间隔区(优选非肽间隔区，例如包含亲水性聚合物(例如PEG))将每个纤维蛋白原结合肽直接共价固定到非胶体多孔敷料材料上的适合方法。
还根据本发明提供了一种制备止血伤口敷料的方法，其包括将止血剂施加到非胶体多孔敷料材料，其中所述止血剂包含多个载体和固定到每个载体的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸，优选为Pro、Sar或Leu；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
例如可通过使止血剂的水溶液或悬浮液与敷料材料接触足够长时间使止血剂非共价施加到非胶体多孔敷料材料上，以致止血剂变成固定到敷料材料上。在一种优选方法中，将止血剂浸在敷料载体上。
本发明特别优选的止血伤口敷料包含多个可溶性载体(优选可溶性蛋白载体，例如白蛋白载体)，多个纤维蛋白原结合肽(每个肽优选包含在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro-Gly-(SEQ ID NO：6))经非肽间隔区(适合地为亲水性聚合物，例如聚乙二醇)共价固定到每个载体。载体非共价固定到非胶体多孔敷料材料(优选包含明胶，例如明胶垫，或包含人造丝或聚酯)。以下实施例2、3和4中描述了此类止血伤口敷料的实例。
本发明进一步特别优选的止血伤口敷料包含经非肽间隔区(适合地为亲水性聚合物，例如聚乙二醇)直接共价固定到非胶体多孔敷料材料(优选包含明胶，例如明胶颗粒)的多个纤维蛋白原结合肽(每个肽优选包含在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Pro-Gly)。以下实施例5中描述了此类止血伤口敷料的实例。
现参考附图，仅通过举例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1示出了共价固定到载体的纤维蛋白原结合肽的优选实例的结构(根据本发明的优选实施方案，多个此类纤维蛋白原结合肽共价固定到载体上-图中仅示出了固定到载体上的单个纤维蛋白原结合肽)；
图2a示出了根据Adams等人，J Thromb Thrombolysis，2009，28(1)：1-5分配出血评分的方案；
图2b为显示根据本发明的优选实施方案，止血伤口敷料止血活性的评估结果的图；
图3示出了从本发明的冻干和非冻干止血伤口敷料回收的具有固定纤维蛋白原结合肽的载体的凝血活性比较结果；
图4示出了根据本发明的另一优选实施方案，止血伤口敷料止血活性的评估结果；
图5示出了固定到HSA载体的纤维蛋白原结合肽在37℃下呈溶液储存长达6个月的稳定性测试结果。
提到关于本发明止血伤口敷料和止血剂的“凝块形成”和“凝固活性”是提到包含所述敷料或试剂的纤维蛋白原结合肽和纤维蛋白原，具有纤维蛋白凝块特征的共聚物的形成。
实施例1
纤维蛋白原结合肽与白蛋白载体的偶联
该实施例描述了通过聚乙二醇(PEG)连接子连接到马来酰亚胺基团(Mal)的序列GPRPG的纤维蛋白原结合肽与白蛋白载体的偶联。所得产物称为“PeproStat”。
将人血清白蛋白于反应缓冲液(50mM磷酸钠、150mM氯化钠、100mM乙二胺四乙酸[EDTA]，pH 8.0±0.2)中稀释至50mg/mL并通过添加60倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷盐酸盐硫醇化。在室温下温育1小时后，使用20mM磷酸钠、150mM氯化钠、1mM EDTA pH7.2±0.2(过滤缓冲液)，通过切向流渗滤法将硫醇化白蛋白与未反应的2-亚氨基硫烷盐酸盐分离。
通过按50mg/mL的浓度将肽(GPRPG-PEG12-马来酰亚胺)溶解于过滤缓冲液中并且按每1mg白蛋白0.95mg肽的比例添加到硫醇化白蛋白中进行肽偶联。在室温下温育1小时后，通过用60倍过量的Tris缓冲盐水(TBS；20mM Tris、150mM氯化钠pH 7.2±0.2)，使用截留分子量为10-14KD的透析膜在4℃下透析至少16小时，更换一次缓冲液，去除过量肽。于TBS中将回收的PeproStat稀释至5mg/mL，通过0.2μm过滤器无菌过滤，分配并于4℃下储存。
通过测量280nm下的吸光度估计最终产物的蛋白质含量，其中E(280，1％)＝5.3。
使用Sigma Amelung KC4凝血计研究最终产物的活性。简言之，按3mg/ml向100μL0.5mg/ml的纯化人纤维蛋白原添加30μL试样，KC4记录在少于6s内凝块形成。
