CN105765061A - 工程化耐受化疗药物的t-细胞用于免疫治疗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于免疫治疗的“现成”异体治疗细胞结合化疗以治疗癌症患者的用途。特别地，本发明人开发了工程改造对化疗试剂耐受的异体T?细胞的方法。通过这种策略提供的治疗益处应当通过化疗和免疫治疗之间的协同作用而增强。特别地，本发明涉及用于通过失活至少一个编码T?细胞受体组分的基因并通过修饰所述T?细胞以赋予耐药性从而修饰T?细胞的方法。本发明开辟了对治疗癌症的标准的和可负担的过继性免疫治疗策略的通道。

Description

工程化耐受化疗药物的T-细胞用于免疫治疗的方法

技术领域

本发明涉及使用用于免疫治疗的“现成的(off-the-shelf)”异体的(同种异体，allogeneic)治疗性细胞结合化疗以治疗癌症患者。特别地，本发明人开发出工程化(工程改造，工程设计，engineering)异体T-细胞耐受化疗试剂(chemotherapy agent)的方法。通过这种策略获得的所述治疗益处应该会通过化疗和免疫治疗之间的协同效应而增强。特别地，本发明涉及通过失活至少一个编码T-细胞受体组分的基因并且通过修饰(改变，modify)所述T-细胞以赋予耐药性而用于修饰T-细胞的方法。本发明为用于治疗癌症的标准而可负担的过继性免疫治疗(adoptive immunotherapy)策略的开辟了通道。

背景技术

过继性免疫治疗，涉及离体(ex vivo)产生的自体抗原-特异性T-细胞的转移，是一种很有前途的癌症治疗策略。用于过继性免疫治疗的T-细胞能够通过抗原特异性T-细胞的扩增来产生或通过遗传工程改造而重定向T-细胞来产生(Park，Rosenberg et al.2011)。病毒抗原特异性T-细胞的转移是用于治疗移植相关的病毒感染和罕见的病毒相关的恶性肿瘤的成熟的治疗方案。同样地，肿瘤特异性T-细胞的分离和转移在治疗黑素瘤中已证明是成功的。T-细胞内的新是特异性已经成功地通过转基因T-细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的基因转移产生。CAR是由靶向(targeting)部分构成，该靶向部分在单个信号融合分子中与一个或多个信号区(signaling domain)结合。CAR已经成功地容许T-细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤(solid tumor))的肿瘤细胞表面上表达的抗原实现重定向((Jena，Dotti et al.2010)。

目前使用过继性免疫治疗用于患者的治疗的方案是基于自体细胞转移。在这种方法中，T淋巴细胞从患者中回收，经体外遗传修饰或选择，如果必要体外(in vitro)培养以扩增数量细胞，并且最后注入患者。自体治疗对于实际应用面临着大量的技术和物流障碍(后勤障碍，logistichurdle)，其产生需要昂贵的专用设施和专家人员，它们必须在癌症诊断之后很短的时间内就产生，并在很多情况下，患者的预治疗会导致免疫功能退化，而使患者的淋巴细胞可能功能受损并且以非常低的数目存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制备实际上是一种新产品，导致效能和安全性大幅变化。

理想的情况下，人们希望使用标准化疗法，其中异体的治疗细胞能够预先生成，详细表征，并可立即给药至患者。然而，异体的T-细胞获自属于相同物种的个体，但遗传上是相异的。因此，异体细胞的内源性TCR特异性会识别宿主组织为外来物，导致移植物抗宿主病(移植抗宿主病，graft versus host disease)(GvHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。T-细胞受体(TCR)是响应抗原的出现参与T-细胞的激活的细胞表面受体。对于免疫球蛋白分子，α和β链的可变区通过V(D)J重组产生，在T-细胞群内产生多种多样的抗原特异性。然而，相对于识别完整抗原的免疫球蛋白，T-细胞通过与MHC分子相连接的处理的肽片段激活，引入通过T-细胞的另一维度的抗原识别，这被称为MHC限制。在供体和受体之间通过T-细胞受体识别MHC差异，会导致T-细胞增殖和GVHD的潜在发展。为了有效地使用异体细胞，本发明人失活了TCRα或TCRβ基因，这导致从T-细胞的表面消除了TCR，从而防止识别同种异型抗原而由此识别GVHD。

虽然在癌症检测和肿瘤细胞生物学的领域取得了优异的进展，但是晚期癌症和转移性癌症的治疗仍然是一个重大的挑战。细胞毒性的化疗药物仍然是最常用的，并成功地用于抗癌治疗。多种细胞毒性药物，如抗代谢物、烷化剂、蒽环类抗生素、DNA甲基转移酶抑制剂、铂化合物和纺锤体毒素已经开发用于杀死癌细胞。然而，它们并不一致有效，并且采用新疗法，如免疫治疗引入这些药物是有问题的。例如，化疗药物可能会由于药物的非特异性毒性曲线而有损于建立稳健的抗肿瘤免疫活性细胞。靶向细胞增殖途径的小分子类疗法也可能妨碍建立抗肿瘤免疫力。然而，如果瞬时有效的化疗方案能够与新的免疫活性细胞疗法组合，则抗肿瘤疗法中的显著进步就可能实现(综述(Dasgupta，McCarty et al.2011))。

因此，为了结合化疗使用“现成的”异体治疗细胞，本发明人开发出了对化疗药物耐受的异体T-细胞进行工程改造的方法。通过这种策略获得的治疗益处应该会通过化疗和免疫治疗之间的协同效应而增强。而且，耐药性也能够受益于选择性扩增的工程改造的T-细胞的能力，从而避免了由于向这些细胞的无效基因转移所致的问题。

发明内容

在一个方面中，本发明提供了工程改造的免疫细胞而使之对嘌呤核苷酸类似物(PNA)化疗药物，如氯法拉滨(clofarabine)和氟达拉滨(fludarabine)耐受的方法，使得这些免疫细胞能够用于在用传统化疗预治疗的患者中的癌症的免疫治疗治疗。考虑到操作的自体治疗，免疫细胞可以来源于患者，如TIL(肿瘤浸润淋巴细胞，tumor infiltrating Lymphocyte)的情况下，或者考虑到产生的异体细胞，免疫细胞可以来自供体，该免疫细胞可以用于异体治疗。

在后一种情况下，当免疫细胞是T-细胞时，本发明还提供了工程改造使之既耐受化疗药物又是异体的T-细胞的方法。这种方法，除了失活药物敏化基因，如dcK和HPRT基因之外，还包括失活至少一个编码T-细胞受体(TCR)组分的基因，尤其是TCRα、TCRβ基因。

根据另一方面，耐药性可以通过表达耐药基因而赋予T-细胞。根据本发明多个基因的变异等位基因，如二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙调磷酸酶或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)已经确定赋予细胞耐药性。

本发明涵盖了通过本发明的方法可获得的分离的细胞或细胞系，更特别是分离的免疫细胞，其包含任何本文描述的蛋白质、多肽、等位基因变体，改变或删除的基因或载体。

本发明的免疫细胞或细胞系可以进一步包含外源重组多核苷酸，特别是CAR或自杀基因或者它们可以包括改变或删除的基因，其编码检查点蛋白(checkpoint protein)或它们的配体，这有助于其作为治疗产品，理想地是作为“现成的”产品的效率。在另一方面，本发明涉及用于通过给药经由上述方法可获得的工程改造的免疫细胞(engineered immune cell)治疗或预防患者的癌症的方法。

附图说明

-图1对应于途径和嘌呤核苷类似物(PNA)的细胞毒性的示意图；酶脱氧胞苷激酶(dCK)的失活赋予了对药物氯法拉滨和氟达拉滨的耐受；

-图2示出酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的失活赋予了对药物6-巯基嘌呤(6MP)和6-硫代-鸟嘌呤(6TG)的耐受；

-图3A描绘了在外显子和内含子方面的整体dCK基因构造，以及

图3B示出了对于dCK外显子2中的2TALE-核酸酶对所定位的TALE-核酸酶靶位点的序列；

-图4示出了遵照来产生和表征HPRT KO T-细胞的工作流程；D0表示第0天，Dn表示第n天；T7对应于内切酶T7分析；

-图5示出了获得自内切T7分析的结果以检查dCK基因的处理；上部的带对应于未处理的WT dCK基因而2条下部的带对应于经处理的dCK基因；

-图6表示在电穿孔后的14天的时间段用5μg或10μg编码dCK2TALE-核酸酶的mRNA处理的dCK KO T-细胞以及WT T-细胞的对照1和2的细胞扩增。

-图7表示在第8天(D8)在1μM氯法拉滨(+)存在或氯法拉滨(-)不存在下(通过使用5μg的TALE-核酸酶dCK 2对)实施内切酶T7分析以检查T-细胞中的dCK失活；

-图8表示在增量的氯法拉滨(10nM至10μM)的存在下培养2天，WT和dCK KO T-细胞(用5μg或10μg TALE-核酸酶dCK 2对处理)的细胞存活率的百分数。本图容许对两个细胞群测定氯法拉滨IC 50；

-图9示出了用于产生和表征氯法拉滨耐受的异体T-细胞的2个工作流程；相比于当未进行药物选择时的下面的那个，上面的一个对应于当进行药物选择的情况；第0天(D0)是当实现通过TRAC和dCK TALE-核酸酶的双电穿孔时的那天。

-图10对应于内切酶T7分析在电穿孔之后在不同时间(D1，D3和D6)基因检查T-细胞内的双KO dCK/TRAC的效能。对于简单KO dCK T-细胞(+-)和简单KO TRAC T-细胞(-+)，双KO dCK/TRAC T-细胞(++)和WT T-细胞(--)，在实施例中示出了用于每个基因座(位点，locus)的引物；下面的带表示正确的dCK和TRAC基因处理；

-图11对应于在氯法拉滨(+)存在下或氯法拉滨(-)不存在，有(+)或无(-)TRAC失活的情况下的内切酶T7分析和深度测序数据以检查dCK失活的效能，图例与图10中相同；进行插入缺失(indel)频率以评价在dCK基因座上的插入或缺失率；

-图12A表示存在抗-TCRmAb-PE((标记的T-细胞)或无抗-TCRmAb-PE(未标记T-细胞)存在下采用T-细胞实施的标记对照物实验；图12B监测在存在或不存在氯法拉滨下培养之后，在TRAC KO T-细胞纯化前后收集的TCAR阴性细胞。这些细胞也对dCK基因进行失活；

-图13示出了简单KO dCK和TRACT-细胞和双KO dCK/TRAC T-细胞相对于WTT-细胞在无氯法拉滨存在下电穿孔后12天长的生长速率；

-图14示出了dCK/TCAR双KO CART-细胞在具有不同氯法拉滨剂量(0.1至10μM)的培养基中相对于CAR T-细胞(有或无氯法拉滨)为期11天的生长速率曲线；

-图15示出了简单KO dCK或TRAC T-细胞，双KO dCK/TCART-细胞在具有不同氯法拉滨剂量(1nM至100μM)的培养基中相对于WTT-细胞的细胞存活率的百分比；该曲线允许测定氯法拉滨对每种T-细胞群的IC50；

-图16表示双KO TRAC/dCK CAR T细胞相比于CAR FMC63T细胞(二者都表达CD19抗原)相对于双KO TRAC/dCK T细胞(无CAR，因此未表达CD19抗原)和WT T细胞(无KO和无CAR)的特异性细胞毒性的百分比；

-图17示出了双KO dCK/TCAR CAR T-细胞相对于CAR T-细胞对照在这些T-细胞培养于增加剂量的氯法拉滨(10ng至100μg，上图)和氟达拉滨(10μM至100μM，下图)中的细胞存活率百分数。这些图表容许测定两种药物氯法拉滨和氟达拉滨的IC50；

-图18对应于在第2天(D 2)基因检查Daudi细胞(+)(使用5μg编码dCK TALE-核酸酶的mRNA)相对于WT-细胞(-)的dCK失活效能的内切酶T7分析。上带对应未处理的dCK基因，而2条下带对应于dCK失活的产物；

-图19表示在不存在或存在增量氯法拉滨(0.1至1μM)下KO dCKDaudi细胞相对于WT Daudi细胞为期7天的生长率(以×10⁶细胞表示)；

-图20示出了关于外显子和内含子的总HPRT基因结构和不同的TALE-核酸酶靶位点(外显子2中的它们的全部)的定位；

-图21描绘了用于产生和表征HPRT KO T-细胞的工作流程；

-图22示出了检查第4天(D4)通过TALE-核酸酶HPRT对n°1和T对n°2(T pair n°2)(测试2个剂量：5μg和10μg)的T-细胞中HPRT基因失活的内切酶T7分析；

-图23表示通过使用5或10μg TALE-核酸酶HPRT 1对(HPRT1)或TALE-核酸酶HPRT 2对(HPRT2)的KO HPRT T-细胞相对于WT T-细胞对照1和对照2的为期13天的生长率(以×10⁶细胞表示)；

-图24表示在使用5或10μg TALE-核酸酶HPRT对n1(TALE-核酸酶HPRT 1)的这些T-细胞培养于1μM的药物6TG中时相对于WT T-细胞[标记标准(symbolized par)(-)]在D8和D18时检查HPRT基因失活的内切酶T7分析；

