DE60100740T2

DE60100740T2 - Verwendung von thrombin-derivierten peptiden zur therapie von kardiovaskuläre krankheiten

Info

Publication number: DE60100740T2
Application number: DE60100740T
Authority: DE
Inventors: H. Darrell CARNEY
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2000-07-12
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2021-07-13
Also published as: US7214661B2; AU7890701A; DE60100740D1; HK1060302A1; US7732411B2; ATE249238T1; JP3618736B2; US20020187933A1; US20020061852A1; WO2002004008A2; US7034001B2; CN1455678A; DE60100740T4; US6861407B2; US20060134167A1; EP1253937B1; US20050153884A1; AU2001278907B2; JP2005036007A; WO2002004008A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Humanes alpha-Thrombin besitzt scheinbar wachstumsfördernde Aktivität für eine breite Vielzahl von Zellen von verschiedenen Geweben. Beispielsweise wurde gezeigt, dass alpha-Thrombin die Proliferation von Fibroblastenzellen in Kultur ohne die Zugabe von Serum oder anderen gereinigten Wachstumsfaktoren initiiert, in bestimmten Hamsterfibroblasten und humanen Endothelzellen mit Epidermiswachstumsfaktor synergistisch wirkt, in Linsenepithel- und Milzzellen von Säugern die Zellteilung oder DNA-Synthese initiiert und Monocyten und Neutrophile aktiviert. Doch wurde die Verwendung von Thrombin als Wachstumfaktor und dessen potentielle Bedeutung für die Wundheilung nicht breit beansprucht. Teilweise kann dies auf der Komplexität der Beteiligung von Thrombin an der Blutgerinnung, Plättchenaktivierung und Initiierung der Zellproliferation sowie der komplexen Regulation von Thrombin und thrombinähnlichen Molekülen durch Serumproteaseinhibitoren und von den Zellen freigesetzte Proteasenexine beruhen. Diese Komplexität und der hohe Grad der physiologischen Regulation stützen jedoch die potentielle Bedeutung dieses Initiierungspfades der Wundheilung.
Thrombin kann auch bei der normalen Revaskularisation und Migration von Zellen aus dem Blut an die Stelle einer Verletzung und der mit Tumoren in Verbindung stehenden anomalen Metastase und Angiogenese eine Rolle spielen. Die Fähigkeit von Thrombin, die Endothelzellproliferation zu erhöhen und die Sperrfunktion von Blutgefäßen zu verändern, kann zu Angiogenese und Entzündung an Stellen einer Gewebeverletzung beitragen.
Durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung wurde die agonistische und antagonistische Wirkung von Thrombinderivatpeptiden auf die Aktivität von Thrombin und/oder Thrombinrezeptoren, beispielsweise bei der Behandlung von Wunden, beschrieben. US-Patent Nr. 5 500 412 oder 5 352 664. Das Patent lehrt jedoch nicht die neue Verwendung der Thrombinderivatpeptide zur Behandlung von geschädigtem Herzgewebe, zur Revaskularisation oder zur Hemmung von Gefäßverschluss und Restenose.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung einer Reparatur von Herzgewebe oder Myokard, Förderung der Vaskularisation oder Hemmung von Gefäßverschluss oder Restenose. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Peptid gemäß der Beschreibung in US-Patent Nr. 5 500 412 oder 5 352 664. Beispielsweise kann das Peptid vorzugsweise eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO. 1) und eine konservierte Serinesterasesequenz umfassen. Bevorzugte konservierte Serinesterasesequenzen umfassen Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 2). In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Thrombinderivatpeptid die Aminosequenz: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 3), beispielsweise ein Peptid, das aus der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 3) besteht. Das Peptid mit der Sequenz SEQ ID NO. 3 wird hier auch als "TP508" bezeichnet.
Das Peptid kann vorzugsweise während einer oder anschlie ßend an eine Herzoperation, beispielsweise durch direkte oder einen Katheter vermittelte Injektion in geschädigtes oder ischämisches Herzgewebe als lösliches Peptid oder in einer Formulierung mit langzeitiger Freisetzung verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines angiogenen Thrombinderivatpeptids gemäß der hier angegebenen Beschreibung zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Revaskularisation oder Gefäßendothelzellproliferation.
Die Erfindung betrifft ferner die Prävention von Gefäßverschluss oder Restenose, wobei diese die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des angiogenen Thrombinrezeptorbindungspeptids zur Verabreichung an Blutgefäße, beispielsweise durch systemische Injektion, Abgabe des Peptids an Stellen einer Gefäßverletzung durch einen Katheter oder durch Befestigen des Peptids an Stents, umfasst.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 ist ein Diagramm, das zeigt, dass zunehmende Konzentrationen von TP508 (ein Peptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 3 aufweist) die Proliferation von humanen Mikrogefäßendothelzellen in vitro stimulieren. Das Diagramm zeigt die Zellzahl 48 h nach einer Verabreichung von verschiedenen Konzentrationen von TP508 (angegeben in μg/ml).
2 ist ein Diagramm, das zeigt, dass zunehmende Konzentrationen von TP508 die Migration von Mikrogefäßendothelzellen auf Kunststoff stimulieren. Das Diagramm zeigt die Entfernung, über die die Zellen nach der Verabreichung von verschiedenen Konzentrationen von TP508 (angegeben in μg/ml) gewandert sind.
