KR20240007179A - 고형 종양 암 면역 요법을 위한 새로운 항-muc1 car 및 유전자 편집된 면역세포 - Google Patents

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토마즈 쿠르콘
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Abstract

본 발명은 새로운 항-MUC1 키메라 항원 수용체를 발현하는 유전적으로 조작된 면역세포 및 고형 종양의 치료, 특히 동종이계 세포 면역요법에 적합한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

고형 종양 암 면역 요법을 위한 새로운 항-MUC1 CAR 및 유전자 편집된 면역세포
본 발명은 세포 면역요법 분야에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고형 종양의 치료에 유용한 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 면역세포에 관한 것이다
CAR 면역세포 치료제는 주로 T세포와 NK세포로 구성되어 지난 10년 동안 혈액암 치료에 혁신을 일으켰다. 그러나, 지금까지 동일한 유형의 치료법은 고형 종양을 치료하는 효과적인 방법이 되지 못했다[June et al., CAR T cell immunotherapy for human cancer (2018) Science 359:1361-1365].
실제로, 고형 종양을 치료하는 데 있어 어려움은 두 가지 주요 영역: 1) 배타적인 종양 특이성의 결여로 인한 오프-종양(off-tumor) 독성 및 2) 고형 종양의 복잡한 면역억제 생물학으로부터 기인한다[Marofi, F., et al. (2021) CAR T cells in solid tumors: challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 18(4):843-851].
CAR 면역세포의 특이성은 건강한 조직에 손상을 초래하는 온-표적(on-target) 오프-종양 활동으로 인해 여전히 중요한 과제로 남아 있다. 이러한 점에서, 면역요법에서의 치료용 항체의 효율성은 이전에 개발된 항체와 동일한 ScFv를 사용하는 CAR-T 세포의 특이성/활성에 대하여 낮은 예측값을 보임이 입증되었다. 또한, 그 반대도 사실인데, 왜냐하면 CD19 항체가 혈액암에 대해 개발되지 못한 경우에 항-CD19 CAR이 매우 효율적인 것으로 입증되었기 때문이다.
혈액학적 종양의 경우 오프-타겟 손상은 더 낮은 위험을 초래한다. 일반적으로 관련 독성은 잘 견디거나 효과적으로 관리된다. 이는 부분적으로 항원이 B-세포에 대한 CD19와 같은 혈액학적 구획의 특정 세포 계통으로 제한되기 때문이다. CD19 CAR-T 활성으로 인한 건강한 B-세포의 손실은 B-세포 무형성증(aplasia)을 초래할 수 있으며, 이는 감염 위험이 더 높지만 치명적이지 않으며 정맥 면역글로불린(IVIG) 대체 요법으로 잘 관리될 수 있다.
대조적으로, 고형 조직에서 CAR-T 표적 항원의 발현은 치명적인 독성과 관련된다. 예를 들어, 전이성 결장암 치료를 위해 투여된 항-HER2 CAR-T 세포는 낮은 HER2 발현 폐 상피를 공격하여 치명적인 사건을 초래하였다[Morgan, R.A. et al. (2010) Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2. Mol. Ther. 18(4):843-851]. CAIX에 대한 CAR-T 세포가 CIAX 발현 담관 상피를 공격하여 간 손상을 초래했던 신장암에 대한 치료법에서도 유사한 독성이 관찰되었다[Lamers CH, et al. (2006) Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous T-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX: first clinical experience. Journal of Clinical Oncology. 24(13):e20-2]. 전반적으로, 고형 종양에 대한 CAR-T 치료법의 성공은 제한적이며, 측정 가능한 반응이 관찰된 경우에는 부분적으로 오프-타겟 결합과 관련된 독성으로 인해 효능을 개선하기 위한 수단으로서의 용량 증량은 가능하지 않았다[Wagner, J. (2020) CAR T Cell Therapy for Solid Tumors: Bright Future or Dark Reality? Molecular Therapy. 28(11):2320-23394].
가장 활성이 있으며 특이적인 scFV에 대해서조차도 고형 종양에서 유의미한 반응을 얻지 못하는 추가 수준의 실패는 다음과 같은 종양 미세환경: (1) 세포외 기질 침착 및 높은 간질압(interstitial pressure)으로 인해 CAR-면역세포 침윤이 제한되고, (2) 종양 내 CAR-면역세포 증식 및 효과기 기능은 저산소증 및 영양분 부족으로 인해 차단된다. 3) 조절 T-세포(T-reg: TGF-β), 암 관련 섬유아세포(CAF: TGF-β) 및 골수 유래 억제 세포(MDSC: IL-10 및 TGF-β)를 포함하는 다른 종양 상주 세포에 의해 생성된 면역억제 신호가 CAR-T 세포 증식 및 효과기 기능을 방지한다. 4) PDL1과 같은 면역 체크포인트 리간드의 상향 조절(upregulation)은 CAR-T 세포 활동을 직접적으로 억제한다. 고형 종양 치료를 위한 성공적인 CAR-T 제품을 개발하려면 차세대 CAR-T 세포의 복잡한 엔지니어링을 통해 이러한 과제들을 해결해야 한다.
표 1: 고형 종양에서의 성공적인 CAR-T 치료의 결정 요인
표 1에 요약된 이러한 주안점들은 종양에만 독점적인 MUC1 에피토프의 고도로 특이적인 번역 후 버전을 표적화하는 항-MUC1 CAR-면역세포를 엔지니어링하고, 이들을 MUC1 양성 고형 종양과 관련된 면역억제 종양 미세환경에 대항할 수 있는 유전적 변형을 도입함으로써 본 발명에서 해결된다.
MUC1은 폐, 자궁 경부, 위 및 내장을 포함한 여러 기관을 감싸고 있는 상피 세포에서 생성되는 대형 뮤신 유형의 당단백질이다. 정상 조직에서 MUC1은 상피 내벽의 정점 측에만 국한되어 있으며 MUC1 위의 글리칸이 물을 가두어 이들 조직을 손상과 병원균으로부터 보호하는 점막 장벽을 형성하는 내강으로 확장된다. 다른 고형 종양 표적과 유사하게 MUC1은 종양에 매우 풍부하지만, 다른 고형 종양 표적과 달리 MUC1은 종양 세포에 의해 생성될 때 구조적으로 상이하다(본원에서는 tMUC1로 약칭함). MUC1의 구조적 차이는 세포외 소단위체의 VNTR 영역 내에서 MUC1의 차등적 글리코실화로 인해 발생한다(도 1 참조). tMUC1에 추가된 O-글리칸은 잘리거나 완전히 누락되거나 시알산으로 조기에 변형된다. 결과적으로, 종양 세포에 의해 생성된 tMUC1은 분자 수준에서 다르며, 저당화된 tMUC1에 대해 생성된 scFV는 정상 세포에 의해 생성된 완전히 당화된 MUC1을 인식해서는 안 된다. tMUC1과 MUC1 사이의 이러한 차이에 기초하여, tMUC1에 대해 생성된 CAR-면역세포가 종양을 인식하는 데 매우 특이적일 것이라는 가설이 세워졌다[Naito et al. (2017) Generation of Novel Anti-MUC1 Monoclonal Antibodies with Designed Carbohydrate Specificities Using MUC1 Glycopeptide Library. ACS Omega. 2(11): 7493-7505].
문헌으로부터의 14개의 항-MUC1 ScFv 후보의 1차 선택에 기초하여, 발명자들은 MUC1의 동일한 폴리펩타이드 세그먼트를 공통적으로 표적화하는 4개의 ScFv를 포함함으로써 tMUC1에 대한 CAR 스캐폴드를 개발하였다. 면역세포에서 다양한 CAR의 발현은 모두 항-tMUC1 항종양 반응 활성에 대해 양성이며 특이적인 결과를 가져왔다. 그러나 CAR는 상이한 범위에서 인-비보(in-vivo) 항종양 반응을 보여주었다.
고형 종양에서의 CAR-면역세포 활성은 종종 종양 면역억제 환경으로 인해 억제되기 때문에, 발명자들은 다음과 같은 고형 종양과 관련된 여러 문제를 동시에 해결하도록 엔지니어링된 면역세포에서 본 발명의 다양한 CAR를 발현하였다:
1) 사이토카인 유도된 이종성 발현에 의한 CAR-면역세포의 효능을 증가시킴;
2) CAR 면역세포 활성화를 억제하는 면역 체크포인트 유전자를 불활성화하여 CAR-T 세포 고갈을 제한함;
3) TGF-β의 면역억제 효과를 완화하기 위한 대안을 이용하여 종양 미세환경으로부터의 면역억제를 예방함;
4) 세포외 기질의 필수 구조 및 신호 전달 성분인 글리코사미노글리칸인 히알루로난(HA)을 발현하여 종양 침윤을 강화함; 및/또는
5) 포도당-6-인산염 아이소머라제(예: GPI1), 젖산염 탈수소효소(예: LDHA) 및 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 1(예: PCK1)과 같은 대사 효소를 과발현함으로써 저산소 및 영양 결핍 환경을 완화시켜, 여러 인자들 사이에서, 저산소 및 영양 결핍 환경에서의 염증성 Th17 세포의 증식 능력을 증강함.
이러한 실험 동안 유전자 표적화 통합과 레트로바이러스 접근법이 사용 및 결합되어 항-MUC1 CAR 면역세포의 유전적 조작을 최종적으로 최적화하고 효능이 향상된 치료 세포를 제공하게 되었다.
도 1: A. 정상 세포와 종양 세포 표면 상의 MUC1 발현에 대한 도식적 표현. B. 건강한 세포와 종양 세포 상의 MUC1의 글리코실화 상태의 도식적 비교 표현. 암 관련 MUC1은 종열 폴리펩타이드 반복부 (SEQ ID NO:20)를 따라 저당화되어 있다.
도 2: 암세포 상 및, 신장, 폐 그리고 자궁경부 조직의 일차 세포(primary cell) 상에서 측정된 선택된 MUC1 scFV의 특이성. 유방암 세포주(T47D 및 HCC70)와 대조적으로, 높은 수준의 정상 MUC1을 발현하는 이들 세포주는 후보 scFV에 의해 염색되지 않는다.
도 3: 시험관 내(in-vitro) 일차 T-세포에서 본 발명의 항-MUC1-CAR를 발현시켜 얻은 각각의 유방암 세포 T47D 및 HCC70의 특이적 세포용해 백분율을 보여주는 다이어그램(비율 1:1, 2.5:1 및 5:1). 다이어그램은 새로운 항-MUC1 CAR-T의 높은 활성 반응과 CLS MUC1-A CAR의 우수성을 보여준다.
도 4: 고형 종양 미세환경 및 고형 종양에서 CAR-T 기능을 억제하는 다양한 요인에 대한 분석.
도 5: 주요 특징적인 유전적 속성을 갖는 본 발명에 따른 항 MUC1-CAR 조작된 면역세포의 도식적 표현. A. TGF베타에 대한 디코이(dnTGRBR2B)와 함께 항-MUC1 CAR의 공-발현을 위한 유전자 구조체의 표현. 이 유전자 구조체는 뉴클레아제 또는 니카제(nickase) 유전자 편집 시약을 사용하는 상동 재조합 또는 NHEJ에 의한 부위 지정 유전자 삽입을 위해 렌티바이러스 벡터 또는 도너 템플릿 내로 포함될 수 있다. B. β2m 내인성 유전자자리에서의 유전자 삽입을 나타내고 있는데, β2m의 불활성화 및 환자의 NK 세포에 대한 내성을 제공하는 HLA-E의 발현을 유도한다. C. PDCD1(PD1) 내인성 유전자자리에서의 유전자 삽입을 나타내고 있는데, PD1의 불활성화 및 면역세포 활성을 증가시키는 IL-12의 발현을 유도한다. D. 항-MUC1 CAR, NK 억제제로서의 HLA-E의 이종 발현, IL-12 및 TGFβ에 대한 디코이로서의 dnTGFβ RⅡ의 분비를 보여주는 조작된 면역세포 표면을 나타낸다. 반면에 TCR, PD1 및 β2m의 발현은 억제되거나 불활성화된다.
도 6: 상기 도 5B에 표시된 ΔB2M-HLA-E 유전적 특성의 상세한 메커니즘.
도 7: 상기 도 5C에 표시된 ΔPD1-IL12 유전적 특성의 상세한 메커니즘. 내인성 PD1 프로모터의 전사 제어 하에 IL-12를 인코딩하는 외인성 서열을 삽입함으로써, IL-12의 분비는 CAR에 의한 종양 항원 인식과 동기화된다.
도 8: 조작된 세포 집단 중 적어도 30%의 세포가 적어도 3가지 주요 유전적 속성을 나타냄을 보여주는, 본 발명에 따라 조작된 세포의 FACS 분석(세부 사항은 실험 섹션 참조). 집단 내 세포의 최소 30%가 CAR 양성, [PD1] 음성, [TCR] 음성, [β2m] 음성 및 [HLAE] 양성으로 테스트되었다.
도 9: OCA(Oligo Capture Assay) 분석시 본 발명의 조작된 세포(rLV CAR-DNTGFBR2 형질도입 + 트리플 TALEN® 형질감염(TRAC/B2M/PD-1) + HLA-E의 AAV 매개 KI)에서 관찰된 오프사이트(off-site) 후보군의 낮은 점수.
도 10: HCC70 암세포에 대한 ΔPD1-IL12 유전적 속성을 사용하여 달성된 UCARTMUC1의 강력한 인 비보 종양내 증식을 보여주는 실시예 2에 자세히 설명된 실험 결과를 보여주는 다이어그램(도 12에 예시된 것과 동일한 실험 설정).
도 11: 본 발명의 4가지 항-MUC1 CAR-T로 각각 처리된 마우스에서 접종부터 28일까지의 인-비보 종양 부피를 보여주는 그래프.
도 12: 도 5에 자세히 설명된 유전적 속성이 항-MUC1 CAR로 치료할 때 마우스 생존을 연장한다는 것을 보여주는 실험(실시예 2 참조).
도 13: 마우스 실험에서 CLS MUC1-A CAR-T 세포를 처리하여 얻은 피하 종양 부피 감소를 보여주는 그래프.
도 14: 유전적 속성이 있거나 없는 항-MUC1 CAR T-세포로 처리된 마우스의 HCC70 종양 분석. 그래프는 본 발명에 따른 유전적 속성을 지닌 세포를 사용하여 달성된 보다 강력한 종양내 UCARTMUC1 증식을 보여준다.
도 15: 고형 종양 이질성(heterogeneity)을 극복하는 것을 목표로 하는 항-MUC1 CAR/항-메소텔린 CAR 이중 접근법의 원리.
도 16: 최적화된 면역 시나리오를 위한 본 발명에 따른 항-MUC1 CAR-T 속성의 원리.
도 17: 주요 특징적 유전 속성을 갖는 본 발명에 따른 최적화된 항 MUC1-CAR 조작된 면역세포의 도식적 표현. 항-MUC1 CAR 구조체는 무작위로(렌티바이러스 벡터 사용) 도입되거나 또는 특정 부위(상동 재조합 또는 유전자 편집 시약을 사용하는 NHEJ에 의한)에 도입될 수 있는데; HLA-E는 β2m 내인성 유전자자리에 통합되어 숙주 면역 탈출을 유도하고; IL-12는 PDCD1(PD1) 내인성 유전자자리에 통합되어 PD1 불활성화 및 종양 특이적 및 국소화된 IL-12 발현을 유도하며, TGFBR2는 불활성화되어 TGF β 경로 차단을 유도한다.
도 18: A. MUC1-A 및 MUC1-C 조작된 CAR-T 세포 평가를 위한 인 비보 실험 설정. B. 지시된 용량의 MUC1-A 및 MUC1-C 조작된 CAR-T 세포를 사용하여 치료한 후 얻은 종양 부피. C. 생존 곡선. D. 치료 후 54일에 종양에서 hCD45+ 세포 검출 비율. 이러한 결과는 다른 항-tMUC1 CAR에 비해 MUC1-A의 우수성과 용량 반응 민감도를 나타낸다.
도 19: MUC1-A, MUC1-C 및 MUC1-D scFVs 단백질을 사용하여 종양 마이크로어레이에서 수행된 IHC 결과이며, 이는 CAR MUC1-A가 환자 종양 세포 샘플에 더 많은 친화성을 나타냄을 보여준다.
요약
본 발명을 달성하기 위해, tMUC1에 대해 4개의 서로 다른 CAR: 즉 CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D가 합성되었다. SEQ ID NO:1의 tMUC1 폴리펩타이드 세그먼트의 다양한 에피토프를 인식하는 이들 CAR 구조체에 사용된 scFV는 유방암 세포 특이적인 것으로 스크리닝되었다(HCC70 및 T47D 세포주). 음성 대조군으로서 MUC1/tMUC1 음성의 HEK293FT-세포를 사용하였다. 본 실험 부분에서 볼 수 있듯이 4개의 서로 다른 CAR는 인-비트로에서 유방암 세포주 T47D 및 HCC70에 대해 높은 세포독성 활성을 나타낸 반면, 폐, 신장 또는 자궁경부의 정상적인 일차 세포에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았다. 이들 데이터는 생산된 4개의 CAR이 tMUC1에 매우 특이적이라는 것을 보여주었다. 한편, 본 발명자들은 4개의 CAR이 일차 T-세포로 발현될 때 서로 다른 수준의 활성을 부여하고 이들 중 하나(CAR MUC1-A)가 인-비보 항종양 활성 측면에서 예기치 않게 다른 CAR를 능가한다는 것을 관찰할 수 있었다.
주로 고형 종양에 대한 특정 면역 반응을 유도하는 데 적절한 것으로 간주되었던 본 발명의 상기 항-MUC1 CAR들은 특히 동종이계(allogeneic) 환경에 대한 적용 가능성의 관점에서 유전적으로 조작된 면역세포에서 테스트되었다.
결과는 본원에 설명된 4개의 CAR뿐만 아니라 항-MUC1 CAR가 다양한 유전적 속성과 성공적으로 결합되어 상당히 향상된 항-종양 효능을 갖는 정교한 유전자 편집된 CAR 면역세포를 생성할 수 있음을 보여준다.
따라서 본 발명은 새로운 항-MUCI CAR뿐만 아니라 고형 종양의 인-비보 제거를 위해 상기 CAR의 활성을 강화시키는 다양한 유전적 속성을 나타내는 항-MUCI CAR이 부여된 조작된 면역세포의 생산을 포함한다.
본 발명에 따른 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)는 바람직하게는 MUC1 폴리펩타이드 영역 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO:20)의 저당화된 에피토프를 구별할 수 있는 항원에 대해 지시된다.
본 발명의 하나의 예시적이고 바람직한 항-MUC1 CAR는 다음을 포함한다:
- 막관통 도메인;
- CD3 제타 시그널링 도메인 및 공-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인
- MUC1-A (SEQ ID NO:17), MUC1-B (SEQ ID NO:27), MUC1-C (SEQ ID NO:37) 또는 MUC1-D (SEQ ID NO:37)로부터 선택된 하나와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 ScFv를 포함하는 리간드 결합-도메인.
본 발명에 사용된 이러한 CAR의 구조는 일반적으로 해당 분야에 기술된 바와 같이 2세대, 3세대 또는 4세대에 속하는데[Subklewe, M., et al. (2019) Chimeric Antigen Receptor T Cells: A Race to Revolutionize Cancer Therapy. Transfusion medicine and hemotherapy. 46(1), 15-24], 항-tMUCI 리간드 결합-도메인을 CD8알파의 힌지 및 막관통 도메인과 4-1BB의 공-자극 도메인 및 CD3 제타의 시그널링 도메인과 결합한다.
본 발명은 또한 면역세포의 표면에 항-MUC1 CAR를 도입하고 발현하는데 사용되는 벡터뿐만 아니라 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
본 발명에 따라 항 MUC1-CAR를 발현하는 조작된 면역세포는 일반적으로 인간 도너로부터 유래하는 NK 또는 T-세포 또는 이의 전구체이며, 동종이계 설정에 사용하기에 적합하다. 이러한 세포는 환자의 숙주 세포에 대해 덜 면역반응성을 가지면서 동시에 환자의 종양 세포에 대해 더 공격적인 방식으로 유전자 편집될 수 있다. 이와 관련하여, 이들은 도 5, 6, 7 및/또는 15에 예시된 몇몇 또는 모든 유전자 변형을 유리하게 조합할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, TCR알파 및/또는 TCR베타의 발현은 상기 조작된 세포에서 억제되거나 불활성화될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 항-CD52 항체와 같은 적어도 하나의 면역 억제 약물에 대한 내성을 부여하도록 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 적어도 하나의 화학요법 약물, 특히 퓨린 유사체 약물에 대한 내성을 부여하도록 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 환자 내에서의 지속성 또는 수명을 개선하기 위해, 특히 HLA 또는 B2m과 같은 MHC-1 성분(들)을 인코딩하는 유전자 내로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 MUC1 CAR 의존성 면역 활성화를 개선하기 위해, 특히 PD-1/PDL1, CTLA4 및/또는 TIM3와 같은 면역 체크포인트 단백질 및/또는 그의 수용체의 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 TGF베타 및/또는 TGF베타 수용체(TGFβRⅡ)를 인코딩하는 것과 같은 TGF베타 경로에 관여하는 유전자로 돌연변이될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 SEQ ID NO:59와 적어도 80% 폴리펩타이드 서열 동일성을 갖는 도미넌트 음성(dominant negative) TGF베타 수용체(dnTGFβRⅡ)와 같은 TGF베타 수용체의 디코이(decoy)를 발현할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 예를 들어, 상기 항-MUC1-특이적 CAR를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 2A 자가 절단 펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 도미넌트 음성 TGF베타 수용체(dnTGFβRⅡ)를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, CAR 및 TGF베타 수용체의 디코이를 공-발현하도록 하는 외인성 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조작된 면역세포는 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)와 하기로부터 선택된 하나와 동일성을 나타내는 또 다른 폴리펩타이드의 공-발현을 허용하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질감염된다:
- HLAG, HLAE 또는 ULBP1과 같은 NK 세포 억제제;
- 돌연변이된 IL6Ra, sGP130 또는 IL18-BP와 같은 CRS 억제제; 또는
- 상기 면역세포에 사이클로포스파미드 및/또는 이소포스파미드와 같은 약물에 대한 과민성을 부여하는 사이토크롬(들) P450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 또는 CYP1A2,
- 약물 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), 칼시뉴린 또는 메틸구아닌 전이효소(MGMT), mTORmut 또는 Lckmut
- IL-12, IL-15 또는 IL-18과 같은 케모카인 또는 사이토카인;
- HYAL1, HYAL2 및 HYAL3(SPAM1)과 같은 히알루로니다제;
- CCR2, CXCR2 또는 CXCR4와 같은 케모카인 수용체;
- 면역세포의 치료적 활성을 향상시키기 위한 CCR2/CCL2 중화제와 같은 종양 관련 대식세포(TAM)의 분비 억제제; 및/또는
- 대사 효소들: 글루코스 포스페이트 아이소머라제 1(GPI1), 락테이트 탈수소효소(LDHA) 및/또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 1(PCK1).
본 발명은 또한 고형 종양의 치료에 유용한 상기 조작된 치료 면역세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함할 수 있다.
a) 환자 또는 바람직하게는 도너로부터 유래된 면역세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포에서 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 단계;
c) 상기 세포의 게놈에 적어도 하나의 유전적 변형(들)을 도입하는 단계로서, 상기 변형(들)은 하기를 초래하는 것 중에서 선택되는 단계:
- TCR 발현의 감소 또는 불활성화;
- B2M의 감소 또는 불활성화;
- TGFβ와 TGFβRⅡ 사이의 상호작용 감소;
- PD1과 PDL1 사이의 상호작용 감소; 및/또는
- 향상된 IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현;
d) 상기 세포들을 증식하여 치료적으로 효과적인 면역세포 집단을 형성하는 단계.
일부 구현예에 따르면, 특히 넉아웃 유전자 발현을 위한 유전적 변형은 레어-커팅 엔도뉴클레아제/니카제 또는 염기 편집기와 같은 서열 특이적 유전자 편집 시약을 사용하여 수행된다.
상기 유전자 편집 변형의 조합은 약물에 반응하는 종양 세포(hot tumor cell)에 대한 면역세포, 특히 T-세포의 접근을 방지하는 종양에 의해 제기된 생화학적 장벽을 극복하는 데 특히 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
생성된 세포 집단은 일반적으로 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 보다 더 바람직하게는 적어도 5개의 유전자 변형(들)을 갖는 조작된 세포를 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 조성물은 하기 (표현형) 속성 중 하나, 여러 개 또는 모두를 특징으로 하는 조작된 면역세포 집단을 포함할 수 있다:
- tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR의 외인성 발현, 및
- B2M 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨; 및/또는
- PD1 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
및/또는
- 선택적으로, TCR 발현이 적어도 50%; 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
- 선택적으로, IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현이 적어도 50%; 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 100% 모두 증가됨;
- 선택적으로, TGFβ 또는 TGFβRⅡ 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
- 선택적으로, TGFβR2 디코이의 외인성 발현,
- 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 HYAL1, HYAL2 및 HYAL3(SPAM1)의 분비; 및
- 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 GPI1, PCK1 및/또는 LDHA의 발현.
유전형적 관점에서 볼 때, 이러한 조작된 면역세포의 치료 집단은 하기 (유전자형) 속성 중 하나, 여러 개 또는 전부를 특징으로 한다:
- 면역세포의 적어도 50%가, tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타냄; 및
- 면역세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, B2M 불활성 대립유전자(들)를 나타냄;
및/또는
- 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 돌연변이된 PD1 대립유전자(들)을 나타냄;
- 선택적으로, T-세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, TCR 불활성 대립유전자(들)을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, IL-12, IL-15 또는 IL-18을 인코딩하는 외인성 도입 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 TGFβR2의 디코이를 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 HYAL1, HYAL2 및/또는 SPAM1을 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 GPI1 및/또는 PCK1을 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, TGFβ 또는 TGFβRⅡ를 인코딩하는 돌연변이된 대립유전자(들)를 나타냄;
본 발명에 따른 조작된 면역세포는 tMUC1 발현 세포를 특징으로 하는 상태, 특히 고형 종양, 예를 들어 일반적으로 식도암, 유방암, 특히 트리플 음성 유방암, 위암, 담관암종, 췌장암, 결장암, 폐암, 흉선암종, 중피종, 난소암 및/또는 자궁내막암을 치료하는데 특히 적합하다.
따라서 본 발명은 조작된 세포, 생성된 치료 세포, 이러한 세포를 포함하는 세포 집단 및 이를 포함하는 치료 조성물뿐만 아니라 tMUC1 발현 세포에 의해 유발된 병리를 해결하도록 하는 치료 방법을 포함한다.
전체 치료 방법은 일반적으로 다음 단계로 구성된다;
- 기능성 항-MUC1 CAR를 발현하도록 환자 또는 도너 유래의 면역세포들을 조작하는 단계
- tMUC1 에피토프를 발현하는 세포들을 제거하기 위해 상기 CAR 양성 조작된 면역세포들을 환자에게 투여하는 단계.
동종이계 환경에서, 그러나 그뿐만 아니라, 이러한 치료 방법은 (1) 림프구고갈제 및 (2) tMUC1 에피토프에 대해 특이적으로 지시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 동종이계 조작된 면역세포 집단의 투여를 유리하게 조합할 수 있다.
이러한 설정에서, 항-MUC1 CAR 양성 조작된 면역세포가 CD52 유전자 발현 또는 림프구 고갈제에 의해 표적화되는 임의의 다른 폴리펩타이드에서 불활성화되어 림프구 고갈 치료에 대한 내성을 부여하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명은 또한 더 많은 수의 암을 표적으로 하고 CAR-T 요법의 선택적 압력 하에서 당형(glycoforms)의 변화로 인한 항원 탈출을 제거할 수 있는 2개의 항-tMUC1 scFV의 조합을 갖는 이중 CAR를 활용하는 것을 제공한다. 이는 또한 표적 세포 인식 속도와 CAR-T 세포 치료 효율성을 높이기 위해 MUC-1의 두 가지 독립적인 항원을 표적으로 하는 이중 CAR T-세포의 사용을 포함한다. 바람직한 접근법에서, 항-MUC1 CAR는 조작된 T-세포에서 항-메소텔린 CAR와 공-발현된다.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 유전자 치료, 생화학, 유전학 및 분자 생물학 분야의 숙련된 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 모든 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있으며, 적합한 방법 및 재료는 본 명세서에 기술되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 달리 명시되지 않는 한 예시일 뿐이며 제한하려는 의도가 아니다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); 분자 클로닝: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); 올리고뉴클레오타이드 합성(M.J. Gait ed., 1984); Mulliset al. 미국 특허. 제4,683,195호; 핵산 혼성화(B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); 전사 및 번역(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); 동물 세포 배양(R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); 고정화된 세포 및 효소(IRL Press, 1986); B. Perbal, 분자 복제에 대한 실용 가이드(1984); 시리즈, Methods In ENZYMOLOGY(J. Abelson 및 M. Simon, 편집장, Academic Press, Inc., New York), 특히 Vols.154 및 155(Wu et al. eds.) 및 Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); 포유류 세포를 위한 유전자 전달 벡터(J.H. Miller 및 M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); 세포 및 분자 생물학의 면역화학적 방법(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir 및 C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 마우스 배아 조작(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)을 들 수 있다.
