KR101777252B1 - T 세포의 prrsv 증식 억제능 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법 및 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포의 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명의 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법은 직접적으로 돼지를 이용하지 않고도 실험실 내 in vitro 상에서 평가 가능하고, 또한, T 세포가 추출된 세포의 개체와 동일 개체(autologous) 혹은 동일 유전자형을 가진 다른 개체(heterologous)에 대한 PRRSV 증식 억제를 확인할 수 있는 효과가 있어, 백신 및 면역 증강제의 효능 평가 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

T 세포의 PRRSV 증식 억제능 평가 방법{Method for evaluating suppression ability of T cell for PRRSV infected-cells}
본 발명은 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법 및 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포에 대한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
병원체(pathogen)는 질병의 원인이 되는 미생물을 말하며, 병원체의 종류로서는 바이러스, 리케치아, 세균, 진균, 원충, 연충류 등이 있다. 감염증의 발생에는 병원체의 존재는 필요조건이나 충분조건은 아니다. 즉 병원체의 독력, 양 등의 조건이 필요하며, 감염개체의 감수성, 감염경로 등의 요인이 존재하지 않으면 발생에 미치지 않는다. 돼지에는 다양한 병원체가 원인이 되어 돼지 콜레라(Swine Fever), 구제역(Foot and mouth Disease), 대장균증(Colibacillosis) 및 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Respiratory Reproductive Syndrome, PRRS )과 같은 주요 질병이 발생한다.
상기 PRRS는 돼지에서 유산 및 호흡기 질병으로 인해 생산성 저하를 유발하므로 양돈산업에 가장 막대한 경제적 피해를 주는 질병이다. PRRS의 예방을 위한 가장 효과적인 방법은 고효능 백신을 이용한 방어면역형성을 유도하는 방법이다. 그러나 지금까지 연구된 방어 기작인 항체면역방법으로는 항원변이가 심하고 항체 유도능이 떨어지는 바이러스의 특성상 효과적인 방제가 이루어지기 어렵다. 따라서 현재까지 밝혀지지 않은 보다 효과적인 다른 방어 기작, 특히 세포성 면역에 대한 평가기술이 개발되어 이러한 신기술을 이용한 백신 및 면역 증강제 개발이 시급한 상황이다.
일반적으로 PRRS의 원인체인 돼지호흡기생식기증후군바이러스(Porcine respiratory and reproductive syndrome virus, PRRSV)는 돼지에 감염하여 3-4주가 지난 후에 중화항체를 형성하나 그 수준이나 지속기간이 바이러스 분리주에 따라 매우 다르다. 현재 중화항체에 대한 형성과정이나, 역가 등의 수준은 많은 연구로 알려져 있고, 중화항체 수준을 높여 질병을 예방하는 연구도 진행되었으나, 아직까지는 중화항체를 이용하여 질병을 예방할 수 있는 효과적인 방법은 나오지 않고 있다. 그에 반해 세포면역연구는 연구 수행 조건이 까다롭고, 돼지 세포면역에 관한 기초정보의 부족으로 세포면역에 관련된 연구가 제한적으로 이루어져 왔다. 현재 사용되는 사이토카인 검출을 통한 세포성 면역의 평가방법은 방어능을 직접적으로 평가하지 못하는 단점이 있다. 따라서 PRRSV에 대한 T 세포 면역의 형성 기작 및 방어효과에 대한 평가가 부재한 상태이다.
이에 본 발명자들은 백신 및 면역 증강제의 효능을 효율적으로 평가할 수 있는 방법을 연구한 결과, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법을 수립하고, 상기 평가 방법을 이용 시 직접적으로 돼지를 이용하지 않고도 실험실 내 in vitro 상에서 평가 가능하고, 백신 및 면역 증강제의 효능 평가에 유용하게 사용 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계; (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계; (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및(4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는, 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법은 직접적으로 돼지를 이용하지 않고도 실험실 내 in vitro 상에서 평가 가능하고, 또한, T 세포가 추출된 세포의 개체와 동일 개체(autologous) 혹은 동일 유전자형을 가진 다른 개체(heterologous)에 대한 PRRSV 증식 억제를 확인할 수 있는 효과가 있어, 백신 및 면역 증강제의 효능 평가 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 배양된 단핵구-유래 마이크로파지(monocyte-derived macrophages, MDM) 세포의 분화 형태를 나타낸 도이다.