3 ist ein Diagramm, das Veränderungen der Herzfunktion bei mit TP508 behandelten Schweinen und Kontrollschweinen bei einem Schweinemodell einer Herzischämie zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind im allgemeinen durch eine beeinträchtigte Zufuhr von Blut zum Herzen oder anderen Zielorganen gekennzeichnet. Ein Myokardinfarkt (MI) resultiert aus verengten oder blockierten Koronararterien im Herzen, wodurch dem Herzen benötigte Nährstoffe und Sauerstoff fehlen. Wenn die Zufuhr von Blut zum Herzen beeinträchtigt ist, reagieren Zellen, indem sie Verbindungen erzeugen, die das Wachstum neuer Blutgefäße induzieren, um die Zufuhr von Blut zum Herzen zu erhöhen. Diese neuen Blutgefäße werden als kollaterale Blutgefäße bezeichnet. Der Prozess, durch den das Herauswachsen von neuen Blutgefäßen aus dem vorhandenen Gefäßsystem induziert wird, wird als Angiogenese bezeichnet, und die Stoffe, die von Zellen zur Induktion von Angiogenese produziert werden, sind die angiogenen Faktoren.
Wenn dem Herzmuskel aufgrund eines Gefäßverschlusses Sauerstoff und Nährstoffe fehlen, wird das Herzmuskelgewebe ischämisch und es verliert seine Fähigkeit zur Kontraktion und Funktion. Dieser Funktionsverlust kann durch natürliche Signale aus dem ischämischen Herzmuskel, die eine angiogene Revaskularisation durch die Entwicklung kollateraler Gefäße, die den Verschluss umgehen, induzieren, geheilt werden. Diese Revaskularisation der Angiogenese umfasst die Stimulation einer Endothelzellproliferation und einer Migration und ein Ausknospen neuer Blutgefäße. In vielen Fällen sind die natürlichen Signale jedoch nicht ausreichend, um ein Wachstum kollateraler Gefäße zu bewirken, und das ischämische Gewebe kann fibrotisch oder nekrotisch werden. Wenn dieser Prozess durch Verfahrensmaßnahmen zum Öffnen der verschlossenen Gefäße oder eine weitere Induktion von kollateralen Blutgefäßen nicht aufgehoben wird, kann das Herz vollständig dysfunktionell werden und eine Transplantation erforderlich machen.
Die hier beschriebenen Peptide können dazu verwendet werden, eine angiogene Proliferation und Migration von Endothelzellen zu induzieren, was zur Bildung von neuen Kapillaren und kollateralen Gefäßen führt, was die Wiederherstellung der Funktion von geschädigtem oder ischämischem Herzgewebe unterstützt. Diese Peptide können vorzugsweise als lösliches Peptid oder in einer Formulierung mit langzeitiger Freisetzung direkt injiziert werden in oder appliziert werden auf Herzgewebe während Verfahrensmaßnahmen am offenen Brustkorb für eine Bypass-Operation oder die Einführung von Kammerhilfsvorrichtungen oder durch eine Katheterinjektion in das Herz abgegeben werden.
Eine Endothelzellproliferation, die beispielsweise bei Angiogenese erfolgt, ist auch zur Prävention oder Hemmung von Restenose anschließend an eine Ballonangioplastik verwendbar. Das Ballonangioplastikverfahren verletzt häufig die Endothelzellenauskleidung der Innenwände von Blutgefäßen und es zerstört die Integrität der Gefäßwand. Glatte Muskelzellen und Entzündungszellen infiltrieren häufig die verletzten Blutgefäße, was eine zweite zerstörerische Wirkung in einem als Restenose bekannten Prozess bewirkt. Die Stimulation der Proliferation und Migration der Endothelzellen, die sich an der Peripherie des durch den Ballon induziert geschädigten Bereichs befinden, um die Lumenoberfläche des Gefäßes mit einer neuen Endothelzellenmonoschicht zu bedecken, kann potentiell die ursprüngliche Struktur des Blutgefäßes wiederherstellen.
Vorzugsweise umfasst eine Endothelisierung eine Reendothelisierung nach einer Angioplastik zur Verringerung, Hemmung oder Verhinderung von Restenose. Einem Fachmann ist klar, dass gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelte Patienten mit oder ohne einen Stent behandelt werden können.
Ein aufblasbarer Ballonkatheter, wobei der Ballon mit Peptid beschichtet ist, oder ein Katheter, der das Peptid direkt in die Gefäßwand injiziert, können ebenfalls zur Abgabe der Substanz an eine angestrebte Arterie verwendet werden.
Eine Ballonangioplastik ist eine übliche Behandlung einer ischämischen Herzerkrankung, wobei diese das Aufblasen eines Ballons in einem verstopften Blutgefäß zum Öffnen des blockierten Blutgefäßes umfasst. Unglücklicherweise führt dieses Behandlungsverfahren zu einer Verletzung der Endothelzellenauskleidung der Innenwände von Blutgefäßen, was häufig zu Restenose führt. Die hier beschriebenen Peptide können dazu verwendet werden, eine Proliferation und Migration der Endothelzellen, die sich an der Peripherie des durch den Ballon induziert geschädigten Bereichs befinden, zu induzieren, um die Lumenoberfläche des Gefäßes mit einer neuen Endothelzellenmonoschicht zu bedecken, wobei eine Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur des Blutgefäßes erhofft wird. Eine Koronarangioplastik wird häufig vom Anbringen eines intravaskulären Stents begleitet, was das Aufrechterhalten der Gefäßfunktion und die Vermeidung von Restenose unterstützen soll. Stents wurden bisher mit Heparin beschichtet, um eine Thrombose zu verhindern, bis der durch den Stent gebildete neue Kanal endothelisieren kann. Die hier beschriebenen Peptide können unter Verwendung von einem Fachmann bekannten Verfahren direkt auf den Stent appliziert werden. Die Peptide können lokal appliziert werden oder systemisch verabreicht werden, um eine Endothelisierung des Gefäßes oder der Gefäßwand zu verstärken und/oder andere Prozesse zu modulieren, um Thrombose und Restenose zu hemmen oder zu verringern.