본 발명은 저당화된 MUC1 종양 항원, 특히 이 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 서열 SEQ ID NO:1에 걸쳐 있는 특정 에피토프 영역에 대해 유도된 입양 면역세포(adoptive immune cell)에 의해, 보다 특히, 조작된 동종이계 CAR 면역세포를 사용하여 고형 종양을 치료하는 일반적인 방법에 관한 것인데, 이러한 항원을 표적으로 삼는데 특별한 효율성이 입증되었다.
본 명세서에는 인간 MUC1 단백질(Uniprot 데이터베이스에서는 MUCIN-1 및 P15941로도 지칭됨)에 대해, 특히 악성 세포의 표면에서 저당화된, SEQ ID NO:1로 표시되는 폴리펩타이드 영역에 대해 유도된 조작된 면역세포를 생산하는 방법이 기재되어 있다. 본 명세서의 실험 섹션에 나타난 바와 같이, 효율적인 CAR T-세포는 SEQ ID NO:1을 포함하거나 이로 구성된 이 항원 영역에 대해 CARs을 유도함으로써, 특히 SEQ ID NO:17 (MUC1-A), SEQ ID NO:27 (MUC1-B), SEQ ID NO:37 (MUC1-C) 또는 SEQ ID NO:47 (MUC1-D)을 포함하는 scFv를 함유하는 결합 도메인 중 하나를 사용하여 생산되었다.
본 발명에 따른 생성된 조작된 면역세포, 일반적으로 본 발명의 항-MUC1 CAR를 갖춘 NK 또는 T-세포는, 다른 이전의 항-MUC1 CAR가 부여된 대응물보다 더 높은 활성화, 효능, 사멸 활성, 사이토카인 방출 및 인-비보 지속성을 나타내었다.
따라서 본 발명은 MUC1의 서열인 SEQ ID NO:1에 포함된 특정 에피토프(들)를 표적으로 하는 CAR이 부여된 면역세포, 특히 트리플 음성 유방암 종양과 같은 고형 종양을 치료하기 위해 조작된 면역세포에 관한 것이다.
면역세포에서의 발현을 위한 항-MUC1-CAR의 설계:
"키메라 항원 수용체(CAR)"는 단일 융합 분자에서 하나 이상의 시그널링 도메인과 연관된 표적화 모이어티를 포함하는 재조합 수용체를 의미한다. 일반적으로 CAR의 결합 모이어티는 단일 사슬 항체(scFv)의 항원 결합 도메인으로 구성되며, 유연한 링커로 연결된 단일클론 항체의 가벼운 사슬 및 무거운 사슬 가변 단편을 포함한다. 이들 ScFv는 일반적으로 에피토프 영역과의 상호작용의 특이성에 중요한 짧은 불변 폴리펩타이드 서열인 상보성 결정 영역 CDR을 특징으로 한다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기반으로 한 결합 모이어티도 성공적으로 사용되었다. CAR의 시그널링 도메인은 일반적으로 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역으로부터 유래하며, 이는 일반적으로 CD28, OX-40(CD134), ICOS 및 4-1BB(CD137)를 포함하는 공-자극 분자 유래의 시그널링 도메인과 결합되어 생존을 강화하고 세포의 증식을 증가시킨다. CAR는 일반적으로 효과기 면역세포에서 발현되어 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성 종양 유래의 종양 세포 표면에 발현된 항원에 대한 면역 활동의 방향을 바꾼다. CAR의 성분은 세포 내로 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 CAR의 임의의 기능적 소단위체이다. 예를 들어, 이 구성요소는 표적 항원과의 상호작용, CAR의 세포 내에서의 안정성 또는 위치화에 도움이 될 수 있다.
일반적으로 이러한 CAR는 하기로 구성된다.
- 단일클론 항-MUC1 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인;
- 막관통 도메인; 및
- 신호 전달 도메인, 바람직하게는 CD3 제타 시그널링 도메인 및 공-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인.
바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)는 각각 MUC1-A ScFv (SEQ ID NO:17), MUC1-B (SEQ ID NO:27), MUC1-C (SEQ ID NO:37) 및/또는 MUC1-D (SEQ ID NO:47)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 ScFv를 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 가진다.
상기 ScFv는 특정 CDR을 포함하는 가변 가벼운 사슬(VL) 및 무거운 사슬(VH)을 특징으로 하며, 따라서 본 발명의 항-MUC1 CAR의 세포외 리간드 결합-도메인은 첫번째 예로서 다음을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO:11 (CDR-VL1-A), SEQ ID NO:12 (CDR-VL2-A) 및 SEQ ID NO:13 (CDR-VL3-A)과 적어도 90%의 동일성을 갖는 가변 가벼운 사슬(VL), 및
- SEQ ID NO:14 (CDR-VH1-A), SEQ ID NO:15 (CDR-VH2-A) 및 SEQ ID NO:16 (CDR-VH3-A)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운 사슬(VH).
여기서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 SEQ ID NO:9 (MUC1-A fullVH) 및 SEQ ID NO:10 (MUC1-A fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
두번째 예로서, 상기 ScFv는 다음을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO:21 (CDR-VL1-B), SEQ ID NO:22 (CDR-VL2-B) 및 SEQ ID NO:23 (CDR-VL3-B)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운 사슬(VL) 및
- SEQ ID NO:24 (CDR-VH1-B), SEQ ID NO:25 (CDR-VH2-B) 및 SEQ ID NO:26 (CDR-VH3-B)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운 사슬(VH).
여기에서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 SEQ ID NO:19 (MUC1-B fullVH) 및 SEQ ID NO:20 (MUC1-B fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
세번째 예로서, 상기 ScFv는 다음을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO:31 (CDR-VL1-C), SEQ ID NO:32 (CDR-VL2-C) 및 SEQ ID NO:33 (CDR-VL3-C)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운 사슬(VL), 및
- SEQ ID NO:34 (CDR-VH1-C), SEQ ID NO:35 (CDR-VH2-C) 및 SEQ ID NO:36 (CDR-VH3-C)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운 사슬(VH).
여기에서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 SEQ ID NO:29 (MUC1-C fullVH) 및 SEQ ID NO:30 (MUC1-C fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
네번째 예로서, 상기 ScFv는 다음을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO:41 (CDR-VL1-D), SEQ ID NO:42 (CDR-VL2-D) 및 SEQ ID NO:43 (CDR-VL3-D)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운 사슬(VL), 및
- SEQ ID NO:44 (CDR-VH1-D), SEQ ID NO:45 (CDR-VH2-D) 및 SEQ ID NO:46 (CDR-VH3-D)과 각각 적어도 90%의 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운 사슬(VH).
여기에서, 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 SEQ ID NO:39 (MUC1-D fullVH) 및 SEQ ID NO:40 (MUC1-D fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함한다.
일반적으로, 결합 도메인의 프레임워크 영역의 잔기는 항원 결합을 개선하거나 이들 영역을 인간화하기 위해 대체될 수 있다. 이들 프레임워크 치환은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하고 특정 위치에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다[참조예: Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; and Riechmann et al., (1988) Nature, 332:323, 이는 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다].
일부 구현예에서, 상기 항-MUC1 CAR 구조체 내의 VH 및 VL 사슬은 그의 인간화 버전으로 대체될 수 있다. 예를 들어, MUC1-A CAR의 바람직한 구현예로서, VH는 각각 SEQ ID NO:228 내지 234 (SEQ ID NO:9로 표시되는 MUC1 full VH의 인간화 변이체)로부터 선택될 수 있고, VL은 SEQ ID NO:235 내지 239 (SEQ ID NO:10으로 표시되는 MUC1 full VH의 인간화 변이체)로부터 선택될 수 있는데, 이는 본원의 표 3에 제공된다.
본 발명의 다양한 실시예는 당업자의 일반적인 실시 및 지식을 고려하여 청구범위에 제공된 특징을 통해 제공된다. 본 발명에 따른 CAR의 상세한 서열은 표 2, 3, 4, 5, 6 및 7에 자세히 설명되어 있으며, 여기에서 각 행 또는 열은 본 발명의 독립적인 구현예로 간주되어야 한다.
표 2: 본 발명에 따른 항-MUC1 CAR를 구성하는, scFv 이외 여러가지 도메인들의 아미노산 서열
표 3: CLS MUC1-A CAR에 포함되는 폴리펩타이드 서열
표 3 (계속): MUC1-A CAR에 선택적으로 포함되는 인간화 폴리펩타이드 서열
표 4: CLS MUC1-B CAR에 포함되는 폴리펩타이드 서열
표 5: CLS MUC1-C CAR에 포함되는 폴리펩타이드 서열
표 6: CLS MUC1-D CAR에 포함되는 폴리펩타이드 서열
표 7: MUC1-A, MUC1-B, MUC1-C 및 MUC1-D CAR들의 폴리펩타이드 구조
본 발명에 따른 CAR의 신호 전달(signal transducing) 도메인 또는 세포내 시그널링(signaling) 도메인은 세포외 리간드 결합-도메인이 표적에 결합한 후 면역세포 및 면역 반응의 활성화를 야기하는 세포내 시그널링을 담당한다. 다시 말해서, 신호 전달 도메인은 CAR가 발현되는 면역세포의 정상적인 효과기(effector) 기능들 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인들의 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포용해(cytolytic) 활성일 수 있다. 따라서, "신호 전달 도메인(signal transducing domain)"이라는 용어는 효과기 신호 기능 신호를 전달하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다.
CAR에 사용하기 위한 신호 전달 도메인의 바람직한 예는 T-세포 수용체의 세포질 서열과 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 공-수용체일 수 있을 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 합성 서열일 수 있다. 신호 전달 도메인은 항원 의존적 1차 활성화를 시작하는 것과 항원 독립적 방식으로 작용하여 2차 또는 공-자극 신호를 제공하는 두 가지 별개의 세포질 시그널링 서열 종류를 포함한다. 일차 세포질 시그널링 서열은 ITAM의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프로 알려진 시그널링 모티프를 포함할 수 있다. ITAM은 syk/zap70 클래스 티로신 키나제에 대한 결합 부위 역할을 하는 다양한 수용체의 세포질 내 꼬리에서 발견되는 잘 정의된 시그널링 모티프이다. 본 발명에 사용되는 ITAM의 예에는 TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들이 비제한적인 예로서 포함될 수 있다. 바람직한 구현예에서, CAR의 신호 전달 도메인은, (SEQ ID NO:7)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 적어도 95%, 97% 이상 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 보이는 아미노산 서열을 갖는 CD3zeta 시그널링 도메인을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 공-자극 신호 분자를 포함한다. 공-자극 분자는 효율적인 면역 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. "공-자극 리간드"는 T-세포 상의 동족 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포상의 분자를 의미하는데, 이로써, 예를 들어 펩타이드와 로딩되는 MHC 분자와의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호에 더하여, 이에 제한되지는 않지만 증식 활성화, 분화 등을 포함하는 T-세포 반응을 매개하는 신호를 제공한다. 공-자극 리간드는 이에 제한되지는 않지만, CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공-자극 리간드(ICOS-L), 세포간 부착 분자(ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체와 결합하는 작용제(agonist) 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 공-자극 리간드는 또한 특히 T-세포상에 존재하는 공-자극 분자, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 4-1BB(GenBank: AAA53133.) 및 CD28(NP_006130.1)의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공-자극 신호 분자의 일부를 포함한다. 특히, 본 발명의 CAR의 신호 전달 도메인은 4-1BB 또는 CD28 중 어느 하나와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 항-MUC1 키메라 항원 수용체는 바람직하게는 SEQ ID NO:7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD3 제타 시그널링 도메인을 포함하고, 일반적으로 SEQ ID NO:6 (4-1BB)과 적어도 80% 동일성을 갖는 공-자극 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR는 일반적으로 세포의 표면 막 상에서 발현된다. 따라서, 이러한 CAR는 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 적절한 막관통 도메인의 구별되는 특징은 세포, 바람직하게는 본 발명에서는 면역세포, 특히 림프구 세포 또는 자연 살해(NK) 세포의 표면에서 발현되고, 미리 정의된 표적 세포에 대한 면역세포의 세포 반응을 지시하기 위해 함께 상호작용하는 능력을 포함한다. 상기 막관통 도메인은 천연 또는 합성 소스로부터 유래될 수 있다. 상기 막관통 도메인은 임의의 막 결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, 막관통 폴리펩타이드는 α, β, γ 또는 ζ와 같은 T-세포 수용체의 서브유닛, CD3 복합체, IL2 수용체 p55(α 사슬), p75(β 사슬) 또는 γ 사슬을 구성하는 폴리펩타이드, Fc 수용체의 서브유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 Ⅲ 또는 CD 단백질일 수 있다. 대안적으로 상기 막관통 도메인은 합성일 수 있고 류신 및 발린과 같은 주로 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD8 알파 사슬로부터 유래된다(예를 들어, NP_001139345.1). 상기 막관통 도메인은 상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 막관통 도메인 사이에 힌지(hinge) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "힌지 영역(hinge region)"은 일반적으로 막관통 도메인을 세포외 리간드-결합 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 힌지 영역은 세포외 리간드 결합-도메인에 더 많은 유연성과 접근성을 제공하는 데 사용된다. 힌지 영역은 최대 300개의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산, 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 자연 발생 분자의 전부 또는 일부, 예를 들어 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 힌지 영역은 자연 발생 힌지 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 또는 전체가 합성 힌지 서열일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 힌지 도메인은 각각 인간 CD8 알파 사슬, FcγRⅢα 수용체 또는 IgG1의 일부, 또는 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 힌지 폴리펩타이드를 포함한다.
따라서 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체(CAR)는 세포외 리간드-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지를 포함하며, 상기 힌지는 일반적으로 CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRⅢα 힌지 또는 이들 폴리펩타이드, 특히, SEQ ID NO:4 (CD8α)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유하는 폴리펩타이드로부터 일반적으로 선택된다.
본 발명에 따른 CAR는 일반적으로 바람직하게는 CD8α 및 4-1BB, 보다 바람직하게는 CD8α-TM 또는 SEQ ID NO:5 (CD8α TM)와 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 나타내는 폴리펩타이드로부터 선택된 막관통 도메인(TM)을 더 포함한다.
추가 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항-MUC1 CAR는 조작된 면역세포를 분류, 정제 및/또는 고갈시키는 데 유용한 안전 스위치를 포함한다. 본 발명의 방법은 엑스-비보(ex-vivo)에서 수행되도록 설계되었지만, 규제 기관에 의해 인간 치료용으로 승인된 항체를 사용하여 면역세포가 환자로 증식되는 것을 제어하고 치료 효과를 잠재적으로 중단시키기 위해 고갈을 인-비보(in-vivo)에서 수행할 수 있다. 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인에 통합될 수 있는 mAb-특이적 에피토프(및 이들의 상응하는 mAb)의 예는 표 8에 나열되어 있다.
표 8: 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인에 삽입될 수 있는, mAb-특이적 에피토프(및 이에 상응하는 mAb)의 예들
따라서, 본 발명에 따른 특정 CAR는 표 8에 나열된 하나 이상의 외인성 mAb 에피토프를 포함하는 안전 스위치, 바람직하게는 리툭시맙(rituximab)에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프 CPYSNPSLC (SEQ ID NO:49)를 포함하는 안전 스위치를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 이러한 CAR는 SEQ ID NO:3과 적어도 90% 동일성을 갖는 "R2"로 지칭되는 안전 스위치를 포함한다.
본 발명의 항-MUC1 CAR의 바람직한 폴리펩타이드 구조는 표 7에 예시되어 있다.
본 발명에 따른 CAR는 또한 조작된 세포의 표면에서의 발현을 돕기 위한 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 일반적으로 단일 사슬 폴리펩타이드를 형성하지만, 그러나, 예를 들어 WO2014039523에 개시된 바와 같이 다중 사슬 형식으로 생산될 수도 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항-MUC1 CAR는 CD8α 유래의 SEQ ID NO:5와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유하는 막관통 도메인을 제시할 수 있다.
본 발명에 따른 항-MUC1 CAR는 세포외 리간드-결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 바람직하게는 CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRⅢα 힌지로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 힌지는 SEQ ID NO:4 (CD8α)와 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 공유한다.
바람직한 구현예에서, 상기 항-MUC1CAR는 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD8α 힌지와 함께, SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD8α 막관통 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 구조를 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 항-MUC1CAR는 치료에 사용하기에 적합한 항체에 의해 특이적으로 인식되는 폴리펩타이드 서열인 안전 스위치, 예컨대 표 8에서 선택된 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 에피토프 CPYSNPSLC (SEQ ID NO:49)를 포함하는 안전 스위치는 리툭시맙(Rituxan, Hoffmann-La Roche)에 의해 특이적으로 결합될 수 있는데, 이는 B 세포를 고갈시키기 위해 암 치료에 일반적으로 사용되는 승인된 항-CD20 키메라 단일클론 항체이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 항-MUC1CAR는 4-1BB 또는 CD28 유래의 공-자극 도메인, 바람직하게는 4-1BB 또는 SEQ ID NO:6과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 기능적 유사 도메인을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 항-MUC1CAR는 SEQ ID NO:7과 적어도 80%의 동일성을 갖는 CD3 제타 시그널링 도메인을 포함한다. 이는 또한 세포 표면에 더 잘 전달되도록 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
실시예 및 표 2 내지 8에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 바람직한 CAR는 항-MUC1 CAR이며, 이는 SEQ ID NO:18 (CLS MUC1-A), SEQ ID NO:28 (CLS MUC1-B), SEQ ID NO:38 (CLS MUC1-C) 및 SEQ ID NO:48 (CLS MUC1-D)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99%의 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 하나의 바람직한 항 MUC1-CAR는 SEQ ID NO:18로 표시되는 CLS MUC1-A이다.
보다 일반적으로, 본 발명의 CAR는 CAR 폴리펩타이드(들)의 연속적인 단편을 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 면역세포 내로 형질감염(transfection) 및 발현을 위한 벡터 내로 조립함으로써 생성되는데, 이는 당업계에서 개시되는 바와 같이, 예를 들어 [Boyiadzis, M.M., et al. (2018) Chimeric antigen receptor (CAR) T therapies for the treatment of hematologic malignancies: clinical perspective and significance. j. immunotherapy cancer 6, 137]에서 볼 수 있는 바와 같다.
본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 벡터뿐만 아니라 본 명세서에 언급된 면역세포 제조 공정의 임의의 단계에 개입하는 임의의 중간 생성물에 관한 것이다.
- "벡터(vector)"는 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 "벡터"는 이에 제한되지는 않지만, 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터 또는 염색체, 비염색체, 반합성 또는 합성 핵산으로 구성될 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 바람직한 벡터는 자율 복제(에피솜 벡터)가 가능하고/하거나 연결된 핵산의 발현이 가능한 벡터(발현 벡터)이다. 다수의 적합한 벡터가 당업자에게 알려져 있고 상업적으로 이용 가능하다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(예: 아데노 관련 바이러스(AAV), 코로나바이러스, 오르토믹소바이러스와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(예: 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스(예: 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스, 및 아데노바이러스를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스, 헤르페스바이러스(예: 단순 헤르페스 바이러스 유형 1 및 2, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포바이러스), 및 폭스바이러스(예: 백시니아, 파울폭스(fowlpox) 및 카나리폭스(canaryfox))를 포함한다. 다른 바이러스로는 예를 들어, 노워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스, 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예로는 하기를 포함한다: 조류 백혈병 육종, 포유류 C형, B형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
특히, 본 발명은 그 중에서도 CAR, IL-12, dnTGFβR, HLA-E 또는 유전자 표적화 통합을 수행하기 위한 도너 폴리뉴클레오타이드 주형으로 사용하기 위한 임의의 다른 유용한 트랜스진(transgene)을 인코딩하는 본원에 개시된 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 비통합 렌티바이러스 벡터(IDLV) 또는 AAV 벡터 형태로 벡터를 제공한다.
이러한 렌티바이러스 벡터는 프로모터(예컨대 비장 초점 형성 바이러스 프로모터(SFFV))에 작동 가능하게 연결된 본 발명에 따른 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 의미한다. 유전자(예컨대 CAR 인코딩 폴리뉴클레오타이드 서열)는 그의 전사가 상기 프로모터의 제어 하에 있을 때 프로모터에 "작동 가능하게 연결"되고, 이러한 전사로 인해 상기 유전자에 의해 인코딩된 생성물이 얻어진다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 전형적으로 5' 및 3' 긴 말단 반복(LTR) 서열과 같은 조절 요소를 함유하지만, 주로 렌티바이러스로부터 유래되는 다른 구조적 및 기능적 유전적 요소를 함유할 수도 있다. 이러한 구조적 및 기능적 유전 요소는 해당 분야에 잘 알려져 있다. 렌티바이러스 벡터는 예를 들어 gag, pol 및 env 유전자를 함유할 수 있다. 그러나 바람직하게는 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 gag, pol 및 env 유전자를 함유하지 않는다. 추가 조절 요소로서 렌티바이러스 벡터는 패키징 신호(예: 패키징 신호 ψ), 프라이머 결합 부위, 트랜스-활성화-반응 영역(TAR) 및 rev-반응형 요소(RRE) 중 하나 이상(예: 2개 이상)을 포함할 수 있다.
일반적으로 렌티바이러스 게놈 측면에 있는 5' 및 3' 긴 말단 반복(LTR) 서열은 프로모터/인핸서 활성을 가지며 전체 길이 렌티바이러스 벡터 전사체의 올바른 발현에 필수적이다. 상기 LTR은 일반적으로 이중 가닥 DNA 분자의 5'- 및 3' 말단 모두에 존재하는 반복 서열 U3RU5를 포함하며, 이는 단일 가닥 RNA의 5' R-U5 세그먼트와 3' U3-R 세그먼트의 조합인데, 반복 R이 RNA의 양쪽 말단에서 발생하는 반면, U5(고유 서열 5)는 RNA의 5' 말단에서만 발생하고 U3(고유 서열 3)은 RNA의 3' 말단에서만 발생한다. 렌티바이러스 벡터는 U3 서열을 제거함으로써 안전성이 향상될 수 있으며, 그 결과 LTR 내에 원래 존재하는 바이러스 프로모터 및 인핸서 서열이 전혀 없는 "자가-불활성화(self-inactivating)" 벡터가 생성된다. 결과적으로, 상기 벡터는 단 한번만 숙주 게놈에 감염시킨 후 통합될 수 있고, 더 이상 통과될 수 없으므로 유전자 전달 벡터로서 벡터의 사용에 대한 안전성을 증가시킨다.
일부 구현예에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 자가-불활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터이다. 특정 구현예에 따르면, 상기 렌티바이러스 벡터는 3' LTR 인핸서-프로모터 서열(즉, U3 서열)이 변형(예를 들어, 결실)된 3' LTR을 함유한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 렌티바이러스 벡터는 5'에서 3' 순서로 다음 요소 중 하나 또는 여러 개를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
- 5' 긴 터미널 반복(5' LTR);
- 프로모터(EF1-알파 프로모터 등);
- 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 및/또는
- 3' 긴 말단 반복(3' LTR), 바람직하게는 3' 자가-불활성화 LTR.
특정 구현예에 따르면, 상기 렌티바이러스 벡터는 5'에서 3' 순서로 다음 요소 중 적어도 하나를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다:
- 5' 긴 터미널 반복(5' LTR);
- 프로모터(EF1-알파 프로모터 등);
- R2와 같은 안전 스위치를 선택적으로 포함하는 본 발명에 따른 CAR,
- 2A 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
- dnTGFβR과 같은, CAR와 공-발현될 임의의 추가 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
; 및/또는
- 3' 긴 말단 반복(3' LTR), 바람직하게는 3' 자가-불활성화 LTR.
대안적으로, 상기 렌티바이러스 벡터는 5'에서 3' 순서로 다음 요소 중 적어도 하나를 포함할 수 있다:
- 5' 긴 터미널 반복(5' LTR);
- 프로모터(EF1-알파 프로모터 등);
- dnTGFβR과 같은, CAR와 공-발현될 임의의 추가 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
- 2A 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
- R2와 같은 안전 스위치를 선택적으로 포함하는 본 발명에 따른 CAR,
; 및/또는
- 3' 긴 말단 반복(3' LTR), 바람직하게는 3' 자가-불활성화 LTR.
일반적으로, 생성된 벡터는 항목 (b)의 프로모터에 작동 가능하게 연결된 단일 전사 단위를 형성하고 모두 상기 프로모터의 제어 하에 전사된다.
AAV 벡터, 특히 AAV6 계열의 벡터[Wang, J., et al. (2015) Homology-driven genome editing in hematopoietic stem and progenitor cells using ZFN mRNA and AAV6 donors. Nat Biotechnol 33, 1256-1263]는 부위 특이적 상동성 재조합을 사용하여 본 발명에 따른 항-MUC1CAR를 게놈에 도입하는 데 특히 유용하다. 일반적으로, 혈액암 치료를 위한 다른 CAR와 관련하여 EP3276000 및 WO2018073391에 이미 교시된 바와 같이 TALEN과 같은 레어-커팅 엔도뉴클레아제를 발현함으로써 면역세포에서 부위 특이적 상동성 재조합이 유도된다. CAR 부위-특이적 통합은 보다 안정적인 통합, 선택된 유전자자리에서 내인성 프로모터의 전사 제어하에 트랜스진을 놓는 통합, 내인성 유전자자리를 불활성화할 수 있는 통합과 같은 여러 이점을 가질 수 있다. 이들 나중 측면은 치료 면역세포의 게놈 조작에 관한 다음 섹션에 자세히 설명된다.
본 발명의 한 목적으로, 이전에 특정된 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 임의로 시스-조절 요소(예를 들어 2A 펩타이드 절단 부위) 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 인코딩하는 또 다른 서열을 포함하는 AAV 벡터가 제공되는데, 조작된 면역세포의 치료 효능을 개선하는 생성물을 인코딩하는 제3 서열의 공-발현을 허용한다. 종양 환경에서 TGFβ에 의해 유도되는 세포의 고갈을 줄이는 SMAD2-3 인산화를 감소시키는 것으로 밝혀진 dnTGFβRⅡ의 과발현에 대한 예가 본원에 제공된다.
"치료 특성(therapeutic properties)"이라는 용어는 치료적 처치에서의 사용 관점에서 이러한 세포들이 개선될 수 있는 다양한 방식을 포함한다. 이는 세포가 치료적 이점(즉, 치료 효능)을 부여하거나 세포의 사용 또는 생산을 촉진하도록 유전적으로 조작되었음을 의미한다. 예를 들어, 상기 유전적 조작은 더 나은 생존, 더 빠른 성장, 더 짧은 세포 주기, 향상된 면역 활동, 더 기능적이고, 더 분화되며, 표적 세포에 대해 더 특이적이고, 약물에 더 민감하거나 저항성을 가지며, 포도당 결핍, 산소 또는 아미노산 고갈에 덜 민감한(즉, 종양 미세환경에 대한 탄력성이 있는) 효과기 세포를 부여할 수 있다. 전구 세포(progenitor cell)는 더 생산적일 수 있고 수용자 환자가 더 잘 견딜 수 있으며 원하는 효과기 세포에서 분화할 세포를 생산할 가능성이 더 높다. "치료 특성"의 이들 예는 제한 없이 예시로서 제공된다.
세포 치료를 위한 항-MUC1 CAR 면역세포의 게놈 조작
"면역세포(immune cell)"는 선천성 및/또는 적응성 면역 반응의 개시 및/또는 실행에 기능적으로 관여하는 조혈 기원의 세포, 예를 들어 일반적으로 CD3 또는 CD4 양성 세포를 의미한다. 본 발명에 따른 면역세포는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절 T-림프구 또는 보조 T-림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 T-세포일 수 있다.
