JPS6054288B2 - 軟組織強化用コラ−ゲン移植物質及び移植方法 - Google Patents

軟組織強化用コラ−ゲン移植物質及び移植方法

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JPS6054288B2
JPS6054288B2 JP57212109A JP21210982A JPS6054288B2 JP S6054288 B2 JPS6054288 B2 JP S6054288B2 JP 57212109 A JP57212109 A JP 57212109A JP 21210982 A JP21210982 A JP 21210982A JP S6054288 B2 JPS6054288 B2 JP S6054288B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体組織の治療用組成物及び治療法に関する。
特に、本発明は容量安定性のすぐれた、啼乳動物におけ
る軟組織強化用コラーゲン移植物質に関する。 コラー
ゲンは製剤担体、外科的補綴物(縫合糸及び包帯用品)
、及び移植(インプラント)物質として使用されている
多くの場合、コラーゲンはその機械的性質の向上、その
免疫原性の低下やその耐吸収性の向上を計るために化学
薬品、放射線その他の手段によつて架橋される。 米国
特許第3949073号公報には、軟組織強化のための
注射可能な移植物質としてコラーゲンのアテロペプチド
溶液を使用することが記載されている。
この公報の記載によれば、移植する前にコラーゲンを再
構成するが、これは移植されると、線維組織体になる。
また、この公報には、強化部位に形成された線維体の収
縮を制御するために、不溶性のコラーゲンのミクロフイ
ブリルを加えることが示唆されている。上記公報に記載
されている物質の市販品はZYDERMコラーゲンイン
プラントであるが、これは少量の局所麻酔薬を含有する
再構成アテロペプチド塩化ナトリウム水溶液からなる。
この市販品の効果は顕著であるが、移植されると、主に
その液体成分が体組織に吸収されるため、収縮すること
がある。従つて、時には1永続性ョと呼はれることもあ
る容量不変性が本質的に重要である場合には、補充用移
植物質を注射(一度とは限らない)により追加しなけれ
ばならない。本発明の目的は容量安定性即ち容量永続性
のすぐれたコラーゲン系移植物質を提供することにある
即ち、本発明の移植物質は(a)粒状の架橋アテロペプ
チドコラーゲンと、そして(b)再構成アテロペプチド
コラーゲン線維との(c)水性担体中分散から成る注射
可能な分散液である。
この物質は被強化部位に注射することによつて軟組織を
強化するために使用される。
本発明による移植物質は現在利用されているコラーゲン
移植物質よりもかなり容量永続性がすぐれている。本発
明て使用するコラーゲンは非架橋型のものと、架橋型の
ものがあるが、いずれも多くの噛乳動物源から採取され
たコラーゲンから誘導したものであればよい。供与体は
コラーゲン物質が最終的に移植される受容体と遺伝学的
に同一である必要はない。入手し易さのため、通常牛ま
たは豚の真皮を利用する。いずれの型のコラーゲンを作
る場合にもその第1工程は上記真皮からアテロペプチド
コラーゲン溶液を作ることである。動物の皮膚は中程度
(マイルド)の酸に浸し、次に体も、表皮や脂肪をこす
り落すと軟化する。次に、このようにして脱毛した皮膚
を再び中程度の酸に浸し−てから、麻酔、細切断やミリ
ングなど物理的方法によつて粉砕する。この粉砕により
皮膚は可溶化できる状態になる。粉砕した組織は水性の
酸媒体に分散させ、コラゲナーゼ以外のタンパク質が水
分解酵素で消化すると、(変性させずに)可溶化させる
ことができる。
低温のときには、通常変性を避けるために、希酸溶液を
使用する。HClなどの鉱酸や酢酸、マロン酸、乳酸な
どのカルボン酸は約5〜25℃の温度で、PHが約1.
