DE69900746T2

DE69900746T2 - Gesteuerte verabreichung von peptiden oder proteinen

Info

Publication number: DE69900746T2
Application number: DE69900746T
Authority: DE
Inventors: N. Jennings; A. Protter; John Wang; Bing Yang
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-28
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: JP5868895B2; JP2002501886A; CA2317411C; WO1999038495A3; JP2013189448A; EP1051157A2; DE69900746D1; US6187330B1; CA2317411A1; EP1051157B1; WO1999038495A2; AU2484399A; JP2009286803A; JP4549529B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der gesteuerten Zufuhr von Peptiden oder Proteinen und Zusammensetzungen, die sich für die gesteuerte Zufuhr von Peptiden oder Proteinen eignen.
Polymer-Matrizen, typischerweise in Form von Mikrokügelchen, Stäben, Plättchen oder Pellets, wurden für die Depot- oder gesteuerte Freisetzung von Arzneimittelprodukten verwendet. Eine Vielzahl an Techniken ist bekannt, wodurch die Wirkstoffe in Polymermatrizen inkorporiert werden können. Beispiele sind Lösungsmittelverdampfung, Sprühtrocknen, Emulgieren oder einfaches physikalisches Vermischen von Teilen diskreter Größe oder Form. Keines dieser Verfahren kann aufgrund der labilen Beschaffenheit von Peptiden und Proteinen leicht an die Inkorporierung von Peptid- oder Proteinarzneien in Polymere angepasst werden. Peptide und Proteine werden durch Lösungsmittel, Emulgation oder Wärme leicht denaturiert. Um das Problem der Instabilität zu vermeiden, beschreibt US-A-5.019.400 ein bei sehr tiefer Temperatur erfolgendes Gießverfahren für das Einarbeiten von Proteinen in Polymermatrizen mit gesteuerter Freisetzung. Diese Technik ist mit mehreren Nachteilen verbunden, da die Tieftemperaturverarbeitung sehr aufwändig sein kann, Spezialgeräte erforderlich sind und die Feuchtigkeitskondensation während des Verfahrens ein potenzielles Problem darstellt.
Es wäre wünschenswert, das Peptid- oder Proteinarzneimittel in ein geschmolzenes Polymer einzumischen, das zu einer definierten Form und Größe gegossen wird. Leider denaturieren die meisten Proteine bei einer Temperatur weit unterhalb des Schmelzpunkts von Polymeren.
Es wäre ferner wünschenswert, dass die Peptid- oder Proteinarznei unter den Bedingungen, unter denen sie aus der Polymermatrix im Körper freigesetzt wird, stabil ist. Die meisten bioerodierbaren Polymere werden durch Hydrolyse von Esterbindungen im Körper depolymerisiert. Diese Hydrolyse kann zu lokalen Regionen hoher Azidität führen. Da viele Peptid- oder Proteinarzneien unter sauren Bedingungen instabil sind, kann dies zur Deaktivierung des Arzneimittels führen, bevor es freigesetzt wird. Eine solche Proteinarznei, die unter sauren Bedingungen instabil ist, ist basischer Fibroblasten- Wachstumsfaktor (bFGF). Dieses Protein, das in Formen variierender Länge isoliert wurde, z. B. mit 146, 154 und 157 Aminosäuren, ist ein hochwirksames Angiogenese- Mittel sowie ein Stimulator der Zellproliferation und -migration während der Wundheilung. Die für Human-bFCE kodierende DNA-Sequenz und ihre deduzierte Aminosäuresequenz sind in der US-A-5.514.566 geoffenbart. Aufgrund seiner gefäßbildenden Eigenschaften eignet es sich zur Unterstützung des lokalen Wachstums neuer kapillarer Gefäßbetten, um die Blockade in Arterien von Individuen zu umgehen, die atherosklerotische Zustände wie etwa Herzkranzerkrankungen und periphere Gefäßerkrankungen aufweisen. Diese Protein ist auch chemotaktisch für Fibroblasten, die die wesentlichen Zellen beim Freisetzen einer für die Wundheilung erforderlichen Matrix sind, z. B. Kollagen; das die Zugfestigkeit der geheilten Wunden bestimmt. Um bFGF wirkungsvoll an eine gewünschte Stelle zu transportieren und potenzielle Nebenwirkungen, die mit der systemischen Zufuhr von bFGF bei der Behandlung solcher Zustände verbunden sind, zu vermeiden, wäre es wünschenswert, ein Gerät zur gesteuerten Freisetzung zu entwickeln, das an oder nahe der Stelle implantiert wird, an der die gefäßbildende oder wundheilende Aktivität erforderlich ist.
Die WO 93/10758 offenbart eine Zusammensetzung für die gesteuerte Freisetzung von Peptiden aus einer amorphen Kohlenhydratglasmatrix mit einem wasserunlöslichen Wachs, wobei das Peptid in der Matrix dispergiert ist.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bietet Verfahren und Zusammensetzungen für die gesteuerte Freisetzung von Peptid- oder Proteinarzneimitteln sowie Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen und Geräten, die sich für die gesteuerte Freisetzung von Peptid- oder Proteinarzneimitteln eignen.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung für die gesteuerte Freisetzung eines Peptids oder Proteins bereitgestellt, die ein biokompatibles, bioerodierbares Polymer umfasst, in dem eine glasartige Matrixphase dispergiert ist, die das Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, wobei die glasartige Matrixphase eine Glastemperatur aufweist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt. Da das Peptid- oder Proteinarzneimittel innerhalb der Zusammensetzung stabil ist, kann es in seiner Schmelzphase günstigerweise zu entsprechend ausgestalteten Vorrichtungen geformt werden, die als Arzneimittelzufuhr-Implantate verwendet werden, d. h. Stäbe, Filme, Perlen o. dgl.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Verabreichung eines bioaktiven Peptids oder Proteins durch gesteuerte Freisetzung an ein Tier bereitgestellt; das einer solchen Verabreichung bedarf, umfassend das Implantieren einer aus der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gebildeten Vorrichtung in ein derartiges Tier.
In einer weiteren Ausführungform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines bioaktiven Peptids oder Proteins bereitgestellt, Folgendes umfassend:
(a) das Dispergieren einer glasartigen Matrix, die das bioaktive Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, in einem biokompatiblen, bioerodierbaren Polymer bei einer Temperatur, die über dem Schmelzpunkt des Polymers und unter der Glastemperatur der glasartigen Matrix liegt; und
(b) das Abkühlen der Dispersion auf eine Temperatur, bei der das Polymer ein Feststoff ist.
Auf Wunsch kann die Dispersion vor dem Abkühlen zu einer Zufuhrvorrichtung mit gewünschter Form ausgestaltet oder gegossen werden.
In bevorzugten Ausführungsfirmen der Erfindung ist das Wärmeschutzmittel aus den Gruppen bestehend aus Trehalose, Melezitose, Cellobiose, Melibiose, Raffinose und Lactose ausgewählt. Ein bevorzugtes Polymer zur Verwendung in den Zusammensetzungen und Vorrichtungen der Erfindung ist Poly(&epsi;-caprolacton) mit einem Schmelzpunkt von unter etwa 65ºC.
Die Zusammensetzungen und Vorrichtungen der Erfindung sorgen für hervorragende gesteuerte Freisetzung von bFGF oder von vaskulärem Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) ohne signifikanten Abbau des Proteins entweder während der Herstellung oder während der Zufuhr des Proteins in vivo.

KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung und Zufuhr von bFGF.
Fig. 2 ist ein Graph, der die in vitro-Freisetzung von bFGF aus drei Formulierungen der Erfindung veranschaulicht.
Fig. 3 ist ein Graph, der die in vitro-Langzeit-Bioaktivität von VEGF veranschaulicht, der aus Polycaprolacton-Stäben gewonnen wird.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der Erfindung ist ein wirkungsvolles Mittel für die Herstellung von Zusammensetzungen und Vorrichtungen zur gesteuerten Freisetzung und Zufuhr von Peptid- oder Proteinarzneien bereitgestellt. Die Anmelder stellten fest, dass Peptid- oder Proteinarzneien in bioerodierbaren, biologisch abbaubaren Polymermatrizen in der Schmelzphase dispergiert werden können, sofern die Peptid- oder Proteinarznei in einer glasartigen Matrixphase mit einer Glastemperatur dispergiert ist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt. Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung einer bestimmten Zufuhrvorrichtung zur gesteuerten Freisetzung ist in Fig. 1 veranschaulicht. Diese Abbildung ist eine schematische Darstellung der Produktion einer Vorrichtung zur gesteuerten Freisetzung für die Zufuhr von bFGF unter Verwendung von Poly(&epsi;- caprolacton) als Polymer.
Das Verfahren und die Zusammensetzung der Erfindung kommen günstigerweise bei der gesteuerten Freisetzung und Zufuhr jedes Protein- oder Peptidmedikaments zum Tragen, das leicht durch Wärme inaktiviert wird. Im Allgemeinen neigt jedes Protein- oder Peptidmedikament, dessen Aktivität von der Beibehaltung seiner Tertiärstruktur abhängt, zu Inaktivierung durch Erwärmung. Während einige kleine Peptide möglicherweise für ihre Aktivität der Beibehaltung der Tertiärstruktur nicht bedürfen, sind fast alle Proteinarzneien gegenüber Inaktivierung durch Wärme anfällig. Somit können das Verfahren und die Zusammensetzung der Erfindung eine Vielzahl an Proteinen verwenden, z. B. Wachstumsfaktoren, hämopoetische Faktoren, Hormone, Cytokine, Lymphokine und Faktoren, die Immunfunktion stimulieren oder supprimieren. Die Anmelder stellten fest, dass die Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung besonders für die lokale Zufuhr von Human-bFGF und VEGF geeignet sind.
Die glasartige Matrixphase kann durch Lyophilisieren einer wässrigen Lösung des Peptid- oder Proteinarzneimittels und eines geeigneten Wärmeschutzmittels erzeugt werden. Das jeweils ausgewählte Wärmeschutzmittel und seine Konzentration im Vergleich zum Peptid oder Protein bestimmen die genaue Glastemperatur des Lyophils. Im Allgemeinen liegt das Gewichtsverhältnis zwischen dem Wärmeschutzmittel und dem Peptid- oder Proteinarzneimittel zwischen etwa 2 und 200. Fachleute auf dem Gebiet können die erforderliche Glastemperatur jeder Kombination festlegen. Der Glasübergang ist als reversible Änderung in einem amorphen Material von einem (oder in einen) viskosen gummiartigen Zustand in einen (oder von einem) harten und relativ spröden Zustand definiert (American Society for Testing and Materials (ASTM) E 1142).
Die Glastemperatur (Tg) ist als ungefährer Mittelpunkt des Temperaturbereichs definiert, in dem der Glasübergang stattfindet (ASTM D 4092). Die Glastemperatur der glasartigen Matrixphase mit dem Peptid- oder Proteinarzneimittel und dem Wärmeschutzmittel kann durch eine Vielzahl an Techniken ermittelt werden, von denen die populärste die Differentialscanning-Kalorimetrie (DSC) ist. Wenn ein glasartiges Material mit konstanter Rate erhitzt wird, kann die Grundlinien-Verschiebung in Bezug auf den Wärmefluss und ihre Temperatur festgestellt werden. Die dem Mittelpunkt der zwei Grundlinien entsprechende Temperatur gilt als Glastemperatur.
