KR20160107172A - 출혈 증후군의 경우에서 출혈을 조절하고/거나, 혈소판을 대체할 수 있는 콜라겐-기반 주사가능한 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 길이가 10 ㎛ 미만인 입자 또는 피브릴 및 1종 이상의 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는 주사가능한 제제에 관한 것이다. 입자 또는 피브릴은 혈소판의 부착 및 활성화, 또는 심지어는 그의 응집을 유도하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 상기 제제는 출혈을 치료하는 데 유용하다.

Description

출혈 증후군의 경우에서 출혈을 조절하고/거나, 혈소판을 대체할 수 있는 콜라겐-기반 주사가능한 제제 {COLLAGEN-BASED INJECTABLE PREPARATIONS CAPABLE OF CONTROLLING BLEEDING AND/OR OF SUBSTITUTING FOR PLATELETS IN THE CASE OF HAEMORRHAGE SYNDROMES}
본 발명은 출혈 치료에서 사용하기 위한 콜라겐-기반 주사가능한 제제에 관한 것이다. 주사가능한 제제는 그 스스로 혈소판의 부착 및 활성화, 그 둘 모두, 및 심지어는 그의 응집을 유도할 수 있는, 콜라겐 유래의 단백질 및 펩티드로 이루어진 것이다. 본 발명은 또한 응급 상황 (출혈, 외과 수술)에서 항혈소판 약물로 처리된 환자 내로의 콜라겐 유래의 단백질 및 펩티드의 전신/전신적 경로에 의한 응급 주사에 관한 것이다.
출혈이란 혈액이 정상 혈류 밖으로 유출되는 것으로 정의된다. 이는 단순 출혈로 이루어질 수 있거나, 또는 특정 상황하에서는 특히 중증 외상이 될 수 있으며, 이는 혈압 하강과 관련된 출혈성 쇼크 상태로까지 이르게 될 수 있다.
예컨대, 수술, 외상, 치료, 혈소판 감소증 또는 체질성 또는 기능 결핍 (예컨대, 혈우병)과 같은 다양한 임상적 상황이 출혈 위험을 유도한다 [문헌: Spahn D et al. Critical Care. 2013, 17:R76]. 중증 출혈에서는 응고병증이 관찰된다. 응고병증은 혈소판 및 응고 인자의 소모에 상응한다. 치료가 필수적이며, 출혈 결과는 그에 의존한다. 다양한 치료 전략법이 현재 이어지고 있다.
한 접근법은 신선한 냉동 혈장 (FFP), 패킹된 적혈구 또는 혈소판 기반의 수혈 지지체를 사용하는 것으로 이루어진다. 그럼에도 불구하고, 혈소판 기반의 접근법의 성공은 혈소판 접근성, 그의 짧은 저장 수명 (평균 5일), 저장 조건과 관련된 문제, 특정 유형의 샘플의 오염 위험성, 그의 비용, 및 동종면역법에 기인한 무효능 또는 심지어는 과민증의 위험을 비롯한, 여러 인자에 의해 제약을 받는다.
또 다른 접근법은 응고 인자 농축물, 예컨대, 피브리노겐 농축물 및 프로트롬빈 복합체 농축물 (인자 II, VII, IX 및 X)의 사용에 기반한다. 연구를 통해서도 또한 인자 VIIa (노보세븐(NovoSeven)®)의 사용이 제안되어 왔다. 그러나, 상기 마지막 것의 사용은 혈전증 유도 비율이 높기 때문에 권고되지 않고 있다.
마지막으로, 응급 상황에서 또 다른 접근법은, 강력한 플라스미노겐 활성화 길항제이며, 이로써 항피브린용해제로서 작용하는 트라넥사민산을 사용하는 것으로 이루어진다 [문헌: Fries D. Transfusion. 2013;53:91S-95S].
비록 혈소판 활성화 및 응집이 출혈을 정지시키는 데 있어 중요한 단계이기는 하지만, 현재까지 제안된 접근법들 중 그 어느 것도 출혈성 에피소드 동안 혈소판 활성화 및 응집을 유도하지 못한다. 혈관 손상으로 출혈이 일어났을 때, 1차 지혈로 지칭되는 일련의 단계가 일어난다. 이는 직경이 대략 2-5 ㎛이고, 핵이 없으며, 양면이 볼록한 디스크 형상의 세포인 혈소판을 포함한다. 다양한 활성인자가 이 과정에 참여하여 지혈 응괴의 형성을 유도한다. 부착으로 불리는 제1 단계를 통해 손상 부위에 순환 혈소판이 동원될 수 있다. 이 단계는 빌레브란트 인자(Willebrand factor), 콜라겐, 및 콜라겐 수용체로 불리는 혈소판 수용체 (GpVI 및 α2β1)를 포함한다. 혈소판 활성화로 불리는 제2 단계는 응집 촉진제 (pro-aggregant) 인자의 유리, 및 단백질, 예컨대, P-셀렉틴의 혈소판 표면 상의 발현을 포함한다. 이 단계 다음으로는 응집으로 불리는 단계가 이어지는데, 이는 특히 피브리노겐 및 혈소판 수용체 GpIIb/IIIa, 및 응고 인자를 상기 부위에 고정시킬 수 있고, 이로써 최종적으로는 피브린/혈소판 응괴를 형성하고, 출혈을 정지시킬 수 있는 응고 촉진제 (procoagulant) 인지질의 막 노출을 포함한다.
현재, 지혈 과정 동안 혈소판의 활성화는 응집 촉진제 및 응고 촉진제로 불리는, 두 혈소판 집단의 출현을 유도한다는 것이 잘 확립되어 있다. 후자의 것은 트롬빈 생성 기점에서의 포스파티딜세린의 표면 발현을 특징으로 한다. 이는 초활성화된 혈소판으로 불린다. 그러므로, 본 발명자들은 효능제, 예컨대, 트롬빈 및 콜라겐에 대한 반응으로 상기 혈소판 집단을 생성할 수 있는 각 개체의 능력을 기술하는 혈소판 초활성화 잠재능에 대해 언급한다. 최근 연구를 통해 상기 활성화된 혈소판 집단의 출현을 유도하는 것을 목적으로 하는 임의의 치료학적 요법이 출혈 상황을 치료하는 데 큰 잠재능을 보인다는 것이 제안되고 있다 [문헌: Mazepa M et al. ATVB 2013, 33(8):1747- 52]. 추가로, 그들의 관심사는 수혈된 혈소판의 지혈 효과는 상기 집단에 의존한다는 것을 확인시켜 주는 데이터에 의해 보강된다. 그러나, 현재까지 제안된 접근법은 생리학적 또는 천연 혈소판 활성인자, 예컨대, 콜라겐, 또는 본 발명에서 주장하는 콜라겐 유래의 단백질 및 펩티드의 혈류 내로의 주사에 기반하지 않는다.
출혈을 정지시키는 데 있어 혈소판의 중심적인 역할이 혈소판, 또는 모방 혈소판 (합성 혈소판) 유래의 생성물을 개발하는 것을 목적으로 하는 최근 연구의 기점이 된다. 제안된 접근법들 중에서 세포, 예컨대, 트롬보적혈구 및 트롬보솜으로부터 유래된 생성물에 기반하는 것과, 혈소판 활성화 캐스케이드에 관여하는 단백질로부터 유래된 펩티드로 커버된 마이크로미터 크기의 입자, 예컨대, 피브리노겐으로부터 유래된 펩티드 (RGD 펩티드 또는 도데카펩티드 H12) 기반의 신토사이트 또는 피브로캅스(Fibrocaps)™, 또는 빌레브란트 인자에 결합, 콜라겐에 결합, 및 GpIIb/IIIa에 결합하는 펩티드로 커버된 것을 사용하는 것 사이에는 차이가 있다 [문헌: Lashof -Sullivan M et al. Nanoscale 2013, 5, 10719- 10728]. 빌레브란트 인자에 결합, 콜라겐에 결합, 및 GpIIb/IIIa에 결합하는 펩티드로 커버된 상기 입자에 대한 지혈 효과는 기술된 바 있으며, 이로써 출혈 상황에 적용되는 것이 구상될 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은, 현재는 초고용량 (대략 1 킬로그램당 수십 밀리그램)이 주사되어야 한다는 사실을 고려하지 않고도, 파라미터, 예컨대, 결합 속도 및 각 펩티드에 대한 비율 뿐만 아니라, 일단 주사되고 난 이후의 생성물의 안정성을 관리하고 제한해야 하는 필요성과 함께, 단일 입자 상에 수개의 펩티드를 조합해야 하는 것인, 상기 유형의 생성물의 산업화에 관한 주요한 문제를 제기한다 [문헌: Modery-Pawlowski C et al. Biomaterials 2013:516-541].
그러므로, 이용가능한, 혈류 내로 주사가능한 새로운 출혈 치료 수단이 요구되고 있다. 바람직하게, 이는 산업상 쉽게 제조될 것이며, 저농도로 사용될 수 있다.