5〜5の範囲内にあると使用できる。20′Cの約2の
PHで1〜5yIeの濃度になるまで粉砕組織をHCl
に分散させるのが好ましい。
組織の分散後、酵素を加え、そして混合物を培養jして
酵素によりコラーゲンのテロペブチド部分及び組織の他
の可溶化成分を消化させる。酵素としては、コラーゲン
のヘリックス部を変性させずに、テロペプチド部分を消
化するものを使用する。例示すれば、トリプシン、ペプ
シン、キモトリプシン及びパパインがある。失活及び可
溶化されたコラーゲンからの分離が比較的簡単であるた
め、ペプシンが好ましい。通常、酵素濃度はコラーゲン
に対して約0.1〜1鍾量%の範囲内にあればよい。培
養時間は例えば約2日間〜2週間の間・から選択すれば
よい。可溶化の進行は溶液の粘度を求めて調べればよい
。粘度がほぼ一定値に達したところが、可溶化の終了点
であり、この時点で酵素を失活(変性)させ、分離する
。酵素の失活は水酸化ナトリウムなどのアルカリ性分質
を添加して、溶液のPHを少なくとも約7にすれは実施
てきる。
酵素を失活(変性)させた後、溶液を処理して変性させ
た酵素及び可溶化時に消化された組織部分を分離する。
この分離には各種の透析法、沈殿法やろ過法が適用でき
る。例えば、米国特許第949073号公報の第3欄1
0〜2桁の記載、及び同第4140537号公報の第5
欄4桁から第6欄34行の記載をみられたい。なお、こ
れら記載は本明細書に利用されている。好適な実施態様
では、ます最初に酸を加えてPHを下げてから、けいそ
う土沈殿法により溶液を清澄化する。沈殿物を枦過し、
そして枦液を濃縮する。次に、イオン交換クロマトグラ
フィー法によつて濃縮物を分別し、さらに濃縮して実質
的に純粋なアテロペプチドコラーゲン溶液にする。この
溶液を使用すれば、本発明に使用する架橋型及び非架橋
型コラーゲン線維を作ることができる。低温で緩衝剤を
用いて溶液を中和することによつて線維コラーゲンを作
るのが好ましい。
中和溶液のイオゾ強度は約0.03〜0.3で、そのP
Hは約7.2〜7.4である。好適な緩衝剤はNa2H
PO4である。このようにPHが大きくなると、コラー
ゲンがアテロペプチドフイブリルに再会合される。これ
らフイブリルを上澄液から分離して、架橋ゲル粒子と合
わせる。コラーゲンをまず再構成してからこれを架橋し
て、溶液から架橋粒子を作る。
低温で緩衝剤及び塩基を加え、溶液の濃度を約7.4〜
7.6に上げてから、温度を適当な温度即ち26〜詔℃
に上げることによつて再構成を行うのが好適である。こ
のような条件下においてコラーゲンは自然に再会合する
。再構成コラーゲンを作つた後、コラーゲン連鎖間(ペ
プチド鎮間)に共有結合を形成する架橋剤にさらして架
橋を行う。放射線誘導架橋か化学作用誘導架橋を適用す
ればよい。非粒子放射線(紫外線、ガンマ線、X線)ま
たは粒子放射線(α粒子、陽子、β粒子、電子)のいず
れもが適用できる。使用できる化学的架橋剤にはホルム
アルデヒド、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、
グリオキシサールピルピン酸アルデヒド、ジアルデヒド
殿粉、キノン類、ヒドロキノン類、ジメチロールアセト
ン及びジビニルスルホンなどの医療用蛋白質を架橋する
ために通常使用されているものがある。好ましい架橋剤
はグルタルアルデヒドである。コラーゲンの架橋度は架
橋条件、特に架橋剤の濃度、温度及び反応時間の影響を
受ける。
間接的には、架橋度は通常分子量変化、ゲル化特性、膨
潤特性や引張り特性例えばヤング率などの物理的測定値
で表わされる。遠心分離による濃縮前のヤング率が約1
000〜10000ダイン/Cfiの範囲にあり、また
以下に述べる遠心分離後のヤング率が約5000〜50
000タイン/Crlの範囲内にあるように条件及び架
橋剤を選択するのが好ましい。グルタルアルデヒドを用
いる場合には、15〜30℃で約3紛〜2CB!間コラ
ーゲンゲル1yにつき0.004〜4哩のグルタルアル
デヒドを用いて反応を行うと、好適な架橋を行うことが
できる。通常、グルタルアルデヒドは希薄水溶液として
コラーゲンゲルに加える。所望の間反応させた後、架橋
ゲルを洗浄して架橋剤を取除き、次に蛋白質濃度が約1
0〜100m91m1になるまで沖過又は遠心分離によ
つて濃縮する。次に、得られた濃縮ゲルに中程度のせん
断応力を作用させて、等量粒子径(EquivaIen
tsphericaIdiameter)約50〜20
0μの均一な球状粒子に粉砕する。コラーゲンゲルを粉
砕するためには高速粉砕機(Gr″Ater)やナイフ
ミルが使用できる。線維コラーゲン及び架橋コラーゲン
粒子は適当な非経口水性担体に分散させる。
分散液は注射器又はその他の注入装置に入れる。通常、
線維コラーゲンは分散液中全コラーゲンの約5〜3鍾量
%好ましくは15〜25重量%を占め、そして架橋ゲル
は分散液中全コラーゲンの約70〜部重量%好ましくは
75〜85重量%を占める。線維コラーゲンと架橋コラ
ーゲンとを20:80の重量比で含む分散液が特に好適
である。移植組成物には局所麻酔薬などの添加剤を少量
配合することができる。水性担体は受容体にとつて生理
的に許容できる媒体でなければならない。従つて、その
イオゾ強度及びPHが生理的であるべきである(即ち、
イオン強度及びPHはそれぞれ0.1〜0.2及び6.