使用经考马斯(Coomassie)染色的4-15％Tris-甘氨酸预制凝胶，通过还原样品的SDS-PAGE，通过与未染色蛋白梯的条带概况比较，估计最终产物的分子量。
产物概况
试验 参数 概况
E280下的吸附 总蛋白 5mg/ml
凝固活性 活性 ＜6s内0.5mg/ml凝块
SDS PAGE 分子量 85-120KD
实施例2
预先浸在明胶垫上的PeproStat的止血活性研究
使用肝素化兔模型测定PeproStat的止血活性。然而，在使用这种模型之前，重要的是确定产物在兔体内有活性，并且尤其是PeproStat的纤维蛋白原结合序列(GPRP-)与兔纤维蛋白原结合。这通过使GPRPG肽与白蛋白颗粒偶联完成，然后用FITC标记的兔纤维蛋白原培育。然后可使用流式细胞仪测定与颗粒结合的荧光纤维蛋白原。通过这种方法证实，PeproStat与兔纤维蛋白原的结合可与人纤维蛋白原匹敌。这证实了显示凝血酶由纤维蛋白原裂解纤维蛋白肽A时暴露的相关兔和人纤维蛋白原结合序列相同的公开资料。
PeproStat中的纤维蛋白原结合序列(GPRP)源自通过凝血酶的作用由纤维蛋白原裂解纤维蛋白肽A时暴露的序列GPR。序列中第4个氨基酸(脯氨酸)赋予对纤维蛋白原的亲和力高于人纤维蛋白原中在该位置具有缬氨酸残基的天然裂解序列(Laudano和DoolittleBiochemistry 1980，19：1013-1019)。Laudano和Doolittle已经证实，虽然所有物种共有末端GPR序列，但是已知影响对纤维蛋白原亲和力的位置4处的氨基酸上有变化。序列数据显示，兔纤维蛋白原在位置4也具有缬氨酸残基并且因此正如我们所发现那样，预计兔和人纤维蛋白原可能对GPRP具有同等亲和力。
兔肝脏磨损损伤模型用于评估浸在凝胶垫上的PeproStat、凝血酶或盐水相当的止血效果。可测定服用了1000IU/kg肝素的兔子的止血活性。
用解剖刀片将明胶垫切成2.0×3.0cm。对于每种处理，将衬垫样品浸入1.5ml等份的试验溶液(PeproStat、凝血酶或盐水溶液)。然后取回并且在戴手套的指间挤压以排出气泡，然后放回溶液中直至需要。
通过使用带有平面磨损石(Dremel，美国专利第85602号)的Dremel手钻(395型5类，USA；10,000-35,000rpm)磨损肝叶表面产生表浅圆形损伤(直径10.3mm，深度2-3mm)。用预先称量好的干拭子收集流出伤口的血液15秒。收集的血液重量作为对出血严重程度的度量。取出拭子后，施加预先浸透的试验垫，并且用湿纱布向处理伤口施加轻微压力30秒。
依次对每个肝脏进行7处损伤，并且使试验垫随机遍布7个部位。对每个试验垫进行34次试验。
取下湿纱布后，试验垫仍在原处，在第1、3、6、9和12分钟评价伤口，其中一分钟指从将试验垫施加到伤口上时起的时间。由外科医生根据图2a所示的方案指定0、1、2、3、4和5出血评分。
结果
将评分0(即，没有出血)判断为在每个时间点成功止血。计算34次处理(n＝34只兔子)在每个时间点视为成功的百分比。结果示于图2b中。
结果显示浸在明胶垫上浓度为5mg/ml的PeproStat是比浸在明胶垫上的盐水或凝血酶(125个单位/ml)明显更好的止血剂。
实施例3
将PeproStat冻干到明胶垫上
要测定衬垫的吸收量，将40cm2明胶垫浸入10ml去离子水中。通过按摩最大化吸光度和再次浸入衬垫以消除所有空气后，留下2ml水。因此计算40cm2衬垫的容量为8ml。
使用Amicon超离心过滤装置为10mg/ml的PeproStat脱盐并稀释到2.5mg/ml。将40cm2明胶垫浸入8ml，2.5mg/ml的PeproStat中，然后通过戴手套的手指挤压衬垫以去除气泡。将衬垫留在溶液中并且在室温下轻轻摇晃1小时以确保吸附所有溶液。
然后使用台式冷冻干燥机冻干衬垫。
使冷冻干燥机的架子在-36℃下平衡，将衬垫置于预冻架上并且经受热处理步骤，使温度在270分钟内达到-20℃。
在800分钟内完成初步干燥，使真空从800毫托降低，温度同时增加到20℃。
将冻干垫储存在干燥器内。
通过比较从衬垫回收的PeproStat在冻干后与尚未冻干的PeproStat的活性，分析冻干的成功。
发现含40mg PeproStat的40cm2垫在冻干后总计重440mg。