"일차 세포(primary cell)" 또는 "일차 세포들"은 살아있는 조직(예: 생검 물질)에서 직접 채취하여 제한된 시간 동안 인 비트로에서 성장하도록 확립된 의도된 세포이며, 이는 제한된 수의 개체수 두 배(doubling) 증가를 겪을 수 있음을 의미한다. 일차 세포는 지속적인 종양 형성 또는 인공적으로 불멸화된 세포주에 반대된다. 이러한 세포주의 비제한적인 예는 CHO-K1 세포; HEK293 세포; Caco2 세포; U2-OS 세포; NIH 3T3 세포; NSO 세포; SP2 세포; CHO-S 세포; DG44 세포; K-562 세포, U-937 세포; MRC5 세포; IMR90 세포; JurkaT-세포; HepG2 세포; HeLa 세포; HT-1080 세포; HCT-116 세포; Hu-h7 세포; Huvec 세포; Molt 4 세포를 들 수 있다.
일차 면역세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직을 포함하여 다양한 비제한적인 출처, 및 종양 침윤 림프구와 같은 종양에서 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역세포는 건강한 도너, 암으로 진단된 환자 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 세포는 CD4, CD8 및 CD56 양성 세포를 포함하는 것과 같이 상이한 표현형 특징을 나타내는 혼합 면역세포 집단의 일부이다. 일차 면역세포는 예를 들어 Schwartz J.et al(Guidelines on the use of therapeutic apheresis in clinical practice-evidence-based approach from the Writing Committee of the American Society for Apheresis: the sixth special issue (2013) J Clin Apher. 28(3):145-284)에 의해 검토된 백혈구 성분채집술(leukapheresis) 기술과 같이 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 도너 또는 환자로부터 제공된다.
줄기세포로부터 유래된 면역세포도 본 발명에 따른 일차 면역세포로 간주되며, 특히 유도만능줄기세포(iPS)로부터 유래된 면역세포[Yamanaka, K. et al. (2008). "Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors". Science. 322(5903):949-53]도 일차 면역세포로 간주된다. 리프로그래밍 인자의 렌티바이러스 발현은 인간 말초 혈액 세포로부터 다능성 세포를 유도하는 데 사용되었다[Staerk, J. et al. (2010). "Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells". Cell stem cell. 7(1):20-4] [Loh, YH. et al. (2010). "Reprogramming of T cells from human peripheral blood". Cell stem cell. 7(1):15-9].
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역세포는 인간 배아의 파괴를 수반하지 않는 당업계에 공지된 기술에 의해 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된다[Chung et al. (2008) Human Embryonic Stem Cell lines generated without embryo destruction, Cell Stem Cell 2(2):113-117].
"유전적 조작(genetic engineering)"이란 세포에서 유전 물질을 도입, 변형 및/또는 제거하는 것을 목표로 하는 모든 방법을 의미한다. "유전자 편집(gene editing)"이란 시간 돌연변이를 포함하여 게놈 내 특정 위치(좌)에 유전 물질을 추가, 제거 또는 변경하도록 허용하는 유전적 조작을 의미한다. 유전자 편집에는 일반적으로 서열 특이적 시약이 포함된다.
"서열 특이적 시약(sequence-specific reagent)"은 "표적 서열(target sequence)"로 지칭되는 게놈 유전자자리에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 인식하는 능력을 갖는 임의의 활성 분자를 의미하며, 이는 상기 게놈 유전자자리의 발현을 변형시키는 관점에서, 일반적으로 9bp 이상, 보다 바람직하게는 10bp 이상 및 보다 더 바람직하게는 12bp 이상이다. 상기 발현은 인코딩 또는 조절 폴리뉴클레오타이드 서열로의 돌연변이, 결실 또는 삽입으로 변형될 수 있으며, 메틸화 또는 히스톤 변형과 같은 후생적 변화, 또는 전사 인자 또는 중합효소와의 상호작용에 의한 전사 수준에서의 간섭에 의해 변형될 수 있다.
서열 특이적 시약의 예는 엔도뉴클레아제, RNA 가이드, RNAi, 메틸라제, 엑소뉴클레아제, 히스톤 디아세틸라제, 엔도뉴클레아제, 엑소뉴클레아제, 디아미나제와 같은 최종 처리 효소, 및 보다 특히, 예를 들어, Hess, G.T. et al. [Methods and applications of CRISPR-mediated base editing in eukaryotic genomes (2017) Mol Cell. 68(1): 26-43] 또는 Mok et al.[A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing (2020) Nature 583:631-637]에 개시된 바와 같이, 뉴클레아제에 의한 절단에 의존할 필요 없이, 염기 편집(즉, 뉴클레오타이드 치환)을 수행하는 CRISPR/cas9 또는 TALE 시스템과 결합된 것과 같은 시티딘 디아미나제를 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 상기 서열 특이적 시약은 가이드된 엔도뉴클레아제와 결합된 RNA 가이드와 같은 서열 특이적 뉴클레아제 시약이다.
본 발명은 유전자 편집 기술, 특히 유전자 표적화 통합을 통해 면역세포의 치료 잠재력을 향상시키는 것을 목표로 한다.
"유전자 표적화 통합(gene targeting integration)"은 게놈 코딩 서열을 살아있는 세포에 삽입, 대체 또는 교정할 수 있는 임의의 공지된 부위-특이적 방법을 의미한다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 상기 유전자 표적화 통합은 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드, 바람직하게는 여러 뉴클레오타이드(즉, 폴리뉴클레오타이드)의 서열, 및 보다 바람직하게는 코딩 서열의 삽입 또는 대체를 가져오는 표적 유전자의 위치에서의 상동 유전자 재조합을 포함한다.
- "DNA 표적(target)", "DNA 표적 서열", "표적 DNA 서열", "핵산 표적 서열", "표적 서열", 또는 "프로세싱 부위(processing site)"란 본 발명에 따른 서열-특이적 뉴클레아제 시약에 의하여 표적화되고 프로세싱될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이들 용어들은 특정 DNA 위치, 바람직하게는 세포에서 게놈 위치, 그러나 또한 제한되지 않는 예로서 미토콘드리아와 같은 세포소기관(organelles)에서, 또는 트랜스포존들(transposons), 바이러스, 에피솜들(episomes), 플라스미드들과 같은 유전적 물질의 본체(main body)에 독립적으로 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분을 지칭한다. RNA 가이드된 표적 서열들의 제한되지 않는 예들로서, 그것들은 원하는 유전자자리로 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제를 지시하는 가이드 RNA를 혼성화할 수 있는 게놈 서열들이다.
"레어-커팅 엔도뉴클레아제들(Rare-cutting endonucleases)"은 그것들의 인식 서열들이 일반적으로 10 내지 50 연이은 염기쌍들, 바람직하게는 12 내지 30 bp, 및 더 바람직하게는 14 내지 20 bp 범위인 한, 선택되는 서열특이적 엔도뉴클레아제 시약들이다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 상기 엔도뉴클레아제 시약은 "조작된(engineered)" 또는 "프로그램 가능한(programmable)" 레어-커팅 엔도뉴클레아제, 예를 들어 예컨대 Arnould S., et al. [WO2004067736]에 의해 기재된 대로 호밍(homing) 엔도뉴클레아제, 예컨대 Urnov F., et al. [Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases (2005) Nature 435:646-651]에 의해 기재된 대로 징크 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease) (ZFN), 예컨대 Mussolino et al. [A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity (2011) Nucl. Acids Res. 39(21):9283-9293]에 의해 기재된 대로 TALE-뉴클레아제(Nuclease), 또는 예컨대 Boissel et al. [MegaTALs: a rare-cleaving nuclease architecture for therapeutic genome engineering (2013) Nucleic Acids Research 42(4):2591-2601]에 의해 기재된 대로 MegaTAL 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산이다.
또 다른 구현예에 따라, 엔도뉴클레아제 시약은, 그 중에서도 참조로 본원에 포함되는, Doudna, J., 및 Chapentier, E., [The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9 (2014) Science 346 (6213):1077]에 의한 가르침에 따라, Cas9 또는 Cpf1과 같은, RNA 가이드된 엔도뉴클레아제와 함께 사용되는 RNA-가이드이다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 엔도뉴클레아제 시약은 세포들 내로 일시적으로 발현되고, 이는 상기 시약이 RNA, 더 특히 mRNA, 단백질들 또는 단백질들 및 핵산들을 혼합하는 복합체들 (예컨대 리보핵산단백질들(Ribonucleoproteins))의 경우와 같이, 장기간에 걸쳐 계속되거나(persist) 또는 게놈 내로 통합되는 것으로 생각되지 않는다는 것을 의미한다.
mRNA 형태의 엔도뉴클레아제는 바람직하게는 예컨대 Kore A.L., et al. [Locked nucleic acid (LNA)-modified dinucleotide mRNA cap analogue: synthesis, enzymatic incorporation, and utilization (2009) J Am Chem Soc. 131(18):6364-5]에 의해 기재된 대로, 당업계에 잘 알려진 기술들에 따라 그것의 안정성을 향상시키기 위하여 캡(cap)으로 합성된다.
일반적으로, PBMC들과 같은, 일차 면역 세포들을 형질감염(transfect)하는데 사용되는 전기천공 단계들은 보통, 특히 23 페이지 25 줄부터 29 페이지 11 줄까지, 참조로 포함되는, WO2004083379에 기재된 대로와 같이 처리 부피 전체에 걸쳐 실질적으로 균일하게, 100 volts/cm 초과 그리고 5,000 volts/cm 미만인 상기 평행(parallel) 플레이트 전극들 사이에 펄스 전기장을 생산하는 평행 플레이트 전극들을 포함하는 닫힌 챔버들에서 수행된다. 이러한 하나의 전기천공 챔버는 바람직하게는 챔버 부피(cm3)로 나눈 제곱된(squared) 전극 갭 (cm2)의 몫(quotient)에 의해 정의되는 기하학적 계수(geometric factor) (cm-1)를 갖고, 이때 기하학적 계수는 0.1 cm-1 이하이고, 이때 서열-특이적 시약 및 세포들의 현탁액(suspension)은 배지에 있고 이는 조정되어 배지가 0.01 내지 1.0 milliSiemens에 걸치는 범위인 전도도(conductivity)를 갖는다. 일반적으로, 세포들의 현탁액은 하나 이상의 펄스된 전기장들을 겪는다. 그 방법으로, 현탁액의 처리 부피는 측정가능하고, 그리고 챔버에서 세포들의 처리 시간은 실질적으로 균일하다.
그것들의 더 높은 특이성 때문에, TALE-뉴클레아제는 특히, 헤테로다이머(heterodimeric) 형태들 하 - 즉 예컨대 Mussolino et al. [TALEN facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity (2014) Nucl. Acids Res. 42(10): 6762-6773]에 의하여 보고된 대로 "우측(right)" 모노머("5'" 또는 "포워드(forward)"로도 지칭됨) 및 '좌측(left)" 모노머 ("3'" 또는 "리버스(reverse)"로도 지칭됨)로 쌍들로 작용하는, 치료적 적용들을 위해 특히 적합한 서열 특이적 뉴클레아제 시약들로 입증되었다.
전술한 바와 같이, 서열 특이적 시약은 바람직하게는 레어 커팅 엔도뉴클레아제 그것의 서브유닛을 인코딩하는 DNA 또는 RNA 형태와 같은 핵산들의 형태이지만, 그것들은 또한 소위 "리보핵산단백질들"과 같은 폴리펩타이드(들) 및 폴리뉴클레오타이드(들)을 포함하는 접합체들(conjugates)의 부분일 수 있다. 이러한 접합체들은, 그것들의 각각의 뉴클레아제들과 복합체를 형성할 수 있는 RNA 또는 DNA 가이드들을 포함하는, Zetsche, B. et al. [Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015) Cell 163(3): 759-771]에 의하여 그리고 Gao F. et al. [DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute (2016) Nature Biotech]에 의하여 각각 기재된 대로 Cas9 또는 Cpf1 (RNA-가이드된 엔도뉴클레아제들)과 같은 시약들로 형성될 수 있다.
"외인성 서열(Exogenous sequence)"은 선택되는 유전자자리에 처음에 존재하지 않았던 임의의 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열을 가리킨다. 이 서열은 세포에 도입되는 외래 서열이거나, 게놈 서열의 카피 또는 상동일 수 있다. 반대로 “내인성 서열(endogenous sequence)”은 유전자자리에 처음에 존재하는 세포 게놈 서열을 의미한다. 외인성 서열은 발현이 바람직하게는 유전자자리에서 이 외인성 서열을 통합하지 않은 자매 세포들에 비해 치료적 이점을 부여하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 다른 폴리펩타이드를 발현하기 위하여, 본 발명의 방법에 따라 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 삽입에 의하여 유전자 편집된 내인성 서열은 외인성 코딩 서열로 넓게 지칭된다.
상기 시약들 및 기술들을 사용함으로써, 본 발명은 하기 단계들 중 하나 이상으로 진행하여 치료적 세포들을 생산하는 방법들을 개발하는 데 동의한다:
- 도너 또는 환자로부터, 면역 세포들, 바람직하게는 일차 세포들을 제공하는 단계;
- 일반적으로 바이러스 벡터를 통해 세포의 게놈 내로 항-MUC1 CAR 코딩 서열을 도입함으로써, 전술한 대로 항-MUC1 CAR를 이러한 세포들 내로 발현하는 단계;
- 내인성 유전자 유전자자리에서 변형(돌연변이들 또는 코딩 서열 삽입)을 유도하기 위하여 레어-커팅 엔도뉴클레아제 또는 염기 편집기와 같은, 서열 특이적-시약을 이러한 면역 세포들 내로 도입하는 단계; 및/또는
- 외인성 코딩 서열을 상기 세포들 내로 그것들의 치료적 효능, 특히 그것의 면역 특성들을 개선하기 위하여 도입하는 단계.
본 발명의 몇몇 측면들에 따라, 면역 세포들은 환자 또는 적합한(compatible) 도너로부터 유래하며, 여기서 항-MUC1 CAR는 조작된 CAR 양성 면역 세포들의 소위 “자가(autologous)” 주입(infusion)을 수행하는 것을 고려하여 발현된다. 그들은 또한 종양 침윤 림프구들(tumor infiltrating lymphocytes)(TILL)로부터 또는 이러한 환자 또는 적합한 도너로부터 유래하는, iPS 세포들과 같은, 줄기 세포들로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 몇몇 측면들에 따라, 그 방법은 면역 세포들의 "기성품(off the shelf)" 조성물들을 제공하는 것을 목표로 하며, 상기 면역 세포들은 동종이계 치료적 처치들을 위해 조작되어 있다.
"동종이계(allogeneic)"란 세포들이 도너로부터 유래함을 의미한다. 그들은 성분채집술(apheresis)로부터 직접 채집될 수 있거나, 줄기 세포들로부터 생산/분화될 수 있다. 동종이계 환경에서 사용되었다는 사실은 조작된 세포가 다른 하플로타입을 갖는 환자 내로 주입되었다는 것을 의미한다.
이러한 면역 세포들은 일반적으로 그들의 환자 숙주에 대해 덜 동종반응성(alloreactive)이도록 및/또는 더 지속성이 되도록 유전적으로 조작된다. 더 구체적으로, 본 방법들은 T-세포들로 유도되는 줄기 세포들 또는 T-세포들로 TCR 발현을 감소 또는 불활성화시키는 단계들을 포함한다. 이는 유전자 침묵(silencing) 또는 유전자 편집 기술들(뉴클레아제, 염기 편집, RNAi...)에 의하는 것과 같은, 여러가지 서열 특이적-시약들에 의하여 수득될 수 있다.
본 출원인은 이전에 특히 TALE-뉴클레아제들(TALEN®)의 형태로 매우 안전하고 특이적인 엔도뉴클레아제 시약들을 제공함으로써 PBMC들로부터 동종이계 치료적 등급 T-세포들을 생산하기 위한 이용가능한 강력한 프로토콜들 및 유전자 편집 전략들을 만들었다. 도너들로부터의 [TCR]neg T-세포들인, 소위 “유니버설(universal) T-세포들”의 생산이 달성되었고 감소된 이식편 대 숙주병(Graft versus Host Disease)(GVhD)을 가진 환자들에게 성공적으로 주입되었다[Poirot et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for "Off-the-Shelf" Adoptive T-cell Immunotherapies. Cancer. Res. 75 (18): 3853-3864] [Qasim, W. et al. (2017) Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Science Translational 9(374)].
바람직한 구현예들에서, 본 발명은 면역 세포를 조작하는 방법을 제공하고, 이때 바람직하게는 레어-커팅 엔도뉴클레아제의 발현에 의하여, TCR알파 또는 TCR베타를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자가 상기 면역 세포에서 불활성화되는 반면 전술한 바와 같은 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드가 안정적인 발현을 위하여 상기 세포의 게놈 내로 도입된다. 상기 외인성 서열은 TCR알파 또는 TCR베타를 인코딩하는 상기 유전자자리에 통합될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 TCR알파 또는 TCR베타의 내인성 프로모터의 전사적 제어 하에, 통합될 수 있다.
추가의 구현예들에서, 조작된 면역 세포는 항-CD52 항체(예컨대: 알렘투주맙(alemtuzumab))의 표적 CD52를 불활성화시키는 것과 같이, 적어도 하나의 면역 억제 약물에 대한 내성을 부여하도록 추가로 변형될 수 있으며, 이는 예를 들어 WO2013176915에서 혈액 암들의 치료에 대하여 이전에 개시되어 왔다.
항-CD52 림프구고갈(lymphodepletion) 제제들의 사용이 지금까지 액체 종양 암들로 제한되었지만[Quasim W. et al. (2019) Allogeneic CAR T cell therapies for leukemia Am J Hematol. 94:S50-S54.], 본 발명의 하나의 주요 측면은 고형 종양들의 치료를 위한 림프구고갈 레지멘(regimen)에 내성으로 만들어진 유전적으로 조작된 림프구들의 사용이다.
또한, 본 발명은 고형 종양들에 대해, 특히 MUC-1 양성 세포들에 대해 지시된 키메라 항원 수용체들이 부여된 조작된 림프구들을, 림프구고갈 치료 단계가 선행되거나, 또는 이와 조합되는 고형 종양 암 치료들에 그들의 사용을 위하여, 제공한다.
이러한 림프구고갈 레지멘은 항-CD52 시약들, 예를 들어 알렘투주맙, 또는 퓨린 유사체들을 혈액 암들 치료에 사용되는 것들로 포함할 수 있다.
바람직한 구현예들에서, 본원에 개시된 항-MUC1 CAR를 지닌 조작된 림프구들은 예를 들어 알렘투주맙의 경우 항원 CD52와 같은, 림프구고갈 시약들에 의해 표적화되는 분자들의 발현을 억제 또는 파괴(disrupting)함으로써 이러한 림프구고갈 레지멘에 대해 내성으로 된다.
추가의 구현예들에서, 상기 조작된 면역 세포는 예를 들어 WO201575195에 개시된 바와 같이 DCK를 불활성화함으로써 특히 퓨린 유사체 약물인, 화학요법 약물 및/또는 이에 대해 내성을 부여하도록 추가로 변형될 수 있다.
앞서 지적한 바와 같이, 림프구고갈 레지멘 또는 화학요법에 내성인, 키메라 항원 수용체들을 지닌 유전적으로 조작된 림프구들로 고형 종양 암들을 치료하는 것이 본 발명의 중요한 측면이다. 이러한 레지멘은 면역 세포들의 표면에 존재하는 항원들, 예를 들어 CD52, CD3, CD4, CD8, CD45, 또는 다른 특정 마커들을 표적화하는 항체들을 포함할 수 있지만, 그러나 글루코코르티코이드들(glucocorticoids) 및 퓨린 유사체들 (예: 플루다빈(fludarabine) 및/또는 클로로파라빈(chlorofarabine))과 같은 덜 특이적인 약물들 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 측면은 조작된 림프구들을 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체들(glucocorticoid receptors)(GR)을 인코딩하는 유전자들 또는 퓨린 유사체들을 대사하는 유전자 DCK인, 이들 림프구고갈 시약들의 적어도 하나의 분자 표적을 인코딩하는 유전자들의 발현을 감소 또는 불활성화함으로써 이러한 레지멘에 내성으로 만드는 것이다.
따라서, 본 발명은 더 특히, 고형 암 치료들에서 그들의 동종이계 사용을 위해, 그들을 덜 동종반응성 및 림프구고갈 레지멘에 내성으로 만들기 위해 TCR, CD52 및/또는 DCK 및/또는 GR의 발현이 감소, 불활성화 또는 결핍되는 CAR 양성 세포들에 집중한다.
항-MUC1 CAR-T 세포의 효능을 증가시키고 고형 종양 내성 메커니즘을 극복하기 위해, 본 발명자들은 MUC1 양성 종양의 면역요법에 특이적으로 전념하는 여러 가지 유전적 변형(본원에서는 유전적 속성으로 언급됨)을 결합하였다. 도 5에 예시된 이러한 유전적 변형은 보다 구체적으로 하기의 하나로부터 선택된다:
1) PD1과 같은 면역 체크포인트 유전자의 불활성화를 유전적으로 억제하여 CAR-T 세포 고갈을 제한함.
종양 세포는 T-세포의 PD-1과 상호작용하는 리간드인 PDL1의 발현을 상향 조절하는 것으로 알려져 있다. 이러한 상호작용은 종양 제거를 방지하는 T-세포 매개 면역 반응을 효과적으로 차단한다. 성공적인 면역 체크포인트 치료법은 PD1과 PDL-1의 상호작용을 차단하는 데 달려 있으며, 이는 면역체계가 암세포를 죽일 수 있게 해준다. 따라서 본 발명은 PD-1/PDL-1 매개 면역억제를 방지하기 위해 CAR-T 세포에서 PD1을 넉아웃시키도록 처방한다. 아래 제안된 유도성 IL-12 방출과 같은 다른 속성과 함께 이러한 변형은 종양 미세환경 내에서 CAR-T 세포 고갈 문제를 완화할 수 있다.
2) IL-12(또는/및 IL-2, IL-15 및/또는 IL-18)의 발현 유도.
IL-12는 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포(및 일부 B 세포)를 비롯한 다양한 면역세포에서 생산되는 사이토카인으로, Th1 반응을 양성으로 조절하고 T-세포의 생존과 증식을 촉진한다. CAR-T 세포에 의한 IL-12 전달은 동종이계 환경에서 항-tMUC1 CAR-T 세포의 효능에 특히 중요하다.
IL-12는 전신 수준에서 전달될 때 독성이 있기 때문에 IL-12의 암호화 서열은 종양 표적 존재 하에서 CAR-T 세포 활성화시 독점적인 IL-12 방출을 허용하는 유도성 IL-12 카세트 아래에 통합될 수 있다. 이러한 점에서 2A 자가 절단 펩타이드(IL-12a-P2A-IL-12b)에 의해 분리된 IL-12a 및 IL-12b를 포함하는 외인성 서열을 사용하여 IL12를 발현하는 것이 유리하다. IL-2, IL-15 또는 IL-18을 인코딩하는 서열에도 동일하게 적용될 수 있다. 따라서, 유도성 사이토카인 방출은 세포의 필요에 따라 CAR-T 효능을 높이는 안전한 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에 따르면, IL-2, IL-12, IL-15 및/또는 IL-18을 발현하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 AAV 벡터에 의해 전달될 수 있고 실시예에 기술된 바와 같이 우선적으로 내인성 PD1 프로모터의 전사 제어 하에 PD1 유전자자리에 통합될 수 있다. PD-1 발현은 CAR T-세포 활성화에 의존하기 때문에 따라서 IL-12 발현은 CAR T-세포 기능이 강화되는 종양 영역으로 제한된다.
실시예에 제공된 바와 같이, IL-12 방출과 함께 PD-1 넉아웃은 CAR-T 세포 기능 및 종양 내 증식을 크게 향상시켜 고형 종양에 대한 항종양 활성을 초래하는데, 이러한 변형 없이는 CAR-T 세포로 치료될 수 없다.
3) 히알루로니다제 효소의 유도 발현을 통한 종양 침윤의 강화.
히알루로난(HA)은 세포외 기질의 필수적인 구조 및 신호 전달 성분인 글리코사미노글리칸이다. HA의 축적은 전립선암, 방광암, 폐암 및 유방암을 비롯한 다양한 고형 종양에서 관찰되며 양호하지 못한 임상 결과와 관련이 있다. HA 캡슐은 정수압을 증가시켜 고형 종양에서 T-세포 침윤과 작은 약물 확산을 방지하여 치료를 더욱 어렵게 만든다. 더 큰 HA 단편은 증식을 촉진하고 T-세포 침윤을 방지하며 종양 세포의 이동을 강화함으로써 많은 암 유형의 종양 진행을 향상시키는 반면, 작은 HA 단편(HA-올리고: 1-10kda)은 암세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 고형 종양의 CAR-T 침윤을 강화하기 위해 CAR-T 세포에서 히알루로난 매트릭스를 분해할 수 있는 히알루로니다제 효소를 성공적으로 발현하였다. CAR-T 세포에 의한 히알루로니다제 효소의 분비는 또한 HA-올리고의 국부적인 생산을 통해 주변(bystander) 종양 세포 사멸을 유도하는 데 유용한다. 중요하게도, 올리고-HA 매개 세포사멸은 CAR 표적 항원의 인식에 의존하지 않으므로 세포 표면에 항원이 부족하거나 낮은 수준으로 발현되는 종양 세포에 작용할 가능성이 있다.
CAR와 히알루로니다제 활성의 조합은 올리고-HA에 대한 노출로 인해 필요한 항원 수준이 부족한 주변 암세포도 사멸될 수 있는 항체 약물 접합체와 유사하다. 이 전략은 항원 부족이나 종양 이질성으로 인한 종양 탈출을 최소화하는 것으로 생각된다.
본 발명은 히알루로니다제 효소를 인코딩하는 외인성 서열이 도입된 조작된 면역세포, 바람직하게는 항-MUC1 CAR-T 세포를 제공한다. 상기 히알루로니다제 효소는 바람직하게는 HYAL1(Uniprot Q12794), HYAL2(Q12891) 및/또는 HYAL3(SPAM1-Uniprot P38567) 또는 이와 적어도 80% 동일성을 갖는 유사한 기능성 히알루로니다제이다. HYAL1, HYAL2 및 SPAM1 서열은 또한 종양 미세환경으로의 분비를 향상시키기 위해 분비 태그를 사용하여 변형될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에 따르면, 상기 면역세포는 CAR와 표적 항원의 결합시, PD1, CD69, CD25 또는 GMCSF로부터 선택된 유전자자리 또는 발현이 유도되는 임의의 유전자자리에 히알루로니다제 코딩 서열을 통합함으로써 면역세포 활성화시에 히알루로니다제 효소가 분비되도록 유리하게 조작될 수 있다.
본 발명은 또한 기능성 히알루로니다제를 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는, 면역세포 내로 HYAL1, HYAL2 또는 SPAM1의 매개 삽입을 위한 AAV, 바람직하게는 AAV6 벡터를 제공한다.
추가 구현예에 따르면, 추가적인 글리코시다제 인간 β-글루쿠로니다제(GUSB) 및 β-N-아세틸글루코사미니다제(ENGASE)가 공-발현되어 히알루로니다제 효소에 의해 절단된 HA 사슬을 더욱 단축시킬 수 있다.
히알루로니다제를 발현하는 생성된 CAR 면역세포는 고형 종양에 더 나은 침윤을 보여주고 건강한 조직을 아끼면서 올리고-HA 매개 아폽토시스를 통해 종양 세포 사멸을 직접 유도함으로써 CAR-T 매개 사멸과 시너지 효과를 발휘할 수 있다.
4) 저산소증 및 영양부족 환경의 완화.