도 2는 배양된 돼지 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM) 세포의 분화 형태를 나타낸 도이다.
도 3은 배양된 MDM 세포의 PRRSV 감염 민감도 및 세포 표면 항원 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 배양된 PAM 세포의 PRRSV 감염 민감도 및 세포 표면 항원 발현 양상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 PRRSV에 감염되지 않은 MDM 세포의 단독 배양(A), PRRSV에 감염되지 않은 MDM 세포와 개체 sow2 PMBC effector 세포 혼합배양(B), PRRSV에 감염되지 않은 MDM 세포와 CD8-제거한 effector 혼합배양(C), PRRSV에 감염된 MDM 세포의 단독배양(D), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 sow2 PMBC effector 혼합배양(E), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8-제거한 effector 혼합배양(F), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8+ 풍부한 effector 혼합배양(G)하여 PRRSV의 증식 억제능 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 PRRSV에 감염된 MDM 세포의 단독 배양(A), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 effector의 혼합배양(B), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD4 풍부한 세포의 혼합 배양(C), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD4 풍부한 세포의 혼합배양(D), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8 제거한 세포의 혼합배양(E) 및 PRRSV에 감염되지 않은 MDM 세포, CD8 풍부한 세포 및 CD4 제거한 세포를 혼합 배양(F)하여 PRRSV의 증식 억제능 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 PRRSV에 감염되지 않은 PAM 세포의 단독 배양(A), PRRSV에 감염되지 않은 PAM 세포와 effector의 혼합배양(B), PRRSV에 감염된 PAM 세포의 단독 배양(C) 및 PRRSV에 감염된 PAM 세포와 effector의 혼합배양(D)하여 PRRSV의 증식 억제능 결과를 나타낸 도이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계; (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 "T 세포"는 흉선에서 유래하는 림프구로 면역에서의 기억능력을 가지며 B세포에 정보를 제공하여 항체 생성을 도울 뿐만 아니라 세포의 면역에 주된 역할을 하는 세포로서, 본 발명에서는 구체적으로 병원체 감염 또는 면역된 타겟 세포인 MDM 세포 혹은 PAM 세포에 특이적으로 작용하여 감염 세포의 증식을 억제시키는 T 세포를 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 "특이적 T 세포"란 감염된 병원체에 의해 특이적으로 유도된 T 세포를 의미한다.
상기 병원체는 바이러스 또는 세균이고, 상기 바이러스는 돼지생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 돼지콜레라바이러스(hog cholera virus), 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus), 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 파보 바이러스(Porcine parvovirus), 구제역 바이러스(Foot and mouth Disease virus), 돼지 로타바이러스(porcine Rotavirus) 및 돼지 써코바이러스(porcine circovirus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이러스이며, 바람직하게는 돼지생식기호흡기증후군바이러스이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 "돼지생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)"는 크게 미국형과 유럽형으로 나뉘며, 직경 25-35nm로 단쇄 RNA 유전자가 자리하고 있으며 Arterivirdae에 속한다. 임상 증상은 번식장애와 호흡기 질환이 복합적으로 나타나며, 번식장애는 대부분 감염 초기부터 6개월 정도가 경과하면 감염 이전 상태이고, 호흡기질환은 PRRS 단독감염의 경우보다는 세균성, 바이러스성 병원체의 2차 감염 및 복합감염이 많으며 그 경우 병원성이 훨씬 증폭된다.
상기 세균은 에레시펠로트릭스 루시오패시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium Perfingens), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및 액티노바실러스 플루로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (2)의 대식 세포는 단핵구에서 분화된 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM), 폐포 대식 세포(alveolar macrophage), 복강 대식 세포, 염증 부위 육아종 대식 세포, 간의 쿠퍼 세포(Kupffer), 결합조직의 조직구(Hystocyte), 뇌의 소교세포(Microglia), 신장의 사구체간질세포(mesengial), 뼈의 파골세포 (osteoclasts) 및 수지상 대식 세포(dendritic cell)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 단핵구에서 분화된 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM) 또는 폐포 대식 세포(alveolar macrophage)이고, 더욱 바람직하게는, 단핵구에서 분화된 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM) 또는 돼지 폐포 대식 세포(porcine alveolar macrophage, PAM)이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "대식 세포"는 탐식세포라고도 하며, 면역담당세포의 하나이다. 동물체내의 모든 조직에 분포하며, 이물질, 세균, 바이러스 및 체내 노폐 세포 등을 포식하고 소화하는 대형 아메바상 식세포를 총칭한다.
