CN111544656B - 皮肤填充剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种皮肤填充剂及其制备方法，该皮肤填充剂包括经交联的胶原蛋白和微球，胶原蛋白提取自人胎盘，所述微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚‑L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。该皮肤填充剂具有良好的生物相容性和稳定性。

Description

皮肤填充剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种皮肤填充剂及其制备方法。
背景技术
人体的软组织通过胶原、弹力蛋白等蛋白质和包含粘多糖的细胞外基质维持其结构。当由于先天性原因、外部冲击或疾病等原因发生软组织缺失时，可以将包含有与皮肤组织类似的成分的皮肤填充剂通过注射注入到特定部位来使得软组织复原或纠正其形态。
目前常用的皮肤填充剂主要以人工合成的羟基磷灰石微球、聚-L-乳酸微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球等微球为主要成分，这些皮肤填充剂的使用寿命长，稳定性好。然而，有研究表明，这类皮肤填充剂的生物相容性较差，容易形成肉芽肿。
发明内容
基于此，有必要提供一种生物相容性好且稳定性高的皮肤填充剂。
此外，还提供一种生物相容性好且稳定性高的皮肤填充剂的制备方法。
一种皮肤填充剂，包括经交联的胶原蛋白和微球，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘中提取的胶原蛋白经交联而成，所述微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。
上述皮肤填充剂包括经交联的胶原蛋白和微球，通过经交联的提取自人胎盘的胶原蛋白与微球配合使用，使得在使用时皮肤填充剂中的微球悬浮于经交联的胶原蛋白溶液中，减少微球与组织的接触面积，同时微球被经交联的胶原蛋白束缚，也使得微球不易析出，从而使得上述皮肤填充剂具有好的稳定性的同时也具有好的生物相容性。此外，上述皮肤填充剂中的胶原蛋白为人源胶原蛋白，与异源(例如猪、牛等)胶原蛋白相比，免疫原性更低。
在其中一个实施例中，以质量份数计，所述经交联的胶原蛋白的份数为1份～15份，所述微球的份数为20份～80份。
在其中一个实施例中，所述微球的粒径为1μm～300μm。
在其中一个实施例中，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘的羊膜中提取的胶原蛋白经交联而成；及/或，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘的叶状绒毛膜中提取的胶原蛋白经交联而成。
在其中一个实施例中，还包括添加剂，所述添加剂选自抗菌剂、麻醉剂、抗炎剂和抗氧化剂中的至少一种。
在其中一个实施例中，以质量份数计，所述添加剂的质量份数为0.1份～2.0份。
在其中一个实施例中，所述抗菌剂为抗生素；及/或，所述麻醉剂为局部麻醉剂。
在其中一个实施例中，所述抗菌剂选自庆大霉素和头孢菌素中的至少一种；及/或，
所述麻醉剂为丁卡因和利多卡因中的至少一种；及/或，
所述抗炎剂选自奈帕芬胺和双氯芬酸中的至少一种；及/或，
所述抗氧化剂选自维生素C及抗坏血酸磷酸钠中的至少一种。
一种皮肤填充剂的制备方法，包括以下步骤：
提取人胎盘中的胶原蛋白；
用交联剂将所述胶原蛋白交联，制备经交联的胶原蛋白；及
将所述经交联的胶原蛋白与微球混合，制备所述皮肤填充剂，其中，所述微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。
在其中一个实施例中，在用交联剂将所述胶原蛋白交联的步骤之前，还包括用EDTA二钠对所述胶原蛋白进行透析处理的步骤。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种皮肤填充剂，该皮肤填充剂包括经交联的胶原蛋白和微球。其中，胶原蛋白提取自人胎盘，微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。