Die vorliegende Erfindung verwendet vorzugsweise synthetische oder aus der Natur abgeleitete Polypeptidagonisten von durch den Thrombinrezeptor vermittelten Ereignissen. Beide Klassen von Mitteln besitzen eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne, die ein Polypeptidsegment, das selektiv an den Thrombinrezeptor hoher Affinität binden kann, umfasst. Dieses Polypeptidsegment umfasst eine Aminosäuresequenz, die homolog zu einer Tripeptid-Zellbindungsdomäne von Fibronektin ist.
Zusätzlich zur Thrombinrezeptorbindungsdomäne besitzen die stimulatorischen (agonistischen) Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die Sequenzen aufweist, die von den N-terminalen Aminosäuren eines Dodecapeptids, von dem bereits gezeigt wurde, dass es unter Serinproteasen hoch konserviert ist, abgeleitet sind. Die hemmenden Polypeptide umfassen diese konservierten Serinesterasesequenzen jedoch nicht.
Beispielsweise stellt die Erfindung eine Zahl von Polypeptiden, die zur Förderung einer Reparatur von Herzgewebe verwendbar sind, bereit. Für derartige Anwendungen stellt die Erfindung ein Polypeptidderivat von Thrombin (oder ein funktionelles Äquivalent eines derartigen Derivats) bereit, das eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne sowie eine Domäne mit einer konservierten Serinesterasesequenz von mindestens 12 Aminosäuren besitzt. Die Erfindung stellt auch eine Polypeptidverbindung mit mindestens 23 L-Aminosäuren bereit, die sowohl eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne als auch eine Domäne mit einer konservierten Serinesteraseaminosäu resequenz besitzt.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung mehrere Polypeptide, die spezifische Aminosäuresequenzen enthalten, bereit, beispielsweise eine Polypeptidverbindung, bei der die Thrombinrezeptorbindungsdomäne die L-Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO. 1) zusammen mit der konservierten Serinesterasesequenz Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 2) umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Polypeptidverbindung die L-Aminosequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 3).
Die Erfindung offenbart ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Förderung einer Gewebereparatur, die eine therapeutisch wirksame Konzentration von einer der im vorhergehenden beschriebenen Verbindungen in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Streckmittel umfasst. Typischerweise umfassen derartige Zusammensetzungen beispielsweise ausreichende Konzentrationen der Polypeptide zum Bewirken einer stimulatorischen Wirkung auf den Thrombinrezeptor, wie hier belegt wird. Daher umfassen derartige Zusammensetzungen typischerweise derart ausreichende Konzentrationen, dass Konzentrationen der Polypeptide an der Targetstelle erhalten werden, von denen in vitro gezeigt wurde, dass sie den Rezeptor stimulieren. Wenn endogene Konzentrationen eines sekundären Signals als inadäquat erachtet werden, können Zusammensetzungen verwendet werden, die ferner die Zugabe einer therapeutisch wirksamen Konzentration von VEGF, alpha-Thrombin, gamma-Thrombin oder anderen Wachstumsfaktoren umfassen. Derartige Kombinationen können eine additive oder synergistische Wirkung ausüben. In bestimmten Fällen wird, wenn eine Gewebeschädigung derart intensiv ist, dass Zellen, die auf die Polypeptide ansprechen können, nicht in ausreichenden Mengen vorhanden sind, angenommen, dass reaktionsfähige Zellen gleichzeitig injiziert werden können, um eine therapeutisch wirksame Kombination bereitzustellen.
Geeignete Träger werden ebenfalls zur Freisetzung des Wirkstoffs und vorzugsweise für eine langsame langzeitige Freisetzung mit der Zeit an der Zielstelle bereitgestellt. Eine Zahl von synthetischen biologisch abbaubaren Polymeren kann als Träger mit Eigenschaften einer langzeitigen Freisetzung dienen. Beispiele für diese Polymere umfassen Poly-αhydroxyester, wie Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Homopolymere und -Copolymere, Polyphosphazene (PPHOS), Polyanhydride und Poly(propylenfumarate).
Polymilchsäure/Polyglykolsäure(PLGA)-Homo- und -Copolymere sind als Vehikel mit verzögerter Freisetzung einschlägig bekannt. Die Freisetzungsrate kann durch einen erfahrenen Fachmann durch Variation des Verhältnisses Polymilchsäure/Polyglykolsäure und des Molekulargewichts des Polymers eingestellt werden (siehe Anderson et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997)). Das Einarbeiten von Poly(ethylenglykol) in das Polymer als Beimischung unter Bildung von Mikropartikelträgern ermöglicht eine weitere Abschwächung des Freisetzungsprofils des Wirkstoffs (siehe Gleek et al., J. Control Release 48: 259 (1997)). PGLA-Mikropartikel werden häufig mit Pluronic-Gelen oder Kollagen gemischt, um eine Aggregation zu verhindern und die Mikropartikel für eine direkte Injektion geeignet zu machen.
