CN109157672A - 一种丝素-短肽凝血微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丝素‑短肽凝血微球的制备方法。由丝素和短肽复合而成,短肽为RGD、TI或者LD;将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解获得丝素蛋白溶液;将丝素蛋白溶液与短肽混匀,注入无水乙醇自组装再超声冷冻,取出后使融化为乳白色溶液,经第一次离心后倒去上清液得到丝素蛋白颗粒,再经第二次离心后用去离子水洗涤两次,两次离心后超声第三次离心,弃去底部沉淀从而得到丝素蛋白微球悬浮液,超声后立刻冷冻;取出冷冻好的悬浮液,冷冻干燥所得丝素短肽微球粉末。本发明获得的产物具有优良的生物相容性,用途广泛,同时能配制溶液注射使用以及治疗体内脏器出血的凝血和外部创伤的凝血,环保无污染。
Description
技术领域
本发明涉及医疗临床治疗技术领域,具体地说,是一种快速止血材料的制 备方法。
背景技术
出血是创伤后主要并发症,出血过多必将引起休克,危及生命。因此及时 有效止血对挽救患者生命具有重要意义。有效的止血不但是内外科手术中急需 解决的重要问题,也是战、创伤中提高伤员生存率的关键。出血后如何止血的 问题一直困扰着人类。随着科学技术的不断发展,骨蜡等非可吸收性止血材料 已大量应用于临床,但这些非可吸收性止血材料引起的术区感染和其他并发症 在所难免,而各种新型医用敷料不断出现,性能也越来越优良,但这些新型敷 料或多或少都存在着一些缺陷。近年来医用可吸收止血材料引起了各国医学界 和产业界的高度重视,许多大型医药公司都致力于研发新型止血材料。发出新 一代的快速止血和功能性止血材料势在必行,只要这样才能适应更高的手术要 求,为人类健康提供良好保障。
目前常用的止血材料有可吸收纤维蛋白胶、壳聚糖、可吸收性明胶海绵、 α-氰基丙烯酸酯类组织胶、氧化纤维素和氧化再生纤维素。然而这些生物止血 材料存在着自身的优势和劣势,有的止血效果欠佳,有的降解过程中会有毒副 物产生且可能会发生排异反应,有的很难保存或是制作成本太高。更为重要的 是,上述止血材料都是针对人体外部创伤出血所使用的材料,而对体内器官、 组织出血没有效果。至今为止,尚无一种针对机体内外创伤出血、无毒性、无 抗原性、不影响组织愈合、成本低廉的理想止血材料。因此,研究出一种综合 性能高的止血材料,成为生物材料领域共同的热点和之一。
丝素蛋白含有对人体极具营养价值的18种氨基酸,家蚕丝蛋白因其独特的 力学性能和良好的生物相容性、抗菌性、无过敏性、降解性,以及本质是蛋白 质的结构特点,经处理后可以得到再生丝素蛋白纤维、丝素蛋白粉末、丝素蛋 白膜、丝素多孔材料等,在生物医学领域有着广泛的应用。然而至今为止,还 没有一种丝素蛋白生物材料应用于快速凝血以及机体内部创伤凝血领域。
发明内容
针对传统止血材料的不足,本发明改进出了一种丝素微球凝血材料,是一 种使用方便、保存简单、可以抑制体内出血的新型材料。
本发明利用丝素独特的物理化学性质,与具有凝血功能的短肽复合,制备 一种能模拟血小板高度形变的凝血微球的止血材料,给静脉出血的大鼠注射5 mg/mL凝血微球溶液后发现小鼠伤口凝血时间明显缩短,给断尾小鼠的创口涂 抹适量微球粉末后,出血时间减少,因此该材料可应用于止血领域,能够作为 一种理想的注射型止血材料。
本发明的具体技术方案如下:
一、一种丝素-短肽凝血微球:所述微球是由丝素和短肽复合而成。
所述的短肽为RGD、TI或者LD,短肽RGD、TI和LD的氨基酸序列分别 为RGD、TRYLRIHPQSQVHQI、LPCDYYGTCLD。
二、一种丝素-短肽凝血微球的制备方法:
(1)将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解在中性盐溶液中,经过过滤、透 析、浓缩后获得0.2%-5%的丝素蛋白溶液;
(2)将步骤(1)中的丝素蛋白溶液与短肽按重量分数比为200:1-9:1 的比例混合均匀,用移液枪注入无水乙醇,使得乙醇终浓度为10%-50%,并混 合均匀待其自组装一段时间,使用小功率超声仪超声1-10min;
(3)将步骤(2)得到的溶液在-20摄氏度中冷冻24h;
(4)将步骤(3)中的溶液取出后使融化为乳白色溶液,经第一次离心后 倒去上清液得到丝素蛋白颗粒,再经第二次离心后用去离子水洗涤两次,两次 离心后超声,接着再进行第三次离心,然后弃去底部沉淀从而得到单分散性较 好的丝素蛋白微球悬浮液,用小功率超声仪超声3min;
(5)将步骤(4)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱,冷冻24h;
(6)取出冷冻好的悬浮液,在冷冻干燥机中冷冻干燥24h,所得即为丝素 短肽微球粉末。
所述的步骤(2)中的短肽为RGD、TI或者LD,短肽RGD、TI和LD的 氨基酸序列分别为RGD、TRYLRIHPQSQVHQI、LPCDYYGTCLD。