从衬垫上切下25mg并置于称量舟内。通过将衬垫衬底浸入1mL 10mM磷酸钠、150mM氯化钠缓冲液(pH 7.2±0.2)中，然后将所得溶液挤出衬垫，从衬垫中提取干燥PeproStat。提取过程在4个不同场合进行。使用5μm C8对称反相HPLC，从由标准PeproStat的稀释构造的校准曲线测量溶液中回收PeproStat的蛋白质含量。
对提取的蛋白质的分析显示从垫上回收了90-95％蛋白质。
使用测量形成凝块所花时间的Sigma Amelung KC-4凝血计测量样品的凝固活性。将洗脱PeproStat凝固活性的分析与非冻干PeproStat比较。
结果
图3中示出了结果。
在0.5mg/mL下，在KC-4凝血计中试验时，对照非冻干PeproStat和来自冻干垫的PeproStat的凝固活性之间没有显著差异。
实施例4
浸在人造丝/聚酯多孔敷料上的PeproStat的止血活性
如下使用血液阻抗法测量浸在聚酯/人造丝掺合物上的0.5mL、5mg/mL的PeproStat的止血活性：
在内径为2.5cm的通用容器上拉伸双层聚酯/人造丝纱布并且标记覆盖开口管的纱布区。从管上取下纱布并且将0.5mL、5mg/mL的PeproStat施加到标记的圆周上，将0.5ml水作为对照施加到以相同方式标记的第二敷料上。
称量通用容器并且拉伸浸透的纱布穿过管口。然后依次将4×0.5mL柠檬酸化全血施加到浸透的纱布上，并且通过管中血液的重量测量通过纱布转移的血液。
结果
如图4中所示代表性图片所示，与通过对照纱布(n＝3)的0.695g±0.721g相比，通过纱布+PeproStat的血液的平均重量为0.009g±0.016g(n＝3)。
实施例5
具有固定纤维蛋白原结合肽的明胶载体的止血性质
该实施例描述了本发明两种不同优选止血伤口敷料的制备及其止血性质。两种敷料均包含多个明胶载体，有多个纤维蛋白原结合肽经PEG连接子共价固定到每个载体。在该实施例中，明胶载体(或颗粒)提供了胶体多孔敷料材料。
为制备第一种敷料，用2-亚氨基硫烷将多个纤维蛋白原结合肽-PEG连接子偶联物共价连接到明胶载体。为制备第二种敷料，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下，使胱胺部分与明胶的羧基偶联，接着还原裂解引入的二硫键以生成供纤维蛋白原结合肽连接的游离硫醇。
使用2-亚氨基硫烷制备与GPRPG-PEG-12-Mal偶联的明胶颗粒
用修饰胺残基的2-亚氨基硫烷硫醇化明胶颗粒。所用方法为Kommareddy S、AmijiM，2005，Bioconjugate Chem 16：1423-1432的方法。
称取1g明胶颗粒并且在40ml含有50mM磷酸钠、0.15M NaCl、0.1MEDTA pH 8.0±0.2的缓冲液中，通过在室温下在滚轴混合器上混合10分钟水合。将102g的2-亚氨基硫烷加到水合明胶添中并且在滚轴混合器上混合1小时。然后在500rpm-RCF 28旋转颗粒2分钟，去除上清液并且用20mM磷酸钠、0.15M NaCl、0.1M EDTA pH 7.2±0.2更换体积。这样重复4次以去除2-亚氨基硫烷。
进行Ellman测定以测量引至明胶上的-SH基团数量。Ellman的试剂5，5’二硫代双(2-硝基苯甲酸)在弱碱性条件下与巯基反应以释放出高产色性化合物，5-硫代-2硝基苯甲酸(TNB)Ellman GL.(1959)ArchBichem.Biophys.8270-77。
-SH基团定量后，向颗粒中添加2.5ml、50mg/ml的GPRPG-PEG-12-Mal并且滚轴混合1小时。然后用蒸馏水洗涤颗粒4次以去除过量肽。将颗粒浆料置于塑料容器中并且通过在37℃下温育15小时干燥。
使用EDC/胱胺化学法制备与GPRPG-PEG-12-Mal偶联的明胶颗粒
称出2.2g明胶颗粒并且于滚轴混合器上，在80mL的50mM MES缓冲液pH6.0中水合15分钟。称出625mg胱胺、350mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和130mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并添加到水合颗粒中。在环境温度下将反应混合物留在滚轴混合器上2小时，然后分到两支50mL管中。然后在500rpm下用4×40mL体积的MES缓冲液洗涤并旋转颗粒。向每支管添加200μL的1M三(2-羧乙基)膦(TCEP)原液并且在环境温度下留在滚轴混合器上10分钟。用4体积的MES重复洗涤，接着进行Ellman测定以测定游离-SH。