PPHOS-Polymere enthalten abwechselnd Stickstoff und Phosphor und keinen Kohlenstoff im Polymergerüst, was im folgenden in der Strukturformel (I) angegeben ist:
Die Eigenschaften des Polymers können durch eine geeignete Variation der Seitengruppen R und R', die an das Polymergerüst gebunden sind, eingestellt werden. Beispielsweise können der Abbau von und die Arzneimittelfreisetzung durch PPHOS durch Variieren der Menge der hydrolytisch instabilen Seitengruppen gesteuert werden. Beispielsweise wird bei einem stärkeren Einbau von mit entweder Imidazolyl oder Ethylglycinato substituiertem PPHOS eine Zunahme der Abbaurate beobachtet (siehe Laurencin et al., J. Biomed. Mater. Res. 27: 963 (1993)), wodurch die Arzneimittelfreisetzungsrate erhöht wird.
Polyanhydride, die in der Strukturformel (II) angegeben sind, besitzen genau definierte Abbau- und Freisetzungseigenschaften, die dadurch gesteuert werden können, dass variierende Mengen von hydrophoben oder hydrophilen Monomeren, wie Sebacinsäure und 1,3-Bis(p-carboxyphenoxy)propan, eingearbeitet werden (siehe Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19: 941 (1985)).
Poly(propylenfumarate) (PPF) sind sehr gewünschte biologisch kompatible implantierbare Träger, da sie ein injizierbares, in situ polymerisierbares, biologisch abbaubares Material sind. "Injizierbar" bedeutet, dass das Material mittels einer Spritze durch eine Standardnadel, die zur Injektion von Pasten und Gelen verwendet wird, injiziert werden kann. PPF bildet in Kombination mit einem Vinylmonomer (N-Vinyl-pyrrolidinon) und einem Initiator (Benzoylperoxid) eine injizierbare Lösung, die in situ polymerisiert werden kann (siehe Suggs et al., Macromolecules 30: 4318 (1997), Peter et al., J. Biomater. Sci. Poly., Ed. 10: 363 (1999) und Yaszemski et al., Tissue Eng. 1: 41 (1995)).
Der hier verwendete Ausdruck "eine therapeutisch wirksame Konzentration" ist als eine Konzentration des speziellen Mittels definiert, die eine ausreichende Zunahme der Rate der Reparatur oder Angiogenese ergibt oder die eine ausreichende Verringerung oder Hemmung von Restenose oder Gefäßverschluss ergibt. Erneut wird angenommen, dass diese Konzentrationen Mengen entsprechen, die zum Auslösen einer Stimulation des Thrombinrezeptors hoher Affinität in vitro ausreichend sind. Es wird jedoch angenommen, dass die Zusammensetzungen sehr wirksam sind, wenn die stimulatorischen (agonistischen) Polypeptide in einer Konzentration von 0,1 μM bis 10 μM vorhanden sind.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Thrombinderivat als ein Molekül mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest teilweise von der von Thrombin abgeleitet ist, und ungeachtet dessen, ob es in vivo oder in vitro synthetisiert wurde, definiert. Daher bezeichnet ein Thrombinderivat, das hier angegeben ist, ein Polypeptidmolekül, das weniger Aminosäuren als Thrombin umfasst.
Ein physiologisch funktionelles Äquivalent eines Thrombin derivats umfasst Moleküle, die sich von Thrombinderivaten in Einzelheiten unterscheiden, die die Funktion der Thrombinrezeptorbindungsdomäne oder der konservierten Serinesteraseaminosäuresequenz nicht beeinflussen. Diese Einzelheiten können, ohne hierauf beschränkt zu sein, konservative Aminosäuresubstitutionen und -modifikationen, beispielsweise eine Amidierung des Carboxylterminus, Acetylierung des Aminoterminus, Konjugation des Polypeptids an ein physiologisch inertes Trägermolekül oder Sequenzwechsel entsprechend den konservierten Serinesterasesequenzen umfassen.
Eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne ist als eine Polypeptidsequenz definiert, die direkt an den Thrombinrezeptor bindet und/oder eine Bindung zwischen Thrombinrezeptoren hoher Affinität und alpha-Thrombin kompetitiv hemmt.
Eine Domäne mit einer konservierten Serinesterasesequenz umfasst eine Polypeptidsequenz, die mindestens 4-12 der N-terminalen Aminosäuren des Dodecapeptids, von dem bereits angegeben wurde, dass es unter Serinproteasen hoch konserviert ist, enthält (Asp-X₁-Cys-X₂-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X₃-Val (SEQ ID NO. 4); wobei X₁ entweder Ala oder Ser bedeutet, X₂ entweder Glu oder Gln bedeutet und X₃ entweder Phe, Met, Leu, His oder Val bedeutet).