-图25表示在4G7CAR存在或不存在下检查T-细胞中HPRT基因失活的内切酶T7分析；在没有6TG选择的情况下进行这种分析；

-图26示出了KO HPRT CAR T-细胞相对于CAR 4G7T-细胞(都表达CD19抗原)和WT T-细胞(无KO和无CAR)的特异性细胞毒性的百分数；

-图27示出了KO HPRT CART-细胞相对于WT T-细胞在增加剂量的6TG药物(10ng至50μM)中的细胞存活率的百分数。

具体实施方式

除非本文中专门定义，所使用的所有技术和科学术语具有在基因治疗，生物化学、遗传学和分子生物学领域内的技术人员通常理解的相同含义。

类似或等效于本文中描述的那些的所有方法和材料都可以在本发明的实践或测试中使用，其中，合适的方法和材料在本文中都进行了描述。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义，为准。此外，除非另有规定，材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。

除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术，这都属于本领域的技术范围。这些技术充分解释于文献中。参见，例如，CurrentProtocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley andson Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrook et al，2001，Cold Spring Harbor，New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，尤其是，Vols.154和155(Wu et al.eds.)和Vol.185，“Gene Expression Technology”(D.Goeddel，ed.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

-耐药性T-细胞

正如本文中所用的术语“治疗试剂”，“化疗试剂”，或“药物”是指可以与癌细胞相互作用，从而降低细胞的增殖状态和/或杀死细胞的化合物或其衍生物。化疗试剂的实例包括，但不限于：烷化剂(例如，环磷酰胺，异环磷酰胺)、代谢拮抗剂(例如，嘌呤核苷抗代谢物，如氯法拉滨、氟达拉滨或2'-脱氧腺苷、氨甲蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、阿霉素)，植物衍生的抗肿瘤试剂(例如，长春新碱、长春地辛、紫杉醇)，顺铂、卡铂、依托泊苷等。这类药物可以进一步包括，但不限于抗癌试剂TRIMETHOTRIXATE^TM(TMTX)、TEMOZOLOMIDE^TM、RALTRITREXED^TM、S-(4-硝基苄基)-6-硫肌苷(thioinosine)(NBMPR)、6-苄基胍(6-BG)、双-氯亚硝基脲(BCNU)和CAMPTOTHECIN^TM，或它们的任意的治疗性衍生物。

正如本文中所用，对试剂“抗性或耐受的”的细胞是指经过遗传修饰而使细胞在一定量的试剂存在下增殖，该试剂抑制或阻止未经修饰的细胞的增殖。

耐药性基因的表达

在特定的实施方式中，所述耐药性可以通过表达至少一个耐药性基因而赋予于T-细胞。所述耐药性基因是指编码对试剂，如化疗试剂(例如，氨甲喋呤)“耐受”的核酸序列。换而言之，耐药性基因在细胞中的表达允许在药物的存在下细胞的增殖比不具有耐药性基因的相应细胞的增殖程度更大。本发明的耐药性基因可以编码对以下各项的耐药性：抗代谢物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷化剂、蒽环霉素、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和素、它们的似物或衍生物等。

多种耐药性基因已经确定可以潜在地用于赋予靶向细胞耐药性(Takebe，Zhao et al.2001；Sugimoto，Tsukahara et al.2003；Zielske，Reeseet al.2003；Nivens，Felder et al.2004；Bardenheuer，Lehmberg et al.2005；Kushman，Kabler et al.2007)。

耐药性基因的一个实例也可以是二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变体或修饰形式。DHFR是参与调节细胞中的四氢叶酸的量的酶，并对于DNA合成是必不可少的。叶酸类似物，如甲氨蝶呤(MTX)会抑制DHFR并因此用作临床上的抗肿瘤剂。已经介绍了不同的DHFR突变体形式，其提高了对于在疗法中所用抗叶酸类物的抑制作用的耐受。在特定的实施方式中，根据本发明的耐药性基因可以是编码人野生型DHFR(SEQ ID NO：14，基因库：AAH71996.1)的突变体形式的核酸序列，其包含至少一个赋予抗叶酸治疗，如甲氨蝶呤的耐药性的突变。在特定的实施方式中，DHFR的突变体形式在位置G15、L22、F31或F34，优选在位置L22或F31上包含至少一个突变的氨基酸((Schweitzer，Dicker et al.1990)；国际申请WO94/24277；美国专利US6,642,043)。在特定的实施方式中，DHFR突变形式在位置L22和F31上包含2个突变氨基酸。本文中的氨基酸位置的对应关系经常依据SEQ ID NO:14中阐述的野生型DHFR多肽的形式的氨基酸的位置进行表达。在特定实施方式中，在位置15上的丝氨酸残基优选用色氨酸残基取代。在另一特定实施方式中，位置22上的亮氨酸残基优选用将会中断突变体DHFR结合至抗叶酸剂的氨基酸，优选使用不带电荷的氨基酸残基，如苯丙氨酸或酪氨酸进行取代。在另一特定实施方式中，位置31或34上的苯丙氨酸残基优选用小的亲水性的氨基酸，如丙氨酸，丝氨酸或甘氨酸取代。

如本文中所用，“抗叶酸剂”或“叶酸类似物”是指针对在一定程度上干扰叶酸代谢途径的分子。抗叶酸剂的实例包括，例如，甲氨蝶呤(MTX)；氨基喋呤；三甲曲沙(Neutrexin^TM)；依达曲沙；N10-炔丙基-5,8-二脱氮杂叶酸(二去氮杂叶酸，dideazafolic acid)(CB3717)；ZD1694[土莫德(Tumodex)]，5,8-二脱氮杂叶酸(IAHQ)；5,10-二脱氮杂四氢叶酸(DDATHF)；5-脱氮杂叶酸；PT523(N-α-(4-氨基-4-脱氧蝶酰基(deoxypteroyl))-Nδ-半酞酰基(半邻苯二甲酰基，hemiphthaloyl)-L-鸟氨酸)；10-乙基-10-脱氮杂氨基蝶呤(DDATHF，洛美曲索(lomatrexol))；吡曲克辛；10-EDAM；ZD1694；GW1843；培美曲塞(Pemetrexate)和PDX(10-炔丙基-10-脱氮杂氨基蝶呤)。

耐药性基因的另一实例也可以是肌苷(ionisine)-5'-单磷酸脱氢酶Ⅱ(IMPDH2)(在鸟苷核苷酸的从头合成中的限速酶)的突变体或修饰形式。IMPDH2的突变体或修饰形式是IMPDH抑制剂抗性基因。IMPDH抑制剂可以是麦可酚酸(麦考酚酸，mycophenolic acid)(MPA)或其前体药物吗替麦考酚酸酯(MMF)。突变IMPDH2可以在野生型人IMPDH2(SEQ IDNO：15；NP_000875.2)的MAP结合部位上包含至少一个，优选两个导致对IMPDH抑制剂的耐药性显著增加的突变。这些突变优选处于位置T333和/或S351(Yam，Jensen et al.2006；Sangiolo，Lesnikova et al.2007；Jonnalagadda，Brown et al.2013)。在特定实施方式中，位置333的苏氨酸残基替换为异亮氨酸残基，而351位上的丝氨酸残基替换为酪氨酸残基。本文中所描述的氨基酸位置的对应关系经常依据SEQ ID NO:15中说明的野生型人IMPDH2多肽的形式的氨基酸的位置表达。

另一耐药性基因是钙调磷酸酶的突变形式。钙调磷酸酶(PP2B)是参与许多生物过程并是T-细胞激活的中心的广泛表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。钙调磷酸酶是由催化亚单元(CnA；三种异构体)和调节亚单元(CnB；两种异构体)构成的异源二聚体。在T-细胞受体接合之后，钙调磷酸酶使转录因子NFAT脱磷酸化，允许其转位至细胞核并激活关键靶基因，如IL2。与FKBP12复合的FK506，或与CyPA复合的环孢霉素A(CsA)阻断NFAT进入钙调磷酸酶的活性位点，防止其去磷酸化，并且从而抑制T-细胞活化((Brewin，Mancao et al.2009)。本发明的耐药性基因可以是编码突变形式的钙调磷酸酶的核酸序列，该突变形式的钙调磷酸酶对钙调磷酸酶抑制剂，如FK506和/或CsA耐受。在特定实施方式中，所述突变形式可以在位置V314，Y341，M347，T351，W352，L354，K360上包含至少野生型钙调磷酸酶异源二聚体的至少一个突变氨基酸，优选在位置T351和L354或V314和Y341上包含双突变。在特定实施方式中，位置341上的缬氨酸残基可以替换为赖氨酸或精氨酸残基，位置341上的酪氨酸残基可以替换为苯丙氨酸残基；位置347上的甲硫氨酸可以替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基；位置351处的苏氨酸可以替换成谷氨酸残基；位置352处的色氨酸残基可以替换成半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基，位置353上的丝氨酸可以替换成组氨酸或天冬酰胺残基，位置354上的亮氨酸可以替换成丙氨酸残基；位置360上的赖氨酸可以替换成SEQ ID NO:16的丙氨酸或苯丙氨酸残基。对应的本文所描述的氨基酸位置经常依据野生型人钙调磷酸酶异源二聚体(SEQ ID NO:16(基因库:ACX34092.1)中阐述的多肽)的形式的氨基酸的位置表达。

在另一特定实施方式中，所述突变形式在位置V120，N123，L124或K125上包含至少一个野生型钙调磷酸酶异源二聚体b的突变氨基酸，优选在位置L124和K125上包含双突变。在特定实施方式中，位置120上的缬氨酸可以替换为丝氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基；位置123上的天冬酰胺可以替换为色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸；位置124上的亮氨酸可以替换为苏氨酸残基；位置125上的赖氨酸可以替换为丙氨酸、谷氨酸、色氨酸或者在氨基酸序列SEQ ID NO:17中位置125上的赖氨酸之后添加两个残基，如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸。本文所描述的氨基酸位置的对应经常依据SEQ ID NO:17(基因库:ACX34095.1)中阐述的野生型人钙调磷酸酶异源二聚体b多肽的形式的氨基酸位置表达。

另一耐药性基因是编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)。AGT是赋予对烷化剂，如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ)的细胞毒性作用的耐受性的DNA修复蛋白。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是AGT抑制剂，其增强亚硝基脲毒性并与增强这种药物的细胞毒性作用的TMZ联合给药。编码AGT变体的MGMT的多种突变形式具有对通过6-BG导致的失活的高的耐受性，且保留了其修复DNA损伤的能力(Maze，Kurpad et al.1999)。在特定实施方式中，AGT突变形式可以在氨基酸序列SEQ ID NO:18(UniProtKB:P16455)中包含野生型AGT位置P140的突变氨基酸。在优选的实施方式，位置140上的所述脯氨酸替换为赖氨酸残基。

另一耐药性基因可以多重耐药性蛋白1(MDR1)基因。这种基因编码膜糖蛋白，称为P-糖蛋白(P-GP)，其参与跨细胞膜的代谢副产物的转运。P-Gp蛋白表现出对几种结构上不相关的化疗试剂的广谱特异性。因此，耐药性可以通过表达编码MDR-1(NP_000918)的核酸序列赋予细胞。

耐药性基因也可以是细胞毒性抗生素，如ble基因或mcr基因。当分别暴露于化疗试剂，博来霉素(bleomycine)或丝裂霉素C时，ble基因或mcrA基因在免疫细胞中的异位表达提供了选择性的优势。

基因治疗的最实用的方法是通过使用采用载体，优选病毒载体的高效基因递送将基因添加到工程改造T-细胞中。因此，在特定实施方式中，耐药性基因可以通过将优选通过至少一个载体所编码的转基因引入细胞中而在细胞中表达。

基因随机插入到基因组中，可能会导致插入的基因或插入位点附近的基因的不恰当表达。使用外源核酸的同源重组的特异性基因治疗可以容许工程改造安全的T-细胞，该外源核酸包含内源序列以便将这些基因靶向基因组中的特异性位点。如上所描述的，该方法的基因遗传修饰步骤可以包括这样的步骤，即向细胞中引入包含至少编码耐药性基因的序列和一部分内源基因的外源核酸，使得同源重组发生于内源基因和外源核酸之间。在特定实施方式中，所述内源基因可以是野生型“耐药性”基因，使得同源重组之后，野生型基因替换为赋予对药物的耐药性的基因的突变形式。

已知内切核苷酸的断裂会刺激同源重组的速率。因此，在特定实施方式中，本发明的方法进一步包括在细胞中表达可以断裂内源基因中的靶序列的稀切核酸内切酶。所述内源基因可以编码，例如DHFR、IMPDH2、钙调磷酸酶或AGT。所述稀切核酸内切酶可以是TALE-核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸内切酶、MBBBD-核酸酶或巨型核酸酶(大范围核酸酶，meganuclease)。

药物致敏基因的失活

在另一特定的实施方式，所述耐药性可以通过失活药物致敏基因赋予T-细胞。本发明人首次寻求失活潜在的药物致敏基因以工程改造T-细胞用于免疫治疗。

通过失活基因，期望的是所感兴趣的基因不再以功能性蛋白质的形式表达。在特定实施方式中，该方法的基因修饰，在提供的工程改造的细胞中依赖于一种稀切核酸内切酶的表达，使得所述稀切核酸内切酶特异性催化一种靶向基因的断裂从而使所述靶基因失活。在特定实施方式中，失活至少一种药物致敏基因的步骤包括向细胞中引入可以断裂至少一种药物致敏基因的稀切核酸内切酶。在更特定实施方式，所述细胞用编码能够断裂药物致敏基因的稀切核酸内切酶的核酸进行转化，并且所述稀切核酸内切酶表达于细胞中。所述稀切核酸内切酶可以是巨型核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、MBBBD-核酸酶或TALE-核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。