Trehalose, Melezitose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Melibiose und Raffinose sind bevorzugte Wärmeschutzmittel. Da Feuchtigkeit die Tg der glasartigen Matrixphase beeinflusst, beträgt der Feuchtigkeitsgehalt der glasartigen Matrixphase vorzugswiese weniger als 1%, noch bevorzugter weniger als 0,5 0/ Dies ist vor allem dann zutreffend, wenn man Saccharose als Wärmeschutzmittel verwenden möchte, da übermäßige Feuchtigkeit bewirken kann, dass die Ig des Saccharose enthaltenden Gemisches unter den Schmelzpunkt des bevorzugten Polymers Poly(&epsi;-caprolacton) fällt. Die Anmelder verwendeten TA 2910- und TA 2920-Differentialscanning-Kalorimeter, um die Tg für verschiedene lyophilisierte bFGF enthaltende Matrizen zu ermitteln. Etwa 5 mg jeder Probe wurden eingewogen und mit einer Faltpresse in einem Aluminiumschälchen hermetisch abgedichtet. DSC-Daten wurden im Heizmodus mit einer Heizrate von 10 ºC/min erfasst. Vor dem Beginn der Temperaturrampe wurde die Probe isothermisch 5 Minuten lang bei einer Temperatur von 30ºC oder mehr unterhalb der erwarteten Tg äquilibriert, bevor das Experiment begann. Wenn der Glasübergang mit Enthalpie- Relaxation verbunden war, wurden Proben über die Tg hinaus erhitzt, auf die Ausgantstemperatur abgekühlt und erneut erhitzt, um die Tg im zweiten Scanning- Durchgang zu messen. Nachstehende Tabelle 1 gibt die Glastemperaturen für Lyophile von bFGF mit verschiedenen Exzipienten an. Tabelle 1 Glastemperatur von bFGF-Lyophilen
Zusätzlich zum Peptid- oder Proteinarzneimittel kann die glasartige Phase auch andere herkömmliche pharmazeutische Exzipienten in den üblichen wirkungsvollen Konzentrationen enthalten. Typischerweise verwendete Exzipienten sind z. B. Netzmittel, Abbaumittel, Tenside, Puffersalze, Konservierungsmittel (antibakterielle Mittel), Antioxidanzien und Chelatbildner. Wie dies auf dem Gebiet bekannt ist, kann man insbesondere ein Antiaggregans als Exzipient verwenden, da die Konzentrationen des Peptid- oder Proteinmedikaments in Vorrichtungen zur gesteuerten Freisetzung relativ hoch sind und Aggregation von Peptid oder Protein bei Fehlen eines solchen Exzipienten auftreten kann. Wirksame Antiaggreganten sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt, und das Gleiche gilt für die Konzentrationen, bei denen sie gewöhnlich verwendet werden. Zu ihnen zählen z. B. Polyole wie etwa Inosit, Xylit, Mannit, Maltose, Arabinose und Galactose.
Die Lyophilisierung der wässrigen Lösung, die das Wärmeschutzmittel, Peptid- oder Proteinarzneimittel und gegebenenfalls andere Exzipienen enthält, erfolgt unter Anwendung auf dem Gebiet der Pharmazie allgemein bekannter Techniken (siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausg., S. 1538). Die Lyophilisierung ergibt eine glasartige Matrixphase in Form eines Pulvers oder Kuchens, das bzw. der zerkleinert werden kann, um ein für die Dispersion im Polymer geeignetes Pulver zu bilden.
Die das Peptid- oder Proteinmedikament enthaltende glasartige Matrixphase wird dann im bioerodierbaren, biokompatiblen Polymer dispergiert, das einen Schmelzpunkt unterhalb der Glastemperatur der glasartigen Matrixphase besitzt. Der Ausdruck "bioerodierbar" bedeutet hierin, dass das Polymer in einer physiologischen Umgebung ausreichend abbaubar ist, um die gesteuerte Freisetzung des Peptid- oder Proteinmedikaments zu ermöglichen. Der Ausdruck "biokompatibel" bedeutet, dass die Abbauprodukte des Polymers nichttoxisch sind und das Peptid- oder Proteinmedikament nicht inaktivieren. Vorzugsweise ist das Polymer auch biologisch abbaubar, d. h. es wird in einer physiologischen Umgebung vollständig abgebaut und resorbiert, sodass es nicht notwendig ist, verbleibende Komponenten der Vorrichtung nach der Zufuhr des Arzneimittels physikalisch zu entfernen.
Ein bevorzugtes Polymer zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist Poly(&epsi;-caprolacton). Noch bevorzugter besitzt das in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendete Poly(&epsi;-caprolacton) ein Molekulargewicht zwischen etwa 2.000 und 30.000, am bevorzugtesten zwischen etwa 10.000 und 20.000. Poly(&epsi;- caprolacton) in diesem Molekulargewichtsbereich besitzt einen Schmelzpunkt von etwa 59ºC bis 65ºC. Poly(&epsi;-caprolacton) ist auch ein sehr günstiges Polymer, wenn das zugeführte Peptid- oder. Proteinarzneimittel nicht säurestabil ist, z. B. bFGF. Die Hydrolyserate von Poly(&epsi;-caprolacton) unter physiologischen Bedingungen ist ausreichend langsam, damit der Abbau des Polymers nicht zu lokalen Regionen mit niedrigem pH- Wert führt, was das Peptid oder Protein inaktivieren würde. Dies ist besonders dann entscheidend, wenn z. B. bFGF freigesetzt wird, da das Proben bei einem pH-Wert von 3 bis 4 innerhalb von etwa 20 bis 30 Minuten vollständig inaktiviert wird. Die bevorzugten Wärmeschutzmittel der Erfindung können auch als Porocigene wirken, die dazu beitragen, die Freisetzung des Peptid- oder Proteinmedikaments zu steuern, wenn es sich im in der physiologischen Umgebung vorhandenen Wasser auflöst.
