ES2879558T3

ES2879558T3 - Apósito hemostático para heridas

Info

Publication number: ES2879558T3
Application number: ES13708510T
Authority: ES
Inventors: Greg Walker; Sarah Middleton
Original assignee: Haemostatix Ltd
Current assignee: Haemostatix Ltd
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2021-11-22
Anticipated expiration: 2033-02-01
Also published as: US9808553B2; GB2501348B; GB201301847D0; EP2809365A1; HRP20211112T8; JP6258868B2; KR20140121864A; EP2809365B1; CN104114198A; US20150071985A1; JP2015506764A; HRP20211112T1; GB2501348A; WO2013114132A1; GB201201751D0; KR102168157B1; EP2809365B8; CN104114198B; RU2661036C2; IN2014DN06952A

Abstract

Un apósito hemostático para heridas, que comprende un material de apósito poroso no coloidal y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados al material de apósito poroso no coloidal, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Ser o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 μm.

Description

DESCRIPCIÓN

Apósito hemostático para heridas

Esta invención se refiere a apósitos hemostáticos para heridas, kits para la formación de apósitos hemostáticos para heridas y métodos para fabricar apósitos.

Actualmente se encuentran disponibles varios hemostáticos tópicos para su uso durante procedimientos quirúrgicos. Las esponjas de gelatina absorbible, tales como Gelfoam, están hechas de gelatina porcina. Gelfoam puede absorber más de cuarenta veces su peso en sangre y expandirse hasta aproximadamente el doscientos por ciento de su volumen inicial. La superficie de la esponja provoca la activación plaquetaria a través de la vía de activación por contacto de la cascada de coagulación. Floseal, un producto alternativo a base de gelatina, incluye gránulos de gelatina que se han reticulado para que no se hinchen casi en la misma medida que Gelfoam.

Las láminas de celulosa oxidada, tal como Surgicel, se derivan de la alfa-celulosa y actúan en el mismo punto de la vía de activación por contacto de la cascada de coagulación que Gelfoam. Cuando están saturadas con sangre, las láminas se hinchan rápidamente hasta formar una masa gelatinosa. El colágeno microfibrilar, tal como Avitene, usa colágeno derivado de piel bovina. Viene en la forma de harina o láminas. Se adhiere fuertemente a las superficies de la sangre y provoca una inflamación mínima. Provoca activación por contacto, pero también activa directamente las plaquetas.

Los hemostáticos tópicos se usan a menudo junto con la trombina, que genera fibrina a partir del fibrinógeno y promueve la activación plaquetaria, lo que acelera de esta manera la coagulación sanguínea. Se usa trombina humana o bovina purificada, o trombina humana recombinante. Sin embargo, la trombina bovina está contaminada con antígeno bovino, en particular Factor V bovino. Los anticuerpos generados contra este antígeno pueden reaccionar de forma cruzada con el factor V humano y provocar hemorragias potencialmente mortales y, en algunas circunstancias, anafilaxia y muerte. La trombina humana se ha aislado del plasma combinado de donantes en un esfuerzo por minimizar estos riesgos, pero tiene el potencial de transmitir patógenos transmitidos por la sangre, especialmente virus. Recientemente, se ha desarrollado una trombina humana recombinante y la FDA ha aprobado su uso. Tiene la ventaja de ser mínimamente antigénica y no conlleva el riesgo de transmisión viral. Sin embargo, se fabrica mediante el uso de una línea celular de ovario de hámster chino genéticamente modificada, por lo que su producción es relativamente cara.

El documento WO 2008/065388 A1 describe un kit de biogel para sellar heridas. El kit comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de restos de unión a fibrinógeno inmovilizados en cada portador.

Las preparaciones de trombina humana recombinante y bovina purificada se almacenan a temperatura ambiente como un polvo que debe reconstituirse con solución salina en solución antes de su uso. La trombina humana purificada aprobada por la FDA se empaqueta como una solución, pero solo se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 24 horas; el almacenamiento a largo plazo requiere congelación (Lew y Weaver, Biologics: Targets & Therapy 2008:2(4) 593-599).

Una desventaja adicional del uso de trombina es que la enzima necesita tiempo para convertir el fibrinógeno en fibrina, por lo que hay un ligero retraso antes de que se acelere la coagulación sanguínea.

Por tanto, existe la necesidad de proporcionar hemostáticos tópicos que puedan detener la hemorragia severa de forma rápida y efectiva, y que superen una o más de las desventajas anteriores del uso de la trombina.

De acuerdo con la invención, se proporciona un apósito hemostático para heridas, que comprende un material de apósito poroso no coloidal y una pluralidad de péptidos de unión a fibrinógeno inmovilizados al material de apósito poroso no coloidal, en donde cada péptido de unión a fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Sar o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (s Eq ID NO: 2) en un extremo aminoterminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

El fibrinógeno comprende dos dominios terminales (dominios D), cada uno de los cuales puede unirse a un péptido de unión al fibrinógeno. Cuando el fibrinógeno, por ejemplo en el plasma o la sangre, entra en contacto con los péptidos, se forma un copolímero que comprende los péptidos de unión al fibrinógeno y el fibrinógeno que tiene las características de un coágulo de fibrina. La presencia de los péptidos de unión al fibrinógeno en un apósito hemostático para heridas de la invención acelera así la hemostasia.

Se ha descubierto sorprendentemente que los apósitos hemostáticos para heridas de la invención tienen propiedades hemostáticas significativamente mejores que una compresa de gelatina convencional humedecida en trombina.