집단이 노령화되어 감에 따라, 의사들은 항응고제 및 항혈소판 약물 치료를 받고 있는 환자와 더욱더 빈번하게 직면하게 된다. 비록 이러한 치료법의 일시적 중단으로 된 전략법이 프로그램화된 중재에 대해 잘 정의되어 있기는 하지만 (신규 항혈소판 약물의 경우, 5-7일 중단, 및 신규 항응고제의 경우, 5일 중단), 이는 출혈 상황 (수술 또는 외상, 특히, 두개 외상)에서 환자의 응급 치료를 심각하게 복잡하게 만들 수 있다 [문헌: Bonhomme F et al. Eur J Intern Med . 2014 Mar;25(3):213-20]. 다양한 응급 복귀 전략법이 제안되어 왔지만, 신규 항혈소판 약물의 경우, 대부분 혈소판 수혈로 한정된다 [문헌: Beynon C et al. Crit Care. 2012 Jul 26;16(4) : 228]. 상기의 신규 항혈소판 약물의 작용 모드와 상관없이 출혈 에피소드 동안 혈소판 기능을 회복시킬 수 있는 새로운 주사가능한 지혈 생성물이 요구되고 있다. 콜라겐 의존성 혈소판 활성화 경로가 가장 생리학적이고, 현재까지는 시판 중인 임의의 항혈소판 치료법에 의해 변형되지 않는다는 사실이 이러한 상황하에서의 전신 경로에 의한 콜라겐 유래의 단백질 또는 펩티드의 투여에 관한 관심을 강화시킨다. GPVI의 콜라겐에의, 또는 본 발명의 콜라겐 유래의 단백질 또는 펩티드에의 결합이 혈소판 내에서 강력한 신호를 유도한다는 것이 잘 확립되어 있다.
출혈 치료에 예컨대, 군사 작전의 해외 작전 구역과 같이, 병참학상 제한된 맥락에서 볼 때, 출혈 치료는 특히 수혈 (패킹된 적혈구, 혈장 및 혈소판)을 비롯한, "손상 통제 소생"의 개념에 의해 지배된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 상황은 상기 혈액 생성물, 특히, 혈소판에의 접근이 어렵다는 것을 특징으로 하며, 이는, 전혈을 이용하는 것을 주요 차이로 하는, "원격 손상 통제 소생"이라는 용어에 포함되는 변형된 치료법을 필요로 한다 [문헌: Jenkins DH et al. Shock. 2014 May;41 Suppl 1:3- 12]. 이러한 전략법은 비록 오염의 위험과 관련이 있기는 하지만, 유망하나, 현재는 여전히 군사 영역으로만 한정되어 있는 상태이다 (문헌 [Murdock AD et al. Shock. 2014 May;41 Suppl 1:62-9]).
그러므로, 본 발명은 출혈을 비롯한, 하기의 3가지 상황:
- 혈류내 혈소판을 활성화시킬 수 있는 능력을 필요로 하는, 대량 출혈, 특히, 비압박형인 에피소드 동안;
- 의료 센터로부터 떨어져 있는 곳에서의 수혈 소생 동안 애주번트로서, 특히, 전혈 또는 혈소판의 수혈에 기반한 접근법에 대한 보완책으로서;
- 수술 또는 출혈, 특히 두개내 수술 또는 출혈을 위한, 현재 해독제 없이 시판 중에 있는 신규한 항혈소판 약물 (예컨대, 프라수그렐, 티카그렐로)에 대한 복귀제로서인 것인 상황하에서의 신규한 주사가능한 지혈제로서의 콜라겐 유래의 혈소판-활성화 단백질 또는 펩티드의 정맥내 투여에 관한 관심에 관한 것이다.
본 발명은
- 상기 입자 또는 피브릴 단백질 또는 펩티드가 혈소판의 부착 및 활성화, 또는 심지어 그의 응집을 유도하는, 길이가 10 ㎛ 미만인 입자 또는 피브릴; 및
- 1종 이상의 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제
를 포함하는, 출혈 치료에 사용하기 위한 주사가능한 제제에 관한 것이다.
도 1은 DLS에 의한, 50배만큼 농축시킨 이후의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 단백질 추출물의 입자 크기 측정을 도시한다.
도 2는 2 IU/dL의 최종 농도로 사용된, 정제된 빌레브란트 인자 (Willfactin, LFB)의 2 ㎍/mL의 최종 농도로 사용된, 상이한 크기의 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드에의, 및 10 ㎍/mL로 사용된 I형 콜라겐 [시르콜(SIRCOL) 콜라겐, 양성 대조군]에의 결합에 관하여 ELISA에 의해 수득된 결과를 도시한다.
도 3A는 유세포 분석법에 의해 수득된, 서열 번호 1의 폴리펩티드, 및 I형 콜라겐 (Horm)에 대한 혈소판 표면 상의 P-셀렉틴 발현에 관한 전형적인 프로파일을 나타내는 것이다.
도 3B는 다양한 효능제에 대해 수득된 평균 형광 강도를 나타내는 것이다.
도 4는 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드를 사용하여 수득된 응집 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 다양한 현미경 검사 기법에 의해 수득된, 피브릴 형태의 I형 콜라겐 (Horm)과의 비교로 제시된 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 거대분자 구조를 도시한다.
도 6은 서열 번호 1의 폴리펩티드 및 I형 콜라겐 (Horm)의 마우스 내로의 주사 이후에 샘플링된 혈소판 표면 상의 P-셀렉틴의 발현에 관한 유세포 분석법에 의해 수득된 평균 형광 강도를 나타내는 것이다.
도 7은 유도성 폐 색전증 마우스 모델에서 에피네프린의 존재하에서의 피브릴 형태의 I형 콜라겐 (Horm) 및 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 마우스 내로의 정맥내 주사의 결과를 도시한다. 도 7A는 주사 이후의 마우스의 사망률에 대해 수득된 결과를 도시하고, 도 7B는 시험된 다양한 콜라겐 투여 후 5분 이상 경과하였을 때 주사된, 테크네튬으로 방사성 표지된 알부민의 거대응집체의 생체분포를 도시한다.
도 8은 꼬리로부터의 유도성 출혈이 있는 마우스 모델에서 마우스 내로의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 주사 결과를 도시한다.
서열 설명
서열 번호 1: 혈소판의 부착 및 활성화를 유도할 수 있는 재조합 단백질을 코딩하는 폴리펩티드.
본 발명은
- 혈소판의 부착 및 활성화를 유도하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는, 길이가 10 ㎛ 미만인 입자 또는 피브릴; 및
- 1종 이상의 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는,
출혈 치료에 사용하기 위한 주사가능한 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주사가능한 제제는 혈소판 활성을 자극시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 입자 또는 피브릴은 일단 혈류 내로 주사되고 나면, 혈소판의 부착 및 활성화, 및 혈소판의 응집 또한 유도하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 후자는 또한 혈소판 농축물 또는 전혈의 수혈 동안 혈소판을 미리 활성화 (pre-activate)시키는 애주번트로서 사용될 수 있다.
혈소판의 부착, 활성화, 및 심지어 응집을 유도하는 단백질 또는 펩티드
본 발명의 제제의 제제화에 사용된 단백질 또는 펩티드는 혈소판의 부착 및 활성화, 둘 모두, 또는 혈소판의 응집 또한 유도할 수 있는 능력을 가지고 있다. 상기 2가지 또는 3가지 활성은 하나의, 및 동일한 단백질 또는 펩티드의 특성임을 이해하여야 한다. 상기 단백질 또는 펩티드는 길이가 10 ㎛ 미만인 입자 또는 피브릴 형태이다.
바람직하게, 피브릴의 길이는 9 ㎛, 8 ㎛, 7 ㎛, 6 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 3 ㎛, 2 ㎛, 1 ㎛ 또는 0.5 ㎛ 미만이다. 더욱 바람직하게, 피브릴의 길이는 0.5 내지 9 ㎛, 1 내지 5 ㎛, 또는 2 내지 4 ㎛이다.
이들 단백질 또는 펩티드는 혈소판의 부착을 담당하는 빌레브란트 인자에 결합할 수 있거나, 또는 그를 활성화시킬 수 있고, 혈소판 활성화의 마커인 P 셀렉틴, 또는 포스파티딜세린의 표면 발현을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드는 혈소판이 풍부한 혈장의 또는 전혈의 시험관내 응집을 유도할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드는, 반드시 응고 활성화를 유도할 수 있는 것은 아니면서, 혈소판을 자극시키고, 출혈 정지를 유도할 수 있으며, 이는 혈소판의 표면 상의 포스파티딜세린의 발현, 응고 촉진제로 언급되는 표면의 형성, 및 결과적으로 초래되는 트롬빈의 생성에 의존한다. 이는 제제의 전신 주사 이후에 유도되는 혈전증의 위험을 한정할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 응고 촉진제 혈소판으로 불리는 이러한 활성화된 혈소판 서브집단의 활성화가 발생할 수는 있지만, 이는 고전적 시험에 의해 검출가능한 트롬빈 생성에 필요한 수준보다 낮은 수준으로 발생할 수 있다.
콜라겐으로 불리는 단백질 패밀리는 특정 콜라겐, 주로 I형 및 III형 콜라겐의 서열 중의 순환 빌레브란트 인자에, 및 두 혈소판 수용체, GpVI 및 α2β1에 결합할 수 있는 펩티드 서열의 존재에 기인하여 상기 언급된 3가지 활성을 유도할 수 있는 능력을 가진다. 이는 혈소판의 부착, 그의 활성화, 및 이어서, 그의 응집을 유도한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 단백질은 콜라겐 중에서, 및 특히 I형 및 III형 콜라겐 중에서 선택될 수 있다.