Wiederum Bezug nehmend auf Fig. 1 ist das Lyophil, das das Wärmeschutzmittel, das Peptid- oder Proteinmedikament und/oder gegebenenfalls andere Exzipienten enthält, im Polymer dispergiert. Das Polymer wird auf seinen Schmelzpunkt erhitzt. Im Fall von Poly(&epsi;-caprolacton) wird das Polymer auf etwa 65ºC erhitzt. Die glasartige Matrixphase wird im geschmolzenen Polymer mittels jedes geeigneten Mischvorgangs dispergiert. Es kann vorteilhaft sein, zusätzliche Additive im Polymer zu dispergieren, um die Arzneimittelfreisetzungsrate der Vorrichtung zu steuern. Insbesondere können auf dem Gebiet bekannte Porocigene in das Polymer inkorporiert werden, um die Freisetzungsrate des Arzneimittels zu steuern. Bekannte Porocigene sind z. B. Zucker, Aminosäuren, Mannit, Sorbit, Xylit und Polyethylenglykol. Diese können in bekannten wirksamen Mengen in das Polymer inkorporiert werden.
Die glasartige Matrix ist normalerweise in einer Menge von etwa 5 bis etwa 25% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Menge von etwa 10 bis etwa 20%, vorhanden. Die genaue Menge der in der Zusammensetzung vorhandenen glasartigen Matrixphase hängt vor allem von der Konzentration des in der glasartigen Matrixphase enthaltenen Peptid- oder Proteinmedikaments, der gewünschten Freisetzungsrate, der Größe der zu implantierenden Vorrichtung und der Dosierung des der lokalen Stelle zuzuführenden Medikaments ab.
Wie aus Fig. 1 zu sehen kann das die glasartigen Matrixphase enthaltende Polymer vor dem Kühlen zu einer als Implantat geeigneten Form ausgestaltet werden, z. B. zu Stäben, Scheiben, Plättchen oder Kügelchen. Da das Peptid oder Protein innerhalb der Zusammensetzung stabil ist, kann es auch zu einem späteren Zeitpunkt zur gewünschten Form ausgestaltet werden.
Die Arzneimittelzufuhrvorrichtung der Erfindung kann auf herkömmliche Weise in ein Tier implantiert werden, das der gesteuerten Freisetzung und Zufuhr des Peptid- oder Proteinmedikaments bedarf. Im Fall der bFGF oder VEGF enthatlenden Vorrichtung wird diese günstigerweise an oder nahe der Stelle der Gefäßblockade oder -läsion implantiert. Auf diese Weise kann man ein Tier wie z. B. ein Säugetier wie etwa einen Menschen behandeln, der unter peripherer Gefäßerkrankung oder Koronararterienerkrankung leidet. Wenn bFGF freigesetzt wird; fördert es die Angiogenese, was zur Ausbildung neuer Kapillargefäße führt, um Blut an der Blockadestelle vorbeizuführen. Typischerweise enthält eine derartige Vorrichtung in dieser Anwendung von etwa 25 bis etwa 250 ug bFGF. In in vivo-Experimenten wurde eine ausreichende Menge an bFGF innerhalb von 5 Tagen freigesetzt, um Angiogenese zu unterstützen. Die erfindungsgemäße Arzneimittelzufuhrvorrichtung kann auch dazu dienen, bFGF zuzuführen und damit Wundheilung zu fördern, z. B. bei der Behandlung von Dekubitus, Diabetesgeschwüren, Schnittwunden aufgrund von chirurgischen Eingriffen und/oder Unfalltrauma u. dgl. oder bei der Heilung von Knochengewebe. Für solche Verwendungszwecke kann die Vorrichtung geeignet dimensioniert oder geformt sein, um in die Wundstelle eingeführt zu werden. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung der Erfindung zu Pulverform gemahlen werden, das auf die Wundstelle aufgebracht werden kann in solchen Fällen sind die geeigneten Dosierungen jene, die Gefäßbildung im Wundbett und somit die Wundheilung fördern. Geeignete Dosierungen werden von Fachleuten auf dem Gebiet bestimmt, wobei zumindest teilweise die Art und Größe der behandelten Wunde ausschlaggeben sind.
Die folgenden nichteinschränkenden Beispiele dienen zur näheren Veranschaulichung der hierin beschriebenen Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von bFGF-PCL-Stäben