본 발명의 목적 상, 대식 세포는 타겟 세포로서, 구체적으로 병원체에 감염된 대식 세포는 이를 타겟으로 하는 T 세포의 대상이 되는 것을 의미한다.
상기 (2)의 다른 개체는 상기 (1)의 개체와 유전자형이 동일한 병원체 비감염 개체 또는 유전자형이 상이한 바이러스 비감염 개체이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 "동일 개체(autologous)"는 어느 개체에 발현하는 면역응답이 그 개체 자신인 항원물질에 향해지는 경우를 의미한다.
본 발명에 있어서 "다른 개체(heterologous)"는 다른 유기체로부터 유래된 것을 의미하는 것으로, 다른 종 또는 다른 세포 타입으로부터 유래된 것도 포함된다.
상기 (3)의 혼합 배양은 상기 (1)의 T 세포 및 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포가 1 : 1~10의 비율로 혼합되고, 바람직하게는 1: 3~7의 비율로 혼합되나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구현 예에 있어서, PRRSV가 감염된 돼지의 세포에서 T 세포를 추출하고, 상기 돼지와 동일 또는 다른 개체의 단핵구에서 분화된 MDM 세포 또는 PAM 세포를 수득하고, 상기 MDM 세포 또는 PAM 세포에 PRRSV를 감염시켰다. 이 후, 상기 T 세포 및 상기 PRRSV 감염 MDM 세포 또는 PAM 세포를 1 : 5의 비율로 혼합배양 한 뒤, PRRSV 감염 MDM 세포 또는 PAM 세포에 대한 T 세포의 PRRSV 증식 억제능을 확인한 결과, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포가 공통 의존성 PRRSV 증식 억제능이 있고, 특히, CD4 T 세포로 인한 증식 억제능이 있음을 확인하였다. 따라서, 직접적으로 돼지를 이용하지 않고도 실험실 내 in vitro 상에서 평가 가능하고, 또한, T 세포가 추출된 세포의 개체와 동일 개체(autologous) 혹은 동일 유전자형을 가진 다른 개체(heterologous)에 대한 PRRSV 증식 억제를 확인할 수 있는 효과가 있어, 백신 및 면역 증강제의 효능 평가 분야에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계; (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계; (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및(4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는, 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포에 대한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 정보는 감염 시기에 따른 T 세포 표현형 또는 T 세포 발현 증감에 대한 정보를 제공할 수 있다.
예컨대 본 발명의 일구현 예에서는 상기 정보 제공 방법에 따라 CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포가 공통 의존성 PRRSV 증식 억제능이 있고, 특히, CD4 T 세포로 인한 증식 억제능이 있음을 확인하였다. 본 발명의 감염 세포 증식 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포의 정보 제공 방법에 따라 T 세포의 표현형 및 상기 표현형의 발현 증감에 대한 정보를 파악할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 돼지 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC), 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM), 돼지 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM) 및 PRRSV -특이적 T 세포가 풍부한 PBMC , 준비
1-1. 돼지 말초 혈액 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC ) 분리
돼지 PBMC를 분리하기 위해 5mM EDTA를 혼합한 신선한 정맥 혈액에 Lymphoprep™ (STEMCELL™ Technologies, Vancouver, Canada)을 이용하였으며, 농도 구배를 주어 원심분리시켰다. 항응고 처리된 혈액은 2% FBS(Fetal Bovine Serum)및 20% ACD(Acid citrate dextrose)가 포함된 10mM 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4)에 2배 희석시켰다. Lymphoprep™ 15ml이 들어있는 SepMate™-50(STEMCELL Technologies) 튜브에 35ml의 희석된 혈액을 넣은 후에 1,100g로 10분간 원심분리하였다. 상층액 중 buffy coat 세포만을 모아서 2% FBS와 20% ACD를 포함한 PBS로 혈소판이 제거될 때까지 세척하였다. 분리된 PBMC는 세포수를 측정한 뒤 10% DMSO(J.T. Baker, Center Valley, PA, USA) 및 90% FBS를 포함한 동결보존배지에 섞어 액체질소에 동결 보존하였다.