在优选的实施方式中，可以失活且赋予T-细胞耐药性的药物致敏基因是人类脱氧胞苷激酶(dCK)基因。这种酶是脱氧核糖核苷脱氧胞苷(dC)，脱氧鸟苷(dG)和脱氧腺苷(dA)进行磷酰化所必需的。嘌呤核苷酸类似物(PNA)由dCK代谢成单-、二-和三-磷酸PNA(phosphate PNA)。它们的三磷酸(triphosphate)形式和尤其是氯法拉滨三磷酸会与ATP对DNA合成发生竞争，起到促细胞凋亡剂的作用，并且是参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂(也如图1中作用的推测机理)。

优选地，dCK在T-细胞中的失活通过TALE核酸酶介导。为了实现该目标，已经设计了多对dCK TALE-核酸酶，以多核苷酸的水平组装并通过测序进行验证。根据本发明可以使用的TALE-核酸酶对的实例由SEQ IDN°63和SEQ ID N°64描述。当使用这对TALE-核酸酶时，dCK靶序列对应于SEQ ID N°62。

正如这些实施例中所示，这种dCK在T-细胞中的失活赋予了对嘌呤核苷类似物(PNA)，如氯法拉滨和氟达拉滨的耐药性。

在另一优选实施方式中，dCK在T-细胞中的失活结合TRAC基因的失活而既赋予这些双敲除(knock out)(KO)T-细胞对药物，如氯法拉滨的耐药性又赋予其对异体耐受。这种双重功能对于治疗的目标是特别有用的，使得用于免疫治疗的“现成的”异体细胞结合化疗以治疗癌症患者。这种双重KO失活dCK/TRAC可以同时或按序进行。在本发明中成功的TALE-核酸酶dCK/TRAC对的一个实例分别是使用SEQ ID N°63和SEQID N°64和SEQ ID N°66和N°67，在2基因位点(loci)的靶序列(dCK和TRAC)分别描绘于SEQ ID N°62和SEQ ID N°65。

可以失活的酶的另一实例是人次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因(基因库：M26434.1)。特别地，HPRT可以在工程改造的T-细胞中失活而赋予对细胞生长抑制代谢物，6-硫代鸟嘌呤(6TG)耐药性，其通过HPRT转化为细胞毒性硫鸟嘌呤核苷酸并且目前用于治疗癌症患者，特别是白血病患者(Hacke，Treger et al.2013)。鸟嘌呤类似物通过HPRT转移酶进行代谢，该HPRT转移酶催化磷酸核糖基部分的加成并使TGMP能够形成(图2)。鸟嘌呤类似物，包括6巯基嘌呤(6MP)和6硫代鸟嘌呤(6TG)，通常用作治疗ALL的淋巴清除(lymphodepleting)药物。它们通过HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，其催化磷酸核糖基部分的加成并使TGMP能够形成)进行代谢。它们随后的磷酸化会导致其三磷酸形式的形成，该三磷酸形式最终整合到DNA中。一旦引入到DNA中，硫代GTP经由其硫醇基团(thiolate groupment)损害DNA复制的保真度并生成对细胞完整性非常有害的随机点突变。

在另一实施方式中，通常表达于T-细胞的表面上的CD3的失活可以赋予针对抗-CD3抗体，如替利珠单抗(Teplizumab)的耐药性。

通过药物抗性测试异体CAR T-细胞细胞毒性的CD19+/luc+耐药性 Daudi细胞

本发明还涵盖用于制备靶细胞的方法，其表达特异于CAR T-细胞的表面受体和耐药基因。这些靶细胞尤其适用于测试CAR T-细胞的细胞毒性。这些细胞很容易对氯法拉滨临床相关的剂量产生耐药性并具有荧光素酶活性。这些特征的这种组合使得可以在小鼠模型中体内追踪它们。更特别地，它们可以用于评价小鼠中耐药性T-细胞在氯法拉滨或其他PNA存在下的细胞毒性特性。耐受氯法拉滨的Daudi细胞模拟急性淋巴细胞白血病(ALL)患者复发型(relapsing form)诱导治疗的生理状态，其具有耐药性B细胞恶性肿瘤。因此，这些细胞对于评价药物抗性CAR T的可靠性和细胞毒性细胞受到极大关注。优选这些靶细胞是CD19+荧光素酶+Daudi细胞。分离的细胞

本发明还涉及通过上述方法可获得的分离的细胞。特别地，本发明涉及分离的耐药性T-细胞，其包含至少一个编码T-细胞受体组分的断裂基因(中断基因，disrupted gene)。在特定实施方式中，T-细胞表达至少一个耐药性基因，优选ble基因或mcr基因或编码突变型DHFR，突变型IMPDH2，突变型AGT或突变型钙调磷酸酶的基因。在另一特定的实施方式中，所述T-细胞包含至少一个断裂药物致敏基因如dCK或HPRT基因。在更特定的实施方式中，分离的T-细胞包含断裂的HPRT基因并表达DHFR突变型；所述分离的T-细胞包含断裂的HPRT基因并表达IMPDH2突变型；所述分离的T-细胞包含断裂的HPRT基因并表达钙调磷酸酶的突变型；所述分离的T-细胞包含断裂的HPRT基因并表达AGT突变型。在另一优选的实施方式中，所述分离的细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，其可以是CD19或CD123。

耐药性异体T-细胞

特别地，本发明涉及特别适合于免疫治疗的耐药性异体T-细胞。耐药性可以通过药物敏化基因的失活或通过如先前的耐药性基因的表达而赋予。适合于本发明的药物的一些实例是嘌呤核苷类似物(PNA)如氯法拉滨或氟达拉滨，或其他药物，如6-巯基嘌呤(6MP)和6硫代鸟嘌呤(6TG)。

根据本发明的细胞是指功能上参与先天性和/或适应性免疫响应(应答，response)的起始和/或进行的造血源的细胞。根据本发明的细胞优选是获自供体的T-细胞。根据本发明的T-细胞可以衍生自干细胞。干细胞可以是成体干细胞，胚胎干细胞，更特别地是非人类干细胞，脐带血干细胞，祖细胞，骨髓干细胞，全能干细胞或造血干细胞。代表性的人干细胞是CD34+细胞。所述分离的细胞也可以是树突细胞、杀伤性树突细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自以下各项组成的组中的T-细胞：炎性T-淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助T淋巴细胞。在另一实施方式中，所述细胞可以衍生自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在本发明的细胞扩增和基因修饰之前，细胞源可以通过各种非限制性方法获自受试者。细胞可以获自许多非限制性源，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤的部位的组织。在本发明的某些实施方式中，本领域那些技术人员可用的和已知的任何数目的T-细胞系都可以使用。在另一实施方式中，所述细胞优选衍生自健康供体。在另一实施方式中，所述细胞是呈现不同表型特征的细胞的混合群的部分。

多重耐药性

在另一特定实施方式中，当患者用不同药物治疗时，使用对多种药物耐受的异体T-细胞以介导工程改造的T-细胞的选择，本发明人力图开发出一种“现成”免疫治疗策略。治疗效率通过基因工程改造多重耐药性的异体T-细胞可以显著增强。这种策略在治疗肿瘤时是特别有效的，该肿瘤响应于表现出协同作用的药物组合。而且，多重耐药性的工程改造的T-细胞可以进行扩增并且可以使用最小剂量的药物试剂进行选择。

因此，根据本发明的方法可以包括修饰T-细胞以赋予所述T-细胞多重耐药性。所述多多重耐药性可以通过表达不至一种耐药性基因或通过失活不至一种药物致敏基因而赋予。在另一特定实施方式中，多重耐药性可以通过表达至少一种耐药性基因并失活至少一种药物致敏基因而赋予T-细胞。特别地，多重耐药性可以通过表达至少一种耐药性基因，如DHFR的突变型、IMPDH2的突变型、钙调磷酸酶的突变型、MGMT的突变型，ble基因和mcr基因并失活至少一种药物致敏基因，如HPRT基因而赋予。在优选的实施方式中，多重耐药性可以通过失活HPRT基因并表达DHFR的突变型；或通过失活HPRT基因并表达IMPDH2的突变型；或通过失活HPRT基因并表达钙调磷酸酶的突变形式；通过失活HPRT基因并表达MGMT的突变型；通过失活HPRT基因并表达ble基因；通过失活HPRT基因并表达mcr基因而赋予。

工程改造耐药性异体T-细胞的方法：

为了改善癌症治疗和异体T-细胞的选择性植入，对细胞赋予耐药性而使它们免受化疗试剂的毒副作用。T-细胞的耐药性还允许其体内外富集，因为表达耐药性基因的T-细胞会相对于药物敏感性细胞生存并繁衍。特别地，本发明涉及工程改造异体且耐药的耐受免疫治疗的T-细胞的方法，包括：

(a)提供T-细胞；

(b)选择至少一种药物；

(c)通过失活至少一种编码T-细胞受体(TCR)组分的基因修饰T-细胞；

(d)修饰T-细胞以赋予所述T-细胞耐药性；

(e)在所述药物的存在下扩增所述工程改造的T-细胞。

-异体T-细胞

本发明涉及异体免疫治疗。异体T-细胞的植入可能通过失活至少一种编码TCR组分的基因进行。TCR通过失活TCRα基因和/或TCRβ基因而使其在细胞中失能(not functional)。异体T-细胞中的TCR失活避免了GvHD。通过失活基因，期望的是感兴趣的基因不会以功能性蛋白质的形式表达。在特定实施方式中，该方法的基因修饰依赖于在所提供的工程改造的细胞中的一种稀切核酸内切酶的表达，使得所述稀切核酸内切酶特异性地催化一种靶向基因中的断裂，从而失活靶向的基因。通过稀切核酸内切酶所致的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端接合(NHEJ)的不同的机制修复。然而，NHEJ是通常导致切割位点的DNA序列变化的不完善的修复过程。这些机制涉及通过直接再连接(re-ligation)(Critchlowand Jackson 1998)或经由所谓的微同源性介导的末端连接(Betts，Brenchleyet al.2003；Ma，Kim et al.2003)而重新连接两个DNA端的其余部分。通过非同源末端连接(NHEJ)的修复通常会导致小的插入或缺失，并可以用于创建特异性基因敲除。所述修饰可以是至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。已经发生断裂诱导的突变事件，即，连续的突变事件成为NHEJ事件的细胞，可以通过本领域内众所周知的方法进行识别和/或选择。在特定实施方式中，失活至少一种编码T-细胞受体(TCR)组分的基因进入每个单个样品的细胞中的步骤包括向细胞引入可以中断至少一种编码T-细胞受体(TCR)的组分的基因的稀切核酸内切酶。在更特定的实施方式中，每个单个样品的所述细胞用编码稀切核酸内切酶的核酸进行转化，该内切酶能够中断至少一种编码T-细胞受体(TCR)的组分的基因，并且稀切核酸内切酶表达进入所述细胞。

所述稀切核酸内切酶可以是巨型核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。对于TALE-核酸酶，期望是由衍生自转录激活因子样效应物(TALE)的DNA结合结构域(binding domain)和一种裂解核酸靶序列的核酸酶催化结构域域组成的融合蛋白(Boch，Scholzeet al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian，Cermak et al.2010；Cermak，Doyle et al.2011；Geissler，Scholze et al.2011；Huang，Xiao et al.2011；Li，Huang et al.2011；Mahfouz，Li et al.2011；Miller，Tan et al.2011；Morbitzer，Romer et al.2011；Mussolino，Morbitzer et al.2011；Sander，Cade et al.2011；Tesson，Usal et al.2011；Weber，Gruetzner et al.2011；Zhang，Cong et al.2011；Deng，Yan et al.2012；Li，Piatek et al.2012；Mahfouz，Li et al.2012；Mak，Bradley et al.2012)。在本发明中，新TALE-核酸酶已经设计用于精确靶向用于过继性免疫治疗策略的相关基因。

根据本发明的优选TALE-核酸酶是识别和断裂选自以下各项组成的组中的靶序列的那些：SEQ ID NO:1至5(TCRα)，SEQ ID NO:6和7(TCRβ)。所述TALE-核酸酶优选包含选自SEQ ID NO:8至SEQ IDNO:13的多肽序列。在另一实施方式中，另外的催化结构域可以进一步引入到具有稀切核酸内切酶的细胞中而增加诱变以增强其失活靶向基因的能力。特别地，所述另外的催化结构域是DNA端加工酶。DNA末端加工酶(末端处理酶，end-processing enzyme)的非限制性实例包括5-3'外切核酸酶，3-5'外切核酸酶，5-3'碱性外切核酸酶，5'瓣状核酸内切酶，解旋酶，磷酸酶，水解酶和非模板依赖(template-independent)的DNA聚合酶。这类催化结构域的非限制性实例包括选自由以下各项组成的组中的蛋白结构域或蛋白结构域的催化活性衍生物：hExoI(EXO1_HUMAN)、酵母ExoI(EXO1_YEAST)、大肠杆菌ExoI、人TREX2、小鼠TREX1、人TREX1、牛TREX1、大鼠TREX1、TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)人DNA2、酵母DNA2(DNA2_YEAST)。在优选的实施方式中，所述另外的催化结构域具有3'-5'外切核酸酶活性，并且在更优选的实施方式中，所述另外的催化结构域是TREX，更优选是TREX2催化结构域(WO2012/058458)。在另一优选的实施方式中，所述催化结构域由单链TREX2多肽进行编码。根据本发明所述另外的催化结构域可以可选地通过连接肽(连接基，linker)融合于核酸酶融合蛋白或嵌合蛋白。