胶原蛋白提取自人胎盘。人胎盘(placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，包括羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。胎儿在子宫中发育，依靠胎盘从母体取得营养，而双方保持相当的独立性。胎盘还合成多种激素、酶和细胞因子等，以维持正常妊娠。与传统的使用提取自猪、牛等动物的胶原蛋白作为主要成分的皮肤填充剂相比，上述皮肤填充剂的免疫原性更低；并且提取自人胎盘的胶原蛋白还含有生物活性因子，这些生物活性因子可以通过多种途径阻断或减轻炎症反应，发挥抗炎作用，降低术后感染，保护创面，减轻或消除创面疼痛。
在一个可选地具体示例中，胶原蛋白提取自人胎盘的羊膜。
在一个可选地具体示例中，胶原蛋白提取自人胎盘的叶状绒毛膜。
在一个可选地具体示例中，胶原蛋白提取自人胎盘的羊膜和人胎盘的叶状绒毛膜。
在本实施方式中，胶原蛋白是经过交联的胶原蛋白，与传统的直接用胶原蛋白作为主要成分的皮肤填充剂相比，经过交联之后的胶原蛋白更不容易在体内被胶原蛋白酶降解，使用寿命更长，稳定性更好。在一个可选地具体示例中，胶原蛋白用交联剂交联。交联剂的选择并没有特别限制，例如，交联剂可以选自环氧化合物、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、单宁酸及京尼平中的一种至少一种。
在一个可选地具体示例中，经交联的胶原蛋白的质量份数为1份～15份。具体地，经交联的胶原蛋白的质量份数为1份、3份、5份、8份、12份或15份。进一步地，经交联的胶原蛋白的质量份数为2份～8份。
微球作为填充剂的成分，起填充作用。上述皮肤填充剂在使用时，微球分散于经交联的胶原蛋白溶液中，减少了微球与组织直接接触的面积，提高了微球的生物相容性，且经交联的蛋白溶液将微球束缚于其中，也使得微球不易析出，进而使得上述皮肤填充剂在使用过程中不易形成肉芽肿。微球的材质没有特别限制，只要符合体内使用即可，例如可以是医用微球。
在一个可选地具体示例中，微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。进一步地，微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。
在一个可选地具体示例中，微球为实心微球。当然，在其他实施例中，微球不限于实心微球，还可以是空心微球或多孔微球。
在一个可选地具体示例中，微球为粉体。具体地，微球的粒径为1μm～300μm。进一步地，微球的粒径为10μm～250μm。更进一步地，微球的粒径为20μm～80μm。
在一个可选地具体示例中，微球的质量份数为20份～80份。具体地，微球的质量份数为20份、25份、30份、32份、36份、40份、45份、52份、56份、60份、74份或80份。进一步地，微球的质量份数为45份～60份。
在一个可选地具体示例中，上述皮肤填充剂中，经交联的胶原蛋白的质量份数为1份～15份，微球的质量份数为20份～80份。进一步地，上述皮肤填充剂中，经交联的胶原蛋白的质量份数为2份～8份，微球的质量份数为45份～60份。按照上述的质量份数设置经交联的胶原蛋白和微球可以兼顾可注射组合物的生物相容性及稳定性。
在一个可选地具体示例中，上述皮肤填充剂中，经交联的胶原蛋白与微球的质量之比为1：20～80。经交联的胶原蛋白和微球按照上述比例设置可使得上述皮肤填充剂具有良好的生物相容性和稳定性。进一步地，上述皮肤填充剂中，经交联的胶原蛋白与微球的质量之比为1：45～60。
在一些实施例中，上述皮肤填充剂还包括添加剂。添加剂用于丰富皮肤填充剂的功能。具体地，添加剂选自抗菌剂、麻醉剂、抗炎剂和抗氧化剂中的至少一种。
抗菌剂用于提高上述皮肤填充剂的抗菌效果，使得上述皮肤填充剂在使用、存储和运输过程中抗菌效果更好。在一个可选地具体示例中，抗菌剂为抗生素。具体地，抗菌剂选自庆大霉素和头孢菌素中的至少一种。当然，在其他实施例中，抗菌剂不限于上述，还可以是本领域常用的其他用于抗菌的物质。
麻醉剂用于使机体或局部机体暂时可逆性失去知觉及痛觉。在一个可选地具体示例中，麻醉剂为局部麻醉剂。具体地，麻醉剂为丁卡因及利多卡因中的一种。当然，在其他实施例中，麻醉剂不限于上述，还可以是其他用于麻醉的物质。
抗炎剂用于减少机体的炎症反应。在一个可选地具体示例中，抗炎剂选自奈帕芬胺和双氯芬酸中的至少一种。当然，在其他实施例中，抗炎剂不限于上述，还可以其他具有抗炎作用的物质。