종양 미세환경은 CAR-T 세포의 증식을 방해하는 두 가지 특징인, 저산소 상태 및 영양분 부족 상태이다. 최근 연구에서는 전염증성 Th17 세포가 염증을 유발하는 저산소 및 영양 결핍 환경에서 효과적으로 증식되는 메커니즘을 설명하였다[Wu, L. et al. (2020) Niche-Selective Inhibition of Pathogenic Th17 Cells by Targeting Metabolic Redundancy. Cell 182(3):641-654]. Th17 림프구는 글루코스 포스페이트 아이소머라제 1(GPI1)을 상향 조절하여 저산소 및 저영양 환경을 극복하여 증식 이점을 얻는다. 대사적으로 중복된 효소인 GPI1의 넉아웃은 영양이 충분하고 정상 산소 상태에 있는 항상성 Th17 세포에는 영향을 미치지 않았지만, 저산소 및 영양 결핍 환경에서는 염증성 Th17 세포의 증식 능력을 심각하게 손상시켰다. 혐기성 해당작용 동안 젖산염이 생성된다. 최근까지 젖산염은 폐기물로 간주되어 왔다. 그러나 새로운 발견은 이것이 포도당 신생합성을 통해 해당 과정의 흐름(glycolytic flux)을 증가시키는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 1(PCK1)의 도움으로 에너지로 대사될 수 있음을 입증하였으며, 이는 유당 소비 및 세포내 포도당 증가를 초래하였다[Yuan, Y. et al. (2020) PCK1 Deficiency Shortens the Replicative Lifespan of Saccharomyces cerevisiae through Upregulation of PFK1. Biomed Res. Int. Article ID 3858465]. 더욱이, PCK1 과발현은 CD8+ Tm 세포의 형성 및 유지를 촉진하고 전체적으로 영양분 획득에 있어서 T-세포 경쟁력을 증가시키는 것으로 나타났다[Ho, P. C. et al. (2015) Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162(6):1217-1228].
본 발명은 GPI1(Uniprot Q9BRB3), PCK1(Uniprot P35558) 및/또는 LDHA(Uniprot P00338) 효소를 인코딩하거나 또는 이들과 적어도 80%의 동일성을 갖는 임의의 기능성 효소를 인코딩하는 외인성 서열이 도입된 조작된 면역 세포, 바람직하게는 항-MUC1 CAR T-세포를 제공한다. 본 발명자들은 고형 종양의 저산소 및 영양 결핍 환경에서 면역세포를 강화하기 위해 GPI1 및 PCK1을 발현시켰다. GPI1 및 PCK1 효소 또는 임의의 기능적 유사 효소를 인코딩하는 유전자는 바람직하게는 TRAC 유전자자리에서의 표적 삽입을 위해 AAV 벡터, 특히 AAV6을 사용하여 전달된다. 대안적으로, 외인성 서열은 렌티바이러스 벡터를 사용하여 EF1 알파와 같은 강력한 프로모터의 제어 하에 전달될 수 있는데, 이는 그의 구성적 발현을 얻는 것이 바람직하기 때문이다. 두 유전자의 발현은 자가-절단 2A 펩타이드에 의해 분리된 두 유전자를 운반하는 바이시스트론 구조체의 전달을 통해 달성될 수 있다.
고형 종양에서 CAR-T 효과를 증대시키기 위해 위에서 언급한 변형은 동종이계 CAR-T의 표준 조작과 조합하여 시행될 수 있으며, 이는 보다 구체적으로 하기 변형들을 포함한다:
- 이식편(graft) 대 숙주병(host disease) 예방을 위한 유전자 편집을 사용한 TRAC 넉아웃;
- 숙주 대 이식편 활성을 방지하기 위해 유전자 편집 또는 침묵화 방법을 사용한 B2M 넉아웃; 및/또는
- NK 세포가 B2M 음성 세포를 공격하는 것을 방지하기 위해 AAV6를 사용하거나 rLV 전달과 같은 유전자 표적 통합을 통해 HLA-E 또는 HLA-G의 과발현.
위에서 언급한 몇 가지 전략을 구현하는 복잡한 엔지니어링은 고형 종양을 치료할 수 있는 차세대 CAR-T 세포를 생성할 수 있는 혁신적인 잠재력을 가지고 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 고형 종양 치료를 위해 조작된 치료 면역세포 집단을 제조하는 방법을 제공한다:
a) 환자 또는 바람직하게는 도너로부터 유래된 면역세포를 제공하는 단계;
b) 상기 세포에서 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 단계;
c) 상기 세포의 게놈에 적어도 하나의 유전적 변형(들)을 도입하는 단계로서, 상기 변형(들)은 하기를 초래하는 것 중에서 선택되는 단계:
- TCR 발현의 감소 또는 불활성화;
- B2M의 감소 또는 불활성화;
- TGFβ 및 TGFβR2 사이의 상호작용의 감소;
- PD1 및 PDL1 사이의 상호작용의 감소; 및/또는
- 향상된 IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현;
d) 상기 세포를 증식하여 치료적으로 효과적인 면역세포 집단을 형성하는 단계.
상기 방법에서의 유전적 변형은 일반적으로 레어-커팅 엔도뉴클레아제/니카제 또는 염기 편집기와 같은 서열 특이적 유전자 편집을 사용하여 얻어진다. 상기 방법은 또한 HYAL1, HYAL2 및/또는 HYAL3(SPAM1)와 같은 히알루리나제의 분비를 향상시키거나 GPI1, PCK1 및/또는 LDHA와 같은 다른 효소의 발현을 향상시키기 위해 세포를 유전적으로 조작하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
표 9: 유전적 속성 폴리펩타이드 서열
추가 구현예에서, 조작된 면역세포는 환자 내에서의 지속성 또는 수명을 개선하기 위해 추가로 변형될 수 있으며, 특히 WO2015136001 또는 Liu, X. et al.[CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells (2017) Cell Res 27:154-157]에 의해 기술된 바와 같이 HLA 또는 β2m과 같은 MHC-1 성분(들)을 인코딩하는 유전자를 불활성화할 수 있다. .
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 조작된 면역세포는 그의 CAR 의존성 면역 활성화를 개선하기 위해, 특히 면역 체크포인트 단백질 및/또는 그의 수용체, 예컨대 WO2014184744에 기술된 바와 같이, PD1 또는 CTLA4의 발현을 감소 또는 억제하기 위해 돌연변이된다. .
치료적으로 조작된 면역세포에서 항-MUC1 CAR의 발현과 TGFbRⅡ 신호 전달 경로 파괴의 조합
본 발명은 보다 구체적으로, 전술한 바와 같이 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 외인성 서열의 발현과 TGF베타 수용체의 억제제, 특히 TGFβRⅡ의 억제제를 인코딩하는 또 다른 외인성 서열을 결합한다.
TGF베타 수용체(Uniprot-P37173)는 종양 미세환경에서 우세한 역할을 하는 것으로 기술되어 왔다[Papageorgis, P. et al. (2015). Role of TGFβ in regulation of the tumor microenvironment and drug delivery (Review). International Journal of Oncology, 46:933-943].
종양 발생에서 TGF베타 수용체의 정확한 역할은 여전히 논란의 여지가 있지만, 본 발명자들은 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)를 TGFBRⅡ 신호 전달의 억제제를 인코딩하는 또 다른 외인성 유전자 서열과 공-발현하고/하거나 서열-특이적 시약을 사용하여 TGF베타 수용체 신호 전달을 불활성화하거나 감소시킴으로써 조작된 면역세포의 치료 효능이 향상된다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 TGFβRⅡ 신호전달 경로를 손상시키기 위해 두 가지 다른 접근법을 사용했는데, 이는 함께 결합될 수 있다:
- Hiramatsu, K., et al.[Expression of dominant negative TGF-β receptors inhibits cartilage formation in conditional transgenic mice (2011) J. Bone. Miner. Metab. 29: 493]에 의해 기술된 바와 같은 도미넌트 음성 TGFβRⅡ(SEQ ID NO:26)와 같은 TGFβRⅡ의 불활성 리간드의 발현 또는 폴리펩타이드 서열 SEQ ID NO:26과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는 유사한 비활성 형태의 TGFβRⅡ의 발현.
및/또는
- 특히 TALE-뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제(예: Cas9 또는 Cpf1)와 같은 레어 커팅 엔도뉴클레아제를 사용하여 TGFβRⅡ의 내인성 유전자 서열의 불활성화.
LY3022859와 같은 수용체-매개 신호 전달 활성화를 억제하는 항-TGFβRⅡ IgG1 단일클론 항체[Tolcher, A.W. et al. (2017) A phase 1 study of anti-TGFβ receptor type-Ⅱ monoclonal antibody LY3022859 in patients with advanced solid tumors Cancer Chemother Pharmacol.79(4):673-680]는 또한 본 발명에 따른 CAR의 조합에서 TGF베타 수용체를 억제하는데 사용될 수 있다.
본 출원은 TGFβRⅡ 유전자 내의 표적 서열의 선택에 특히 특이적인 TALE-뉴클레아제의 선택을 본원에 개시한다. 이러한 TALE-뉴클레아제는 매우 적은 오프-타겟 절단으로 최고의 TGFβRⅡ 넉아웃 효율을 보여 여러 환자에게 투여하기에 충분한 생존 가능한 조작된 세포의 대규모 집단을 생성하였다. 이들 바람직한 TALE-뉴클레아제 및 이들의 상응하는 표적 서열은 표 10에 나열되어 있다.
표 10: TGFβRⅡ 유전자에 대한 TALE-뉴클레아제 표적 서열.
RNA 가이드 avec은 또한 Cas9 뉴클레아제 시약을 사용하여 TGFβRⅡ 유전자를 불활성화하도록 설계되었다. 이들의 상응하는 각각의 표적 서열은 표 11에 개시되어 있다.
표 11: TGFβRⅡ 유전자에 대한 CRISPR 표적 서열.
따라서 본 발명은 본 명세서의 교시 내에서 치료적 면역세포의 생산을 위하여, TGFβRⅡ의 발현을 불활성화하거나 감소시키기 위한 표 10 또는 11에 언급된 표적 서열 SEQ ID NO:90 내지 204 중 임의의 것에 결합하도록 설계된 TALE-뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한 내인성 TGFβRⅡ 유전자의 발현을 불활성화하거나 감소시키기 위해 앞서 언급한 것과 같은 뉴클레아제를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조작된 면역세포에 관한 것이다. 이 전략은 도 16 및 17에 더욱 구체적으로 예시되어 있다.
본원의 실험 섹션에 나타난 바와 같이, 레어-커팅 엔도뉴클레아제 또는 염기 편집자와 같은 서열 특이적 시약의 세포 내로의 발현에 의한 TGFBRⅡ의 불활성화는 더 높은 항종양 활성을 갖는 항-MUC1 CAR T-세포를 유도한다.
이와 관련하여 바람직한 특정 시약은 SEQ ID NO:86, 87, 88 또는 89, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO:89로부터 선택된 TGFBRⅡ의 하나의 표적 서열에 돌연변이를 도입하기 위한 TALE-뉴클레아제 또는 TALE 염기 편집기, 특히 폴리펩타이드 서열 SEQ ID NO:223 및 SEQ ID NO:224 중 어느 하나와 적어도 95% 동일성을 나타내는 하나 이상의 모노머를 갖는 TALE 뉴클레아제이다.
이러한 구현예에 따르면, 본 발명은 고형 종양에 대해 활성인 CAR 면역세포를 생성하는 방법을 제공하며, 여기서 각각의 TCR(예: TRAC), PD1, B2M 및 TGFBRⅡ 유전자의 하나 이상의 대립유전자는 서열 특이적 시약(뉴클레아제 또는 염기 편집기)을 사용하여 돌연변이되어 그들의 발현을 줄이거나 불활성화한다. 이러한 방법은 바람직하게는 서열 특이적 시약을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 바람직하게는 mRNA 형태를 세포 내로 도입하는 2개의 전기천공(electroporation) 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 이들 2개의 전기천공 단계는 바람직하게는 48시간 이상, 보다 바람직하게는 72시간 이상, 및 보다 더 바람직하게는 96시간 이상의 간격으로 이격되어 있다. 본 발명자들은 첫 번째 전기천공 단계에서 TCR과 B2M을 표적으로 하는 특정 시약을 도입하고, 두 번째 전기천공 단계에서 PD1과 TGFBRⅡ를 표적으로 하는 특정 시약을 도입함으로써 특히 좋은 결과를 얻었다. 이는 4중 돌연변이 조작 세포의 더 높은 수율을 생성하는데 허용된 세포독성을 줄이기 위해 발생하였다.
그러나 여러 종양 상주 세포가 강력한 면역 억제 효과가 있고 CAR-T 증식과 효과기 기능을 모두 차단할 수 있는 TGF-β를 생성하는 경우가 발생할 수 있다. 이러한 차단을 방지하기 위해, 본 발명은 도미넌트 음성 TGFBR2(dnTGFBR2)의 전달을 제공한다. 도미넌트 음성 TGFBR2는 세포내 신호 전달 도메인이 결여된 수용체이므로 TGF-β에 대한 높은 친화력을 유지하는 동안 TGF-B 신호를 전달할 수 없다. 따라서 dnTGFBR2는 CAR-T로부터 TGF-β를 격리하는 스펀지 역할을 하며 또한 TGF-β1의 면역 억제 효과도 완화시킨다. dnTGFBR2의 바람직한 전달은 rLV를 통해 단일 실체로서 또는 CAR를 발현하고 2A 자가-절단 펩타이드에 의해 분리된 바이시스트론 구조체로서 성공적으로 달성되었다. 그러나 이는 면역-억제성 고형 종양 미세환경의 재-프로그래밍을 지원하기 위한 목적으로 유도성 유전자자리(예: PD-1, CD25...) 내의 AAV 벡터와 같은 표적 통합을 통해 달성될 수도 있다.
따라서 본 출원은 TGF베타 수용체의 억제제를 인코딩하는 외인성 서열이 세포 내로, 보다 구체적으로 도미넌트 음성 TGF베타 수용체를 인코딩하는 서열이 세포 내로 도입된 조작된 면역세포, 특히 CAR 면역세포를 보고한다. 이러한 세포는 더욱 특히 고형 종양, 특히 MUC1 양성 종양의 치료에 사용된다.
따라서, 본 출원은 또한 도미넌트 음성 TGFβRⅡ를 인코딩하는 적어도 폴리뉴클레오타이드 서열 및 선택적으로 항-MUC1 키메라 항원 수용체를 포함하는 당업계에 기술된 바와 같은 렌티바이러스 벡터 또는 AAV 벡터와 같은 벡터, 특히 바이러스 벡터를 권리로 청구한다. 바람직한 구현예에서, 상기 벡터는 상기 d152 도미넌트 음성 TGFβRⅡ를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 2A 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열 및 상기 특정 항-MUC1 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
면역세포로의 표적화된 삽입은 AAV 벡터, 특히 Sharma A., et al.[Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. (2010) Brain Research Bulletin. 81 (2-3): 273-278]에 의해 이전에 기술된 AAV6 계열의 벡터 또는 키메라 벡터 AAV2/6을 사용함으로써 상당히 개선될 수 있다.
따라서 본 발명의 한 측면은 TALE 엔도뉴클레아제와 같은 서열-특이적 엔도뉴클레아제 시약의 발현과 함께 인간 일차 면역세포에서의 항-MUC1CAR 코딩 서열을 포함하는 AAV 벡터의 형질도입으로, 이전에 인용된 유전자자리에서 유전자 통합을 증가시키는 것이다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약은 형질감염에 의해, 더욱 바람직하게는 상기 서열 특이적 엔도뉴클레아제 시약을 인코딩하는 mRNA의 전기천공에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
획득된 외인성 핵산 서열의 삽입은 유전 물질의 도입, 내인성 서열의 교정 또는 대체, 보다 바람직하게는 해당 유전자자리의 내인성 유전자 서열과 관련하여 "인 프레임(in frame)"을 초래할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 세포당 105 내지 107개, 바람직하게는 106 내지 107개, 보다 바람직하게는 약 5.106개의 바이러스 게놈이 형질도입된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 세포는 상동성 재조합을 추가로 돕기 위해 보르테조밉(Bortezomib) 또는 HDAC 억제제와 같은 프로테아좀 억제제로 처리될 수 있다.
본 발명의 한 목적으로서, 상기 방법에 사용되는 AAV 벡터는 프로모터가 없는 외인성 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 상기 코딩 서열은 본 명세서에 언급된 것들 중 임의의 것이다.
본 발명은 또한 보다 구체적으로 숙주-이식편 상호작용 및 인식에 관여하는 다양한 유전자자리에서 유전자 편집될 수 있는 일차 면역세포를 얻기 위한 효율적인 방법을 제공한다. 조작된 일차 세포, 특히 일차 T-세포의 활성, 생존 또는 수명을 개선하는 관점에서 다른 유전자자리도 편집될 수 있다.
도 2는 조작된 면역세포의 효율성을 향상시키기 위해 본 발명에 따른 유전자 편집에 의해 변형될 수 있는 주요 세포 기능을 지도화한 것이다. 각 기능 아래에 나열된 유전자 불활성화는 다른 기능과 결합하여 면역세포의 전반적인 치료 효능에 대한 시너지 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 보다 구체적으로 다음과 같은 고형 종양, 특히 항-MUC1 양성 악성 세포에 대한 면역세포 효능을 향상시키는 면역세포 내 유전적 변형(유전자형)의 조합을 제공한다:
- [항MUC1 CAR]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [PD1]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [PD1]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [PD1]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [PD1]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [PD1]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [PD1]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]- [β2m]-, 또는
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]- [β2m]-.
더욱 바람직한 구현예에서, 상기 유전자형은 바람직하게는 본원에 기술되고 도 5에 도시된 바와 같은 IL-12a-2A-IL-12b 구조체 및 HLAE의 삽입을 통해 IL-12의 과발현과 결합되는데, 다음 유전자형 중 어느 하나를 수득하기 위함이다:
- [항-MUC1 CAR]+ [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [β2m]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [PD1]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [PD1]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [PD1]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [PD1]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [PD1]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [β2m]- [PD1]- [TCR]- [HLAE]+ [IL12]+,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [PD1]- [TCR]- [β2m]- [HLAE]+ [IL12]+, 또는
- [항-MUC1 CAR]+[dnTGFβRⅡ]+[TGFβRⅡ]-[PD1]-[TCR]-[β2m]-[HLAE]+[IL12]+,
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 또한 특히 림프구 고갈제에 내성을 갖게 되어 동종이계 환경에서 사용하기 위해 림프구 고갈 레지멘과 조합되거나 선행될 수 있는 고형암 치료에서의 CAR 양성 세포의 사용에 중점을 둔다. 이러한 세포는 바람직하게는 다음과 같은 유전자형을 나타낸다:
항-CD52 항체 부분적 또는 완전 내성과 관련하여:
- [항-MUC1 CAR]+ [CD52]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [CD52]- [TCR]- [β2m]-,,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [CD52]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [CD52]- [TCR]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [CD52]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [CD52]- [TCR]- [β2m]-,
퓨린 유사체 부분적 또는 완전 내성과 관련하여:
- [항-MUC1 CAR]+ [DCK]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [DCK]- [TCR]- [β2m]-,,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [DCK]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [DCK]- [TCR]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [DCK]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [DCK]- [TCR]- [β2m]-,
글루코코르티코이드 부분 또는 완전 내성과 관련하여:
- [항-MUC1 CAR]+ [GR]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [GR]- [TCR]- [β2m]-,,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [GR]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [TGFβRⅡ]- [GR]- [TCR]- [β2m]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [GR]- [TCR]-,
- [항-MUC1 CAR]+ [dnTGFβRⅡ]+ [GR]- [TCR]- [β2m]-,
불활성화된 유전자자리에서 트랜스진의 발현을 통한 치료용 면역세포의 추가 개선
상기 바람직한 유전자형은 유전자 표적화 통합에 의해 바람직하게는 PD1, TCR(TCR알파 및/또는 TCR베타) 또는 TGFβRⅡ 유전자자리에서 얻을 수 있지만, 또한 이후에 기술되는 추가로 선택된 유전자자리에서도 얻을 수 있다.
"유전자 표적화 통합(gene targeting integration)"은 살아있는 세포에 게놈 서열을 삽입, 대체 또는 교정할 수 있는 임의의 공지된 부위-특이적 방법을 의미한다. 유전자 표적화 통합은 일반적으로 엔도뉴클레아제 서열 특이적 시약에 의해 강화되어 적어도 하나의 외인성 뉴클레오타이드, 바람직하게는 여러 뉴클레오타이드의 서열(즉, 폴리뉴클레오타이드), 보다 바람직하게는 미리 정의된 유전자자리의 코딩 서열의 삽입 또는 대체를 가져오는데, 상동성 유전자 재조합 또는 NHEJ(Non homologous Ends Joining)의 메커니즘을 포함한다.
고형 종양에 대한 면역세포의 효능을 개선시킬 수 있는 추가 트랜스진의 발현
본 발명의 방법은 바이러스 형질도입과 같은 유전적 형질전환을 수반하는 다른 방법과 연관될 수 있고, 반드시 통합을 수반하지 않는 다른 이식유전자 발현과 조합될 수도 있다.
한 측면에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 다음으로부터 선택된 내인성 유전자자리에 돌연변이 또는 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열을 면역세포 내로 도입하는 단계들을 포함한다:
a) 칼슘 신호 전달을 증가시키는 SERCA3, 해당(glycolysis)을 증가시키는 miR101 및 mir26A, 해당 비축물을 동원하는 BCAT와 같이 낮은 포도당 조건에 반응하여 해당 및 칼슘 신호의 감소에 발현이 관여하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
b) IL27RA, STAT1, STAT3와 같은 면역 체크포인트 단백질(예를 들어 TIM3, CEACAM, LAG3, TIGIT)의 발현을 상향 조절하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
c) 발현이 예컨대 ILT2 또는 ILT4와 같은 HLA-G와의 상호작용을 매개하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
d) Treg 증식을 감소시키는 SEMA7A, SHARPIN, 세포사멸을 감소시키는 STAT1, IL-2 분비를 증가시키는 PEA15 및 CD8 메모리 분화를 선호하는 RICTOR와 같이 발현이 T-세포 증식의 하향 조절에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
e) mir21과 같은, 발현이 T-세포 활성화의 하향 조절에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
f) JAK2 및 AURKA와 같은, 사이토카인에 반응하는 신호 전달 경로에 발현이 관여하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들); 및/또는
g) DNMT3, miRNA31, MT1A, MT2A, PTGER2와 같은, 발현이 T-세포 고갈에 관여하는 폴리뉴클레오타이드 서열(들);
바람직하게는, 선택된 내인성 유전자자리를 특이적으로 표적화하는 서열-특이적 시약을 상기 세포 내로 발현시킴으로써이다.
추가 구현예에서, 본 발명에 따라 조작된 면역세포는 하기를 인코딩하는 것 중에서 선택되는 또 다른 외인성 유전자 서열과 함께 상기 세포에서 항-MUC1 CAR의 공-발현을 얻기 위해 추가로 변형될 수 있다:
- 돌연변이된 IL6Ra, sGP130 또는 IL18-BP와 같은 CRS 억제제;
- 상기 면역세포에 사이클로포스파미드 및/또는 이소포스파미드와 같은 약물에 대한 과민성을 부여하는, 사이토크롬(들) P450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 또는 CYP1A2;
- 약물 내성을 부여하는, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), 칼시뉴린 또는 메틸구아닌 전이효소(MGMT), mTORmut 또는 Lckmut;
- CCR2, CXCR2 또는 CXCR4와 같은 케모카인 수용체; 및/또는
- 면역세포의 치료 활성을 향상시키기 위한 CCR2/CCL2 중화제와 같은 종양 관련 대식세포(TAM)의 분비 억제제;
상기 이식유전자 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 그의 발현이 상기 유전자자리 중 어느 하나에 존재하는 적어도 하나의 내인성 프로모터의 전사 제어하에 놓이도록 삽입된다.
유전자 통합을 수행함으로써 상기 언급된 하나의 유전자자리를 표적화하는 것은 본 발명의 치료 면역세포의 효능을 추가로 향상시키는 데 유익하다.
선택된 유전자자리에서 발현되거나 과발현될 수 있는 이러한 외인성 서열 또는 이식유전자의 예는 이하에 자세히 설명되어 있다:
약물이나 면역 고갈제에 대한 내성을 부여하는 추가 트랜스진의 발현
본 방법의 일 측면에 따르면, 면역세포 게놈 유전자자리에 통합된 외인성 서열은 상기 면역세포의 약물에 대한 내성을 부여하는 분자를 인코딩한다.
바람직한 외인성 서열의 예는 메토트렉세이트와 같은 폴레이트 유사체에 대한 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 변이체, 마이코페놀산(MPA) 또는 이의 전구약물 마이코페놀레이트 모페틸(MMF)과 같은 IMPDH 억제제에 대한 내성을 부여하는 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2)의 변이체, FK506 및/또는 CsA와 같은 칼시뉴린 억제제에 대한 내성을 부여하는 칼시뉴린 또는 메틸구아닌 트랜스퍼라제(MGMT)의 변이체, 라파마이신에 대한 내성을 부여하는 mTORmut과 같은 mTOR의 변이체 및 이마티닙(Imatinib) 및 글리벡(Gleevec)에 대한 내성을 부여하는 Lckmut와 같은 Lck의 변이체를 들 수 있다.
본원에서 용어 "약물(drug)"은 바람직하게는 암 세포와 상호작용하여 세포의 증식 또는 생존 상태를 감소시키는 데 일반적으로 사용되는 표준 화학요법 제제인 화합물 또는 이의 유도체를 지칭하는 것으로 사용된다. 화학요법 제제의 예에는 이에 제한되지는 않지만, 알킬화제(예: 사이클로포스파미드, 이포사미드), 대사성 길항제(예: 클로파라빈, 플루다라빈 또는 2'-데옥시아데노신, 메토트렉세이트(MTX), 5-플루오로우라실 또는 이들의 유도체와 같은 퓨린 뉴클레오시드 항대사물질), 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 아드리아마이신), 식물-유래 항종양제(예를 들어, 빈크리스틴, 빈데신, 탁솔), 시스플라틴, 카보플라틴, 에토포시드 등을 포함한다. 이러한 제제에는 이에 제한되지는 않지만, 항암제 TRIMETHOTRIXATE™(TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-니트로벤질)-6-티오이노신(NBMPR), 6-벤지구아니딘(6-BG), 비스-클로로니트로소우레아(BCNU) 및 CAMPTOTHECIN™, 또는 이들의 치료 유도체를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 면역세포는 상기 약물의 최대 억제 농도의 절반(IC50)을 함유하는 배양 배지에서 적어도 인-비트로에서 증식할 수 있도록 상기 세포 또는 세포 집단이 변형될 때 약물에 대해 "저항성 또는 내성"을 갖게 된다(상기 IC50은 변형되지 않은 세포(들) 또는 세포 집단에 대해 결정됨).
특정 구현예에서, 상기 약물 내성은 적어도 하나의 "약물 내성 코딩 서열"의 발현에 의해 면역세포에 부여될 수 있다. 상기 약물 내성 코딩 서열은 위에서 언급한 화학요법 제제 중 하나와 같은 제제에 "내성"을 부여하는 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 약물 내성 코딩 서열은 항-대사물질, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 시스플라틴, 알킬화제, 안트라사이클린, 세포독성 항생제, 항-면역필린, 이들의 유사체 또는 유도체 등에 대한 내성을 인코딩할 수 있다(Takebe, N., S. C. Zhao, et al. (2001) "Generation of dual resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of the human aldehyde dehydrogenase class 1 gene and a mutated dihydrofolate reductase gene". Mol. Ther. 3(1): 88-96), (Zielske, S. P., J. S. Reese, et al. (2003) "In vivo selection of MGMT(P140K) lentivirus-transduced human NOD/SCID repopulating cells without pretransplant irradiation conditioning." J. Clin. Invest. 112(10): 1561-70) (Nivens, M. C., T. Felder, et al. (2004) "Engineered resistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression of tyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase" Cancer Chemother Pharmacol 53(2): 107-15), (Bardenheuer, W., K. Lehmberg, et al. (2005). "Resistance to cytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells after retroviral expression of cytidine deaminase in human hematopoietic progenitor cells". Leukemia 19(12): 2281-8), ( Kushman, M. E., S. L. Kabler, et al. (2007) "Expression of human glutathione S-transferase P1 confers resistance to benzo[a]pyrene or benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis, macromolecular alkylation and formation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1" Carcinogenesis 28(1): 207-14).
본 발명에 따른 면역 세포들에서 이러한 약물 내성 외인성 서열들의 발현은 더 특히 이들 약물들로 전에 치료된 환자들에서 또는 세포 요법이 화학요법과 조합되는 세포 요법 치료 계획들(schemes)에서 상기 면역 세포들의 사용을 가능하게 한다.