현재까지, 출혈 치료를 위해 콜라겐을 사용하는 것에 관하여 제안된 바는 없었다. 천연 콜라겐 중 오직 피브릴 형태인 것만이 혈소판의 부착, 활성화 및 응집을 유도할 수 있는 것으로 기술되어 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다 [문헌: Clementson K. Thrombosis Research 2012 129 220- 224]. 그러나, 길이가 수 마이크로미터에 이를 수 있는 섬유를 포함하는 상기 피브릴 형태는 혈류 내로의 주사와는 화합성을 띠지 않는다. 본 발명의 특정 형태가 혈류 내로의 주사와 화합성을 띤다.
콜라겐의 특정 형태, 예컨대, 마이크로스피어, 마이크로플로레트(microflorette) 및 덴드리머는 방법, 예컨대, 문헌 [참조: Pires M and Chmielewski J. J. Am. Chem . Soc . 2009 131,2706-2712]; [참조: Przybyla D et al. J. Am. Chem . Soc . 2013, 135,3418-3422]; [참조: Kojima C et al. J. Am. Chem. Soc . 2009 131, 30652-6053]; [참조: Slatter D et al. Peptides 2012 36, 86-93]; [참조: Kar et al. Journal of Biological Chemistry 2006 vol 281, no.44 33283-33290]에 기술되어 있는 방법에 의해 수득할 수 있다. 이러한 특정 형태를 수득하기 위해, 특히 금속 또는 염의 사용, 펩티드 서열 중 시스테인 (이황화 브릿지) 또는 방향족 아미노산의 부가, 또는 상이한 성질 (극성, 무극성, 산성, 염기성)을 가지는 아미노산 사이의 비율에 기초하여 다양한 접근법이 사용될 수 있다.
콜라겐과 달리, 본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 단백질은 재조합 단백질, 예컨대, 국제 특허 출원 WO 2010/034718에 기술되어 있는 것일 수 있다. 콜라겐 유래의 상기 재조합 단백질은 천연 콜라겐과 등가인 방식으로 혈소판 응집을 유도할 수 있다. 본 발명에서 유용하고, 콜라겐으로부터 유래된 것인 다른 단백질은 유럽 특허 출원 EP 2013/071816에 기술되어 있는 것이다. 이들 단백질은 손상된 혈관 부위에서의 혈소판의 초기의 부착에 연루된 결합제인 빌레브란트 인자에 결합할 수 있다.
이러한 방식으로, 본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 단백질은 천연 콜라겐, 에컨대, I형 및 III형 콜라겐 또는 재조합 단백질 중에서 선택되고, 상기 재조합 단백질의 서열은
- 서열 번호 1의 폴리펩티드;
- 2회 이상 반복되는 GXY 트리플렛의 반복으로부터 형성되는 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 여기서 G는 글리신을 의미하고, X 및 Y는 임의의 아미노산을 의미하는 것인, 폴리펩티드;
- 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드; 또는
- 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드
로부터 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 재조합 단백질로부터 선택될 수 있다.
추가로, 매 3개의 아미노산마다 하나의 글리신을 가지는 서열을 포함하는 천연 또는 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 콜라겐 유도체로서 간주될 수 있다 (문헌 [An B et al. Frontiers in chemistry. 2014 June;2 article 40]). 쇄의 이러한 1차 구조는 아미노산 (예컨대, 시스테인) 존재하의 콜라겐의 것, 또는 다량체 구조 (예컨대, MBL [만노스 결합 렉틴] 단백질의 삼량체화 도메인)를 형성할 수 있는 펩티드 서열과 유사한 펩티드 쇄의 입체구조를 유도한다.
서열 번호 1의 1번 내지 24번 위치의 펩티드는 숙주 세포에 의한 재조합 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드에 상응한다. 이러한 신호 펩티드는 존재하지 않을 수 있거나, 또는 당업자에게 널리 공지된 기법에 따라 또 다른 신호 펩티드로 치환될 수 있다. 당업자는 각종의 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서의 폴리펩티드의 발현 및 분비에 적절한 동종성 또는 이종성 신호 펩티드를 선택할 수 있을 것이다. 바람직하게, 폴리펩티드는 진핵 세포 또는 유기체에서, 및 특히, 포유동물 세포에서 제조된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 그의 세포외 매질 내로의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 신호 펩티드의 절단 후, 성숙한 폴리펩티드가 수득된다.
특정 실시양태에서, 재조합 단백질의 서열은 하기 펩티드 서열:
- GX1X2GER로서, 여기서, X1 및 X2는 독립적으로 A, R, N, D, Q, E, G, H, I, K, M, F, P, S, T, W, Y, V 및 O로부터 선택되는 아미노산을 나타내는 것인 것;
- (GPX3)n로서, 여기서, n은 4 내지 10이고, X3은 P 또는 O를 나타내는 것인 것; 및
- GPRGQX4GVMGFX5로서, 여기서, X4 및 X5는 독립적으로 P 또는 O를 나타내는 것인 것을 함유하는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
P는 프롤린을 의미하고, O는 히드록시프롤린을 의미한다.
특정 실시양태에서, 재조합 단백질의 서열은 하기 펩티드 서열:
- GAPGER,
- KPGEPGPK,
- (GPP)n로서, 여기서, n은 4 내지 10인 것,
- RGD를 함유하는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
이러한 방식으로, 재조합 단백질은
(a) 4개의 GPO 트리플렛으로 이루어진 1개 이상의 반복부를 가지는 펩티드 서열;
(b) 각종 혈소판 수용체에 결합하는 결합 활성을 가지고, 콜라겐의 천연 서열 중에 존재하는 것을 가지는 펩티드 서열; 및
(c) 서열 (a)와 (b) 사이에 GXY 트리플렛의 반복으로부터 형성된 결합 서열로서, 여기서, G는 글리신을 의미하고, X 및 Y는 임의의 아미노산을 의미하는 것인 결합 서열을 포함한다.
본 발명의 제제의 제제화에서 사용되는 재조합 단백질은 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 서열을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 번호 1의 폴리펩티드와 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 이상, 및 바람직하게, 99% 이상의 동일성을 나타낸다. 동일성(%)이란 동일한 아미노산 (두 서열 사이의 불변인 또는 변함이 없는 아미노산)의 비율을 의미한다. 이들 폴리펩티드는 서열 번호 1의 폴리펩티드와 관련하여 1개 이상의 아미노산의 결실, 부가 또는 치환을 나타낼 수 있다.
폴리펩티드 사이의 동일성(%) 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 벡터(Vector) NTi 9.1.0, 정렬 프로그램 얼라인X (AlignX Clustal W algorithm, Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com)가 사용될 수 있다. 바람직하게, 디폴트 파라미터가 사용된다.
재조합 단백질은 당업자에게 널리 공지된 방법, 특히, WO 2010/034718 및 EP 2013/071816에 기술되어 있는 것에 의해서 박테리아 및 포유동물 세포에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질은 또한 특히 3 내지 10회 반복되는 GPO 서열로 이루어진 서열 중의 존재를 통해 손상된 혈관 부위에 존재하는 콜라겐에 결합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 단백질은 페길화 (PEGylated) 또는 파실화(PASylated) (아미노산 프롤린, 알라닌 및 세린의 n회 부가)된 것일 수 있다.
본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 펩티드는 상기 기술된 것일 수 있다. 이러한 방식으로, 펩티드는
- 서열 번호 1의 폴리펩티드;
- 2회 이상 반복되는 GXY 트리플렛의 반복으로부터 형성되는 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 여기서 G는 글리신을 의미하고, X 및 Y는 임의의 아미노산을 의미하는 것인, 폴리펩티드;
- 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드; 또는
- 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드로부터 선택될 수 있다.
폴리펩티드는 천연 환경으로부터 단리 또는 정제된다. 폴리펩티드는 다양한 공정 수단에 의해 제조될 수 있다. 상기 공정은 특히 적절한 숙주 세포에 의한 재조합 폴리펩티드의 제조 및 그의 후속 정제, 화학적 합성에 의한 제조, 또는 마지막으로 이러한 상이한 접근법의 조합이다. 이러한 다양한 제조 공정은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직하게, 폴리펩티드는 원핵 또는 진핵 재조합 세포에 의해 제조된다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드는 박테리아에서, 또는 포유동물 세포에서 제조될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화된 것이다. 서열 번호 1의 폴리펩티드는 특히 102번 및 141번 위치에 (GXY 트리플렛의 3번 위치에) 존재하는 리신 아미노산에 O-글리코실화 부위를 가진다. 바람직한 실시양태에서, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 93번 위치의 아스파라긴 잔기는 글리코실화된 것이다.
피브릴 형태의 단백질
본 발명에 따른 주사가능한 제제의 제제화에 사용되는 단백질은 길이가 10 ㎛ 미만인 피브릴 형태로 구조화될 수 있다. 피브릴 형태는 길이가 10 ㎛ 초과이고, 길이가 수 마이크로미터에 이를 수 있는 섬유를 포함하고, 혈류 내로의 주사와는 화합성을 띠지 않는다.
