CN113967286A

CN113967286A - 一种短肽干粉粘合剂在缺损硬膜的封堵与修复中的应用

Info

Publication number: CN113967286A
Application number: CN202111295569.1A
Authority: CN
Inventors: 赵建武; 程学良; 刘晓欢; 李文; 曲扬; 秦彦国; 孙映川; 董荣鹏
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2041-11-03
Also published as: CN113967286B

Abstract

本发明公开了一种以短肽干粉型粘合剂为密封材料发展对硬膜缺损快速封堵的技术应用。本发明短肽干粉型粘合剂遇水即可快速成胶，迅速封堵硬膜缺损，有效阻止因脑脊液渗漏引起的切口愈合延迟、感染、假性硬膜囊肿形成、神经功能障碍等。

Description

一种短肽干粉粘合剂在缺损硬膜的封堵与修复中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种短肽干粉粘合剂在缺损硬膜的封堵与修复中的应用。

背景技术

硬膜破损在脊柱外科/神经外科中是常见的并发症，硬膜破损后会出现脑脊液漏，从而引起切口延迟愈合、感染、假性硬膜囊肿形成、脊髓疝等一系列并发症(Liao J,Li X,He W,Guo Q,Fan Y.Acta Biomater.2021Aug；130:248-267.)。

目前，临床上修复硬膜的方法常常采用缝线缝合和粘合剂封堵等方法。其中，单纯采用缝线缝合时，无论选用何种尺寸的针线和缝合方法，都无法避免针孔处脑脊液的渗漏。而粘合剂方面目前主要包括三类：一是含有同种异体或自体纤维原与(同种异体)凝血酶组合的生物可吸收密封剂；二是含有聚乙二醇(PEG)基聚合物的可吸收密封剂；三是氰基丙烯酸酯内粘合剂。

通过目前的文献调研，纤维蛋白胶用于硬膜的修复作用是有限的(Kinaci A,Algra A,Heuts S,O'Donnell D,van der Zwan A,van Doormaal T.WorldNeurosurg.2018Oct；118:368-376.e1.)。文献中关于含有聚乙二醇(PEG)基的粘合剂的封堵效果部分可达90％以上，但由于PEG胶的高溶胀率，在有限的椎管容积内会对脊髓产生严重的压迫(Wright NM,Park J,Tew JM,Kim KD,Shaffrey ME,Cheng J,Choudhri H,Krishnaney AA,Graham RS,Mendel E,Simmons N.2015Apr 15；40(8):505-13.)。此外，上述两种粘合剂与组织湿性界面的粘合表现一般。而硬膜撕裂后持续的脑脊液流出使得胶对硬膜的粘合力大大降低，从而降低了粘合剂对硬膜的封堵作用。

氰基丙烯酸酯类粘合剂是具有强有力的粘合，目前临床主要用于皮肤切口表面。但氰基丙烯酸酯类粘合剂存在降解产物有毒，成胶后硬度大，柔韧性差等缺点，限制了它的应用。

因此，开发一种新型的水下粘合剂用于硬膜的封堵是很有必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种短肽干粉粘合剂在缺损硬膜的封堵与修复中的应用。这种粉末型粘合剂遇水即粘，可用于破损硬膜(硬脑膜和硬脊膜)的快速封堵与修复，具有制备简便、存储方便、易消毒、易量产、操作便捷、生物相容性好、降解速率与硬膜修复相匹配等优点。

本发明短肽干粉粘合剂具有以下特征：

1、适用于活体动物缺损硬膜的封堵与修复；

2、可直接撒在缺损硬膜的位置使用；

3、遇体液和脑脊液可快速吸收水分实现有效黏附

4、体外爆破压为80-130mH₂O，优选为118.2cmH₂O，体内爆破压为80-130mH₂O，优选为105.9cmH₂O；

5、在细胞水平具有良好的生物相容性，不同浓度稀释液的溶血率均低于5％；

6、在7-10天降解，与缺损硬膜的修复速度相匹配。

进一步，上述短肽干粉粘合剂包括如下质量分数原料：短肽50％-61％，余量为甘草酸；优选为：短肽55％，余量为甘草酸。

更进一步，短肽的结构式为：

更进一步，甘草酸的结构式为：

本发明还提供了上述短肽干粉粘合剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)按上短肽干粉粘合剂的质量分数称取各原料；