1-2. 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM) 세포 또는 돼지 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM) 준비 및 PRRSV에 대한 민감도 확인
PRRSV 증식 억제능 평가를 위하여, PRRSV 특이적 T 세포가 타겟으로 하는 세포인 MDM 또는 PAM 세포를 준비하고, 상기 세포의 PRRSV 감염 민감도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1-1에서 준비한 동결된 PBMC를 녹인 후 무혈청 EMEM에 세척한 뒤 37도에서 2시간 동안 무혈청 EMEM에서 배양하였다. 배지와 부유세포들은 제거하고 부착 세포들만 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 배지에 6일 동안 배양하였다. 상기 배지에는 쥐 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor, Biolegend, San Diego, CA, USA)를 2일 마다 5ng/ml의 조건으로 첨가하였다. 상기 6일 분화시킨 MDM 또는 PAM 은 하기 PRRSV 증식 억제능 평가(CA)의 타겟 세포로서 이용하였다. 상기 배양된 MDM의 분화한 형태를 광학현미경을 이용하여 확인한 결과를 도 1에, PAM의 형태는 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, MDM 또는 PAM 세포의 분화가 잘 이루어짐을 확인하였다.
또한, 상기 MDM 또는 PAM 세포의 PRRSV 감염 민감도를 확인하기 위하여, 상기 MDM 또는 PAM 세포의 PRRSV 감염 민감도 및 세포 표면 항원 발현 양상을 확인하였다.
구체적으로, 상기 MDM 또는 PAM 세포를 상기 실험예 1-1에서 준비한 동결된 PBMC를 녹인 후 무혈청 EMEM에 세척한 뒤 37도에서 2시간 동안 무혈청 EMEM에서 배양하였다. 배지와 부유세포들은 제거하고 부착 세포들만 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 배지에 MDM 세포는 0, 2, 4, 6 및 8일간 동안 배양하였고, PAM 세포는 24시간 및 48시간 동안 배양하였다. 상기 배지에는 쥐 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor, Biolegend, San Diego, CA, USA)를 2일 마다 5ng/ml의 조건으로 첨가하였다. 각 조건으로 분화시킨 MDM 또는 PAM세포는 직접 돼지의 폐에서 수득하여 PRRSV 증식 억제능 평가(CA)의 타겟 세포로서 이용하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 시간이 지날수록 MDM 세포의 CD14 발현이 강해지고 PRRSV 감염 민감도가 매우 높아짐을 확인하여, MDM 세포가 하기 PRRSV 증식 억제능 평가에 적합함을 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 배양 시간이 지날수록 PAM 세포의 CD172a 발현이 약해지고 PRRSV 감염 민감도가 매우 높아짐을 확인하여, PAM 세포가 하기 PRRSV 증식 억제능 평가에 적합함을 확인하였다.
또한, 상기 MDM 세포 또는 PAM 세포는 MHC class I molecule 및 MHC class II molecule을 발현함을 확인하였다.
1-3. PRRSV -특이적 T 세포가 풍부한 PBMC 준비
상기 실험예 1-2의 MDM 세포에 PRRSV 감염 후 회복된 암퇘지로부터 분리한 PBMC를 혼합하여 PRRSV 특이적 T 세포를 수득하였다.
구체적으로, RPMI-1640 40ml(ml당 106)(10% FBS 및 5ng/ml 재조합 돼지 IL-7(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 포함)이 첨가된 150cm2 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에 열로 불활성화시킨 PRRSVSD23983(MOI 0.1)를 준비하여 상기 실험예 1-2에서 수득한 MDM을 감작시켰다. 이 후, PRRSV 감염 후 회복된 암퇘지로부터 분리한 PBMC를 상기 실험예 1-2의 MDM 세포와 혼합하여 7일 동안 자극시켜, PRRSV-특이적 T 세포가 풍부한 PBMC 준비하였다.
실시예 1-1. PBMC에서 T 세포 소집단 결손 및 선별
T 세포 분석에 쓰일 T 세포 소집단을 준비하고, CD4+ 또는 CD8+ T 세포 수득하기 위하여, 마그네틱 비드(Miltenyi, Cologne, Germany), CD4(PT90 clone, VMRD, Pullman, WA, USA) 또는 CD8(PT81B clone, VMRD) 특이적인 단클론 항체를 이용하여 결손시키거나 선별하였다. PRRSV에 감염되었다가 회복된 암퇘지로부터 분리한 상기 실험예 1-3의 PBMC 106에 CD4 혹은 CD8 특이적 단클론 항체 50ul(5-10 ug/반응)를 10분마다 미약하게 진탕을 시키면서 4도, 30분 조건으로 반응시켰다. 상기 반응시킨 세포는 PBS로 두 번 세척한 뒤 107당 20ul의 마그네틱 비드 현택액과 혼합하여 4도, 15분 조건으로 두었다. . 마그네틱 비드에 의해 부착된 세포들은 컬럼 방법을 이용하여 수집하여 PRRSV 특이적 T 세포를 수득하였으며, 하기 PRRSV 증식 억제능 평가에 이용하였다.