Los apósitos hemostáticos para heridas de la invención no se basan en la acción de la trombina exógena. Los péptidos de unión al fibrinógeno se pueden fabricar sintéticamente y, por lo tanto, son mínimamente antigénicos, no conllevan el riesgo de transmisión viral, se pueden fabricar de forma más económica que las proteínas recombinantes expresadas en líneas celulares de mamíferos y se pueden almacenar a largo plazo a temperatura ambiente en solución.

Los apósitos hemostáticos para heridas de la invención no requieren actividad enzimática para acelerar la hemostasia y, por tanto, acelerar la hemostasia inmediatamente en contacto con el fibrinógeno.

El término "material de apósito poroso no coloidal" se usa en la presente descripción para referirse a láminas, almohadillas, esponjas, espumas, películas, gasas, mallas, gránulos y perlas. El material de apósito poroso no coloidal es adecuado para la aplicación tópica en una herida, pero no para la inyección en el cuerpo. En particular, los gránulos o perlas son demasiado grandes para pasar a través del lecho capilar pulmonar. Al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm. El material de apósito poroso no coloidal puede comprender cualquier producto químico adecuado. Los ejemplos incluyen gelatina, algodón, rayón, poliéster, colágeno, alginato y celulosa oxidada. Se prefiere la gelatina.

La trombina escinde péptidos (mediante la liberación de los fibrinopéptidos A y B) de las terminales amino de las cadenas a y p del fibrinógeno para exponer las secuencias NH2-GPRV- (SEQ ID NO: 3) y NH2-GHRP- (SEQ ID NO: 4), respectivamente. Los péptidos de unión al fibrinógeno del apósito hemostático para heridas de la invención, por lo tanto, difieren en secuencia de las secuencias expuestas por la acción de la trombina sobre el fibrinógeno. Preferentemente, al menos algunos (con mayor preferencia todos) los péptidos de unión al fibrinógeno comprenden la secuencia NH2-GPRP-(SEQ ID NO: 5) en el extremo amino terminal.

Preferentemente, los péptidos de unión al fibrinógeno tienen cada uno de 4-60, preferentemente 4-30, con mayor preferencia 4-10, residuos de aminoácidos de longitud.

El extremo amino-terminal de cada péptido de unión al fibrinógeno puede unirse a "agujeros" en la molécula de fibrinógeno (Weisel, Fibrinogen and Fibrin, Advances in Protein Chemistry, 2005, vol. 70, págs. 247-299). Por lo tanto, cualquier secuencia de los péptidos de unión al fibrinógeno que sea carboxi-terminal a los cuatro residuos de aminoácidos en el extremo amino-terminal de cada péptido no es crítica siempre que esta secuencia no inhiba la unión del extremo aminoterminal del péptido al fibrinógeno.

En algunas modalidades preferidas de la invención, cada péptido de unión al fibrinógeno tiene una longitud de al menos 5 residuos de aminoácidos para asegurar que el péptido sea suficientemente largo para acoplarse con alta afinidad a su sitio de unión en el fibrinógeno. Por tanto, se prefiere particularmente que cada péptido de unión al fibrinógeno tenga una longitud de 5-60, 5-30 o 5-10 residuos de aminoácidos. Se prefiere que el quinto residuo de aminoácido del extremo amino-terminal de cada uno de dichos péptidos de unión al fibrinógeno sea un residuo de glicina. En otras modalidades, cada péptido de unión al fibrinógeno puede tener al menos 6, 7, 8, 9, 10 u 11 residuos de aminoácidos de longitud. Se prefiere que cada péptido de unión al fibrinógeno no tenga más de 60 residuos de aminoácidos de longitud, con mayor preferencia no más de 30 residuos de aminoácidos de longitud.

Preferentemente, cada péptido de unión al fibrinógeno es un péptido sintético.

Preferentemente, los péptidos de unión al fibrinógeno se unen al fibrinógeno con una constante de disociación de entre 10-9 a 10-6 M, por ejemplo alrededor de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o más nM. Se prefiere una constante de disociación de alrededor de 100 nM.

Los péptidos de unión al fibrinógeno pueden tener cada uno la misma secuencia, preferentemente cada uno comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 en el extremo amino-terminal. Alternativamente, los péptidos de unión al fibrinógeno pueden comprender péptidos de secuencia diferente, siempre que cada péptido comprenda la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en su extremo amino-terminal.

La pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno puede inmovilizarse de forma covalente o no covalente al material de apósito poroso no coloidal.

De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, una pluralidad de portadores se inmovilizan de forma no covalente al material de apósito poroso no coloidal, y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan, preferentemente de forma covalente, a cada portador.

Cuando el fibrinógeno, por ejemplo en el plasma o la sangre, entra en contacto con los péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a los portadores, se une a los péptidos. Debido a que cada molécula de fibrinógeno puede unirse a dos péptidos, las moléculas de fibrinógeno se entrecruzan de forma no covalente a través de los portadores y se forma un copolímero que comprende los portadores y el fibrinógeno que tiene características de un coágulo de fibrina.

Los portadores pueden ser portadores solubles o insolubles, pero no plaquetas. Los portadores deben ser adecuados para la administración tópica en el sitio de una herida sangrante. Los portadores pueden comprender un polímero soluble o insoluble, por ejemplo una proteína, un polisacárido o un polímero biocompatible sintético, tal como polietilenglicol, o una combinación de cualquiera de estos. La albúmina es un portador proteico preferido.

Un portador insoluble puede ser una micropartícula (que incluye una micropartícula sólida, hueca o porosa, preferentemente una micropartícula sustancialmente esférica). La micropartícula puede estar formada por cualquier sustancia adecuada, por ejemplo una proteína reticulada. Una proteína adecuada es la albúmina (derivada de suero o recombinante, humana o no humana en secuencia). Las micropartículas adecuadas para su uso como portadores insolubles en la presente invención pueden formarse mediante la albúmina de suero humana (HSA) secada por pulverización mediante el uso de una tecnología de secado por pulverización bien conocida, por ejemplo como en el documento WO 92/18164. Las alternativas para el uso de micropartículas como portadores incluyen liposomas, partículas de polímero sintético (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico y ácido poli(láctico/glicólico)) o fragmentos de membrana celular.