抗氧化剂用于提高的抗氧化性。在一个可选地具体示例中，抗氧化剂选自维生素C、L-抗坏血酸2-葡萄糖苷(AA2G)、抗坏血酸磷酸钠(AA2P)中的至少一种。当然，在其他实施例中，抗氧化剂不限于上述，还可以其他具有抗氧化作用的物质。
在一个可选地具体示例中，上述皮肤填充剂中添加剂的质量份数为0.1份～2.0份。进一步地，上述皮肤填充剂中添加剂的质量份数为0.1份～1.5份。
具体地，以质量份数计，抗菌剂的份数为0～0.5份，麻醉剂的份数为0.1份～0.5份，抗炎剂的份数为0～1份，抗氧化剂的份数为0～2份。进一步地，以质量份数计，抗菌剂的份数为0.1份～0.2份，麻醉剂的份数为0.1份～0.2份，抗炎剂的份数为0.1份～0.5份，抗氧化剂的份数为0.5份～1份。
可以理解的是，在其他实施例中，添加剂的种类不限于上述，还可以是其他添加剂。当然，在一些实施例中，上述皮肤填充剂中还包括生理盐水。
上述皮肤填充剂包括经交联的胶原蛋白和微球，其中胶原蛋白提取自人胎盘，微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。通过经交联的提取自人胎盘的胶原蛋白与微球配合使用，使得皮肤填充剂中的微球悬浮于经交联的胶原蛋白溶液中，减少微球与组织的接触面积，同时微球被经交联的胶原蛋白束缚，也使得微球不易析出，从而使得上述皮肤填充剂具有较好的稳定性的同时也具有好的生物相容性。此外，采用人源的胎盘作为交联的胶原蛋白的原料，与传统的以自猪、牛等动物的组织作为原料提取的胶原蛋白作为主要成分的皮肤填充剂相比，上述皮肤填充剂注射到人体时免疫原性更低。
本发明一实施方式还提供了一种皮肤填充剂的制备方法，该方法包括步骤a～步骤c：
步骤a：提取人胎盘中的胶原蛋白。
具体地，提取人胎盘中胶原蛋白的方法为酸法、碱法、盐法和酶法中的至少一种。
在本实施方式中，提取人胎盘中胶原蛋白的方法包括以下步骤：
将人胎盘在乙酸中匀浆后用胃蛋白酶消化，然后离心弃去上清液，以去除部分蛋白质；然后用丙酮洗涤以除去脂质，得到粗产物；接着用EDTA二钠对粗产物进行透析处理，得到胶原蛋白。
具体地，采用的人胎盘的具体部位为羊膜和叶状绒毛膜中的至少一种。可以理解的是，也可以直接采用整个人胎盘作为提取胶原蛋白的原料。当然，在将人胎盘均浆之前还包括对胎盘进行预处理的步骤。
在一个可选地具体示例中，对胎盘进行预处理的步骤包括：用水清洗人胎盘以去除血凝块和碎屑。对于短期储存，可以将羊膜和绒毛膜置于抗生素溶液中，并保存于-20℃。
可以理解的是，在其他实施例中，消化均浆后的人胎盘的酶不限于胃蛋白酶，还可以是胰蛋白酶或胃蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶。去除脂质的试剂不限于丙酮，也可以是其他本领域常用的其他去除脂质的试剂。
进一步地，酶解消化人胎盘的步骤重复多次，即，多次重复将消化后的人胎盘的离心弃上清后，再加入胃蛋白酶进行再次消化、离心并弃上清的步骤。多次重复消化是尽量减少提取胶原中的杂质，包括细胞、杂蛋白、脂肪、多糖等引起免疫反应的物质，进一步降低免疫原性。
用EDTA二钠对粗产物进行透析处理利于皮肤填充剂植入后的原位聚合，进而利于上述皮肤填充剂的稳定性。可以理解的是，在其他实施例中，用EDTA二钠对粗产物进行透析处理的步骤可以省略。
在一个可选地具体示例中，提取人胎盘中胶原蛋白的方法包括以下步骤：
将处理好的组织在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用胃蛋白酶将其消化。然后将消化后的胎盘离心、弃去上清并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。然后称重沉淀，向沉淀中加入胃蛋白酶，接着均质化后在4℃～8℃下反应12小时～24小时，得到混合物；接着将混合物离心并弃去上清液，称重沉淀，再次重复向沉淀中加入多胃蛋白酶、均质化、消化反应一定时间、离心并弃上清，得到沉淀的步骤，得到沉淀物。接着将沉淀物溶解在0.5M乙酸中并离心、弃去沉淀后，向上清中加入2M～5M NaCl溶液，在4～8℃下放置过夜，然后再次离心，弃去上清液后，将沉淀物溶解于0.5M乙酸中，离心后，用EDTA二钠透析；透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
步骤b：用交联剂将胶原蛋白交联，制备经交联的胶原蛋白。
具体地，将交联剂与胶原蛋白混合，以使胶原蛋白交联。交联胶原蛋白所使用的交联剂如上文描述，此处不再赘述。
步骤c：将经交联的胶原蛋白与微球混合，制备皮肤填充剂。