A. Herstellung einer glasartigen Matrixphase

4,42 g Trehalosedihydrat wurden in einen 100 ml-Messkolben eingefüllt. 84 ml der wässrigen 8,37 mg/ml-Lösung von rekombinantem Human-bFGF (154 Aminosäuren) wurden dem Kolben zugegeben. Die Lösung wurde mit Wasser auf 100 ml gebracht und dann durch einen sterilen 0,2 um Arodisc® 13 Filter (Gelman Science) filtriert. Die filtrierte Lösung wurde zwecks Lyophilisierung in Fläschchen (2 ml/Fläschchen) gefüllt.
Die Aliquoten in jedem Fläschchen wurden zunächst gefroren, indem die Lagertemperatur 2 Stunden lang bei -45ºC gehalten wurde, gefolgt von einem Vergütungsschritt bei 10ºC über 2 Stunden und dem Kühlen bei -40ºC über weitere 3 Stunden. Das erste Trocknen erfolgte 5 bzw. 15 Stunden lang bei -20ºC bzw. -25ºC und 60 mTorr. Das zweite Trocknen erfolgte 10 Stunden lang bei 25ºC bis 30ºC und 60 mTorr.

B. Inkorporation von lyophilem bGFG-Mittel in PCL

1,192 g von im Handel erhältlichem Poly(&epsi;-caprolacton) (Molekulargewicht 10.000 bis 20.000) wurden in einen sterilisierten Becher in einem Ölbad gefüllt. Das Ölbad wurde 1 Stunde lang auf 90ºC erhitzt und dann auf 65ºC abgekühlt. Das lyophile bFGF-Mittel aus einem Fläschen (wie oben hergestellt) wurde geschmolzenen PCL zugegeben. Das Lyophil wurde im viskosen PCL suspendiert und geschüttelt, um eine homogene Dispersion zu erhalten.

C. Herstellung von bFGF-PCL-Stäben

Das bFGF-Lyophil-PCL-Gemisch wurde mit einer sterilen 16 G Nadel gestreckt, um einen Stab mit einem Durchmesser von 1 mm zu bilden. Der Stab wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und zu 10 mm-Stücken geschnitten.