피브릴의 길이는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해, 특히, 현미경 검사, 예컨대, 원자력 현미경 검사 (AFM)에 의해 측정될 수 있다.
입자
본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 입자는 혈소판의 부착 및 활성화, 또는 그의 응집을 유도하는 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 단백질 및 펩티드는 상기 기술된 것과 같다.
특정 실시양태에서, 입자는 단백질 또는 펩티드의 지지체에의 부착에 의해 수득될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 제제의 제제화에 사용되는 입자는 혈소판의 부착, 활성화 또는 응집을 유도하는 단백질 또는 펩티드의 부착이 그 위에서 이루어지는 지지체를 포함한다.
지지체는 유기 또는 무기 미세입자일 수 있다. 미세입자의 예로는 알부민, 지질, 금속, 예컨대, 금, 티타늄, 철, 은, 또는 그의 산화물, 그래핀, 실리카, 또는 중합체를 포함한다.
단백질 또는 펩티드의 지지체 상의 부착은 입자 표면 상에 존재하는 작용기를 통해, 또는 이작용성 (bifunctional) 스페이서 또는 이작용성 중합체를 통해 공유 결합에 의해 이루어질 수 있다. 이작용성 스페이서 또는 이작용성 중합체를 통해 미세입자의 관능화가 이루어질 수 있다. 한쪽 단부에는 그 자체를 미세입자의 표면에 공유적으로 접합 (graft)시킬 수 있는 작용기가 존재하고, 나머지 다른 한쪽 단부에는 그 자체를 단백질 또는 펩티드에 공유적으로 접합시킬 수 있는 작용기가 존재한다.
바람직하게, 이작용성 중합체는 이종이작용성 중합체이다. 2개의 상이한 작용기가 존재함에 따라 원치않는 커플링, 예컨대, 중합체 양쪽 두 단부 모두의 미세입자에의 부착이 제한될 수 있다. 바람직하게, 중합체의 말단 작용기 사이의 친화도는 또한 상기 두 단부 사이의 상호작용에 의한 중합체의 자기 축합을 제한할 정도로 약하다.
미세입자를 관능화시키는 데 다양한 유형의 이작용성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 이작용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA), 폴리(카프로락톤) (PLCL), 폴리(락트산) (PLA), 글리콜리드 중합체 (PGA), 키토산, 덱스트란 등으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 중합체는 이작용성 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게, 이종이작용성이다. 중합체의 분자 질량은 일반적으로 500 Da 내지 10,000 Da, 바람직하게, 2,000-8,000 Da, 더욱 바람직하게, 약 5,000 Da으로 다양하다. 중합체의 분자 질량은 전형적으로, 단백질 또는 펩티드가 이작용성 중합체를 통해 미세입자에 부착될 때, 중합체 쇄는 단백질 또는 펩티드의 특성이 미세입자의 존재에 의해 영향을 받지 않게 충분한 길이를 가지도록 선택된다.
특정 실시양태에서, 입자는 단백질 또는 펩티드의 자기 조립에 의해 수득될 수 있다. 상기 실시양태에서, 입자는 지지체를 포함하지 않고, 오직 단백질 또는 펩티드로만 이루어진다. 자기 조립은 상이한 방법에 의해, 에컨대, 코아세르베이션에 의해, 또는 응집에 의해, 예를 들어, 침전, 농축, 금속 또는 염 첨가, 또는 온도 변동에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 입자는 동적 광산란 (DLS)에 의해 측정된 바, 0.05 ㎛ 내지 6 ㎛, 또는 1 ㎛ 내지 5 ㎛, 또는 2 ㎛ 내지 4 ㎛ 범위의 평균 직경을 가질 수 있다. 이롭게는, 본 발명의 입자의 평균 직경은 0.02 ㎛ 내지 0.05 ㎛, 예를 들어, 0.025 ㎛ 내지 0.045 ㎛, 또는 예를 들어, 0.035 ㎛일 수 있다.
입자가 그의 서열이
- 서열 번호 1의 폴리펩티드;
- 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드; 또는
- 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 것인 재조합 단백질을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 때, 및
입자가 DLS에 의해 측정된 바, 2 ㎛ 초과인 평균 직경을 나타낼 때, 이는 혈소판의 부착, 활성화 및 응집을 유도할 수 있다. 이러한 효과는 또한 그의 평균 직경이 2 ㎛ 미만, 예를 들어 0.02 ㎛ 내지 1 ㎛, 0.05 ㎛ 내지 0.5 ㎛, 또는 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛인 것에 대해 관찰된다.
제약상 허용되는 비히클 또는 부형제
본 발명에 따른 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제, 즉, 개체에게로의 그의 투여가 유의적인 부작용을 동반하지 않는 비히클 또는 부형제는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
제약상 허용되는 부형제 또는 비히클의 예로는 용매, 활택제, 현탁제, 가용화제, 안정제, 보존제, 완충제, 항산화제 및 킬레이트제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 주사가능한 제제는 당업자에게 널리 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 주사가능한 제제는 출혈 증후군의 경우에서 혈소판 활성화에 의해 출혈을 조절하고/거나, 혈소판을 대체할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 유효량의, 상기 정의된 제제를 개체의 혈류 내로 주사함으로써 투여하는 것을 포함하는 출혈 치료 방법에 관한 것이다.
그러므로, 본 발명과 관련하여, "주사"란 본 발명의 생성물의 환자에게로의 전신 투여 (이는 종종 일반적 투여로도 불림)와 같은 의미를 가진다는 것은 명백하다.
마지막으로, 본 발명은 출혈 치료용 의약품 제조를 위한 상기 정의된 제제의 용도에 관한 것이다.
실시예
콜라겐 제조 및 입자로의 자기 조립 (DLS에 의한 입자의 크기 측정 방법)
형질감염 이전에 3주간 CHO-S 세포 (nvitrogen)를 미리 배양하였다. 세포를 5% CO2하의 37℃ 인큐베이터 중 125 mL 진탕 플라스크 중에서 교반시키면서 (80 rpm) 4 mM L-글루타민 (Lonza) 및 1X 프로HT (proHT) (Lonza)로 보충된, CHO 세포 (Power-CHO, EXCEL 302, proCHO4, proCHO5 etc.)에 특이적인 배지 중에서 유지시켰다. 형질감염 이틀 전, 배지를 완전히 교체함으로써 세포를 5x105개의 생존가능한 세포/mL로 시딩하고, 125 mL 진탕 플라스크 중에서 CHO 세포에 특이적인 12.5 mL의 보충된 배지 중에서 배양하였다.
형질감염 당일, 5x106개의 생존가능한 세포를 원심분리 (1,000 g로 5 분)에 의해 분리한 후, 4 mM L-글루타민 (Lonza) 및 1X 프로HT (Lonza)로 보충된 5 mL의 RPMI 배지 (Lonza)에 용해시켰다. 이어서, 4 mL의 현탁액을 9 mL 보충된 RPMI 배지 (진탕 플라스크 1개당 1x106개의 생존가능한 세포)를 함유하는 25 mL 진탕 플라스크 4개 (플라스크 1개당 1 mL씩)로 분배하였다. 이어서, 앞서 기술된 서열 번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 벡터로 CHO-S 세포를 형질감염시켰다. 양성 형질감염 대조군은 세포를 pMAX-GFP 벡터로 형질감염시킴으로써 수행하고, 2개의 음성 형질감염 대조군은 세포를, 저항성에 대한 유전자를 보유하지 않는 벡터로 형질감염시킴으로써, 및 어떤 처리도 수행하지 않음으로써 수행하였다. 형질감염제 펙투린(Fecturine) (PolyPlus Transfection) 또는 임의의 다른 적절한 형질감염제를 사용하여, 및 제품의 최적화된 상업적 프로토콜에 따라 형질감염을 수행하였다. 펙투린의 경우, 선택된 형질감염 조건은 106개의 생존가능한 세포의 경우, 12 ㎕ 펙투린에 대하여 6 ㎍ DNA (DNA/형질감염제 비 = ½)였다. 당업자는 일과성 형질감염을 위해, 또는 안정적인 형질감염을 위해 가장 적절한 형질감염제를 정의하는 방법에 관하여 알고 있을 것이다. 형질감염 모드가 일과성인지 또는 안정적인지 여부와 상관없이, 세포를 5% CO2 및 37℃에서 정치 조건하의 형질감염 복합체의 존재하에서 인큐베이션시켰다. 형질감염 후 4시간이 경과하였을 때, CHO 세포에 특이적인 보충된 배지 중에 세포를 재현탁시키고, 교반 조건으로 복귀시켰다. 형질감염 후 24시간이 경과하였을 때, 유세포 분석법에 의해 분취량의 양성 및 음성 형질감염 대조군에 대하여 형질감염 효율을 측정하였다.
일과성 모드로 서열 번호 1의 폴리펩티드를 제조하는 경우, 상청액의 초기 샘플을 D+3 (D0은 형질감염 당일에 상응)에 채취한 후, D+5에 배양을 중단하였다. 3,000 g로 10분 동안 원심분리함으로써 세포 및 세포 잔해를 제거한 후, 세포에 의해 분비된 서열 번호 1의 폴리펩티드를 함유하는 배양 상청액을 회수한 후, -20℃에서 냉동시켰다.