具体地，经交联的胶原蛋白与微球的混合方式为搅拌混合。
在一个可选地具体示例中，将经交联的胶原蛋白与微球和水混合，制得皮肤填充剂。当然，在其他实施例中，可以根据需要制备的皮肤填充剂的剂型来决定是否加水及水的添加量。进一步地，皮肤填充剂还包括赋形剂。通过赋形剂以使皮肤填充剂达到所需的剂型。
在一个可选地具体示例中，皮肤填充剂中还包括添加剂，此时，将经交联的胶原蛋白、微球及添加剂混合，制备皮肤填充剂。进一步地，先将经交联的胶原蛋白与添加剂混合后，再与微球混合，得到皮肤填充剂。
需要说明的是，步骤c中的微球的种类、微球的用量、经交联的胶原蛋白的用量、添加剂的种类及添加剂的用量均如上文描述，此处不再赘述。
上述一种皮肤填充剂的制备方法制备简捷，制得的皮肤填充剂具有生物相容性好、免疫原性低及稳定性好的优点。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下实施例中。“M”表示mol/L；份数均为质量份数。
实施例1
(1)胎盘预处理：从胎盘组织提取胶原的方法：收集新鲜胎盘并手动将羊膜与绒毛膜分离。然后清除羊膜和绒毛膜中任何剩余的血凝块或碎屑。
(2)提取胶原：
1)将处理好的羊膜组织在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液按照均浆后的羊膜组织与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例将其消化。然后将消化后的组织离心；然后弃去上清液并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。接着在沉淀中按照沉淀与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例加入质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液，均质化，将混合物在4℃下反应12小时后，离心并弃去上清液，称重沉淀，进行3次胃蛋白酶、均质化和混合反应的步骤，弃去上清液，得到沉淀物。
2)将步骤1)得到的沉淀物溶解在0.5M乙酸中，离心，弃去沉淀。向上清液中加入2MNaCl溶液中，在4℃下放置过夜；然后再次离心，弃去上清液，将沉淀溶解于0.5M乙酸中，离心，用EDTA二钠彻底透析，进行4次透析液更换，透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
(3)交联胶原蛋白：将步骤(2)得到的胶原蛋白稀释到100mg/mL，得到胶原蛋白溶液；接着在胶原蛋白溶液中加入交联剂进行交联，交联结束后，采用透析方法除去多余的交联剂，得到经交联的胶原蛋白。其中，交联剂的质量与胶原蛋白的质量之比为0.05：1，交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比约为：1：2。
(4)添加添加剂：以质量份数计，将5份的步骤(3)得到的经交联的胶原蛋白、0.5份的麻醉剂、0.5份的抗氧化剂和49份的生理盐水混合均匀，得到混合物；其中，麻醉剂为利多卡因，抗氧化剂为L-抗坏血酸2-葡萄糖苷(AA2G)。
(5)将45份的微球与步骤(4)得到的混合物搅拌混合，使得微球分散于步骤(4)得到的混合物中，得到皮肤填充剂，其中，微球为甲基丙烯酸甲酯微球，微球粒径为20μm～80μm。
实施例2
(1)胎盘预处理：从胎盘组织提取胶原的方法：收集新鲜胎盘并手动将羊膜与绒毛膜分离。然后清除羊膜和绒毛膜中任何剩余的血凝块或碎屑。
(2)提取胶原：1)将处理好的绒毛膜组织在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液按照均浆后的绒毛膜组织与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例将其消化。然后将消化后的组织离心；然后弃去上清液并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。接着在沉淀中按照沉淀与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例加入质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液，均质化，将混合物在4℃下反应24小时后，离心并弃去上清液，称重沉淀，四次进行胃蛋白酶、均质化和混合反应的步骤，弃去上清液，得到沉淀物。