使7.2mL、50mg/ml的GPRPG-PEG-12-Mal与10.45mL的N-乙基-马来酰亚胺混合，然后向每支管添加8.8mL混合物。在环境温度下将反应物留在滚轴混合器上1小时。
在800rpm下用4体积的Milli-Q水洗涤并旋转反应物以去除过量肽和N-乙基-马来酰亚胺。然后将颗粒倒入塑料盒中，盖上Nescofilm，刺破Nescofilm并置于台式冷冻干燥机中干燥，如下：
偶联颗粒的干燥过程
使冷冻干燥机的架子在-36℃下平衡，将明胶颗粒置于预冻架上并且经受热处理步骤，使温度在270分钟内达到-20℃。在800分钟内完成初步干燥，使真空从800毫托降低，温度同时增加到20℃。试验之前将冻干颗粒储存在干燥器内。
塞崩解试验中对干燥明胶颗粒的试验
将100mg干燥偶联明胶颗粒包装到3ml注射器中，然后使用注射器连接器添加0.5ml tris缓冲盐水(TBS)(0.02M Tris、0.15M NaCI，pH7.2±0.2)，以使颗粒悬浮。向100mg“空白”(非偶联明胶颗粒)添加0.5ml、500u/ml的凝血酶或0.5ml TBS。使用注射器连接器，使TBS从另一支3ml注射器中进入每种制剂中以使其悬浮。然后通过在注射器间传递约40次混合每种悬浮液。
将明胶浆料添加到第三支3ml注射器中并且用注射器活塞形成塞子。然后将0.2ml血浆注入塞子，并使其静置3分钟。切去注射器底部并将塞子推入装哟0.9％盐水的50ml管中。然后在涡旋混合器上混合所述管10分钟。然后如下，在10分钟内为塞子评分：
0＝塞子完全崩解；2＝存在一小块(尺寸为2-5mm)；5＝存在一大块(5-8mm)；8＝塞子大部分完整，有腐蚀迹象；10＝塞子完好无损。
结果
结果显示使用本发明的偶联明胶颗粒形成的塞子的机械耐久性与混合有凝血酶的非偶联颗粒相当。
实施例6
固定到载体的纤维蛋白原结合肽在溶液中的稳定性
该实施例描述了固定到载体的纤维蛋白原结合肽在37℃溶液中的稳定性试验的结果。
PeproStat(包含纤维蛋白原结合肽，每个序列GPRPG固定到HSA载体)在37℃下呈溶液储存6个月。在0时和储存期间的不同时间，测定储存溶液样品与纤维蛋白原形成共聚物的能力，如下：
将纤维蛋白原于10mM HEPES、0.15M NaCl(pH 7.3+/10.2)中稀释至6mg/ml。将25μl、5mg/ml的PeproStat添加到400μl稀释纤维蛋白原中，并且记录形成包含PeproStat和纤维蛋白原的共聚物的可见凝块所花的时间。
结果示于图5中，并且证明PeproStat在37℃下呈溶液稳定至少6个月。

Claims (27)

1.一种止血伤口敷料，其包含非胶体多孔敷料材料和固定到所述非胶体多孔敷料材料的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：
在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸；或
在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸；
其中所述非胶体多孔敷料材料包括片、衬垫、海绵、泡沫、膜、纱布、网或颗粒，其中如果所述非胶体多孔敷料材料包含颗粒，则至少大部分所述颗粒具有大于6μm的最大尺寸；
其中多个载体固定到所述非胶体多孔敷料材料并且多个纤维蛋白原结合肽共价固定到每个载体，或者所述多个纤维蛋白原结合肽共价固定到所述非胶体多孔敷料材料。
2.根据权利要求1的伤口敷料，其中所述非胶体多孔敷料材料包括珠，其中如果所述非胶体多孔敷料材料包含珠，则至少大部分所述珠具有大于6μm的最大尺寸。
3.根据权利要求1或2的伤口敷料，其中在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)中的Xaa为Pro、Sar或Leu。
4.根据权利要求1的伤口敷料，其中每个纤维蛋白原结合肽通过非肽间隔区共价固定到所述载体。
5.根据权利要求4的伤口敷料，其中所述非肽间隔区包含亲水性聚合物。
6.根据权利要求5的伤口敷料，其中所述亲水性聚合物包含聚乙二醇。
7.根据权利要求1或2或4-6中任一项的伤口敷料，其中所述载体为可溶性载体。
8.根据权利要求1或2的伤口敷料，其中每个纤维蛋白原结合肽通过非肽间隔区共价固定到所述非胶体多孔敷料材料。
9.根据权利要求8的伤口敷料，其中所述非肽间隔区包含亲水性聚合物。
10.根据权利要求9的伤口敷料，其中所述亲水性聚合物包含聚乙二醇。