안정적인 모드로 서열 번호 1의 폴리펩티드를 제조하는 경우, 형질감염 후 48시간 경과하였을 때, 세포를 계수하였다. 이어서, 세포 모두를 1,000 g로 5분 동안 원심분리한 후, CHO 세포에 특이적인 보충된 배지 + 700 ㎍/mL 제네티신 (G418 Merck) (선택압) 중에 3x105개의 생존가능한 세포/mL로 시딩하였다. 이어서, 세포를 주 3회에 걸쳐 125 mL 진탕 플라스크 중에서 최종 12.5 mL의 완전 배지 + 700 ㎍/mL G418에 모든 세포를 시딩함으로써 유지시켰다. 선택압하에서 배양 첫 주에 세포 농도 감소 및/또는 세포 생존가능성을 관찰하였다. 세포 생존가능성은 선택압하에서 2-3주 후 다시 증가하였지만, 오직 서열 번호 1의 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 벡터, 또는 공 벡터로 형질감염된 세포의 경우에만 그러하였다. 형질감염되지 않은 세포의 생존가능성은 0이 될 때까지 계속해서 하락하였다. 일단 배양물의 생존가능성이 95% 초과에 도달하고 나면, (10개의 앰플에서) 5x106개의 생존가능한 세포/앰플로 냉동 보존을 수행하였다. 세포를 CHO 세포에 특이적인 보충된 배지 + 10% DMSO 중에서 냉동시켰다.
서열 번호 1의 폴리펩티드를 제조하기 위해, 서열 번호 1의 폴리펩티드를 제조하도록 유전적으로 변형된 세포를 해동시키고, 적절한 배지 중에 유지시켰다. 세포를 12.5 mL의 최종 배지 중에 놓고, 5% CO2 및 습도 40% 내지 80%로 조절된, 80 rpm의 쿠너 랩썸(Kuehner LabTherm)® 교반기 중 125 mL 진탕 플라스크에 놓았다. 세포를 1 또는 2주 동안 3x105개의 생존가능한 세포/mL로 유지시켰다. 이어서, 제조를 수행하는 데 필요한 양을 가지도록 하기 위해 세포를 증폭시켰다. 증폭은 모든 세포를 생존가능한 농도로 유지시키기 위해 매 배지 교체시마다 더 많은 부피로 세포를 유지시키는 것으로 이루어졌다.
일단 제조에 필요한 양으로 세포를 수득하고 나면, 제조를 개시할 수 있었다. 세포를 3x105개의 생존가능한 세포/mL로 시딩하였다. 각종 장치: 쿠너 랩썸® 교반기, 쿨티백(Cultibag) RM 20/50® (Sartorius), 셀레디(CellReady)® (Merck Millipore), 바이오번들(BioBundle)® (Applikon) 및 같거나, 또는 그보다 큰 규모의 다른 등가 장치에 배치된 진탕 플라스크 중에서 제조를 수행할 수 있었다. 배양 조건에 따라 5일 이상, 최대 10일 동안 계대배양을 수행하였다. 제조 파라미터, 세포 농도, 및 세포 생존가능성을 매일 모니터링하였다. 제조하는 동안, 성분, 예컨대, 아미노산, 비타민, 글루코스, 또는 제조를 위해 또는 세포를 위해 관심의 대상이 되는 임의의 다른 요소를 첨가할 수 있었다. 이러한 경우, 배양은 "유가 (fed-batch)" 또는 "반연속" 배양이었으며, 이를 통해서 세포를 최대 21일 동안 배양할 수 있었다. 배양하는 동안 어떤 화합물도 첨가하지 않은 경우, 이는 "회분 (batch)" 또는 "불연속" 배양이었다.
서열 번호 1의 폴리펩티드의 정제는 예를 들어, 정제 표지, 예컨대, 그 서열 중에 존재하는 태그-6(His)를 사용하여 수행할 수 있었다. 이러한 방식으로, 원심분리 또는 심층 여과 (Merck-Millipore POD Millistack+)® 또는 임의의 다른 유형의 장치 지지체) 또는 컷 오프 0.2 ㎛인 막 상에서의 접선 여과 (tangential filtration)에 의해 서열 번호 1의 폴리펩티드를 함유하는 배지 중에 존재하는 세포 및 세포 잔해를 제거하였다. 이렇게 수득한 상청액을 금속, 예컨대, 니켈, 코발트, 아연 또는 구리와 킬레이팅된 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 서열 번호 1의 폴리펩티드의 부착을 촉진시키기 위해, 0-50 mM 이미다졸, 0-500 mM NaCl, 5-20 mM (Na2HPO4·2H2O) 및 5-20 mM (NaH2PO4·H2O)을 함유하는 완충제 용액을 상청액에 첨가하고, pH 7 내지 8로 조정하였다. 두 완충제 용액 [완충제 1:500 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4·2H2O) 및 10 mM (NaH2PO4·H2O); 완충제 2:20 mM 이미다졸, 500 mM NaCl, 10 mM (Na2HPO4·2H2O) 및 10 mM (NaH2PO4·H2O)]의 혼합물을 사용하여, 또는 등용매 방식으로 50-500 mM 이미다졸, 0-500 mM NaCl, 5-10 mM (Na2HPO4·2H2O) 및 5-10 mM (NaH2PO4·H2O)을 함유하는 완충제 용액을 사용하여 구배에 의해 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용리를 수행하였다. 서열 번호 1의 폴리펩티드의 순도를 개선시키기 위하여 다른 정제 단계를 추가할 수 있다. 이러한 단계는 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 또는 임의의 다른 유형의 크로마토그래피일 수 있다.
관심의 대상이 되는 용리 분획을 원 고유의 조건하에 전기영동 겔 상에서 이동할 수 있도록 배치하고, 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색한 후, 그의 프로파일에 따라 수집하고, 물 또는 포스페이트 완충제 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 보관에 적절한 임의의 다른 완충제 용액 중에서 투석시켰다. 시르콜® 키트 (TebuBio)에 의해 제조사의 설명서에 따라서, 또는 브래드포드(Bradford) 시험 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드의 정량화에 적절한 임의의 다른 시험에 의해 폴리펩티드의 농도를 측정하였다.
서열 번호 1의 폴리펩티드를 한외여과에 의해 그의 초기 부피와 비교하여 수배로 (50배) 농축시켰고, 이로써, 단백질 농도는 서열 번호 1의 폴리펩티드의 자기 조립 및 입자 형성을 유도하는 데 충분한 농도에 도달할 수 있었다. 이러한 방식으로 4℃ 및 4,000 rpm으로 원심분리를 반복 수행함으로써 컷 오프 10,000 Da인 한외여과 칼럼 (Vivaspin 4, 사르토리우스) 상에서 서열 번호 1의 폴리펩티드를 함유하는 단백질 추축물을 농축시켰다. 일단 용액을 농축시키고 나면, 이렇게 형성된 입자의 크기를 말번 제타사이저(Malvern Zetasizer) 나노 장치를 사용하여 동적 광산란 (DLS) 기법에 의해 측정하였다. DLS 측정은 액체 중 현탁액 중의 입자의 크기를 측정할 수 있는 비파괴 분광 분석 기법으로서; 이는 특히 단백질, 예컨대, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 자기 조립 또는 응집을 측정하는 데 적절하다.
도 1은 DLS에 의한, 50배만큼 농축시킨 이후의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 단백질 추출물의 입자 크기 측정에 대한 특징적인 결과를 도시한다. 용액 중에 존재하는 상이한 크기의 입자에 상응하는 일련의 피크가 관찰되었다. 3개의 피크가 두드러졌는데: 이는 입자 크기 1.25 ㎛, 3 ㎛ 및 5.5 ㎛에 상응하는 것이었다. 서열 번호 1의 폴리펩티드의 생물학적 활성을, 상기와 같이 생성된 입자의 크기와 연관시키기 위해, 최종 농도 20 mM가 될 때까지 염산을 용액에 첨가하였다. 앞서 측정된 3개의 피크는 소멸되었고, 약 500 nm 및 1.8 ㎛에서 2개의 피크가 출현하였다. 시각적으로, 분획은 "정화됨"에 따라 흐릿한 외관에서부터 반투명 외관으로 변하였다.