본 발명에 따라 약물 내성을 부여하기 위해 잠재적으로 사용될 수 있는 몇몇 약물 내성 코딩 서열들이 확인되었다. 약물 내성 코딩 서열의 하나의 예는 예를 들어 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 돌연변이체 또는 변형된 형태일 수 있다. DHFR은 세포에서 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 양을 조절하는데 관여되는 효소이며 DNA 합성에 필수적이다. 메토트렉세이트(MTX)와 같은 폴레이트 아날로그들은 DHFR을 억제하며 따라서 임상에서 항-신생물 제제들(anti-neoplastic agents)로 사용된다. 요법(therapy)에서 사용되는 항-폴레이트들에 의한 억제에 대한 내성을 증가시킨 DHFR의 여러가지 돌연변이체 형태들이 기재되어 왔다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약물 내성 코딩 서열은 인간 야생형 DHFR(GenBank: AAH71996.1)의 돌연변이체 형태를 인코딩하는 핵산 서열일 수 있으며, 이는 메토트렉세이트와 같은, 항-폴레이트 치료에 대한 내성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, DHFR의 돌연변이 형태는 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 위치 G15, L22, F31 또는 F34에서, 바람직하게는 위치들 L22 또는 F31에서 포함한다(Schweitzer et al. (1990) "Dihydrofolate reductase as a therapeutic target" Faseb J 4(8): 2441-52; 국제 출원 WO94/24277; 및 US 특허 US 6,642,043). 특정 구현예에서, 상기 DHFR 돌연변이체(mutant) 형태는 위치 L22 및 F31에 두 개의 돌연변이된 아미노산들을 포함한다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 상응은 야생형 DHFR 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들에 관하여 자주 나타내어진다. 특정 구현예에서, 위치 15에서 세린(serine) 잔기는 바람직하게는 트립토판(tryptophan) 잔기로 대체된다. 또 다른 특정 구현예에서, 위치 22의 류신(leucine) 잔기는 바람직하게는 돌연변이체 DHFR의 항폴레이트들(antifolates)에 대한 결합을 방해할 아미노산, 바람직하게는 티로신(tyrosine) 또는 페닐알라닌(phenylalanine)과 같은 하전되지 않은 아미노산 잔기들로 대체된다. 또 다른 특정 구현예에서, 위치 31 또는 34의 페닐알라닌 잔기는 바람직하게는 알라닌(alanine), 세린(serine) 또는 글리신(glycine)과 같은 작은 친수성 아미노산으로 대체된다.
약물 내성 코딩 서열의 또 다른 예는 또한 구아노신(guanosine) 뉴클레오타이드들의 디 노보(de novo) 합성에서 속도-제한(rate-limiting) 효소인 이오니신-5'-모노포스페이트 탈수소효소 Ⅱ(ionisine-5'-monophosphate dehydrogenase Ⅱ) (IMPDH2)의 돌연변이체 또는 변형된 형태일 수 있다. IMPDH2의 돌연변이체 또는 변형된 형태는 IMPDH 억제제 내성 유전자이다. IMPDH 억제제들은 마이코페놀산 (MPA) 또는 그것의 전구 약물(prodrug) 마이코페놀레이트 모페틸 (MMF)일 수 있다. 돌연변이체 IMPDH2는 IMPDH 억제제에 대한 상당한 내성 증가를 이끄는 야생형 인간 IMPDH2(Genebank: NP_000875.2)의 MAP 결합 부위에 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 돌연변이들을 포함할 수 있다. 이들 변이체들에서 돌연변이들은 바람직하게는 위치들 T333 및/또는 S351에 있다(Yam, P., M. Jensen, et al. (2006) "Ex vivo selection and expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphate dehydrogenase 2 after HIV vector transduction: effects on lymphocytes, monocytes, and CD34+ stem cells" Mol. Ther. 14(2): 236-44)(Jonnalagadda, M., et al. (2013) "Engineering human T cells for resistance to methotrexate and mycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy." PLoS One 8(6): e65519).
또 다른 약물 내성 코딩 서열은 칼시뉴린의 돌연변이체 형태이다. 칼시뉴린(PP2B - NCBI: ACX34092.1)은 T-세포 활성화에 중심되고 많은 생물학적 프로세스들에서 관련되는 편재하여 발현되는 세린/트레오닌 단백질 포스파타제(phosphatase)이다. 칼시뉴린은 촉매적 서브유닛(CnA; 세 개의 아이소폼들(isoforms)) 및 조절 서브유닛 (CnB; 두 개의 아이소폼들)을 포함하는 헤테로다이머(heterodimer)이다. T-세포 수용체의 결합 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT를 탈인산화하여(dephosphorylates), 그것이 IL2와 같은 활성 주요 표적 유전자 및 핵으로 이동시키는 것을 가능하게 한다. FKBP12와 복합체가 된 FK506 또는 CyPA와 복합체가 된 사이클로스포린 A(CsA)는 칼시뉴린의 활성 부위로 NFAT 접근을 차단하여, 그것의 탈인산화를 방지하고 이로써 T-세포 활성화를 억제한다(Brewin et al. (2009) "Generation of EBV-specific cytotoxic T cells that are resistant to calcineurin inhibitors for the treatment of posttransplantation lymphoproliferative disease" Blood 114(23): 4792-803). 특정 구현예에서, 상기 돌연변이체 형태는 위치들: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산들, 바람직하게는 위치들 T351 및 L354 또는 V314 및 Y341에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 위치 341에서 발린 잔기는 리신 또는 아르기닌 잔기로 대체될 수 있고, 위치 341에서 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있으며; 위치 347에서 메티오닌은 글루타민산, 아르기닌 또는 트립토판 잔기로 대체될 수 있고; 위치 351에서 트레오닌은 글루타민산 잔기로 대체될 수 있으며; 위치 352에서 트립토판 잔기는 시스테인, 글루타민산 또는 알라닌 잔기로 대체될 수 있고, 위치 353에서 세린은 히스티딘 또는 아스파라긴들 잔기로 대체될 수 있으며, 위치 354에서 류신은 알라닌 잔기로 대체될 수 있고; 위치 360에서 리신은 알라닌 또는 페닐알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 돌연변이체 형태는 위치들: V120, N123, L124 또는 K125에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 b의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 위치들 L124 및 K125에서 이중 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 위치 120에서 발린은 세린, 아스파르트산, 페닐알라닌 또는 류신 잔기로 대체될 수 있고; 위치 123에서 아스파라긴들은 트립토판, 리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 히스티딘 또는 세린으로 대체될 수 있으며; 위치 124에서 류신은 트레오닌 잔기로 대체될 수 있고; 위치 125에서 리신은 알라닌, 글루타민산, 트립토판으로 대체될 수 있거나, 또는 류신-아르기닌 또는 이소류신-글루타민산과 같은 두 개의 잔기들이 아미노산 서열의 위치 125에서 리신 뒤에 추가될 수 있다. 본원에 기재된 아미노산 위치들의 상응은 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 b 폴리펩타이드(NCBI: ACX34095.1)의 형태의 아미노산들의 위치들에 관하여 자주 나타내어진다.
또 다른 약물 내성 코딩 서열은 인간 알킬 구아닌 트랜스페라제(hAGT)를 인코딩하는 0(6)-메틸구아닌 메틸트랜스페라제(MGMT - UniProtKB: P16455)이다. AGT는 테모졸로마이드(TMZ) 및 나이트로소우레아들과 같은, 알킬화 제제들의 세포독성 효과들에 대한 내성을 부여하는 DNA 수선 단백질이다. 6-벤질구아닌(6-BG)은 나이트로소우레아 독성에 효력을 더하는 AGT의 억제제이고 이 제제의 세포독성 효과들에 효력을 더하기 위하여 TMZ와 함께 공-투여된다. AGT의 변이체들을 인코딩하는 MGMT의 몇몇 돌연변이체 형태들은 6-BG에 의한 불활성화에 매우 내성이지만, DNA 손상을 수선하는 그들의 능력을 유지한다(Maze, R. et al. (1999) "Retroviral-mediated expression of the P140A, but not P140A/G156A, mutant form of O6-methylguanine DNA methyltransferase protects hematopoietic cells against O6-benzylguanine sensitization to chloroethylnitrosourea treatment" J. Pharmacol. Exp. Ther. 290(3): 1467-74). 특정 구현예에서, AGT 돌연변이체 형태는 야생형 AGT 위치 P140의 돌연변이된 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 위치 140에서 상기 프롤린은 리신 잔기로 대체된다.
또 다른 약물 내성 코딩 서열은 다약제내성 단백질(multidrug resistance protein)(MDR1) 유전자일 수 있다. 이 유전자는 세포막을 통한 대사 부산물들의 수송에 관여되는 P-당단백질(P-GP)로 알려진, 막 당단백질을 인코딩한다. P-Gp 단백질은 몇몇 구조적으로 관련없는 화학요법 제제들에 대해 광범위한 특이성을 나타낸다. 따라서, MDR-1(Genebank NP_000918)을 인코딩하는 핵산 서열의 발현에 의해 약물 내성이 세포들에 부여될 수 있다.
또 다른 약물 내성 코딩 서열은 ble 또는 mcrA 유전자들로부터의 것들과 같은 세포독성 항생제들의 생산에 기여할 수 있다. 면역 세포에서 ble 또는 mcrA 유전자의 이소성(Ectopic) 발현은 각각의 화학요법 제제들인 블레오마이신(bleomycine) 및 미토마이신(mitomycin) C에 노출될 때 선택적인 이점을 준다(Belcourt, M.F. (1999) “Mitomycin resistance in mammalian cells expressing the bacterial mitomycin C resistance protein MCRA”. PNAS. 96(18):10489-94).
또 다른 약물 내성 코딩 서열은 Lorenz M.C. et al. (1995) "TOR Mutations Confer Rapamycin Resistance by Preventing Interaction with FKBP12-Rapamycin" The Journal of Biological Chemistry 270, 27531-27537에 기술된 바와 같이 라파마이신에 대한 내성을 부여하는 mTOR(mTOR mut)의 돌연변이된 변이체, 또는 Lee K.C. et al. (2010) "Lck is a key target of imatinib and dasatinib in T-cell activation", Leukemia, 24: 896-900에 의해 기술된 바와 같이 Gleevec에 대한 내성을 부여하는 Lck(Lckmut)의 특정 돌연변이된 변이체와 같은, 약물 표적들의 돌연변이된 버전을 인코딩하는 유전자들로부터 유래될 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 방법의 유전적 변형 단계는 상동 재조합이 내인성 유전자 및 외인성 핵산 사이에서 일어나도록 내인성 유전자의 부분 및 약물 내성 코딩 서열을 인코딩하는 서열을 적어도 포함하는 외인성 핵산의 세포들 내 도입의 단계를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 내인성 유전자는 야생형 "약물 내성" 유전자일 수 있어, 상동 재조합 후에 야생형 유전자가 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자의 돌연변이체 형태로 대체된다.
인-비보에서 면역 세포들의 지속성을 향상시키는 트랜스진의 발현
본 방법의 하나의 측면에 따라, 면역 세포 게놈 유전자자리에 통합된 외인성 서열은 면역 세포들의 지속성, 특히 종양 환경에서 인-비보 지속성을 향상시키는 분자를 인코딩한다.
"지속성 향상(enhancing persistence)"이라는 것은 특히 조작된 면역 세포들이 환자에게 주입되면 수명(life span)의 측면에서 면역 세포들의 생존을 연장하는 것을 의미된다. 예를 들어, 적어도 10% 이상, 바람직하게는 20%, 보다 바람직하게는 30%, 보다 더 바람직하게는 50%만큼, 변형된 세포들의 평균 생존이 변형되지 않은(non-modified) 세포들의 그것보다 유의하게 더 길면, 지속성이 향상된다.
이것은 면역 세포들이 동종이계일 때 특히 관련있다. 이것은 세포막에서, 또는 이를 통해, 면역억제성 폴리펩타이드들을 이소성으로(ectopically) 발현 및/또는 분비하는 코딩 서열들을 도입함으로써 국소적 면역 보호를 생성함으로써 될 수 있다. 특히 NKG2D 리간드 또는 바이러스 외피(envelope)로부터 유래된 면역억제성 펩타이드들, 면역 체크포인트들의 길항제들인, 이러한 폴리펩타이드들의 다양한 패널이 환자들로 동종 면역 세포들의 생착(engraftment) 및/또는 지속성을 향상시킬 수 있다.
하나의 구현예에 따라, 상기 외인성 코딩 서열에 의해 인코딩되는 면역억제성 폴리펩타이드는 세포독성 T-림프구 항원 4(CD152로도 알려진 CTLA-4, GenBank accession number AF414120.1)의 리간드이다. 상기 리간드 폴리펩타이드는 바람직하게는 항-CTLA-4 면역글로불린, 예를 들어 CTLA-4a Ig 및 CTLA-4b Ig 또는 그것의 기능적 변이체이다.
하나의 구현예에 따라, 상기 외인성 코딩 서열에 의하여 인코딩되는 면역억제성 폴리펩타이드는 PD1의 길항제, 예를 들어 PD-L1(다른 이름들: CD274, 프로그램된 세포사(Programmed cell death) 1 리간드; 인간 폴리펩타이드 서열 Q9NZQ7에 대해 UniProt 참조(ref.))로, 이는 Ig V-유사(like) 도메인, Ig C-유사 도메인, 소수성 막관통 도메인 및 30 아미노산들의 세포질 꼬리로 구성되는 290 아미노산들의 타입 I 막관통 단백질을 인코딩한다. PD-L1 리간드의 이러한 막-결합된 형태는 예를 들어 하나 이상의 돌연변이(들)을 가진 또는 세포내 도메인을 제거함으로써, 이와 같은, 트런케이티드(truncated) 형태 하 또는 네이티브 형태(야생형) 하 본 발명에서 의미된다(Wang S et al., 2003, J Exp Med. 2003; 197(9): 1083-1091). 주목하게, PD1은 본 발명에 따라 PD-L1 리간드의 막-결합된 형태로 고려되지 않는다. 또 다른 구현예에 따라, 상기 면역억제성 폴리펩타이드는 분비된 형태이다. 이러한 재조합 분비된 PD-L1 (또는 가용성 PD-L1)은 면역글로불린의 Fc 부분에 PD-L1의 세포외 도메인을 융합함으로써 만들어질 수 있다(Haile ST et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2(7): 610-615; Song MY et al., 2015, Gut. 64(2):260-71). 이 재조합 PD-L1은 PD-1을 중화할 수 있고 PD-1-매개 T-세포 억제를 방해할 수 있다. PD-L1 리간드는 둘다의 더 향상된 지속성을 위하여 CTLA4 Ig와 공-발현될 수 있다.
또 다른 구현예에 따라, 외인성 서열은 비(non)-인간 MHC 상동체(homolog), 특히 바이러스 MHC 상동체, 또는 Margalit A. et al. (2003) "Chimeric β2 microglobulin/CD3ζ polypeptides expressed in T cells convert MHC class I peptide ligands into T cell activation receptors: a potential tool for specific targeting of pathogenic CD8+ T cells" Int. Immunol. 15 (11): 1379-1387에 의해 기재된 바와 같이 키메라 β2m 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
하나의 구현예에 따라, 외인성 서열은 NKG2D 리간드를 인코딩한다. 사이토메갈로바이러스들(cytomegaloviruses)과 같은 몇몇 바이러스들은 NKG2D 리간드들에 결합할 수 있고 그것들의 표면 발현을 방지할 수 있는 단백질을 분비함으로써 NK 세포 매개 면역 감시(NK cell mediate immune surveillance)를 피하고 NKG2D 경로를 방해하기 위한 메커니즘들을 획득하였다(Welte, S.A et al. (2003) "Selective intracellular retention of virally induced NKG2D ligands by the human cytomegalovirus UL16 glycoprotein". Eur. J. Immunol., 33, 194-203). 종양 세포들에서, 몇몇 메커니즘들은 ULBP2, MICB 또는 MICA와 같은 NKG2D 리간드들을 분비함으로써 NKG2D 반응을 회피하도록 발달해왔다(Salih HR, Antropius H, Gieseke F, Lutz SZ, Kanz L, et al. (2003) Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia. Blood 102: 1389-1396).
하나의 구현예에 따라, 외인성 서열은 IL-12 수용체와 같은 사이토카인 수용체를 인코딩한다. IL-12는 면역 세포 활성화의 잘 알려진 활성제(activator)이다(Curtis J.H. (2008) "IL-12 Produced by Dendritic Cells Augments CD8+ T Cell Activation through the Production of the Chemokines CCL1 and CCL171". The Journal of Immunology. 181 (12): 8576-8584).
하나의 구현예에 따라, 외인성 서열은 억제성 펩타이드들 또는 단백질들에 대해 지시되는 항체를 인코딩한다. 상기 항체는 바람직하게는 면역 세포들에 의해 가용성 형태로 분비된다. 낙타들과 상어로부터의 나노바디들(nanobodies)은 그것들이 단일 사슬 항체들로 구조화되어 있어, 이 면에서 유리하다(Muyldermans S. (2013) "Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies" Annual Review of Biochemistry 82: 775-797). 동일한 것이 또한 분비 신호 폴리펩타이드들 및 가용성 친수성 도메인들과 더 쉽게 융합되는 것으로 간주된다.
더 나아가 상술하는 대로, β2m 또는 또다른 MHC 요소를 인코딩하는 내인성 유전자를 파괴함으로써 외인성 코딩 서열이 도입될 때, 세포들의 지속성을 향상시키기 위해 위에 개발된 여러가지 측면들이 특히 바람직하다.
면역 세포들의 치료적 활성을 향상시키는 트랜스진들의 발현
본 방법의 하나의 측면에 따라, 면역 세포들 게놈 유전자자리에 통합되는 외인성 서열은 면역 세포들의 치료적 활성을 향상시키는 분자를 인코딩한다.
"치료적 활성을 향상시키는 것(enhancing the therapeutic activity)"이란, 본 발명에 따라 조작된 면역 세포들 또는 세포들의 집단이 표적 세포들의 선택되는 타입과 관련하여 조작되지 않은 세포들 또는 세포들의 집단보다 더 공격적으로 되는 것을 의미한다. 상기 표적 세포들은 정의되는 타입의 세포들, 또는 세포들의 집단으로 구성되며, 이는 바람직하게는 공통의 표면 마커(들)에 의하여 특징된다. 본 명세서에서 "치료적 가능성(therapeutic potential)"은 인-비트로 실험들을 통해 측정된 대로, 치료 활성을 반영한다. 일반적으로 Daudi 세포들과 같은 민감한 암 세포주들은 세포 용해 또는 성장 감소 측정들을 수행하여 면역 세포들이 상기 세포들에 대해 다소 활성인지 여부를 평가하는 데 사용된다. 이것은 또한 면역 세포들의 탈과립 또는 케모카인들 및 사이토카인들 생산의 수준들을 측정하여 평가될 수 있다. 실험들은 또한 종양 세포들이 주입된 마우스들에서, 그리고 그 결과인 종양 증식을 모니터링하여 수행될 수 있다. 이들 실험들에서 발달 중인 세포들의 수가 면역 세포들에 의해 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과, 보다 바람직하게는 30% 초과, 보다 더 바람직하게는 50% 초과 감소되는 때 활성의 향상이 유의한 것으로 간주된다.
본 발명의 하나의 측면에 따라, 상기 외인성 서열은 케모카인 또는 사이토카인, 예를 들어 IL-12를 인코딩한다. IL-12를 발현하는 것은 특히 유리한데, 이는 이 사이토카인이 면역 세포 활성화를 촉진하는 것으로 문헌에서 광범위하게 나타내어지기 때문이다(Colombo M.P. et al. (2002) "Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy" Cytokine Growth Factor Rev. 13(2):155-68).
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 외인성 코딩 서열은 T-조절 세포들과 같은 면역 세포들의 다른 집단들에, 상기 면역 세포들에 대한 그들의 억제 효과를 완화하기 위해, 작용하는 분비된 인자들을 촉진 또는 인코딩한다.
본 발명의 하나의 측면에 따라, 상기 외래성 배열은 포크헤드(forkhead)/윙드(winged) 헬릭스(helix) 전사 인자 3(FoxP3)의 폴리펩타이드 억제제이고, 더 바람직하게는, P60으로 지칭되는 것과 같은, FoxP3의 세포-관통(penetrating) 펩타이드 억제제인 조절 T-세포 활성의 억제제를 인코딩한다(Casares N. et al. (2010) "A peptide inhibitor of FoxP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice." J Immunol 185(9):5150-9).
"조절 T-세포들 활성의 억제제(inhibitor of regulatory T-cells activity)"란, T-세포들이 그에 대한 조절 T-세포들에 의하여 발휘되는 하향 조절 활성을 피하는 것을 가능하게 하고 T-세포들에 의하여 분비되는 분자 또는 상기 분자의 전구체를 의미한다. 일반적으로, 조절 T-세포 활성의 이러한 억제제는 상기 세포들에서 FoxP3 전사 활성을 감소시키는 효과를 갖는다.
본 발명의 하나의 측면에 따라, 상기 외인성 서열은 CCR2/CCL2 중화제와 같은 종양 관련 대식세포들(TAM)의 분비된 억제제를 인코딩한다. 종양-관련 대식세포들(TAMs)은 종양 미세환경의 중요한 모듈레이터들(modulators)이다. 임상 병리학적 연구들은 종양들에서 TAM 축적은 좋지 않은 임상적 결과와 상관 관계가 있다는 것을 제안하였다. 그 증거와 일치하게, 실험적 및 동물 연구들은 TAM들이 종양 발달 및 진행을 촉진하는데 유리한 미세환경을 제공할 수 있다는 개념을 뒷받침했다.(Theerawut C. et al. (2014) "Tumor-Associated Macrophages as Major Players in the Tumor Microenvironment" Cancers (Basel) 6(3): 1670-1690). 단핵구 화학유인물질 단백질 1(monocyte chemoattractant protein 1)(MCP1-NCBI NP_002973.1)으로도 불리는, 케모카인 리간드 2(Chemokine ligand 2)(CCL2)는 단핵구들, 림프구들 및 호염기구들(basophils)에 대한 화학유인(chemoattraction)을 생산하는, 대식세포들에 의하여 분비되는, CC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. CCR2(C-C 케모카인 수용체 타입 2 - NCBI NP_001116513.2)는 CCL2의 수용체이다.
상기 유전자자리에 삽입되는 코딩 서열은 일반적으로 조작된 면역 세포들의 치료적 가능성을 개선하는 폴리펩타이드(들)을 인코딩하지만, 삽입된 서열은 간섭(interference) RNA들 또는 가이드-RNA들과 같은, 다른 유전자들의 발현을 억제 또는 지시할 수 있는 핵산일 수 있다. 삽입된 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드들은 전사 조절자들 또는 신호 전달자들과 같이 간접적으로 또는 직접적으로 작용할 수 있다.
조작된 면역 세포들 및 면역 세포들의 집단
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법 중 하나에 따라, 단리된(isolated) 형태로, 또는 세포들의 집단의 부분으로서 수득가능한 다양한 조작된 면역 세포들에 대한 것이다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 상기 조작된 세포들은 일반적으로 다른 타입들의 세포들을 포함할 수 있는 세포들의 집단들의 부분인, NK 세포들 또는 T-세포들과 같은 일차 면역 세포들이다. 일반적으로, PBMC(말초 혈액 단핵 세포들)로부터 백혈구성분채집에 의해 단리되는 도너들 또는 환자들로부터 유래하는 집단이다.
본 발명은 각각 및 독립적으로 상기 기재된 상이한 외인성 코딩 서열들 및 유전자 불활성화의 임의의 조합들을 포함하는 면역 세포들을 포함한다. 이들 조합들 중에서 면역 세포 활성화 동안 활성인 내인성 프로모터, 특히 하나의 TCR 유전자자리에 존재하는 하나의 프로모터, 특히 TCR알파 프로모터의 전사 제어 하에 CAR의 발현을 조합하는 것들이 특히 바람직하다.
또 다른 바람직한 조합은 저산소증-유도성 인자 1 유전자 프로모터(hypoxia-inducible factor 1 gene promoter)(Uniprot: Q16665)의 전사 제어 하에 CAR 또는 그것의 구성성분들 중 하나를 인코딩하는 외인성 서열의 삽입이다.
본 발명은 또한 감염 또는 암의 치료를 위해 이전에 기재된 바와 같은 조작된 일차 면역 세포 또는 면역 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물(pharmaceutical composition), 및 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이때 상기 방법은 하기를 포함한다:
- 전술한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 조작된 일차 면역 세포들의 집단을 제조하는 단계;
- 선택적으로, 상기 조작된 일차 면역 세포들을 정제 또는 분류하는 단계;
- 상기 세포들을 상기 환자에게 주입할 때 또는 주입 후에 조작된 일차 면역 세포들의 상기 집단을 활성화시키는 단계.
본 발명은 또한 상기 방법으로부터 생성된 조작된 면역세포를 목적으로 하며, 여기에서 상기 세포는 특히 그의 세포 표면에서 항-MUC1 CAR의 발현을 위해 본원에 언급된 바와 같은 외인성 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 조작된 면역세포는 바람직하게는 일차 세포로부터 유래되거나 iPS 세포와 같은 줄기 세포로부터 분화된 T-세포 또는 NK 세포이다.
특정 구현예에 따르면, TCR알파 또는 TCR베타를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자의 불활성화에 의해 상기 면역세포에서 TCR의 발현이 감소되거나 억제된다. 이것은 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의한 것이다.
특정 구현예에 따르면, 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 내인성 프로모터의 전사 제어 하에 내인성 유전자자리, 바람직하게는 TCR알파 또는 TCR베타 유전자자리에 통합될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 면역세포는 항-CD52 항체와 같은 적어도 하나의 면역 억제 약물에 대한 내성을 부여하기 위해 추가로 돌연변이될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 면역세포는 적어도 하나의 화학요법 약물, 특히 퓨린 유사체 약물에 대한 내성을 부여하도록 추가로 돌연변이될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조작된 면역세포는 환자 내에서의 지속성 또는 수명을 개선하기 위해, 특히 HLA 또는 B2m과 같은 MHCI 성분(들)을 인코딩하는 유전자로 돌연변이되었다.
바람직한 구현에에 따르면, 본 발명의 조작된 면역세포는 CAR-의존성 면역 활성화를 개선하기 위해, 특히 면역 체크포인트 단백질 및/또는 이의 수용체의 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 돌연변이될 수 있다.
특정 구현예에 따르면, 상기 항-MUC1 CAR는 TGF베타 수용체의 억제제 또는 디코이(decoy), 예를 들어 SEQ ID NO:59와 적어도 80% 폴리펩타이드 서열 동일성을 갖는 도미넌트 음성 TGF베타 수용체(dnTGFβRⅡ)를 인코딩하는 또 다른 외인성 유전적 서열과 함께 상기 세포에서 공-발현될 수 있다. 이러한 발현은 상기 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 2A 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 도미너트 음성 TGF베타 수용체를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입함으로써 얻어질 수 있다.
대안적으로 또는 보충적으로, 상기 조작된 면역세포는 적어도 하나의 TGF베타 수용체 유전자 발현이 감소되거나 불활성화될 수 있다.
일부 추가 구현예에 따르면, 상기 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)는 하기를 인코딩하는 것 중에서 선택되는 또 다른 외인성 유전자 서열과 함께 상기 세포에서 공-발현될 수 있다:
- NK 세포 억제제, 예를 들어 HLAG, HLAE 또는 ULBP1;
- CRS 억제제, 예를 들어 돌연변이된 IL6Ra, sGP130 또는 IL18-BP이고; 또는
- 사이클로포스파미드 및/또는 이소포스파미드와 같은, 약물에 대한 상기 면역세포들의 과민성을 부여하는, 사이토크롬(들) P450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 또는 CYP1A2,
- 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), 칼시뉴린 또는 메틸구아닌 전이효소(MGMT), mTORmut 또는 Lckmut이며, 약물 내성을 부여함
- 케모카인 또는 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-12 및 IL-15;
- 히알루로니다제, 예를 들어 HYAL1, HYAL2 및 SPAM1;
- 케모카인 수용체들, 예를 들어 CCR2, CXCR2 또는 CXCR4;
- 면역세포들의 치료적 활성을 향상시키기 위한, CCR2/CCL2 중화제와 같은 종양 관련 대식세포들(TAM)의 분비된 억제제; 및/또는
- 다음과 같은 대사 효소들: 글루코스 포스페이트 아이소머라제 1(GPI1), 젖산염 탈수소효소(LDHA) 및/또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 1(PCK1).