11.根据权利要求1或2的伤口敷料，其中所述非胶体多孔敷料材料包含明胶、棉花、人造丝、聚酯、胶原、藻酸盐或氧化纤维素。
12.根据权利要求1或2的伤口敷料，其呈干燥形式。
13.根据权利要求1或2的伤口敷料，其呈冻干形式。
14.根据权利要求1或2的伤口敷料，其中所述纤维蛋白原结合肽各自为4-60个氨基酸残基长。
15.根据权利要求1或2的伤口敷料，与向伤口施加所述伤口敷料的说明书包装在一起。
16.根据权利要求1或2的伤口敷料，其用于控制出血。
17.一种用于形成止血伤口敷料的试剂盒，其包含非胶体多孔敷料材料，和单独的止血剂，所述止血剂包含多个载体和固定到每个载体的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
18.根据权利要求17的试剂盒，其中在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)中的Xaa为Pro、Sar或Leu。
19.根据权利要求17的试剂盒，其进一步包含向伤口施加所述敷料材料之前将所述止血剂施加到所述非胶体多孔敷料材料上的说明书。
20.根据权利要求17至19中任一项的试剂盒，其进一步包含向伤口施加所述止血伤口敷料的说明书。
21.根据权利要求1-14中任一项的止血伤口敷料在制备用于控制出血的试剂盒中的用途。
22.一种制备止血伤口敷料的方法，其包括将多个纤维蛋白原结合肽固定到非胶体多孔敷料材料，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：
在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸；或
在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸；
其中所述非胶体多孔敷料材料包括片、衬垫、海绵、泡沫、膜、纱布、网或颗粒，其中如果所述非胶体多孔敷料材料包含颗粒，则至少大部分所述颗粒具有大于6μm的最大尺寸；
其中多个载体固定到所述非胶体多孔敷料材料并且多个纤维蛋白原结合肽共价固定到每个载体，或者所述多个纤维蛋白原结合肽共价固定到所述非胶体多孔敷料材料。
23.根据权利要求22的方法，其中所述非胶体多孔敷料材料包括珠，其中如果所述非胶体多孔敷料材料包含珠，则至少大部分所述珠具有大于6μm的最大尺寸。
24.根据权利要求22或23的方法，其中在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)中的Xaa为Pro、Sar或Leu。
25.根据权利要求22或23的方法，其中通过将多个载体固定到所述非胶体多孔敷料材料，而将所述多个纤维蛋白原结合肽固定到所述非胶体多孔敷料材料，其中多个纤维蛋白原结合肽固定到每个载体。
26.一种制备止血伤口敷料的方法，其包括将止血剂施加到非胶体多孔敷料材料，其中所述止血剂包含多个载体和共价固定到每个载体的多个纤维蛋白原结合肽，其中每个纤维蛋白原结合肽包含：在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)，其中Xaa为除Val以外的任何氨基酸；或在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-His-Arg-Xaa(SEQ ID NO：2)，其中Xaa为除Pro以外的任何氨基酸。
27.根据权利要求26的方法，其中在所述肽氨基末端的氨基酸序列Gly-Pro-Arg-Xaa(SEQ ID NO：1)中的Xaa为Pro、Sar或Leu。
CN201380007527.0A 2012-02-01 2013-02-01 止血伤口敷料 Active CN104114198B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1201751.3 2012-02-01
GBGB1201751.3A GB201201751D0 (en) 2012-02-01 2012-02-01 Haemostatic wound dressing
PCT/GB2013/050237 WO2013114132A1 (en) 2012-02-01 2013-02-01 Haemostatic wound dressing

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104114198A CN104114198A (zh) 2014-10-22