Beispiel 2

Herstellung von bFGF-PCL-Stäben

pBFG-PCL-Stäbe wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 unter Einsatz unterschiedlicher Beladungen mit bFGF und unterschiedlicher Wärmeschutzmaterialien hergestellt. In jedem Fall wurden 2 ml einer wässrigen Lösung, umfassend bFGF (2 mg für Niedrigdosierung und 50 mg Für Hochdosierung), Wärmeschutzmittel (80 mg bis 370 mg), 20 mM Citratpuffer und 1 mM EDTA, zwecks Lyophilisierung in jedes Fläschchen gefüllt. Die verwendeten Wärmeschutzmittel wären Trehalose, Melezitose und Saccharose. Diese Lösungen wurden lyophilisiert, in geschmolzenem PCL dispergiert und zu Stäben geformt (ähnlich wie in Beispiel 1). Im Fall der Saccharose-hältigen Lösung erfolgte die Lyophilisierung bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von 0,5%, um sicherzustellen, dass die Tg des Lyophils über dem Schmelzpunkt des PCL lag.

Beispiel 3

In vitro-Freisetzung von bFGF. aus Stäben

PCL-Stäbe (1 mm · 10 mm) mit bFGF wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Trehalose, Melezitose oder Saccharose als Wärmeschutzmittel hergestellt. Im Fall von Trehalose und Melezitose enthielt das zur Herstellung der Stäbe verwendete Lyophil eine 4%ige Konzentration des Wärmeschutzmittels (Gew.-% vor Lyophilisierung), und das Lyophil war im PCL in einer Konzentration von 8,3 Gew.-% dispergiert. Im Fall von Saccharose enthielt das zur Herstellung der Stäbe verwendete Lyophil eine 9%ige Saccharose-Konzentration (Gew.-% vor Lyophilisierung), und das Lyophil war im PCL in einer Konzentration von 13,8 Gew.-% dispergiert.
Die Messung der in vitro-Freisetzung des bFGF aus denn Stäben wurde bei 5ºC bestimmt. Die Stäbe wurden in 1 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) gelegt und die Lösung mit einem Rührstäbchen umgerührt. Die PBS wurde in 1-Tages-Intervallen abgezogen und mit frischer PBS ersetzt, um das Volumen beizubehalten. Ionenaustausch- HPLC diente dazu, den bFGF in der abgezogenen PBS und den akkumulierten aus den Stäben freigesetzten bFGF zu quantifizieren. Die Freisetzung des bFGF aus den Stäben im Lauf der Zeit ist in Graph in Fig. 2 aufgetragen. In der Abbildung sind Datenpunkte für die Trehalose enthaltende Formulierung durch leere Kreise dargestellt; Datenpunkte für die Melezitose enthaltende Formulierung sind durch ausgefüllte Dreiecke dargestellt; und Datenpunkte für die Saccharose enthaltende Formulierung sind durch ausgefüllte Kreise dargestellt.

Beispiel 4

Förderung der Gefäßbildung durch pBFG-PCL-Implantat

Männliche und weibliche Sprague Dawley-Ratten (Körpergewicht 225 bis 425 g) wurden kurz durch Inhalieren von Isofluran anästhesiert. Die Abdominalregion wurde geschoren und mit 70% Ethanol gereinigt. Stäbe (1 mm · 10 mm) mi tbFGF (rekombinant produzierter Human-bFGF, 1154 Aminosäuren) in PCL, erzeugt wie in Beispiel 1, wurden in eine Nummer 14-Kathetersetznadel eingeführt. Die Haut des Abdomens wurde mit Gewebezange festgehalten und mit der Nadel entlang der Mittellinie etwa 2 cm oberhalb des Beckens durchbohrt. Das Pellet wurde zu einer Position zwischen der Haut und den Abdominalmuskelschichten unter Verwendung eines feinen Drahts vorgeschoben. Die Nadel wurde entfernt, die Tiere wurden gewogen und in einen geeigneten Käfig gesperrt. Die Tiere waren unmittelbar nach dem Abbruch der Inhalation von Isofluran wieder wachsam und mobil.
5 Tage nach dem ersten Setzen der bFGF-PCL-Stäbe wurden die Tiere durch Kohlendioxid-Inhalation oder eine Phenobarbital-Überdosis euthanisiert. Das Körpergewicht wurde aufgezeichnet und die Abdominalhaut vorsichtig eingeschnitten und zurückgebogen, um den Abdominalmuskel freizulegen. Informationen betreffend die Position und Vaskularität sowie die Akkumulierung von Granulationsgewebe wurden aufgezeichnet und Aufnahmen jedes Tiers gemacht. Die Abdominalmuskelschicht wurde entfernt und in 10% gepuffertes Formalin gelegt. Gewebeproben wurden in 5 mm- Abständen geschnitten und mit Hematoxylin und Eosin eingefärbt.
Die folgenden Formulierungen wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Angiogenese zu fördern:

Vergleiche

1. pGFG in Kochsalzlösung (subkutan injiziert), 70 ug bFGF in 0,5 ml Volumen sterile isotonische Kochsalzlösung
2. PCL-Stab: 9% Saccharoselyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,16
3. PCL-Stab: 4% Trehaloselyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,09

pFG F-PCL-Stäbe

1. bFGF in 9% Saccharoselyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,17. bFGF-Beladung = 100 ug/Stab
2. bFGF in 4% Trehalyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,09. bFGF-Beladung = 25 ug/Stab
3. bFGF in 4% Trehaloselyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,09. bFGF-Beladung = 100 ug/Stab
4. bFGF in 4% Melezitoselyophil, Lyophil-PCL-Verhältnis = 0,09. bFGF-Beladung = 100 ug/Stab
Die visuelle Kontrolle der die Stäbe enthaltenden subkutanen Region zeigte, dass sich beim Vorhandensein von bFGF in der Formulierung Gewebe um den Stab akkumulierte und das Gewebe ein vaskularisiertes Äußeres aufwies. Wenn kein bFGF in der Formulierung enthalten war, war die lokale Gewebeakkumulierung entweder sehr gering oder nicht vorhanden. Wenn bFGF in Salzlösung ohne die Stabformulierung verabreicht wurde, ergab sich keine offensichtliche Wirkung auf das subkutane Gewebe in der Injektionsregion. Der Wirkungsgrad von bFGF in den Stabformulierungen hing von der Beladung mit bFGF ab.
Die histologische Analyse der Gewebe zeigte, dass sich bei Vorhandensein von bFGF in der Formulierung Fibroblasten und Blutgefäße um den Stab akkumulierten. Wenn kein bFGF in der Formulierung enthalten war, war die Fibroblasten- und Blutgefäß- Akkumulierung entweder sehr gering oder nicht vorhanden. Die mit bFGF in den Stabformulierungen erkennbare Fibroblasten- und Blutgefäßakkumulierung wäre für das Wundheilen vorteilhaft und würde die Entwicklung von Kollateralblutgefäßen in Fällen vaskulärer Insuffizienz (z. B. bei peripherer Gefäßerkrankung oder ischämischer Herzerkrankung) stimulieren.

Beispiel 5

Herstellung von BEGF-PCL-Stäben und Bioaktivität von aus den Stäben gewonnenem BEGF

VEGF-PCL-Stäbe wurden in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 und Beispiel 2 unter Verwendung von BEGF als Arzneimittel und Saccharose als Wärmeschutzmittel hergestellt. Im Präparat waren 2 ml einer wässrigen Lösung lyophilisiert. Die Lösung enthält 6,8 mg VEGF, 80 mg Saccharose, 20 mM Citratpuffer und 1 mM EDTA. Der lyophiliserte Kuchen wurden dann in geschmolzenem PCL dispergiert und in gleicher Wiese wie in beispiel 1 zu BEGF-PCL-Stäben geformt. Das Gewichtsverhältnis zwischen Lyophil und PCL wurde zwischen 0,07 und 0,17 gehalten.
Es wurde die Bioaktivität von aus den Stäben gewonnenem VEGF bestimmt. Die VEGF- PCL-Stäbe wurden bei 37ºC in einer PBS-Pufferlösung inkubiert, die 0,1% Proteasefreie BSA und 10 u/ml Gentamycin enthielt. Zu jedem Zeitpunkt wurden die PCL-Stäbe aus der Lösung entfernt und in eine frische Lösung mit der gleichen Zusammensetzung gelegt. Die entfernte Lösung wurde mittels eines Bioassay-Verfahrens analysiert und die Ergebnisse in Fig. 3 aufgetragen. Die in vitro-Ergebnisse zeigen, dass VEGF im Stab nach fünfwöchiger Inkubation aktiv ist.
Die Förderung der Gefäßbildung der VEGF-PCL-Stäbe, auf Sprague Dawley-Ratten wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 4 untersucht. Die visuelle Kontrolle und histologische Analyse der die VEGF-PCL-Stäbe enthaltenden subkutanen Region zeigte, dass sich Gewebe um den Stab akkumulierte und dass das Gewebe ein vaskularisiertes Äußeres besaß. Wen VEGF nicht in der Formulierung enthalten war, fehlte diese lokale Gewebeakkumulierung.

Claims

1. Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines Peptids oder Proteins, die ein biokompatibles, bioerodierbares Polymer umfasst, in dem eine glasartige Matrixphase dispergiert ist, die das Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, wobei die glasartige Matrixphase eine Glastemperatur aufweist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer biologisch abbaubar ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin die Glastemperatur der glasartigen Matrixphase über 65ºC liegt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Wärmeschutzmittel aus der aus Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Melezitose, Melibiose und Raffinose bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Polycaprolacton ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) mit einem Schmelzpunkt von unter 65ºC ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das bioaktive Peptid oder Protein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Gefäßendothelwachstumfaktor ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Wärmeschutzmittel aus Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Melezitose, Melibiose und Raffinose ausgewählt ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Wärmeschutzmittel Saccharose ist und die glasartige Matrixphase einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 1% aufweist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Wärmeschutzmittel Trehalose ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) mit einem Schmelzpunkt von unter 65ºC ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) mit einem Schmelzpunkt von unter 65ºC ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die Hydrolyse des Polymers unter physiologischen Bedingungen mit einer Rate erfolgt, die nicht bewirkt, dass der lokale pH innerhalb der Zusammensetzung unter 4 absinkt.