이중 항-메소텔린/항-MUC1 CAR 면역세포
추가 구현예로서, 본 발명은 또한 이전에 기술된 바와 같은 항-MUC1 CAR 및 항-메소텔린 CAR 둘 모두를 발현하는 면역세포 또는 면역세포 집단을 특징으로 한다. CAR의 이러한 특정 조합은 메소텔린 및 MUC1 모두 양성인 고형 종양을 치료하는 데 상당한 이점을 갖는다. 유전적으로 관련이 없는 이 두 가지 항원을 표적으로 삼으면 항원 탈출 가능성이 줄어든다. 본 발명자들은 이러한 조합이 본 발명의 세포 집단에 인-비보 고형 종양에 대한 추가 능력을 부여한다는 것을 발견하였다. 이는 또한 특히 다양한 유형의 종양 형성 세포가 공존할 수 있는 이종 고형 종양에서 항종양 활성 범위를 확장할 수 있게 해준다. 예를 들어, 항-메소텔린 CAR 및 항-MUC1 CAR 양성 세포를 발현하는 이중 CAR 면역세포는 MUC1 CAR만으로는 죽일 수 없었던, 메소텔린 양성 또는 tMUC1 양성 세포를 죽일 수 있다.
항-MUC1 CAR 및 항-메소텔린 CAR 둘 다 이전에 설명된 방법에 의해 조작된 면역세포에서 공-발현될 수 있으며, 따라서 본 출원에서 언급된 임의의 유전적 속성, 예를 들어 TCR, B2M 및 PD1의 감소된 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역세포는 항-MUC1 CAR 또는 항-메소텔린 CAR 중 하나를 인코딩하는 서열, 또는 또한 2A 폴리펩타이드에 의해 연결된 두 코딩 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입될 수 있다. 대안적으로, 항-MUC1 CAR 또는 항-메소텔린 CAR를 독립적으로 발현하는 면역세포를 혼합함으로써 세포의 치료 집단을 얻을 수 있다.
따라서 본 발명은 항암 요법, 특히 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 췌장암, 위암 및 폐암의 치료에 사용하기 위한 항-MUC1 CAR 또는 항-메소텔린 CAR 또는 두 CAR 모두를 발현하는 세포의 혼합을 포함하는 조작된 면역세포의 치료 집단을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 메소텔린 특이적 키메라 항원 수용체(항-MESO CAR)는 전형적으로 하기를 포함하는 구조를 나타내는 것이다:
- 단일클론 항-메소텔린 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인;
- 막관통 도메인; 및
- CD3 제타 시그널링 도메인 및 공-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인.
바람직한 구현예에 따르면, 메소텔린 특이적 키메라 항원 수용체(항-MESO CAR)는 인간 메소텔린(Uniprot 데이터베이스에서 Q13421로 지칭되는 MSLN_human)에 대해 지시된 것이고, 보다 특히 SEQ ID NO:209로 표시되는 특이적 메소텔린의 폴리펩타이드 영역인데, 이는 악성 세포의 표면에 나타나는 것이다. 출원인은 이 항원 영역, 특히 SEQ ID NO:210(Meso1-VH) 및 SEQ ID NO:211(Meso1-VL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인을 포함하는 영역에 대해 효율적인 CAR를 개발하였다.
항-MESO CAR의 세포외 리간드 결합-도메인은 바람직하게는 meso1으로 지칭되는 항체로부터의 하나 또는 여러개의 scFv 세그먼트를 포함하고, 보다 특히 SEQ ID NO:216, 217, 218, 219, 220 및/또는 221을 포함하는 그로부터의 CDR을 포함한다.
바람직한 측면에 따르면, 상기 CAR의 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 하기를 포함한다:
- SEQ ID NO:3 (CDRH1-Meso1), SEQ ID NO:4 (CDRH2-meso1) 및/또는 SEQ ID NO:5 (CDRH3-meso1)와 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 항체 meso1으로부터 CDR을 포함하는 가변 무거운 VH 사슬, 및
- SEQ ID NO:6 (CDRL1-meso1), SEQ ID NO:7 (CDRL2-meso1) 및/또는 SEQ ID NO:8 (CDRL3- meso1)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 항체 meso1으로부터 CDR을 포함하는 가변 가벼운 VL 사슬.
본 발명에 따라 항-MUC1 CAR과 조합하여 사용되는 하나의 바람직한 항-메소텔린 CAR는 MESO1 CAR로 지칭되는 것인데, 이는 SEQ ID NO:222와 각각 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
다른 항-MESO CAR도 본 발명의 일부로서 발현될 수 있으며, 예를 들어 MESO2 및 P4-R2 또는 표 12 및 13에 언급된 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 동일성을 갖는 ScFv 서열을 포함하는 임의의 기능적 변이체를 들 수 있다.
표 12: 항-MESO CAR의 예시적인 결합 도메인의 아미노산 서열
표 13: P4-R2, Meso1-R2, Meso1 및 MESO2-R2 CAR의 아미노산 서열들의 예
T-세포들의 활성화 및 증식
유전적 변형 전 또는 후에, 본 발명에 따른 면역 세포들은, 그것들이 항원 결합 메커니즘들과 독립적으로 활성화 또는 확산할 수 있더라도, 활성화 또는 증식될 수 있다. 특히, T-세포들은 예를 들어, U.S. Patents 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 U.S. Patent Application Publication No. 20060121005에 기재된 방법들을 이용하여 활성화 및 증식될 수 있다. T-세포들은 인 비트로 또는 인 비보에서 증식될 수 있다. T-세포들은 일반적으로 T-세포에 대한 활성화 신호를 생성하기 위해 T-세포들의 표면 상 공-자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제와의 접촉에 의하여 증식된다. 예를 들어, 화학물질들(chemicals) 예를 들어 칼슘 이오노포어(calcium ionophore) A23187, 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA), 또는 파이토헤마글루티닌(PHA) 같은 미토게닉 렉틴들(mitogenic lectins like phytohemagglutinin)이 T-세포에 대한 활성화 신호를 생성하는데 사용될 수 있다.
제한되지 않는 예들로서 T-세포 집단들은 인 비트로에서 예를 들면 표면상에 고정화된 항-CD2 항체, 또는 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편과의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 조합한(conjunction) 단백질 키나제 C활성제(예컨대 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의해, 자극할 수 있다. T-세포들의 표면 상의 악세서리 분자의 공-자극을 위해, 악세서리 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 예를 들어, T-세포들의 집단은 T세포들의 증식을 자극하는데 적절한 조건 하에서 항-CD28 항체 및 항-CD3 항체와 접촉될 수 있다. T-세포 배양에 적합한 조건들은 혈청(예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-2, IL-15, TGFp, 및 TNF- 또는 통상의 기술자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제들을 포함하는, 생존능력(viability) 및 증식을 위해 필요한 인자들을 포함할 수 있는 적합한 배지들(예컨대 최소 필수 배지들(Minimal Essential Media) 또는 RPMI Media 1640 또는 X-vivo 5, (Lonza))을 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은 이에 제한되지는 않지만, 계면활성제, 플라스마네이트(plasmanate) 및 환원제들 예를 들어 N-아세틸-시스테인(N-acetyl-cysteine) 및 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanoi)을 포함한다. 배지들은 적합한 양의 혈청 (또는 혈장) 또는 정의된 세트의 호르몬들, 및/또는 T-세포들의 성장 및 증식에 충분한 사이토카인(들)의 양으로 보충되거나 또는 혈청-없는, 첨가된 아미노산들, 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 및 비타민들을 가진, RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제들, 예컨대 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 실험 배양들에서만 포함되고, 대상에 주입되게 되는 세포들의 배양들에는 포함되지 않는다. 표적 세포들은 성장을 지원하는데 필요한 조건들 하, 예를 들면 적합한 온도(예컨대 37℃) 및 대기(예컨대 공기 플러스 5% C02)로 유지된다. 다양한 자극 시간들에 노출되어 온 T-세포들은 여러가지 특징들을 보일 수 있다.
또 다른 특정 구현예에서, 상기 세포들은 조직 또는 세포들과의 공-배양(co-culturing)에 의해 증식될 수 있다. 상기 세포들은 또한 인-비보, 예를 들어 상기 세포를 대상(subject)에 투여한 후 대상의 혈액에서 증식될 수 있다.
치료적 조성물들 및 적용들
상기 기재된 본 발명의 방법은 조작된 일차 면역 세포들을 그들이 특히 그들의 세포독성 활성과 관련하여 그들의 완전한 면역 치료적 가능성을 유지하도록 약 15 내지 30 일, 바람직하게는 15 및 20 일 사이, 그리고 가장 바람직하게는 18 및 20 일 사이의 제한된 시간 프레임 내에 생산하는 것을 가능하게 한다.
이들 세포들은 바람직하게는 단일 도너 또는 환자로부터 유래하는 세포들의 집단을 형성한다. 이들 세포들의 집단은 최고 제조 관행 요건들(manufacturing practices requirements)을 준수하기 위해 폐쇄된 배양 받는이들(recipients) 하 증식될 수 있고 그리고 환자에게 주입 전에 동결될 수 있어, 이로써 "기성품(off the shelf)" 또는 "즉시 사용 가능한(ready to use)" 치료적 조성물들을 제공할 수 있다.
본 발명에 따라, 동일한 백혈구성분채집으로부터 유래하는 상당한 수의 세포들이 수득될 수 있고, 이는 환자를 치료하기에 충분한 도즈들(doses)을 수득하는데 중요하다. 다양한 도너들로부터 유래하는 세포들의 집단들 사이의 변동들이 관찰될 수 있지만, 백혈구성분채집에 의해 입수되는 면역 세포들의 수는 일반적으로 약 108부터 1010까지 PBMC의 세포들이다. PBMC는 몇몇 타입들의 세포들: 과립구들(granulocytes), 단핵구들(monocytes) 및 림프구들을 포함하고, 그중 T-세포들의 30부터 60%까지, 이는 일반적으로 하나의 도너로부터 108 내지 109 사이의 일차 T-세포들을 나타낸다. 본 발명의 방법은 일반적으로 약 108 T-세포들 초과, 더 일반적으로 약 109 T-세포들 초과, 더욱 더 일반적으로 약 1010 T-세포들 초과, 그리고 보통 1011 T-세포들 초과에 이르는 조작된 면역세포들의 집단으로 보통 끝난다.
따라서 본 발명은 더 특히 치료적으로 효과적인 일차 면역 세포들의 집단에 대한 것이며, 이때 상기 집단에서 세포들의 적어도 30%, 바람직하게는 50%, 더 바람직하게는 80%가 여기에 기재되는 방법들 중 임의의 하나에 따라 변형되어 왔다.
본 발명의 바람직한 측면에 따라, 상기 집단에 포함되는 면역 세포들의 50% 초과가 TCR 음성 T-세포들이다. 본 발명의 더 바람직한 측면에 따라, 상기 집단에 포함되는 면역 세포들의 50% 초과가 CAR 양성 T-세포들이다. 조작된 면역 세포들, 세포들의 집단들, 치료적 조성물들 및 용도들.
본 발명은 특히 치료 조성물로서 사용하기 위해 본원에 기술된 방법에 의해 얻을 수 있는 하나 이상의 속성을 포함하는 조작된 세포의 혼합물을 포함할 수 있는 세포 집단에 초점을 맞추고 있다.
이러한 세포 집단은 일반적으로 상기 유전적 변형(들) 중 하나 이상을 갖는 것이 세포의 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%를 포함한다.
이러한 세포 집단은 본원에 "속성(attributes)"으로도 지칭되는 상기 유전적 변형(들)의 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 보다 더 바람직하게는 적어도 5개를 갖는 면역 세포들을 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%를 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 하기 (표현형) 속성에 의해 특징되는 조작된 면역세포 집단을 포함하는 치료 조성물을 포함한다:
- tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR의 외인성 발현, 및
- B2M 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨; 및/또는
- PD1 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨; 및/또는
- 선택적으로, TCR 발현이 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
- 선택적으로, IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 증가함;
- 선택적으로, TGFβ 발현이 적어도 30%; 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
- 선택적으로, TGFβR2의 디코이의 외인성 발현,
- 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 HYAL1, HYAL2 및 SPAM1의 분비; 및
- 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 GPI1, PCK1 및/또는 LDHA의 발현.
상기 발현 백분율은 이들 표현형 중 적어도 하나를 갖는 집단 내 세포의 80%, 90%, 95% 초과 또는 100%를 반영할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 배양 조건에서 조작되지 않은 세포와의 비교, 예를 들어, 전체 단백질 발현 측정에 의한 비교를 기반으로 한다.
유전자형 관점에서, 본 발명에 따른 세포 집단은 하기와 같은 유전적 특질을 특징으로 할 수 있다:
- 면역세포의 적어도 50%가, tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타냄; 및
- 면역세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, B2M 불활성 대립유전자(들)을 나타냄;
및/또는
- 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 돌연변이된 PD1 대립유전자(들)을 나타냄;
- 선택적으로, T-세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, TCR 불활성 대립유전자(들)을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, IL-12, IL-15 또는 IL-18을 인코딩하는 외인성 도입 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 TGFβR2의 디코이를 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 HYAL1, HYAL2 및/또는 SPAM1을 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 GPI1 PCK1 및/또는 LDHA를 인코딩하는 서열을 나타냄;
- 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 돌연변이된 TGFβ 대립유전자(들)를 나타냄.
상기 백분율은 적어도 하나의 유전적 변형을 포함하는 집단 내 세포의 80%, 90%, 95% 초과 또는 100%를 반영할 수 있다. 상기 백분율은 조작되지 않은 세포와의 비교, 예를 들어 전체 세포 집단 또는 이의 대표 샘플에 대해 수행된 정량적 PCR에 기초한다.
이러한 집단에서, 적어도 하나의 TCR알파 대립유전자는 환자에서의 후속 동종 사용을 위해 세포의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%에서 파괴되는 것이 바람직할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 TCR 알파 유전자는 CAR 자체 또는 dnTGFBRⅡ (SEQ ID NO:59) 또는 두가지 모두와 같은 유전적 속성을 코딩하는 외인성 서열의 삽입에 의해 파괴된다. TGFβR2의 이러한 디코이는 바이러스 벡터 형질도입(두 코딩 서열을 모두 포함하는 rLV 또는 AAV 벡터)시 CAR와 함께 공-발현될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, B2M 및/또는 PD1 대립유전자는 HLA-E (SEQ ID NO:60) 또는 HLA-G (SEQ ID NO:61) 또는 이들과 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 임의의 기능적 서열과 같은 NK 억제제를 인코딩하는 외인성 서열의 삽입에 의해 상기 세포 집단에서 파괴된다.
바람직한 구현예에 따르면, B2M 및/또는 PD1 대립유전자는 IL-12a (SEQ ID NO:63) 및/또는 IL12b (SEQ ID NO:64), IL-15a (SEQ ID NO:66) 또는 IL-18 (SEQ ID NO:68) 또는 이들과 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 임의의 기능적 서열을 인코딩하는 외인성 서열의 삽입에 의해 상기 세포 집단에서 파괴된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 집단은 HYAL1 (SEQ ID NO:69), HYAL2 (SEQ ID NO:70), SPAM1 (SEQ ID NO:71), GPI1 (SEQ ID NO:72), PCK1 (SEQ ID NO:73) 또는 LDHA (SEQ ID NO:74), 또는 이와 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 임의의 기능적 서열을 인코딩하는 외인성 서열을 포함하는데, 이들은 바람직하게는 PD1, CD69, CD25 또는 GMCSF 유전자자리에 삽입된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 집단은 CD52 및/또는 dCK 유전자 대립유전자(들)의 발현을 불활성화하거나 감소시키는 것과 같이 림프구고갈 치료에 대한 내성을 부여하도록 추가로 돌연변이된 세포들을 포함한다.
상기 세포 집단은 바람직하게는 반드시 그런 것은 아니지만 tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR, 예컨대 CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C, CLS MUC1-D를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR를 인코딩하는 이러한 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207 및 SEQ ID NO:208과 각각 적어도 80%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
그러므로 이러한 조성물들 또는 세포들의 집단들은 이를 필요로 하는 환자에서 특히 암을 치료하기 위한, 특히 림프종(lymphoma)을 치료하기 위한, 그러나 또한 고형 종양들 예를 들어 흑색종들(melanomas), 신경모세포종들(neuroblastomas), 신경아교종들(gliomas) 또는 암종들(carcinomas) 예를 들어 폐, 유방, 결장(colon), 전립선(prostate) 또는 난소(ovary) 종양들의 치료를 위한, 의약들(medicaments)로서 사용될 수 있다.
본 발명은 더 특히 단일 도너로부터 유래하는 일차 TCR 음성 T-세포들의 집단들에 대한 것으로, 이때 상기 집단의 세포들의 적어도 20%, 바람직하게는 30%, 더 바람직하게는 50%가 적어도 둘, 바람직하게는 셋의 다른 유전자자리들에서, 서열-특이적 시약들을 사용하여 변형되어 왔다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자들을 치료하기 위한 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 환자 종양 생검의 표면에 존재하는 특정 항원 마커를 결정하는 단계;
(b) 앞서 설명한 본 발명의 방법 중 하나에 의해 조작되고, 바람직하게는 상기 특정 항원 마커에 대한 재조합 수용체를 발현하는 조작된 일차 면역세포 집단을 제공하는 단계;
(c) 상기 조작된 일차 면역세포의 상기 조작된 집단을 상기 환자에게 투여하는 단계,
일반적으로, 상기 세포들의 집단은 CD4 및 CD8 양성 면역 세포들, 예를 들어 T-세포들을 주로 포함하고, 이는 강력한(robust) 인 비보 T-세포 확장을 겪을 수 있고 그리고 인-비트로 및 인-비보에서 연장된(extended) 양의 시간 동안 지속될 수 있다.
본 발명에 따른 조작된 일차 면역 세포들을 포함하는 치료들은 개선(ameliorating), 치유(curative) 또는 예방(prophylactic)적일 수 있다. 그것은 자가 면역요법의 일부 또는 동종 면역요법 치료의 일부일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포 또는 상기 단리된 세포로부터 유래하는 세포주는 고형 종양들, 특히 고형 종양들 예를 들어 보통: 식도암, 유방암, 위암, 담관암종, 췌장암, 결장암, 폐암, 흉선 암종, 중피종, 난소암 및/또는 자궁내막암의 치료를 위해 사용될 수 있다.
성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다.
본 발명에 의한 조작된 면역 세포들로 치료는 항체들 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포(dendritic cell) 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택되는 암에 대한 하나 이상의 요법들과 조합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 상기 치료(treatment)는 면역억제 치료를 받고 있는 환자들에게 투여될 수 있다. 실제로 본 발명은 이러한 면역억제제에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자의 불활성화로 인해, 바람직하게는 적어도 하나의 면역억제제(immunosuppressive agent)에 내성으로 된, 세포들 또는 세포들의 집단에 의존한다. 이 측면에서 면역억제 치료는 환자 내에서 본 발명에 따른 T-세포들의 선택 및 확장을 도울 것이다.
본 발명에 따른 세포들 또는 세포들의 집단의 투여는 에어로졸 흡입(aerosol inhalation), 주사(injection), 섭취(ingestion), 수혈(transfusion), 임플란트(implantation), 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 여기에서 기재되는 조성물들은 환자에게 피하로(subcutaneously), 피내로(intradermally), 종양내로(intratumorally), 결절내로(intranodally), 골수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥내 또는 림프내 주사(intravenous or intralymphatic injection)에 의해, 또는 복강내로(intraperitoneally) 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여된다.
세포들 또는 세포들의 집단의 투여는 그것들 범위들 내의 세포 수들의 모든 정수 값들을 포함하는, kg 체중 당 104-109 세포들, 바람직하게는, 105 내지 106 세포들/kg체중의 투여로 구성될 수 있다. 본 발명은 따라서, 단일 도너의 또는 환자의 샘플링(sampling)으로부터 유래하는 106 내지 108 사이의 유전자 편집된 세포들을 포함하는, 10 초과, 일반적으로 50 초과, 더 일반적으로 100 초과 및 보통 1000 초과 도즈들을 제공할 수 있다.
세포들 또는 세포들의 집단은 하나 이상의 도즈들로 투여될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 유효량(effective amount)의 세포들은 단일 도즈로서 투여된다. 또 다른 구현예에서, 상기 유효량의 세포들은 일정 기간에 걸쳐 하나 하나 초과의 도즈로서 투여된다. 투여의 타이밍은 관리하는 의사(physician)의 판단 내이며 환자의 임상 컨디션에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 집단은 임의의 소스, 예를 들어 혈액 은행 또는 도너로부터 수득될 수 있다. 각각의 필요성은 달라지나, 특정 질환 또는 컨디션들에 대한 주어진 세포 타입의 유효량들의 최적 범위들의 결정은 해당 분야의 기술 내 이다. 유효량은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량(dosage)은 받는이의 연령, 건강 및 체중, 동시(concurrent) 치료의 종류, 만약 있으면, 치료의 빈도 및 원하는 효과의 성질(nature)에 의존할 것이다.
또 다른 구현예에서, 상기 유효량의 세포들 또는 이들 세포들을 포함하는 조성물은 비경구적으로(parenterally) 투여된다. 상기 투여는 정맥 내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내의 주사에 의해 직접 될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예들에서, 세포들은 항바이러스 요법, 시도포비르(cidofovir) 및 인터류킨-2, 시타라빈(Cytarabine)(ARA-C로도 알려짐)과 같은 제제들로 하는 치료 또는 MS 환자들을 위한 나탈리지맙(natalizⅡmab) 치료 또는 건선(psoriasis) 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련된 치료 양식들와 조합(conjunction)하여 (예컨대 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여된다. 추가의 구현예들에서, 본 발명의 T-세포들은 화학요법, 방사선(radiation), 면역 억제제들, 예를 들면 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 마이코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506, 항체들, 또는 다른 면역어블라티브(immunoablative) 제들, 예를 들면 CAMPATH, 항- CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코플리에놀릭산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들(cytokines), 및 방사선 조사(irradiation)와 조합하여 이용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린(cyclosporine) 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도되는 시그널링 에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(라파마이신)(Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). 추가의 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 골수 이식, 하기 어느 하나를 이용한 T-세포 어블라티브(ablative) 요법: 화학요법 제제들, 예를 들면 플루다라빈(fludarabine), 외부-빔 방사선 요법(external-beam radiation therapy)(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체들 예를 들어 OKT3 또는 CAMPATH과 조합하여 (예컨대 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 예컨대 리툭산(Rituxan)인, CD20과 반응하는 제제들과 같이 B-세포 어블라티브 요법 후 투여된다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 대상들은 표준 치료로 높은 도즈 화학요법 그리고 그 후의 말초 혈액 줄기 세포 이식을 받을 수 있다. 특정 구현예들에서, 이식 후, 대상들은 본 발명의 증식된 면역 세포들의 주입을 받는다. 추가적인 구현예에서, 증식된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
본 발명은 또한 특히 환자에서 고형 종양(들)을 치료하는 일반적인 방법에 대한 것으로, 림프구고갈 레지멘으로 상기 환자를 림프구고갈시키는(immunodepleting) 단계 및 상기 고형 종양(들)을 특이적으로 표적화하고 림프구고갈 레지멘에서 사용되는 림프구고갈 제제에 내성으로 된 유전적으로 조작된 림프구들을 주입하는 단계를 포함한다. 이러한 유전적으로 조작된 림프구들은 바람직하게는 CAR 양성 T-세포들이고, 더 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 항-MUC1CAR를 지닌다.
림프구고갈 레지멘은 바람직하게는 CD52, CD3, CD4, CD8, CD45, 또는 다른 특정 마커들과 같은, 면역 세포들의 표면에 존재하는 항원에 대해 지시되는 항체, 또는 약물들 예를 들어 퓨린 유사체들(예: 플루다라빈 및/또는 클로로파라빈) 및 글루코코르티코이드들을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따라, 상기 방법은 CD52에 대해 지시되는 항체를 포함하는 림프구고갈 레지멘에 환자를 따르게 하는(submitting) 단계, 및 CD52의 발현이 감소, 결핍(deficient) 또는 불활성화된(inactivated), 항-MUC1 CAR를 지닌 조작된 CAR T-세포를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 림프구고갈 치료는 항-CD52 항체, 예컨대 알렘투주맙을, 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다. 림프구고갈 레지멘은 예를 들어 일반적으로 1 내지 3일 동안 사이클로포스파미드, 1 내지 5일 동안 플루다라빈, 그리고 1 내지 5일 동안 알렘투주맙을 조합할 수 있다. 일반적으로 림프구고갈 레지멘은 50 및 70mg/kg/일 사이의 사이클로포스파미드, 20 및 40mg/m2/일 사이의 플루다라빈, 및 0.1 내지 0.5mg/kg/일 알렘투주맙을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.
이 목적으로, 본 발명은 고형 종양에 의하여 영향을 받는 환자를 림프구고갈시키기 위한 조성물의 조합된 사용과 제공하고, 상기 조성물은 항-CD52 항체, 및 상기 항체에 민감하지 않은 MUC1을 표적화하는 조작된 림프구들의 집단을 포함하고, 이러한 집단은 바람직하게는 손상된 CD52 발현을 갖고 항-MUC1 CAR를 발현하는 세포들을 포함한다. 이러한 조작된 세포들에서, CD52 유전자의 대립유전자(allele)(들)은 바람직하게는 레어-커팅 엔도뉴클레아제, 예를 들어 이전 기술된 바와 같이 TALE-뉴클레아제 또는 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제에 의해 불활성화되었다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, MUC1 발현 세포에 의해 특징되는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다:
- 이전에 기술한 바와 같은 기능성 항-MUC1 CAR를 발현하도록 도너로부터의 면역세포들을 조작하는 단계;
- tMUC1 에피토프를 발현하는 세포들을 제거하기 위해 상기 CAR 양성 조작된 면역세포들을 환자에게 투여하는 단계.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 환자가 림프구고갈된 이전 치료 단계를 포함한다. 이러한 관점에서, 상기 CAR 양성 조작된 면역세포는 상기 림프구고갈 치료에 대한 내성을 부여하도록 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR 양성 조작된 면역세포는 CD52 유전자에서 돌연변이가 발생하여 알렘투주맙과 같은 항CD52 치료에 내성을 갖게 될 수 있다.
동종이계 설정에 적용될 때, 이러한 프로토콜은 MUC1 발현 세포에 의해 특징되는 질환을 가진 환자를 치료하는 방법으로 간주될 수 있으며, 이때 상기 방법은 (1) 림프구고갈제 및 (2) tMUC1 에피토프에 대해 특이적으로 지시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는, 도너로부터의 동종이계 조작된 면역세포들의 집단의 투여를 조합한다..
본 발명은 또한 고형 종양들 암 치료에 그것의 사용을 위한 상기 림프구고갈 조성물 및 이에 내성인 조작된 세포들의 상기 집단을 포함하는 의료 키트를 제공한다.
"세포용해 활성" 또는 "세포독성 활성" 또는 "세포독성"은 면역세포에 의해 부여되는 표적 세포들의 세포 용해의 백분율을 의미한다.
세포독성을 결정하는 방법들이 하기에 기재된다:
부착성 표적 세포들로: 2.104 특정 표적 항원 (STA)-양성 또는 STA-음성 세포들이 96 웰 플레이트에 웰 당 0.1ml로 시딩된다(seeded). 플레이팅 다음 날, STA-양성 및 STA-음성 세포들이 CellTrace CFSE으로 표지되고 4 시간 동안 4×105 T-세포들과 공-배양된다. 그 다음 세포들이 수확되고, 고정가능한 생존능력 염료(viability dye)(eBioscience)로 염색되고, MACSQuant 유세포 분석기(flow cytometer)(Miltenyi)를 이용하여 분석된다.
현탁액(suspension) 표적 세포들과: STA-양성 및 STA-음성 세포들이 각각 CellTrace CFSE 및 CellTrace Violet으로 표지된다. 약 2×104 ROR1-양성 세포들이 96-웰 플레이트에서 웰 당 0.1ml으로 4×105 T 세포들과 2×104 STA-음성 세포들과 공-배양된다. 4시간 인큐베이션 후, 세포들이 수확되고 고정가능한 생존능력 염료 (eBioscience)로 염색되고 그리고 MACSQuant 유세포 분석기(Miltenyi)를 사용하여 분석된다.
특정 용해(lysis) 비율은 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다.
- "증가된 세포독성(increased cytotoxicity)"에 의해 조작되지 않은 면역 세포에 의해 부여되는 표적 세포들의 % 세포 용해에 비교해, 조작된 면역 세포들에 의해 부여되는 표적 세포들의 % 세포 용해가 적어도 10%, 예를 들어 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100% 이상 증가되는 것이 의미된다.