Ein stimulatorisches Polypeptid ist als ein Polypeptidderivat von Thrombin oder ein physiologisch funktionelles Äquivalent desselben mit der Fähigkeit sowohl zur Bindung an den Thrombinrezeptor als auch zur Stimulierung desselben definiert. Daher umfassen die stimulatorischen Peptide sowohl eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne als auch eine Domäne mit einer konservierten Serinesterasesaminosäuresequenz.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die in keinster Weise beschränkend sein sollen, erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
TP508 stimuliert die Proliferation und Migration von humanen Endothelzellen in vitro
Um zu bestimmen, ob TP508 indirekt die Proliferation von Endothelzellen induzieren konnte, wurden humane Mikrogefäßendothelzellen von Clonetics gekauft, auf Kunststoff von Gewebekulturqualität in 24-Vertiefungen-Kulturschalen ausplattiert und 24 h ohne Serum belassen. Die Zellen wurden 48 h in Medium mit oder ohne TP508 stimuliert, und danach wurde eine Proliferation unter Verwendung einer direkten Zellzählung getestet. Wie in 1 angegeben, stimulierte TP508 die Proliferation von Mikrogefäßendothelzellen um 30 bis 50 % gegenüber der von in Medium allein behandelten (1,0 μg/ml TP 508). Dieser Effekt schien spezifisch zu sein, da das Wachstum von aus Rattenaorta isolierten glatten Muskelzellen durch TP508 nicht beeinflusst wurde.
Die Effekte von TP508 auf die Migration von humanen Endothelzellen wurden unter Verwendung eines In-vitro-Monoschichtwundentests getestet, bei dem Endothelzellen in Kul-turschalen von 35 mm ausplattiert wurden und drei Tage fast bis zum Zusammenfließen wachsen gelassen wurden, und danach die Monoschicht durch Schaben über die Mitte der Schale mit einem Gummischaber zum Entfernen einer Zellenbande "verwundet" wurde. An diesem Zeitpunkt wurden Photos gemacht, und die Zellen wurden dann mit frischem Medium allein oder Medium, das verschiedenen Konzentrationen von TP508 enthielt, behandelt und weitere 48 h wachsen gelassen. Die Zellen wurden erneut photographiert, und die Entfernung, über die die Endothelzellen in den Wundbereich wanderten, wurde ermittelt. Wie in 2 angegeben, stimulierte TP508 eine Migration von Endothelzellen, auch wenn die Zellen auf Kunststoff allein gezüchtet wurden.
Diese Untersuchungen zeigten, dass TP508 direkte angiogene Wirkungen auf humane Endothelzellen hat, wobei es eine erhöhte Proliferation und Migration in vitro bewirkt. Weitere Untersuchungen zeigen, dass das Einwirken von TP508 auf Endothelzellen eine Schutzwirkung der Verhinderung des Tods von Zellen, der durch oxidative Einwirkungen verursacht wird, hat. Diese Schutzwirkung kann auch zu den Prozessen einer Reendothelisierung und Angiogenese beitragen.
Beispiel 2
TP508 stimuliert eine Angiogenese in vitro in einem Chorioalloantoismembranmodell
Untersuchungen mit operativen vollständigen Hautschnitten und offenen Schnittwunden im Rücken von Ratten zeigten, dass eine einzige topische Applikation von TP508 eine Revaskularisation und das Offenhalten von einen operativen Schnitt durchlaufenden Blutgefäßen stimuliert. Zwei operative Schnittwunden wurden auf dem Rücken einer Ratte ausgeführt. Eine Wunde wurde mit einer einzige Applikation von TP508 (0,1 μg) behandelt; die andere blieb unbehandelt. Blutgefäße wurden eher von der behandelten Wunde als von der Kontrolle angezogen.
Die Zugabe von TP508 zu Agarplatten, die auf die Chorioalloantoismembran von Hühnerembryos gegeben wurden, führte zu einem angiogenen Herauswachsen von Blutgefäßen. Das Wachsen von Blutgefäßen in Agarplatten, die TP508 enthielten, wurde stimuliert. Es bestand auch eine Zunahme des Herauswachsens von kollateralen Gefäßen in zu dem Pfropfen entfernten Gefäßen, die ähnlich der mit anderen angiogenen Faktoren beobachteten war.
Beispiel 3
TP508 zeigte Wirksamkeit bei der Behandlung einer Myokardischämie in einem Schweinemodell
Bei Yucatan-Minischweinen wurden toroidförmige Ameroid-Verschlussvorrichtungen an deren proximalen linken Umhüllungsarterien angebracht. Das Ameroid nahm mit der Zeit Wasser auf, was eine Gefäßverengung bewirkte. Ein Verschluss wurde vier Wochen nach dem Eingriff durch kontrastverstärkte Angiographie verifiziert. An diesem Zeitpunkt wurde der Brustkorb jedes Tiers erneut geöffnet, wobei die Region der Ischämie eine Formulierung mit langsamer Freisetzung von TP508, d.h. TP508 enthaltenden PGLA-Mikrokügelchen in einem Pluronic-Gel suspendiert, injiziert erhielt. Die PLGA-Mikrokügelchen, die gemäß der Beschreibung in Beispiel 6 hergestellt wurden, ergaben einen Anfangsfreisetzungsstoß des Arzneimittels (50 % der Menge in 24 h) und zeigten dann eine gesteuerte Freisetzung während weiterer 3–4 Tage, wobei nach dieser Zeit 80 % der Menge freigesetzt war. Das verwendete Gel war 30 % (Gew/V) Pluronic F68 in 0,9 % Kochsalzlösung. Zu jedem Milliliter Gel, zur Verringerung der Viskosität auf Eis, wurden 3,3 mg PLGA-Mikrokügelchen unmittelbar vor der Injektion gegeben. Dies ergab eine TP508-Dosis von 100 μg/ml Gel, die an zehn Stellen (100 μl pro Stelle) in dem ischämischen Bereich injiziert wurde. Kontrollen erhielten PLGA-Mikrokügelchen in Pluronic-Gel ohne TP508. Grundlinien- und Nachbehandlungsangiogramme und –echokardiogramme wurden erhalten.