CN104114198B true CN104114198B (zh) 2018-09-04

Family

ID=45876478

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380007527.0A Active CN104114198B (zh) 2012-02-01 2013-02-01 止血伤口敷料

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9808553B2 (zh)
EP (1) EP2809365B8 (zh)
JP (1) JP6258868B2 (zh)
KR (1) KR102168157B1 (zh)
CN (1) CN104114198B (zh)
ES (1) ES2879558T3 (zh)
GB (2) GB201201751D0 (zh)
HR (1) HRP20211112T8 (zh)
IN (1) IN2014DN06952A (zh)
RU (1) RU2661036C2 (zh)
WO (1) WO2013114132A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105916524A (zh) * 2014-01-08 2016-08-31 哈莫斯塔蒂斯有限公司 包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0516091D0 (en) * 2005-08-04 2005-09-14 Haemostatix Ltd Therapeutic agent
GB0808376D0 (en) 2008-05-08 2008-06-18 Bristol Myers Squibb Co Wound dressing
GB0817796D0 (en) 2008-09-29 2008-11-05 Convatec Inc wound dressing
GB201020236D0 (en) 2010-11-30 2011-01-12 Convatec Technologies Inc A composition for detecting biofilms on viable tissues
WO2012078781A1 (en) 2010-12-08 2012-06-14 Convatec Technologies Inc. Integrated system for assessing wound exudates
US9526816B2 (en) 2010-12-08 2016-12-27 Convatec Technologies Inc. Wound exudate monitor accessory
GB201115182D0 (en) 2011-09-02 2011-10-19 Trio Healthcare Ltd Skin contact material
GB2497406A (en) 2011-11-29 2013-06-12 Webtec Converting Llc Dressing with a perforated binder layer
GB201120693D0 (en) 2011-12-01 2012-01-11 Convatec Technologies Inc Wound dressing for use in vacuum therapy
KR20150099776A (ko) 2012-12-20 2015-09-01 컨바텍 테크놀러지스 인크 화학적 개질된 셀룰로스 섬유의 처리
GB201508020D0 (en) * 2015-05-11 2015-06-24 Haemostatix Ltd Haemostatic material
GB201508024D0 (en) * 2015-05-11 2015-06-24 Haemostatix Ltd Haemostatic compositions
GB201508014D0 (en) * 2015-05-11 2015-06-24 Haemostatix Ltd Haemostatic device
CN107709577A (zh) * 2015-06-08 2018-02-16 宝洁公司 鉴定护肤组合物的昼夜节律依赖性化妆剂的方法
