KR20160103002A - 면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 ｔ―세포들의 조작 방법 - Google Patents

면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 ｔ―세포들의 조작 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암을 가진 환자를 치료하기 위하여 화학요법과 함께 면역요법을 위한 "기성품인" 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들의 사용에 대한 것이다. 특히, 본 발명자들은 화학치료 제제들에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포를 조작하는 방법을 개발한다. 이 전략에 의하여 제공되는 치료적 이점들은 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강된다. 특히, 본 발명은 T-세포 수용체 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 것에 의한, 그리고 상기 T-세포들을 변형시켜 약물 저항성을 부여하는 것에 의한 T-세포들의 변형 방법에 대한 것이다. 본 발명은 암을 치료하기 위한 안정적이고 알맞은 입양 면역요법 전략들에 대한 길을 연다.

Description

면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 Ｔ―세포들의 조작 방법{METHOD OF ENGINEERING CHEMOTHERAPY DRUG RESISTANT T-CELLS FOR IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 암환자들을 치료하기 위하여, 화학요법(chemotherapy)과 함께 면역요법(immunotherapy)을 위한 "기성품인(off-the-shelf)" 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들의 이용에 대한 것이다. 특히 본 발명자들은 화학요법제들(chemotherapeutic agents)에 저항성인 동종이형 T-세포들을 조작하는 방법을 개발하였다. 이 전략에 의하여 제공되는(afforded) 치료적 이점들은 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강된다. 특히, 본 발명은 T-세포 수용체(receptor) 요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 그리고 상기 T-세포들을 약물 저항성을 부여하도록 변형함으로써 T-세포들을 변형하는 방법에 대한 것이다. 본 발명은 암을 치료하기 위한, 표준 및 알맞은(affordable) 입양(adoptive) 면역요법 전략들로의 길을 연다.
엑스 비보(ex vivo)에서 만들어내는 자기유래(autologous) 항원-특이적 T-세포들의 전달(transfer)을 수반하는 입양 면역요법은 암을 치료하는 유망한 전략이다. 입양 면역요법에 사용되는 T-세포들은 유전공학을 통하여 T-세포들의 방향수정(redirection) 또는 항원-특이적 T 세포들의 확장에 의하여 만들어질 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T-세포들의 전달(transfer)은 희귀한 바이러스-관련 악성종양들(malignancies) 및 이식 관련 바이러스 감염들의 치료에 사용되는 잘-확립된 절차이다. 유사하게 종양(tumor) 특이적 T-세포들의 분리 및 전달은 흑색종(melanoma)를 치료하는데 성공적인 것으로 보여져 왔다. T-세포들에서 신규한 특이성들이 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들(receptors) (CARs) 또는 형질전환(transgenic) T 세포 수용체들의 유전적 전달을 통하여 성공적으로 발성되어 왔다. CAR들(CARs)은 단일 융합 분자 내 하나 또는 그보다 많은 신호전달(signaling) 도메인들(domains)과 관련된 타겟팅(targeting) 모이어티(moiety)로 구성되는 합성 수용체들이다. CAR들은 림프종들(lymphoma) 및 고형암들(solid tumors)을 포함하는 여러가지 악성종양들(malignancies)로부터 암 세포들의 표면에 발현되는 항원들에 대항하여 T-세포들이 방향을 수정하도록(redirect) 성공적으로 허용하여 왔다 (Jena, Dotti et al. 2010).
입양 면역요법을 이용하는 환자의 치료를 위한 현재의 프로토콜은 자기유래(autologous) 세포 전달에 기초한다. 이 접근에서, T 림프구들(lymphocytes)이 환자들에게서 회수되고, 엑스 비보에서 선택되거나 유전적으로 변형되고, 필요하다면 세포들의 수를 증폭시키기 위하여 인 비트로(in vitro)에서 배양되고 최종적으로 환자 내로 주입(infuse)된다. 자기유래(autologous) 요법들은 실제 적용에 상당한 기술적 및 논리적(logistic) 장애물들을 직면하는데, 그것들의 발생은 비싼 전용 시설들 및 전문 인력들을 요구하고, 그것들은 환자의 진단 후 빠른 시간 내에 만들어져야 하고, 많은 경우, 환자의 사전처리(pretreatment)는 저하된(degraded) 면역 기능을 야기하여, 환자의 림프구들이 저조하게 작용하고, 매우 적은 수로 존재할 수 있다. 이러한 장애물들 때문에, 각 환자의 자기유래(autologous) 세포 제제는 효과적으로 새로운 상품이며, 약효 및 안정성에서 상당한 차이를 야기한다.