Die Indizes für eine Myokardwandverdickung und die Herzausstoßleistungsfraktion zeigten Trends, dass mit TP508 behandelte Tiere durch Dobutamin induzierten Stress besser als Kontrollen tolerierten. Nach drei Wochen wurden die Tiere mit kontrastverstärkter Echokardiographie bewertet. Erste Ergebnisse an dieser begrenzten Zahl von Tieren zeigten, dass mit TP508 behandelte Tiere unter Dobutamin-Stress eine etwas größere Zunahme der Ausstoßleistungsfraktion und eine besser beibehaltene Wandverdickung im Vergleich zum Kontrollen aufwiesen. Daher scheint diese Behandlung die Wiederherstellung der Funktionalität des ischämischen Herzmuskels zu unterstützen.
Beispiel 4
TP508 stimuliert eine Myokardrevaskularisation bei einem Kaninchenmodell
TP508, das in PLGA-Mikrokügelchen mit verzögerter Freisetzung formuliert war, wurde in ischmämisches Kaninchenmyokard injiziert. Ein Ameroid-Verschlussmittel wurde über der lateralen Teilung der linken Hauptkoronararterie von zwei Kaninchen unmittelbar unterhalb der A-V-Furche gemäß der Beschreibung bei Operschall et al., J. Appl. Physiol. 88: 1438 (2000) angebracht. Zwei Wochen nach dem Anbringen wurden die Brustkörbe der Tiere erneut geöffnet. Bei einem Tier wurden TP508-Mikrokügelchen in Pluronic-Gel (gemäß der Beschreibung in Beispiel 3) an acht diskreten Stellen in dem und um den Bereich, der durch das verschlossene Gefäß bedient wurde, injiziert. Das andere Tier diente als nichtbehandelte Kontrolle. Etwa vier Wochen nach der Injektion wurden die Tiere getötet und ihre Herzen in 10%-igem gepuffertem Formalin 24 h fixiert. Die Herzen wurden dann in dem interessierenden Bereich seziert und durch Hämatoxylin-Eosin angefärbt und gegenüber von-Willebrand-Faktor (vWF), einem Endothelzellenmarker, immunmarkiert.
Die Histologie zeigte, dass das Kontrolltier in dem durch das Verschlussmittel bedienten Bereich eine signifikante Fibrose aufwies. Das mit TP508 behandelte Herz wies andererseits gesund aussehendes Myokard mit einer größeren Zahl funktioneller Kapillaren mit offensichtlichen roten Blutzellen auf.
Beispiel 5
TP508 unterdrückt Restenose in einem Hypercholesterinämie-Kaninchenmodell
Dieses Verfahren wurde so gestaltet, dass es ein System zum Testen der Wirksamkeit einer Testprobe der Hemmung von Neointimabildung und Gefäßverschluss nach einer Angioplastik bei New Zealand White Rabbits mit Hypercholesterinämie ergibt. Die Tiere erhielten während 3 Wochen als Futter eine fettreiche Ernährung, die aus 0,5 % Cholesterin und 2,0 % Erdnussöl bestand. Die Tiere wurden 24 h vor der Operation vorbehandelt; die Beckenarterie wurde wie beschrieben mit einer Ballonangioplastik verletzt; und die Tiere wurden mit TP508 7 Tage behandelt. Die Tiere wurden 4 Wochen mit einer fettreichen Ernährung gehalten. Eine Angiographie wurde vor der Ballonangioplastik und bei Beendigung des Experiments durchgeführt. Die verletzten und nichtverletzten Beckenarterien wurden gewonnen und für eine Histologie präpariert. Morphometrische Messungen wurden hinsichtlich Lumen, Neointima (falls vorhanden) und Tunica media durchgeführt.
Testproben von TP-508 wurden in steriler apyrogener Kochsalzlösung zu der gewünschten Konzentration gelöst/verdünnt und durch intravenöse Injektion in einem Volumen von 0,2 ml einen Tag vor der Operation, am Tag der Operation und während 6 aufeinanderfolgenden Tagen nach der Operation verabreicht.
Ein Mittelliniennackenschnitt von 5 cm wurde durchgeführt und die rechte Halsschlagader wurde freigelegt, proximal ligiert und eingeschnitten. Ein 4 Fr Berman Balloon Angiographic Catheter wurde dann in die Aorta eingeführt. Eine 5-Fr-Hülle wurde in die Aorta über den 4 Fr Berman Balloon Angiographic Catheter eingeführt. 3 ml Blut wurden zur Cholesterinzählung gewonnen. Das Kaninchen erhielt dann Heparin und (falls notwendig) weitere Anästhetika inji ziert. Zur Sichtbarmachung der Beckenarterien wurden 6 ml Hypaque 76 % gemischt mit 4 ml steriler Kochsalzlösung durch den Katheter injiziert. Eine Abbildung der Beckenarterien wurde erhalten (das Bild wird mit einem Gitter markiert und Scheren werden an der rechten Seite angebracht). Der 4 Fr Berman Balloon Angiographic Catheter wurde aus der Hülle entfernt. Ein Ballonkatheter von 0,014''/3,0 mm × 20,0 mm/120 cm wurde dann durch die Hülle in die Aorta und die Beckenarterie eingeführt. Der Ballon wurde 3-mal mit 10 ATM 30 s mit Abständen von 1 min aufgeblasen. Der Katheter und die Hülle wurden dann entfernt. Die rechte Arteria carotis wurde mit Seidennahtmaterial 3,0 ligiert. Der Nackenschnitt wurde mit PDS geschlossen und die Haut wurde geheftet und mit doppelter antibiotischer Salbe behandelt.