2)将步骤1)得到的沉淀物溶解在0.5M乙酸中，离心，弃去沉淀。向上清液中加入2MNaCl溶液中，在8℃下放置过夜；然后再次离心，弃去上清液，将沉淀溶解于0.5M乙酸中，离心，用EDTA二钠彻底透析，三次进行透析液更换，透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
(3)交联胶原蛋白：将步骤(2)得到的胶原蛋白稀释到100mg/mL，得到胶原蛋白溶液；接着在胶原蛋白溶液中加入交联剂进行交联，交联结束后，采用透析方法除去多余的交联剂，得到经交联的胶原蛋白。其中，交联剂的质量与胶原蛋白的质量之比为0.05：1，交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺。
(4)添加添加剂：以质量份数计，将1份的步骤(3)得到的经交联的胶原蛋白、0.1份的麻醉剂和18.9份的生理盐水混合均匀，得到混合物；其中，麻醉剂为丁卡因。
(5)将80份的微球与步骤(4)得到的混合物搅拌混合，使得微球分散于步骤(4)得到的混合物中，得到皮肤填充剂，其中，微球为羟基磷灰石微球，微球粒径为1μm～300μm。
实施例3
(1)胎盘预处理：从胎盘组织提取胶原的方法：收集新鲜胎盘并手动将羊膜与绒毛膜分离。然后清除羊膜和绒毛膜中任何剩余的血凝块或碎屑。
(2)提取胶原：
1)将处理好的羊膜组织在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液按照均浆后的羊膜组织与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例将其消化。然后将消化后的组织离心；然后弃去上清液并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。接着在沉淀中按照沉淀与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例加入质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液，均质化，将混合物在8℃下反应18小时后，离心并弃去上清液，称重沉淀，3次进行胃蛋白酶、均质化和混合反应的步骤，弃去上清液，得到沉淀物。
2)将步骤1)得到的沉淀物溶解在0.5M乙酸中，离心，弃去沉淀。向上清液中加入3MNaCl溶液中，在8℃下放置过夜；然后再次离心，弃去上清液，将沉淀溶解于0.5M乙酸中，离心，用EDTA二钠彻底透析，4次进行透析液更换，透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
(3)交联胶原蛋白：将步骤(2)得到的胶原蛋白稀释到100mg/mL，得到胶原蛋白溶液；接着在胶原蛋白溶液中加入交联剂进行交联，交联结束后，采用透析方法除去多余的交联剂，得到经交联的胶原蛋白。其中，交联剂的质量与胶原蛋白的质量之比为0.08：1，交联剂为环氧化合物(乙二醇-乙醚-二环氧丙酯)。
(4)添加添加剂：以质量份数计，将8份的步骤(3)得到的经交联的胶原蛋白、0.1份的抗菌剂、0.5份的麻醉剂、1份的抗炎剂、0.5份的抗氧化剂和69.9份的生理盐水混合均匀，得到混合物；其中，抗菌剂为庆大霉素和头孢菌素的混合物，庆大霉素和头孢菌素的质量之比为：1：2；麻醉剂为利多卡因；抗炎剂为奈帕芬胺和双氯芬酸的混合物，奈帕芬胺和双氯芬酸的质量之比为1：1；抗氧化剂为抗坏血酸磷酸钠(AA2P)。
(5)将20份的微球与步骤(4)得到的混合物搅拌混合，使得微球分散于步骤(4)得到的混合物中，得到皮肤填充剂，其中，微球为聚-L乳酸微球和羟基磷灰石微球，聚-L乳酸微球和羟基磷灰石微球的质量之比为1：1；微球粒径为50μm～60μm。
实施例4
(1)胎盘预处理：从胎盘组织提取胶原的方法：收集新鲜胎盘并手动将羊膜与绒毛膜分离。然后清除羊膜和绒毛膜中任何剩余的血凝块或碎屑。
(2)提取胶原：
1)将处理好的羊膜和绒毛膜组织(质量之比1：1)在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液按照均浆后的组织与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例将其消化。然后将消化后的组织离心；然后弃去上清液并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。接着在沉淀中按照沉淀与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例加入质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液，均质化，将混合物在8℃下反应12小时后，离心并弃去上清液，称重沉淀，进行5次胃蛋白酶、均质化和混合反应的步骤，弃去上清液，得到沉淀物。