8〜7.5)。好適な担体は塩化ナトリウム水溶液であ
る。分散液の全コラーゲン濃度は通常約15〜80m9
ht1好ましくは40〜60m91m1の範囲内にある
。上記の本発明コラーゲン移植物質は軟組織の強化、先
天性異常、後天性欠損や化粧品による欠損の治療や矯正
を目的として皮内注射することができる。
これらの例には顔面半側形成不全症、頬及ぼ頬骨の減形
成症、一側性の乳房減形成症、漏斗胸、胸筋の発育不全
又は無形成(ポーランド異常)及び口蓋裂や粘膜下口蓋
裂治療(咽頭後方移植片として)に伴う口蓋帆咽頭の機
能不全などの”先天性異常、陥凹痩痕、(例えばDLE
円盤状エリテマトーデスに伴う)粘膜下萎縮症、摘出眼
の眼球陥没(上側頭溝症)、顔面の座瘉陥凹、粘度下萎
縮症を伴う線形強皮(硬皮)症、鞍鼻症、ロンベルグ病
や一側性声帯麻痺などの(外傷、外科手.術、感染後の
)後天性欠損、及び眉間の渋面線、深い鼻唇ひだ、口周
辺の幾何学的しわ、頬陥没及び乳房の減形成症などの化
粧品による欠損がある。以下実施例により本発明の移植
物質、これの使ノ用方法及び本発明の内移植物質から得
られる内移植片の長所を説明するが、本発明はこれら実
施例の制限を受けるものではない。
コラーゲン物質及び方法 牛のアテロペプチドコラーゲン溶液の調製牛の皮膚を軟
化させ、HCl処理によつて脱毛した。
次に、脱毛した皮膚を粉砕し、PH2のHClに8〜1
1f11eの量で分散させた。全蛋白質に対して0.1
重量%のペプシンをこの分散液に加え、混合物を15〜
20℃で約100〜30C@間培養した。次に、NaO
Hを加えて、培養媒体のPHを約7に上げ、これによつ
て消化を中止させた。低いPHで沈殿法によつて反応混
合物から失活(変性)酵素を取除いた。次に、溶液を浄
化し、淵過及びクロマトグラフィーによつて濃縮して、
牛のアテロペプチドコラーゲンの希塩酸(PH)溶液3
Tn91m1を作つた。以下この溶液をCISと呼ぶ。
線維コラーゲンの調製 18℃でCISに0.02MNaHP04を加えそのP
Hを7.4に上げて、CISから線維コラーゲンを再構
成した。
析出沈殿した線維コラーゲンを上澄液から分離し、濃縮
してから、NaCl及びNa28O4を用いて生理的P
H及びイオン強度まで均質化した。得られた分散液のコ
ラーゲン濃度は35m9′mlであつた。架橋ゲル粒子
の調製 0℃で1.3I1!4NaC1と0.yNa2HP04
とからなる緩衝剤とCISを混合し、0.1NNa0H
を用いて混合物のPHを7.4〜7.6に上げた。
次に混合物の温度を34℃に上げ、この温度を2時間維
持して、この間に−溶液をゲル化させた。グルタルアル
デヒドの生理的リン酸塩緩衝剤溶液、PH7.4(ゲル
中のコラーゲン1y当りグルタルアルデヒド280m9
)0.4重量%にこのゲルを加え、1時間反応させた。
リン酸塩緩衝剤で得られ!た架橋ゲルを繰返し洗浄して
アルデヒドを取除いた。次に、蛋白質濃度が約30m9
1WL1(定量ニンヒドソン法によつて測定)になるま
でゲルを遠心分離した。このゲルをサンプリングし、そ
のヤング率を下記の文献に記載されている方法で求めた
。CMechanicalPrOpertiesOfP
OlymersarKiCOmpOsitiOnsVO
l.lDEkkerNewYOrkl974、Ppl−
501ndG0rd0n,.eta1Natur′eλ
口ニ735(1968)遠心分離したコラーゲンはゲル
の強靭度に応じ1て幾つかの方法から選択したいずれか
の方法によつて粉砕した。
強度の低いコラーゲンゲルは#12ゲージロ径の管によ
つて接続した2本の注射器間で往復押出しすることによ
つて粉砕できた。強度のより大きいゲルの場合には、ダ
ブル注射器法を適用する前に細かく切断してストリップ
にしなければならなかつた。いつたん架橋調製物を均質
化した後は、線維コラーゲンをこれらと混合し、そして
注射器と注射器の間を通すことによつてさらに均質化す
ることができた。移植物質の調製 各種割合で線維コラーゲン分散液を架橋コラーゲン粒子
と混合し、無菌注射器に入れた。
対照と”して、分散液及びゲルをそれぞれ単独に無菌注
射器に入れた。移植 受容体として体重が125±20fのSpmn渋EDa
wIey系のめすのラットを用いた。
各ラットの2つの部位に移植を施した。