Die Testprobe(n) oder Kontrollprobe(n) wurden dann an das Kaninchen verabreicht. Die Testprobe wurde auf folgende Weise verdünnt: 0,3 ml Kochsalzlösung wurde in eine 1,0-ml-Spritze mit einer 23 G 1''-Nadel aufgezogen. Das Volumen wurde in die TP-508-Phiole injiziert. Nach dem Auflösen von TP-508 wurden 0,25 ml der Lösung entnommen und verabreicht. Der Kanülenschlauch wurde dann mit Kochsalzlösung gespült. Wenn das Kaninchen eine Kontrolle war, wurden 0,2 ml Kochsalzlösung injiziert und es wurde mit weiterer Kochsalzlösung gespült. Das Kaninchen erhielt auch 0,3 ml Buprenorphin durch subkutane Injektion.
Nach der Operation erhielt das Kaninchen Zeit um Wachwerden, während es auf dem Heizkissen lag. Das Kaninchen wurde dann in seinen Käfig zurückgegeben und es erhielt Nahrung und Wasser nach Belieben. Die Kaninchen wurden weitere 4 Wochen bis zur Tötung bei dieser Ernährung gehalten.
Vier Wochen nach dem Verfahren wurden beide Beckenarterien in situ fixiert, gewonnen und zur Histologie präpariert. Digitalbilder wurden dann von den histologischen Serienschnitten, die etwa 1 mm von einander beabstandet waren, aufgenommen und morphometrische Messungen wurden hinsichtlich Lumen, Neointima (falls vorhanden) und Tunica media durchgängig im Bereich der Verletzung gemacht.
Histologiezusammenfassung
Die morphohistologische Analyse von 19 Proben wurde unter Verwendung von Image-Pro Plus und Excel-Software durchgeführt. Von den 19 Proben zeigten 2 eine Beeinträchtigung der äußeren elastischen Lamina. Eine Probe von den 19 schien eine weitere Sektion zu erfordern. Daher wurden 16 Proben verglichen, die 7 behandelte und 9 Kochsalzkontrollen umfassten.
Die Dicke der Restenoseläsion wurde durch Ermitteln der Fläche der Neointima durch digitale Analyse bestimmt. Die Tunica media der Gefäße wurde in ähnlicher Weise ermittelt. Diese Werte wurden dann durch Aufsummieren der Fläche dieser zwei Regionen und Dividieren des Ergebnisses durch die Fläche von normaler (nicht-verletzter) Media, die in der gleichen Serie histologischer Schnitte gefunden wurde, genormt. Es wurde verifiziert, dass kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen hinsichtlich der Bereiche, die für nicht-verletzte Media gefunden wurden, bestand.
Beim Vergleichen der behandelten Tiere gegenüber Kontrollen wurde das Ausmaß der Restenose durch drei unterschiedliche Verfahren analysiert: das Verfahren eines "einzigen schlimmsten Werts", das Verfahren der "durchschnittlichen Läsionsdicke" und das Verfahren des "Durchschnittswerts aller Schnitte". Das Verfahren eines "einzigen schlimmsten Werts" vergleicht den bei den operierten Gefäßen erhaltenen maximalen Restenosewert. Das Verfahren der "durchschnittlichen Läsionsdicke" vergleicht die Durchschnittswerte aller anomalen Punkte innerhalb eines genau definierten Verletzungsbereichs zwischen behandelten Gefäßen. Schließlich vergleicht das Verfahren des "Durchschnittswerts aller Schnitte" die durchschnittliche Dicke aller gemessenen Proben ungeachtet dessen, ob sie ein Teil der Läsion zu sein scheinen oder nicht. Die Mittelwerte dieser Ergebnisse wurden auf statistische Signifikanz durch den Student-T-Test getestet.
Zusammenfassen der Daten
Alle Datenanalysen wurden unter Verwendung des zweiseitigen t-Tests mit der Annahme ungleicher Varianzen durchgeführt. Alpha ist 0,05 und die mittlere Differenz wird als 0 angenommen. Jede Analyse umfasst n = 7 für behandelte Proben und n = 9 für eine Kochsalzkontrolle. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst. Der angegebene "Differenz"-Wert betrifft die prozentuale Änderung der behandelten Probe im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle. Mit einem Sternchen bezeichnete Werte waren statistisch signifikant. Tabelle 1
Folgerung
Die Daten zeigen, dass TP-508 Restenose und Gefäßverschluss in dem Hypercholesterinämie-Kaninchenmodell signifikant unterdrückte. Dieses Ergebnis ist insofern beständig, als es unabhängig von dem zur quantitativen Bestimmung der Ergebnisse gewählten Verfahren ist.