内切核苷酸断裂已知会刺激同源重组的速率。因此，在另一实施方式中，本方法的基因修饰步骤进一步包括向细胞中引入外源核酸的步骤，该外源核酸包含至少一种同源于一部分靶核酸序列的序列，使得靶核酸序列和外源性核酸之间发生同源重组。在特定实施方式中，所述外源核酸分别包含同源于靶核酸序列的5'和3'区域的第一和第二部分。在这些实施方式中的所述外源核酸还包含位于第一和第二部分之间的第三部分，其与靶核酸序列的5'和3'区域没有同源性。靶核酸序列的断裂之后，靶核酸序列和外源核酸之间刺激同源重组事件。优选地，至少50bp，优选超过100bp且更优选超过200bp的同源序列用于供体基体(donor matrix)中。在特定实施方式中，同源序列可以是200bp至6000bp，更优选是1000bp至2000bp。实际上，共享的核酸同源区位于侧接断裂位点上游和下游的区域内，而要引入的核酸序列应该位于两臂之间。

在特定实施方式中，根据本发明，所述外源核酸可以包含编码耐药性基因的转基因。

另外可能的T-细胞属性的工程改造

根据本发明的免疫细胞可以进一步经过工程改造而获得参与到其更特异性或有效的治疗用途中的另外的属性。

-嵌合抗原受体

嵌合抗原受体(CAR)利用配体结合结构域属性，可以重定向对选定靶的免疫细胞特异性和反应性。因此，在另一特定实施方式中，本方法进一步包括向所述淋巴细胞中引入嵌合抗原受体的步骤。所述嵌合抗原受体针对存在于靶细胞上的组分使结合结构域，例如对于所需抗原(例如，肿瘤抗原)的基于抗体的特异性，与T-细胞受体-活化的胞内域结合而产生表现出特异性抗靶细胞免疫活性的嵌合蛋白。一般而言，CAR由融合至T-细胞抗原受体复合物Zeta链(scFv:ζ)的胞内信号域(signaling domain)的胞外单链抗体(scFv)组成，并在表达于T-细胞中时具有基于单克隆抗体特异性重定向抗原识别的能力。本发明中所用的CAR的一个实例是针对CD19抗原定向的CAR并且可以包含氨基酸序列：SEQ ID NO:19或20作为非限制性实例。

-免疫检测点基因的失活

T-细胞介导的免疫性包括多个连续步骤，涉及抗原特异性细胞的克隆选择、其在次级淋巴组织中的活化和增殖、其向抗原和发炎位点的转运、直接效应物功能的执行以及向众多效应器免疫细胞的提供帮助(通过细胞因子和膜配体)。这些步骤的每个都通过反平衡(抵消，counterbalancing)微调响应的刺激和抑制信号进行调节。本领域技术人员应该理解的是，术语“免疫检测点”是指通过T-细胞表达的一组分子。这些分子有效地起到下调或抑制免疫响应的“刹车”作用。免疫检测点的分子包括，但不限于程序性死亡(Programmed Death)1(PD-1，也称为PDCD1或CD279，登录号：NM_005018)，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，基因库登录号AF414120.1)，LAG3(也称为CD223，登录号：NM_002286.5)，Tim3(也称为HAVCR2，基因库登录号：JX049979.1)，BTLA(也称为CD272，登录号：NM_181780.3)，BY55(也称为CD160，基因库登录号：CR541888.1)，TIGIT(也称为VSTM3，登录号：NM_173799)，LAIR1(也称为CD305，基因库登录号：CR542051.1，(Meyaard，Adema et al.1997)，SIGLEC10(基因库登录号：AY358337.1)，2B4(也称为CD244，登录号：NM_001166664.1)，PPP2CA，PPP2CB，PTPN6，PTPN22，CD96，CRTAM，SIGLEC7(Nicoll，Ni et al.1999)，SIGLEC9(Zhang，Nicoll etal.2000；Ikehara，Ikehara et al.2004)，TNFRSF10B，TNFRSF10A，CASP8，CASP10，CASP3，CASP6，CASP7，FADD，FAS，TGFBRII，TGFRBRI，SMAD2，SMAD3，SMAD4，SMAD10，SKI，SKIL，TGIF1，IL10RA，IL10RB，HMOX2，IL6R，IL6ST，EIF2AK4，CSK，PAG1，SIT1，FOXP3，PRDM1，BATF(Quigley，Pereyra et al.2010)，GUCY1A2，GUCY1A3，GUCY1B2，GUCY1B3，其直接抑制免疫细胞。例如，CTLA-4是表达于某些CD4和CD8T-细胞上的细胞表面蛋白；当在抗原呈递细胞上由它的配体(B7-1和B7-2)结合时，T-细胞活化和效应物功能受到抑制。因而，本发明涉及工程改造耐药性异体T-细胞的方法，进一步包括通过失活参与免疫检测点的至少一种蛋白，特别是PD1和/或CTLA-4而修饰T-细胞。在优选的实施方式中，失活至少一种参与免疫检测点的蛋白的步骤通过表达稀切核酸内切酶而实现，该酶能够特异性断裂免疫检测点基因中的靶序列。在优选的实施方式中，所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。例如，所述TALE-核酸酶可以特异性断裂选自以下各项组成的组中的靶序列：SEQ ID NO:21至23(CTLA-4)和SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25(PDCD1)，而在更优选的实施方式中，所述TALE-核酸酶包含选自由SEQID NO:26至SEQ ID NO:35组成的组中的氨基酸序列。

-免疫抑制耐受T-细胞

异体细胞迅速被宿主免疫系统排斥。据证实，存在于非辐照血液产品中的异体白细胞将持续不超过5至6天((Boni，Muranski et al.2008)。因此，为了防止异体细胞排斥，宿主免疫系统通常不得不进行一定程度的抑制。然而，在使用过继性免疫治疗的情况下，免疫抑制药物还对引入的治疗性T-细胞具有不利影响。因此，为了在这些条件下有效使用过继性免疫治疗的方法，引入的细胞也需要耐受免疫抑制治疗。因此，在特定实施方式中，根据本发明的方法还包括修饰T-细胞(优选通过失活至少一种编码用于免疫抑制剂的靶的基因)而使之耐受免疫抑制剂的步骤。免疫抑制剂是一种通过多种作用机制之一抑制免疫功能的药物。换而言之，免疫抑制剂是通过这样的化合物扮演角色，该化合物表现出降低免疫响应程度的能力。根据本发明的方法允许通过失活T-细胞中的免疫抑制剂的靶赋予T-细胞免疫抑制耐受用于免疫治疗。作为非限制性实例，免疫抑制剂的靶可以是免疫抑制剂的受体，如：CD52，糖皮质激素受体(GR)，FKBP家族基因成员和亲环素家族基因成员。在特定实施方式中，本方法的基因修饰依赖于一种稀切核酸内切酶在提供的进行工程改造的细胞中的表达，使得所述稀切核酸内切酶特异性催化在一种靶向基因中的断裂，由此失活靶向的基因。稀切核酸内切酶可以是巨型核酸酶，锌指核酸酶或TALE-核酸酶。优选根据本发明的TALE-核酸酶是识别和断裂选自以下组成的组中的靶序列的那些：SEQ ID NO:36至41(GR)，以及SEQ ID NO:54至59(CD52)。所述TALE-核酸酶优选包含选自SEQ ID NO:42至SEQ ID NO:53和SEQID NO:60至SEQ ID NO:61的多肽序列。

-自杀基因

在另一方面，由于工程改造的T-细胞可以扩增并在给药后持续数年，则理想的是包括一个安全机构(机制，mechanism)以允许选择性删除所给药的T-细胞。因此，在一些实施方式中，本发明的方法可以包括用重组自杀基因转化所述T-细胞。一旦给药于受试者，所述重组自杀基因用于降低T-细胞的直接毒性和/或不受控制的增殖的风险(Quintarelli C，Vera F，blood 2007；Tey SK，Dotti G.，Rooney CM，boil blood marrow transplant2007)。自杀基因能够选择性删除体内的转化细胞。特别地，自杀基因具有将无毒的前体药物转化成细胞毒性药物或者表达毒性基因表达物的能力。换言之，“自杀基因”是对产物编码的核酸，其中产物由其自身或在其它化合物存在下导致细胞死亡。这种自杀基因的代表性实例是对单纯疱疹病毒的胸苷激酶编码的基因。其他实例是水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，其可以将5-氟胞嘧啶转化成高毒性化合物5-氟尿嘧啶。自杀基因还包括作为非限制性实例的胱天蛋白酶-9或胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶。胱天蛋白酶-9可以使用二聚化的特异性化学诱导物(CID)激活。自杀基因还可以是在细胞表面上表达并可以使细胞对治疗性单克隆抗体敏感的多肽。本文所用的“前体药物”是指适用于本发明方法中可以转化成毒性产物的任何化合物。这种前体药物代表性实例是通过HSV胸苷激酶体内转化成有毒化合物的更昔洛韦(ganciclovir)。更昔洛韦衍生物随后对肿瘤细胞是有毒的。前体药物的其他代表性实例包括阿昔洛韦，FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘尿嘧啶]，VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。

-递送方法

上述不同方法涉及将所关注的蛋白，如耐药性基因、稀切核酸内切酶、嵌合抗原受体(CAR)、自杀基因表达于细胞中。作为非限制性的实例，所述感兴趣的蛋白可以通过其作为转基因(优选由至少一种质粒载体编码)引入而表达于细胞中。多肽可以表达于细胞中由此将编码多肽的多核苷酸引入到细胞中。可替代地，所述多肽可以在细胞外产生并随后将其引入。用于将多核苷酸构建体引入细胞中的方法在本领域中是已知的，并且作为非限制性实例包括，将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中的稳定转化方法，将多核苷酸构建体并不整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法和病毒介导方法。所述多核苷酸可以通过例如，重组病毒载体(例如，逆转录病毒，腺病毒)、脂质体等引入到细胞中。例如，瞬时转化方法包括，例如，显微注射、电穿孔或粒子轰击。所述多核苷酸，鉴于表达于细胞中，可以包含于载体中，更特别地包含于质粒或病毒中。所述质粒载体可以包含对收到载体的细胞的进行识别和/或选择的选择标记物。不同的转基因都可以包含于载体中。所述载体可以包含编码核糖体跳过序列(间越序列，skip sequence)的核酸序列，如编码2A肽的序列。2A肽，是在小核糖核酸病毒的口蹄疫病毒亚单位中确定的，导致从一个密码子到下一个密码子的核糖体“跳过”而在通过密码编码的两个氨基酸之间未形成肽键(参见Donnelly et al.，J.of General Virology 82:1013-1025(2001)；Donnelly et al.，J.of Gen.Virology 78:13-21(1997)；Doronina et al.，Mol.And.Cell.Biology28(13):4227-4239(2008)；Atkins et al.，RNA 13:803-810(2007))。“密码子”是指在由核糖体翻译成一个氨基酸残基的mRNA上(或DNA分子的有义链上)的三个核苷酸。因此，当多肽由处于框内的2A寡肽序列分开时，两个多肽可以由mRNA中的单个的相邻的开放阅读框合成。这种核糖体跳过机制在本领域中是公知的，并已知由用于由单个信使RNA编码的几个蛋白的表达的几个载体使用。

在本发明的更优选的实施方式中，编码根据本发明的多肽的多核苷酸可以是，例如通过电穿孔直接引入细胞的mRNA。本发明人确定了在T-细胞中mRNA电穿孔的最佳条件。本发明人所使用的cytoPulse技术允许通过使用脉冲电场瞬时渗透活细胞以将物料递送入细胞中。这种技术，基于PulseAgile(BTX Havard Apparatus，84October Hill Road，Holliston，MA 01746，USA)电穿孔波形脉冲的使用，赋予对脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔的精确控制(美国专利6,010,613和国际PCT申请WO2004083379)。所有这些参数可以进行修改以便达到高转染效率的最佳条件且死亡率最低。基本上，第一高电场脉冲容许孔道形成，而随后的低电场脉冲允许多核苷酸进入细胞内。

-T-细胞的活化和扩增

无论在T-细胞基因修饰之前或之后，T-细胞一般可以使用如下专利文献中的方法进行活化和扩增：例如，美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请出版物No.20060121005。T-细胞可以进行体外或体内扩增。一般而言，本发明的T-细胞通过与刺激CD3TCR复合物和T-细胞表面上的共刺激分子的试剂接触以产生T-细胞的活化信号而进行扩增。例如，可以使用化学物质如钙离子载体(离子通道，ionophore)A23187，佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，或促有丝分裂凝集素，如植物血凝素(PHA)对T-细胞产生活化信号。作为非限制性的实例，T-细胞群可以在体外结合钙离子载体，如通过与抗CD3抗体，或其抗原-结合片段，或表面上固定的抗-CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C活化子(例如，苔藓虫素)接触而进行刺激。为了T-细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用了结合辅助分子的配体。例如，T-细胞群可以在适于刺激T-细胞增殖的条件下接触抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。为了刺激CD4+T-细胞或CD8+T-细胞的增殖，接触抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。例如，提供每种信号的试剂可以在溶液中或耦合于表面。由于本领域中那些普通技术人员容易理解，粒子与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒径。