실시예 1-2. PRRSV 증식 억제능 평가
PRRSV에 감염된 MDM 또는 PAM 세포에 대한 T 세포의 PRRSV 증식 억제능 및 T 세포 표현형 또는 T 세포 발현 증감을 확인하였다.
구체적으로, MDM 또는 PAM 세포는 PRRSV 비감염 암퇘지(동일 유전자형 혹은 비동일 유전자형을 가진 다른 개체 타겟 세포의 근원)의 PBMC에서 분화한 것을 이용하였다. 또한, PRRSV를 공격 접종한 뒤 임상적으로 회복한 암퇘지(동일개체 타겟 세포의 근원)에서 얻어진 PBMC에서 분화한 것을 이용하였다. 상기 2 종류의 MDM 또는 PAM 세포를 6일 동안 배양하고 PRRSVSD23983(MOI 0.00005)에 감염시켰다. 그 후, 항원-자극시킨 PBMC 또는 그 소집단(CD4 및 CD8 결손/선별된 소집단)과 혼합 배양하였다. 혼합 배양 시 실험예 1-3의 특이적 T세포(effector 세포로서 이용) 및 타겟 세포(MDM 또는 PAM 세포)의 비율은 5:1이며(5백만 개의 실험예 1-3의 특이적 T세포(effector 세포로서 이용)와 1백만 개의 MDM 또는 PAM 세포), 상기 혼합된 세포를 24 well 플레이트 넣고 10% FBS 및 0.5ng/ml 재조합 돼지 IL-2(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)가 첨가된 RPMI-1640배지에 6일 동안 배양하였고 2일 마다 새로운 배지로 보충하였다.
effector 세포에 의한 MDM 세포 혹은 PAM 세포 내 PRRSV 증식 억제능을 알아보기 위하여, T 세포(CD3+,CD4+,CD8+), 감염 MDM 세포(CD172a+ PRRSV-N+ 과 CD172a- PRRSV-N+), 비감염 MDM 세포 혹은 PAM 세포 (CD172a+ PRRSV-N-)는 각각 특이적인 단클론 항체를 이용하여 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 감염 MDM 세포 수의 감소 퍼센트는 effector 세포에 의하여 PRRSV 증식이 억제된 것으로 계산하였다. 세포 표면 및 세포 내 염색을 위해 쓰인 단클론항체와 형광 결합된 이차 항체는 다음과 같다: annti-CD172a(74-22-15 clone, IgG1 isotype, VMRD), anti-CD3(8E6 clone, IgG1 isotype, VMRD), anti-CD8(PT81B clone, IgG2b clone, VMRD), anti-PRRSV-N(2D6 clone, IgG2b isotype; VMRD), anti-CD4-PerCP-Cy5.5(BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), goat anti-mouse IgG1-FITC(Life Technologies) 및 goat anti-mouse IgG2b-R-PE(Life Technologies). 염색된 세포는 FACS Calibur 유세포분석기 (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. monocyte/대식세포는 forward/side scatter에 근거하여 게이트를 잡았다. CD172a가 감염 12시간 이상 후에 대부분의 MDM과 또는 PAM 에서 하향 조절되는 현상과 관련이 있는 CD172a- PRRSV 감염 MDM 또는 PAM 세포를 계산에 포함시켜, effector 세포의 유무에 따른 PRRSV 감염 MDM 또는 PAM 세포(CD172a+ PRRSV-N+ 및 CD172a- PRRSV-N+ 세포)의 퍼센트 감소분을 계산함으로써 퍼센트 억제능 계산하였다. 타겟 세포인 MDM 또는 PAM 세포만을 배양한 것과 비교해봤을 때, effector 세포의 존재하에 PRRSV 감염 MDM 또는 PAM 세포의 80% 이상이 감소하는 것을 효과적인 억제능으로 정의하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, PRRSV에 감염된 MDM 세포와 개체 sow2 PMBC effector 혼합배양한 결과(E), 95.5%의 PRRSV 증식 억제율을 확인하였다. 또한, PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8-제거한 effector 혼합배양(F)한 결과로는 95%의 억제율을 확인하였으며, PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8+ 풍부한 effector 혼합배양(G) 결과로는 61.8%의 억제율이 나타남을 확인하였다. 따라서, CD4 T 세포가 PRRSV 감염에 대한 주된 방어능과 관련된 세포임을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, PRRSV에 감염된 MDM 세포와 effector의 혼합배양(B), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD4 풍부한 세포의 혼합 배양(C), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD4 풍부한 세포의 혼합배양(D), PRRSV에 감염된 MDM 세포와 CD8 제거한 세포의 혼합배양(E) 및 PRRSV에 감염되지 않은 MDM 세포, CD8 풍부한 세포 및 CD4 제거한 세포를 혼합 배양(F)에 대한 PRRSV 증식 억제율은 각 91%, 44.4%, 45.1%, 44.5% 및 67.9%임을 확인하였다. 