Beispiel 6
Herstellung von Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymer-Mikrokügelchen von TP508
Ein Doppelemulsionsverfahren wurde zur Herstellung von Mikrokügelchen aus Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymer (PLA/PGA), die TP508 enthalten, verwendet. Kurz gesagt, wurden die Matrixkomponenten in Methylenchlorid gelöst und TP508 in Wasser gelöst. Die beiden wurden unter Verwirbeln allmählich zusammengemischt, wobei eine Wasser-in-Öl (W/O)-Emulsion gebildet wurde. Polyvinylalkohol (0,3 % in Wasser) wurde unter weiterem Verwirbeln zu der Emulsion zur Bildung der zweiten Emulsion (O/W) gegeben, wodurch eine doppelte Emulsion gebildet wurde: eine aus PLA/PGA-Tröpfchen bestehende O/W-Emulsion und in diesen Tröpfchen eine zweite disperse Phase, die aus TP508 in Wasser bestand. Bei einer Phasentrennung bildeten die PLA/PGA-Tröpfchen diskrete Mikrokügelchen, die TP508 enthaltende Hohlräume enthielten. Zum Bewirken der Phasentrennung der Mikrokügelchen wurde eine 2%-ige Isopropylalkohollösung zugegeben. Die Teilchen wurden durch Zentrifugation gewonnen und dann zur Entfernung von verbliebener Feuchtigkeit lyophilisiert. Die Zusammensetzung der Matrix wurde zur Bildung von Mikrokügelchen mit unterschiedlicher Freisetzungskinetik variiert (Tabelle 2).
Tabelle 2 Zusammensetzung verschiedener Mikrokügelchenformulierungen
Der mittlere Durchmesser der Mikrokügelchen wurde in einem Counter Counter ermittelt und die Arzneimitteleinfangwirksamkeit wurde durch spektrophotometrischen Test bei 276 nm anschließend an das Auflösen einer abgewogenen Probe von Mikrokügelchen in Methylenchlorid und Extraktion des freigesetzten Arzneimittels in Wasser ermittelt (Tabelle 3).
Tabelle 3 Durchmesser und Arzneimitteleinfangwirksamkeitder Formulierung
Um die Freisetzung von TP508 aus den verschiedenen PLA/PGA-Matrizes zu ermitteln, wurden 20 mg Mikrokügelchen in 1,0 ml PBS, das in 1,5-ml-Polypropylenmikrozentrifugenröhrchen enthalten war, gegeben. Die Röhrchen wurden bei 37 °C inkubiert und mit 6 Umin^–1 geschüttelt. Zu verschiedenen Zeiten wurden die Röhrchen zentrifugiert und der freigesetztes TP508 enthaltende Überstand entfernt und zur anschließenden Analyse eingefroren. Frisches PBS wurde zu den Mikrokügelchen gegeben und die Inkubation wurde fortgesetzt. TP508 im Überstand wurde durch die Extinktion bei 276 nm ermittelt. Für jede Formulierung wurden vierfache Bestimmungen der Freisetzung durchgeführt. Die Formulierungen B und D zeigten keine nachweisbare Arzneimittelfreisetzung während einer Inkubation von 28 Tagen bei 37 °C. Die übrigen Formu 1ierungen setzten alle nachweisbare Mengen von TP508 frei, obwohl in allen Fällen die freigesetzte Arzneimittelmenge innerhalb von 3-4 Tagen unter die Nachweisgrenzen (< 1 μg/mg Matrix/Tag) fiel. Die Formulierungen A und C zeigten die größte Freisetzung von TP508, wobei diese 60-80 % des eingefangenen Arzneimittels während 3-4 Tagen freisetzten. Die Formulierung mit der schnellsten Freisetzungskinetik, C, wurde zum weiteren Testen in In-vivo-Untersuchungen, die in Beispiel 3 und Beispiel 4 beschrieben sind, gewählt.
Obwohl diese Erfindung speziell unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen derselben angegeben und beschrieben ist, ist einem Fachmann klar, dass verschiedene Änderungen hinsichtlich Form und Einzelheiten in derselben ohne Abweichen vom Schutzumfang der Erfindung, der durch die angefügten Ansprüche gegeben ist, durchgeführt werden können. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Förderung einer Herzgewebereparatur.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptid eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO. 1) und eine konservierte Serinesterasesequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die konservierte Serinesterasesequenz Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 2) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Thrombinderivatpeptid die Aminosäuresequenz: Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 3) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Thrombinderivatpeptid aus der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 4) besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Peptid zur Verabreichung während einer oder anschließend an eine Herzoperation vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament zur Verabreichung durch Injektion in das Herzgewebe vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Medikament eine Formulierung mit verzögerter Freisetzung, die das angiogene Thrombinderivatpeptid umfasst, zur Verabreichung an Herzgewebe ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Formulierung mit verzögerter Freisetzung Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Mikroteilchen, die das angiogene Thrombinderivatpeptid umfassen, sind.
Verwendung eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Gefäßneubildung von Herzgewebe.
Verwendung eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Gefäßendothelzellenproliferation.
Verwendung eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Restenose bei einem Patienten anschließend an eine Ballonangioplastik.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Peptid auf einen Ballonangioplastikkatheter aufgetragen wird.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament zur systemischen Verabreichung dient.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Medikament zur lokalen Verabreichung an einen durch einen Ballon induzierten geschädigten Bereich eines Blutgefäßes dient.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei ein Stent mit dem angiogenen Thrombinderivatpeptid zur Einführung in ein Blutgefäß an einem durch einen Ballon induzierten geschädigten Bereich beschichtet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei das Peptid eine Thrombinrezeptorbindungsdomäne mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Ala (SEQ ID NO. 1) und eine konservierte Serinesterasesequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die konservierte Serinesterasesequenz Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 2) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Thrombinderivatpeptid die Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 3) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Thrombinderivatpeptid aus der Aminosäuresequenz Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val (SEQ ID NO. 4) besteht.
Stent, der mit einem angiogenen Thrombinderivatpeptid beschichtet ist.
Verwendung eines angiogenen Thrombinderivatpeptids zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung eines Gefäßverschlusses.