适于T-细胞培养的条件包括可以包含增殖和存活必需的因子的合适培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 5，(Lonza))，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、干扰素克、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFP、IL-21和TNF-或本领域技术人员已知用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括，但不限于，表面活性剂、血浆蛋白，以及还原剂，如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-vivo 1和X-vivo 20、Optimizer，还有所加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清的或补充适量血清(或血浆)或限定的激素，和/或足够用于T-细胞的生长和扩增的一定量的细胞因子。抗生素，例如，青霉素，链霉素仅包含于实验培养物中，而并不包含于要注入到受试者的细胞培养物中。靶细胞维持于支持生长的必要条件，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气+5％CO₂)下。已经暴露于不同刺激时间的T-细胞可以显示出不同的特性。

治疗应用

在另一实施方式中，如前描述的获得的所述分离T-细胞可以用于异体过继性细胞免疫治疗中。特别地，根据本发明的T-细胞可以用于治疗需此治疗的患者中的癌症、感染或自体免疫疾病。在另一方面，本发明依赖于用于治疗需此治疗的患者的方法，所述方法包括至少一个以下步骤：

(a)提供通过任意一种前面描述的方法可获得的分离的T-细胞；

(b)向所述患者给药所述细胞。

在一种实施方式，本发明的T-细胞可以进行体内强健的扩增并可以持续较长的时间。

所述治疗可以是缓解性的、治愈性的或预防性的。本发明特别适合于异体免疫治疗，因为它可以将通常获自供体的T-细胞转化成非异体反应性的细胞。这可以在标准方案下完成，并根据需要重复多次。所得的修饰T-细胞给药于一个或多个患者，使之作为“现成的”治疗产品供使用。

可以与所公开的方法一起使用的细胞描述于上一节中。治疗可以用于治疗诊断为癌症、病毒感染、自身免疫性疾病的患者。可以治疗的癌症包括未血管化(not vascurized)的，或还未大幅血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(如血液瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或者可以包括实体瘤。用本发明的耐药性异体T-细胞治疗的癌症类型包括，但不限于上皮恶性肿瘤(carcinoma)，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或恶性淋巴瘤、良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如，肉瘤，上皮恶性肿瘤和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。在本发明的一种实施方式中，儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)和肌萎缩性髓性白血病(急性骨髓性白血病，amyotrophic myeloma leukemia)(AML)的疾病通常通过根据本发明的异体耐药性T-细胞进行治疗。这可以分别通过使用耐药性KO TRAC CD19⁺CAR T-细胞和耐药性KO TRAC CD123⁺T-细胞实现。

它可以是结合一种或多种选自以下各项的组的抗癌疗法的治疗：抗体治疗、化疗、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因治疗、激素疗法、激光疗法和放射疗法。

根据本发明的优选的实施方式，治疗给药于正进行免疫抑制治疗的患者。本发明优选依赖于由于表达耐药性基因或失活药物致敏基因而制成对至少一种根据本发明的药物试剂耐受的细胞或细胞群。在这方面，根据本发明药物治疗应该在患者中有助于T-细胞的选择和扩增。

给药根据本发明的细胞或细胞群，可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、灌注、植入或移植。本文中的组合物可以在皮下，皮内，瘤内，结节内，髓内，肌肉内，颅内，通过静脉内或淋巴内注射，或腹腔内给药于患者。在一种实施方式，本发明的细胞组合物优选通过静脉注射给药。

给药细胞或细胞群可以包括给药10³-10¹⁰个细胞/kg体重，优选10^5-10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内的所有整数值的细胞数。细胞或细胞群可以按照一个或多个剂量给药。在另一实施方式中，所述有效量的细胞作为单剂量给药。在另一实施方式中，所述有效量的细胞在一段时间内以多于一个剂量进行给药。给药时间在管理医师的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群可以获自任何来源，如血库或供体。虽然个体需要变化，但对于特定疾病和病症确定给予的细胞类型的有效量最佳范围都在本领域的技术范围内。有效量是指提供治疗益处或预防益处的量。给药的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重，某种并行治疗，如果存在的话，治疗的频率和所需效果的性质。

在另一实施方式中，所述有效量的包含那些细胞的细胞或药物组合物经肠胃给药。所述给药可以是静脉内给药。所述给药可以直接通过注射于肿瘤内完成。

在本发明某些实施方式中，细胞结合(例如，之前，同时或之后)任何数量的相关治疗方式给药于患者，包括但不限于用试剂治疗，如抗病毒疗法，西多福韦和白细胞介素-2，阿糖胞苷(也称为ARA-C)，或那他利珠单抗(nataliziimab)治疗用于MS患者或依法利珠单抗(efaliztimab)治疗用于银屑病患者的或其他治疗用于PML患者。在进一步的实施方式中，本发明的T-细胞可以结合化疗，辐射，免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯(麦考酚酯，mycophenolate)，和FK506，抗体或其他免疫清除(immunoablative)剂，如CAMPATH、抗-CD 3抗体或其它抗体疗法，细胞毒素(cytoxin)，氟达拉滨，环孢素，FK506，雷帕霉素，麦考酚酸(mycoplienolic acid)，类固醇，FR901228，细胞因子，和辐辐照进行使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导信号很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liuet al.，Cell 66:807-815，1 1；Henderson et al.，Immun.73:316-321，1991；Bierer et al.，Citrr.Opin.mm n.5:763-773，93)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物结合(例如，之前，同时或之后)骨髓移植、使用化疗试剂，如氟达拉滨的T-细胞消融疗法、外部-束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体，如OKT3或CAMPATH给药于患者，在另一实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞消融疗法，如与CD20，例如，利妥昔单抗反应的试剂之后进行给药。例如，在一种实施方式中，受试者可以采用高剂量化疗进行标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，移植之后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞灌注。在另外的实施方式中，扩增的细胞在手术之前或之后给药。

药物组合物

本发明的分离的T-细胞可以单独，或与稀释剂和/或与其他组分，如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合作为药物组合物进行给药。简言之，本发明的药物组合物可以包含如本文中所述的T-细胞，组合一种或多种药学或生理学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。这种组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲生理盐水，磷酸盐缓冲生理盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内给药。本发明的药物组合物可以按照适合于待治疗(或预防)的疾病的方式给药。给药的量和频率将通过以下因素确定，如患者的身体状况，和患者疾病的类型和严重程度，但是合适的剂量可以通过临床试验确定。

测试分离的CAR T-细胞的细胞毒性的方法和用于其用途的试剂盒

本发明的另一实施方式包括测试如先前描述的分离的嵌合抗原受体(CAR)T-细胞针对以下各项的细胞毒性的方法：耐药性靶细胞；表达嵌合抗原受体(CAR)的所述分离的CAR T-细胞和表达至少一种特定表面抗原(和可选地标记基因，如荧光素酶)的靶细胞二者，包括：

(a)同时制备T-细胞和靶细胞的所述细胞群；

(b)所述T-细胞群与至少所述特异性靶细胞孵育；

(c)测定所述特异性靶细胞的存活率。

抗性基因可以在前述部分中介绍的那些中进行选择。优选抗性基因是

dCK。

本发明中要选择的表面抗原是通过嵌合抗原受体(CAR)可以表达于T-细胞中，并依赖于待靶向的细胞和通常对癌细胞具有特异性的表面抗原。优选地，用于CAR T-细胞中的表面抗原是CD19，因为这种抗原表现为特异性地表达于某些淋巴瘤或白血病，如急性淋巴细胞白血病(ALL)中。

最后，本发明涉及一种用于进行测试CAR T-细胞对于靶细胞的细胞毒性的方法的试剂盒，包括：

(d)赋予所述T-细胞群对于抗原特异的CAR；

(e)表达所述抗原的所述靶细胞；

(f)可选地，培养基；

根据本发明T-细胞和靶细胞都已经具有对化疗试剂的耐药性。

本发明申请并非仅仅寻求对将T-细胞工程改造成对嘌呤核苷酸类似物(PNA)药物和6TG耐受的一般方法的保护。它应该更广泛地推导至获取既对化疗试剂具有抗性又是异体的T-细胞的方法，包含下列目的至少之一：

1)一种工程改造用于免疫治疗的异体耐药性T-细胞的方法，包括：

(a)提供T-细胞；

(b)选择至少一种T-细胞对其敏感的化疗试剂；

(c)通过失活至少一种编码T-细胞受体(TCR)组分的基因来修饰所述T-细胞；

(d)修饰所述T-细胞以赋予对所述化疗试剂的耐药性；

(e)可选地在所述药物的存在下扩增所述工程改造的T-细胞。

2)根据权利要求1所述的方法，其中至少一种编码TCR组分的基因通过表达可以切割至少一种编码TCR组分的基因内的靶序列的稀切核酸内切酶而失活。

3)根据权利要求1或2所述的方法，其中所述耐药性通过失活至少一种药物致敏基因而赋予T-细胞。

4)根据权利要求3所述的方法，其中所述药物致敏基因通过表达可以切割药物致敏基因内的靶序列的稀切核酸内切酶而失活。

5)根据权利要求4所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。

6)根据权利要求3至5所述的方法，其中所述药物致敏基因是dCK。

7)根据权利要求6所述的方法，其中dCK基因通过TALE-核酸酶失活。

8)根据权利要求7的方法，其中TALE-核酸酶dCK基因失活通过使用SEQ ID N°63和SEQ ID N°64的TALE-核酸酶而进行实施，而dCK靶序列是SEQ ID N°62。

9)根据权利要求3至5所述的方法，其中所述药物致敏基因是HPRT。

10)根据权利要求1的方法，其中所述耐药性通过表达至少一种耐药性基因而赋予T-细胞。

11)根据权利要求10所述的方法，其中所述耐药性基因是赋予对叶酸治疗，优选氨甲喋呤(MTX)耐受的突变二氢叶酸还原酶(DHFR)蛋白。

12)根据权利要求11的方法，其中突变DHFR在选自由在SEQ ID NO:14中的G15、L22、F31或F34组成的组中的位置上，包含至少一个氨基酸突变。

13)根据权利要求12所述的方法，其中所述突变DHFR在SEQ ID NO:14中的L22和F31的位置上，包含两个氨基酸突变。

14)根据权利要求10所述的方法，其中所述耐药性基因是赋予对IMPDH抑制剂，优选霉酚酸酯(MMF)耐受的突变肌苷-5’-单磷酸脱氢酶II(IMPDH2)。

15)根据权利要求14的方法，其中所述突变IMPDH2在SEQ ID NO:15中的位置T333和/或S351上，包含至少一个氨基酸突变。

16)根据权利要求10所述的方法，其中所述耐药性基因是赋予对钙调磷酸酶抑制剂，优选FK506和/或CsA的耐药性的突变钙调磷酸酶(CN)异源二聚体a和/或b。

17)根据权利要求16所述的方法，其中所述突变的钙调磷酸酶异源二聚体a在选自由SEQ ID NO:16中的V314、Y341、M347、T351、W352、L354和K360组成的组中的位置上，包含至少一个氨基酸突变。

18)根据权利要求17所述的方法，其中所述突变的钙调磷酸酶异源二聚体a在SEQ ID NO:16中的位置T351和L354上包含氨基酸突变。

19)根据权利要求17所述的方法，其中所述突变的钙调磷酸酶异源二聚体a在SEQ ID NO:17中的位置V314和Y341上包含氨基酸突变。

20)根据权利要求16所述的方法，其中所述突变的钙调磷酸酶异源二聚体b在选自由在SEQ ID NO:17中的V120、N123、L124和K125组成组中的位置上，包含至少一个氨基酸突变。

21)根据权利要求20所述的方法，其中所述突变钙的调磷酸酶异源二聚体b在SEQ ID NO:17中的位置L124和K125上包含氨基酸突变。

22)根据权利要求10至21中任一项所述的方法，其中所述耐药性基因通过向T-细胞中引入编码耐药性基因的转基因而表达于T-细胞中。

23)根据权利要求10至21中任一项的方法，其中所述耐药性基因通过向T-细胞中引入供体基体使得同源重组发生于内源基因和供体基体之间而表达于T-细胞中，该供体基体包含内源基因的至少一种同源序列和编码耐药性基因的序列。

24)根据权利要求23所述的方法，进一步包括向T-细胞中引入可以选择性切割所述内源基因中的靶序列的稀切核酸内切酶，使得同源重组率被刺激。

25)根据权利要求24的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。

26)根据权利要求1至25中任一项的方法，进一步包括将嵌合抗原受体表达于T-细胞中。

27)根据权利要求1至26中任一项的方法，所述嵌合抗原受体是CD19+或CD123+。

28)根据权利要求1至27中任一项所述的方法，进一步包括失活免疫检测点基因。

29)根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述工程改造T-细胞在患者血液中扩增。

30)根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述工程改造的T-细胞在体外扩增。

31)根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述工程改造的T-细胞在所述药物存在下扩增。

32)一种由根据权利要求1至31任一项所述的方法可获得的分离的T-细胞或细胞系。

33)一种分离的耐药性T-细胞，包含至少一种编码T-细胞受体组分的断裂基因。

34)根据权利要求33所述的分离的T-细胞，表达至少一种耐药性基因。

35)根据权利要求33所述的分离的T-细胞，其中所述耐药性基因选自由ble基因，mcr基因和编码突变型DHFR、突变型IMPDH2、突变型钙调磷酸酶和突变型AGT的基因组成的组。