Al menos la mayoría de los portadores tienen preferentemente una dimensión máxima que es menor de 6 pm.

En teoría, no existe un límite superior para el número de péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Es probable que el número óptimo dependa de muchos factores, tales como la naturaleza del portador y el número de grupos reactivos en cada portador para unir los péptidos de unión al fibrinógeno. Sin embargo, se prefiere que en promedio haya hasta 100 péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Preferentemente, en promedio hay al menos tres, preferentemente al menos cinco péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora. Un intervalo preferido es de 10 20 péptidos de unión al fibrinógeno por molécula portadora.

Preferentemente, los péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente a los portadores.

Los portadores pueden comprender grupos reactivos que permitan la unión de los péptidos de unión al fibrinógeno. Por ejemplo, los portadores pueden comprender restos tiol o restos de amina en su superficie. Si los portadores son proteináceos, los restos tiol o amina pueden ser proporcionados por cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo cisteína o lisina. Alternativamente, se pueden añadir grupos reactivos al portador. Esto es particularmente ventajoso si el portador se forma a partir de una proteína, tal como HSA. Por ejemplo, el portador puede tiolarse mediante el uso de un reactivo tal como 2-iminotiolano (2-IT) que es capaz de reaccionar con grupos amino primarios en el portador. Alternativamente, la cistamina se puede acoplar a grupos carboxilo en el portador en presencia de clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), seguido de escisión reductora del enlace disulfuro introducido.

En modalidades preferidas, los péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente al portador mediante un espaciador. Un espaciador preferido es un espaciador no peptídico, que por ejemplo comprende un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol (PEG). En una modalidad preferida, una pluralidad de conjugados de péptidos, cada uno de los cuales comprende un péptido de unión al fibrinógeno unido a un grupo reactivo tiol (por ejemplo, un grupo maleimida) mediante un espaciador de PEG, se hacen reaccionar con un portador tiolado (por ejemplo preparado mediante el uso de 2-IT o cistamina como se describió anteriormente).

Los portadores pueden inmovilizarse de forma no covalente al material de apósito poroso no coloidal al poner en contacto una solución o suspensión acuosa de los portadores con el material de apósito durante un tiempo suficiente para que los portadores queden inmovilizados en el material de apósito. En un método preferido, los portadores se impregnan sobre el material de apósito.

En otras modalidades, cada péptido de unión al fibrinógeno se inmoviliza de forma covalente directamente al material de apósito poroso no coloidal, opcionalmente mediante un espaciador. Un espaciador preferido es un espaciador no peptídico, que comprende preferentemente un polímero hidrófilo tal como PEG.

En tales modalidades, el material de apósito poroso no coloidal comprende preferentemente gránulos o perlas. En una modalidad particularmente preferida, los gránulos o perlas comprenden una sustancia polimérica, por ejemplo una proteína tal como gelatina.

El material de apósito no coloidal puede comprender grupos reactivos que permitan la unión de los péptidos de unión al fibrinógeno. Por ejemplo, el material de apósito puede comprender restos tiol o restos de amina en su superficie. Si el material del apósito es proteinaceo, los restos tiol o de amina pueden proporcionarse mediante cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo cisteína o lisina. Alternativamente, se pueden añadir grupos reactivos al material del apósito. Esto es particularmente ventajoso si el material del apósito está formado por proteínas, tales como gelatina. Por ejemplo, el material del apósito puede tiolarse mediante el uso de un reactivo tal como 2-iminotiolano (2-IT) que puede reaccionar con grupos amino primarios en el material del apósito. Alternativamente, la cistamina se puede acoplar a grupos carboxilo en el material del apósito en presencia de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), seguido de escisión reductora del enlace disulfuro introducido.

En modalidades preferidas, los péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente al material de apósito no coloidal mediante un espaciador. Un espaciador preferido es un espaciador no peptídico, que por ejemplo comprende un polímero hidrófilo tal como polietilenglicol (PEG). En una modalidad preferida, una pluralidad de conjugados de péptidos, cada uno de los cuales comprende un péptido de unión al fibrinógeno unido a un grupo reactivo tiol (por ejemplo, un grupo maleimida) mediante un espaciador de PEG, se hacen reaccionar con un material de apósito tiolado (por ejemplo, preparado mediante el uso de 2-IT o cistamina como se describió anteriormente).

Un apósito hemostático para heridas de la invención puede estar en forma seca, preferentemente en forma liofilizada. El Ejemplo 5 a continuación muestra que un apósito hemostático para heridas de la invención conserva la capacidad de copolimerizar el fibrinógeno después de la rehidratación después de la liofilización.

Preferentemente, el apósito para heridas está estéril. Puede proporcionarse un apósito hemostático para heridas de la invención como apósito estéril para heridas listo para su administración a una herida.

Se proporciona además de acuerdo con la invención un apósito hemostático para heridas de la invención empaquetado con instrucciones para la aplicación del apósito a una herida.

También se proporciona de acuerdo con la invención un kit para la formación de un apósito hemostático para heridas, que comprende un material de apósito poroso no coloidal y, por separado, un agente hemostático que comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (s Eq ID NO: 1) en un extremo amino terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Sar o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEq ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

El kit puede comprender además instrucciones para aplicar el agente al material de apósito poroso no coloidal antes de la aplicación del material de apósito a una herida y/o instrucciones para la aplicación del apósito hemostático para heridas a una herida.