(2)将短肽和甘草酸分别溶于水，得到短肽水溶液和甘草酸水溶液；

(3)用pH调节剂分别将短肽水溶液和甘草酸水溶液的pH值调节为6.0-8.0，得到短肽前驱液和甘草酸前驱液；

(4)将短肽前驱液和甘草酸前驱液混合，进行交联组装，即得短肽干粉粘合剂。

进一步，步骤(2)中，短肽水溶液的摩尔浓度为74.5-80.0mmol/L，甘草酸水溶液的摩尔浓度为74.5-80.0mmol/L。

采用上述进一步方案的有益效果在于，本发明所选摩尔浓度可在确保两种组分充分溶解的情况下提高短肽与甘草酸的碰撞几率，实现分子间的有效交联和粘合剂的快速形成。另外，本发明所选摩尔浓度还可极大抑制短肽干粉粘合剂在水中的解离。

进一步，步骤(3)中，pH调节剂为盐酸或氢氧化钠。更进一步，盐酸为盐酸水溶液，摩尔浓度为0.01-0.1mol/L；氢氧化钠为氢氧化钠水溶液，摩尔浓度为0.01-0.1mol/L。

采用上述进一步方案的有益效果在于，通过盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液，能够快速、便利的将短肽水溶液和甘草酸水溶液的pH值调节至所需的范围内。

进一步，步骤(4)中，交联组装的温度为22-25℃，时间为0.5-1h。

采用上述进一步方案的有益效果在于：通过交联组装，能够在无需能耗的温和条件下获得短肽干粉粘合剂。

本发明还请求保护上述短肽干粉粘合剂或上述制备方法制得的短肽干粉粘合剂在硬膜封堵和修复中的应用。

综上所述，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明干粉型粘合剂遇水即可快速成胶，迅速封堵硬膜缺损，有效阻止因脑脊液渗漏引起的切口愈合延迟、感染、假性硬膜囊肿形成、神经功能障碍等。

2、本发明短肽-甘草酸粉末制备简便，可批量合成，对硬膜组织的粘附性能良好，具有良好的生物相容性，同时可生物降解，并且降解速率与硬膜修复速率相匹配。

3、动物活体实验表明，本发明干粉粘合剂使用方便，只需将粉末撒在硬膜破损处即刻快速成胶实现及时止漏，操作便捷。

附图说明

图1为实施例1短肽干粉粘合剂的形态变化过程；

图2为体外爆破压测试图；

图3为实施例1短肽干粉粘合剂和纤维蛋白胶的体外爆破压值；

图4为实施例1短肽干粉粘合剂和纤维蛋白胶的体内爆破压值；

图5为实验组、纤维蛋白组和空白组对破损硬膜的封堵和修复效果；

图6为实施例1短肽干粉粘合剂的细胞毒性；

图7为实施例1短肽干粉粘合剂与红细胞孵育3h后的数码图；

图8为实施例1短肽干粉粘合剂与细胞孵育3h后的溶血率；

图9为实施例1短肽干粉粘合剂在PBS、0.9％NaCl、DMEM中的降解情况；

图10为实施例1短肽干粉粘合剂植入体内后不同时间点的降解数码图；

图11为实施例1短肽干粉粘合剂在不同时间点的HE染色情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂不同状态的转变

取短肽干粉遇水后可快速吸水并形成水性粘合剂的短肽前驱液和甘草酸前驱液，混合后迅速成胶，之后冻干研磨即可成粉末，遇水又即刻固化成胶。形态变化过程如图1所示。

由图1可知，本发明短肽干粉粘合剂具有制备简单和使用方便等优势。

2、短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂对动物组织的粘接性能

(1)体外爆破压

按照图2(体外爆破压测试图)的方法测量短肽干粉粘合剂的爆破压。其中，组织为猪的肠衣，采用1.6mm针头在肠衣上穿刺形成一个孔，然后按照0.8mL/min的速度往小室里注入生理盐水，肠衣表面轻度被生理盐水浸湿(模仿手术时硬膜撕裂导致脑脊液渗漏情况)后分别加实施例1制得的短肽干粉粘合剂封堵和纤维蛋白胶封堵。待胶稳定2min后测量两种材料的爆破压。结果如图3所示。

由图3可知，实施例1短肽干粉粘合剂的体外爆破压118.2cmH₂O，纤维蛋白胶的体外爆破压为34.1cmH₂O，两组存在组间差异。

(2)体内爆破压

选择日本大耳白兔，雄性，2.5kg左右，采用安泰麻醉后颅顶皮肤备皮。于颅顶正中做一长约3cm的皮肤切口，显露颅骨。于冠状缝后方矢状缝两旁各做一直径10mm的圆形骨缺损和在额顶部正中做一直径5mm的颅骨缺损。并在两侧颅顶缺损区硬脑膜上做一长约5mm的纵行切口，在额顶区颅骨缺损处埋置留置针，以0.8mL/min的速度往颅内注射生理盐水，保证在两侧硬膜缺损区有脑脊液持续稳定的漏出。此时，分别往缺损区加实施例1制得的短肽干粉粘合剂和纤维蛋白胶，成胶2min后观察止漏效果。结果如图4所示。