36)根据权利要求33所述的分离的T-细胞，包含至少一种断裂的药物致敏基因，优选HPRT基因。

37)根据权利要求32至36中任一项所述的分离的T-细胞，其中所述分离的T-细胞赋予了抗原特异性的嵌合抗原受体(CAR)。

38)根据权利要求37所述的分离的T-细胞，其中所述CAR靶向CD19+细胞或CD123+细胞；

39)一种根据权利要求32至38中任一项所述的分离的T-细胞，其适合用作药物。

40)一种根据权利要求32至39中任一项所述的分离的T-细胞，适用于治疗癌症、自身免疫性病症或病原体所致感染。

41)根据权利要求40所述的分离的T-细胞，其适用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)或肌萎缩性髓性白血病(AML)。

42)包含至少一种根据权利要求32至41中任一项所述的分离的T-细胞的药物组合物。

43)用于治疗有此需要的患者的方法，包括：

(a)制备根据权利要求1至27中任一项的方法所述的T-细胞群；

(b)将所述转化的T-细胞给药于所述患者。

44)根据权利要求36所述的方法，其中所述患者用根据权利要求1至31的方法中所使用的所述药物进行治疗。

45)用于测试根据权利要求32至41任一项的分离的嵌合抗原受体(CAR)T-细胞对以下各项的细胞毒性的方法：耐药性性靶细胞；表达嵌合抗原受体(CAR)的分离的CAR T-细胞和表达至少特定表面抗原(和可选地标记基因，如荧光素酶)的靶细胞二者，包括：

(a)制备T-细胞和靶细胞的所述群；

(b)所述T-细胞群与至少所述特异性靶细胞孵育；

(c)测定所述特异性靶细胞的存活率。

46)根据权利要求45所述的方法，其中所述抗性基因是dCK。

47)根据权利要求44或权利要求45所述的方法，其中所述表面抗原是CD19。

48)根据权利要求47所述的方法，其中所述靶是CD19+荧光素酶+Daudi细胞。

49)用于实施测试CAR T-细胞对于靶细胞的细胞毒性的方法的试剂盒，包括：

(a)赋予CAR抗原特异性的T-细胞群；

(b)表达所述抗原的靶细胞；

所述T-细胞和靶细胞都已经对化疗药物耐受。

定义

在上述的说明中，许多术语被广泛使用。提供以下定义以助于对本实施方式的理解。

-多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码指定，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。

-核苷酸如下指定：单字母代码用于指定核苷的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，以及g是鸟嘌呤。对于变性的核苷酸，r代表g或a(嘌呤核苷酸)，k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(嘧啶核苷酸)，d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表示a、t或c，以及n表示g、a、t或c。

-如本文所用的，“核酸”或“核酸分子”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段和通过连接、切断、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用产生的片段。核酸分子可以包含天然存在的核苷酸的单体(如DNA和RNA)，或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)，或二者的组合。核酸可以是单链的或双链。

-对于“基因”，是指遗传的基本单元，包括沿着染色体以线性方式排列的DNA区段，其编码特异性的蛋白或蛋白区段，小RNA等。基因通常包括启动子，5'非翻译区，一个或多个编码序列(外显子)，可选地还有内含子，3'非翻译区。基因可以进一步包括终止子，增强子和/或沉默子。

-术语“转基因”是指核酸序列(编码，例如1或多个多肽)，其是部分地或完全异源(即外来的)于其引入的宿主细胞的内源基因，或同源于其引入的宿主细胞的内源基因，但其可以经过设计而插入，或者可以插入到细胞的基因组中，以这样的方式以改变其插入的细胞的基因组(例如，它插入到不同于天然基因的位置的位置上或其插入导致基因敲除)。转基因可以包括一个或多个转录调节序列和任何其它核酸，如内含子，其可能对于编码多肽的所选核酸的最佳表达是必需的。通过转基因编码的多肽可以在转基因插入的细胞中不表达、或表达，但是是非生物活性的。

-对于“基因组”，是指包含于细胞中的完整遗传物质，如核基因组，叶绿体基因组、线粒体基因组。

-对于“突变”是指在多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中的一个或多个核苷酸/氨基酸的取代、缺失、插入。突变可以影响基因的编码序列或其调控序列。它还可以影响基因组序列的结构/编码的mRNA的结构/稳定性。

-术语“稀切核酸内切酶”是指可以催化DNA或RNA分子，优选DNA分子内核酸之间的键的水解(断裂)的野生型或变体酶。特别地，所述核酸酶可以是核酸内切酶，更优选具有高度特异性的稀切核酸内切酶，识别的核酸靶位点范围在10至45个碱基对(bp)长度，通常而言范围在10至35个碱基对长度。根据本发明的核酸内切酶识别并断裂特异性多核苷酸序列上的核酸，进一步称为“靶序列”。稀切核酸内切酶可以识别和产生在特异性多核苷酸序列上的单链或双链断裂。

在特定实施方式中，根据本发明的所述稀切核酸内切酶可以是Cas9核酸内切酶酶。事实上，最近新的基因组工程改造工具已基于RNA引导的Cas9核酸酶(Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski et al.2012；Cong，Ran et al.2013；Mali，Yang et al.2013)而从II型原核CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复)适应性免疫系统开发出来(参见综述(Sorek，Lawrence et al.2013))。CRISPR关联的(Cas)系统首次发现于细菌中而功能上起到对抗外源DNA(无论是病毒或是质粒)的防御作用。CRISPR介导的基因组工程改造首先通过选择通常由短序列基序，称为前间区序列邻近基序(PAM)侧接的靶序列进行。在选择靶序列之后，工程改造互补于靶序列的特异性crRNA。在CRISPR II型系统中所需的反式活化crRNA(tracrRNA)配对于crRNA并结合到提供的Cas9蛋白。Cas9充当了有助于tracRNA与cRNA的碱基配对的分子锚的作用(Deltcheva，Chylinski etal.2011)。在这种三元复合物中，双tracrRNA:crRNA结构充当了将核酸内切酶Cas9引导至同源靶序列的导向RNA作用。通过Cas9-tracrRNA:crRNA复合物的靶识别是通过扫描靶序列和crRNA之间的同源区的靶序列而开始。除了靶序列-crRNA互补之外，DNA靶向需要毗邻于前间区序列的短基序(前间区序列邻近基序-PAM)的存在。在双RNA和靶序列之间的配对之后，Cas9随后将钝双链断裂3碱基(blunt doublestrand break 3bases)引入到PAM基序的上游(Garneau，Dupuis et al.2010)。在本发明中，引导RNA可以经过设计，例如，特异性地靶向编码TCR组分的基因。在引导RNA和靶序列之间的配对之后，Cas9诱导TCR基因内的断裂。

稀切核酸内切酶也可以是归巢核酸内切酶(homing endonuclease)，又称为巨型核酸酶。这种归巢核酸内切酶在本技术领域是公知的(Stoddard2005)。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别DNA靶位点的范围在12至45个碱基对(bp)长度，一般范围可达14至40个bp长度。根据本发明的归巢核酸内切酶可以，例如对应于LAGLIDADG核酸内切酶，对应于HNH核酸内切酶，或对应于GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明优选的归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。“变体”核酸内切酶，即自然界并不天然存在并通过工程改造或通过随机诱变而获得的核酸内切酶，可以结合不同于通过野生型核酸内切酶识别的DNA序列(参见国际申请WO2006/097854)。

所述稀切核酸内切酶可以是模块化的DNA结合核酸酶。对于模块化DNA结合核酸酶，是指包含至少一种核酸内切酶的催化结构域和至少一种DNA结合结构域或指定核酸靶序列的蛋白的任何融合蛋白。DNA结合结构域通常是由包含至少一种识别双链或单链多核苷酸的基序的独立折叠多肽或蛋白结构域形成的RNA或DNA结合结构域。许多这种多肽已经在本领域中介绍，具有特异性结合核酸序列的能力。这种结合结构域通常包含，作为非限制性示例，螺旋-转角螺旋结构域，亮氨酸拉链结构域，翼状螺旋结构域，螺旋-环-螺旋结构域，HMG-框结构域，免疫球蛋白结构域，B3结构域或工程改造的锌指结构域。

根据本发明的优选的实施方式中，DNA结合结构域衍生自转录激活因子样效应物(TALE)，其中序列特异性由源自黄单胞菌属或青枯细菌蛋白的一系列33-35个氨基酸重复序列进行驱动。这些重复序列基本上区别为指定与碱基对的相互作用的两个氨基酸位置(Boch，Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009)。DNA靶上的每个碱基对通过单个重复序列接触，其中特异性由重复序列的两个变体氨基酸(所谓的重复序列可变二肽，RVD)产生。TALE结合结构域可以进一步包含负责靶向序列的第一胸腺嘧啶碱基(T₀)的要求的N-端转位结构域和含有核定位信号(NLS)的C-端结构域。TALE核酸结合结构域一般对应于包含多个TALE重复序列的工程改造的芯(core)TALE支架，每个重复序列包含对TALE识别位点的每个核苷酸碱基具有特异性的RVD。在本发明中，核心支架(corescaffold)的每个TALE重复序列是由30至42个氨基酸，更优选33或34个氨基酸构成，其中位于位置12和13的两个关键氨基酸(即所谓的重复可变二肽，RVD)介导TALE结合位点序列的一个核苷酸的识别；相当的两个关键氨基酸可以专门位于长度超过33或34个氨基酸的TALE重复序列中除了位置12和13之外的位置。优选地，与不同的核苷酸的识别相关的RVD是用于识别C的HD、识别T的NG、识别A的NI、识别G或A的NN。在另一实施方式中，关键氨基酸12和13可以朝着其他氨基酸残基突变，调节它们针对核苷酸A，T，C和G的特异性并且特别地，增强这种特异性。TALE核酸结合结构域通常包含8至30个TALE重复序列。更优选地，本发明的所述核心支架包含8至20个TALE重复序列；更加优选地，15个TALE重复序列。它也可以包含由位于所述TALE重复序列组的C-端的20个氨基酸构成的另外的单截短(短切，截头，truncated)TALE重复序列，即另外的C-端半TALE重复序列。

其他工程改造的DNA结合结构域是模块化的碱基-每-碱基特异性核酸结合结构域(MBBBD)(PCT/US2013/051783)。所述MBBBD可以，例如，由以下新近确定的蛋白进行工程改造：来自内共生真菌伯克霍尔德氏菌Rhizoxinica(Burkholderia Rhizoxinica)的新近测序基因组的EAV36_BURRH，E5AW43_BURRH，E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH(Lackner，Moebius et al.2011)。MBBBD蛋白包含约31至33个氨基酸的碱基特异性的模块。这些模块表现出与黄单胞TALE共同重复序列小于40％的序列同一性，而它们呈现出更多的多肽序列可变性。当它们组装到一起时，这些模块化多肽可以按照与黄单胞菌属TALE-核酸酶十分相似的方式靶向特异性核酸序列。根据本发明的优选的实施方式，DNA结合结构域是一种工程改造的包含10至30个模块，优选16至20个模块的MBBBD结合结构域。来自伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)和黄单胞菌(Xanthomonas)的上述蛋白(模块，N和C-端)的不同域适用于设计具有特异于核酸序列的结合性质的新蛋白或支架。特别地，经工程改造的MBBBD的另外的N-端和C-端域可以源自作为非限制性的实例的天然TALE样AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c。

-“TALE-核酸酶”或“MBBBD-核酸酶”是指通常获得自DNA结合结构域与核酸内切酶催化结构域的融合的工程改造蛋白，该DNA结合结构域通常源自转录激活因子样效应蛋白(TALE)或MBBBD结合结构域。这种催化结构域优选是核酸酶结构域，且更优选是具有核酸内切酶活性的结构域，例如，像I-TevI，ColE7，NucA和Fork-I。在特定实施方式中，所述核酸酶是单体TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶。单体核酸酶是不需要二聚化用于特异性识别和断裂的核酸酶，如描述于WO2012138927中的工程改造DNA结合结构域与I-TevI的催化结构域的融合。在另一特定实施方式中，所述稀切核酸内切酶是二聚TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶，优选包含融合至Fok的DNA结合结构域。TALE-核酸酶已经描述并用于刺激基因靶向定位和基因修饰(Boch，Scholze et al.2009；Moscou andBogdanove 2009；Christian，Cermak et al.2010)。这种工程改造TALE-核酸酶可以以商品名TALEN^TM商购获得(Cellectis，8rue de la Croix Jarry，75013Paris，France)。

-术语“断裂”是指多核苷酸的共价主链的断开。断裂可以通过各种方法，包括但不限于通过磷酸二酯键的酶促或化学水解引发。单链断裂和双链断裂都是可能的，并且双链断裂可以由于两个独特的单链断裂事件而发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体的断裂可以导致钝端或交错端的产生。

-对于“嵌合抗原受体”(CAR)，是指包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域的嵌合受体。

-如本文所用的术语“胞外配体结合结构域”定义为可以结合配体的寡肽或多肽。优选地，结构域可以与细胞表面分子相互作用。例如，胞外配体结合结构域可以经过选择而识别充当与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记物的配体。

在优选的实施方式中，所述胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其含有通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链(V_L)和重链(V_H)可变片段。在优选的实施方式中，scFV源自CD19或CD123抗体。优选地，本发明的所述scFV包含源自CD19单克隆抗体4G7的scFV(Peipp，Saul et al.2004)。

-根据本发明的CAR的信号转导结构域或胞内信号结构域负责在胞外配体结合结构域结合至靶之后的胞内信号传递，从而导致免疫细胞的活化和免疫响应。适用于CAR种的信号转导域的优选实例可以是T-细胞受体和抗原受体结合之后协同启动信号转导的共受体的细胞质序列。信号转导结构域包括两个独特类型的胞质信号序列，启动抗原依赖性的初级活化作用的那些，和以抗原非依赖性方式作用而提供次级或共刺激信号的那些。初级胞质信号序列可以包含已知为ITAM的免疫受体酪氨酸类的活化基序的信号基序。在特定实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是除了抗原受体或其对有效免疫响应所需的配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括，但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。共刺激分子的实例包括CD27、CD28、CD8、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和特异性结合CD83的配体等。