2)将步骤1)得到的沉淀物溶解在0.5M乙酸中，离心，弃去沉淀。向上清液中加入3MNaCl溶液中，在4℃下放置过夜；然后再次离心，弃去上清液，将沉淀溶解于0.5M乙酸中，离心，用EDTA二钠彻底透析，进行5次透析液更换，透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
(3)交联胶原蛋白：将步骤(2)得到的胶原蛋白稀释到100mg/mL，得到胶原蛋白溶液；接着在胶原蛋白溶液中加入交联剂进行交联，交联结束后，采用透析方法除去多余的交联剂，得到经交联的胶原蛋白。其中，交联剂的质量与胶原蛋白的质量之比为0.1：1，交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量之比为：1：1。
(4)将60份的微球与15份的步骤(3)得到经交联的胶原蛋白和25份的生理盐水搅拌混合，使得微球分散于步骤(3)得到的经交联的胶原蛋白中，得到皮肤填充剂，其中，微球为甲基丙烯酸甲酯微球和羟基磷灰石微球的混合物，甲基丙烯酸甲酯微球和羟基磷灰石微球的质量之比为1：1；微球粒径为20μm～80μm。
对比例1
(1)胎盘预处理：从胎盘组织提取胶原的方法：收集新鲜胎盘并手动将羊膜与绒毛膜分离。然后清除羊膜和绒毛膜中任何剩余的血凝块或碎屑。
(2)提取胶原：
1)将处理好的羊膜和绒毛膜组织(质量之比1：1)在0.5M乙酸中匀浆，用HCl将pH调节至2.5，并用质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液按照均浆后的组织与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例将其消化。然后将消化后的组织离心；然后弃去上清液并用丙酮洗涤沉淀以除去脂质。接着在沉淀中按照沉淀与胃蛋白酶溶液的体积之比为1:40的比例加入质量百分含量为5％的胃蛋白酶溶液，均质化，将混合物在8℃下反应12小时后，离心并弃去上清液，称重沉淀，进行5次胃蛋白酶、均质化和混合反应的步骤，弃去上清液，得到沉淀物。
2)将步骤1)得到的沉淀物溶解在0.5M乙酸中，离心，弃去沉淀。向上清液中加入3MNaCl溶液中，在4℃下放置过夜；然后再次离心，弃去上清液，将沉淀溶解于0.5M乙酸中，离心，用EDTA二钠彻底透析，进行5次透析液更换，透析结束后再次离心，弃去上清液，得到胶原蛋白。
(3)交联胶原蛋白：将步骤(2)得到的胶原蛋白稀释到100mg/mL，得到胶原蛋白溶液；接着在胶原蛋白溶液中加入交联剂进行交联，交联结束后，采用透析方法除去多余的交联剂，得到经交联的胶原蛋白。其中，交联剂的质量与胶原蛋白的质量之比为0.1：1，交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合物，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比约为：1：1。
(4)将10份的微球与15份的经交联的步骤(3)制得的胶原蛋白和75份的生理盐水搅拌混合，使得微球分散于胶原溶液中，得到皮肤填充剂，其中，微球为甲基丙烯酸甲酯微球和羟基磷灰石微球的混合物，甲基丙烯酸甲酯微球和羟基磷灰石微球的质量之比为1：1，微球粒径为20μm～80μm。
测试1
对实施例1～4和对比例1制得的胶原组合物的稳定性进行测试，具体操作如下：
将约2g的实施例1～实施例4的皮肤填充剂(各实施例的皮肤填充剂的质量具体见表1)和对比例1的皮肤填充剂，分别放置于具有300μm孔的网袋中。然后将各个装有皮肤填充剂的网袋分别放置于不同的100mL离心管中，并且向每个离心管中添加50mL水，使得装有皮肤填充剂的网袋浸没在水中。然后在样品静置预定的时间(见表1)后，将离心管中的微球沉淀物洗涤后进行干燥，称重，计算离心管中释放到水中的微球的含量，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002540731480000161