Un agente hemostático que comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Sar o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y en donde también se describe que el agente está empaquetado con instrucciones para aplicar el agente a un material de apósito poroso no coloidal antes de la aplicación del material de apósito a una herida.

Ventajosamente, el agente hemostático puede estar en solución, en suspensión o en forma seca, por ejemplo en forma liofilizada. El Ejemplo 3 siguiente demuestra que un agente hemostático de la invención conserva la capacidad de copolimerizar el fibrinógeno después de la extracción en solución de un apósito hemostático para heridas liofilizado de la invención. El Ejemplo 6 muestra que un agente hemostático de la invención es estable en solución durante al menos seis meses a 37 °C. Por tanto, si se desea, un agente hemostático de la invención puede almacenarse en solución, lo que evita de esta manera la necesidad de reconstituirlo en solución antes de su uso.

También se describe un método para controlar la hemorragia, especialmente la hemorragia severa, que comprende administrar un apósito hemostático para heridas de la invención a una herida.

El término "hemorragia severa" se usa en la presente descripción para incluir la hemorragia que requiere intervención (quirúrgica o endoscópica) o descompresión de un espacio cerrado para detener o controlar el evento, la hemorragia que provoca compromiso hemodinámico (que requiere sangre, reemplazo de líquidos, soporte inotrópico o intervención quirúrgica), o hemorragia que no puede controlarse mediante intervención convencional, tal como presión manual, cauterización o suturas.

De acuerdo con la invención, también se proporciona un método para fabricar un apósito hemostático para heridas, que comprende inmovilizar una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno en un material de apósito poroso no coloidal, opcionalmente en donde la pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan al material de apósito poroso coloidal mediante la inmovilización de una pluralidad de portadores en el material de apósito poroso no coloidal, en donde una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan a cada portador, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Sar o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

Preferentemente, una pluralidad de portadores se inmovilizan de forma no covalente al material de apósito poroso no coloidal, y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan, preferentemente de forma covalente, a cada portador.

Los métodos adecuados para inmovilizar de forma covalente los péptidos de unión al fibrinógeno a los portadores, opcionalmente mediante un espaciador (preferentemente un espaciador no peptídico, por ejemplo que comprende un polímero hidrófilo tal como PEG), se describieron anteriormente.

Los métodos adecuados para inmovilizar de forma no covalente los portadores al material de apósito poroso no coloidal se describieron anteriormente.

Se describieron anteriormente los métodos adecuados para inmovilizar de forma covalente cada péptido de unión al fibrinógeno directamente al material de apósito poroso no coloidal, opcionalmente mediante un espaciador (preferentemente un espaciador no peptídico, por ejemplo que comprende un polímero hidrófilo tal como PEG).

También se proporciona de acuerdo con la invención un método para fabricar un apósito hemostático para heridas, que comprende aplicar un agente hemostático a un material de apósito poroso no coloidal, en donde el agente hemostático comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Ser o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo aminoterminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

El agente hemostático se puede aplicar de forma no covalente al material de apósito poroso no coloidal, por ejemplo mediante el contacto de una solución o suspensión acuosa del agente hemostático con el material de apósito durante un tiempo suficientemente largo para que el agente hemostático quede inmovilizado al material de apósito. En un método preferido, el agente hemostático se impregna sobre el material de apósito.

Los apósitos hemostáticos para heridas particularmente preferidos de la invención comprenden una pluralidad de portadores solubles (preferentemente portadores de proteína solubles, tales como portadores de albúmina) a los que se les aplica una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno (cada péptido comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Pro-Gly- (SEQ ID NO: 6) en el extremo amino-terminal del péptido) inmovilizada de forma covalente mediante un espaciador no peptídico (adecuadamente un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol) a cada portador. Los portadores están inmovilizados de forma no covalente a un material de apósito poroso no coloidal (que comprende preferentemente gelatina, tal como una almohadilla de gelatina, o que comprende rayón o poliéster). En los Ejemplos 2, 3 y 4 a continuación se describen ejemplos de tales apósitos hemostáticos para heridas.

Otros apósitos hemostáticos para heridas particularmente preferidos de la invención comprenden una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno (cada péptido comprende preferentemente una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Pro-Gly- en el extremo amino-terminal del péptido) inmovilizados de forma covalente mediante un espaciador no peptídico (adecuadamente un polímero hidrófilo, tal como polietilenglicol) directamente a un material de apósito poroso no coloidal (que comprende preferentemente gelatina, tal como gránulos de gelatina). En el Ejemplo 5 a continuación se describen ejemplos de tales apósitos hemostáticos para heridas.

Las modalidades de la invención se describirán ahora a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales:

La Figura 1 muestra la estructura de un ejemplo preferido de un péptido de unión al fibrinógeno inmovilizado de forma covalente a un portador (de acuerdo con las modalidades preferidas de la invención, una pluralidad de tales péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente al portador - solo un único péptido de unión al fibrinógeno inmovilizado al portador se muestra en la figura);

La Figura 2a muestra un esquema para la asignación de puntuaciones de hemorragia de acuerdo con Adams y otros, J Thromb Thrombolysis, 2009, 28(1):1-5;

La Figura 2b es un gráfico que muestra los resultados de una evaluación de la actividad hemostática de un apósito hemostático para heridas de acuerdo con una modalidad preferida de la invención;

La Figura 3 muestra los resultados de una comparación de la actividad de coagulación de portadores con péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados recuperados de apósitos hemostáticos para heridas liofilizados y no liofilizados de la invención;

La Figura 4 muestra los resultados de una evaluación de la actividad hemostática de un apósito hemostático para heridas de acuerdo con otra modalidad preferida de la invención; y

La Figura 5 muestra los resultados de los ensayos de estabilidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados en el portador de HSA en solución almacenado a 37 °C para un máximo de 6 meses.