所述的步骤(2)中的短肽为促进凝血而添加的凝血因子,来源于机体中凝 血因子的蛋白核心序列。
所述步骤(4)中,第一次离心以8000rpm的速度离心15min,第二次离心 的离心速和第一次离心相同,第三次离心以500rpm的离心速度离心15min。
所述的中性盐溶液为9mol/L的LiBr溶液、质量分数为50%的氯化钙溶液。
所述方法制成的丝素-短肽凝血微球既能用于外部创伤,又能用于注射。
制成的丝素短肽微球具有很好的促进血液凝固的功能,可直接将丝素-短肽 凝血微球粉末外敷在创伤出血部位进行凝血;也能够将丝素-短肽凝血微球粉末 溶于生理盐水,通过注射器注入体内,用于脏器出血部位的凝血。
与现有技术相比,本发明具有以下突出特点:
(1)优良的生物相容性;原料中使用的丝素蛋白和短肽都为天然活性物质, 丝素蛋白普遍应用于生物医疗材料行业,不对皮肤产生刺激。短肽来自人体中 天然存在的成分,不会对人体产生危害。
(2)用途广泛,同时能配制溶液注射使用以及治疗体内脏器出血的凝血和 外部创伤的凝血。
(3)保存简单,冷冻干燥后的粉末保存在低温,干燥状态下即可。
(4)针对现有止血材料存在的问题,提供了一种制作简单,适合于大规模 生产的方法。
附图说明
图1为实施例2中所制备丝素短肽微球扫描图;
图2为实施例3中所制备的丝素短肽微球粉末对小鼠断尾创伤部位的凝血 效果图:(a)未添加丝素短肽微球粉末在1min 40s时的照片,断尾处依然在出 血,(b)添加丝素短肽微球粉末在1min 40s时的照片,断尾处已经止血;
图3为实施例4中所制备的丝素短肽微球对大鼠体内静脉血管创伤部位的 凝血效果柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明,以下实施 例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
本发明的实施例如下:
实施例1
(1)用9mol/L的LiBr溶液溶解脱胶后的蚕茧纤维,经过过滤、透析、浓 缩后获得0.2%的丝素蛋白溶液;
(2)将9mL步骤(1)中的丝素蛋白溶液与2mg短肽(TI)混合均匀, 用移液枪快速注入无水乙醇1mL并混合均匀,待其自组装2min;
(3)将(2)中得到的溶液用小功率超声仪超声3min;
(4)将(3)得到的溶液,在-20摄氏度中冷冻24h;
(5)取出后使其缓慢融化为乳白色溶液,以8000rpm的速度离心15min, 倒去上清液即得到丝素蛋白颗粒,在同样的离心速度下用去离子水洗涤两次, 两次离心后超声15min后以500rpm的离心速度离心15min,弃去底部沉 淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液。
(6)将(5)所得悬浮液用小功率超声仪超声3min;
(7)将(6)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱,冷冻24h;
(8)取出冷冻好的悬浮液,在冷冻干燥机中冷冻干燥24h,所得即为丝素 短肽微球粉末。
(9)将实验小鼠进行断尾(尾部约4cm处截断),再将所得丝素短肽微 球粉末5mg贴敷在断尾处。丝素短肽微球粉末组在1min 40s后即停止出血,而 未添加丝素短肽微球粉末组在8min之后才流血停止。可见,本发明的凝血材料 不但大大降低出血速率,而且出血总量也得到了显著的减少。
实施例2
(1)用9.3mol/L的LiBr溶液溶解脱胶后的蚕茧纤维,经过过滤、透析、 浓缩后获得2%的丝素蛋白溶液;
(2)将8mL丝素蛋白溶液与4mg短肽(RGD)混合均匀,用移液枪快速 注入无水乙醇2mL并混合均匀,待其自组装2min;
(3)将(2)中得到的溶液用小功率超声仪超声3min;
(4)将(3)得到的溶液,在-20摄氏度中冷冻24h;
(5)取出后使其缓慢融化为乳白色溶液,以8000rpm的速度离心15min, 倒去上清液即得到丝素蛋白颗粒,在同样的离心速度下用去离子水洗涤两次, 两次离心后超声15min后以500rpm的离心速度离心15min,弃去底部沉 淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液。
(6)将(5)所得悬浮液用小功率超声仪超声3min;
(7)将(6)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱,冷冻24h;
(8)取出冷冻好的悬浮液,在冷冻干燥机中冷冻干燥24h,所得即为丝素 短肽微球粉末。
本实施例所制备丝素短肽微球扫描结果如图1所示。
实施例3
(1)用质量分数为50%的氯化钙溶液溶解脱胶后的蚕茧纤维,经过过滤、 透析、浓缩后获得5%的丝素蛋白溶液;
(2)将8mL丝素蛋白溶液与2mg短肽(LD)混合均匀,用移液枪快速 注入无水乙醇8mL并混合均匀,待其自组装2min;