따라서, CD4 및 CD8 T 세포는 공통 의존성을 갖는 방어 효능을 나타냄을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, PRRSV에 감염된 PAM 세포와 effector의 혼합배양(D)과 PBMC effector 없이 PAM 세포 단독 배양(C)한 것을 비교한 결과 PRRSV 증식 억제율이 92.6%임을 확인하였다. 따라서, PBMC effector 세포가 PAM 세포에서도 방어 효능을 나타냄을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명의 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법은 직접적으로 돼지를 이용하지 않고도 실험실 내 in vitro 상에서 평가 가능하고, 또한, T 세포가 추출된 세포의 개체와 동일 개체(autologous) 혹은 동일 유전자형을 가진 다른 개체(heterologous)에 대한 PRRSV 증식 억제를 확인할 수 있는 효과가 있어, 백신 및 면역 증강제의 효능 평가 분야에 유용하게 이용할 수 있다.

Claims (9)

  1. (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계;
    (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계;
    (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 T 세포는 감염된 병원체에 의해 특이적으로 유도된 T 세포인 것을 특징으로 하는 T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 병원체는 바이러스 또는 세균인 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 바이러스는 돼지생식기호흡기증후군바이러스(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV), 돼지열병바이러스(classical swine virus), 돼지 전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus), 돼지 유행성 설사증 바이러스(Porcine Epidemic Diarrhea Virus), 일본뇌염바이러스(Japanese encephalitis virus), 파보 바이러스(Porcine parvovirus), 구제역 바이러스(Foot and mouth Disease virus), 돼지 로타바이러스(porcine Rotavirus) 및 돼지 써코바이러스(porcine circovirus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 세균은 에레시펠로트릭스 루시오패시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 클로스트리디움 페르프린젠스(Clostridium Perfingens), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida) 및 액티노바실러스 플루로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세균인 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (2)의 대식 세포는 단핵구에서 분화된 단핵구-유래 대식 세포(monocyte-derived macrophages, MDM), 폐포 대식 세포(alveolar macrophage), 복강 대식 세포, 염증 부위 육아종 대식 세포, 간의 쿠퍼 세포(Kupffer), 결합조직의 조직구(Hystocyte), 뇌의 소교세포(Microglia), 신장의 사구체간질세포(mesengial), 뼈의 파골세포 (osteoclasts) 및 수지상 대식 세포(dendritic cell)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (2)의 다른 개체는 상기 (1)의 개체와 유전자형이 동일한 병원체 비감염 개체 또는 유전자형이 상이한 바이러스 비감염 개체인 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (3)의 혼합 배양은 상기 (1)의 T 세포 및 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포가 1 : 1~10의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는, T 세포의 병원체 감염 세포 증식 억제능 평가 방법.
  9. (1) 병원체 감염 또는 면역된 개체의 세포에서 T 세포를 추출하는 단계;
    (2) 상기 (1)과 동일 개체(autologous) 또는 다른 개체(heterologous)의 대식 세포를 수득하고 병원체를 감염시키는 단계;
    (3) 상기 (2)의 병원체 감염 대식 세포 및 상기 (1)의 T 세포를 혼합 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3)의 병원체에 감염된 대식 세포에서 병원체의 증식 억제를 확인하는 단계;를 포함하는, 세포 억제능에 관여하는 병원체 특이적 T 세포에 대한 정보 제공 방법.
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