La referencia a "formación de coágulos" y "actividad de coagulación" en relación con los apósitos y agentes hemostáticos para heridas de la invención es una referencia a la formación de un copolímero que comprende los péptidos de unión al fibrinógeno de los apósitos o agentes y fibrinógeno, que tiene características de un coágulo de fibrina.

Ejemplo 1

Conjugación de un péptido de unión al fibrinógeno con un portador de albúmina

Este ejemplo describe la conjugación de un péptido de unión al fibrinógeno de secuencia GPRPG, unido a un grupo maleimida (Mal) mediante un enlazador de polietilenglicol (PEG), a un portador de albúmina. El producto resultante se denomina "PeproStat".

La albúmina de suero humana se diluye a 50 mg/mL en tampón de reacción (fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético [EDTA] 100 mM, pH 8,0±0,2) y se tiola mediante la adición de un exceso molar de sesenta veces de clorhidrato de 2-iminotiolano. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, la albúmina tiolada se separa del clorhidrato de 2-iminotiolano sin reaccionar mediante diafiltración de flujo tangencial mediante el uso de fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 1 mM pH 7,2±0,2 (tampón de filtración). La conjugación de péptidos se realiza mediante la disolución del péptido (GPRPG-PEG12-maleimida) a una concentración de 50 mg/mL en tampón de filtración y mediante la adición de albúmina tiolada en una razón de 0,95 mg del péptido por 1 mg de albúmina. Después de la incubación durante una hora a temperatura ambiente, el exceso de péptido se elimina mediante diálisis contra un exceso de 60 veces de solución salina tamponada con Tris (TBS; Tris 20 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7,2±0,2) mediante el uso de una membrana de diálisis con un límite de peso molecular de 10-14 KD durante al menos 16 horas a 4 °C, con un cambio de tampón. El PeproStat recuperado se diluye a 5 mg/mL en TBS, se filtra de forma estéril a través de un filtro de 0,2 pm, se distribuye y se almacena a 4 °C.

El contenido proteico del producto final se estima mediante la medición de la absorbancia a 280 nm en donde E(280, 1 %) = 5,3.

La actividad del producto final se investiga mediante el uso de un coagulómetro Sigma Amelung KC4. Brevemente, se añaden 30 pL de la muestra de ensayo a 0,5 mg/mL a 100 pL de fibrinógeno humano purificado a 3 mg/mL, el KC4 registra la formación de coágulos en menos de 6 segundos.

El peso molecular del producto final se estima mediante SDS-PAGE de muestras reducidas mediante el uso de geles prefabricados de Tris-glicina al 4-15 % teñidos con Coomassie en comparación con el perfil de bandas de la escalera de proteínas sin teñir.

Perfil del producto

Ejemplo 2

Estudio de la actividad hemostática de PeproStat impregnado previamente en una almohadilla de gelatina

La actividad hemostática de PeproStat debía determinarse mediante el uso de un modelo de conejo heparinizado. Sin embargo, antes de usar este modelo, era importante determinar que el producto es activo en un conejo y, en particular, que la secuencia de unión al fibrinógeno de PeproStat (GPRP-) se une al fibrinógeno del conejo. Esto se hizo mediante la conjugación de un péptido GPRPG a micropartículas de albúmina, que luego se incubaron con fibrinógeno de conejo marcado con FITC. La unión del fibrinógeno fluorescente a las partículas se puede medir luego mediante el uso de un citómetro de flujo. Mediante este método se demostró que la unión de PeproStat al fibrinógeno de conejo era comparable a la del fibrinógeno humano. Esto confirma los datos publicados que muestran que la secuencia de unión al fibrinógeno humano y de conejo relevante expuesta cuando la trombina escinde el fibrinopéptido A del fibrinógeno es la misma.

La secuencia de unión al fibrinógeno (GPRP) en PeproStat se deriva de la secuencia GPR que está expuesta cuando el fibrinopéptido A se escinde del fibrinógeno mediante la acción de la trombina. El cuarto aminoácido en la secuencia (prolina) confiere una mayor afinidad por el fibrinógeno que la secuencia natural escindida en el fibrinógeno humano que tiene un residuo de valina en esa posición (Laudano y Doolittle Biochemistry 1980, 19: 1013-1019). Laudano y Doolittle han demostrado que, si bien todas las especies comparten la secuencia GPR terminal, existe una variación en el aminoácido en la posición cuatro, que se conoce que afecta la afinidad por el fibrinógeno. Los datos de la secuencia muestran que el fibrinógeno de conejo también tiene un residuo de valina en la posición cuatro y, por lo tanto, se podría esperar que el fibrinógeno de conejo y humano tuvieran una afinidad comparable por GPRP, como hemos encontrado.

Se usó un modelo de lesión por abrasión hepática de conejo para evaluar el efecto hemostático comparativo de PeproStat, trombina o solución salina impregnados en una almohadilla de gelatina. La actividad hemostática se determinó en conejos a los que se les administró heparina a 1000 UI/kg.

Se cortó una almohadilla de gelatina a 2,0 x 3,0 cm mediante el uso de una hoja de bisturí. Para cada tratamiento, se sumergió una muestra de almohadilla en una alícuota de 1,5 mL de solución de ensayo (una solución de PeproStat, de trombina o salina). Luego se retiró y se exprimió entre los dedos enguantados para expulsar las burbujas de aire, luego se regresó a la solución hasta que se requirió.