即ち、左背側の頭蓋部には対照として線維コラーゲンの
みを、そして右背側の頭蓋部には線維コラーゲンを混合
した、あるいはこれと混合していないグルタルアルデヒ
ド架橋コラーゲンを移植した。#18ゲージ針を用いて
皮下注射を行つた。架橋コラーゲン単独の注射は難しか
つた。所定量(通常は約0.5y)を注射した。5〜5
0日間の間隔を置いて本発明のサンプル及び対照サンプ
ルを外移植(エクスプラント)した。
コラーゲン移植(インプラント)片から注意しながら受
容体の組織を切り離し、湿重量を記録した。移植(イン
プラント)した重量から重量回復率(永続性)を求めた
。次に、計量した試料を包理、切断し、そして組織学的
検査のために染色した。使用した染色法にはヘマトキシ
ソ/エオシン法、三色染色法及びフオン・コツサ染色法
が含まれていた。結果 本発明の移植物質及び対照物質の移植結果を下記の表に
示す。
架橋コラ―ゲンかなり広範囲に (57〜/蛋白わたる細胞侵入 以上の結果から判るように、非架橋線維コラーゲンと架
橋コラーゲンを組合せてなる移植物質は非架橋線維コラ
ーゲンのみを含む移植物質よりも永続性がかなりすぐれ
ている。
架橋コラーゲン移植物質の方が永続性がすぐれているが
、但し、これは注射が難しかつた。非架橋コラーゲンど
架橋コラーゲンを組合せてなる移植物質は注射の点から
みても許容できた。組織学的には、上記三物質のすべて
が生体適合性であつた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 (a)粒状架橋アテロペプチドコラーゲンと、(b
    )再構成線維アテロペプチドコラーゲンとの、(c)水
    性担体中における、分散液からなることを特徴とする軟
    組織強化用の注射可能な移植物質。 2 前記水性担体のpH及びイオン強度が実質的に生理
    的なものである特許請求の範囲第1項に記載の移植物質
    。 3 分散液中の全コラーゲン量が約15〜約80mg/
    mlの範囲にある特許請求の範囲第1項に記載の移植物
    質。 4 架橋コラーゲンが分散液中の全コラーゲン量の約7
    0〜約95重量%を占め、線維コラーゲンが分散液中の
    全コラーゲン量の約5〜約30%を占める特許請求の範
    囲第1〜3項の一に記載の移植物質。 5 架橋コラーゲンの粒径が約50〜約200μmの範
    囲内にあり、架橋コラーゲンのヤング率が約5000〜
    約50000ダイン/cm^2である特許請求の範囲第
    4項に記載の移植物質。 6 架橋コラーゲンがグルタルアルデヒドで架橋したも
    のである特許請求の範囲第5項に記載の移植物質。 7 水性担体のpH及びイオン強度が実質的に生理的な
    ものであり、分散液中の全コラーゲン量が40〜60m
    g/mlの範囲にあり、架橋コラーゲンが分散液中の全
    コラーゲン量の75〜85重量%を占めると共に、線維
    コラーゲンが分散液中の全コラーゲン量の15〜25重
    量%を占め、かつ架橋コラーゲンの粒径及びヤング率が
    それぞれ約50〜約200μm及び約5000〜約50
    000ダイン/cm^2の範囲にある特許請求の範囲第
    1項に記載の移植物質。 8 分散液が(d)局所麻酔薬を含有する特許請求の範
    囲第1項又は第7項に記載の移植物質。
JP57212109A 1982-01-11 1982-12-04 軟組織強化用コラ−ゲン移植物質及び移植方法 Expired JPS6054288B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

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US338661 1982-01-11

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US (1) US4424208A (ja)
EP (1) EP0083868B1 (ja)
JP (1) JPS6054288B2 (ja)
CA (1) CA1199580A (ja)
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