EP3943127A1 (en) * 2015-09-01 2022-01-26 Baxter International Inc Hemostatic material
GB2543307B (en) * 2015-10-14 2020-12-09 Selentus Science Ltd Haemostatic device
CN109310528B (zh) 2016-03-30 2021-07-20 康沃特克科技公司 检测伤口中的微生物感染
KR20190008199A (ko) 2016-03-30 2019-01-23 시노보 게엠베하 상처에서 미생물 감염의 검출 방법
ES2882336T3 (es) 2016-07-08 2021-12-01 Convatec Technologies Inc Sistema flexible de presión negativa
WO2018009873A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Convatec Technologies Inc. Fluid collection apparatus
EP3481360B1 (en) 2016-07-08 2022-03-09 ConvaTec Technologies Inc. Fluid flow sensing
CN106344960B (zh) * 2016-09-20 2019-02-22 安徽思维特生物科技有限公司 利用微晶纤维素接枝改性胎牛皮胶原纤维制备的止血凝胶
IL256405A (en) * 2017-12-19 2018-01-31 Omrix Biopharmaceuticals Ltd Wound bandage and method for its production
GB2571080A (en) * 2018-02-14 2019-08-21 Medtrade Products Ltd Haemostatic material
CN110448719B (zh) * 2019-06-28 2020-05-22 浙江大学 一种促进凝血的丝素-多肽电纺膜及其制备方法
US11331221B2 (en) 2019-12-27 2022-05-17 Convatec Limited Negative pressure wound dressing
US11771819B2 (en) 2019-12-27 2023-10-03 Convatec Limited Low profile filter devices suitable for use in negative pressure wound therapy systems
GB2596525A (en) * 2020-06-26 2022-01-05 Fujifilm Corp Modified gelatins
CN112206307B (zh) * 2020-09-15 2023-12-05 广州领晟医疗科技有限公司 一种可注射的温敏型水凝胶及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101267843A (zh) * 2005-08-04 2008-09-17 哈莫斯塔蒂斯有限公司 人造血小板
CN101687061A (zh) * 2006-11-27 2010-03-31 哈莫斯塔蒂斯有限公司 生物凝胶

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE13810T1 (de) 1981-06-25 1985-07-15 Serapharm Gmbh & Co Kg Angereichertes plasmaderivat zur unterstuetzung von wundverschluss und wundabdeckung.
GB9107628D0 (en) 1991-04-10 1991-05-29 Moonbrook Limited Preparation of diagnostic agents
ES2194013T3 (es) 1992-05-29 2003-11-16 Univ North Carolina Plaquetas de sangre humana de secado fijo farmaceuticamente aceptables.