Se creó una lesión circular superficial (diámetro 10,3 mm, profundidad 2-3 mm) mediante el raspado de la superficie del lóbulo hepático mediante el uso de un taladro manual Dremel (Modelo 395 Tipo 5, EE. UU.; 10000-35000 rpm) con una piedra de abrasión de superficie plana (Dremel, número de pieza 85602 EE. UU.). La sangre que salía de la herida se recogió durante 15 s con un hisopo seco pesado previamente. El peso de la sangre extraída se usó como una medida de la gravedad de la hemorragia. Después de retirar el hisopo, se aplicó la almohadilla de ensayo humedecida previamente y se usó una gasa húmeda para aplicar una presión suave a la herida tratada durante 30 segundos.

Se pueden realizar siete lesiones secuencialmente en cada hígado y las almohadillas de ensayo se asignan al azar en los siete sitios. Se realizaron 34 ensayos en cada almohadilla de ensayo.

Al retirar la gasa húmeda, con la almohadilla de ensayo aún en su lugar, se evaluó la hemostasia de la herida a los 1, 3, 6, 9 y 12 minutos, donde un minuto se refiere al tiempo desde que se aplica la almohadilla de ensayo a la herida. El cirujano asigna puntuaciones de hemorragia de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 3a.

Resultados

Una puntuación de 0 (es decir, sin hemorragia) se considera como hemostasia satisfactoria en cada punto de tiempo. Se calculó el porcentaje de 34 tratamientos (n = 34 conejos) considerados exitosos para cada punto de tiempo. Los resultados se muestran en la Figura 3b.

Los resultados muestran que PeproStat a una concentración de 5 mg/mL impregnado en la almohadilla de gelatina es un agente hemostático significativamente mejor que la solución salina o la trombina (a 125 unidades/mL) impregnadas en la almohadilla de gelatina.

Ejemplo 3

Liofilización de PeproStat en una almohadilla de gelatina

Para determinar la capacidad absorbente de la almohadilla, una almohadilla de gelatina de 40 cm2 se humedeció en 10 mL de agua desionizada. Después de maximizar la absorbancia mediante masaje y remojado de la almohadilla para eliminar todo el aire, quedaron 2 mL de agua. Por tanto se calculó que la capacidad de una almohadilla de 40 cm2 fue de 8 mL.

PeproStat a 10 mg/mL se desaló mediante el uso de un dispositivo de filtro centrífugo Amicon Ultra y se diluyó a 2,5 mg/mL. Una almohadilla de gelatina de 40 cm2 se humedeció en 8 mL de PeproStat a 2,5 mg/mL y luego se exprimió la almohadilla con los dedos enguantados para eliminar las burbujas de aire. Las almohadillas se dejaron en la solución y se balancearon suavemente durante 1 hora a temperatura ambiente para asegurar que se adsorbiera toda la solución.

A continuación, la almohadilla se liofilizó mediante el uso de un liofilizador de mesa.

Los estantes del liofilizador se equilibraron a -36 °C, y las almohadillas se colocaron en el estante precongelado y se sometieron a etapas de tratamiento térmico que llevaron la temperatura hasta -20 °C durante un período de 270 minutos.

El secado primario se logró durante 800 minutos al disminuir el vacío de 800 mTorr con un aumento concomitante de temperatura a 20 °C.

La almohadilla liofilizada se almacenó en un desecador.

El éxito de la liofilización se analizó mediante la comparación de la actividad de coagulación del PeproStat recuperado de la almohadilla después de la liofilización con el PeproStat que no se había liofilizado.

Se encontró que la almohadilla de 40 cm2 que contenía 40 mg de PeproStat pesaba 440 mg en total después de la liofilización.

Se cortaron 25 mg de la almohadilla y se colocaron en un bote de pesaje. El PeproStat seco se extrajo de la almohadilla al humedecer completamente la almohadilla en 1 mL de fosfato de sodio 10 mM, tampón de cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2±0,2 y luego al exprimir la solución resultante fuera de la almohadilla. El procedimiento de extracción se realizó en cuatro ocasiones distintas. El contenido proteico del PeproStat recuperado en la solución se midió mediante el uso de HPLC de fase inversa de simetría C8 de 5 |jm a partir de una curva de calibración construida a partir de diluciones de PeproStat estándar.

El análisis de la proteína extraída mostró que el 90-95 % de la proteína se recuperó de la almohadilla.

La actividad de coagulación de la muestra se midió mediante el uso de un coagulómetro Sigma Amelung KC-4 que mide el tiempo necesario para formar un coágulo. El análisis de la actividad de coagulación del PeproStat eluido se comparó con el del PeproStat no liofilizado.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 4.

No hubo diferencia significativa entre la actividad de coagulación del PeproStat no liofilizado control y el PeproStat de la almohadilla liofilizada cuando se ensayó en el coagulómetro KC-4 a 0,5 mg/mL.

Ejemplo 4

Actividad hemostática de PeproStat impregnado en el apósito poroso de rayón/poliéster

La actividad hemostática de 0,5 mL de PeproStat a 5 mg/mL impregnado en una mezcla de poliéster/rayón se midió mediante el uso de un método de impedancia sanguínea de la siguiente manera:

Se estiró una capa doble de gasa de poliéster/rayón sobre un contenedor Universal con un diámetro interno de 2,5 cm y se marcó el área de gasa que cubría el tubo abierto. Se retiró la gasa del tubo y se aplicaron 0,5 mL de PeproStat a 5 mg/mL al círculo marcado; se aplicaron 0,5 mL de agua a un segundo apósito marcado de la misma manera que un control.

Se pesaron los contenedores Universal y las gasas humedecidas se estiraron a lo largo de la boca del tubo. A continuación, se aplicaron secuencialmente 4 x 0,5 mL de sangre completa con citrato a la gasa humedecida y se midió la transferencia sanguínea a través de la gasa mediante el peso de la sangre en el tubo.

Resultados

El peso promedio de la sangre que pasa a través de la gasa más PeproStat fue 0,009 g±0,016 g (n = 3) en comparación con 0,695 g±0,721 g que pasó a través de la gasa control (n = 3) como se ilustra en una imagen representativa mostrada en la Figura 5.

Ejemplo 5

Propiedades hemostáticas de los portadores de gelatina con péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados

Este ejemplo describe la preparación de dos diferentes apósitos hemostáticos para heridas preferidos de la invención y sus propiedades hemostáticas. Ambos apósitos comprenden una pluralidad de portadores de gelatina, con una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados de forma covalente a cada portador mediante un conector PEG. En este ejemplo, los portadores (o gránulos) de gelatina proporcionan el material de apósito poroso no coloidal.

Para preparar el primer apósito, se usó 2-iminotiolano para unir de forma covalente una pluralidad de conjugados del péptido de unión al fibrinógeno-enlazador PEG al portador de gelatina. Para preparar el segundo apósito, se conjugaron restos de cistamina a los grupos carboxilo de la gelatina en la presencia de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS), seguido de una escisión reductora del enlace disulfuro introducido para generar un tiol libre para la unión del péptido de unión al fibrinógeno.

Preparación de gránulos de gelatina conjugados con GPRPG-PEG-12-Mal mediante el uso de 2-Iminotiolano

Los gránulos de gelatina se tiolaron mediante el uso de 2-iminotiolano que modifica los residuos de amina. El método usado fue el de Kommareddy S, Amiji M, 2005, Bioconjugate Chem 16: 1423-1432.

Se pesó 1 g de gránulos de gelatina y se hidrataron en 40 mL de un tampón que contenía fosfato de sodio 50 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M pH 8,0±0,2, mediante la mezcla en un mezclador de rodillo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añaden 102 g de 2-iminotiolano a la gelatina hidratada y se mezclan en un mezclador de rodillo durante 1 hora. A continuación, se centrifugaron los gránulos a 500 rpm-RCF 28 durante 2 minutos, se eliminó el sobrenadante y se reemplazó el volumen con fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 0,1 M pH 7,2±0,2. Esto se repitió cuatro veces para eliminar el 2-iminotiolano.

Se realizó un ensayo de Ellman para medir el número de grupos -SH introducidos en la gelatina. El reactivo de Ellman 5,5'ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) reacciona con sulfhidrilos en condiciones ligeramente alcalinas para liberar el compuesto altamente cromogénico, ácido 5-tio-2 nitrobenzoico (TNB) Ellman GL. (1959) Arch Bichem. Biophys. 82 70 77.

Después de la cuantificación de los grupos -SH, se añadieron 2,5 mL de GPRPG-PEG-12-Mal a 50 mg/mL a los gránulos y se mezclaron con rodillo durante 1 hora. A continuación, los gránulos se lavaron cuatro veces con agua destilada para eliminar el exceso de péptido. Se colocó una suspensión de los gránulos en un contenedor de plástico y se secó mediante la incubación a 37 °C durante 15 horas.

Preparación de gránulos de gelatina conjugados con GPRPG-PEG-12-Mal mediante el uso de química EDC/Cvstamine

Se pesaron 2,2 g de gránulos de gelatina y se hidrataron en 80 mL de tampón MES 50 mM, pH 6,0, durante 15 minutos en un mezclador de rodillo. Se pesaron 625 mg de cistamina, 350 mg de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 130 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) y se añadieron a gránulos hidratados. La mezcla de reacción se dejó durante 2 horas en un mezclador de rodillo a temperatura ambiente y luego se dividió en dos tubos de 50 mL. A continuación, los gránulos se lavaron y se centrifugaron a 500 rpm con 4 volúmenes de 40 mL de tampón MES. Se añadieron 200 pL de solución madre de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 1 M a cada tubo y se dejaron durante 10 minutos en el mezclador de rodillo a temperatura ambiente. Un lavado repetido con 4 volúmenes de MES fue seguido por un Ensayo de Ellman para determinar los -SH libres.

Se mezclaron 7,2 mL de GPRPG-PEG-12-Mal a 50 mg/mL con 10,45 mL de N-etil-maleimida y luego se añadieron 8,8 mL de la mezcla a cada tubo. La reacción se dejó durante 1 hora en un mezclador de rodillo a temperatura ambiente.

Las reacciones se lavaron y se centrifugaron a 800 rpm con 4 volúmenes de agua Milli-Q para eliminar el exceso de péptido y de N-etil-maleimida. A continuación, se vertieron los gránulos en una caja de plástico, se cubrieron con Nescofilm, se perforaron los Nescofilm y se colocaron en un liofilizador de mesa para secar de la siguiente manera:

Proceso de secado para gránulos conjugados

Los estantes del liofilizador se equilibraron a -36 °C, y los gránulos de gelatina se colocaron en el estante precongelado y se sometieron a etapas de tratamiento térmico que llevaron la temperatura hasta -20 °C durante un período de 270 minutos. El secado primario se logró durante 800 minutos mediante la disminución del vacío de 800 mTorr con un aumento concomitante en la temperatura a 20 °C. Los gránulos liofilizados se almacenaron en un desecador antes del ensayo.

Ensayo de gránulos de gelatina secos en un ensayo de desintegración de tapones

Se empacaron 100 mg de gránulos de gelatina conjugados secos en una jeringa de 3 mL, y luego se añadieron 0,5 mL de solución salina tamponada con tris (TBS) (Tris 0,02 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2±0,2), mediante el uso de un conector de jeringa, para suspender los gránulos. Se añadieron 0,5 mL de trombina a 500 u/mL o 0,5 mL de TBS a 100 mg de "blanco" (gránulos de gelatina no conjugados). Mediante el uso de un conector de jeringa, se pasó TBS de otra jeringa de 3 mL a cada formulación para suspenderla. A continuación, se mezcló cada suspensión al pasarla entre las jeringas aproximadamente 40 veces.

Se añadió la suspensión de gelatina a una tercera jeringa de 3 mL y se usó el émbolo de la jeringa para formar un tapón. A continuación, se inyectaron 0,2 mL de plasma en el tapón y se dejó reposar durante 3 minutos. Se cortó la parte inferior de la jeringa y se empujó el tapón hacia un tubo de 50 mL que contenía solución salina al 0,9 %. A continuación, el tubo se mezcló en un mezclador de vórtice durante 10 minutos. A continuación, el tapón se calificó durante un período de 10 minutos de la siguiente manera:

0 = tapón completamente desintegrado; 2 = presencia de pequeños grumos (2-5 mm de tamaño); 5 = presencia de grumos más grandes (5-8 mm); 8 = tapón grande intacto, signos de erosión; 10 = tapón completamente intacto.

Resultados

Los resultados muestran que la durabilidad mecánica del tapón formado mediante el uso de los gránulos de gelatina conjugados de la invención es equivalente a la de los gránulos no conjugados mezclados con trombina.

Ejemplo 6

Estabilidad de los péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados al portador en solución

Este ejemplo describe los resultados de los ensayos de estabilidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados en portadores en solución a 37 °C.

PeproStat (que comprende péptidos de unión al fibrinógeno, cada uno de secuencia GPRPG inmovilizada al portador de HSA) se almacenó en solución durante 6 meses a 37 °C. En el momento cero, y en varios momentos durante el período de almacenamiento, se analizó la capacidad de las muestras de la solución almacenada para formar un copolímero con el fibrinógeno, como sigue:

Se diluyó el fibrinógeno en HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,3+/1 0,2 a 6 mg/mL. Se añadieron 25 pL de PeproStat a 5 mg/mL a 400 pL del fibrinógeno diluido y se registró el tiempo necesario para la formación de un coágulo visual que comprende un copolímero de PeproStat y fibrinógeno.

Los resultados se muestran en la Figura 5 y demuestran que PeproStat es estable en solución a 37 °C durante al menos 6 meses.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un apósito hemostático para heridas, que comprende un material de apósito poroso no coloidal y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados al material de apósito poroso no coloidal, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende:

una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Ser o Leu; o

una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y

en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

2. Un apósito para heridas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno están inmovilizados de forma no covalente al material de apósito poroso no coloidal.

3. Un apósito para heridas de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde una pluralidad de portadores están inmovilizados al material de apósito poroso no coloidal, y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan a cada portador, en donde opcionalmente la pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente a cada portador, opcionalmente en donde cada péptido de unión al fibrinógeno se inmoviliza de forma covalente al portador mediante un espaciador no peptídico, opcionalmente en donde el espaciador no peptídico comprende un polímero hidrófilo y opcionalmente en donde el polímero hidrófilo comprende polietilenglicol.

4. Un apósito para heridas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los portadores son portadores solubles.

5. Un apósito para heridas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan de forma covalente al material de apósito poroso no coloidal, opcionalmente en donde cada péptido de unión al fibrinógeno se inmoviliza de forma covalente al material de apósito poroso no coloidal mediante un espaciador no peptídico, en donde opcionalmente el espaciador no peptídico comprende un polímero hidrófilo y en donde opcionalmente el polímero hidrófilo comprende polietilenglicol.

6. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende gelatina, algodón, rayón, poliéster, colágeno, alginato o celulosa oxidada.

7. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que está en forma seca.

8. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que está en forma liofilizada.

9. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde los péptidos de unión al fibrinógeno tienen cada uno de 4-60 residuos de aminoácidos de longitud.

10. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, empaquetado con instrucciones para la aplicación del apósito a una herida.

11. Un apósito para heridas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para controlar la hemorragia.

12. Un kit para la formación de un apósito hemostático para heridas, que comprende un material de apósito poroso no coloidal y, por separado, un agente hemostático que comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador, en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende: una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Ser o Leu; o una secuencia de aminoácidos Gly-His-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 2) en un extremo amino-terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Pro, y en donde el material de apósito poroso no coloidal comprende una lámina, almohadilla, esponja, espuma, película, gasa, malla, gránulos o perlas, y en donde si el material de apósito poroso no coloidal comprende gránulos o perlas, al menos la mayoría de los gránulos o perlas tienen una dimensión máxima que es mayor que 6 pm.

13. Un método para fabricar un apósito hemostático para heridas, que comprende:

a) inmovilizar una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno en un material de apósito poroso no coloidal, en donde opcionalmente la pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan al material de apósito poroso no coloidal mediante la inmovilización de una pluralidad de portadores al material de apósito poroso no coloidal, en donde una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno se inmovilizan a cada portador; o

b) aplicar un agente hemostático a un material de apósito poroso no coloidal,

en donde el agente hemostático comprende una pluralidad de portadores y una pluralidad de péptidos de unión al fibrinógeno inmovilizados a cada portador,

en donde cada péptido de unión al fibrinógeno comprende:

una secuencia de aminoácidos Gly-Pro-Arg-Xaa (SEQ ID NO: 1) en un extremo amino terminal del péptido, en donde Xaa es cualquier aminoácido distinto de Val, preferentemente Pro, Ser o Leu; o