根据本发明的CAR表达于细胞的表面膜上。因此，CAR可以包含跨膜结构域。适当的跨膜结构域的突出特性包括这样的能力，即在细胞，在本发明中优选免疫细胞，特别地淋巴细胞细胞或天然杀伤(NK)细胞的表面上表达，并一起相互作用而引导免疫细胞对预限定的靶细胞的细胞响应。跨膜结构域可以进一步包含胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的茎区(stalk region)。本文中所用的术语“茎区”一般是指功能上将跨膜结构域连接至细胞外配体结合结构域的任何寡-或多肽。特别地，茎区用于对胞外配体结合结构域提供更大灵活性和易接近性。茎区可以包括最多300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，以及最优选25至50个氨基酸。茎区可以全部或部分源自天然分子，如源自CD8、CD4或CD28的全部或部分胞外区，或源自所有或部分的抗体恒定区。可替代地，茎区可以对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。

靶抗原下调或突变通常会在癌细胞中观察到，产生抗原-丢失逃逸突变体。因此，为了抵消肿瘤逃逸和赋予免疫细胞对靶的更具特异性，CD19特异性CAR可以包含另一胞外配体结合结构域，并且同时在靶中结合不同元件，由此增加免疫细胞的活化和功能。CD19特异性CAR的实例是ScFV FMC63(Kochenderfer JN，Wilson WH，Janik JE，et al.Eradication ofB-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated withautologous T cells geneticallyengineered to recognize CD19.Blood 2010；116(20):4099-410)或ScFv 4G7CAR(描述于以序号PCT/EP2014/059662提交的申请中)。在一种实施方式中，胞外配体结合结构域可以在相同跨膜多肽上以汇接(串联，tandem)设置。在另一实施方式中，所述不同的胞外配体结合结构域可以置于构成CAR的不同跨膜多肽上。在另一实施方式中，本发明涉及包含每一个不同胞外配体结合结构域的CAR群。特别地，本发明涉及一种工程改造免疫细胞的方法，包括提供一种免疫细胞，并在细胞的表面上表达每一个包含不同胞外配体结合结构域的CAR群。在另一特定实施方式中，本发明涉及一种工程改造免疫细胞的方法，包括提供一种免疫细胞，并向所述细胞中引入多核苷酸，其编码包含每一个包含不同胞外配体结合结构域的CAR群的多肽。对于CAR群，是指至少两、三、四、五、六或更多的每一个包含不同的胞外配体结合结构域的CAR。根据本发明的不同胞外配体结合结构域可以优选同时在靶中结合不同的元件，从而增加免疫细胞的活化和功能。本发明还涉及分离的免疫细胞，其包含每一个含有不同的胞外配体结合结构域的CAR群。

-术语“载体”是指可以转运其已经连接的另一核酸分子的核酸分子。本发明中的“载体”，包括，但不限于病毒载体，质粒，RNA载体，或直链或环状DNA或RNA分子，其可以由染色体、非染色体、半合成的或合成的核酸构成。优选的载体是能够自动复制(游离型载体)和/或表达它们链接的核酸(表达型载体)的那些。大量的合适的载体对于本领域技术人员是已知且可商购的。

-对于“递送载体”，是指任何可以用于本发明中导致细胞接触(即“接触型”)或在细胞或亚细胞区室内递送(即“引入”)本发明中所需的药物/化学品和分子(蛋白质或核酸)的递送载体。它包括，但不限于脂质体递送载体、病毒递送载体、药物递送载体、化学物质载体、聚合物载体、脂质复合物、多聚物、树枝状聚合物、微泡(超声造影剂)、纳米颗粒、乳剂或其它合适的转运载体。

-病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(例如，腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒，如正粘性病毒(例如，流感病毒)，棒状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘性病毒(例如，麻疹和仙台)，正链RNA病毒如小核糖核酸病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型，爱泼斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其它病毒包括，例如，诺沃克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae:The viruses and their replication，In Fundamental Virology，Third Edition，B.N.Fields，et al.，Eds.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。

-对于“慢病毒载体”，是指由于其相对较大的封装能力、降低的免疫原性和其高效率稳定转导大范围的不同细胞类型的能力而用于基因递送具有非常有前景的HIV-类慢病毒载体。慢病毒载体通常在将三种(包装，壳和转运)或更多种质粒瞬时转染到生产细胞中之后产生。像HIV，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体相互作用而进入靶细胞。进入时，病毒RNA要经历逆转录，这通过病毒逆转录酶复合物介导。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，这是受感染细胞的DNA中病毒整合的底物。对于“整合慢病毒载体(或LV)”，是指作为非限制性的实例，可以整合靶细胞的基因组的这类载体。相反，“非整合慢病毒载体(或NILV)”是指并不通过病毒整合酶的作用整合靶细胞的基因组的高效基因递送载体。

-对于细胞或多个细胞，期望的是指源自体外培养物的这些生物体的任何真核活细胞、原生细胞(原代细胞，primary cell)和细胞系。

-对于“原生细胞”或“原代细胞”，期望的是指直接采集自活组织(即，活检材料)并为建立用于体外生长，其已经经过数次群体倍增并且因此相比于连续致瘤性或人工永生化细胞系更代表主要功能组分和由其衍生的组织的特性的细胞。作为非限制性实例，细胞系可以选自由以下各项组成的组：CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞，U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；JurkaT-细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。

-因为一些可变性可以源自这些多肽衍生的基因组数据，并且为了考虑代替这些多肽中存在的一些氨基酸而没有显著减少活性(功能性变体)的可能性，本发明包括上述多肽的多核苷酸变体，其与本专利申请中提供的序列共享至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更加优选至少95％的同一性。

本发明因此涉及这样的多肽，其包含与选自由SEQ ID NO:8至SEQID NO:20和SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:35组成的组中氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，95％97％或99％的序列同一性的多肽序列。

-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可以通过比对在可以对齐进行比对的每个序列中的位置而进行测定。在比对序列中的位置被相同碱基占据时，则这些分子在那个位置就具有同一性(相同的，identical)。核酸或氨基酸序列之间的相似度或同一性程度是由核酸序列共享的位置上相同或匹配的核苷酸数的函数。各种比对算法和/或程序可以用于计算两个序列之间的同一性，包括FASTA，或BLAST，其可获得为GCG序列分析软件包的部分(University of Wisconsin，Madison，Wis.)，并可以利用，例如默认设置使用。例如，与本文描述的特异性多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性并优选表现出基本上相同的功能的多肽，以及编码这样的多肽的多核苷酸都被考虑；

-<<敲除>>是指基因突变至它无法表达的程度；

-“TRAC”是指“T-细胞受体α恒定区(保守区，constant)>>并对应于TCRα亚单位恒定基因。

除了前述特征，本发明包括进一步的特征，其将从以下示出工程改造的异体且耐药性的T-细胞用于免疫治疗抗性的方法的实施例，以及附图揭示。

实施例1:氯法拉滨耐性的T-细胞的产生和表征

dCK的TALE-核酸酶-介导的失活

为了失活dCK，设计，组装了两对dCK TALE-核酸酶，并通过测序验证；仅采用命名为TALE-核酸酶dCK2和具有SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：64的两对实施后续工作。关于dCK基因整体架构的细节(外显子和内含子)以及位于外显子2中的TALE-核酸酶靶位点的序列指示于图3。

TALE-核酸酶dCK2对的dCK靶序列对应于SEQ ID N°62。

一旦验证，则生产编码两个TALE-核酸酶的mRNA，多腺苷酸化并用于利用如WO 2013/176915中描述的脉冲敏捷(agile)技术电穿孔T-细胞(左和右使用了5或10μg TALE-核酸酶的mRNA)。在电穿孔之后，通过在30℃下培养T-细胞进行立即冷温冲击并且持续24h。重新活化(12.5μL珠粒/10⁶个细胞)在D8(电穿孔后8天)时进行实施。

获得的细胞允许进行生长，并最终进行基因型(通过内切酶T7分析并且在dCK和TRAC位点上深度测序)以及表型表征。其表型表征由以下组成(i)，检查其在药物存在或不存在之下生长的能力(ii)，测定PNA、氯法拉滨和氟达拉滨对T-细胞的IC₅₀，和(iii)当实施双KO时通过FACS分析确定TRAC失活的程度。

dCK KO T-细胞的基因型表征

为了评价dCK基因失活的效率，用5或10μg TALE-核酸酶mRNA转染的细胞生长4天(电穿孔后4天，D4)，并收集以便在dCK位点实施T7分析(图5)。

在这些T7分析中使用的引物的序列对应于SEQ ID N°68和SEQ IDN°69。T7分析测定方案描述于文献Reyon，D.，Tsai，S.Q.，Khayter，C.，Foden，J.A.，Sander，J.D.，and Joung，J.K.(2012)FLASH assemblyof TALE-nucleases for high-throughput genome editing.Nat Biotechnologies中。

根据这种内切酶T7分析的结果表明，当转染5和10μg左右(left andright)dCK2TALE-核酸酶时，显著的基因加工表明dCK有效失活。

dCK KO T-细胞的生长率的测定

正如图6中所示，dCK KO细胞相对于WT-细胞展示出类似的生长速率。此外，它们可以以与WT T-细胞相同的效率在D8时重新活化。

dCK KO T-细胞在氯法拉滨的存在下的选择

dCK KO或WT T-细胞允许从D8生长到D13，并随后用或不用1μM氯法拉滨培养直至D18。细胞在D8(加入药物之前)和在D18(药物培养之后)收集，并用于实施内切酶T7分析。

图7中所示的结果表明在D18时培养基中1μM氯法拉滨的存在，相比于野生型(WT)T-细胞，选择性地富集了dCK KO T-细胞(相比于WTT-细胞的单带高分子量，dCK KO T-细胞有2带低分子量)。这表明dCK的TALE-核酸酶介导的失活允许优于WT T-细胞，选择耐药性T-细胞。因此，dCK KO T-细胞可以耐受1μM氯法拉滨的存在，其对应于根据European Medecines Agency(EMA)报告的C_最大(C_max)的治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)的临床相关剂量。

相对于WT T-细胞，氯法拉滨对dCK KO T-细胞的IC50的测定

为了进一步研究T-细胞耐受氯法拉滨能力，对dCK KO和WT T-细胞测定这种药物的IC50。在转染3后，收集细胞，在浓度渐增的氯法拉滨(0至10μM)存在下培养2天。在氯法拉滨培养结束时，T细胞的存活率通过FACS分析2测定。

图8中所示的结果清楚表明，由TALE-核酸酶介导的dCK基因的处理在T-细胞中有效失活了dCK活性。这种失活关联于氯法拉滨耐药性，与WT T-细胞的敏感性形成对比。IC50值(加入到培养基中将细胞存活率降低至50％的药物量)分别对应于WT和dCK KO T-细胞的约100nM和10μM。

总之，该第一组数据容许得出结论，dCK基因的TALE-核酸酶介导失活是有效的。dCK的失活并不会损害工程改造的T-细胞的生长率，而同时使其可以耐受氯法拉滨的临床相关剂量。

实施例2.耐受氯法拉滨的异体T-细胞的产生和表征

为了开发并生产耐受氯法拉滨的异体CAR T-细胞，同时失活dCK和TRAC基因。在实施例1中已经证实dCK失活成功后，生成并表征TRAC/dCK双KO T-细胞。图9中所示的两个工作流程并行进行。它们中之一对应于细胞在氯法拉滨的存在下培养5天的时间段。

基因型表征

为了首先评价TRAC和/或dCK基因失活的效率和动力学，转染的细胞生长6天并在D1、D3和D6收集以便在dCK和TRAC基因座上实施T7分析。为了实现这一目标，分别具有SEQ ID N°68和N°69；以及SEQID N°70和N°71的2对引物对于dCK和TRAC基因座，用于T7分析。

方案使用了文献Reyon，D.，Tsai，S.Q.，Khayter，C.，Foden，J.A.，Sander，J.D.，and Joung，J.K.(2012)FLASH assembly of TALE-nucleasesfor high-throughput genome editing.Nat Biotechnol中描述的那个。

图10中所示的结果表明，TALE-核酸酶介导的单TRAC和dCK KO甚至在D1就是高效的。尽管双KO细胞已经不能表征为同源群体，TRAC/dCK双KO也是表现为高效的。

细胞随后在1μM氯法拉滨存在或不存在氯法拉滨下生长。在D 6(转染之后6天)并且在存在氯法拉滨或不存在氯法拉滨下培养3天后，收集细胞并通过内切酶T7分析和高通量DNA测序测定dCK KO效率。

用于深度测序的方案描述于文献Shendure，J.，&Ji，H.(2008).Next-generation DNA sequencing.Nature biotechnology，26(10)，1135-1145中。

图11中所示的结果表明，dCK位点产生的插入缺失的频率在所有实验中为约80％至90％。这再次表明，dCK的TALE-核酸酶-介导的失活是高效的，即使在它同时与TRAC失活组合时也是如此。1μM氯法拉滨在培养基中存在5天不会提高dCK KO-特异性T7带，正如在第一组实验中所见。这间接表明，在这个特定实验中，dCK失活的成功足以允许工程改造的T-细胞在氯法拉滨的存在下生长。有趣的是，这表明，如果dCK KO足够有效，就没有必要在氯法拉滨的存在下选择T-细胞而获得耐药性T细胞。因此，此特征表示在生产耐药性异体T-细胞中明显的优势。