입자 크기의 함수로서의 빌레브란트 인자 결합 활성 측정
입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드에 기반한 제제는 빌레브란트 인자에 결합할 수 있는 능력을 가진다. 96 웰 플레이트 (Nunc Maxisorp)에서 ELISA 기법에 의해 서열 번호 1의 폴리펩티드의 빌레브란트 인자 결합 활성을 측정하였다. 이를 위해, 포스페이트 완충제 또는 임의의 다른 적절한 완충제 용액 중 2 ㎍/mL로 폴리펩티드를 함유하는 용액을 100 ㎕ 부피로 각 웰에 첨가하고, 22℃에서 18-20 h 동안 인큐베이션시켰다. 200 ㎕ PBS-0.05% 트윈(Tween)으로 3회 세척한 후, 포스페이트 완충제 중 1% BSA 용액 (유로메덱스(Euromedex), 0.45 ㎛를 통해 여과된 것) 200 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 주변 온도 (22℃)에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 200 ㎕ PBS-0.05% 트윈으로 3회 세척한 후, 포스페이트 완충제 또는 임의의 다른 적절한 완충제 용액 중에 희석된, 다양한 농도 (IU/dL로 표시)의 정제된 빌레브란트 인자 (윌팩틴 100 IU/mL, LFB) 및/또는 환자의 혈장 100 ㎕를 주변 온도 (22℃)에서 1시간 30분 동안 인큐베이션시켰다. 3회 이상 세척한 후, 포스페이트 완충제 또는 임의의 다른 적절한 완충제 용액 중에 1:8,000으로 희석된 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (토끼 항-인간 VWF/HRP, DAKO)에 커플링된 1차 항-vWF 항체를 함유하는 용액 100 ㎕를 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후; 상기 기술된 바와 같이 4회 세척을 수행하였다. 이어서, 퍼옥시다제에 대한 기질로서 125 ㎕ 테트라메틸벤지딘 용액 (TMB, Sigma)을 첨가하고; 플레이트를 암실에서 최대 10-45분 동안 인큐베이션시켰다. 125 ㎕ 2 N HCL (Sigma)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 분광 광도계 (왈락빅토르 3(Wallacvictor 3))에서 450 nm에서의 흡광도를 신속하게 측정하였다. 블랭크는 정제된 vWF 또는 혈장을 포스페이트 완충제 또는 임의의 다른 적절한 완충제 용액으로 대체함으로써 수행하였다.
도 2는 2 IU/dL의 최종 농도로 사용된, 정제된 빌레브란트 인자 (Willfactin, LFB)의 2 ㎍/mL의 최종 농도로 사용된, 상이한 크기의 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드에의, 및 10 ㎍/mL로 사용된 I형 콜라겐 (SIRCOL 콜라겐, 양성 대조군) 에의 결합에 관하여 ELISA에 의해 수득된 결과를 도시한다.
본 결과는 대다수가 2 ㎛ 초과인 입자로 구성된 서열 번호 1의 폴리펩티드가 I형 콜라겐과 등가인 방식으로 빌레브란트 인자에 결합할 수 있다는 것을 도시한다. 빌레브란트 인자 결합 활성은 서열 번호 1의 폴리펩티드가 2 ㎛보다 작은 입자 형태일 때 크게 증가되었다. 이러한 후자의 결과는 서열 번호 1의 폴리펩티드의 더 큰 입자로의 자기 조립이 빌레브란트 인자 인식 부위의 개수를 감소시키며, 상기 인식 부위는 아마도 더 큰 입자 내부로 "은폐"되어 있을 수 있다는 것을 제안한다. 본 결과는 크기가 1 ㎛ 내지 5 ㎛인 입자로 구조화된 서열 번호 1의 폴리펩티드가 실제로 빌레브란트 인자에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다.
입자 크기의 함수로서의 콜라겐에 의해 유도되는 P- 셀렉틴의 표면 발현 측정
입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드에 기반한 제제는 혈소판의 활성화를 유도할 수 있는 능력을 가진다. 상기 활성화는 전혈에서 유세포 분석법에 의해 P-셀렉틴의 혈소판 표면 발현을 측정함으로써 측정될 수 있다. 휴지기 혈소판에서, P-셀렉틴은 알파 입자로 불리는 과립에 저장된다. 혈소판이 상이한 효능제에 의해 활성화되었을 때, P-셀렉틴은 이들 과립으로부터 방출되고, 혈소판 표면 상에서 검출가능하다.
혈액 샘플을 채혈하여 시트레이트 튜브 (BD Vacutainer, BD Biosciences)에 넣은 후, 사용하기 전 1시간 동안 안정화시켰다. 유리 튜브 중 50 ㎕ 혈액을, 50 ㎍/mL 농도의 서열 번호 1의 폴리펩티드를 함유하는 50 ㎕ 포스페이트 완충제 용액에 첨가하고 (최종 농도 25 ㎍/mL); 혼합물을 주변 온도에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
이어서, 500 ㎕ 포스페이트 완충제를 각 튜브에 첨가함으로써 반응을 안정화시켰다. 이어서, 세포 분석 튜브 중 20 ㎕의 앞서 기술된 반응 혼합물을, FITC에 커플링된 1차 항-CD62P 항체 (FITC Mouse Anti-Human CD62P, BD 바이오사이언시즈), 또는 FITC에 커플링된 이소타입 대조군 항체 (FITC 마우스 IgG1 κ 이소타입 대조군, BD 바이오사이언시즈)를 함유하는 용액 20 ㎕에 첨가하고, 암실에서 주변 온도하에 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 2 mL 포스페이트 완충제를 각 튜브에 첨가하였다. 신속하게 유세포 분석기 (LSRII, BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 520 nm에서 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다. 음성 대조군은 서열 번호 1의 폴리펩티드를 포스페이트 완충제로 대체함으로써 수행하였다. 2개의 양성 대조군은 서열 번호 1의 폴리펩티드를 TRAP 트롬빈-유래 혈소판 활성인자 [인간 임상 진단용 키트: PLT Gp/리셉터스 키트(PLT Gp/Receptors Kit), 바이오시텍 스(Biocytex)] 또는 이오노포어 활성인자 A23187 (Calbiochem , Merck; Streptomyces chartreusensis)로 대체함으로써 수행하였다. 참조는 50 ㎍/mL로 사용된 I형 콜라겐 (Horm)에 의해 폴리펩티드를 대체함으로써 수행하였다.
도 3A는 유세포 분석법에 의해 수득된, 서열 번호 1의 폴리펩티드, 및 I형 콜라겐 (Horm)에 대한 혈소판 표면 상의 P-셀렉틴 발현에 관한 전형적인 프로파일을 나타내는 것에 상응한다. 도 3B의 표는 다양한 효능제에 대해 수득된 평균 형광 강도를 나타내는 것이다. TRAP 및 칼슘 이오노포어를 양성 활성화 대조군으로서 사용하였다.
입자 크기가 2 ㎛ 초과인 서열 번호 1의 폴리펩티드는 P-셀렉틴의 표면 발현을 특징으로 하는 혈소판 활성화를 유도할 수 있다. 이러한 활성화는 같은 농도로 사용된 피브릴 I형 콜라겐 (1 ㎛보다 큰 섬유)에 의해 유도되는 것과 같다. 입자 크기가 2 ㎛보다 작은 서열 번호 1의 폴리펩티드 (서열 번호 1 + 20 mM HCl) 또한 P-셀렉틴의 발현 및 따라서, 혈소판의 활성화를 유도할 수 있되, 단, 그보다는 더 적은 정도로 (47.3 대 70.4 MFI) 가능하였다.
입자 크기의 함수로서의 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집 측정
입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드에 기반한 제제는 참고 기법 [문헌: Born, 1962]에 따라 혈전-응집측정기 (Soderel: 프랑스 플로랑주)로 검출되는 인간 혈액 혈소판에 대한 응집 촉진제 활성을 가진다. 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)을 효능제 (290 ㎕의 PRP 중 10 ㎕)와 접촉하게 놓고, (응집체 형성과 연관된) 배지의 정화를 실시간으로 모니터링하였다 (응집 곡선). 혈소판 응집 부재시에 신호는 평평하게 그대로 유지되었다 (배지는 흐릿한 상태 그대로 유지되었다). 측정 종료시 튜브를 검사함으로써 응집체의 존재 또는 부재를 확인할 수 있었다. 연속적으로 교반하면서 (1,000 rpm) 37℃에서 혈소판 응집 시험 반응 평가를 수행하였다. 장치는 하기와 같이 표준화하였다: 혈소판이 풍부한 혈장 (300x109/L로 조정된, 저속 원심분리 및 농축에 의해 수득된 제제)의 경우, 0% 응집 및 혈소판이 부족한 혈장 (고속 원심분리에 의해 수득된 제제)의 경우, 100% 응집. 항혈소판 처리 개발에 사용된 참조 효능제 (5 μM ADP 및 1 ㎍/mL 콜라겐)에 대한 반응을 확인함으로써 혈소판 제제의 양을 입증하였다. 단백질이 40% 초과의 비가역적 응집을 유도할 수 있을 때, 이는 응집 촉진제 효능제인 것으로 간주되었다.
도 4는 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드를 사용하여 수득된 응집 결과를 도시한다. 경로 1은 입자 크기가 2 ㎛ 초과인 서열 번호 1의 폴리펩티드 제제가 1분 안에 및 피브릴 형태의 참조 콜라겐인 Horm I형 콜라겐 (경로 4)과 등가인 방식으로 혈소판 응집을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 그에 반해, 입자 크기가 2 ㎛ 미만인 서열 번호 1의 폴리펩티드는 심지어 10분이 경과한 후에도 혈소판 응집을 유도하지 못하였다 (경로 2). 이러한 활성 부재는, 경로 3이 20 mM HCl의 존재하에 6분 후에 첨가된 I형 콜라겐에 의한 자극시 정상적인 혈소판 응집을 보였는 바, 용액 중 20 mM HCl 존재와는 연관이 없는 것이었다.
본 결과는 응집 촉진제 활성을 얻기 위해서는 서열 번호 1의 폴리펩티드가 2 ㎛보다 큰 입자 형태로 구조화되어야 한다는 것을 보여주는 것이다.