由图4可知，实施例1短肽干粉粘合剂的体内爆破压105.9cmH₂O，纤维蛋白胶的体内爆破压为34.23cmH₂O，两组存在组间差异。

3、短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复作用

选择日本大耳白兔，雄性，2.5kg左右。采用安泰麻醉后，于兔子右侧颅顶冠状缝后方矢状缝右侧做一直径1cm的圆形骨缺损，然后用显微剪刀剪开硬膜和下层的蛛网膜，长约5mm，见清亮的脑脊液流出，代表造模成功。整个手术过程如图3a-e所示。然后轻轻擦去硬脑膜表面渗出的血液和脑脊液后，于硬膜缺损处分别加入实施例1制得的短肽干粉粘合剂(刚好填充整个直径10mm的骨缺损，遇脑脊液迅速成胶封堵缺损硬膜，防止脑脊液渗出)作为实验组，加入纤维蛋白作为纤维蛋白组，不处理的作为空白组。在术后1周、2周给动物做头部3.0T核磁检测，观察各处理组对破损硬膜的封堵和修复效果。结果如图5所示。

由图5可知，在术后1周时，纤维蛋白胶组和空白组有大量脑脊液渗出，积聚于皮下，而实验组封堵硬膜良好，无脑脊液渗出。在术后2周时，纤维蛋白胶组和空白组仍有少量的脑脊液渗出，而实验组对硬脑膜的封堵依旧表现良好。

4、短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂的生物相容性

(1)细胞毒性

为了测定短肽干粉粘合剂的细胞毒性，采用CCK-8法。将实施例1制得的短肽干粉粘合剂按照国家医疗器械标准，以200mg/mL浸泡在DMEM培养基中，37°孵育24h，获取浸提液。将获取的浸提液梯度稀释获得100％、50％、25％、12.5％、6.25％的浸提稀释液，备用。复苏成纤维细胞3T3后，进行稳定传代一次后，接种于96孔板中，细胞密度约5000/孔。于37°，5％CO₂中培养24h确定细胞生长状态良好后，将培养基换成浸提稀释液进行细胞培养，分别于24h和48h观察细胞的活力。结果如图6所示。

由图6可知，按照国家医疗器械标准制备的浸提稀释液无细胞毒性，实施例1短肽干粉粘合剂在细胞水平具有良好的生物相容性。

(2)溶血试验

先将实施例1制得的短肽干粉粘合剂按照国家医疗器械标准，以200mg/mL浸泡在生理盐水中，37°孵育24h，获取浸提液。将获取的浸提液梯度稀释获得100％、50％、25％、12.5％、6.25％的浸提稀释液，备用。用抗凝管收集日本大耳白兔的新鲜静脉血，1500r/min，离心15min，去除上清液后加入0.9％NaCl洗涤、离心，反复清洗直至上清液呈清亮。将收集到的红细胞，加入0.9％NaCl配制2％浓度的红细胞悬液。设立7个组，分别是100％、50％、25％、12.5％、6.25％浸提液组，生理盐水组(阴性对照组)、去离子水组(阳性对照组)。每组设立3个平行样，每个1.5mL离心管中按照体积比1:1加入浸提液/生理盐水/去离子水和红细胞悬液，共1mL，将离心管放置37°，5％CO₂培养箱中孵育3h，到时间后取出观察离心管中的溶血情况。数码图和溶血率如图7和图8所示。

由图7和图8可知，实施例1短肽干粉粘合剂不同浓度稀释液的溶血率均低于5％，认为是安全的。

5、短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂的降解性

(1)体外降解

选择小皿称量实施例1制得的短肽干粉粘合剂胶态150mg，称取9个样品。每3个皿一组，分为3组，分别加入0.9％NaCl/PBS/DMEM。放置在37°恒温箱中振荡，每24h取出小皿，吸干液体拍照称重，重新加入新的液体。讲解情况如图9所示。