16. Vorrichtung zur gesteuerten Verabreichung eines bioaktiven Peptids oder Polymers an ein Tier, die die Zusammensetzung nach Anspruch 1 in Form eines geformten Implantats umfasst.

17. Vorrichtung zur gesteuerten Verabreichung eines bioaktiven Peptids oder Polymers an ein Tier, die die Zusammensetzung nach Anspruch 7 in Form eines geformten Implantats umfasst.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16, worin das geformte Implantat in einer Form vorliegt, die aus Stäben, Scheiben und Kugeln ausgewählt ist.

19. Verwendung einer Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines bioaktiven Polymers oder Proteins, die ein biokompatibles, bioerodierbares Polymer umfasst, in dem ein glasartige Matrixphase dispergiert ist, die das Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, wobei die glasartige Matrixphase eine Glastemperatur aufweist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tiers, das der Verabreichung des Peptids oder Proteins bedarf.

20. Verwendung nach Anspruch 19, worin das bioaktive Peptid oder Protein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Gefäßendothelwachstumsfaktor ist.

21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, worin die Zusammensetzung eine Vorrichtung in Form eines geformten Implantats ist.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin das geformte Implantat in einer Form vorliegt, die aus Stäben, Scheiben und Kugeln ausgewählt ist.

23. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines bioaktiven Peptids oder Proteins, welches Folgendes umfasst.

(a) das Dispergieren einer glasartigen Matrix, die das bioaktive Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, in einem biokompatiblen, bioerodierbaren Polymer bei einer Temperatur, die über dem Schmelzpunkt des Polymers und unter der Glastemperatur der glasartigen Matrix liegt; und

(b) das Abkühlen der Dispersion auf eine Temperatur, bei der das Polymer ein Feststoff ist.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die glasartige Matrix in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.

25. Verfahren nach Anspruch 23, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer biologisch abbaubar ist.

26. Verfahren nach Anspruch 23, worin die Glastemperatur der glasartigen Matrixphase über 65ºC liegt.

27. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Wärmeschutzmittel aus der aus Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Melezitose, Melibiose und Raffinose bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

28. Verfahren nach Anspruch 23, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolacton) ist.

29. Verfahren nach Anspruch 23, worin das bioaktive Peptid oder Protein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Gefäßendothelwachstumsfaktor ist.

30. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Wärmeschutzmittel aus Trehalose, Lactose, Maltose, Cellobiose, Melezitose, Melibiose und Raffinose ausgewählt ist.

31. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Wärmeschutzmittel Saccharose ist und die glasartige Matrix einen Feuchtigkeitsgehalt von unter 0,5% aufweist.

32. Verfahren nach Anspruch 29, worin das Wärmeschutzmittel Trehalose ist.

33. Verfahren nach Anspruch 29, worin das biokompatible, bioerodierbare Polymer Poly(&epsi;-caprolaeton) ist.

34. Verwendung einer Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines bioaktiven Peptids oder Proteins, die ein biokompatibles, bioerodierbares Polymer umfasst, in dem eine glasartige Matrixphase dispergiert ist, die das Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, wobei die glasartige Matrixphase eine Glastemperatur aufweist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von mangelnder Durchlutung bei einem Säugetier aufgrund von Gefäßverstopfung, worin das bioaktive Peptid oder Protein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Gefäßendothelwachstumsfaktor ist.

35. Verwendung nach Anspruch 34, worin die Zusammensetzung eine Vorrichtung in Form eines geformten Implantats ist.

36. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, worin die Vorrichtung etwa 25 ug bis etwa 250 ug bFGF enthält.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 34 bis 36, worin das Tier ein Mensch mit einer Koronararterienerkrankung oder peripheren Gefäßerkrankung ist.

38. Verwendung einer Zusammensetzung zur gesteuerten Freisetzung eines bioaktiven Peptids oder Proteins, die ein biokompatibles, bioerodierbares Polymer umfasst, in dem eine glasartige Matrixphase dispergiert ist, die das Peptid oder Protein und ein Wärmeschutzmittel umfasst, wobei die glasartige Matrixphase eine Glastemperatur aufweist, die über dem Schmelzpunkt des Polymers liegt, zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Wundheilung bei einem Tier, worin die Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die wirksam Angiogenese und Fibroblasten-Ansammlung fördert, worin das bioaktive Peptid oder Protein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor oder Gefäßendothelwachstumsfaktor ist.