- "동일성(identity)"은 두 핵산 분자들 또는 폴리뉴클레오타이드들 사이의 서열 동일성을 나타낸다. 동일성은 비교의 목적들로 정렬될 수 있는 각 서열에서 위치를 비교함으로써 결정할 수 있다. 비교되는 서열에서 위치가 동일한 염기에 의해 차지되는 때, 그러면 분자들은 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산의 서열들 사이의 유사성(similarity) 또는 동일성의 정도는 핵산 서열들에 의해 공유되는 위치들에서 동일한 또는 매칭되는 뉴클레오타이드들의 수의 함수이다. 다양한 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이, 예컨대 디폴트 세팅(default setting)으로 이용될 수 있고 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 부분으로서 이용가능한, BLAST 또는 FASTA를 포함하는, 두 서열들 사이의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 여기에 기재되는 특정 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고 바람직하게는 실질적으로 같은 기능들을 보이는 폴리펩타이드들, 및 이러한 폴리펩타이드들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 고려된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명은 본원에 기술된 것들과 적어도 70%, 일반적으로 적어도 80%, 보다 일반적으로 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 97%를 공유하는 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
- 본 명세서에 사용된 용어 "대상(subject)" 또는 "환자(patient)"는 일반적으로 포유동물들, 바람직하게는 영장류들 그리고 더 바람직하게는 인간들을 지칭한다.
본 발명의 상기 설명은 통상의 기술자가 동일한 것을 만들고 사용하는 것이 가능하도록 그것을 만들고 이용하는 프로세스 및 방식을 제공하고, 이 가능하게 하는 것은 특히 원래 설명의 일부를 이루는 첨부된 특허청구범위의 주제를 위하여 제공된다.
수치적 한정 또는 범위가 여기에서 서술될 경우, 엔드포인트들(endpoints)이 포함된다. 또한 수치적 한정 또는 범위 내의 모든 값들 및 서브범위들(subranges)은 마치 명시적으로 작성되는 것처럼 명확하게 포함된다.
본 발명을 개괄적으로 설명했고, 특정 예들로 참조에 의하여 추가의 이해가 수득될 수 있고, 이는 실례(illustration)의 목적들로만 여기에서 제공되고, 청구된 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 인-비트로 실험 및 항-MUC1 CAR-T의 제조
인-비트로 분석을 위한 UCARTMUC1 표적 세포주의 선택:
표적 세포주 T47D(ATCC® HTB-133™) 및 HCC70(ATCC® CRL-2315™)은 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. MUC1 음성 대조 세포주 293FT(R70007)는 ThermoFisher Scientific에서 구입하였다. 모든 세포주는 제조업체 권장 사항에 따라 배양되었다.
종양 관련 MUC1(tMUC1)의 세포 표면 발현은 유세포 분석법을 사용하여 결정되었다. 부착 세포, T47D, HCC70 및 293FT를 Accutase Cell Dissociation Reagent(Biolegend: 423201)를 사용하여 세포 배양 플라스크에서 분리한 후 상업용 항 MUC1 항체 HMFG2(BD Biosciences: 566590) 16A(Biolegend: 355608) 또는 SM3(Invitrogen: 53989382)로 염색하였다. 데이터는 BD FACS CANTO Ⅱ 유세포 분석기에서 수집되었으며 FlowJo에서 분석되었다.
리포터 세포주 T47D-NanoLuc-GFP 및 HCC70-NanoLuc-GFP는, 단일 바이시스트론 전사체를 형성하는 자가 절단 펩타이드 T2A에 의해 분리된 NanoLuciferase(NanoLuc) 및 EGFP를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 rLV를 사용하여 야생형 T47D 및 HCC70 세포를 형질도입함으로써 생성되었다. 리포터 세포주의 MUC1 발현은 상술한 바와 같이 평가되었다.
상위 4개 항-MUC1 scFV들의 인 비트로 특이성:
표 3 내지 6에 기술된 항-MUC1 scFV들(CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D)은 Lake Pharma(201 Industrial Road San Carlos, CA 94070)에 의해 마우스 FC에 재조합 단백질이 융합되는 방식으로 제조되었다. 높은 수준의 정상 MUC1을 발현하는 것으로 알려진 조직: 신장(PCS-400-012), 폐(PCS-300-010) 및 자궁경부(PCS-480-011)으로부터 일차 세포를 ATCC에서 얻었으며, 제조업체 권장 사항에 따라 배양하였다. T47D, HCC70 및 293FT 세포는 (각각) 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. Accutase Cell Dissociation 용액을 사용하여 모든 세포를 분리하고 재조합 scFV-FC 단백질에 이어 PE 접합 염소 항-마우스 FC 감마 특이적 항체(Jackson Immunoresearch: 115-115-164) 또는 상업용 HMFG2 항체(BD Biosciences: 566590)로 염색하였다. BD FACS CANTO Ⅱ 기기에서 데이터를 수집하고 FlowJo로 분석하였다. 비교를 위해 세포를 또한 상업용 항-TROP2 항체(Biolegend(NY18): 363804 및 Miltenyi(REA916): 130-115-055)로 염색하였다. 상기 FlowJo 그래프 분석은 도 2에 표시되어 있으며, 상업용 HMFG2 항체뿐만 아니라 재조합 scFV(MUC1-A-scFV, MUC1-B-scFV, MUC1-C 및 MUC1-D-scFV)가 tMUC1 발현 유방암 세포주 T47D 및 HCC70를 염색하는 것으로 관찰되었으나, 정상 MUC1(신장, 폐 및 자궁경부) 또는 MUC1 음성 대조군 세포주 293FT를 발현하는 조직의 일차 세포를 염색하지는 못하는 것으로 관찰되었다. 이들 결과는 tMUC1에 대한 4개의 scFV 후보군의 강력한 특이성을 입증한다.
MUC1 CAR-T 세포의 생산:
0일차에, AllCells(Alameda, California 94502)로부터 냉동 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동, 세척하고 계수한 다음 5% AB 혈청(GeminiBio: 100-318) 및 20ng/mL 재조합 인간 IL-2(Miltenyi: 130-097-743)가 보충된 X-vivo 15 배지(Lonza: 04-418Q)에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
1일차에, PBMC를 계수하고 유세포 분석기로 분석하여 CD3+ 세포의 %를 평가한 후 원심분리하고 5% AB 혈청, 20ng/mL 인간 IL-2 및 Dynabeads Human T activator CD3/CD28(ThermoFisher #11161D: CD3+ 세포 백만 개당 25㎕)이 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
4일차에, 항 MUC1 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 T 세포 및 rLV 벡터를 5% AB 혈청 및 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁시키고, 레트로넥틴(retronectin) 코팅된 플레이트 위에 접종하였다. 그런 다음 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
5일차에, T-세포를 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 신선한 X-vivo 15 배지에 계대배양하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
7일차에, T-세포를 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 신선한 X-vivo 15 배지에 계대배양하였다. CAR-T 세포가 추가 속성(TCR 및 PD1 넉아웃 및 유도성 IL-12 방출)으로 조작된 경우, 세포는 아침에 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에서 1e6 세포/mL로 계대되었다. 6시간 후, 이전에 보고된 바와 같이 TRAC TALEN (SEQ ID NO:75 및 76)과 PD1 TALEN (SEQ ID NO:77 및 78)의 우측 및 좌측 암(arm) 각각을 인코딩하는 mRNA로 세포를 공-전기천공하였는데[Poirot et al. (2013) Blood. 122 (21): 1661 and Sachdeva et al. (2019) Nat Commun. 10 (1)], TCRα 및 PD-1 유전자를 효율적으로 불활성화하고 일차 T-세포 표면에서 TCRαβ 발현을 방지하였다. TALEN®은 Voytas 등이 WO2011072246에 처음 기술한 바와 같이 Fok1을 뉴클레아제 촉매 도메인으로 사용하는 Cellectis(8, rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)에 의해 설계된 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제의 등록명이다.
AgilePulse 기술을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 15분 동안 두었다. 이 단계 후에 세포를 펠렛화하고 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 200uL의 X-vivo 15 배지로 재현탁하였다. 자가 절단 펩타이드 T2A에 의해 분리된 IL-12 사이토카인 및 LNGFR 리포터 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 AAV6을 50,000개 게놈/세포로 세포에 형질도입하였다.
8일차에 T-세포를 증식을 위해 GRex 장치로 옮겼다. 8일과 18일 사이에 T-세포는 GRex 장치에서 증식되었다. GRex10 또는 GRex 6 다중-웰 세포 배양 플레이트를 사용한 경우 13일차에 배양배지의 75%를 제거하고 IL-2가 포함된 새로운 배지로 교체했으며 11일차와 15일차에 신선한 IL-2를 첨가하였다. 증식 기간 동안, 상기 세포 배양물을 5% CO2 하, 37℃에서 배양하였다.
18일차에 UCART-세포 전체를 나중에 인 비트로 및 인 비보 분석에 사용하기 위해 냉동보존하였다.
차세대 MUC-1 CAR T-세포들 [dnTGFBR2]pos [TCR]neg [B2M]neg [HLA-E]pos [PD1]neg [IL-12/LNGFR]pos를 조작하기 위해, (도 5) 하기 프로토콜이 사용되었다.
0일차에 AllCells(Alameda, California 94502)로부터 냉동 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동, 세척하고 계수한 다음 5% AB 혈청(GeminiBio: 100-318) 및 20ng/mL 재조합 인간 IL-2(Miltenyi: 130-097-743)가 보충된 X-vivo 15 배지(Lonza: 04-418Q)에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
1일차에, PBMC를 계수하고 유세포 분석기로 분석하여 CD3+ 세포의 %를 평가한 후 원심분리하고 5% AB 혈청, 20ng/mL 인간 IL-2 및 Dynabeads Human T activator CD3 CD28(ThermoFisher #11161D: CD3+ 세포 백만개당 25㎕)이 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
3일차에, dnTGFBR2를 갖는 바이시스트론 구조체로부터 발현된 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 T-세포 및 rLV 벡터를 5% AB 혈청 및 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁시키고 레트로넥틴 코팅된 플레이트 위에 시딩하였다. 그런 다음 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
5일차에, TRAC TALEN (SEQ ID NO:75 및 76) 및 B2M TALEN (SEQ ID NO:79 및 80)의 우측 및 좌측 암(arm)을 각각 인코딩하는 mRNA로 T-세포를 공-전기천공하고 30분 후에, 이전에 보고된 프로토콜에 따라 HLA-E AAV6 (SEQ ID NO:85)로 형질도입하여[Poirot et al. (2013) Blood. 122 (21): 1661 and Sachdeva et al. (2019) Nat Commun. 10 (1)], TCRα 및 B2M 유전자를 효율적으로 불활성화하고 일차 T-세포 표면에서 TCRαβ 발현을 방지하였다. TALEN®은 Voytas 등이 WO2011072246에 처음 기술한 바와 같이 Fok1을 뉴클레아제 촉매 도메인으로 사용하는 Cellectis(8, rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)에 의해 설계된 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제의 등록명이다.
6일차에, 조작된 T-세포를 5% AB 혈청 및 20ng/ml IL-2가 보충된 신선한 X-vivo 15 배지에 계대배양하였다.
7일차에, 이전에 보고된 프로토콜에 따라 T-세포를 각각 PD-1 TALEN (SEQ ID NO:77 및 78)의 우측 및 좌측 암을 인코딩하는 mRNA로 전기천공하고, 30분 후에 이전 보고된 바와 같이 IL-12-LNGFR AAV6 (SEQ ID NO:84)로 형질도입하였다.
AgilePulse 기술을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 15분 동안 두었다. 이 단계 후에 세포를 펠렛화하고 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 200㎕의 X-vivo 15 배지로 재현탁하였다. 세포는 5일째에 HLA-E를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 7일째에 자가-절단 펩타이드 T2A에 의해 분리된 IL-12 사이토카인 및 LNGFR 리포터 유전자를 보유하는 AAV6로 50,000개 게놈/세포로 형질도입되었다. 형질도입 후 세포를 30℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮기고 밤새 인큐베이션하였다.
8일차에 T-세포를 증식을 위해 GRex 장치로 옮겼다. 8일과 18일 사이에 T-세포는 GRex 장치에서 증식되었다. GRex10 또는 GRex 6 다중-웰 세포 배양 플레이트를 사용한 경우 13일차에 배양배지의 75%를 제거하고 IL-2가 포함된 새로운 배지로 교체했으며 11일차와 15일차에 신선한 IL-2를 첨가하였다. 증식 기간 동안, 상기 세포 배양물을 5% CO2 하, 37℃에서 배양하였다.
18일차에 UCART-세포 전체를 나중에 인 비트로 및 인 비보 분석에 사용하기 위해 냉동보존하였다.
차세대 MUC-1 CAR T-세포들 [TGFBR2]neg [TCR]neg [B2M]neg [HLA-E]pos [PD1]neg [IL-12/LNGFR]pos를 조작하기 위해, (도 17) 하기 프로토콜이 사용되었다.
0일차에 AllCells(Alameda, California 94502)로부터 냉동 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동, 세척하고 계수한 다음 5% AB 혈청(GeminiBio: 100-318) 및 20ng/mL 재조합 인간 IL-2(Miltenyi: 130-097-743)가 보충된 X-vivo 15 배지(Lonza: 04-418Q)에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
1일차에, PBMC를 계수하고 유세포 분석기로 분석하여 CD3+ 세포의 %를 평가한 후 원심분리하고 5% AB 혈청, 20ng/mL 인간 IL-2 및 Dynabeads Human T activator CD3 CD28(ThermoFisher #11161D: CD3+ 세포 백만개당 25㎕)이 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁하였다. 그런 다음 상기 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
2일차에, MUC1 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 T-세포 및 rLV 벡터를 5% AB 혈청 및 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에 재현탁시키고 레트로넥틴 코팅된 플레이트 위에 시딩하였다. 그런 다음 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 옮겼다.
3일차에, T-세포를 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 신선한 X-vivo 15 배지에 계대배양하였다. CAR-T 세포가 추가 속성(TCR 및 B2M 넉아웃 및 HLA-E)으로 조작된 경우, 세포는 아침에 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에서 1e6 세포/mL로 계대되었다. 6시간 후, 이전에 보고된 바와 같이 TRAC TALEN (SEQ ID NO:75 및 76) 및 B2M TALEN (SEQ ID NO:79 및 80)의 우측 및 좌측 암(arm) 각각을 인코딩하는 mRNA로 세포를 공-전기천공하였는데[Poirot et al. (2013) Blood. 122 (21): 1661 and Sachdeva et al. (2019) Nat Commun. 10 (1)], TCRα 및 B2M 유전자를 효율적으로 불활성화하고 일차 T-세포 표면에서 TCRαβ 발현을 방지하였다. TALEN은 Voytas 등이 WO2011072246에 처음 기술한 바와 같이 Fok1을 뉴클레아제 촉매 도메인으로 사용하는 Cellectis(8, rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France)에 의해 설계된 헤테로다이머 TALE-뉴클레아제의 등록명이다.
AgilePulse 기술을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 15분 동안 두었으며, 이 단계 후에 세포를 펠렛화하고 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 200㎕의 X-vivo 15 배지로 재현탁하였다. 자가-절단 펩타이드 T2A에 의해 분리된 HLA-E 유전자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 보유하는 AAV6을 50,000개 게놈/세포로 세포에 형질도입하였다.
7일차에, T-세포를 추가 속성(TGFBR2 및 PD1 KO 및 IL12 발현)으로 더 조작하였다. T-세포를 5% AB 혈청, 20ng/ml IL-2가 보충된 X-vivo 15 배지에 1e6 세포/mL로 계대되었다. 6시간 후, 이전에 보고된 바와 같이 PD1 TALEN (SEQ ID NO:77 및 78) 및 TGFBR2 TALEN (SEQ ID NO:223 및 224)의 우측 및 좌측 암(arm)을 인코딩하는 mRNA로 세포를 공-전기천공하였는데, TGFBR2 및 PD1 유전자를 효율적으로 불활성화하여, MUC1 인식시 특이적인 IL-12 발현과 T-세포 활성화를 가능하게 한다.
9일차에, T-세포를 증식을 위해 GRex 장치로 옮겼다. 9일과 18일 사이에 T-세포를 때때로 배지 교체하면서 37℃, 5% CO2 하에서 GRex 장치에서 증식되었다.
18일차에, UCART-세포 전체를 나중에 인 비트로 및 인 비보 분석에 사용하기 위해 냉동보존하였다.
여러 TALEN의 공-형질감염으로 인해 발생하는 게놈 온-타겟(on-target) 및 잠재적 오프-타겟(off-target) 부위를 동시에 분석하기 위해, 우리는 이전 분석에서 채택한 차세대 시퀀싱과 결합된 올리고 포획 분석법을 사용하였다(Tsai et al. 2015). 온 타겟만이 높은 점수를 나타냈는데, 이는 UCART MUC1-A [dnTGFBR2]pos [TCR]neg [B2M]neg [HLA-E]pos [PD1]neg [IL-12/LNGFR]pos 세포들을 생성하기 위해 사용된 TRAC, B2M 및 PD1 TALEN의 조합으로는 오프-타겟이 검출되지 않았음을 시사한다(도 9).
표 14: UCART MUC1에 유전적 속성을 도입하기 위해 사용된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열
CAR 발현의 검출:
그런 다음 CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D의 다양한 UCART-세포 제품을 인 비트로에서 평가하였다. CAR 표면 발현은 CAR 구조체의 마우스 F(ab)2 단편을 검출하는 비오틴-SP 접합 염소 항-마우스 F(ab)2 단편 특이적 항체, 또는 CAR ScFv의 인간 F(ab)2 단편을 검출하는 비오틴-SP 접합 염소 항-인간 F(ab)2 단편 특이적 항체, 또는 모든 CAR의 R2 자살 스위치 부분을 인식하는 Alexa Fluor-488 접합 리툭시맙을 사용하여 유세포 분석법으로 평가하였다.
사멸 활성 분석
CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D CAR를 부여받은 MUC1 UCART 세포를 생성하고 상기 기재된 바와 같이 CAR 발현에 대해 시험하였다. 0일차에, 표적 세포인 T47D-NanoLuc-GFP 또는 HCC70-NanoLuc-GFP를 웰당 10,000개의 표적 세포 밀도로 평평한 바닥 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 각각의 완전 배지에 플레이팅하였다. 1일차에, 표적 세포에서 배지를 제거하고 CLS MUC1-A, CLS MUC1-B, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D 또는 비-형질도입(NTD) UCART 세포를 5% AB 혈청이 보충된 X-Vivo 배지에서 CAR+ 효과기 대 표적(E:T) 비율이 5:1, 2.5:1 또는 1:1로 첨가하였다. 표적 세포를 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 48시간 동안 CAR 또는 NTD 대조군과 공-배양하였다. 그 후, NanoLuciferase 신호가 개발되었다. 배지를 제거한 후, 웰을 100㎕의 PBS로 1회 세척한 후 PBS 중 0.026% Triton X-100과 함께 2분 동안 볼텍싱하면서 배양하였다. 총 10㎕의 용해물을 40㎕의 PBS에 희석하고 50㎕의 Nano-Glo 기질과 혼합하고 3분 동안 배양하였다. 인큐베이션 후 발광을 읽었다. 백분율 특이적 용해물은 하기 방정식을 사용하여 계산되었다: % 용해 = (1-(표적 + scFV UCART)/(표적 + NTD UCART))*100.
결과는 도 3의 다이어그램에 표시되어 있으며, 서로 다른 비율 5:1, 2.5:1 또는 1:1에서 4개의 항-MUC1 CAR-T 각각에 대한 용해 %를 나타낸다. 상기 다이어그램은 4개의 CAR 구조체가 각각 부여된 일차 T-세포의 사멸 활성을 농도 의존적 방식으로 보여준다. CLS MUC1-A CAR 구조체에 의해 유도된 사멸 활성은 다른 구조체보다 상당히 높았다.
유방암 종양에서 MUC1 발현을 검출하기 위한 종양 마이크로어레이.
CD8 힌지 및 마우스 IgG1 Fc에 결합된 CLS MUC1-A, CLS MUC1-C 및 CLS MUC1-D scFV를 발현하는 단백질을 CHO 세포에서 생산하고 단백질 A를 사용하여 정제하였다. 84개의 유방암 샘플을 포함하는 인간 파라핀 내장된 조직 마이크로어레이(TMA)를 미국 Biomax사로부터 구입하였다. scFV 단백질은 면역조직화학 분석에 사용되었다. TMA는 자일렌, 100% 에탄올, 96% 에탄올, 70% 에탄올 및 물의 연속 조에서 탈랍되었다. 그런 다음 슬라이드를 반응 완충액으로 세척하고 자동화된 염색을 위해 Discovery XT2 기기에서 염색되었다. 슬라이드를 먼저 반응 완충액과 함께 32분 동안 배양한 후 CAR CLS MUC1-A 및 CLS MUC1-C의 경우 3ug/ml, CAR MUC1-D의 경우 9ug/ml의 1차 항체와 함께 37℃에서 60분간 배양하였다. 그런 다음 항마우스 HRP를 16분간 적용하고 절편을 헤마톡실린과 블루잉 시약으로 염색하였다. 그 후, 슬라이드를 비눗물과 수돗물로 세척하고 최종적으로 현미경으로 장착 및 분석하였다. 특이적 양성 염색은 하기와 같이 등급이 매겨졌다: 1등급: 최소; 2등급: 약간; 3등급: 보통; 4등급: 현저함, 5등급: 강함. 슬라이드는 Leica의 전체 스캐닝 장치 AT2를 사용하여 디지털화되었다(도 19).
실시예 2: 인 비보 항-MUC1 CAR 활성
동물 모델 선택의 이론적 근거
MUC-1 CAR+ T-세포의 인간 특이성 때문에 표준 면역 능력이 있는 동물 모델에 대한 연구는 이종 면역 반응에 의한 인간 T-세포의 신속한 표적화 및 제거로 인해 적용 가능하지 않다. 선택된 동물 모델은 인간 MUC1+ 종양 세포와 인간 CAR T-세포 모두의 생착을 허용하기 때문에 고도로 면역결핍된 NSG 마우스 계통(Jackson laboratory의 NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ 계통)이다.
UCART MUC1 세포 유전적 특성 및 TCR 고갈 검증
실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라 생산되고 CLS MUC1-A CAR로 변형된 UCART-세포의 20% 미만이 TCRαβ+로 남아 있었는데, 이는 TCRα 유전자의 TALEN-매개 불활성화 수준이 세포 집단에서 매우 효율적이었음을 시사한다.
남은 TCRαβ+ 세포는 CAR-T 세포 생산 18일째에 고갈되었다. UCART MUC1 세포를 계수하고, 펠렛화하고, 10e8 세포/mL의 밀도로 0.5% 열 불활성화 FBS를 함유하는 PBS에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 항-TCRα/β-비오틴 항체(Miltenyi CliniMACS TCRα/β 키트: 200-070-407)와 함께 4℃에서 30분 동안 매 10e7 세포당 항체 1.875㎕의 농도로 배양하였다. 배양한 후, 세포를 0.5% FBS를 함유한 5배 부피의 PBS로 세척하고, 10e8 세포/mL로 재현탁한 다음, 10e7 세포마다 3.75㎕의 항비오틴 비드와 함께 4℃에서 30분간 배양하였다(Miltenyi CliniMACS TCRα/β 키트: 200-070-407). 배양한 후, 세포를 이전과 같이 세척하고 1.25e8 세포/mL로 재현탁하고 사전 평형화된 LS 컬럼을 통과시켰다. TCRαβ-세포를 함유하는 플로우 스루(flow through)를 5번의 1mL 세척과 함께 수집하였다. TCRαβ+ 세포의 고갈은 항-TCRαβ-PE-Vio770 항체(Miltenyi: 130-119-617)로 세포를 염색하여 유세포 분석법으로 분석하였다. PD-1 유전자의 불활성화 효율과 IL-12 방출 효율은 PMA/이오노마이신(40ng/mL PMA 및 2nM 이오노마이신)으로 활성화된 CAR-T 세포에서 PD-1과 LNGFR 리포터의 세포 표면 발현을 24시간 동안 직접 비교하여 테스트하였다. 활성화 후, PD-1 및 LNGFR의 세포 표면 발현을 항 PD-1 또는 항 LNGFR 항체로 세포를 염색하여 유세포 분석법으로 테스트하였다. CLS MUC1-A 및 속성으로 변형된 UCART MUC1의 편집 효율성은 PD-1 넉아웃 50% 및 LNGFR+ 4.7%로 계산되었다. NTD 대조군 세포에서도 유사한 값이 달성되었다. 속성 없이 CLS MUC1-A CAR로 변형된 UCART MUC1 세포는 높은 수준의 PD-1(68%)을 발현하고 LNGFR을 발현하지 않았다.
NSG 마우스에서의 HCC70 인간 종양 세포 생착
NSG 마우스는 6주령에 구입하여 이식 1주일 전에 면도하였다. 야생형 HCC70(ATCC® CRL-2315™) 세포를 공급자 권장 사항에 따라 배양하였다. 이식 당일, HCC70 세포의 80-90% 융합 단층(confluent monolayer)을 PBS로 세척한 후 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 Accutase Cell Dissociation Reagent와 함께 배양하였다. Accutase 절단은 1 부피 당량의 완전 성장 배지를 첨가하여 중단되었다. 세포를 300g에서 5분 동안 펠릿화하고 30mL의 PBS로 재현탁한 후 Vi-cell을 사용하여 계수하였다. 계수된 세포를 50mL 코니컬 튜브로 4℃에서 5분 동안 300g로 펠렛화하였다. 펠렛화된 세포를 아이스 상에서 5분 동안 배양한 후 매트리 겔(Corning: 356237)과 PBS의 1:1 혼합물에 100e6 세포/mL 또는 50e6 세포/mL 밀도로 재현탁시켰다. 0일차에, 100㎕의 HCC70 세포 현탁액을 NSG 마우스의 유선 지방층(mammary fat pad)에 이식하여 마우스당 총 10e6 또는 5e6개의 HCC70 세포를 만들었다. 종양 부피는 19일 동안 일주일에 한 번씩 측정되었다. HCC70의 양호한 생착이 관찰되었다.
종양 이식, CAR-T 치료 및 종양 모니터링
도 12에 요약된 바와 같이, 100e6 세포/mL의 밀도로 100㎕의 HCC70-NanoLuc-GFP 세포를 6주령 NSG 균주의 유선 지방층에 주입하였다. 0일차에, 마우스에 각각 10e6 CAR+ UCART CLS MUC1-A 및 비-형질도입된 상응하는 T-세포(NDT) 대조군을 주입하였다. 그룹당 평균 종양 부피가 가장 유사하도록 동물들을 각 치료 그룹에 할당하였다. 종양 부피는 일주일에 한 번씩 측정되었다. 종양 부피가 2000mm3를 초과하거나 종양이 궤양화되면 동물을 희생시켰다.
도 11 및 13은 각각 유선 지방 이식 후 또는 피하 종양 이식 후 7일째에 치료를 시작하고 표시된 날짜 동안 종양 부피를 추적한 실험 결과를 보여준다. CLS MUC1-A CAR가 부여된 T-세포로 처리된 마우스는 약 28일까지 종양이 없는 반면, 대조군은 동일한 종양의 부피가 기하급수적으로 증가한 것으로 관찰될 수 있다.
인 비보 주입을 위해 조작된 CAR-T 세포:
UCART-세포를 CLS MUC1-A CAR로 조작 및 형질도입하였으며 속성(CAR-T CLS MUC1-A 또는 UCART CLS MUC1-A + 속성) 유무에 관계없이 비교를 수행하였다. 속성은 TCR 넉아웃, PD-1 넉아웃 및 IL-12 방출로 구성되었다. 유사하게, 속성(NTD 및 NDT + 속성)이 있거나 없는 비-형질도입 대조군(NTD: CAR 음성 대조군 T-세포)을 생산하였다. CAR-T 세포는 위에서 설명한 대로 생산되었으며, 사전 동결 없이 생산 후 신선하게 주입되었다. 생산에 약간의 수정이 구현되었다. CAR-T 세포 생산 18일차에 세포를 G-rex에서 꺼내어 2e6 세포/mL로 재현탁하고 일반 조직 배양 플라스크에 시딩하였다. 생산 20일차에 세포를 PBS로 1회 세척하고, 계수 및 100e6 CAR+ 세포/mL로 농축하였다. 총 100㎕의 UCART 제품 또는 대조군을 정맥 주사하였다.