由图9可知，实施例1短肽干粉粘合剂在10天左右降解，这与硬膜修复的速度是相匹配的。

以上试验说明，本发明短肽干粉粘合剂在封堵和修复硬膜的同时不会阻碍硬膜的生长。

(2)体内降解

采用SD大鼠，雄性，220-250g左右。麻醉成功后于大鼠后背两侧植入实施例1制得的短肽干粉粘合剂150mg后缝合切口，分别在术后1天，3天，5天，7天，10天处死动物，观察实施例1短肽干粉粘合剂的降解情况，结果如图10所示。并将取的组织标本进行HE染色评估材料的炎症反应，结果如图11所示。

由图10可知，实施例1短肽干粉粘合剂在1周左右降解。

由图10可知，实施例1短肽干粉粘合剂植入前3天引起了轻度的炎症反应，随着实施例1短肽干粉粘合剂的降解，炎症反应逐渐消退。

实施例2

短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂对兔子胸腰段硬膜的封堵与修复作用，与“实施例1中短肽干粉粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复作用”的区别仅在于，将“硬脑膜”替换为“胸腰段硬膜”，并且后续处理和实施例1相同。

分别在1周和2周进行核磁检测。从影像结果可以看到和实施例1中相类似的实验结果。

实施例3

如实施例1所述，材料和条件不变，将兔子的硬脑膜替换为“SD大鼠胸腰段硬膜”，研究短肽(AC-RRYNYQRR-NH₂)干粉粘合剂对SD大鼠胸腰段硬脊膜的封堵与修复效果。

选用SD大鼠，250g左右，雄性。选用戊巴比妥钠麻醉，剂量40mg/kg。麻醉生效后，备皮，消毒。于后背正中做一长约3cm的手术切口，钝性分离棘旁肌肉，去除椎板，充分暴露硬膜。采用显微剪刀，在硬膜上做一长约1cm的缺损，切开硬膜及其下层的蛛网膜，见清亮的脑脊液流出。之后往缺损处分别加入实施例1制得的短肽干粉粘合剂作为实验组，加入纤维蛋白作为纤维蛋白组，不处理的作为空白组，最后逐层缝合伤口。术后定期观察硬膜封堵效果。

从实验结果可以看到，在术后1周时，空白组和纤维蛋白胶组后背均鼓起一个液性包块，包块大小约为3cm*4cm，且纤维蛋白胶组包块略小于未处理组；而实验组表现良好，后背部并未出现包块。在术后2周时，空白组和纤维蛋白胶组的包块均变小。

将大鼠处死解剖可见，大鼠后背手术处局部形成假性硬膜囊肿，同时纤维蛋白胶组假性硬膜囊肿较小，而实验组效果明显优于其他两组，肌肉表面创口愈合良好，无假性硬膜囊肿形成。

实施例4

如实施例1所述，其它条件不变，将实施例1中的短肽序列AC-RRYNYQRR-NH₂替换为AC-RRFNFNRR-NH₂，研究所得短肽干粉型粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复效果。

实施例5

如实施例1所述，其它条件不变，将实施例1中的短肽序列AC-RRYNYQRR-NH₂替换为C₈-SQRR-NH₂，研究所得短肽干粉型粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复效果。

实施例6

如实施例1所述，其它条件不变，将实施例1中的短肽序列AC-RRYNYQRR-NH₂替换为C₁₂-SQRR-NH₂，研究所得短肽干粉型粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复效果。

实施例7

如实施例1所述，其它条件不变，将实施例1中的短肽序列AC-RRYNYQRR-NH₂替换为YGGFLRR，研究所得短肽干粉型粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复效果。

实施例8

如实施例1所述，其它条件不变，将实施例1中的短肽序列AC-RRYNYQRR-NH₂替换为AC-RRYSYSRR-NH₂，研究所得短肽干粉型粘合剂对兔子硬脑膜的封堵与修复效果。

由实施例4-8的实验结果可知，上述干粉粘合剂的体内爆破压大约在70-120cmH₂O，均能满足临床患者卧位时脑脊液压力(8-18cmH₂O)和体位变化时脑脊液的压力变化波动(<60cmH₂O)。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种短肽干粉粘合剂在缺损硬膜的封堵与修复中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂适用于活体动物缺损硬膜的封堵与修复。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂可直接撒在缺损硬膜的位置使用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂遇体液和脑脊液可快速吸收水分实现有效黏附。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂的体外爆破压为80-130mH₂O，体内爆破压为70-120cmH₂O。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂在细胞水平具有良好的生物相容性，不同浓度稀释液的溶血率均低于5％。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述短肽干粉粘合剂在7-10天降解，与缺损硬膜的修复速度相匹配。