결론적으로, 상기의 상이한 실시예들을 통해 서열 번호 1의 폴리펩티드는 그 스스로 크기가 1 ㎛ 내지 6 ㎛인 입자 형태로 구조화될 수 있고, 이들 입자는 빌레브란트 인자에 결합할 수 있고, 혈소판 활성화 (P-셀렉틴의 표면 발현)를 유도할 수 있는 능력을 가지며, 입자 크기가 2 ㎛ 초과인 경우에만 오직 혈소판 응집을 유발할 수 있는 능력을 가진다는 것이 밝혀졌다.
다양한 현미경 검사 기법에 의한, 피브릴 I형 콜라겐 ( Horm )과 비교하여 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 구조 관찰.
분자의 거대분자 구조를 상이한 해상도 및 규모로 시각화할 수 있는 다양한 현미경 검사 기법이 존재한다. 도 5는 콜라겐 타입의 단백질의 구조를 관찰할 수 있는 3가지 현미경 검사 기법 (투과 현미경 검사, 주사 전자 현미경 검사 및 원자력 현미경 검사)을 이용하여 수득된 영상을 보여주는 것이다.
투과 현미경 검사에 의해 관찰하는 경우, I형 콜라겐 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드를 37℃에서 2시간 동안에 걸쳐 유리 슬라이드 상에 적층시킨 후, 60x 대물렌즈가 장착된 자이스(ZEISS) 도립 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 영상은 자이스 액시오캠 ICc 1(ZEISS AxioCam ICc 1) 카메라를 이용하여 수득하였다.
주사 전자 현미경 검사에 의해 관찰하는 경우, 적층을 위해 선택되는 표면은 단결정 실리콘이었다 (100). 본 방법에 의해 콜라겐을 관찰하기 위해서는 반도체이고, 원자상 평평한 것, 이 둘 모두가 확실한 선택이었다. 200 ㎍.mL-1로 농축된 피브릴 I형 콜라겐 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드 소적 10 ㎕를 6시간 동안 실리콘 표면 상에 배치함으로써 샘플 제조를 수행하였다. 이어서, 표면을 증류수로 세정하고, 질소하에서 건조시켰다. 에드워즈(Edwards) S150 스퍼터 코터 (2분 동안 0.3 mPa 아르곤 대기하에 25 mA 전류)에서 금 스퍼터링함으로써 건조된 표면을 금속화하였다. 방출 전위 20 keV 및 방출 전류 60 μA하에 JEOL 6500F 주사 전자 현미경을 이용하여 샘플 표면을 관찰하였다.
원자력 현미경 검사 (AFM)에 의해 관찰하는 경우, 관찰되는 I형 콜라겐 및 서열 번호 1의 폴리펩티드가 놓여져 있는 표면은 다결정 금 표면 (운모 상에서의 에피택시에 의해 수득된 Au(111) 테라스, PHASIS, 참조 20020022)이었다. 적층은 30분 동안에 걸쳐 300 s-1의 전단 속도로 25 ㎍.mL-1 농도로 유동하에 계내 밖에서 이루어졌다. 이러한 유동식 관능화가 이루어질 수 있도록 하기 위해, 금 표면 상에서 미세유체 셀에 가압하고, ISMATEC IPC-4 연동 펌프를 통하여 단백질 용액을 표면으로 가져왔다. 용수철 상수 k (N.m-1), 공명 진동수 f = 50-100 kHz 및 레버 길이 L = 200-250 ㎛로 하여, FESPA 포인트 (Bruker)가 장착된 나노스코프 IV 멀티모드(Nanoscope IV Multimode) 원자력 현미경 (Digital Instrument, Veeco Inc.: 미국 캘리포니아주 산타바바라)를 이용하여 샘플을 관찰하였다. 상기 생물학적 샘플에 대하여 저잡음으로 획득이 가능한 동적 태핑 모드인 브루커 피크포스(Bruker PeakForce) QNM 모드를 이용하여 획득을 수행하였다. 주사 주파수는 1 Hz로 고정시켰다. 획득한 영상은 고해상도를 수득하기 위해 WSxM 프로그램을 이용하여 평활화 및 평준화 기능을 적용시킴으로써 프로세싱하였다.
도 5에 제시된 관찰 결과를 통해, DLS에 의해 수득된 결과를 확인할 수 있었으며, 이는 I형 콜라겐의 피브릴 구조와 비교하였을 때, 서열 번호 1의 폴리펩티드는 입자 형태의 구조라는 것을 시사한다. 관찰된 입자의 크기는 그의 관찰에 사용된 실험 조건하에서 대략 수십 나노미터였다.
입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드, 및 피브릴 형태의 I형 콜라겐 (Horm)의 마우스 내로의 주사 이후의 P 셀렉틴의 혈소판 표면 발현 측정.
입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 피브릴 I형 콜라겐에 기반한 제제는 유세포 분석법에 의해 측정된 P-셀렉틴의 혈소판 표면 발현에 의해 제시된 바와 같이, 전혈 중 혈소판의 활성화를 유도할 수 있는 생체외 능력을 가진다. 상기 제제가 일단 혈류 내로 주사되고 나면, 상기와 같은 동일한 활성화를 실제로 유도할 수 있는지 입증하기 위해, 400 ㎍/kg I형 콜라겐 또는 2 mg/kg 서열 번호 1의 폴리펩티드 투여 후 15분 경과하였을 때, 또는 혈전증의 첫번째 징후 (질식)를 보이는 순간에 마우스로부터 혈액 샘플을 채혈하여 시트레이트 튜브 (BD 배큐테이너, BD 바이오사이언시즈)에 넣었다. 50 ㎕ 혈액을 유리 튜브에 넣은 후, 250 ㎕ 포스페이트 완충제로 안정화시켰다. 이어서, 세포 분석 튜브 중 20 ㎕의 앞서 기술된 반응 혼합물을, FITC에 커플링된 1차 항-CD62P 항체 (FITC 마우스 안티-휴먼 CD62P, BD 바이오사이언시즈), 또는 FITC에 커플링된 이소타입 대조군 항체 (FITC 마우스 IgG1 κ 이소타입 대조군, BD 바이오사이언시즈)를 함유하는 용액 20 ㎕에 첨가하고, 암실에서 주변 온도하에 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 2 mL 포스페이트 완충제를 각 튜브에 첨가하였다. 신속하게 유세포 분석기 (LSRII, BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 520 nm에서 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하였다.
도 6은 에피네프린 존재 또는 부재하에서의 두 입자 크기에 대한, 피브릴 I형 콜라겐 및 서열 번호 1의 폴리펩티드의 주사 이후 마우스로부터 채취된 혈액으로부터 측정된 P 셀렉틴의 혈소판 발현을 도시한다. 입자 크기가 어떻든, 서열 번호 1의 폴리펩티드는 그의 마우스에게로의 투여 후 15분 경과하였을 때, 또는 혈전증의 첫번째 징후 (질식)를 보이는 시점에 실제로 혈소판의 활성화를 유도하였다는 점에 주목할 수 있었다. 상기 활성화는, 에피네프린에 의해 강력하게 증가되는 피브릴 I형 콜라겐에 의한 활성화와는 달리, 에피네프린의 공동 투여에 의해 조절되지 않았다. 본 결과를 통해 서열 번호 1의 폴리펩티드는 생체외에서 제시된 바와 같이, 일단 혈류 내로 투여되고 나면, 실제로 혈소판의 활성화를 유도할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
마우스에서 유도된 폐 색전증 모델에서 서열 번호 1의 폴리펩티드의 혈류 내로의 주사와 관련된 혈전증 위험 측정
본 발명은 혈소판의 활성화에 의존하는 기전에 의해 출혈을 치료하기 위한 콜라겐 유래의 단백질 또는 펩티드의 용도를 기술한다. 출혈 상황과 상관 없이, 입자 형태의, 콜라겐 유래의 상기 단백질 또는 펩티드의 주사에 의해 유도된 생체내 혈소판 활성화가 혈전증 위험과 관련이 있는지 여부를 측정하기 위해, 콜라겐 및 에피네프린 투여에 의해 마우스에서 유도된 폐 색전증 모델을 사용하였다. 목적은 일단 주사되고 나면, 본 발명의 콜라겐 유래의 단백질 또는 펩티드에 의해 유도된 혈소판 활성화 그 자체는 혈전증을 유도함으로써 유해성을 띠는 것은 아님을 밝히는 것이었다. 상기 투여의 잠재적인 혈전증 효과를 특징 규명하기 위해, 동물이 폐 색전증으로 사망할 때까지 소요되는 시간을 측정하는 것으로 이루어진 기준으로서, 상기 모델에서 고전적으로 사용되는 것인 기준 이외에도, 동위 원소 영상 (SPECT)에 의해 시각화될 수 있는 방사성 트레이서를 관찰 기준으로서 사용하였다. 정맥내 주사 후, 테크네튬-99m으로 표지된 인간 알부민의 거대응집체는 혈류내를 순환하고, 이를 통해 폐 또는 특정 정맥의 신티그래프를 촬영할 수 있었다. 혈전증 병소가 존재할 경우, 상기 트레이서의 정상적인 폐 분포는 변경될 것이며, 동위 원소 영상은 폐 중 트레이서의 감소 또는 부재를 보이는 것이었다.