(3)将(2)中得到的溶液用小功率超声仪超声3min;
(4)将(3)得到的溶液,在-20摄氏度中冷冻24h;
(5)取出后使其缓慢融化为乳白色溶液,以8000rpm的速度离心15min, 倒去上清液即得到丝素蛋白颗粒,在同样的离心速度下用去离子水洗涤两次, 两次离心后超声15min后以500rpm的离心速度离心15min,弃去底部沉淀 从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液。
(6)将(5)所得悬浮液用小功率超声仪超声3min;
(7)将(6)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱,冷冻24h;
(8)取出冷冻好的悬浮液,在冷冻干燥机中冷冻干燥24h,所得即为丝素 短肽微球粉末。
(9)将步骤(8)所得丝素短肽微球粉末5mg溶于1mL的生理盐水中,贴 敷在断尾处。丝素短肽微球粉末组在1min 40s后即停止出血(图2b),而未添 加丝素短肽微球粉末组8min之后才流血停止(图2a)。可见,本发明的凝血 材料不但大大降低出血速率,而且出血总量也得到了显著的减少。
实施例4
步骤(1)-(8)同实施例1、2、3;
(9)分别将步骤(8)所制得的丝素-RGD短肽微球粉末、丝素-TI短肽微 球粉末和丝素-RGD短肽微球粉末5mg溶于1mL的生理盐水中,制备成可注射 的丝素-短肽微球溶液。
(10)选取250g的健康大鼠若干,麻醉大鼠,剔毛,剪皮,再用止血钳将 股神经首先分出,然后分离股动、静脉间的结缔组织,暴露股静脉,用注射器 针头刺穿长约2~2.5cm的切口(此时回心端静脉已用止血夹夹住);
(11)分别将步骤(9)所制得的丝素-短肽微球溶液1mL注入步骤(10) 中的大鼠体内,循环5min,松开止血夹,开始计算流血质量。打入1mL的生 理盐水作为对照组。
在4min之后,本实施例的丝素短肽微球对大鼠体内静脉血管创伤部位的凝 血效果为:丝素-TI短肽微球粉末和丝素-LD短肽微球组的出血量约为2g左右, 而丝素-RGD短肽微球组的出血量约为3.5g左右,而生理盐水组的出血量达到 4g以上。因此可见,本发明的丝素-TI短肽微球粉末和丝素-RGD短肽微球具有 很好的促进体内组织出血部位的凝血,
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然, 本发明不限于以上实施例子,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范 围。
Claims (6)
1.一种丝素-短肽凝血微球,其特征在于:所述微球是由丝素和短肽复合而成。
2.一种丝素-短肽凝血微球的制备方法,其特征在于:所采用的具体制备步骤如下:
(1)将蚕茧脱胶后形成的纤维状丝素溶解在中性盐溶液中,经过过滤、透析、浓缩后获得0.2%-5%的丝素蛋白溶液;
(2)将步骤(1)中的丝素蛋白溶液与短肽按重量分数比为200:1-9:1的比例混合均匀,用移液枪注入无水乙醇,使得乙醇终浓度为10%-50%,并混合均匀待其自组装一段时间,使用超声仪超声1-10min;
(3)将步骤(2)得到的溶液在-20摄氏度中冷冻24h;
(4)将步骤(3)中的溶液取出后使融化为乳白色溶液,经第一次离心后倒去上清液得到丝素蛋白颗粒,再经第二次离心后用去离子水洗涤两次,两次离心后超声,接着再进行第三次离心,然后弃去底部沉淀从而得到单分散性较好的丝素蛋白微球悬浮液,用超声仪超声3min;
(5)将步骤(4)中得到的悬浮液立刻放入-20摄氏度冰箱,冷冻24h;
(6)取出冷冻好的悬浮液,在冷冻干燥机中冷冻干燥24h,所得即为丝素短肽微球粉末。
3.根据权利要求1所述的一种丝素-短肽凝血微球的制备方法,其特征在于,
所述的步骤(2)中的短肽为RGD、TI或者LD,短肽RGD、TI和LD的氨基酸序列分别为RGD、TRYLRIHPQSQVHQI、LPCDYYGTCLD。
4.根据权利要求1所述的一种丝素-短肽凝血微球的制备方法,其特征在于,
所述步骤(4)中,第一次离心以8000rpm的速度离心15min,第二次离心的离心速和第一次离心相同,第三次离心以500rpm的离心速度离心15min。
5.根据权利要求1所述的一种丝素-短肽凝血微球的制备方法,其特征在于,
所述的中性盐溶液为9mol/L的LiBr溶液、质量分数为50%的氯化钙溶液。
6.根据权利要求1所述的一种丝素-短肽凝血微球的制备方法,其特征在于,
所述方法制成的丝素-短肽凝血微球既能用于外部创伤,又能用于注射。
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GR01 | Patent grant | ||
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