Figure BDA0002540731480000171
由表1可以看出，微球含量为20％～80％时，微球溶出率较低，皮肤填充剂稳定。
测试2
对实施例1～4及对比例1制得的皮肤填充剂的抗降解性进行测试，具体操作如下：
(1)取2g各实施例和对比例1的皮肤填充剂，冷冻干燥(干燥条件：冷冻真空干燥-18小时)，干燥后精确称量样品的质量，记为M0。
(2)以0.05M的三羟甲基氨基甲烷-HCl为缓冲液(pH 7.4)，制备浓度为3.5U/mL的胶原酶溶液(Sigma，来源于溶组织梭菌，货号：C0130，CAS：9001-12-1)；然后将冷冻干燥后的各个皮肤填充剂分别加入对应的含有50mL胶原酶溶液的试管中，在37℃的恒温水槽中缓慢震荡，24h后，将各个试管中残留的皮肤填充剂用水洗净并冷冻干燥(干燥条件：冷冻真空干燥18小时)后精确称量样品的质量，记为M1。平行样品数为3，计数取平均值，利用以下公式计算各皮肤填充剂的残留率：
残留率＝M1/M0×100％
其中，M0＝酶解前样品的质量；M1＝酶解后样品的质量；
各实施例的皮肤填充剂的残留率的结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002540731480000172
Figure BDA0002540731480000181
由表2可知，实施例1～4的皮肤填充剂具有良好的抗胶原酶降解性，稳定性高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种皮肤填充剂，其特征在于，包括经交联的胶原蛋白和微球，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘中提取的胶原蛋白经交联而成，所述微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种；其中，以质量份数计，所述经交联的胶原蛋白的份数为1份～15份，所述微球的份数为20份～80份。
2.根据权利要求1所述的皮肤填充剂，其特征在于，所述胶原蛋白用交联剂交联，所述交联剂选自环氧化合物、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、单宁酸及京尼平中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的皮肤填充剂，其特征在于，所述微球的粒径为1μm～300μm。
4.根据权利要求1所述的皮肤填充剂，其特征在于，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘的羊膜中提取的胶原蛋白经交联而成；及/或，所述经交联的胶原蛋白是由人胎盘的叶状绒毛膜中提取的胶原蛋白经交联而成。
5.根据权利要求1～4任一项所述的皮肤填充剂，其特征在于，还包括添加剂，所述添加剂选自抗菌剂、麻醉剂、抗炎剂和抗氧化剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的皮肤填充剂，其特征在于，以质量份数计，所述添加剂的质量份数为0.1份～2.0份。
7.根据权利要求5所述的皮肤填充剂，其特征在于，所述抗菌剂为抗生素；及/或，所述麻醉剂为局部麻醉剂。
8.根据权利要求5所述的皮肤填充剂，其特征在于，所述抗菌剂选自庆大霉素和头孢菌素中的至少一种；及/或，
所述麻醉剂为丁卡因和利多卡因中的至少一种；及/或，
所述抗炎剂选自奈帕芬胺和双氯芬酸中的至少一种；及/或，
所述抗氧化剂选自维生素C及抗坏血酸磷酸钠中的至少一种。
9.一种皮肤填充剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取人胎盘中的胶原蛋白；
用交联剂将所述胶原蛋白交联，制备经交联的胶原蛋白；及
将所述经交联的胶原蛋白与微球混合，制备所述皮肤填充剂，其中，以质量份数计，所述经交联的胶原蛋白的份数为1份～15份，所述微球的份数为20份～80份；所述微球选自聚甲基丙烯酸甲酯微球、聚己内脂微球、聚-L乳酸微球、聚乙醇酸微球和羟基磷灰石微球中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的皮肤填充剂的制备方法，其特征在于，在用交联剂将所述胶原蛋白交联的步骤之前，还包括用EDTA二钠对所述胶原蛋白进行透析处理的步骤。
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