상기 폐 색전증 모델로는 체중이 25-30 g인 수컷 스위스(SWISS) 마우스를 사용하였다. 마우스를 실험 전 기간 동안 이소플루란 마취제하에서 유지시켰다. 먼저, 2개의 경정맥을 노출시킨 후, 서열 번호 1의 폴리펩티드 (1 mg/kg)/에피네프린 (60 ㎍/kg) 혼합물 또는 피브릴 I형 콜라겐 (400 ㎍/kg)/에피네프린 (60 ㎍/kg) 혼합물을 최종 부피 150 ㎕로 상기 정맥 중 하나에 주사하였다. 폐 색전증이 발생한 경우, 마우스는 질식하기 시작하였고, 주사 후 10분 이내에 사망하였다. 15분 초과의 기간 동안 생존한 마우스는 폐 색전증을 앓지 않는 것으로 간주하였다. SPECT 획득을 수행하기 위해, 폐 색전증을 앓는 마우스의 경우, 심장 정지 직후에 또는 생존한 마우스의 경우, 15분 후에 테크네튬-99m (최종 부피 100 ㎕로 마우스 1마리당 30 μCi씩)으로 표지된 인간 알부민의 거대응집체를 나머지 다른 한 경정맥 내에 주사하였다. 이어서, 스캐너로 15분 동안 동위 원소 영상 획득을 수행하였다.
도 7A의 표는 에피네프린의 존재하에서 피브릴 I형 콜라겐의, 및 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드의 마우스에게로의 투여 이후에 수득된 결과를 폐 색전증이 관찰된 동물의 비율(%) 및 상기 색전증 출현까지의 평균 소요 시간으로 도시한다. 본 결과, 피브릴 I형 콜라겐 주사 후 평균적으로 5분 50초 경과 후에는 100%의 동물이 사망한 것으로 나타났다. 그에 반해, 서열 번호 1의 폴리펩티드 주사 후에는 어느 동물에서도 폐 색전증은 발생하지 않았으며, 심지어 2.5배 더 높은 농도 (1 mg/kg 대 400 ㎍/kg)로 사용된 경우에도 그러하였다. 도 7B는 방사성 표지된 알부민 거대응집체 주사 후 수득된 결과를 도시한 것으로서, 이를 통해 피브릴 I형 콜라겐을 주사맞은 마우스에서는 중증 폐 색전증이 나타났고, 서열 번호 1의 폴리펩티드를 주사맞은 마우스에서는 어떤 유도성 혈전증도 보이지 않으면서, 정상적인 폐 분포가 나타났다는 것을 확인할 수 있었다.
본 결과를 통해, 같은 혈소판 활성화 활성을 가지는 두 콜라겐 유형의 단백질의 경우, 일단 혈류 내로 주사되고 나면, 오직 입자 형태인 것만이 혈전증을 유도할 위험 없이 사용될 수 있다는 것이 확인되었다.
꼬리로부터의 유도성 출혈이 있는 마우스 모델에서 서열 번호 1의 폴리펩티드의 주사 효과 측정.
상기 제시된 결과를 통해 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드는 일단 마우스의 혈류 내로 주사되고 나면, 실제로 혈소판 활성화를 유도할 수 있고, 이러한 활성화는 피브릴 I형 콜라겐과 달리 혈전형성성 효과는 없다는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 콜라겐 유래의 단백질 또는 펩티드의 혈류 내로의 주사가 실제로 혈소판 활성화에 의존하는 기전에 의해 출혈 정지를 유도할 수 있는지 입증하기 위하여, 꼬리로부터의 유도성 출혈이 있는 마우스 모델에서 서열 번호 1의 폴리펩티드의 투여가 혈액 손실에 미치는 효과를 평가하였다.
상기 꼬리로부터의 출혈이 있는 모델로는 체중이 25-30 g인 수컷 스위스 마우스를 사용하였다. 마우스를 실험 전 기간 동안 이소플루란 마취제하에서 유지시켰다. 먼저, 2개의 경정맥 중 하나를 노출시킨 후, 포스페이트 완충제 중에 희석된 상이한 분자를 주사하였다. 3개의 동맥 및 정맥을 절단하기 위해 단부로부터 1.5 cm되는 부분에서 꼬리를 절단하였다. 포스페이트 완충제 (비히클 대조군) 또는 서열 번호 1의 폴리펩티드 (1.6 mg/kg)의 주사 후 10분 경과하였을 때, 및 헤파린 (항응고제, 양성 출혈 대조군, 60 IU/kg) 주사 후 20분 경과하였을 때, 절단을 수행하였다. 절단 후, 적혈구를 손상시키지 않으면서 16분 동안에 걸쳐 혈액을 수집하기 위해 37℃에서 50 mL 생리 식염수에 꼬리를 침지시켰다. 튜브를 주변 온도에서 1시간 동안 걸쳐 그대로 방치하여 침전시킨 후, 250 g로 15분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 버리고, 적혈구 펠릿을 3 mL 특이 용해 완충제 (8.3 g/L NH4Cl, 1 g/L KHCO3 및 37 mg/L EDTA) 중에 용해시켰다. 플레이트 판독기 상에서 200 ㎕의 용해물에 대한 550 nm에서의 광학 밀도를 판독하였다.
혈액 손실량을 측정하기 위하여 보정 곡선을 작성하였다. 이를 위해, 체중이 25-30 g인 수컷 스위스 마우스를 복부 대동맥으로부터 출혈시켰다. 응고를 막기 위해 혈액을 수집하여 시트레이트 튜브에 넣었다. 50 mL 생리 식염수를 함유하는 튜브에서 다양한 혈액 부피로 구성하였다. 이어서, 상기 기술된 바와 같이 혈액 처리를 수행하였다 (도 8A 참조).
도 8B에 제시된 결과를 통해 입자 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드가 천연 형태든 또는 농축된 형태든 간에 상기 모델에서 실제로 출혈 정지를 유도할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 비처리 마우스의 경우, 42 ± 18.4 ㎕인 것에 반해, 서열 번호 1의 폴리펩티드의 존재하에서 출혈 정지 전 평균 손실량은 11.6 ± 2.4 ㎕ (비농축) 및 12.6 ± 6.1 ㎕ (10배 농축)였다. 그러므로, 대조군 마우스와 비교하였을 때, 혈액 손실량은 약 70% 감소된 것으로 나타났다. 그에 반해, 헤파린 존재하에서 혈액 손실량은 크게 증가하였으며, 평균 혈액 손실량은 257.9 ± 87.5 ㎕까지 이르렀다. 그러므로, 대조군 마우스와 비교하였을 때, 혈액 손실량은 514% 증가된 것으로 나타났으며, 이를 통해 상기 모델이 입증되었다.
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Claims (11)

  1. - 혈소판의 부착 및 활성화를 유도하는 단백질 또는 펩티드를 포함하는, 길이가 10 ㎛ 미만인 입자 또는 피브릴; 및
    - 1종 이상의 제약상 허용되는 비히클 또는 부형제를 포함하는,
    출혈 치료에 사용하기 위한 주사가능한 제제.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 콜라겐 또는 재조합 단백질 중에서 선택되고, 상기 재조합 단백질의 서열은
    - 서열 번호 1의 폴리펩티드;
    - 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드;
    - 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드;
    - 2회 이상 반복되는 GXY 트리플렛의 반복으로부터 형성되는 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 여기서 G는 글리신을 의미하고, X 및 Y는 임의의 아미노산을 의미하는 것인, 폴리펩티드
    로부터 선택되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 것인, 주사가능한 제제.
  3. 제1항에 있어서, 펩티드가
    - 서열 번호 1의 폴리펩티드;
    - 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드;
    - 그의 전장을 따라 서열 번호 1의 폴리펩티드, 또는 서열 번호 1의 25번 내지 184번 위치의 서열을 가지는 폴리펩티드와 70% 이상의 동일성을 가지는 폴리펩티드; 또는
    - 2회 이상 반복되는 GXY 트리플렛의 반복으로부터 형성되는 서열을 가지는 폴리펩티드로서, 여기서 G는 글리신을 의미하고, X 및 Y는 임의의 아미노산을 의미하는 것인, 폴리펩티드
    로부터 선택되는 것인, 주사가능한 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 콜라겐 또는 재조합 단백질로부터 선택되는 펩티드 또는 단백질로 이루어진 것인, 주사가능한 제제.
  5. 제4항에 있어서, 입자가 코아세르베이션, 응집 또는 자기 조립에 의해 수득되는 것인, 주사가능한 제제.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입자가 펩티드 또는 단백질이 부착된 지지체를 포함하는 것인, 주사가능한 제제.
  7. 제6항에 있어서, 지지체가 유기 또는 무기 미세입자인, 주사가능한 제제.
  8. 제7항에 있어서, 단백질이 공유 결합에 의해 미세입자의 표면 상에 접합 (graft)되는 것인, 주사가능한 제제.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 미세입자가 알부민, 지질, 금속 및 그의 산화물, 그래핀, 실리카, 및 중합체를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 주사가능한 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 입자의 평균 직경 범위가 1 ㎛ 내지 6 ㎛인, 주사가능한 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 또는 단백질이 페길화 (PEGylated) 또는 파실화 (PASylated)된 것인, 주사가능한 제제.
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