UCART-세포를 CLS MUC1-A 또는 CLS MUC-1 C로 형질도입하고 TCR KO, PD1-KO 및 IL-12 통합을 위해 추가로 조작하였다. CAR-T 세포는 위에서 설명한 대로 생산되었다. 조작된 T-세포는 10e6 또는 3e6 CAR+ UCARTMUC1-A나 UCARTMUC1-C, 또는 3e6이나 10e6 총 비-형질도입 T-세포(NTD) 대조군(동일 도너로부터의)이나 PBS를 사용하여 생산에서 신선하게 주입되었다. 종양 부피는 CLS MUC1-A 또는 CLS MUC1-C 조작된 CAR-T 세포로 치료한 후 일주일에 한 번씩 측정되었다. 종양 부피가 2000mm3을 초과하거나 종양이 궤양화되면 동물을 희생시켰다(도 18A). 결과는 CLS MUC1-A를 보유하는 UCART가 주입된 3백만 개의 세포에서, 및 심지어는 1천만 개의 세포에서 종양 성장을 방지할 수 있고 최고의 생존을 제공할 수 있음을 입증한다(도 18B 및 C).
UCARTMUC1 +/- 속성으로 처리된 종양 샘플의 FACS 분석
CLS MUC1-A로 형질도입된 CAR-T 세포와, 속성(PD-1 및 TCR 넉아웃 및 IL-12 방출)을 가진 것 또는 가지지 않은 것, 또는 NTD 세포(속성을 가진 것 또는 가지지 않은 것)로 이전에 설명한 대로 처리한 마우스로부터 종양을 분리하였다. 종양을 Accutase Cell Dissociation Reagent로 균질화하고 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 30분 동안 옮겼다. 해리된 세포를 3% FBS가 포함된 20mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 100um 메쉬를 통과시켰다. 종양 분리물을 vi-세포에서 계수하고 FACS 분석을 위해 염색하였다.
종양에서의 CAR-T 세포 침윤 및 종양 세포에서의 MUC1 발현을 검사하고, 항원 탈출을 나타내는 MUC1 발현의 손실이 있는지 확인하기 위해 세포를 고정 가능한 생존 염료 e780으로 염색하고 생존가능한 세포상에 게이트하였는데, 항인간 HLA-ABC-VioBlue 및 항-마우스 MHCⅡ-PE를 사용하여 인간 세포상에 게이트하고, 항-인간 CD45 및 항-인간 EpCAM을 사용하여 상피 종양 세포를 게이트하고, 마지막으로 항-MUC1(HMFG2 또는 16A) 항체 또는 이에 상응하는 이소형(isotype) 대조군을 사용하여 개별 마우스로부터 분리된 종양에서 MUC1 발현을 결정한다.
도 10 및 14에 나타낸 바와 같이, FACS 데이터를 FlowJo에서 분석하고, 각 동물로부터의 생존 가능한 인간 상피 세포 중 MUC1 양성 세포의 백분율에 해당하는 값을 Excell로 내보내고 각 처리군에 대한 평균으로 표시하였다. 각 종양 분리주에 대해 모든 생존 가능한 인간 세포(Viability e780-, hHLA-ABC+) 중 CAR-T 세포(hCD45+) 및 종양 세포(hEpCAM+)의 빈도를 개별 데이터 포인트와 각 치료 그룹에 대한 평균으로 표시하였다.
결과는 속성(PD1/TRAC 넉아웃 및 IL-12 방출)으로 조작된 CAR-T 세포가 속성이 없는 CAR-T 세포보다 훨씬 더 높은 빈도로 HCC70 종양에서 발견되었음을 보여주었다.
이러한 결과는 속성을 추가하면 종양 침윤 및/또는 종양 내 CAR-T 세포 증식이 향상된다는 것을 시사한다. 강화된 종양 침윤은 관찰된 항-종양 반응을 지지하며 이는 이전에 도 12에서 관찰된 결과와 일치하였다.
전반적으로, 이러한 결과는 고형 종양 치료에서 완전한 반응을 달성하는 데 속성 추가가 중요하다는 점을 시사한다.
CLS MUC1-A 또는 CLS MUC1-C 조작된 CART-세포로 처리된 마우스의 종양을 54일차에 마우스로부터 분리하고(도 18A), Accutase Cell Dissociation Reagent로 균질화하고 37℃, 5% CO2로 설정된 인큐베이터로 30분간 옮겼다. 해리된 세포를 3% FBS를 함유한 20mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 30개를 100um 메쉬로 통과시켰다. 종양 분리물을 vi-세포에서 계수하고 FACS 분석을 위해 염색하였다. 종양 내 CAR-T 세포 침윤을 조사하기 위해, 고정 가능한 생존 염료 e780을 사용하여 생존 가능한 세포를 확인하고, 인간 항-CD45 항체 및 마우스 항-CD45 항체를 사용하여 인간 CAR T-세포를 동정하였다. MUC-1A 및 MUC1-C 조작된 CAR-T 세포 모두, 주입된 10e6 CLS MUC1-A 조작된 CAR-T 세포에 대해 40% 초과의 평균값으로 시험처리 후 54일에 종양에서 검출될 수 있었다(도 18D).
적대적인 종양 미세환경에서 CAR-T 세포 증식, 침윤 및 효과기 기능은 수많은 종양 내 요인에 의해 억제될 수 있다. 따라서 가장 활동적인 CAR라도 추가 특질없이는 임상적 항-종양 반응을 거의 달성할 수 없다. 여기에서 우리는 CAR-T 세포 고갈을 제한하는 PD1 넉아웃과 같은 속성과 유도성 IL-12 방출을 조합함으로써 미세환경 장벽을 성공적으로 제거하여 T-세포 효능을 향상시킬 수 있음을 보여준다. 본 발명에 포함된 속성은 고형 종양에 대한 성공적인 CAR-T 세포주 개발의 효능을 증가시키는 전략을 배가시킬 수 있다.
또한 상기 결과로부터 MUC1 CAR T-세포를 조작하는 것은 고형 종양, 특히 트리플 음성 유방암을 표적으로 하는 상황에서 효능을 강화하고 동종 지속성을 개선하는 유망한 접근법임이 자명하다.
SEQUENCE LISTING <110> Cellectis S.A. <120> NEW ANTI-MUC1 CARS AND GENE EDITED IMMUNE CELLS FOR SOLID TUMORS CANCER IMMUNOTHERAPY <130> P345232PC00 <150> US63/182,330 <151> 2021-04-30 <150> PA202170361 <151> 2021-07-06 <160> 239 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> MUC1 hypoglycosylated epitope region <400> 1 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ala 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8慣; signal peptide <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> R2 suicide switch <400> 3 Ser Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro 1 5 10 15 Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser 20 25 30 Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> homo sapiens <220> <223> CD8慣; hinge <400> 4 Thr Thr Thr Pro 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DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 95 cctgggaaac cggcaagacg cgg 23 <210> 96 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 96 acagatatgg caactcccag tgg 23 <210> 97 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 97 gtggaggtga gcaatccccc ggg 23 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 98 acctacagga gtacctgacg cgg 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 99 gtgatcacac tccatgtggg agg 23 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 100 gctggtgtta tattctgatg ggg 23 <210> 101 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 101 cacagtgatc acactccatg tgg 23 <210> 102 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 102 cacatggagt gtgatcactg tgg 23 <210> 103 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 103 cagagtaggg tccagacgca ggg 23 <210> 104 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 104 gcttctgctg ccggttaacg cgg 23 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 105 gtggatgacc tggctaacag tgg 23 <210> 106 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 106 gggaaagccc aaagtcacac agg 23 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 107 aatatgacta gcaacaagtc agg 23 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 108 atggagtgtg atcactgtgg agg 23 <210> 109 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 109 atcaccgcct tccacgccaa ggg 23 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 110 aggagcggaa gacggagttg ggg 23 <210> 111 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 111 ccacgccaag ggcaacctac agg 23 <210> 112 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 112 caagatgccc atcgtgcaca ggg 23 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 113 gatatggcaa ctcccagtgg tgg 23 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 114 agcagaagct gagttcaacc tgg 23 <210> 115 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 115 cctgtaggtt gcccttggcg tgg 23 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 116 gtgagcaatc ccccgggcga ggg 23 <210> 117 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 117 acagagtagg gtccagacgc agg 23 <210> 118 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 118 gacgcggcat gtcatcagct ggg 23 <210> 119 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 119 ggtcatccac agacagagta ggg 23 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 120 agtcaagatc tttccctatg agg 23 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 121 gaacatactc cagttcctga cgg 23 <210> 122 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 122 acgtggagct gatgtcagag cgg 23 <210> 123 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 123 ggggaaaggt cgctttgctg agg 23 <210> 124 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 124 tctggaccct actctgtctg tgg 23 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 125 tgggcagctc cctcgcccgg ggg 23 <210> 126 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 126 agctgatgac atgccgcgtc agg 23 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 127 gccgcgtcag gtactcctgt agg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 128 caagaggcat actcctcata ggg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 129 ggtgagcaat cccccgggcg agg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 130 ttgctggtgt tatattctga tgg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 131 cctatgagga gtatgcctct tgg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 132 tgctggtgtt atattctgat ggg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 133 cgaggatatt ggagctcttg agg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 134 gttgatgttg ttggcacacg tgg 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 135 tgacgcggca tgtcatcagc tgg 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 136 ttgagctgga caccctggtg ggg 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 137 ttcagagcag tttgagacag tgg 23 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> 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targetting TGFbetaRII gene <400> 145 gtcgttcttc acgaggatat tgg 23 <210> 146 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 146 catcagcctc ctgccaccac tgg 23 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 147 agttcctgac ggctgaggag cgg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 148 actccagttc ctgacggctg agg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 149 cttgaggtcc ctgtgcacga tgg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 150 ttgaggtccc tgtgcacgat ggg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 151 ccgcgtcttg ccggtttccc agg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 152 gttgcccttg gcgtggaagg cgg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 153 ctttgggctt tccctgcgtc tgg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 154 gatcaccgcc ttccacgcca agg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 155 tgaagtgttc tgcttcagct tgg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 156 ctgtgcacga tgggcatctt ggg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 157 ggcatcttgg gcctcccaca tgg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 158 ttacctgccc actgttagcc agg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 159 atcagcctcc tgccaccact ggg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 160 tcgctttgct gaggtctata agg 23 <210> 161 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 161 agtcacacag gcagcaggtt agg 23 <210> 162 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 162 gaggagcgga agacggagtt ggg 23 <210> 163 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 163 tgggcagcag ctctgtgttg tgg 23 <210> 164 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 164 tagcaacaag tcaggattgc tgg 23 <210> 165 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 165 ccaagatgcc catcgtgcac agg 23 <210> 166 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 166 tgtggaggtg agcaatcccc cgg 23 <210> 167 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 167 tgcctcttgg aagacagaga agg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 168 gcccattgag ctggacaccc tgg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 169 ctgagttcaa cctgggaaac cgg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 170 tgggaggacc tgcgcaagct ggg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 171 gtactcctgt aggttgccct tgg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 172 tcttccgctc ctcagccgtc agg 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> artificial <220> <223> sgRNA sequence targetting TGFbetaRII gene <400> 173 ctgggcagct ccctcgcccg ggg 23 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> 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Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 237 <211> 114 <212> PRT <213> artificial <220> <223> MUC1-A VL humanized L3 <400> 237 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 238 <211> 114 <212> PRT <213> artificial <220> <223> MUC1-A VL humanized L4 <400> 238 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 239 <211> 114 <212> PRT <213> artificial <220> <223> MUC1-A VL humanized L5 <400> 239 Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala

Claims (77)

  1. 적어도 하기를 포함하는 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR):
    - tMUC1 에피토프(들)을 표적으로 하는 단일클론 항체로부터의 VH 및 VL을 포함하는 세포외 리간드 결합-도메인;
    - 막관통 도메인; 및
    - CD3 제타 시그널링 도메인 및 공-자극 도메인을 포함하는 세포질 도메인
    이때 상기 세포외 리간드 결합-도메인은 MUC1 항원 폴리펩타이드 영역 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO:1)에 대해 지시된다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포외 리간드 결합-도메인이 MUC1-A (SEQ ID NO:17), MUC1-B (SEQ ID NO:27), MUC1-C (SEQ ID NO:37) 및/또는 MUC1-D (SEQ ID NO:47)와 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 ScFv를 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CAR이 하기를 포함하는 항-MUC1 CAR:
    - SEQ ID NO:11 (CDR-VL1-A), SEQ ID NO:12 (CDR-VL2-A) 및 SEQ ID NO:13 (CDR-VL3-A)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운(VL) 사슬, 및
    - SEQ ID NO:14 (CDR-VH1-A), SEQ ID NO:15 (CDR-VH2-A) 및 SEQ ID NO:16 ( CDR-VH3-A)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운(VL) 사슬.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:9 (MUC1-A fullVH) 및 SEQ ID NO:10 (MUC1-A fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CAR이 하기를 포함하는 항-MUC1 CAR:
    - SEQ ID NO:21 (CDR-VL1-B), SEQ ID NO:22 (CDR-VL2-B) 및 SEQ ID NO:23 (CDR-VL3-B)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운(VL) 사슬, 및
    - SEQ ID NO:24 (CDR-VH1-B), SEQ ID NO:25 (CDR-VH2-B) 및 SEQ ID NO:26 ( CDR-VH3-B)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운(VH) 사슬.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:19 (MUC1-B fullVH) 및 SEQ ID NO:20 (MUC1-B fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CAR이 하기를 포함하는 항-MUC1 CAR:
    - SEQ ID NO:31 (CDR-VL1-C), SEQ ID NO:32 (CDR-VL2-C) 및 SEQ ID NO:33 (CDR-VL3-C)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운(VL) 사슬, 및
    - SEQ ID NO:34 (CDR-VH1-C), SEQ ID NO:35 (CDR-VH2-C) 및 SEQ ID NO:36 ( CDR-VH3-C)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운(VH) 사슬.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:29 (MUC1-C fullVH) 및 SEQ ID NO:30 (MUC1-C fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CAR이 하기를 포함하는 항-MUC1 CAR:
    - SEQ ID NO:41 (CDR-VL1-D), SEQ ID NO:42 (CDR-VL2-D) 및 SEQ ID NO:43 (CDR-VL3-D)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 가벼운(VL) 사슬, 및
    - SEQ ID NO:44 (CDR-VH1-D), SEQ ID NO:45 (CDR-VH2-D) 및 SEQ ID NO:46 ( CDR-VH3-D)과 각각 적어도 90% 동일성을 갖는 CDR을 포함하는 가변 무거운(VH) 사슬.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포외 리간드 결합-도메인이 SEQ ID NO:39 (MUC1-D fullVH) 및 SEQ ID NO:40 (MUC1-D fullVL)과 각각 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VH 및 VL 사슬을 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬의 막관통 영역(들), PD-1, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 엡실론(epsilon), CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80 , CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 유래된, 항-MUC1 CAR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8α로부터의 SEQ ID NO:5와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하는, 항-MUC1 CAR .
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포외 리간드-결합 도메인과 상기 막관통 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 힌지는 CD8α 힌지, IgG1 힌지 및 FcγRⅢα 힌지로부터 선택되는, 항-MUC1 CAR.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 힌지는 SEQ ID NO:4 (CD8α)와 각각, 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 공유하는, 항-MUC1 CAR .
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR는 SEQ ID NO:4에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 CD8α 힌지 및 SEQ ID NO:5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 CD8α 막관통 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 구조를 갖는, 항-MUC1 CAR.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    표 8로부터 선택되는 에피토프를 포함하는 안전 스위치를 추가로 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 안전 스위치는 리툭시맙에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프 CPYSNPSLC (SEQ ID NO:49)를 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CAR는 4-1BB 또는 CD28로부터의 공-자극 도메인을 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 공-자극 도메인은 4-1BB로부터 유래되고/되거나 SEQ ID NO:6와 적어도 80% 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CD3 제타 시그널링 도메인은 SEQ ID NO:7과 적어도 80% 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호 펩타이드를 추가로 포함하는, 항-MUC1 CAR.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 CAR는 SEQ ID NO:18 (CLS MUC1-A CAR)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 CAR는 SEQ ID NO:28 (CLS MUC1-B CAR)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 CAR는 SEQ ID NO:38 (CLS MUC1-C CAR)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 CAR는 SEQ ID NO:48 (CLS MUC1-D CAR)과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 99% 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 항-MUC1 CAR.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  28. 렌티바이러스 벡터와 같은, 제27항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  29. 제27항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 제28항에 따른 발현 벡터를 포함하는 조작된 면역세포.
  30. 세포 표면에서 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 항-MUC1 CAR를 발현하는 조작된 면역세포.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서,
    상기 면역세포는 T-세포 또는 NK 세포인, 조작된 면역세포.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 T-세포 또는 NK 세포는 일차 세포로부터 유래되거나 iPS 세포와 같은 줄기 세포로부터 분화된 것인, 조작된 면역세포.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR의 발현이 상기 면역세포에서 감소되거나 또는 억제되는, 조작된 면역세포.
  34. 제33항에 있어서,
    TCR알파 또는 TCR베타를 인코딩하는 적어도 하나의 유전자가 상기 세포에서 불활성화된, 조작된 면역세포.
  35. 제34항에 있어서,
    TCR알파 또는 TCR베타를 인코딩하는 상기 적어도 하나의 유전자가 레어-커팅 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는, 조작된 면역세포.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 내인성 프로모터의 전사 제어 하의 내인성 유전자자리, 바람직하게는 TCR알파 또는 TCR베타 유전자자리에 통합된, 조작된 면역세포.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    환자의 동종이계 사용(allogeneic use)을 위한 도너로부터 유래되는, 조작된 면역세포.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 항-CD52 항체와 같은, 적어도 하나의 면역 억제 약물에 내성을 부여하도록 돌연변이된, 조작된 면역세포.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 특히 퓨린 유사체 약물인, 적어도 하나의 화학요법 약물에 내성을 부여하도록 추가로 돌연변이된, 조작된 면역세포.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 환자에 대한 지속성 또는 수명을 개선하기 위해, 특히 HLA 또는 B2m과 같은 MHCI 요소(들)을 인코딩하는 유전자로 돌연변이된, 조작된 면역세포.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 그의 CAR-의존성 면역 활성화를 개선하기 위하여, 특히 면역 체크포인트 단백질들 및/또는 이의 수용체의 발현을 감소 또는 억제하도록 돌연변이된, 조작된 면역세포.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-MUC1 CAR는 TGF베타 수용체의 억제제 또는 디코이(decoy)를 인코딩하는 또 다른 외인성 유전적 서열과 함께 상기 세포에서 공-발현되는, 조작된 면역세포.
  43. 제42항에 있어서,
    상기 TGF베타 수용체의 디코이(decoy)는 SEQ ID NO:59와 적어도 80% 폴리펩타이드 서열 동일성을 갖는 것과 같은, 도미넌트 음성 TGF베타 수용체(dnTGFβRⅡ)인, 조작된 면역세포.
  44. 제35항에 있어서,
    상기 세포는 상기 항-MUC1 CAR를 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오타이드 서열, 2A 자가-절단 펩타이드를 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 도미넌트 음성 TGF베타 수용체를 인코딩하는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조작된 면역세포.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 감소 또는 불활성화된 적어도 하나의 TGF베타 수용체 유전자 발현을 갖는, 조작된 면역세포.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 TGF베타 수용체 유전자는 TGFβRⅡ인, 조작된 면역세포.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)는 하기를 인코딩하는 것으로부터 선택되는 또 다른 외인성 유전적 서열과 함께 상기 세포에서 공-발현되는, 조작된 면역세포:
    - NK 세포 억제제, 예를 들어 HLAG, HLAE 또는 ULBP1;
    - CRS 억제제, 예를 들어 돌연변이된 IL6Ra, sGP130 또는 IL18-BP이고; 또는
    - 사이클로포스파미드 및/또는 이소포스파미드와 같은, 약물에 대한 상기 면역세포들의 과민성을 부여하는, 사이토크롬(들) P450, CYP2D6-1, CYP2D6-2, CYP2C9, CYP3A4, CYP2C19 또는 CYP1A2,
    - 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 이노신 모노포스페이트 탈수소효소 2(IMPDH2), 칼시뉴린 또는 메틸구아닌 전이효소(MGMT), mTORmut 또는 Lckmut이며, 약물 내성을 부여함
    - 케모카인 또는 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-12, IL-15 및 IL-18;
    - 히알루로니다제, 예를 들어 HYAL1, HYAL2 및 SPAM1;
    - 케모카인 수용체들, 예를 들어 CCR2, CXCR2 또는 CXCR4;
    - 면역세포들의 치료적 활성을 향상시키기 위한, CCR2/CCL2 중화제와 같은 종양 관련 대식세포들(TAM)의 분비된 억제제; 및/또는
    - 대사 효소들, 예를 들어 글루코스 포스페이트 아이소머라제 1(GPI1), 젖산염 탈수소효소(LDHA) 및/또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 1(PCK1).
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료에 사용하기 위한, 조작된 면역세포.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료용 약제로 사용하기 위한, 조작된 면역세포.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    MUC1 양성 세포들에 의하여 특징되는 전-악성(pre-malignant) 또는 악성 암 상태의 치료에 사용하기 위한, 조작된 면역세포.
  51. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    식도암, 유방암, 위암, 담관암종, 췌장암, 결장암, 폐암, 흉선암종, 중피종, 난소암, 및 자궁내막암(endometrial cancer)으로부터 선택되는 암 상태의 치료에 사용하기 위한, 조작된 면역세포.
  52. 고형 종양의 치료를 위해 포유류에서 동종이계 용도로 tMUC1 에피토프에 대해 특이적으로 지시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 조작된 면역세포에 있어서, 상기 CAR에 의해 표적화되는 상기 tMUC1 에피토프는 서열 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO:1)의 절단된 글리칸 펩타이드에 포함되는, 조작된 면역세포.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 면역세포는 제29항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른, 조작된 면역세포.
  54. 하기 단계들을 포함하는, 고형 종양 치료를 위해 조작된 치료적 면역세포 집단을 제조하는 방법:
    e) 환자 또는 바람직하게는 도너로부터 유래된 면역세포를 제공하는 단계;
    f) 상기 세포에서 항-MUC1 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 단계;
    g) 상기 세포의 게놈에 적어도 하나의 유전적 변형(들)을 도입하는 단계로서, 상기 변형(들)은 하기를 초래하는 것 중에서 선택되는 단계:
    - TCR 발현의 감소 또는 불활성화;
    - B2M의 감소 또는 불활성화;
    - TGFβ와 TGFβR2 사이의 상호작용 감소;
    - PD1과 PDL1 사이의 상호작용 감소; 및/또는
    - 향상된 IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현;
    h) 상기 세포들을 증식하여 치료적으로 효과적인 면역세포 집단을 형성하는 단계.
  55. 제54항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 레어-커팅 엔도뉴클레아제/니카제 또는 염기 편집자와 같은 서열 특이적 유전자 편집 시약을 사용함으로써 획득되는, 방법.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서,
    상기 면역세포는 HYAL1, HYAL2 및/또는 HYAL3(SPAM1)과 같은, 히알루리나제의 분비를 향상시키도록 추가로 유전적으로 조작되는, 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역세포는 상기 세포 내로의 GPI1, PCK1 및/또는 LDHA의 발현을 향상시키도록 추가로 유전적으로 조작되는, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 상기 CAR는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 CAR인, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 세포 집단.
  60. 제59항에 있어서,
    상기 집단 내 상기 세포의 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가 상기 유전적 변형(들) 중 적어도 하나를 갖는, 세포 집단.
  61. 제59항에 있어서,
    상기 집단 내 상기 세포의 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가 상기 유전적 변형(들) 중 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 보다 더 바람직하게는 적어도 5개를 갖는, 세포 집단.
  62. 하기 (표현형) 속성에 의해 특징되는 조작된 면역세포 집단을 포함하는 치료 조성물:
    - tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR의 외인성 발현, 및
    - B2M 발현이 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨; 및/또는
    - PD1 발현이 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨; 및/또는
    - 선택적으로, TCR 발현이 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90% 감소됨;
    - 선택적으로, IL2, IL-12, IL-15 또는 IL-18 발현이 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 증가함;
    - 선택적으로, TGFβ 발현이 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75% 감소됨;
    - 선택적으로, TGFβR2의 디코이의 외인성 발현,
    - 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 HYAL1, HYAL2 및 SPAM1의 분비; 및
    - 선택적으로, 외인성 코딩 서열의 도입에 의한 GPI1, PCK1 및/또는 LDHA의 발현.
  63. 하기 (유전자형) 속성에 의해 특징되는 조작된 면역세포 집단을 포함하는 치료 조성물:
    - 면역세포의 적어도 50%가, tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 CAR를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타냄; 및
    - 면역세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, B2M 불활성 대립유전자(들)을 나타냄;
    및/또는
    - 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 돌연변이된 PD1 대립유전자(들)을 나타냄;
    - 선택적으로, T-세포의 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%가, TCR 불활성 대립유전자(들)을 나타냄;
    - 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-18을 인코딩하는 외인성 도입 서열을 나타냄;
    - 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 TGFβR2의 디코이를 인코딩하는 서열을 나타냄;
    - 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 HYAL1, HYAL2 및/또는 SPAM1을 인코딩하는 서열을 나타냄;
    - 선택적으로, 면역세포의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 이들 게놈에 외인적으로 삽입된 GPI1 PCK1 및/또는 LDHA를 인코딩하는 서열을 나타냄;
    - 선택적으로, 면역세포의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 75%가, 돌연변이된 TGFβ 대립유전자(들)를 나타냄.
  64. 제63항에 있어서,
    적어도 하나의 TCR알파 대립유전자가 파괴되는, 치료 조성물.
  65. 제64항에 있어서,
    상기 TCR 알파는 외인성 코딩 서열의 삽입에 의해 파괴되는, 치료 조성물.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 코딩 서열은 dnTGFβR2 (SEQ ID NO:59)와 같은 TGFβR2의 디코이를 인코딩하는, 치료 조성물.
  67. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 외인성 코딩 서열은 TGFβR2의 디코이를 인코딩하고, 이러한 dnTGFβR2가 바람직하게는 바이러스 벡터 삽입시에 CAR와 공-발현되는, 치료 조성물.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 B2M 대립유전자는 HLA-E (SEQ ID NO:60) 또는 HLA-G (SEQ ID NO:61)와 같은, NK 억제제를 인코딩하는 외인성 서열의 삽입에 의해 파괴되는, 치료 조성물.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-12a (SEQ ID NO:63) 및/또는 IL12b (SEQ ID NO:64), IL-15a (SEQ ID NO:66) 또는 IL-18 (SEQ ID NO:68)을 인코딩하는 상기 외인성 서열은, 상기 PD1 및/또는 TGFβ 돌연변이된 대립유전자(들)에 삽입되는, 치료 조성물.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    HYAL1 (SEQ ID NO:69), HYAL2 (SEQ ID NO:70), SPAM1 (SEQ ID NO:71), GPI1 (SEQ ID NO:72), PCK1 (SEQ ID NO:73) 또는 LDHA (SEQ ID NO:74)를 인코딩하는 상기 외인성 서열은, PD1, CD69, CD25 또는 GMCSF 유전자자리에 삽입되는, 치료 조성물.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역세포는 CD52 및/또는 dCK 유전자 대립유전자(들)의 발현을 불활성화하거나 감소시키는 것과 같이, 림프구고갈 치료에 대한 내성을 부여하기 위해 추가로 돌연변이되는, 치료 조성물.
  72. 제34항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서,
    tMUC1 에피토프를 표적으로 하는 상기 CAR는 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 CAR인, 치료 조성물.
  73. 하기 단계들을 포함하는, MUC1 발현 세포에 의해 특징되는 질환을 갖는 환자를 치료하는 방법:
    - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 기능성 항-MUC1 CAR를 발현하도록 도너로부터의 면역세포들을 조작하는 단계;
    - tMUC1 에피토프를 발현하는 세포들을 제거하기 위해 상기 CAR 양성 조작된 면역세포들을 환자에게 투여하는 단계.
  74. 제73항에 있어서,
    상기 환자가 림프구고갈되는(lymphodepleted) 추가의 치료 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  75. 제74항에 있어서,
    tMUC1 에피토프를 발현하는 세포들을 제거하는 상기 CAR 양성 조작된 면역세포들은, 림프구고갈 치료에 대한 내성을 부여하도록 돌연변이되는, 환자를 치료하는 방법.
  76. 제75항에 있어서,
    상기 CAR 양성 조작된 면역세포들은 그의 CD52 유전자에서 돌연변이되는, 환자를 치료하는 방법.
  77. MUC1 발현 세포에 의해 특징되는 질환을 가진 환자를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 (1) 림프구고갈제 및 (2) tMUC1 에피토프에 대해 특이적으로 지시된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는, 도너로부터의 동종이계 조작된 면역세포들의 집단의 투여를 조합하는, 환자를 치료하는 방법.
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