MXPA05007973A - Anticuerpos especificos para celulas dendriticas plasmacitoides. - Google Patents

Abstract

La invencion provee reactivos inmunologicos (anticuerpos) capaces de unirse a celulas dendriticas plasmacitoides (pDC), a lineas celulares que expresan tales anticuerpos y a procedimientos para identificar y purificar celulas dendriticas plasmacitoides a partir de tejidos que contiene tales pDC usando dichos anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS ESPECIFICOS PARA CELULAS DENDRITICAS PLASMACITOIDES CAMPO DE LA INVENCION La invención provee reactivos inmunológicos (anticuerpos) capaces de unirse a células dendríticas plasmacitoides (pDC), a líneas celulares que expresan tales anticuerpos y a procedimientos para identificar y purificar células dendríticas plasmacitoides a partir de tejidos que contienen pDC usando tales anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células dendríticas (DC) con células que presentan el antígeno (APC) que inician las respuestas inmunes dependientes de linfocitos T (Steinman, 1991 , Ann. Rev. Immunol. 9:271-296). En los humanos, las DC plasmacitoides (pDC) son un subconjunto de DC caracterizado por su parecido ultraestructural a células de plasma que secretan Ig (Grouard ef a/., 1997, J. Exp. Med. 185(6): 1101-111 1 ), su fenotipo superficial único (CD4+IL-3R++CD45RA+HLA-DR+) (Grouard ef al., 1997, J. Exp. Med. 185(6):1101-1 1 11 ; Facchetti et al., 1999, Histopathology 35(1 ):88-9; Res et al., 1999, Blood 94(8):2647-57), y su capacidad para producir altos niveles de IFNa en respuesta a la estimulación de virus o a motivos de CpG particulares que contienen oligodesoxinonucleótidos (ODN) (Siegal et al., 1999, Science 284 (5421 ): 1835-7; Kadowaki et al., 2001 , J Immunol 166(4):2291-5) e inducen una iniciación potente in vitro y polarización Th-1 de linfocitos T naturales después del encuentro viral (Celia et al., 2000, Nat Immunol 1 (4):305- 0; Kadowaki et al., 2000, J. Exp Med 192 (2):219-26). Las pDC se piensa que se derivan de un precursor común con linfocitos T y linfocitos B (Grouard et al., 1987, J. Exp. Med. 185, 6:1 101-1 11 1 ; Res et al., 1999, Blood 94, 8:2647-57; Res et al., 1999, Blood 94 (8):2647-57; Bruno et al., 1997, J. Exp. Med. 185:875-884; Bendriss-Vermare et al., 2001 , JCI 107:835; Spits et ai, 2000, J. Exp. Med. 92 (12): 1775-84). En el ratón, las pDC han sido identificadas recientemente por varios grupos como células CD11 cbaJob220altoGr1 ba)'°, capaces de producir IFN del tipo I en respuesta a la estimulación viral y que exhiben morfología plasmacitoide (Nakano eí al, 2001 , J. Exp Med, 194(8): 1 171-8; Paturel et al, 2001 , Nat lmmunol. 2(12): 144- 150; Bjorck, 2001 , Blood 98(13):3520-6). Las pDC de ratón también se pueden obtener en gran número in vitro, a través de la diferenciación de células de médula ósea en células dendríticas en presencia de FLT3L. Además de su morfología, su producción de IFNa y su origen putativo, las pDC también difieren de las DC mieloide en su actividad fagocítica débil (Grouard et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 6:1 101-1 111), su capacidad de producción de IL-12 débil (Rissoan et al., 1999, Science 284:1183-1 186), y las señales que inducen su activación (Kadowaki eí al., 2001 , J. Immunol 166(4):2291-5). Mientras el reclutamiento de las pDC activadas puede iniciar inmunidad mediante la activación de linfocitos T naturales, las DC inmaduras o inactivadas han sido referidas porque inducen tolerancia inmune, probablemente a través de la inducción de linfocitos T reguladores (Jonuleit eí al., 2001 , Trends ¡mmunol. 22:394; Bell et al., 2001 , Trends Immunol 22:1 1 , Roncarolo eí al., 2001 , JEM 193:F5; Jonuleit et al., 2000, JEM 162:1213). Además, las pDC han mostrado que inducen linfocitos T que secretan IL-10 (Rissoan et al., 1999, 0283:1183; Liu et al., 2001 , Nature Immunol 2:585) y linfocitos T reguladores de CD8 (Gilliet eí al., 2002, J. Exp. Med. 195(6):695-704). Las células que producen IFN naturales de humano (HulPC) también han mostrado que realizan un papel esencial en la activación de células asesinas naturales (NK) para eliminar las células infectadas con virus (Bandyopadhyay et al., 1986, J. Exp Med 164(1 ): 180-95). Además, las pDC recientemente han sido asociadas con enfermedades auto-inmunes, en particular lupus eritamatoso (Farkas et al., 2001 , Am. J. Pathol. 159(1 )237-43). Los interferones del tipo I (IFN-cc, ß o ?) son activadores centrales en la resistencia del huésped a las infecciones por virus o microbios (Pfeffer et al., 1998, Cáncer Res 58(12):2489-99; van den Broek er al., 1995, Immunol Rev 69(8):4792-6). El papel crítico de las pDC en la infección viral recientemente se ha demostrado in vivo, en los modelos de infección MCMV y VSV (Dalod eí ai, 2002, J. Exp Med 195(4):5 7-28; Barchet eí al., 2002, J. Exp Med 195(4):507-16). Verdaderamente, en la ausencia de pDC de ratón, el nivel de IFNa es disminuido de manera dramática en ratones infectados con MCMV. En este estudio, el tratamiento con anti-Gr1 usado para la depleción de pDC, además de los neutrófilos, también posiblemente disminuye una proporción de macrofagos y de linfocitos T activados. Sin embargo, debido a que todas estas células no producen IFN-a in vitro y que los linfocitos T o B no se requieren para la producción in vivo de IFN-a, estos datos demuestran que MIPC son las células únicas capaces de producir in vivo IFN tipo I en respuesta a la infección por MCMV o que su producción inicial de IFN tipo I es necesana para iniciar la cascada de producción de IFN a partir de otros tipos de células (Dalod et al., 2002, J. Exp Med 195(4): p. 517-28). En los seres humanos, las pDC inactivas han mostrado que expresan de manera específica BDCA-2 y BDCA-4 (Dzionek, et al., 2000, J. Immunol. 165(1 ):6037-46). En el ratón, no se han identificado hasta la fecha tales marcadores específicos. Sería de gran beneficio identificar nuevos marcadores específicos para las pDC de ratón, con el propósito de monitorear, caracterizar y aislar pDC y también estudiar su función in vivo en modelos de animales.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención satisface la necesidad anterior al proveer un compuesto de unión que tiene las características de unión de un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma depositada el 27 de enero de 2003 bajo el No. de acceso ATCC No. PTA-4957. En modalidades preferidas, la composición de unión es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Más preferiblemente el anticuerpo monoclonal es anticuerpo monoclonal 120G8 producido por ATCC No. PTA-4957 de hibridona. También se provee una línea celular de ibridoma que tiene No. de acceso ATCC PTA-4957. La invención también provee método para purificar pDC a partir de una muestra que contiene pDC, donde el método comprende contactar la muestra con un anticuerpo 120G8 y después recuperar las pDC que se han unido a dicho anticuerpo. Finalmente, la invención provee un método para identificar pDC de una muestra que comprende pDC que comprende las etapas de poner en contacto la muestra con un anticuerpo 120G8 para formar un complejo anticuerpo/pDC y detectar la presencia de dicho complejo de anticuerpo/pDC para identificar las pDC.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se basa, en parte en el descubrimiento de un anticuerpo que reconoce de manera específica las pDC en el ratón. La naturaleza de la respuesta de linfocito T durante la presentación de antígeno a través de DC es dependiente de la sub-población de DC involucradas y la etapa de maduración de las DC de presentación (Steinman eí ai, 2000, J. Exp. Med. 191 (3):41 1-6). A pesar de la plasticidad funcional, las MDC y pDC son capaces de polarizar el tipo de respuesta del linfocito T hacia una respuesta de Th1 o Th2 a través de su capacidad para secretar IL-2 o no, respectivamente (Rissoan et al., 1999, Science 283:1183-1 186). Los dos subtipos de DC también hacen enlaces diferentes entre las respuestas inmunes adquiridas e innatas, con las MDC activando ambos linfocito B (Dubois et al., 1999, J Leukoc. Biol. 66:224-230) y células NK (Zitvogel et al., 2002, J. Exp. Med. 195(3):F9-14), y pDC produciendo grandes cantidades de IFNs naturales en respuesta a los virus (Liu, Y.J., 2001 , Cell 106(3):259-62). En vista de la carencia de marcadores específicos capaces de reconocer las pDC, por ejemplo en el ratón, ambas inactivas y activas, los inventores han generado un mAb dirigido contra las pDC de ratón. Este anticuerpo ha sido designado 120G8 y se produce a través de una línea celular de hibridoma la cual se ha depositado el 27 de Enero de 2003 bajo el tratado de Budapest con No. de acceso ATCC No. PTA-4957. El 120G8 mAb se puede usar para aislar selectivamente pDC de las células totales. Este tiñe las pDC de cualesquiera de las células total ex vivo o DC derivadas de médula ósea ¡n vitro. También se reconoce las pDC que se origina no sólo de órganos diferentes en el ratón, sino también de diferentes cepas de ratones. Se puede usar en estudios de clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS), el teñido inmunohistoquímico (IHC) o por inmunohistofluorescencia (IHF) en secciones de tejido. Debido a que 120G8 mAb reconoce las pDC desactivadas y activadas, es más útil para estudiar la respuesta de las pDC en la activación, in vitro e in vivo. Finalmente la inyección de 120G8 mAb in vivo produce depleción de pDC en el ratón, según se determina de manera fenotípica y funcional. El término "compuesto de unión" como se usa aquí incluye anticuerpos y fragmentos funcionales del mismo que específicamente unen las pDC, y que tienen una especificidad epitópica que es la misma o similar a aquella del 120G8 mAb descrito en la presente. Los compuestos de unión los cuales tienen una especificidad epitópica que es la misma o similar a aquella del 120G8 mAb se puede identificar por su capacidad para competir con 120G8 mAb para la unión a pDC.

EJEMPLOS La invención puede ser ilustrada a manera de los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales pueden ser más fácilmente entendidos haciendo referencia a los siguientes materiales y métodos.

Ratones, medio de cultivo y anticuerpos Ratones hembra desnudos BALB/cByJ, 129 SvPas, C57BI/6J, CBA/J, C3H/HeN, DBA/2J, BALB/c libres de patógenos específicos, de 6 a 8 semanas de edad, son adquiridos de Charles River (Iffa-Credo, L'Arbresle, Francia). Todos los experimentos con los ratones se realizan siguiendo los protocolos aprobados por los comités institucionales de los animales y de acuerdo con la directiva del consejo EEC 86/609 así como el cuidado institucional de los animales y línea de guía de uso. Las células primarias se desarrollan en medio completo de RP I1640: RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley Park, Reino Unido) complementado con suero de becerro fetal inactivado con calor al 10% (v/v) (FCS, Life Technologies), 2 mM de L-Glutamina (Life Technologies), 80 //g/ml de Gentallin (Schering Plough, Union, NJ), 10 mM de Hepes (Life Technologies), 50 /M de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, MO), a 37°C en C02 al 5%. Los sobrenadantes de alta densidad de hibridoma se producen en DMEM/F12 (Life Technologies), complementados con 2 mM de L-Glutamina, 80 µg/ml de Gentallin. Se añade suero de caballo al 10% (v/v) (HS, Life Technologies) a menos que se especifique otra cosa. Todos los anticuerpos son de Pharmingen (San Diego, CA), a menos que se especifique otra cosa.

Preparación del tejido y depleción celular Los ratones son asesinados por inhalación de CO2. Las células aisladas se mantienen en todo el procedimiento en PBS-FCS-EDTA: PBS (Life Technologies) complementado con FCS al 5% (v/v) inactivado con calor y 0.5 mM de EDTA (Sigma). Las células sanguíneas son recolectadas en PBS-FCS-EDTA en exceso a través de punción cardiaca inmediatamente después de la muerte. Bazos, timo, nodulos linfáticos (poplíteo o periférico) (inguinal agrupado, axilar y poplíteo), los parches del peyer se trituran en PBS-FCS-EDTA y pasan a través de una aguja 25G. Los glóbulos rojos son Usados en solución de NH4CI (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) durante 5 minutos. Las células de la médula ósea son lavadas fuera de los huesos con PBS-FCS-EDTA frío. Para las depleciones de linfocitos T y B, las células son incubadas durante 30 minutos a 4°C con una mezcla de complejo molecular anti-CD3 (17A2), anti-CD ? (53-5.8), anti-CD19 (1 D3) o un anti-eritrocito (TER1 19) se usaron alternativamente. Las células y Dynabeads revestidas con igG de cabra anti-rata (Dynal, Oslo, Noruega) se mezclan bajo agitación continua durante 15 minutos a 4°C. Las perlas y las células unidas se remueven usando un magneto Dynal. Las células CD1 1 c+ son purificadas a través de selección positiva usando Microbeads CD11c+ y MiniMacs (Myltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) iniciando de las células totales de bazo, células totales de la médula ósea o células que experimentaron depleción con CD19, CD3, CD8y?, TER1 19. Para las DC derivadas in vitro de la médula ósea (BM-DC) en FLT3L, las células de médula ósea aisladas se sembraron 06 células/ml en placas de 24 pozos, se incubaron durante 9 días en medio completo de RPMI1640 complementado con 25 ng/ml de recombinante murina FLT3L (R&D systems, Abingdon, Reino Unido). El medio se renueva cada 2 a 3 días.

Inmunización de rata con PC plasmacitoides de ratón Las células del bazo de ratón de ratones BALB/c se incuban durante 30 minutos a 4°C con una mezcla de mAb de rata que incluye complejo anti-CD3 (17A2), antiCD8 (53-5.8), anti-CD19 (1 D3), anti-CD5 (53-7.3), ant¡-CD11 b (M1/70), y anti-eritrocito (TER 19) entonces las células cubiertas con anticuerpo se remueven usando Dynabeads. Las células que experimentaron depleción son teñidas con (RB6-8C5)-ficoeritrina (PE) de anti-Ly6G/C de rata, (HL-3)-biotina de anti-CD1 1c de hámster, y en cóctel de anti-CD3e (145-2C1 1 ) de hámster marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD 9 (1 D3) de rata, anti-CD5 (53-7.3), anti-CD11 b (M1/70), y células NK anti-pan (DX5) durante 30 minutos a 4°C. Las células después fueron teñidas con estreptavidina-Pe-Cy5 (Dako, Glostrup, Dinamarca) y clasificadas como células CD11c+Gr1+CD CD19"CD5 D1 1 b X5" (pDC) usando un citómetro de flujo FACStar plus (Becton Dickinson, Moutain View, CA). Las células clasificadas son lavadas tres veces en PBS (Life Technology, Paisley Park, Reino Unido), suspendidas nuevamente en PBS y congeladas a -20°C hasta el tiempo de inyección. Una rata LOU hembra (Iffa Credo), de 4 semanas de edad, es inmunizada con pDC clasificadas. El protocolo es el siguiente: Día 0: inyección intraperitoneal (ip) de 106 células en auxiliar completo de Freund (CFA) Dia 14: inyección ip de 06 células en auxiliar incompleto de Freund (IFA) Día 21 : inyección ¡p de 105 células en PBS Día 35: inyección intravenosa (iv) de 2. 06 células en PBS Día 38: la rata es asesinada y es recolectado el bazo. Las células del bazo se fusionan con la línea celular de murina mieloma SP20, usando polietilenglicol 1000 (Sigma). Las células híbridas son sembradas en placas de 96 pozos y alimentadas con DME /F12 complementado con HS al 10%, 2 mM de L-Glutamina, 80 µ?/?t?? de Gentallin, aditivo de medio de cultivo al 1% (CRT, Lyon, Francia), 10~5 M de azaserina (Sigma) y 5x10"5 M de hipoxantina. Los sobrenadantes son seleccionados por su reactividad con células de bazo aisladas ex vivo, células de la médula ósea y dendríticas esplénicas CD1 c+. El hibridoma seleccionado es clonado a través de dilución limitante. mAB 120G8 se purifica a partir de sobrenadantes de alta densidad libre de suero a través de cromatografía de intercambio aniónico en una columna Hiload Q (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y se acopla con Alexa488 y biotina usando procedimientos estándar. Las ascitas son producidas en ratones desnudos Balb/c (iffa Credo). El isotipo Ig se determina a través de ELISA usando un equipo de formación de subtipo Ig de rata (Pharmingen, San Diego, CA).

Análisis FACS Para todos los análisis FACS, las células, mantenidas en PBS-FCS-EDTA, primero se incuban durante 15 minutos con Ab de rata no marcado anti-CD16/32 para asegurar el bloqueo del receptor Fe y después se tiñen con Abs indicado durante 30 minutos a 4°C. Las células teñidas son analizadas con un citómetro de flujo FACScan. Los controles negativos se realizan con rata o hámster Ig con isotipo igual. Cuando no se usa la tinción PerCpCy5.5, las células auto-fluorescentes se proveen usando el canal FL3. Para la formación del fenotipo superficial de células 120G8+, las células aisladas son teñidas con 120G8 marcado con Alexa-488, anticuerpos marcados con PE (anti-CD3e, CD19, DX5, CD1 1c, CD45R/B220, Ly6C, Ly6G/C (Gr1 , RB6-8C5), CD1 1 b, l-Ad, H2-Kd) y anti-CD1 1c (HL-3) de hámster marcado con APC. Para la tinción en BM-DC en los días indicados de cultivo en FLT3L, las células son teñidas con 120G8 Aiexa488, anti-CD11 c-PE, anti-CD1 1 b-PerCpCy5.5 y anti-CD45R/B220-APC. Para la formación de fenotipo superficial de células 120G8+ y 120G8" CD 1 c+ en diferentes órganos, las células aisladas son teñidas con 120G8-Alexa488, anti-CD45T/B220-PE, anti-Ly6C-biotina y anti-CD1 1c-APC. Anti-Ly6C biotinilado se revela con PerCP-Cy5.5 estreptavidina (Pharmingen). Para el análisis de la frecuencia celular de subconjuntos de DC en los órganos del ratón, las células del bazo mantenidas en PBS-FCS-EDTA se tiñen con 120G8-Alexa 488 de rata, ambos anti-CD19 y anti-CD3e-PerCPCy5.5, anti-CD1 1c-APC y anti-CD8a-PE o anti-CD1 b-PE. Las células de CD19+/CD3 + se proveen usando canal FL3 para el análisis. Los resultados se muestran como la frecuencia de los subconjuntos celulares indicados entre las células del bazo totales.

Activación celular y producción de citocina Para la activación celular, las células indicadas son cultivadas en medio RPMI1640 completo (en 106 células/ml para células no clasificadas y en 0.5x106 células/ml para células clasificadas) en ausencia o presencia de estímulos indicados. La cepa NK/T /138/00, virus de influenza humana inactivada con formaldehído (kindly provisto por N. Kuehn, Aventis Pasteur, Val de Reuil, Francia) se añade a los cultivos a una concentración final de 100 unidades de hemagglutinin (HAU) por mi. Fosforotioato CpG ODNs, (TCA TTG GAA AAC GTT CTT CGG GGC G) (SEQ ID NO: 1) a menos que se especifique otra cosa, se adquiere de MWGBiotech (Munich, Alemania) y se se usa a una concentración final de 10 µ9/???. IFN-a de ratón recombinante (Hycult Biotechnology, Uden, Holanda) se usa en la concentración final indicada. IFN-? (R&D) de ratón recombinante se usa a una concentración final de 2 ng/ml. Para la producción de citocina a través de células 120G8+, las células del bazo se incuban durante 30 minutos a 4°C con una mezcla de mAb que incluye complejo molecular anti-CD3, anti-CD8p, anti-CD19 y antieritrocito (TER119) entonces las células revestidas con anticuerpo se remueven usando Dynabeads. Las células que experimentan depleción son teñidas con 120G8-Alexa488 de rata, (HL-3)-ficoeritrina de anti-CD11c de hámster (PE) durante 30 minutos a 4°C. Las células entonces son clasificadas usando un citómetro de flujo FACStar plus (Becton Dickinson), lavadas y sembradas en placas de cultivo de 96 pozos con los estímulos indicados durante 20 a 24 horas. Los sobrenadantes son recolectados en 20-24h y almacenados a -20°C hasta que se analicen para IFN-ot e IL-12 (p40 o p70) a través de ELISAs específico (PBL Biomedical Laboratories, New Brunwick, NJ y R&Dsystems respectivamente). Para la expresión de 120G8 después de la activación celular, células aisladas se incuban durante 20 a 24 horas con los estímulos indicados. Las células estimuladas entonces son teñidas con 120G8-Alexa488, anti-CD11 b-PerCpCy5.5 y anti-CD45R/B220-PE para células activadas con CD11 c+ o 120G8-Alexa488 y mAbs indicado acoplado a PE para células de bazo totales. Para este último experimento, las células indicadas se proveen usando un canal FL2.

Inmunotinción de 120G8 en sección de tejido Los bazos son fijados en compuesto OCT- (Miles) y congelados de manera instantánea en nitrógeno líquido, y almacenados a -80°C hasta análisis adicional. Crlosecciones con ocho micrómetros de grosor se fijan en acetona al 80% (Sigma) a -20°C durante 20 minutos, se secan a temperatura ambiente y se almacenan congelados hasta su tinción. Las secciones son rehidratadas en PBS (Life Technology). Contenido de tejido Avidina/Biotina y peroxidasa se neutralizan usando un equipo específico (Vector Laboratory, Burlingame, CA) y H2O2 (Sigma) a 0.3% respectivamente. Las secciones son bloqueadas con suero de ratón normal al 2% (Dako, Glostrup, Dinamarca), y las tinciones se realizan a temperatura ambiente. Para la distribución in situ de células 120G8+ en varios tejidos de ratón, las secciones son teñidas secuencialmente con 120G Ab no marcado durante 60 minutos, cabra antirata acoplada a biotina (Jackson Immunoresearch) durante 60 minutos, extravidina acoplada a peroxidasa (Sigma) durante 30 minutos y se revela con sustrato de peroxidasa (AEC, Sigma). La contratinción se realiza con hematoxilina (Vector Laboratory). Para el análisis de inmunohistofluorescencia, las secciones son teñidas secuencialmente con 120G8 Ab no marcado durante 60 minutos, cabra anti-rata acoplada a Alexa488 (Molecular Probes, Leiden, Holanda) durante 60 minutos, suero de rata al 2%, Abs indicado acoplado a biotina y estreptavidina-Alexa594 (Molecular Probes).

Tratamientos in vivo Para el tratamiento CpG, 30 µ? por ratón de la preparación de liposoma catiónica (DOTAP, Roche, Mannheim, Alemania) se mezclan con 5 µ9 de CpG ODN en 170 µ? de PBS en un tubo de poliestireno durante 30 minutos, antes de la inyección en la vena retro-orbital de ratones anestesiados. Seis horas después de la inyección de CpG, los bazos son recolectados y preparados para la inmunotinción. Para la depleción in vivo de células 120G8+, los ratones son inyectados i.p. con cantidad óptima de 120G8 ascitas. Para el análisis FACS de depleción de pDC, células del bazo son aisladas 24 horas después de la inyección con 120G8 y teñidas con anti-Ly6C-FITC, anti-CD45R/B220-PE, ant¡-CD11c-APC y anti-CD19-PerCpCy5.5 o anti-CD3e-PerCpCy5.5. Para los experimentos de evaluación de la contribución de células 120G8+ a la producción de citocina in vivo después del tratamiento con CpG, los ratones son inyectados i.p. con 120G8 ascitas en el día -1 y en el momento del tratamiento con CpG. Seis horas después de la inyección con CpG, la sangre es recolectada a través de punción cardiaca inmediatamente después de la muerte. El suero es preparado a partir de sangre entera mediante coagulación durante 30 minutos a 37°C y centrifugación, y los sueros son congelados hasta que se analizan para los contenidos de citocina. Las células del bazo se aislan para evaluar la eficiencia de depleción a través de citometría de flujo.

EJEMPLO 1 Selección de reactivo 120G8 de anticuerpo monoclonal contra pDC de ratón Los sobrenadantes de 2400 hibridomas se seleccionan para reactividad con menos de 5% de células de las preparaciones celulares del bazo de ratón totales y se clasifican además para la reactividad en la depleción del bazo de células CD3+, CD19+, TER 19+, CD1 1 b+. Cinco placas de 96 pozos fuera de las 25 placas resultantes de la fusión se congelan a -80°C en HS complementado con DMSO al 10%. Dos de estas 5 placas no son congeladas, y se alimentan con DMEM F12 completo como se describió anteriormente y los sobrenadantes son clasificados una segunda vez por tinción con FACS en células del bazo totales (menos de 5%). Los sobrenadanetes seleccionados se analizan para su reactividad en células de la médula ósea y del bazo CD11c+. El sobrenadante de un hibridoma, de nombre 120G8, se encuentra que reacciona solamente con un subconjunto principal de células CD1 1 c+ de médula ósea (60-70%), y un subconjunto CD1 1 clow menor de células CD 1 c+ del bazo (10-20%). El hibridoma es clonado a través de dilución de limitación. El clon resultante, una vez seleccionado para una reactividad similar como la línea de origen, además se clona por dilución de limitación y se selecciona para la reactividad más alta en células CD1 c+ de ratón, es decir la capacidad más alta para producir el Ab (clon 6). El anticuerpo es producido a partir del progenitor y el clon 6 en ascitas y sobrenadantes de alta densidad. MAb 120G8 se encuentra que es del isotipo \gG1/k según se determina por ELISA. Conforme a las células 120G8+ en el bazo parecen también ser células CD1 1 c+B220+Gr1 + (definidas en otros tiempos como pDC de ratón) que parecen ser de particular interés, el mAb 120G8 se selecciona para estudios adicionales.

EJEMPLO 2 120G8 mAb es altamente reactivo con IFN-cc de ratón que produce células ÍpDCI La reactividad de 120G8 mAb además examina en células del bazo no estimuladas, usando estudios de doble inmunofluorescencia con 120G8 acoplado a Alexa 488 y marcadores específicos del linaje. 120G8 Ab tiñe un subconjunto pequeño de células esplénicas aisladas recientemente que son homogéneas en una dispersión hacia delante y lateral. Este subconjunto no expresa TER1 19 (marcador de linaje de eritrocitos), CD19 (marcador de linaje de linfocito B), CD3e (marcador de linaje de linfocito T), y DX5 (marcador de linaje de células Nk). Todas las células 120G8+ también son CD11 cbaj0 confirmando que Ab tiñe un subconjuto de DC esplénicas. Estos resultados son representativos de por lo menos 3 experimentos. Posteriormente, la capacidad de 120G8 mAb para reconocer específicamente IFN- que produce células (IPC) se analiza in vitro. Las células CD1 1 c+ esplénicas ya han demostrado que son las únicas células que producen cantidades altas de INFa in vitro en respuesta al virus de la influenza (Paturel et al., Nat Immunol, 2001 ). Las células CD c+120G8+ y CD1 1 c+120G8" se purifican por citometría de flujo a partir de células de bazo que experimentan depleción de células CD3+CD19+CD8 TER119+. Los dos subconjuntos son estimulados in vitro a través del virus de la influenza inactivido o CpG como se describió anteriormente. El experimento se realiza 3 veces y proporciona resultados similares. La producción de IFN-a e IL-12p40 de ambas poblaciones clasificadas incubadas con medio solamente estuvieron por debajo del nivel detección ELISA. Sólo el subconjunto 120G8+ de células CD11c+ produce IFN-a después de la estimulación con virus de la influenza y CpG. La producción de IFN-a a través de células clasificadas 120G8" en respuesta al virus de la influenza y CpG fue muy baja o tuvo niveles de detección bajos. Las células 120G8+ también tienen la capacidad de producir IL-12p40 en respuesta a ambos estímulos, pero para la estimulación CpG, a un nivel más bajo que el de las células 120G8-, un subconjunto que incluye DC CD11calt0. Esto concuerda con los datos previos que muestran que las DC CD8a+CD11calt0 tiene la capacidad de producir cantidades altas de IL- 2 en respuesta a varios estímulos.

EJEMPLO 3 Fenotipos superficial de células esplénicas 120G8+CD11c+ Las pDC de ratón han sido descritas previamente por ser células CD11c+Gr1+B220+ en el bazo (Paturel, 2001 , Nagano, 2001 , Bjorck, 2001 ), y células CD11c+B220+CD 1b- en DC derivadas in vitro de células de la médula ósea. Para estudiar el fenotipo superficial de células 120G8+, en comparación con DC aisladas ex vivo y derivadas in vitro 120G8-CD11c+DC, CD1 1c+ en FLT3L se tiñen con 120G8, CD11 c y diversos Abs se acoplan a PE. Cuando las células CD1 1 c+ esplénicas aisladas ex vivo son analizadas, las células 120G8+ son B220alto, Gr1bajo, Ly6Calt0, CD11 b', CD8aneg baj0, IAd bajo y H-2Kd+, mientras que las células CD11c+120G8- son B220ne9/bajo, GrT, Ly6Cneg/bajoj CD^ ^ CD8aneg/alt0, IA d ba]0/alto y H-2Kd+. 1208G8. El fenotipo 120G8 acopla bien con el fenotipo superficial descrito previamente de las pDC de ratón. Además, 120G8 también tiñe las pDC de ratón CD11 b-CD11 c+B220+ previamente identificas, derivadas in vitro en cultivos celulares de médula ósea estimuladas con FLT3L (BM-DC). Cuando los BM-DC se analizan, las células 120G8+ son B220alto, Gr1ne9/baj'°, Ly6Calt0, CD11b" mientras que las células 120G8" son B220neg/ ai°, Gr1', Ly6Cneg, CD11b÷. De esta forma, 120G8 mAb tiñe tanto las pDC esplénicas de ratón como las pDC derivadas in vitro.

EJEMPLO 4 120G8 es un marcador inicial de diferenciación de las pDC de ratón La tinción con 120G8 mAb sobre BM-DC (FLT3L) se investiga entre el día 6 y 10 de la diferenciación de las pDC in vitro. Las células son teñidas con 120G8, CD11c, CD11b y B220. 120G8 mAb no tiñe las células CD11c- del día 6 al 10. Sin embargo, todas las células 120G8+ son células CD 1c+CD1 -B220+ tan pronto como 6 días después del cultivo. Un sübconjunto de B220+CD11 c+120G8- puede ser detectado, y es CD11b+ y probablemente emitido de las DC miloides CD11 b+. Mientras el porcentaje de células CD11c+ se incrementa del día 6 (70%) al 8 (90%), y permanece constante hasta el día 10, el porcentaje de células 120G8+ entre las células CD1 1c+ se incrementa lentamente desde el día 6 (23%) al 8 (38%), y en adelante rápidamente disminuye (4% al día 10). Estos resultados demuestran que 120G8 mAb es un marcador inicial de pDC de ratón junto con su diferenciación in vitro.

EJEMPLO 5 Fenotipo superficial de células 120G8+ en diversos órganos linfoides La tinción de 120G8 mAb se investiga en el bazo, médula ósea, sangre, timo, nodo linfático periférico y mesentérico de ratones Balb/c. Células aisladas son analizadas en tinción superficial cuádruple con 120G8, anti-CD45R/B220, anti-Ly6C y anti-CD11c Abs. Las expresiones de Ly6C y B220 en células CD1 1c+120G8+ y CD1 1c+120G8- se investigan. En todos los órganos analizados y en la sangre, CD1 1 c+120G8+ son todos B220altoLv6Calto. En contraste, CD11 c+120G8- no fueron B220altoLy6Calto Esto demuestra que 120G8 mAb puede reconocer células de pDC de ratón (CD11c+ B220altoLy6Calto), sin considerar de cual tejido habían sido aisladas.

EJEMPLO 6 Frecuencia de células 120G8+ en cepas de ratón diferentes La capacidad de 120G8 mAb para reaccionar con cepas de ratón de diferentes formas de pDC se investiga también. 120G8 mAb reacciona con pDC esplénicas aisladas de ratones BALB/cByJ, 129 SvPas, C57BI/6J, CBA/J, C3H/HeN y DBA/2J de ratón. La frecuencia del subconjunto de DC 120G8+ entre las células del bazo totales de aquellas 6 diferentes cepas de ratón se investiga también. Las células del bazo son aisladas del ratón de la misma edad (3 ratones por cepa de ratón, experimento realizado dos veces), y teñidas con 120G8, CD11c, CD19 y CD3e. Las células CD19/CD3e+ se proveen para el análisis. El análisis de la frecuencia de las pDC entre las células del bazo muestra que ésta varía dependiendo sobre que cepa del ratón se considera, por ejemplo, el ratón C57/BI6 exhibe la frecuencia de las pDC esplénicas más baja (0.6%+/-0.06 de células del bazo totales), y los ratones 129Sv la frecuencia más alta (1 .94%+/-0.37 de células del bazo totales).

EJEMPLO 7 Teñido Inmunohistoquímico de 120G8 en sección de tejido La distribución in situ de células 120G8+ se examina a través de análisis inmunohistoquímico de timo, bazo, parches de peyer, nodo linfático periférico, nodo linfático mesentérico. En todos estos órganos, las células individuales 120G8+ se pueden detectar. En algunos órganos, (por ejemplo, el timo), parte de una baja tinción en las células endotelial se puede detectar. Parte de una baja tinción en la vellosidad intestinal también es detectada.

EJEMPLO 8 120G8 se mantiene en pDC de ratón después de la activación in vitro BDCA2, CD 23, BDCA4 son tres marcadores comúnmente usados para detectar las pDC en humanos. Sin embargo, se sabe que las pDC de humano activadas subregulan estos marcadores muy rápidamente in vitro. De esta forma, ha sido muy difícil hasta la fecha detectar las pDC activadas in situ. En el ratón las pDC (pasivas o activas) se detectan comúnmente a través de una doble tinción con anti-CD1 1 y anti-CD45R/B220, pero esta combinación tiñe otras cepas, por ejemplo linfocitos B. Con el propósito de evaluar la tinción con 120G8 en las pDC pasivas o activas, las células esplénicas CD1 1 c+ purificadas con MACS, de ratones 129Sv se incubaron in vitro durante 20h con o sin virus de la influenza inactivado y CpG ODN 1668 (TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT) (SEQ ID NO:2). La intensidad de fluorescencia promedio de la tinción con 120G8 mAb permanece constante en un subconjunto de CD11 c+B220altoCD1 1b" (pDC) pequeño, en todas las condiciones analizadas. Aunque parte de CD1 c"l'B220alto120G8" se detecta después del virus de la influenza y estimulación con CpG, aquellas células también expresan CD1 1 b, lo que sugiere que parte de las DC mieloides puede sobre-regular B220, pero no 120G8, confirmando además la especificidad de la tinción con 120G8 sobre las pDC. Con el propósito de confirmar que 120G8 mAb también tiñe pDC activo in vivo, los ratones 129Sv se tratan con CpG como se describió en los métodos. Las células del bazo se aislan 6 horas después de la inyección con CpG y marcadores de activación, expresados en las DC, se estudian en subconjuntos de DC. Las células 120G8+ sobre-regulan las moléculas de activación DC tal como CD40, CD86, y a un grado menor CD8a y moléculas clase II MHC después de la estimulación in vivo con CpG. Aquellas células muestran el mismo nivel de CD c (bajo) y CD b (negativo) en el control y ratones tratados con CpG, y la intensidad de fluorescencia promedio de la tinción con 120G8 en las pDC permanece constante. De esta manera 120G8 mAb reconoce las pDC en estado pasivo y activo, ambas in vitro e in vivo.

EJEMPLO 9 Localización de células 120G8+ en el bazo de ratón activado con CpG y normal Mientras algunos estudios han mostrado que las pDC de humano se localizan en la zona del linfocito T, las células que producen IFNor en respuesta a la infección con HSV se han ubicado en la zona marginal esplénica en el ratón (Eloranta. Alm, Scand J Immunol, 1999). Los estudios de tinción inmunohistoquímica, según como se presenta en el ejemplo 7 sugiere que las pDC esplénicas en ratones normales se localiza en la zona del linfocito T. Como 120G8 mAb parece como una herramienta única para teñir las pDC en estado pasivo y activo in situ, se trataron ratones 129Sv con CpG como se describe en los métodos, con el propósito de seguir la localización de las pDC en el ratón en el bazo. Este estudio se realiza a través de análisis de inmunofluorescencia in situ, con co-tinción en el bazo, 6 horas después del tratamiento con CpG, de células 120G8+ en fluorescencia verde (Alexa488 fluorocromo) y T, B, DC o macrófagos en fluorescencia roja (Alexa594 fluorocromo, con anti-CD3e, anti-CD19, anti-CD1 1 c (clon N418) y anti-CD 1 b mAbs). Se debe observar que la célula 120G8+ no es teñida por CD 1c bajo condiciones de experimentación utilizadas aquí, debido a la baja expresión de CD 1c por pDC. Así, solamente CD 1 calt0 se detecta por tinción con CD 1 c in situ. Las secciones seriales se analizan para la co-tinción de CD19, CD3 o CD1 1 b con 120G8. En animales inactivos, 120G8 mAb tiñe la célula de ambas la zona del linfocito T (tinción CD3a) y la zona marginal (tinción CD1 1 b). No se pueden encontrar células 120G8+ en la zona de linfocito B (tinción CD19). Las células CD1 1calto (tinción CD11c) se detectan en el canal de formación de puente entre la pulpa y la zona de linfocito T, pero no muestran el mismo patrón de distribución que las pDC. En el bazo activado con CpG, 120G8 mAb tiñe células de la zona marginal. No se detectan o se detectan algunas células 120G8+ en la zona del linfocito B o T. Por el contrario, un flujo hacia adentro masivo de células CD 1calt0 se puede detectar en la zona de linfocito T. De esta forma, 120G8 mAb se puede usar para seguir la migración de las pDC en respuesta a la activación, directamente in situ.

EJEMPLO 10 Depleción in vivo de células 120G8 en la producción de IFN-a En estudios anteriores, el papel de las pDC en infecciones víricas ha sido demostrado mediante la depleción de aquellas células con tratamiento anti-Ly6G/C (Gr1 ). Este tratamiento, además de pDC y neutrofilos, también realiza la depleción posiblemente de una proporción de macrofágos y de linfocitos T activados. De esta forma el uso de 120G8 para realiza la depleción específicamente de las pDC puede ser de un gran uso para los estudios in vivo. Los ratones BALB/c se inyectan i.p. o con 120G8 mAb y 24 horas después, la células del vaso se aislan para el análisis fax d el frecuencia de Ly6C+B220+CD11c+ en células del vaso, así como el nivel de células de contaminación CD19 o CD3e , ambas en ratones no tratados y tratados con 120G8 (3 ratones por grupo). El tratamiento ¡n vivo con 120G8 Ab disminuye la frecuencia de células esplénicas Ly6C+B220+CD 1 c\ Además, las células Ly6C+B220+CD1 1 c+ restantes no todas son pDC, debido a que expresan CD3LTO (42%) y a un menor grado CD19 (18%). Para valorar el efecto de la depleción 120G8 en la producción de IFNa, la producción de IFNoc e IL 12 sérica se analiza 6 horas después del tratamiento con CpG en ratones 129Sv (3 ratones por grupo), previamente experimentados con depleción de células 120G8+ o no. Los sueros de ratón de control (solamente DOTAP) son negativos para ambas citocinas. El tratamiento con 120G8 abolisa completamente la producción de IFNa inducida por el tratamiento de CpG (13300 PG/ML+/-1500 para ratones normales, menos de 150 PG/ L para ratones tratados, con 120G8), mientras que resultan en una pequeña inhibición de producción de IL 12, ambas p40 y p70 (!L-12p70: 240 pg/ml+/-540 para ratones normales, 300 pg/ml+/-74 para ratones tratados con 120G8; IL-12p40:5806 pg/ml+/- 135 para ratones normales, 4250 pg/ml+/-1 170 para ratones tratados con 120G8). De esta forma 120G8 mAb se puede usar para realizar la depleción de ratones de células que producen IFNa in vivo.

EJEMPLO 11 La expresión de 120G8 es sobre-regulada en linfocitos B en presencia de IFNct 20G8 mAb tiñe solamente las pDC entre las células inactivadas totales aisladas de ratones normales. Se investiga sí algunas otras células pueden ser teñidas a través de 120G8 después de la activación con citocina. Las células del bazo son aisladas de ratones Balb/c y se encuban durante 24 horas en presencia de citocinas. La tinción doble con 120G8 y anti-CD19, CD4, CD8 o CD11c mAbs entonces es analizada en estas células. Las células autofluorescentes se proveen usando el canal FL3. Esto demuestra que el antígeno reconocido por 120G8 mAb es sobre-regulado en linfocitos B y las DC CD1 c+ en respuesta a IFN-a en 100U/ml, pero no en T CD4+ ó en DC T CD8+. Esta sobre-regulación no se observa respuesta a IFNy, IL-12 o TNFa. Sin embargo la intensidad de fluorescencia promedio del teñido con 120G8 sobre los linfocitos B permanece aún al menos un log más bajo que en las pDC. Se puede realizar diversas modificaciones y variaciones de esta invención sin desviarse de la esencia y el alcance, como será obvio para aquellos expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente se ofrecen solamente a manera de ejemplo, y la invención no se limita solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con e! alcance total de equivalentes a los cuales tales reivindicaciones son calificadas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Schering Corporation <120> Anticuerpos Específicos para Células Dendríticas Plasmacitoides <130> SF06011WI01 <150> US 60/443,244 <151> 28-01-2003 <160> 2 <170> Patente en versión 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligodesoxynucleótido (ODN) <400> 1 tcattggaaa acgttcttcg gggcg <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligodesoxynucleótido (ODN) <400> 2 tccatgacgt tcctgatgct

Claims (7)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION
2. REIVINDICACIONES
3. .- Un compuesto de unión que tiene las características de unión del anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma depositada bajo el número de acceso de la ATTC PTA-4957. 2.- El compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 3.- Un fragmento de unión de antígeno de un anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma depositada bajo el número de acceso de la ATCC PTA-4957.
4. 4.- El anticuerpo monoclonal producido por la línea celular hibridoma depositada bajo el número de acceso de la ATCC PTA-4957.
5. 5.- La línea celular hibridoma depositada bajo el número de acceso de la ATCC PTA-4957.
6. 6.- Un método para purificar células dendríticas plasmacitoides a partir de una muestra que contiene las células dendríticas plasmacitoides, el método comprendiendo las etapas de poner en contacto dicha muestra con el compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 1 y después recuperar las células dendríticas plasmacitoides que se han unido a dicho compuesto de unión.
7. 7.- Un método para identificar células dendríticas plasmacitoides a partir de una muestra que contiene dichas células dendríticas plasmacitoides, el procedimiento comprendiendo las etapas de poner en contacto la muestra con el compuesto de unión de conformidad con la reivindicación 1 para formar un complejo anticuerpo/células dendríticas plasmacitoides; y detectar la presencia de dicho complejo.