TCAR KO效率的表型评价

分析双重KO实验收集的TRAC KO T-细胞并通过FACS(CliniMACS)纯化。图12A中所示的结果示出了具有或不具有抗TCR mAb-PE的T-细胞的标记实验。图12B还涉及培养基中具有或不具有氯法拉滨，在TRACKO T-细胞纯化之前和之后的T-细胞的mAb-PE标记。

结果表明，TCR KO的效率在用TRAC和dCK mRNA处理(dCK/TRAC双敲除)的T细胞中很高(约85％)。纯化的方法允许进行TCR阴性细胞(negative cell)的有效选择/纯化高达纯度99.3％。

TRAC/dCK KO T-细胞的表型表征

T-细胞在不存在氯法拉滨之下的生长率如图13中所示。即使KOdCKT细胞表现出出轻微的生长缺陷，这些可以在D10以与WT T-细胞相同的效率重新活化。

T-细胞在氯法拉滨的存在下的生长率如图14中所示。这个实验对双KO dCK/TCAR T CART-细胞(描述于申请号PCT/EP2014/059662的专利申请中的FMC63)通过在具有不同的氯法拉滨(0.1μM至10μM)的培养基中培养这些细胞达11天而进行实施。图14中所示的结果清楚表明，虽然生长并没有这些细胞无药物时的生长显著，双KO dCK/TCAR CAR T-细胞的T-细胞扩增在高达1μM氯法拉滨(这对应于C_最大)下是正确的。

氯法拉滨对工程改造的T-细胞相对于WTT-细胞的IC50的测定

为了进一步研究双KO T-细胞应对氯法拉滨的能力，测定了这种药物的IC50。在有和没有氯法拉滨的情况下培养T-细胞长达D3至D8(参见图9中的工作流程2)，在具有不同浓度的氯法拉滨的培养基中培养2天(从D15至D17)。随后通过FACS分析使用亮计数试剂盒(count bright kit)评价T-细胞存活率。

图15中所示的结果表明，dCK和dCK/TRAC KO T-细胞相比于阴性对照物T细胞和TRAC简单KO T-细胞表现出耐受氯法拉滨的显著能力。值得注意的是，通过使用1μM从D3至D8的5天进行细胞选择(参见图9中的工作流程2)并不会提高其耐受氯法拉滨的能力。这间接表明dCK失活足够有效，并且并不需要对药物选择的5天培养就能获得氯法拉滨耐受的异体CAR T-细胞。

耐药性的异体T-CAR T-细胞的细胞毒性

如下实施细胞毒性分析：10个CAR T-细胞(FMC63，参见以上参考文献)用DAUDI细胞(特异性靶)和K562细胞(非特异性靶)培养5小时。然后收集细胞并通过计算靶向细胞溶解的频率而测定DAUDI和K562细胞的存活率。

图16中所示的结果表明，dCK/TRAC双KO CAR T-细胞显示出与WT CAR T-细胞相似的靶向细胞毒性(35％靶向细胞毒性)。这表明dCK和TRAC基因的失活并不影响CAR FMC63T-细胞的毒性细胞。

然后如前所实施的，将这些细胞用于确定其对氯法拉滨和氟达拉滨的敏感性。图17中所示的结果表明，dCK/TRAC KO CAR T-细胞相比于CART-细胞阴性对照具有显著的抗氯法拉滨能力(分别为IC₅₀＝500nM和0.1nM)。采用氟达拉滨获得了类似的结果(对于双KO CAR T-细胞和T CAR分别为IC₅₀＝400μM和10μM)。

结论

总之，这些实验表明，dCK和TRAC基因的同时失活是高度有效的并允许采用单轮电穿孔产生超过70％的双KO T-细胞。有趣的是，由于这种高效率，没有必要进行耗时的选择步骤。工程改造的T-细胞表现出显著的抗氯法拉滨能力并在临床相关的氯法拉滨剂量的压力下保持于其最大存活率。

实施例3.耐受氯法拉滨的Daudi细胞的产生

目的是制备耐药性CD19⁺/Luc⁺Daudi靶细胞以评价耐受氯法拉滨的异体CAR T-细胞的细胞毒性。

dCK KO Daudi基因型表征

制备dCK TALE-核酸酶mRNA并根据WO2013/176915中描述的方案通过dCK TALE-核酸酶mRNA电穿孔Daudi细胞。

正如实施例1中实施内切酶T7分析评价dCK KO效率。在转染2天之后进行分析。引物具有SEQ ID N°68和N°69。

图18中所示的结果示出了dCK基因的高的失活。

dCK KO Daudi细胞的表型表征

将Daudi细胞在具有不同浓度的氯法拉滨(0；0.1；0.25；0.5和1μM)的培养基中培养数天，并在每次传代时进行计数。

图19中所示的结果表明，dCK KO Daudi细胞可以在1μM氯法拉滨的存在下生长。其生长率类似于无氯法拉滨下WT T-细胞生长的情况，这间接表明dCK失活并未损害Daudi生长的能力。正如预期的那样，WTDaudi细胞生长明显受到损害。这个结果证实，已成功产生dCKKO-CD19⁺-Luc⁺-GFP⁺细胞。

实施例4.耐受6TG的T-细胞的生成和表征

为了开发耐受6MP和6TG的T-细胞(HPRT KO T-细胞)，HPRT基因如下进行TALE-核酸酶介导的失活。完整HPRT基因构架(外显子和内含子)和不同TALE-核酸酶靶位点的位置显示于图20中。

HPRT基因的TALE-核酸酶介导失活

这个实验中用于产生和表征的HPRT单KO T-细胞的工作流程报告于图21中。为了失活HPRT基因，设计、组装了2对HPRT TALE-核酸酶，并通过测序进行验证(对于HPRT1：SEQ ID N°74和SEQ ID N°75；对于HPRT2：SEQ ID N°77和SEQ ID N°78)。关于HPRT基因完整构架(外显子和内含子)和TALE-核酸酶靶位点的位置的细节如图20中所示。对于HPRT1和HPRT2TALE-核酸酶的靶序列分别对应于SEQ ID N°76和SEQID N°79。

HPRT KO T细胞的基因型表征

HPRT KO T细胞在D4通过内切酶T7分析进行基因型表征，表明T细胞中的HPRT基因失活。在该分析中使用的引物对(pair)具有SEQ IDN°72和SEQ ID N°73。图22中所示的结果表明，HPRT TALE-核酸酶对可以高效加工HPRT基因。

HPRT KO T-细胞的生长率

根据图23所示的结果，KO HPRT-细胞表现出类似于WT T-细胞的生长率，尽管对于TALE-核酸酶HPRT2对(pair)(采用10μg TALE-核酸酶进行实施)稍低。然而，通过10μg TALE-核酸酶HPRT2对而失活的T细胞在D10以与WT T-细胞相同的效率重新活化，表明HPRT失活并未显著损害T-细胞的生长。在以下实验中选择TALE-核酸酶HPRT1对。

在6TG的存在下HPRT KO T-细胞的选择

HPRT KO或WT T-细胞允许从D8生长至D13，并随后在1μM 6TG存在或不存在下培养直到D18(图22中所示的工作流程)。细胞在D8(药物添加之前)和D18(药物培养之后)收集，并用于实施内切酶T7分析。所用的引物对具有序列SEQ ID N°72和SEQ ID N°73。图24中所示的结果表明，培养基中1μM 6TG的存在允许选择性富集HPRT KO T-细胞(如在6TG的存在下在D18由不太密的WT带所示)。

HPRT KO CAR T-细胞的生成

为了研究HPRT失活对CAR T-细胞细胞毒性活性的影响，将CAR 4G7慢病毒载体转导的T-细胞(如描述于以编号PCT/EP2014/059662提交的申请)采用编码mRNA的TALE-核酸酶HPRT1进行电穿孔。下面描述的所有实验都用未进行任何6TG选择而产生的工程改造T-细胞进行。HPRT加工的效率通过内切酶T7分析进行评价。这种分析所用的引物对对应于SEQ ID N°72和SEQ ID N°73。图25中所示的结果表明，HPRT基因在存在或不存在CAR 4G7下成功失活。在T-细胞中比在CAR T-细胞中获得的HPRT失活更彻底。

HPRT KO CAR-T细胞对Daudi细胞的细胞毒性特性

如图27示意性所示实施细胞毒性分析。采用Daudi细胞(特异性靶)和K562细胞(非特异性靶)培养10个CAR T细胞的组5小时。随后收集细胞，并测定Daudi和K562细胞的存活率用于计算靶向细胞溶解的频率。图26中所示的结果表明，HPRT KO CAR T细胞具有类似于WT CART-细胞的靶向细胞毒性。这表明，HPRT基因的失活不影响CAR 4G7T细胞的细胞毒性。

6TG对工程改造的T细胞相对于WT T细胞的IC50测定

图27中所示的结果表明，HPRT基因的处理(如通过T7分析的早期所见)有效地失活了T-细胞中的HPRT活性。这种失活作用赋予了相对于WT T细胞对这种药物的敏感性的6TG耐受。对于WT和HPRT KO T-细胞，IC50可以分别近似测定至10nM和>100μM。

结论

总之，这些结果表明，HPRT基因的失活作用是有效的。这种失活作用使T-细胞可以耐受高剂量6TG，而不需要通过耗时的过程进行纯化。这也表明，HPRT失活可以以略低的程度实施于CAR T-细胞中。这种失活不会损害CAR T-细胞对Daudi细胞的细胞毒性性质。

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Claims (32)

1.一种制备对嘌呤类似物药物耐受的离体免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(a)提供免疫细胞；

(b)用编码稀切核酸内切酶的核酸序列转染所述免疫细胞，所述稀切核酸内切酶特异性靶向表达具有脱氧胞苷激酶活性的酶(dcK-EC 2.7.1.74)的基因；

(c)在所述免疫细胞内表达所述核酸内切酶以获得所述dcK基因的靶向失活；

d)可选地在所述嘌呤类似物药物的存在下，扩增在步骤c)中获得的工程化的所述免疫细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞是CD8+细胞。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是TIL(肿瘤浸润细胞)。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞来源于诊断患有癌症的患者。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫细胞进一步在步骤e)中注射到所述患者中。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞来源于供体。

8.根据权利要求2至权利要求7中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞在其编码TCRα或TCRβ的基因中进一步失活以使得所述免疫细胞是异体的。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE-核酸酶。

10.根据权利要求9所述的方法，其中TALE-核酸酶dCK基因失活通过使用SEQ ID N°63或SEQ ID N°64的TALE-核酸酶进行，dCK靶序列是SEQ ID N°62。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤e)中的工程化的所述细胞在体内扩增。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中工程化的所述细胞在体外扩增。

13.根据权利要求2所述的方法，进一步包括在所述T-细胞中表达嵌合抗原受体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述嵌合抗原受体是CD19+或CD123+。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，进一步包括使免疫检测点基因失活。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述嘌呤类似物药物是氯法拉滨或氟达拉滨。

17.一种通过根据权利要求1至16中任一项所述的方法可获得的分离的免疫细胞，其对嘌呤类似物药物是耐受的。

18.一种对嘌呤类似物耐受的分离的T-细胞，其包含至少一个编码T-细胞受体组分的断裂基因。

19.一种对嘌呤类似物耐受的分离的T-细胞，其中所述分离的T细胞被赋予对抗原特异的嵌合抗原受体(CAR)。

20.根据权利要求19所述的分离的T-细胞，其中所述CAR靶向CD19+细胞或CD123+细胞。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的分离的T-细胞，用于其作为药物的用途。

22.根据权利要求20所述的分离的T-细胞，结合使用嘌呤类似物药物。

23.根据权利要求20至权利要求22中任一项所述的分离的T-细胞，用于其治疗癌症的用途。

24.根据权利要求23所述的分离的T-细胞，其中所述癌症是急性淋巴细胞白血病(ALL)或肌萎缩性髓性白血病(AML)。

25.一种包含至少一种根据权利要求17至24中任一项所述的分离的T-细胞的药物组合物。

26.一种用于治疗需要其的患者的方法，包括：

(a)根据权利要求17至24中任一项所述的方法制备T-细胞群；

(b)将转化的所述T-细胞给药至所述患者。

27.根据权利要求26所述的用于治疗患者的方法，进一步结合嘌呤类似物药物的给药。

28.用于测试根据权利要求13或权利要求14所述的分离的嵌合抗原受体(CAR)T-细胞对耐药性靶细胞的细胞毒性的方法；所述分离的CAR T-细胞都表达嵌合抗原受体(CAR)并且所述靶细胞表达至少特定的表面抗原(和可选的标记基因，如荧光素酶)，包括：

(a)制备所述T-细胞群和所述靶细胞群两者；

(b)孵育所述T-细胞群与至少特异性的所述靶细胞；

(c)测定特异性的所述靶细胞的存活率。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述耐受基因是dCK。

30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述表面抗原是CD19。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述靶是CD19+荧光素酶+Daudi细胞。

32.一种用于进行用于测试CAR T-细胞对于靶细胞的细胞毒性的方法的试剂盒，包括：

(a)赋予了对于抗原特异性的CAR的所述T-细胞群；

(b)表达所述抗原的所述靶细胞；

(c)可选的培养基；

T-细胞和靶细胞都根据本发明制备为对于化疗药物耐受。