WO1997044015A1 (en) 1996-05-17 1997-11-27 Andaris Limited Microparticles and their use in wound therapy
AU718956B2 (en) 1996-10-21 2000-05-04 Quadrant Healthcare (Uk) Limited Platelet substitutes and conjugation methods suitable for their preparation
US6891077B2 (en) 2001-07-25 2005-05-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Fibrinogen bandages and arterial bleeding models and methods of making and using thereof
CA2482529A1 (en) 2002-04-15 2003-10-30 American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
US20040101546A1 (en) * 2002-11-26 2004-05-27 Gorman Anne Jessica Hemostatic wound dressing containing aldehyde-modified polysaccharide and hemostatic agents
US7550282B2 (en) 2002-11-20 2009-06-23 Bar-Ilan University Biological glue based on thrombin-conjugated nanoparticles
DE10323794A1 (de) 2003-05-23 2004-12-09 Dr. Suwelack Skin & Health Care Ag Verfahren zur Herstellung von Alginat-haltigen porösen Formkörpern
CA2530032C (en) 2003-06-16 2015-11-24 Loma Linda University Medical Center Deployable multifunctional hemostatic agent
US7186684B2 (en) 2003-08-07 2007-03-06 Ethicon, Inc. Hemostatic device containing a protein precipitate
US7927626B2 (en) 2003-08-07 2011-04-19 Ethicon, Inc. Process of making flowable hemostatic compositions and devices containing such compositions
GB0323378D0 (en) * 2003-10-07 2003-11-05 Univ Leicester Therapeutic agent
JP2008507362A (ja) 2004-07-22 2008-03-13 ヘモ ナノサイエンス リミテッド ライアビリティ カンパニー 過剰な出血を処置するための組成物および方法
US9358318B2 (en) 2004-10-20 2016-06-07 Ethicon, Inc. Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing
CA2672651C (en) * 2006-12-15 2014-03-11 Lifebond Ltd. Gelatin-transglutaminase hemostatic dressings and sealants
EP2183280B1 (en) * 2007-08-01 2011-10-26 Ethicon, Inc. Collagen-related peptides and uses thereof
US8512740B2 (en) 2008-03-26 2013-08-20 Baxter International Inc. Fibrin foam and process for making
US20100021527A1 (en) 2008-07-25 2010-01-28 Chunlin Yang Collagen-related peptides and uses thereof and hemostatic foam substrates
WO2011006069A1 (en) 2009-07-09 2011-01-13 Georgia Tech Research Corporation Peptides for binding fibrinogen and fibrin

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101267843A (zh) * 2005-08-04 2008-09-17 哈莫斯塔蒂斯有限公司 人造血小板
CN101687061A (zh) * 2006-11-27 2010-03-31 哈莫斯塔蒂斯有限公司 生物凝胶

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105916524A (zh) * 2014-01-08 2016-08-31 哈莫斯塔蒂斯有限公司 包含纤维蛋白原结合肽的肽类树状聚合物

Also Published As

Publication number Publication date
US20150071985A1 (en) 2015-03-12
KR20140121864A (ko) 2014-10-16
ES2879558T3 (es) 2021-11-22
JP6258868B2 (ja) 2018-01-10
EP2809365A1 (en) 2014-12-10
KR102168157B1 (ko) 2020-10-21
GB2501348B (en) 2020-06-24
EP2809365B8 (en) 2021-06-23
US9808553B2 (en) 2017-11-07
HRP20211112T8 (hr) 2022-01-21
HRP20211112T1 (hr) 2021-10-15
WO2013114132A1 (en) 2013-08-08
RU2014132763A (ru) 2016-03-27
GB201301847D0 (en) 2013-03-20
GB2501348A (en) 2013-10-23
IN2014DN06952A (zh) 2015-04-10
GB201201751D0 (en) 2012-03-14
EP2809365B1 (en) 2021-05-12
JP2015506764A (ja) 2015-03-05
CN104114198A (zh) 2014-10-22
RU2661036C2 (ru) 2018-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104114198B (zh) 止血伤口敷料
ES2551388T3 (es) Modificación de agentes de entrecruzamiento enzimáticos para controlar las propiedades de las matrices entrecruzadas
CN102939113A (zh) 止血海绵
AU2010208150B2 (en) PCL/PGA hemostatic foams
CN108495658B (zh) 止血材料
CA2672651A1 (en) Gelatin-transglutaminase hemostatic dressings and sealants
CA2695288A1 (en) Collagen-related peptides and uses thereof
JP2005169103A (ja) タンパク様ポリマーを含有している止血用傷包帯
US11484623B2 (en) Dry pad comprising thrombin and pectin
JPS6159737B2 (zh)
CN107592814A (zh) 止血组合物
JP2023541650A (ja) 止血管理を改善するシステム
CA2695361A1 (en) Collagen-related peptides
JP2018516643A (ja) 止血材料
CN109789091A (zh) 稳定的药物泡沫
CN107580508A (zh) 止血装置

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant