JP2018516643A - 止血材料 - Google Patents

Abstract

止血材料、特に複数のフィブリノーゲン結合ペプチドに共有結合で固定化された酸化セルロース基材を含む止血材料が記載される。表面上にカルボキシル基を有する酸化セルロース基材およびその他の基材にフィブリノーゲン結合ペプチドを共有結合する方法が記載される。
【選択図】なし

Description

本発明は、創傷包帯材などの止血材料、およびこのような材料を形成する方法に関する。本発明はまた、基材にペプチドを結合させる方法にも関する。

酸化セルロース織物は、医療用途で長期にわたり使用されてきた生体吸収性の織物であり、また、他の物質を吸収する性質のある織物である。それらの有益な特性には、高吸収性、抗菌および抗ウイルス性、ならびに非毒性および抗接着性作用がある。

適用される部位で血液凝固を開始または加速する能力があるために、酸化セルロースは止血材料として使用できる。市販の酸化セルロース織物の例は、Ｓｕｒｇｉｃｅｌ（登録商標）Ｎｕ−Ｋｎｉｔ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．により製造）である。

しかし、酸化セルロース織物は、低い止血性、低い生分解性およびトロンビン、アルブミンおよびグロブリンなどの酸に敏感なタンパク質を不活性化する低ｐＨなどのいくつかの欠点を有する。

酸化セルロースを修飾して、その特性を改善する取り組みは、ほとんどがその材料の酸性を中和することに注力されてきた。例えば、欧州特許第ＥＰ０６５９４４０Ｂ１号は、酸化セルロースをカルシウムまたはカルシウムとナトリウムもしくはカリウムの組み合わせで処理することについて記載している。しかし、酸化セルロースの止血特性をさらに改善してほしいという要望が存在する。

ＳＰＯＴ合成法は、セルロース膜上での固相ペプチド合成の確立された方法であり、ペプチドアレイを調製するのによく使われる（Ｈｉｌｐｅｒｔ，Ｋ．，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｄ．Ｆ．Ｈ，Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．Ｗ．（２００７）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｏｕｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｒｒａｙｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２４：１，３１−１０６）。セルロースは遊離ヒドロキシル基を有するポリサッカライドである。セルロースをペプチドの合成に適するものにするには、ヒドロキシルからより反応性に富むアミノ基に官能基付与を変更する必要がある。最も容易で利用されることが多いセルロース膜の誘導体化は、Ｆｍｏｃ β−アラニンまたはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ、およびＮ，Ｎ’−ジイソプロペニルカルボジイミドを使ったエステル化である。

しかし、酸化セルロースの構造は、酸化セルロース基材がその表面上にカルボキシル基を有するという点で、セルロースとは異なる。

酸化セルロースは従来のペプチドのＳＰＯＴ合成法には適せず、特に、遊離Ｎ末端を有するペプチドの場合には適しない。これは、アミノ酸のアミノ基と、酸化セルロースのカルボキシル基との間で反応が起こる可能性があるためである。

ＳＰＯＴ合成法のさらなる欠点は、反復される固体支持体結合カルボキシル基活性化のために、全てのカップリング段階でエピマー化のリスクが高まることである。

出願者は、より効率的なペプチドの、酸化セルロースなどの基材への結合方法を考え、意外にも、フィブリノーゲン結合ペプチドが酸化セルロース基材に共有結合する場合には、止血特性が大幅に向上することを見出した。

広い意味では、本発明は、フィブリノーゲン結合ペプチドなどのペプチドの基材への共有結合による固定化、およびこのようなペプチドを基材に共有結合で固定化する方法に関する。

本発明の方法は、ペプチドおよび第１の反応性基を含む部分を用意すること、第２の反応性基を有する基材を用意すること、および第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で連結させること、を含む。

この手法は、Ｃ末端が基材に固定化される間に、ペプチドがカルボキシル基からアミノ基の方向に合成されるＳＰＯＴ合成法とは対照をなす。換言すれば、ＳＰＯＴペプチド合成は基材上で起こる。従来のＳＰＯＴ合成法はセルロース基材上にペプチドアレイを作製するには好適するかもしれないが、創傷包帯材などの基材にペプチドを結合させるためには実用的でなく、非経済的である。例えば、ペプチドを基材に結合させる前に、ペプチドを最初に合成することは、材料の特性を明らかにし、純度を制御するのを容易にし得る。

本発明の方法は、ＳＰＯＴ合成法に対する改善を包含し、ＳＰＯＴ合成法に好適でない場合がある酸化セルロースなどのカルボキシル基を有する基材に適用可能である。カルボキシル基を有する他の基材の例には、デンプン、グリコーゲン、デキストラン、ヘミセルロース、ペクチン、ヒアルロン酸、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、および絹が挙げられる。

本発明では、ペプチドを共有結合で基材に固定化する方法が提供され、該方法は、部分であって、それぞれの部分がペプチドおよびカルボキシル反応性基の形の第１の反応性基（または反応性基の部分）を含む部分を用意すること；カルボキシル基の形の第２の反応性基（または反応性基の部分）を含む基材を用意すること；および第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

好ましい実施形態では、基材は酸化セルロースなどのセルロース系基材、最も好ましいのは再生酸化セルロース基材であるか、それを含む。

部分はフィブリノーゲン結合ペプチドを含むのが好ましい。

好ましくは、方法は複数のペプチドを共有結合で基材へ固定化することを含む。

本発明では、止血材料または止血剤を作製する方法が提供され、該方法は、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを酸化セルロース基材に共有結合で固定化することを含む。

いくつかの実施形態では、方法は、フィブリノーゲン結合ペプチドおよびカルボキシル反応性基の形の第１の反応性基を含む部分を用意すること；カルボキシル基の形の第２の反応性基を含む酸化セルロース基材を用意すること；および第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

第１の反応性基は、第１の反応性基と第２の反応性基との反応がアミド結合を形成するように、アミノ基であるのが好ましい。

好ましい実施形態では、ペプチドは、ペプチドのＣ末端を介して基材に共有結合で固定化される。

本発明では、ペプチドを共有結合で基材に固定化する方法が提供され、該方法は、ペプチドおよびＣ−末端を介してペプチドに結合されたカルボキシル反応性基の形の第１の反応性基を含む部分を用意すること；カルボキシル基の形の第２の反応性基を含む基材を用意すること；およびペプチドがそのＣ末端を介して共有結合で基材に固定化されるように、第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、それぞれのペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

部分は非ペプチド部、またはリンカーを含んでもよい。非ペプチド部が、第１の反応性基を提供してもよい。部分の非ペプチド部がペプチドのＣ末端でα−カルボニル基に共有結合で連結してもよい。第１の反応性基を与える非ペプチド部がない場合は、ペプチドは他の方法で基材上の第２の反応性基と反応できないであろう。このように、非ペプチド部はアダプターとして機能する。第１と第２の反応性基が反応する場合、非ペプチド部は基材とペプチドとの間のスペーサーの少なくとも一部を形成し得る。

非ペプチド部分は、アミド結合を介してペプチドに共有結合し得る。

部分は下記の構造を含み得る：

部分の非ペプチド部は、式−（ＣＨ_２）_ａ−の直鎖基を適宜含んでよく、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である。

特定の好ましい実施形態では、部分は下記の構造：

を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５、または２〜４である。

部分は、例えば、標準的Ｆｍｏｃ反応またはＢｏｃ反応を使って、固相ペプチド合成により合成されているのが好ましい。本発明の方法は、部分を合成するステップを含んでよい。好都合にも、部分は、基材上にインサイツで合成されるのではなく、基材へのその結合の前に合成される。

部分のペプチド上の反応性基は、Ｔ−ｂｏｃまたはＦ−ｍｏｃなどの保護基により保護され得る。アルギニン側鎖は、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）基またはＰｍｃにより保護され得る。好都合にも、部分の第１の反応性基のみが基材の第２の反応性基と反応し得る。例えば、ペプチドのＮ末端のアミノ基、またはいずれかのカルボキシル反応性アミノ酸側鎖は基材の第１の反応性基との反応が防止され得る。ペプチドがＣ末端を介して基材に結合すること、およびペプチドのＮ末端がリガンドにアクセス可能となることが望まれる場合には、これは特に有利である。

いくつかの実施形態では、ペプチドのＮ末端アミノ基が基材のカルボキシル基と反応して、ペプチドがＮ末端を介して基材に結合されることが望ましい場合は特に、Ｎ末端は必ずしも保護される必要はない。

ペプチドは基材に共有結合で固定化されると、脱保護されてよい。

他の実施形態では、ペプチドは、側鎖を介して、例えば、リジン残基の側鎖を介して基材に結合され得る。したがって、第１の反応性基は、ペプチド中のアミノ酸の側鎖であってよい。

いくつかの実施形態では、基材のカルボキシル基と修飾基とを反応させることにより、基材は修飾（または活性化）される。第２の反応性基がスペーサーの末端に現れる、または配置されるように、修飾基がスペーサーを導入してもよい。これは、結合中に第２の反応性基の部分に対するアクセシビリティを改善し得る。

好適なスペーサーの例には、ペプチドスペーサーが含まれる。本明細書で使用される場合、「ペプチドスペーサー」という用語は、１個または複数のアミノ酸残基のスペーサーを包含する。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、１〜５個、または１〜２個のアミノ酸残基の長さである。好適なペプチドスペーサーの例には、グリシン、グリシン−グリシン、β−アラニン、Ｌ−リシンまたはε−アミノヘキサン酸が挙げられる。

方法は、基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させることにより、基材を修飾することを含んでもよい。

好ましくは、それぞれの修飾基は、カルボキシル反応性基である第１の反応性基およびカルボキシル基である第２の反応性基を有する。修飾基の第１の反応性基は、アミノ基であるのが好ましい。したがって、アミノ基は、担体のカルボキシル基と反応してアミド結合を形成し得る。したがって、第２の反応性基は修飾前には基材上に存在する同じ官能基であってもよいが、スペーサーを導入することによって、官能基がよりアクセスしやすい配置に存在できるようになり得る。

修飾前は、基材は下記の構造を含み得る：

修飾基材は、下記の構造を含み得る：

修飾基と基材上のカルボキシル基との反応が完了すると、アミド結合の形成をもたらす、部分の第１の反応性基との反応のためのカルボキシル基を提供し得る。

例えば、修飾基が２個のグリシン残基を含む場合は、修飾基材は、下記の構造を含み得る：

修飾基が６−アミノヘキサン酸を含む場合は、修飾基材は、下記の構造を含み得る：

本発明では、ペプチドを共有結合で基材に固定化する方法が提供され、該方法は、ペプチドおよび第１の反応性基を含む部分を用意すること；基材のカルボキシル基を修飾することにより形成された第２の反応性基を含む基材を用意すること；および第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、フィブリノーゲン結合ペプチドおよび第１の反応性基を含む部分を用意すること；基材のカルボキシル基を修飾することにより形成された第２の反応性基を含む修飾酸化セルロース基材を用意すること；および第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

いくつかの実施形態では、第１の反応性基は、カルボキシル基、場合により、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基である。他の実施形態では、第１の反応性基は、ペプチドＣ末端を介して連結され得る。

本発明では、ペプチドを共有結合で基材に固定化する方法が提供され、該方法は、ペプチドおよび、第１の反応性基であって、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基である第１の反応性基、またはペプチドのＣ末端を介して連結される第１の反応性基を含む部分を用意すること；基材のカルボキシル基を修飾することにより形成される第２の反応性基を含む修飾基材を用意すること；およびペプチドがＣ末端を介して基材に共有結合されるように、第１の反応性基と第２の反応性基とを反応させて、ペプチドを基材に共有結合で固定化すること、を含む。

第２の反応性基は、非カルボキシル基、好ましくはカルボキシル反応性基、最も好ましくはアミノ基であってよい。第２の反応性基は、部分のカルボキシル基、例えば、ペプチドのアミノ酸残基の側鎖上のペプチドのＣ末端にあるカルボキシル基、と反応するためのものであってよい。

基材のカルボキシル基は、修飾基と反応させることにより修飾（または活性化）されたであろう。したがって、方法は、基材を修飾することを含む。修飾は、スペーサーの導入という結果に繋がり、基材の第２の反応性基がスペーサーの末端に配置され得る。スペーサーは、アミド結合を介してペプチドに共有結合し得る。

修飾基材は、下記の構造を含み得る：

スペーサーは、式−（ＣＨ_２）_ａ−の直鎖基を適宜含んでよく、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である。

修飾基は第１のカルボキシル反応性基および第２のカルボキシル反応性基を含んでよく、第１と第２のカルボキシル反応性基はアミノ基であるのが好ましい。

修飾基は下記の構造を含み得る：
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ａ−ＮＨ_２
式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０または１〜６である。

したがって、修飾基はジアミン分子、例えば、エチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミンまたは１，４−ブタジアミンを含んでよい。

例えば、修飾基がエチレンジアミンを含む場合、修飾基材は、下記の構造を含み得る：

本発明は、本発明の方法により得ることができる基材に共有結合したペプチドを提供する。

本発明は、基材を修飾（または活性化）する方法を提供し、該方法は、基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させることを含み、修飾基は、第１の反応性基、好ましくはカルボキシル反応性基、最も好ましくはアミノ基；および第２の反応性基、好ましくはアミノ反応性基、最も好ましくはカルボキシル基を含む。

修飾基はペプチドを含んでよい。
修飾前は、基材は下記の構造を含み得る：

修飾基材は、活性化基材または誘導体化基材と呼んでも良い。

本発明は、下記の構造：

を含む、修飾基材、好ましくは修飾酸化セルロース基材を提供し、式中、Ｘはアミノ反応性基、好ましくはカルボキシル基である。

好ましくは、スペーサーは、アミド結合を介して結合される。したがって、基材は下記の構造：

を含み得、式中、Ｘはアミノ反応性基、好ましくはカルボキシル基である。したがって、修飾基材は、下記の構造を含み得る：

スペーサーは、本明細書で記載のペプチドスペーサーを含んでもよい。

本発明は、基材を修飾（または活性化）する方法を提供し、該方法は、基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させることを含み、修飾基は、第１の反応性基、好ましくはカルボキシル反応性基、最も好ましくはアミノ基；および第２の反応性基、好ましくはカルボキシル反応性基、最も好ましくはアミノ基を含む。
それぞれの修飾基は下記の構造：
Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ａ−ＮＨ_２
を含み得、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０または１〜６である。

本発明は、下記の構造：

を含む、修飾基材、好ましくは修飾酸化セルロース基材を提供し、式中、Ｘはカルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である。

好ましくは、スペーサーは、アミド結合を介して結合される。したがって、修飾基材は、下記の構造：

を含み得、式中、Ｘはカルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である。したがって、修飾基材は、下記の構造を含み得る：

スペーサーは、基−（ＣＨ_２）_ａ−を含み得、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０または１〜６である。

本発明は、本発明の方法により得ることができる修飾基材を提供する。

本発明はまた、ペプチドに共有結合した基材を含む材料にも関する。基材は好ましくは、カルボキシル基を含み、ペプチドを含む部分と基材上のカルボキシル基とを反応させることにより、ペプチドを基材に結合させてよい。

好ましくは、基材は酸化セルロースであるか、または酸化セルロースを含む。好ましくは、ペプチドはフィブリノーゲン結合ペプチドである。好ましくは、基材は、複数のペプチドに共有結合されている。

本発明では、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドに共有結合で固定化された酸化セルロース基材を含む止血材料（または止血剤）が提供される。

好ましくは、ペプチドは、基材のカルボニル基を介して基材に固定化される。例えば、それぞれのペプチドは、ペプチド、またはペプチドを含む部分と、基材上のカルボキシル基とを反応させることにより、基材に固定化され得る。ペプチドは、アミド結合を介して基材に結合し得る。

好都合にも、基材上のカルボキシル基をペプチドに対する結合点として使用することにより、基材の酸性を変え、トロンビンおよびフィブリノーゲンなどのタンパク質との相互作用を改善し得る。

好ましい実施形態では、ペプチドはスペーサーを介して基材に固定化される。
スペーサーはリガンドへのアクセシビリティを高め得る。フィブリノーゲン結合ペプチドの場合には、それによりフィブリノーゲンへのアクセシビリティが高められ、止血活性が改善され得る。

材料は下記の構造を含み得る：

好ましい実施形態では、ペプチドはそのＣ末端を介して基材に固定化される。したがって、ペプチドのＮ末端は、リガンドとの相互作用のためにアクセスしやすく、利用可能であり得る。ペプチドは、Ｃ末端の主鎖α−カルボニル基を介して基材に結合し得る。
したがって、材料は下記の構造を含み得る：

あるいは、ペプチドはそのＮ末端を介して基材に結合し得る。したがって、材料は下記の構造を含み得る：

あるいは、ペプチドは、そのアミノ酸残基の１個の側鎖を介して結合可能であろう。

好ましくは、スペーサーは、アミド結合によりペプチドに結合される。したがって、材料は下記の構造の１つまたは両方を含み得る：

好ましくは、スペーサーは、アミド結合により基材に結合される。

好ましい実施形態では、スペーサーはペプチドスペーサーを含む。好適なペプチドスペーサーの例には、グリシン、グリシン−グリシン、β−アラニン、Ｌ−リシンまたはε−アミノヘキサン酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、１〜５個、または１〜２個のアミノ酸の長さである。

いくつかの実施形態では、スペーサーは非ペプチドスペーサーを含む。これは、ペプチドスペーサーに追加しても、またはそれに代えてもよい。非ペプチドスペーサーは、直鎖を含み得、好ましくは、非ペプチドスペーサーは、基−（ＣＨ_２）_ａ−を含み、式中、ａは、１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である。

好ましい実施形態では、材料は下記の構造の１つまたは両方を含む：

いくつかの実施形態では、基材は創傷包帯材である。創傷包帯材は、好ましくは非コロイド状の多孔質包帯材である。本明細書で使われる場合、用語の「非コロイド状の多孔質包帯材」は、局所に適用して、創傷を被覆、手当て、または保護できる任意の非コロイド状の多孔質材料を意味する。このような物質の例としては、シート、パッド、スポンジ、発泡体、フィルム、ガーゼ、メッシュ、顆粒、およびビーズが挙げられる。非コロイド状の多孔質包帯材には、創傷への局所適用に好適するが身体への注射用としては適さない材料が含まれる。特に、顆粒またはビーズは、大き過ぎて肺の毛細血管床を通過できない。少なくとも顆粒またはビーズの大部分が６μｍより大きい最大寸法を有する。包帯材は、好ましくは酸化セルロース、または結合に利用可能なカルボキシル基を有する任意のその他の包帯材である。創傷包帯材は織物であってよい。

創傷包帯材は無菌であるのが好ましい。創傷包帯材は創傷への使用の準備ができている無菌の創傷包帯材として提供されてよい。創傷包帯材は創傷に対する適用のための説明書と一緒に包装されてよい。

本発明は、創傷への創傷包帯材の使用を含む、出血を減らすまたは制御する方法を提供し得る。

いくつかの実施形態では、基材は外科用留め具である。用語の「外科用留め具」は、組織を穿孔または穿刺することにより適用される、機械的に組織を連結するための手段または媒介物を意味する。外科用留め具の例には、縫合糸、ステープルおよびピンが含まれる。フィブリノーゲン結合ペプチドが共有結合で固定される外科用留め具は、その留め具の適用中に孔中の凝固を促進するのに特に有利であり得る。例えば、フィブリノーゲン結合ペプチドは、縫合穴の出血を防ぐまたは減らし得る。外科用留め具を使って、創傷包帯材などの材料を患者に取り付け得る。

本発明は、外科用留め具を患者に適用することを含む、組織を連結する方法を提供し得る。

好ましくは、基材に共有結合で固定化される（または基材への共有結合固定化のための）ペプチド、例えば、フィブリノーゲン結合ペプチドは、それぞれ４〜６０個、好ましくは４〜３０個、より好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基の長さである。他の実施形態では、それぞれのペプチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸残基の長さであってよい。それぞれのペプチドが６０個のアミノ酸残基の長さ以下、より好ましくは３０個のアミノ酸残基の長さ以下であるのが好ましい。

本明細書で使用される場合、用語の「ペプチド」は、ペプチド類似体も包含する。いくつかのペプチド類似体は当業者に既知である。フィブリノーゲン結合ペプチドにおいては、フィブリノーゲンがフィブリノーゲン結合ペプチドに結合できる限りにおいて、任意の好適な類似体を使ってよい。

好適なフィブリノーゲン結合ペプチドの例およびそれらを特定し得る方法は、国際公開第２００５／０３５００２号、同第２００７／０１５１０７号、および同第２００８／０６５３８８号で提供されている。

それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが合成ペプチドであるのが好ましい。

好ましくは、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、１０^−９〜１０^−６Ｍ、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、またはそれを超えるｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でフィブリノーゲンに結合する。約１００ｎＭのＫ_Ｄが好ましい。解離定数は平衡時に測定できる。例えば、既知の濃度の放射標識フィブリノーゲンをフィブリノーゲン結合部分が架橋結合しているマイクロスフェアとインキュベートできる。通常、５μＭのペプチドが１ｇmのマイクロスフェアに架橋結合する、または１５〜４０μモルのペプチドが１ｇmのマイクロスフェアに架橋結合する。ペプチド結合マイクロスフェアは、０．５ｍｇ／ｍｌに希釈され、ｐＨ７．４の等張性緩衝液（例えば、０．１５ＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍヘペス緩衝液）中で、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の放射標識フィブリノーゲンと共に２０℃で１時間までインキュベートされる。マイクロスフェア上のフィブリノーゲン結合部分に結合したフィブリノーゲンは、遠心分離により遊離フィブリノーゲンから分離でき、遊離および結合フィブリノーゲンの量が測定される。次に、結合：遊離フィブリノーゲンの濃度の比率に対し、結合フィブリノーゲンの濃度をプロットすることにより、スキャチャード解析で解離定数が計算でき、曲線の傾斜がＫ_Ｄを表す。

フィブリノーゲンの分子は、ジスルフィド結合で一緒に連結された非同一ポリペプチド鎖、Ａα、Ｂβおよびγの３種の対から構成される。フィブリノーゲン鎖は、３つの別々の構造領域、１つの中央Ｅ領域に結合した２つの遠位のＤ領域に折り畳まれる。それぞれのＤ領域は、γおよびＢβ鎖のＣ末端中に位置する重合「ａ」および「ｂ」ホールをそれぞれ含む。トロンビンは、それぞれ、２つの重合部位：アミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−を有する「ノブＡ」；およびアミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−を有する「ノブＢ」を露出している中心Ｅ領域中のフィブリノーゲンのＡαおよびＢβ鎖のアミノ末端からの、短ペプチド、フィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）およびＢ（ＦｐＢ）の除去を触媒する。新しく露出された１個のフィブリンモノマーの重合ノブは、「Ａ−ａ」および「Ｂ−ｂ」ノブ−ホール相互作用を介して別のフィブリンモノマーの対応するホールと相互作用し、フィブリンモノマーが、半分ずらして交互に配置された、二本鎖プロトフィブリルへと組み合わされる。

本発明の好ましい実施形態では、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する。この配列がペプチドのアミノ末端にあるのが好ましい。例えば、ペプチドは、配列ＮＨ_２−Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含んでよい。ペプチドは、カルボキシ末端を介して基材に結合し得る。

しかし、いくつかの実施形態では、このアミノ酸配列がペプチドのカルボキシ末端にあってよい。ペプチドは、アミノ酸末端を介して基材に結合し得る。例えば、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりホール「ａ」に選択的に結合する少なくとも１個のフィブリノーゲン結合ペプチド、例えば、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２）を含むペプチドは、そのアミノ末端を介して、担体または繊維に結合し得る。フィブリノーゲン結合ペプチドがそのアミノ末端を介して結合する場合は、ペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を含み得る。露出したペプチドのカルボキシ末端での、カルボキシル基（または負電荷カルボキシレートイオン）ではなくアミド基の存在は、フィブリノーゲン結合ペプチドのフィブリノーゲンへの結合を最適化するのを支援し得る。

本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも一部のフィブリノーゲン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号３）を含み、ここでＸａａは任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘａａは、Ｖａｌ以外の任意のアミノ酸であり、好ましくは、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、またはＬｅｕである。

いくつかの実施形態では、少なくとも一部のフィブリノーゲン結合ペプチドは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号４）を含み、ここでＸａａは、Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸である。

本発明のいくつかの実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ｂ」より、フィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合する。フィブリノーゲンのホール「ｂ」より、ホール「ａ」に選択的に結合する好適なフィブリノーゲン結合ペプチドの配列例には下記が含まれる：ＧＰＲ−；ＧＰＲＰ−（配列番号５）；ＧＰＲＶ−（配列番号６）；ＧＰＲＰＦＰＡ−（配列番号７）；ＧＰＲＶＶＡＡ−（配列番号８）；ＧＰＲＰＶＶＥＲ−（配列番号９）；ＧＰＲＰＡＡ−（配列番号１０）；ＧＰＲＰＰＥＣ−（配列番号１１）；ＧＰＲＰＰＥＲ−（配列番号１２）；ＧＰＳＰＡＡ−（配列番号１３）。

いくつかの実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドは、好ましくは、フィブリノーゲンのホール「ａ」より、フィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合する。フィブリノーゲンのホール「ａ」より、ホール「ｂ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドの配列例には下記が含まれる：ＧＨＲ−、ＧＨＲＰ−（配列番号１４）、ＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）、ＧＨＲＰＬ−（配列番号１６）、ＧＨＲＰＹアミド−（配列番号１７）。

材料は異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。例えば、いくつかの実施形態では、材料は、フィブリノーゲンのホール「ｂ」と比較してホール「ａ」に対する異なる結合選択性を有するフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。

好ましくは、フィブリノーゲン結合ペプチドはフィブリノーゲンを含まない。好ましくは、フィブリノーゲンは基材に固定化されない。好ましくは、材料は、基材にフィブリノーゲンを固定化することにより形成されない。

好ましい構成では、フィブリノーゲン分子は少なくとも２個のフィブリノーゲン結合ペプチドに結合できる。したがって、基材に固定された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドが存在する場合、フィブリノーゲン分子は非共有結合で架橋されてもよい。したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの２つの異なる領域に同時に結合できる１個または複数の配列を含んでよい。例えば、フィブリノーゲンは２つの末端ドメイン（Ｄ−ドメイン）を含み、それぞれのドメインは、フィブリノーゲン結合ペプチドに結合し得る。

好ましい実施形態では、材料は下記の構造の内の１つまたは複数を含み得る：

本発明は、創傷への止血材料の使用を含む、出血を制御する方法を提供し得る。

いくつかの実施形態では、基材（好ましくは酸化セルロース基材）は、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドに共有結合で固定化され、フィブリノーゲン結合ペプチドは、基材に共有結合で固定化されている止血剤の一部である。

例えば、止血剤は、複数の担体およびそれぞれの担体に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。したがって、複数の担体は、基材に共有結合で固定化され得、複数のフィブリノーゲン結合ペプチドはそれぞれの担体に固定化され得る。

好ましい実施形態では、担体は可溶性担体である。例えば、担体は血漿中に可溶性であってよい。担体は出血創傷部位への使用に好適する必要がある。担体は、ポリマー、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、もしくはポリエチレングリコールなどの合成生体適合性ポリマー、またはこれらの内のいずれかの組み合わせを含んでよい。アルブミンは好ましいタンパク質担体である。可溶性担体または止血剤は、少なくとも１ｍｌの溶媒あたり１０ｍｇの溶解度、例えば、１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ、３３〜１０００ｍｇ／ｍｌ、または３３〜１００ｍｇ／ｍｌの溶解度を有し得る。

担体は、フィブリノーゲン結合ペプチドの結合を可能とする反応性基を含んでよい。例えば、担体は、その表面にチオール部分またはアミン部分を含んでよい。担体がタンパク質性である場合は、チオールまたはアミン部分はアミノ酸、例えば、システインまたはリシンの側鎖により提供され得る。あるいは、反応性基を担体に付加してもよい。担体がアルブミンなどのタンパク質から形成される場合は、これは特に有利である。例えば、担体は、担体上の一級アミン基と反応できる２−イミノチオラン（２−ＩＴ）などの試薬を用いてチオール化され得る。あるいは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下でシスタミンを担体上のカルボキシル基に結合させ、その後、導入されたジスルフィド結合の還元開裂を行ってもよい。

好ましい実施形態では、フィブリノーゲン結合ペプチドはスペーサーを介して担体に共有結合で固定化される。好ましいスペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーを含む非ペプチドスペーサーである。好ましい実施形態では、ＰＥＧスペーサーによってチオール反応性基（例えば、マレイミド基）に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドをそれぞれ含む複数のペプチド複合体が、チオール化担体（例えば、２−ＩＴまたはシスタミンを使って上述のように調製された）と反応する。好適な非ペプチドスペーサーは、国際公開第２０１３／１１４１３２号に記載されている。

止血剤はペプチド複合体を含んでよい。したがって、好適な担体は、１個または複数のアミノ酸残基、例えば、リシンアミノ酸残基などの単一アミノ酸残基を含み得る。１個または複数のアミノ酸残基を含む担体を含む複合体の利点は、それらが固相ペプチド合成法を使って容易に作成できることである。さらに、免疫原性薬剤を使用せずにそれらは容易に作製し得、また、滅菌放射線に対し耐え得る。

ペプチド複合体のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、独立に、カルボキシ末端で（必要に応じてリンカーを介して）、またはアミノ末端で（必要に応じてリンカーを介して）担体に結合し得る。

一例では、ペプチド複合体は下記の一般式を有し得る：
ＦＢＰ−（リンカー）−Ｘ−（リンカー）−ＦＢＰ
式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは非ペプチドリンカーであり；
Ｘは、アミノ酸、好ましくは多官能性アミノ酸、最も好ましくは三官能性アミノ酸残基、例えば、リシン、オルニチン、またはアルギニンである。

好ましい一実施形態では、ペプチド複合体はデンドリマーである。デンドリマーは分岐コアおよび分岐コアに別々に共有結合した複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含み得る。分岐コアは、１個または複数の多官能性アミノ酸を含み得る。それぞれの多官能性アミノ酸、または複数の多官能性アミノ酸は、それに共有結合した１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを有し得る。

分岐コアは、ｉ）２〜１０個の多官能性アミノ酸残基であって、それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが別々に分岐コアの多官能性アミノ酸残基に共有結合している多官能性アミノ酸残基；ｉｉ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドがそれぞれ別々に分岐コアの少なくとも２個の隣接する多官能性アミノ酸残基に共有結合する多官能性アミノ酸残基；ｉｉｉ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドが別々に分岐コアの少なくとも１個の多官能性アミノ酸残基に共有結合する多官能性アミノ酸残基；ｉｖ）複数の多官能性アミノ酸残基であって、２個以上の多官能性アミノ酸残基が隣接する多官能性アミノ酸残基の側鎖を介して共有結合で連結する多官能性アミノ酸残基；またはｖ）単一の多官能性アミノ酸残基であって、フィブリノーゲン結合ペプチドが別々に多官能性アミノ酸残基のそれぞれの官能基に共有結合する多官能性アミノ酸残基、を含み得る。

多官能性アミノ酸残基は、三もしくは四官能性アミノ酸残基、または三および四官能性アミノ酸残基であってよく、あるいは単一の多官能性アミノ酸残基は、三もしくは四官能性アミノ酸残基である。

それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアとの結合点が異なっていてよく、したがって、フィブリノーゲン結合ペプチドは、本明細書では分岐コアに「別々に共有結合される」と呼ばれる。

分岐コアは任意の好適なアミノ酸配列を含む。分岐コアは、１０個までの多官能性アミノ酸残基、例えば、２〜１０個、または２〜６個の多官能性アミノ酸残基を含み得る。

分岐コアは、複数の連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。分岐コアは、１０個までの連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。

本明細書で使われる場合、用語の「三官能性アミノ酸」は、アミン（−ＮＨ_２）である第１の官能基、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基、および第３の官能基を有する任意の有機化合物を意味する。本明細書で使われる場合、用語の「四官能性アミノ酸」は、アミン（−ＮＨ_２）である第１の官能基、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基、第３の官能基、および第４の官能基を有する任意の有機化合物を意味する。第３および第４の官能基は、フィブリノーゲン結合ペプチドのカルボキシ末端と反応できる任意の官能基、またはフィブリノーゲン結合ペプチドのカルボキシ末端に結合したリンカーの官能基と反応できる任意の官能基であってよい。

多官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、およびさらなる官能基（それにより、三官能性アミノ酸を提供する）、またはさらなる２個の官能基（それにより、四官能アミノ酸を提供する）を有する側鎖を有する中心炭素原子（α−または２−）を含み得る。

その、またはそれぞれの多官能性アミノ酸残基は、タンパク質を構成する多官能性アミノ酸または非タンパク質構成多官能性アミノ酸の残基、または天然のまたは非天然の多官能性アミノ酸の残基であってよい。

タンパク質を構成する三官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、側鎖およびα−水素左旋性配座を有する中心炭素原子（α−または２−）を有する。好適な三官能性タンパク質を構成するアミノ酸の例には、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、およびＬ−システインが挙げられる。

好適な三官能性の非タンパク質構成アミノ酸残基の例には、、ベータ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニン残基が挙げられる。

したがって、本発明のペプチドデンドリマーのための使用に好適な三官能性アミノ酸残基の例には、リシン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、およびシステイン残基、例えば、Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、ベーターリシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、Ｌ−システイン、およびＤ−システイン残基が挙げられる。

本発明のペプチドデンドリマーに使用するために好適な多官能性非天然アミノ酸の例には、シトルリン、２，４−ジアミノイソ酪酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、およびシス−４−アミノ−Ｌ−プロリンが挙げられる。多官能性非天然アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手できる。

いくつかの実施形態では、分岐コアは、２〜１０個、または２〜６個の、連続したリシン、アルギニン、またはオルニチン残基を含む分岐コアなどの、ホモポリマー多官能性アミノ酸配列、例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、またはポリオルニチン配列を含んでよい。他の実施形態では、分岐コアは、異なる多官能性アミノ酸残基、例えば、１個または複数のリジン残基、１個または複数のアルギニン残基、および／または１個または複数のオルニチン残基を含んでよい。

他の実施形態では、分岐コアは、複数の多官能性アミノ酸残基、および１個または複数のその他のアミノ酸残基を含んでよい。

分岐コアが複数の多官能性アミノ酸残基を含む場合は、隣接する多官能性アミノ酸残基はアミノ酸側鎖連結により、ペプチド結合により一緒に連結され得、またはいくつかの隣接する多官能性アミノ酸残基は側鎖連結によりおよびその他の残基はペプチド結合により一緒に連結され得る。

さらなる実施形態では、分岐コアは２個以上の多官能性アミノ酸残基を含んでよく、少なくとも１個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、２個以上の多官能性アミノ酸残基のそれぞれに別々に結合し、また、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアの少なくとも１個の多官能性アミノ酸残基に別々に結合する。

その他の実施形態では、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアの末端多官能性アミノ酸残基に別々に結合する。

ペプチドデンドリマーの構造の例には、下記のペプチドデンドリマーが含まれる：
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基を含む；
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、および２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基を含む；
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基を含む；または
・分岐コアは、２個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基、１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基、および１個のフィブリノーゲン結合ペプチドが結合している第４の三官能性アミノ酸残基を含む。

ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（Ｉ）を含み得る：

式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは非ペプチドリンカーであり；
Ｘは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、オルニチン、またはアルギニンであり；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ_２であり；
Ｚは、Ｙが−ＦＢＰの場合、−（リンカー）−ＦＢＰであり、またはＹが−ＮＨ_２の場合、−［−Ｘ_ｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］_ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり；
式中、
Ｘ_ｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、Ｌ−オルニチン、またはアルギニンであり；かつ
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。

例えば、ＹがＮＨ_２、Ｚが−［−Ｘ_ｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］_ａ−（リンカー）−ＦＢＰである場合、デンドリマーの構造は以下の通りである：
ａが１の場合：

または、ａが２の場合：

または、ａが３の場合：

あるいは、Ｙが−ＦＢＰの場合、Ｚは、−［−Ｘ_ｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］_ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり；
式中、
Ｘ_ｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくは、リシン、Ｌ−オルニチン、またはアルギニンであり；および
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。

例えば、Ｙが−ＦＢＰ、Ｚが−［−Ｘ_ｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］_ａ−（リンカー）−ＦＢＰで、ａが１である場合、デンドリマーの構造は以下の通りである：

ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（ＩＩ）を含み得る：

式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−を含み；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ_２であり；
Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
−Ｒ−（リンカー）−ＦＢＰであり、または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であり；または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であり；または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であり；
式中、Ｒは、−（ＣＨ_２）_４ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ−、または−（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＮＨＮＨ−である。

したがって、一実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＮＨ_２である場合、

であってよく；
式中、Ｒは、−（ＣＨ_２）_４ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ−、または−（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＮＨＮＨ−であり；
ａは１〜３である。
あるいは、ａは４〜１０であってよく、または１〜１０であってよい。

別の実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、

であり、
式中、Ｒは、−（ＣＨ_２）_４ＮＨ−、−（ＣＨ_２）_３ＮＨ−、または−（ＣＨ_２）_３ＮＨＣＮＨＮＨ−であり；
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。

例えば、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰで、ａが１の場合、

である。

ペプチドデンドリマーは、下記の一般式（ＩＩＩ）を含み得る：

式中、
ＦＢＰは、フィブリノーゲン結合ペプチドであり；
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−を含み；
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ_２であり；
Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、
−（ＣＨ_２）_４ＮＨ−（リンカー）−ＦＢＰであり；または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であり；または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であり；または
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

である。

したがって、一実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＮＨ_２の場合、

であってよく；
ａは１〜３である。
あるいは、ａは４〜１０であり、または１〜１０であってよい。

別の実施形態では、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰの場合、

であり；
式中、ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。

例えば、Ｚは：
Ｙが−ＦＢＰで、ａが１の場合、

である。

１個または複数の、またはそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは非ペプチドリンカーにより共有結合され得る。リンカーは、フィブリノーゲンのフィブリノーゲン結合ペプチドへの結合と干渉しない任意の好適なリンカーであってよい。リンカーは可撓性の直鎖リンカー、適宜に直鎖アルキル基を含んでよい。したがって、このようなリンカーは、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドが相互に離れて伸長するのを可能にする。例えば、リンカーは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_ｎＣＯ−基を含んでもよく、式中、ｎは任意の数値、適宜に１〜１０、例えば、５である。−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−基を含むリンカーは、ε−アミノ酸 ６−アミノヘキサン酸（εＡｈｘ）の使用により形成し得る。

ペプチドデンドリマーなどのペプチド複合体の固有の利点は、例えば、照射、適切にガンマ線照射に暴露することにより、ペプチドデンドリマー、または組成物のフィブリノーゲンと重合する能力を大きく失うことなく、容易に無菌化できることである。

本発明では、止血材料を無菌化する方法が提供され、該方法は、材料を、好ましくは３０ｋＧｙまでのガンマ線照射に暴露することを含み、止血材料は基材（好ましくは酸化セルロース基材）および基材に固定化された複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。好ましくはフィブリノーゲン結合ペプチドは、ペプチドデンドリマーなどのペプチド複合体により提供される。

理論上は、担体当たりのフィブリノーゲン結合ペプチドの数の上限に制限はない。しかし、実際には、任意の特定の構造に対し、フィブリノーゲン結合ペプチドの数を変え、所望のフィブリノーゲン重合特性の最適数、例えば、フィブリノーゲン重合速度、またはフィブリノーゲンとの重合により作製されたヒドロゲルの密度の最適数を決定するために試験することができる。最適数は、多くの因子、例えば、担体の性質、およびそれぞれの担体上のフィブリノーゲン結合ペプチドに結合するための反応性基の数に依存し得る。しかし、平均で担体分子当たり１００個までのフィブリノーゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。平均で担体分子当たり少なくとも３個の、好ましくは少なくとも５個のフィブリノーゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。好ましい範囲は、担体分子当たり、１０〜２０個のフィブリノーゲン結合ペプチドである。ペプチドデンドリマーなどのペプチド複合体は、デンドリマー当たり、合計で２０個までのフィブリノーゲン結合ペプチド、例えば、デンドリマー当たり１０個までのフィブリノーゲン結合ペプチド、またはデンドリマー当たり５個までのフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。

それぞれの担体が、担体に結合した異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを有してよい。複数の担体に対しては、第１の複数の担体が、第２の複数の担体に比べて、担体に結合した異なるフィブリノーゲン結合ペプチドを有してよい。

基材への固定化に好適する止血剤は、２個以上のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドデンドリマー、およびペプチド複合体を含んでよい。ペプチド複合体は、同じ配列のまたは異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでよい。例えば、ペプチド複合体は、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもホール「ａ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドのみを含んでもよく、またはフィブリノーゲンのホール「ａ」よりもホール「ｂ」に選択的に結合するフィブリノーゲン結合ペプチドのみを含んでもよく、またはフィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもホール「ａ」に選択的に結合する１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドおよびフィブリノーゲンのホール「ａ」よりもホール「ｂ」に選択的に結合する１個または複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド複合体はペプチドデンドリマーであってよい。ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもフィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合し得、かつペプチド複合体のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンのホール「ａ」よりもフィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合し得る。このような組成物は、それらがペプチドデンドリマーまたはペプチド複合体単独よりもより急速にフィブリノーゲンを重合できるという点で相乗的効果を有することが見出された。この相乗的作用の機構は完全には理解されていない。しかし、理論に束縛されるものではないが、それは、組成物がより多くの「Ａ」および「Ｂ」フィブリノーゲン重合部位を提供するという理由で起こると考えられている。

あるいは、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドが、フィブリノーゲンのホール「ａ」よりもフィブリノーゲンのホール「ｂ」に選択的に結合し得、かつペプチド複合体のフィブリノーゲン結合ペプチドが、フィブリノーゲンのホール「ｂ」よりもフィブリノーゲンのホール「ａ」に選択的に結合し得る。

本発明の実施形態が、添付の図面を参照しながら、例示の目的のみで、以降で記載される。

本発明の止血包帯材の合成のためのスキームを示す図である。 本発明の包帯材上に結合して残っている完全に脱保護されたフィブリノーゲンペプチドの存在をモニターするために使用されたカイザー試験（ニンヒドリン試験）の結果を示す図である。 対照包帯材および本発明の止血包帯材の試料を示す図である。 本発明の包帯材の向上した凝固活性を対照と比較して示す図である。 包帯材の表面を修飾するための反応スキームを示す図である。 本発明の止血包帯材の合成のための反応スキームを示す図である。 本発明の包帯材上に結合して残っている完全に脱保護されたフィブリノーゲンペプチドの存在をモニターするために使用されたカイザー試験（ニンヒドリン試験）の結果を示す図である。 対照包帯材および本発明の止血包帯材の試料を示す図である。 本発明の包帯材の向上した凝固活性を対照と比較して示す図である。 ポリプロピレンチューブ中に配置された本発明の止血材料および対照材料を示す図である。 本発明の止血材料によるヒトフィブリノーゲンの重合を示す図である。 本発明の止血材料上のフィブリノーゲン凝血塊を示す図である。 包帯材の表面を修飾するための反応スキームを示す図である。 本発明の止血包帯材の合成のための反応スキームを示す図である。 本発明の包帯材上に結合して残っている完全に脱保護されたフィブリノーゲンペプチドの存在をモニターするために使用されたカイザー試験（ニンヒドリン試験）の結果を示す図である。 包帯材の表面を修飾するための反応スキームを示す図である。 本発明の止血包帯材の合成のための反応スキームを示す図である。 本発明の包帯材上に結合して残っている完全に脱保護されたフィブリノーゲンペプチドの存在をモニターするために使用されたカイザー試験（ニンヒドリン試験）の結果を示す図である。 種々の濃度で、ペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。 種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。 種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。 種々の濃度で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。番号は、ペプチドデンドリマーの識別情報を意味する。 異なるペプチドデンドリマーを使って、フィブリノーゲンの重合により形成されたヒドロゲルの写真を示す。 種々の濃度で、ペプチド複合体との異なる組み合わせのペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。 ヒト血漿中で、いくつかの異なるペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力を示す図である。

実施例１：Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２（Ｂｏｃ−ＦＢＰ−）の酸化再生セルロース織物上への一段階カップリング
Ｆｍｏｃ反応のみで、Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２（Ｂｏｃ−ＦＢＰ−）部分がＣからＮ末端へ組み込まれた。合成の最終合成段階で、Ｃ末端の遊離アミノ基を除いて、部分を完全に保護した（Ａｒｇ上のＰｂｆ保護基を含む）。保護部分は、Ａｌｍａｃ Ｌｔｄ．から購入した。

Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ＬｉｍｉｔｅｄのＥｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ．で製造された市販のＳｕｒｇｉｃｅｌ^＊ Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ Ｈｅｍｏｓｔａｔ（酸化再生セルロース（ＯＲＣ））を基材として使用した。Ｓｕｒｇｉｃｅｌ中のカルボン酸含量は、文献から採用した（欧州特許第ＥＰ０６５９４４０号を参照）。５０ｇのＳｕｒｇｉｃｅｌ Ｎｕ−Ｋｎｉｔ^＊クロスは２０％のカルボン酸含量を有する（０．２２モルのカルボン酸）。

合成に使用したＯＲＣ織物を、２ｘ１ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）（１分）で予備洗浄し、３３℃で乾燥した。乾燥後、５０ｍｇのＯＲＣ織物（０．２ｍｍｏｌのカルボン酸ＣＯＯＨ）を、１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；９０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）と混合した後、包帯材を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．４ｍｍｏｌ、０．０７５ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン ＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ＤＭＦ中に溶解した５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２を反応混合物に加えた−合計２ｍｌ。カップリング反応を室温で５時間実施した。織物をＤＭＦ（３ｘ１ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ１ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ１ｍｌ）で洗浄した。Ｂｏｃ−ＧＰＲ（Ｐｂｆ）ＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２のカップリングステップを反復し、室温で一晩インキュベートした後、ＤＭＦ（２ｘ１ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１ｘ１ｍｌ）およびＤＭＦ（２ｘ１ｍｌ）で洗浄した。その後、ＯＲＣ織物をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ」）が得られた。

図１に反応スキームおよび構造をまとめている。図２は、織物上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターするためのカイザー試験（ニンヒドリン試験）の結果を示す（ＯＲＣ対照（上側）；ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ（下側））。

実施例２：官能性試験
ＧＰＲＰＧ−ＦＢＰおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１００μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ Ｌｏｔ＃Ａ１１６２ Ｅｘｐ ２０１５−０３）で処理し、３３℃で１．５分または３分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、差異を判定した。この試験を３回繰り返した。表１の結果から、ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照試料に比べてかなり多く、織物に結合された場合に、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示すことがわかる。

ＯＲＣ（対照）およびＧＰＲＰＧ−ＯＲＣの試料（それぞれ６ｍｇ）を秤量ボートに入れ（図３ａ参照−対照（左）；ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ（右））、１００μｌのヒト血漿で処理した後、３３℃で３分間インキュベートした。得られた凝血塊を９０°の角度に配置（傾斜させて）し、凝血塊からの全ての流出を観察した。ＯＲＣ（対照）は、流体を放出したが、ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣは放出しなかった（図３ｂ参照−対照（左）；ＧＰＲＰＧ−ＯＲＣ（右））。

実施例３：Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーを使った表面修飾酸化セルロース織物の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーの酸化セルロース織物への導入を行った。合成に使用した織物を、２ｘ５ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）（１分）で予備洗浄し、３３℃で乾燥した。乾燥後、２８５ｍｇの織物（１．２５ｍｍｏｌのＣＯＯＨ濃度）を、５ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；５９７ｍｇ、１．１５６ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；２１７ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）と混合した後、織物を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（３．１４ｍｍｏｌ、０．５０５ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン ＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した２４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌのＧｌｙ−ＯＨを反応混合物に加えた。

カップリング反応を室温で１４０分間実施した。酸化セルロース織物をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。Ｇｌｙ−ＯＨのカップリングステップを反復し、室温で３０分間インキュベートした後、ＤＭＦ（２ｘ５ｍｌ）、ＭｅＯＨ（１ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（２ｘ５ｍｌ）で洗浄した。図４に反応スキームおよび構造をまとめている。

実施例４：Ｂｏｃ−ＦＢＰのＧｌｙ−Ｇｌｙ−官能化酸化セルロース織物へのカップリング
塩基触媒合成手法により、Ｂｏｃ−ＦＢＰのＧｌｙ−Ｇｌｙ−官能化織物へのカップリングを行った。最初に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−官能化織物をＤＭＦ（５ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（４７５ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１６９ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．４０６ｍｌ、２．５ｍｍｏｌ）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、２分間混合した。２７５ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（２００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、包帯材をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ」）が得られた。

カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、織物上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターした（図６参照−ＯＲＣ対照（上側）；ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（下側））。

カイザー試験は、実施例１（Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーなし）に比べて、より強力な極めて望ましい結果を示した。

実施例５：官能性試験
傾斜試験（実施例２に記載）を、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣに対し繰り返した。ＯＲＣ（対照）およびＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（それぞれ８ｍｇ）を秤量ボートに入れ、１００μｌのヒト血漿で処理した後、３３℃で１．５分間インキュベートした。得られた凝血塊を９０°の角度に配置（傾斜させて）した。凝血塊の強度を観察した。図７ａおよび７ｂは、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ試料がＯＲＣ対照（左）より固い血漿による凝血塊を形成したことを示す（ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（右））。

ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＦＢＰおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１５０μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ Ｌｏｔ＃Ａ１１７４ Ｅｘｐ ２０１６−０３）で処理し、３３℃で１．５分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、何らかの差異が観察されるかどうかを判定した。この試験を４回繰り返した。表２の結果から、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照試料に比べてかなり多く、再生酸化セルロース織物に結合された場合、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示すことがわかる。

図７ｃは、別々のポリプロピレンチューブ中に投入されたＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（チューブ標識ＳＣ＋（上側））およびＯＲＣ（対照）（チューブ標識ＳＣ−（下側））繊維を示す。１５０μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ Ｌｏｔ＃Ａ１１６２ Ｅｘｐ ２０１６−０３）をそれぞれの試料に加え、繊維を３７℃で１．５分間インキュベートした。図７ｄに示すように、ＳＣ＋には凝血塊が存在する。

ポリエチレンチューブから取りだした繊維の目視検査も行った。図７ｅは、ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ繊維がヒトフィブリノーゲンによる凝血塊を形成したことを示す。容器から取り出したＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣは対照試料より肉厚であった。

実施例６：ε−Ａｈｘスペーサーを使った表面修飾酸化セルロース織物の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、６−アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）スペーサーの酸化セルロース織物への導入を行った。用いた合成方法は、ＯＲＣ織物のＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーによる修飾のために実施例３で上記したものと実質的に同じであった。

予備洗浄と乾燥ステップ後、１１４ｍｇの織物を、２ｍｌのＤＭＦ溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；２３７ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；８４ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）と混合した後、織物を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（１．２５ｍｍｏｌ、０．２００ｍｌ、ｄ＝０．７９８）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した１６．４ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌのε−Ａｈｘ−ＯＨを反応混合物に加えた。カップリング反応を室温で一晩実施した。

織物をＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ３ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）で洗浄した。
図８に反応スキームおよび構造をまとめている。

実施例７：Ｂｏｃ−ＦＢＰのＡｈｘ官能化包帯材へのカップリング
実施例４に記載の塩基触媒合成手法により、Ｂｏｃ−ＦＢＰのＡｈｘ官能化織物へのカップリングを行った。
反応スキームおよび構造の概要を図９に示す。

最初に、Ａｈｘ官能化包帯材をＤＭＦ（２ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（６７．４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．１８０ｍｌ、１．１ｍｍｏｌ）（またはＤＩＰＥＡ）を加え、２分間混合した。１１０ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（２００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、包帯材をＤＭＦ（３ｘ３ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ３ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−Ａｈｘ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ」）が得られた。

カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、セルロース上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターした（図１０参照−ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ（左）；ＧＰＲＰＧ−Ｇ−Ｇ−ＯＲＣ（右））。

実施例８：β−Ａｌａスペーサーを使った表面修飾酸化セルロース織物の調製
塩基触媒ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴアミド結合形成により、β−アラニン（β−Ａｌａ）スペーサーの酸化セルロース織物への導入を行った。用いた合成方法は、ＯＲＣ織物のＧｌｙ−Ｇｌｙスペーサーによる修飾のために実施例３で上記したものと実質的に同じであった。

予備洗浄と乾燥ステップ後、２０６ｍｇの織物を、５ｍｌのＤＭＦ溶液中に浸漬し、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ；４４２ｍｇ、１．１６５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ；１５２ｍｇ、１．１２５ｍｍｏｌ）と混合した後、織物を室温で１５分間活性化した。次に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチレンジアミン（２．４６８ｍｍｏｌ、０．３１９ｍｌ）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン ＤＩＥＰＡ）を加え、得られた溶液をさらに１５分間反応させた。この後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した２０ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌのβ−Ａｌａ−ＯＨを反応混合物に加えた。カップリング反応を室温で一晩実施した。

織物をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ）（３ｘ５ｍｌ）およびＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。図１１に反応スキームおよび構造をまとめている。

実施例９：Ｂｏｃ−ＦＢＰのβ−Ａｌａ官能化包帯材へのカップリング
実施例４に記載の塩基触媒合成手法により、Ｂｏｃ−ＦＢＰのβ−Ａｌａ官能化織物へのカップリングを行った。
反応スキームおよび構造の概要を図１２に示す。

最初に、β−Ａｌａ官能化包帯材をＤＭＦ（５ｍｌ）中に浸漬し、ＨＢＴＵ（３５０ｍｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）、ＨＯＢＴ（１２４ｍｇ、０．９１８ｍｍｏｌ）と混合した。室温で２分間撹拌後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチレンジアミン（０．２４７ｍｌ、１．９１１ｍｍｏｌ）（またはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン ＤＩＥＰＡ）を加え、２分間混合した。２０２ｍｇ（０．２３１ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−ＦＢＰペプチドをＤＭＦ（４００μｌ）に溶解し、これを、反応混合物に添加した。カップリング反応を室温で一晩（１７時間）実施した。その後、包帯材をＤＭＦ（３ｘ５ｍｌ）およびＤＣＭ（３ｘ５ｍｌ）で洗浄した。カップリング反応後、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳ、２．５％水（３ｍｌ）による保護基の除去により、ＧＰＲＰＧ−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯ−Ａｈｘ−ＯＲＣ（「ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ」）が得られた。

カイザー試験（ニンヒドリン試験）を使って、セルロース上に結合して残っている完全に脱保護されたペプチドの存在をモニターした。図１３：左Ｓｕｒｇｉｃｅｌ対照（ＯＲＣ−Ｃｏｎｔｒｏｌと標識）、ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＯＲＣおよびＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣを参照されたい。

実施例１０：官能性試験
ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＦＢＰ、ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣおよびＯＲＣ（対照）の試料を秤取し、１００μｌのヒト血漿（Ａｌｐｈａ Ｌａｂｓ−Ｐｌａｓｍａ Ｌｏｔ＃Ａ１１７４ Ｅｘｐ ２０１６−０３）で処理し、３３℃で１．５分間インキュベートした。試験した試料および対照を血漿から取り出した後、秤量して、何らかの差異が観察されるかどうかを判定した。この試験を３回繰り返した。表３の結果から、ＧＰＲＰＧ−β−Ａｌａ−ＯＲＣ、ＧＰＲＰＧ−Ａｈｘ−ＯＲＣ上に残っている量は、対照（Ｓｕｒｇｉｃｅｌ）試料に比べてかなり多いことが示され、再生酸化セルロース織物に結合された場合、フィブリノーゲン結合ペプチドの活性が維持されることを示唆している。

実施例１１：ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の合成
Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使って、標準的Ｆｍｏｃペプチド合成によりＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ低密度充填型樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）上でペプチドを合成した。

一般に、合成全体を通して、単一カップリングサイクルが使用され、ＨＢＴＵ活性化反応を採用した（カップリング剤としてＨＢＴＵおよびＰｙＢＯＰ（ＡＧＴＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓから入手）を使用した）。しかし、いくつかの位置では、カップリングが予測より効率が低く、２回のカップリングが必要であった。

分岐点までは、自動化ペプチド合成装置およびＨＢＴＵを使ってペプチドを構築し、ペプチド分岐部に対しては、ＰｙＢＯＰを使って手操作によるペプチド合成により構築した。

自動化合成では、それぞれのカップリングに対し３倍過剰のアミノ酸およびＨＢＴＵを使用し、９倍過剰のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ）中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を使用した。

手操作による合成では、それぞれのカップリングに対し３倍過剰のアミノ酸およびＰｙＢＯＰを使用し、９倍過剰のＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ、Ｓｉｇｍａ）中のＤＩＰＥＡを使用した。

ＤＭＦ中の２０％のピペリジン（Ｓｉｇｍａ）を使った、成長しているペプチドの脱保護（Ｆｍｏｃ基の除去）も同様に必ずしも効率的とは限らず、２回の脱保護を要する可能性がある。

分岐部は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを使って作製した。

ペプチドの最終的脱保護および固体支持体からの開裂をトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ、Ｓｉｇｍａ）、水およびアニソール（Ｓｉｇｍａ）（１：１：１、５％）を含む９５％のＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ）を使った樹脂の２〜３時間の処理により実施した。

開裂させたペプチドを冷ジエチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）中で沈殿させ、遠心分離によりペレット化して、凍結乾燥した。ペレットを水（１０〜１５ｍＬ）中に再溶解し、濾過して、Ｃ−１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、流速２０ｍｌ／分）カラムおよび０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル／水グラジエントを使って逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製生成物を凍結乾燥し、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよび分析用ＨＰＬＣで分析し、純粋（＞９５％）であることが示された。質量分析結果は全て計算値と合致した。

ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体
上記の方法を使って合成したペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の構造を以下に示す。

ペプチド配列の末端の「ＮＨ_２−」基は、配列のアミノ末端のアミノ基を意味する。ペプチド配列の末端の「−ａｍ」基は、配列のカルボキシ末端のアミド基を意味する。

ペプチド複合体Ｎｏ．１：

ペプチド複合体Ｎｏ．２：

ペプチド複合体Ｎｏ．３：

ペプチド複合体Ｎｏ．４：

ペプチド複合体Ｎｏ．５：

ペプチド複合体Ｎｏ．８：

ペプチド複合体Ｎｏ．９：

ペプチド複合体Ｎｏ．１０：

ペプチド複合体Ｎｏ．１１：

ペプチド複合体Ｎｏ．１２：

ペプチド複合体Ｎｏ．１３：

実施例１２：ペプチドデンドリマーとフィブリノーゲンの共重合
デンドリマーＮｏ．１２は、５個の連続したリジン残基を有する分岐コアを含む。リジン残基は、隣接するリジン残基の側鎖を介して共有結合で連結される。

ペプチドデンドリマーＮｏ．１２のフィブリノーゲンを重合させる能力を評価した。０．００５〜２ｍｇ／ｍｌの濃度のデンドリマー溶液３０μｌを、３ｍｇ／ｍｌ（血液中で認められたフィブリノーゲンのレベル）の精製ヒトフィブリノーゲン１００μｌに加えた。Ｓｉｇｍａ Ａｍｅｌｕｎｇ ＫＣ４ Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使ってフィブリノーゲンの重合を分析した。図１４は、重合（凝固）時間（秒）とデンドリマーの濃度増加のプロットを示す。

結果は、デンドリマーが、極めて低いデンドリマー濃度であっても、フィブリノーゲンとほぼ瞬時に共重合することができることを示している。０．５ｍｇ／ｍｌを超えるデンドリマー濃度による凝固時間の増加は、フィブリノーゲン中の遊離結合ポケットの数に比べて、過剰なフィブリノーゲン結合ペプチドにより説明されると考えられる。より高い濃度では、デンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲン結合ポケットを飽和させて、フィブリノーゲンと共重合できないかなりの数の過剰デンドリマー分子を生じるであろう。

実施例７：デンドリマー当たりの種々の数のフィブリノーゲン結合ペプチドがフィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響
この実施例は、デンドリマー当たりの種々の数のフィブリノーゲン結合ペプチドがフィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響を調査する。

実施例１１に記載のものと同じ方法を使って、ペプチドデンドリマーＮｏ．４、５、１０、１１、および１２の、フィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。それぞれのデンドリマーの濃度を、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌで変化させた。図１５は、凝固時間（秒）と異なるデンドリマーの濃度増加のプロットを示す。

結果は、Ｎｏ．５（２個のみのフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）はフィブリノーゲンと共重合できなかったことを示している。フィブリノーゲン結合ペプチドの数が３から５に増加（デンドリマーの濃度で約０．１２５から約０．２７５ｍｇ／ｍｌに増加）するのに伴い、共重合速度が増加する。約０．１２５ｍｇ／ｍｌデンドリマー未満の濃度では、デンドリマーＮｏ．１０（３個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）は、デンドリマーＮｏ．４（４個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）より速い凝固時間をもたらした。約０．０２〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲では、デンドリマーＮｏ．１２（５個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）がほぼ瞬時の凝固をもたらした。約０．０５〜０．３ｍｇ／ｍｌの範囲では、デンドリマーＮｏ．１１（４個のフィブリノーゲン結合ペプチド／デンドリマーを有する）もほぼ瞬時の凝固をもたらした。

本発明のデンドリマーによりフィブリノーゲンが重合される速度は、デンドリマー当たりのフィブリノーゲン結合ペプチドの数が増加するに伴い、一般に増加すると結論付けられる。

実施例１３：フィブリノーゲン結合ペプチドの配向、および異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列の、フィブリノーゲンとの共重合速度に与える影響
フィブリノーゲン結合ペプチドの配向がペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力に影響を与えることがあり得るのかどうかを評価するために、単一の三官能性アミノ酸残基（リシン）に結合した３個のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むペプチドデンドリマーを合成し（「３分岐」デンドリマーと呼ぶ）、そのフィブリノーゲン結合ペプチドの１個を、分岐コアに結合したアミノ末端に配向させ、そのカルボキシ末端をアミド化した。異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を含むペプチドデンドリマーの、フィブリノーゲンと共重合する能力も試験した。

ペプチドデンドリマーＮｏ．３および１０のフィブリノーゲン結合ペプチドは、それぞれの配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）である。ペプチドデンドリマーＮｏ１０．のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのカルボキシ末端に配向している。ペプチドデンドリマーＮｏ３．の１個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向している。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。

ペプチドデンドリマーＮｏ８．の２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）であり、３番目のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向した、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２）である。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。

ペプチドデンドリマーＮｏ９．の２個のフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７）であり、３番目のフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向した、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１２）である。そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。

配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１５）は、フィブリノーゲンのホール「ａ」およびホール「ｂ」に結合するが、ホール「ａ」に対する多少の選択性を有する。配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７）は、高い選択的でフィブリノーゲンのホール「ａ」に結合する。配列Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏは、ペプチド鎖の主鎖を安定化し、ノブ−ホール相互作用の親和性を高める（Ｓｔａｂｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，２０１０，１１６：１３５２−１３５９）。

実施例１１と同じ方法を使って、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のそれぞれのデンドリマーに対し、デンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１６は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。

結果は、ペプチドが分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向するように、３分岐デンドリマーのフィブリノーゲン結合ペプチドの１個の配向を変えること（すなわち、デンドリマーＮｏ．３）が、デンドリマーのフィブリノーゲンを共重合する能力を低下させた（デンドリマーＮｏ．３の凝固時間をデンドリマーＮｏ．１０の凝固時間と比較して）ことを示している。しかし、より高いフィブリノーゲン濃度では、デンドリマーＮｏ．３は、フィブリノーゲンと共重合可能であった（データは示さず）。

分岐コアに結合したアミノ末端に配向した異なる配列のフィブリノーゲン結合ペプチドを有する３分岐デンドリマーは、フィブリノーゲンと共重合することが可能であった（デンドリマーＮｏ．８に対する結果を参照）。

選択的にフィブリノーゲンのホール「ｂ」と結合する配列（配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号７））を含み、分岐コアに結合したそれらのカルボキシ末端に配向した２個のフィブリノーゲン結合ペプチド、および分岐コアに結合したそのアミノ末端に配向したリバース配列（すなわち、ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号２））を含む別のペプチドを含む３分岐デンドリマー（デンドリマーＮｏ．９）も同様に、フィブリノーゲンと共重合する大きな活性があった。

実施例１４：異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマーの、フィブリノーゲンと共重合する能力
ＧＰＲＰＧ（配列番号１８）およびＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号８）モチーフが主にフィブリノーゲンの「ａ」ホールに結合する。この実施例は、キメラペプチドデンドリマー（すなわち、同じ分岐コアに結合した異なるフィブリノーゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマー）の、フィブリノーゲンと共重合する能力の評価について記載する。

ペプチドデンドリマーＮｏ．１３は、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１８）（これは「ａ」ホールに対する結合選択性を有する）を有する２個のフィブリノーゲン結合ペプチド、およびＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）（これは「ｂ」ホールに対する結合選択性を有する）を有する２個のフィブリノーゲン結合ペプチドを含むキメラ４分岐ペプチドデンドリマーである。非キメラペプチドデンドリマーＮｏ．１１および１２は、それぞれ、４および５アームペプチドデンドリマーである。これらのデンドリマーのそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１８）を有する。ペプチドデンドリマーＮｏ．１１、１２、および１３のそれぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、分岐コアに対しそのカルボキシ末端で結合している。

実施例１１と同じ方法を使って、０．００５〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲のそれぞれのデンドリマーに対し、デンドリマーのフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１７は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。

結果は、キメラデンドリマーを使った凝固速度は、０．３ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で、非キメラデンドリマーよりも遅かったことを示している。しかし、図１８は、異なるデンドリマーを使って得られたヒドロゲルの写真を示す。ゲルは、使用したペプチドデンドリマーの番号（１１、１２、および１３）で標識され、「Ｐ」は、いくつかのフィブリノーゲン結合ペプチドがヒト血清アルブミンに結合されている生成物を使って形成したヒドロゲルの標識である。キメラデンドリマーにより形成したヒドロゲルは、デンドリマーＮｏ．１１および１２（３ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲン、またはより高濃度のフィブリノーゲン）を使って形成されたヒドロゲルに比べて、より緻密で、より少ない流体を含んでいた。したがって、キメラデンドリマーを使った場合、凝固時間はより遅いが、このデンドリマーを使って形成されたヒドロゲルはより緻密であった。

実施例１５：ペプチドデンドリマーおよびペプチド複合体の混合物のフィブリノーゲンと共重合する能力
配列ＧＰＲＰ−（配列番号５）のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの「ａ」ホールに強力におよび選択的に結合する（Ｌａｕｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９７８ ＰＮＡＳ ７Ｓ）。ペプチド複合体Ｎｏ．１は、この配列を有する２個の、それぞれリジン残基に結合したフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。第１のペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのカルボキシ末端に結合され、第２のペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのアミノ末端に結合される。第２のペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。

配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１５）のフィブリノーゲン結合ペプチドは、フィブリノーゲンの「ｂ」ホールに強力におよび選択的に結合する（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ａｎｄ Ｐａｎｄｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６，４５，２６５７−２６６７）。ペプチド複合体Ｎｏ．２は、リジン残基へのリンカーによりそのカルボキシ末端に結合した、この配列を有する第１のフィブリノーゲン結合ペプチドを含む。リバース配列（ＹＰＲＨＧ（配列番号１９））を有する第２のフィブリノーゲン結合ペプチドは、リジン残基へのリンカーによりそのアミノ末端に結合される。第２のペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含む。

リンカーは、ペプチドが相互に離れて伸長するのを可能にする。

ペプチド複合体Ｎｏ．１または２（２ｍｇ／ｍｌ）をペプチドデンドリマーＮｏ．３または４、およびフィブリノーゲンと混合し、実施例１１での記載と同じ方法を使って、０．０２５〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲のそれぞれのデンドリマーの濃度に対し、その混合物のフィブリノーゲンと共重合する能力を評価した。図１５は、それぞれの異なるデンドリマーの濃度増加に対し得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。

驚くべきことに、結果は、ペプチド複合体Ｎｏ．２（すなわち、Ｂ−ノブペプチドを有する）およびデンドリマーペプチドを含む混合物のみが、活性が相乗的で、増加したが、ペプチド複合体Ｎｏ．１（Ａ−ノブペプチド）は、ペプチド複合体Ｎｏ．２またはペプチドデンドリマーに添加した場合、活性ではなかったことを示している。

実施例１６：ヒト血漿中でペプチドデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力
ヒト血漿中で、いくつかの異なるペプチドデンドリマー（Ｎｏ．４、５、８、９、１０、１１、１２、１３）のフィブリノーゲンを重合する能力を試験した。

３０μＬのそれぞれのデンドリマー（０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で）を３７℃で１００μＬのヒト血漿に加え、Ｓｉｇｍａ Ａｍｅｌｕｎｇ ＫＣ４ Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使ってフィブリノーゲンの重合を測定した。

それぞれのデンドリマーに対する凝固時間を図２０に示し、また、ペプチドデンドリマーＮｏ．１０、１１、４、１２および１３がヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合でき、デンドリマーＮｏ．１２が特に効果的であった（１秒未満の凝固時間）ことを示す。しかし、ペプチドデンドリマーＮｏ．５、８および９は、ヒト血漿中でフィブリノーゲンを重合できなかった。

実施例１２：すぐに使えるペプチドデンドリマー配合物に対する殺菌の効果
この実施例は、ガンマ線照射の、水和ゼラチンを含むすぐに使えるペースト剤としてのペプチドデンドリマーの止血活性に与えるガンマ線照射の効果について記載している。

ペプチドデンドリマーＮｏ．１２または１３の２ｍｌの溶液を、ＳＵＲＧＩＦＬＯ Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ（水和流動性ゼラチンマトリックス）と混合し、それぞれのペプチドのペースト剤を形成した。それぞれのペースト剤を、３０ｋＧｙの線量の^６０Ｃｏガンマ線による照射により無菌化し、その後室温で貯蔵した。２および４週間の貯蔵後、無菌化ペースト剤試料を試験に使用した。

貯蔵後、１０ｍＭのヘペス緩衝液を使って、それぞれのペースト剤からペプチドデンドリマーを抽出した。３０μＬのそれぞれ抽出物（約０．２５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度）を３ｍｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲン１００μＬに加え、Ｓｉｇｍａ Ａｍｅｌｕｎｇ ＫＣ４ Ｄｅｌｔａ凝固分析装置を使って、３７℃でそれぞれのデンドリマーのフィブリノーゲンを重合する能力（「凝固」活性）を測定した。非照射対照試料の重合活性も測定した。結果を下表にまとめている。

結果は、本発明の、すぐに使えるペースト剤として配合された水和ゼラチンを含むペプチドデンドリマーは、照射による滅菌後、フィブリノーゲンを重合する能力を保持していることを示している。

Claims (62)

1. 複数のフィブリノーゲン結合ペプチドに共有結合で固定化された酸化セルロース基材を含む止血材料。
2. それぞれのペプチドが、前記基材のカルボニル基を介して前記基材に固定化される、請求項１に記載の材料。
3. それぞれのペプチドが、スペーサーを介して前記基材に固定化される、請求項１または請求項２に記載の材料。
4. 前記スペーサーが、アミド結合を介して前記ペプチドに共有結合で連結される、請求項３に記載の材料。
5. 前記スペーサーが、アミド結合を介して前記基材に共有結合で連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の材料。
6. 前記スペーサーが、ペプチドスペーサーを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の材料。
7. 前記スペーサーが、非ペプチドスペーサーを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載の材料。
8. 非ペプチドスペーサーが直鎖を含み、好ましくは、前記非ペプチドスペーサーが、基−（ＣＨ_２）_ａ−を含み、式中、ａは、１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である、請求項７に記載の材料。
9. それぞれのペプチドが、前記ペプチドのＣ末端を介して前記基材に固定化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の材料。
10. 下記の構造：
    

    

    を含み、式中、
    

    

    はフィブリノーゲン結合ペプチドである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の材料。
11. それぞれのペプチドが、前記ペプチドのＮ末端を介して前記基材に固定化される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の材料。
12. 下記の構造：
    

    

    を含み、式中、
    

    

    はフィブリノーゲン結合ペプチドである、請求項１〜８、または１１のいずれか１項に記載の材料。
13. それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドは、配列Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の材料。
14. それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが、４〜６０残基の長さである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の材料。
15. 前記止血材料が、創傷包帯材の形態である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の材料。
16. 複数のフィブリノーゲン結合ペプチドを酸化セルロース基材に共有結合で固定化することを含む止血材料の作製方法。
17. 複数の部分であって、それぞれの部分がフィブリノーゲン結合ペプチドおよびカルボキシル反応性基の形の第１の反応性基を含む複数の部分を用意すること、
    カルボキシル基の形の複数の第２の反応性基を含む酸化セルロースを用意すること、および
    前記第１の反応性基と前記第２の反応性基とを反応させて、それぞれのペプチドを前記基材に共有結合で固定化すること
    を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１の反応性基が、アミノ基である、請求項１７に記載の方法。
19. それぞれの部分が、第１の反応性基を与える非ペプチド部を含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
20. それぞれの部分の前記非ペプチド部が、前記ペプチドのＣ末端を介してα−カルボニル基に共有結合で連結される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記非ペプチド部が、アミド結合を介して前記ペプチドに共有結合で連結される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. それぞれの部分の前記非ペプチド部が、式−（ＣＨ_２）_ａ−の直鎖基を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. それぞれの部分が、下記の構造：
    

    

    を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５、または２〜４であり、
    

    

    はフィブリノーゲン結合ペプチドである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. それぞれの部分が、前記第１の反応性基のみが前記第２の反応性基と反応できるように、１つまたは複数の保護基により保護されている、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記基材が、前記基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させて前記基材上にスペーサーを形成することにより修飾されており、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させて前記基材上にスペーサーを形成することにより前記基材を修飾することを含み、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. それぞれの修飾基が、カルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である第１の反応性基、およびカルボキシル基である第２の反応性基を有し、前記第１の反応性基が、前記基材上のカルボキシル基と反応してアミド結合を形成できる、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
28. 前記修飾基が、ペプチドを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 複数の部分であって、それぞれの部分がフィブリノーゲン結合ペプチドおよび第１の反応性基を含む、複数の部分を用意すること、
    複数の第２の反応性基を含む修飾基材であって、前記第２の反応性基が前記酸化セルロースのカルボキシル基を修飾することにより形成されている修飾基材を用意すること、および
    前記第１の反応性基と前記第２の反応性基とを反応させること、
    を含む、請求項１６に記載の方法。
30. 前記第１の反応性基が、カルボキシル基、好ましくは前記ペプチドのＣ末端のカルボキシル基である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記第２の反応性基が、カルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
32. 前記基材上のカルボキシル基が、前記カルボキシル基と修飾基とを反応させて、好ましくは、前記基材上にスペーサーを形成することにより修飾されており、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記カルボキシル基と修飾基とを反応させて、好ましくは、前記基材上にスペーサーを形成することにより前記基材上のカルボキシル基を修飾することを含み、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. それぞれの修飾基が、第１のカルボキシル反応性基および第２のカルボキシル反応性基を含み、前記第１と第２のカルボキシル反応性基が、好ましくはアミノ基である、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
35. それぞれの修飾基が、下記の構造：
    Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ａ−ＮＨ_２
    を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０または１〜６である、請求項３４に記載の方法。
36. それぞれのスペーサーが、アミド結合により前記基材に共有結合で連結されている、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記修飾基材が、下記の構造：
    

    

    を含む、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
38. それぞれのフィブリノーゲン結合ペプチドが、前記配列Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ、Ｈｉｓ）−Ａｒｇ−Ｘａａ（配列番号１）を含み、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｐｒｏ／Ｈｉｓはプロリンまたはヒスチジンがその位置に存在することを意味する、請求項１６〜３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 請求項１〜１５のいずれか１項に記載の止血剤を、創傷へ使用することを含む、出血を制御する方法。
40. 基材にペプチドを共有結合で固定化する方法であって、
    ペプチドおよび前記ペプチドのＣ末端を介して連結された、カルボキシル反応性基の形の第１の反応性基を含む部分を用意すること、
    カルボキシル基の形の第２の反応性基を含む基材を用意すること、および
    前記ペプチドがそのＣ末端を介して前記基材に共有結合で固定化されるように、前記第１の反応性基と前記第２の反応性基とを反応させて、それぞれのペプチドを前記基材に共有結合で固定化すること
    を含む、方法。
41. 前記第１の反応性基が、アミノ基である、請求項４０に記載の方法。
42. それぞれの部分が、第１の反応性基を与える非ペプチド部を含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
43. 前記非ペプチド部が、アミド結合を介して前記ペプチドに共有結合で連結される、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記部分の非ペプチド部が、式−（ＣＨ_２）_ａ−直鎖基を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５または２〜４である、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記部分が、下記の構造：
    

    

    を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０、１〜５、または２〜４である、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記基材が、前記基材上のカルボキシル基と修飾基とを反応させて前記基材上にスペーサーを形成することにより修飾されており、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. それぞれの修飾基が、カルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である第１の反応性基、およびカルボキシル基である第２の反応性基を有し、前記第１の反応性基が、前記基材上のカルボキシル基と反応してアミド結合を形成できる、請求項４６に記載の方法。
48. 前記修飾基が、ペプチドを含む、請求項４７に記載の方法。
49. 基材にペプチドを共有結合で固定化する方法であって、
    ペプチドおよび第１の反応性基を含む部分であって、前記第１の反応性基が前記ペプチドのＣ末端のカルボキシル基であるか、または前記第１の反応性基が前記ペプチドのＣ末端を介して連結される部分を用意すること、
    前記基材のカルボキシル基を修飾することにより形成される第２の反応性基を含む修飾基材を用意すること、および
    前記ペプチドがそのＣ末端を介して前記基材に共有結合されるように、前記第１の反応性基と前記第２の反応性基とを反応させて、前記ペプチドを前記基材に共有結合で固定化すること
    を含む、方法。
50. 前記第２の反応性基が、カルボキシル反応性基、好ましくはアミノ基である、請求項４９に記載の方法。
51. 前記基材上のカルボキシル基が、前記カルボキシル基と修飾基とを反応させて、好ましくは、前記基材上にスペーサーを形成することにより修飾されており、前記第２の反応性基が前記スペーサーの末端に配置されている、請求項４９または請求項５０に記載の方法。
52. 前記修飾基が、第１のカルボキシル反応性基および第２のカルボキシル反応性基を含み、前記第１と第２のカルボキシル反応性基が、好ましくはアミノ基である、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記修飾基が、下記の構造：
    Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ａ−ＮＨ_２
    を含み、式中、ａは１〜２０、好ましくは１〜１５、１〜１０または１〜６である、請求項５２に記載の方法。
54. 前記スペーサーが、アミド結合により前記基材に共有結合で連結されている、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記修飾基材が、下記の構造：
    

    

    を含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記ペプチドが、フィブリノーゲン結合ペプチドである、請求項４０〜５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記基材が、酸化セルロースを含む、請求項４０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記基材が、創傷包帯材である、請求項４０〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記部分が、前記第１の反応性基のみが前記第２の反応性基と反応できるように、１つまたは複数の保護基により保護されている、請求項４０〜５８のいずれか１項に記載の方法。
60. ペプチドに共有結合で固定化された酸化セルロース基材であって、前記ペプチドがそのＣ末端を介して共有結合で固定化されている、酸化セルロース基材。
61. 前記添付図面に基づいて、実質的に上記で記載されている通りの材料。
62. 前記添付図面に基づいて、実質的に上記で記載されている通りの方法。

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