이상적으로, 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들이, 상세하게 특징되어, 미리 제조되고, 환자들에게 즉시 투여되도록 이용 가능한 표준화된 요법을 사용하고 싶어한다. 그러나 동종이형(allogeneic) T-세포들은 같은 종에 속하지만 유전적으로 다른 개인들로부터 수득된다. 그러므로 동종이형(allogeneic) 세포들 내인성(endogenous) TCR 특이성들은 숙주 조직을 외래(foreign)로 인식하여, 이식편대숙주병(graft versus host disease) (GvHD)을 야기하는데, 이는 심각한 조직 손상 및 죽음을 야기할 수 있다. T 세포(cell) 수용체들(receptors) (TCR)은 항원의 제시에 답하여 T 세포들의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체들이다. 면역글로불린(immunoglobulin) 분자들을 위하여, 알파 및 베타 체인들의 가변(variable) 영역(region)은 V(D)J 재조합(recombination)에 의하여 만들어지고, T 세포들 군집(population) 내 항원 특이성들의 큰 다양성을 만든다. 그러나, 온전한 항원을 인식하는 면역 글로불린들과는 대조적으로, T 세포들은, MHC 제한(restriction)으로 알려진 T 세포들에 의한 항원 인식에 여분의 차원(extra dimension)을 도입하는, MHC 분자와 관련된 가공된(processed) 펩타이드 단편들에 의하여 활성화된다. T 세포 수용체를 통한 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 사이의 MHC 차이들(disparities)의 인식은 T 세포들 증식 및 GVHD의 잠재적 발달로 이어진다. 동종이형(allogeneic) 세포들을 효과적으로 이용하기 위하여, 본 발명자들은 TCR알파(TCRalpha)또는 TCR베타(TCRbeta) 유전자를 불활성화시키는데, 이는 T-세포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기하고 이렇게 하여 동종항원(alloantigen)의 인식 및 이렇게 GVHD을 방지한다.
암 발견(detection) 및 종양 세포 생물학의 영역에서 뛰어난 진보가 이루어져왔음에도 불구하고, 말기 및 전이성 암의 치료는 주된 도전으로 남아 있다. 세포독성 화학요법 제제는 가장 널리 사용되고 성공적으로 이용되는 항암 치료들 중에 있다. 항대사물질들(anti-metabolites), 알킬화제들(alkylating agents), 안트라사이클린들(anthracyclines), DNA 메틸트렌스페라제(methyltransferase) 억제제들, 백금 화합물들(platinum compounds) 및 방추체 독들(spindle poisons)과 같은 몇몇 세포독성 제제(agents)들이 암세포들을 죽이기 위하여 개발되어 왔다. 그러나, 그것들은 균일하게 효과적이지 않고, 면역요법들과 같은 신규 요법들에 이들 제제들의 도입은 문제가 많다. 예를 들어, 화학요법 제제들은, 제제들의 비특이적 독성(toxicity) 프로파일들(profiles) 때문에, 탄탄한 항종양 면역적격(immunocompetent) 세포들의 확립에 해로울 수 있다. 세포 증식 경로들을 타겟팅하는 작은 분자-에 기초한 요법들은 또한 항종양 면역력(immunity)의 확립을 방해할 수 있다. 그러나, 만약 일시적으로 효과적인 화학요법 양생법(regimen)이 신규 면역적격(immunocompetent) 세포 요법들과 결합할 수 있으면, 그 다음에 항-신생(neoplastic) 요법에서 중요한 개선이 달성될 수 있다(리뷰를 위하여 (Dasgupta, McCarty et al. 2011)).
이런 식으로, 화학요법과 함께 "기성품인(off-the-shelf)" 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들을 이용하기 위하여, 본 발명자들은 화학치료적 제제들에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포를 조작하는 방법을 개발한다. 이 전략에 의하여 제공되는 치료적 이점들은 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강될 것이다. 게다가 약물 저항성은 또한 조작된 T-세포 요법을 선택적으로 확장하는 능력으로부터 이익을 얻을 수 있고, 이로써 이들 세포들로의 비효율적인 유전자 전달에 기인하는 문제들을 피한다.
- 도 1은 퓨린(purine) 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사체들(analogs) (PNAs)의 세포 독성 및 경로의 도식적인 표시에 부합한다; 효소 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제 (dCK)의 불활성화는 약물들 클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)에 대한 저항성을 부여한다;
- 도 2는 효소 하이포크산틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포리보실트랜스페라제(phosphoribosyltransferase) (HPRT)가 약물들 6-머캅토퓨린(Mercaptopurine) (6MP) 및 6 티오(thio)-구아닌(guanine) (6TG)에 대한 저항성을 부여하는 것을 보여준다;
- 도 3A는 엑손들 및 인트론들의 면에서 전체 dCK 유전자 건축을 묘사하고, 도 3B는 dCK 엑손 2에서 2 TALE-뉴클레아제 TKd들에 위치한 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들의 서열들을 보여준다;
- 도 4는 HPRT KO T 세포들을 만들고 특징화하는 것을 따르는 작업 흐름을 보여준다; D0은 일(Day) 0을 나타내고, Dn은 일(Day) n을 나타내고 ; T7은 엔도 T7 분석에 대응한다;
- 도 5는 dCK 유전자의 가공을 체크하기 위한 엔도 T7 분석으로부터 얻어진 결과들을 나타낸다; 위쪽 밴드는 가공되지 않은 WT dCK 유전자에 대응하고, 2 개의 아래쪽 밴드들은 가공된 dCK 유전자에 대응한다;
- 도 6은 전기천공 후 14 일의 기간 동안 WT T-세포들 대조군들 1 및 2 및 dCK2 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA 5 μg 또는 10 μg으로 처리된 dCK KO T-세포들의 세포 확장을 나타낸다.
- 도 7은 1 μM 클로파라빈(clofarabine) (+)의 존재 하 또는 클로파라빈(clofarabine) (-)의 부존재 하 (5 μg의 TALE-뉴클레아제 dCK 2 쌍을 이용함으로써) T 세포들에서 dCK 불활성화를 체크하기 위한 일(Day) 8 (D8)에 수행된 엔도 T7 분석을 나타낸다;
- 도 8은 증가하는 양의 클로파라빈(clofarabine) (10 nM 내지 10 μM)의 존재 하 2 일 동안 배양된 (dCK2 TALE-뉴클레아제 쌍을 코드하는 mRNA 5 μg 또는 10 μg으로 처리된) WT 및 dCK KO T 세포들의 세포 생존능의 퍼센트를 나타낸다. 이 그래프는 둘다 세포 군집들에 대한 클로파라빈(Clofarabine) IC50을 결정하도록 한다;
- 도 9는 클로파라빈(clofarabine) 저항성 동종이형(allogeneic) T 세포들을 만들고 특징화하는데 사용되는 2 개의 작업흐름들을 보여준다; 위쪽의 하나는 약물 선택이 수행되었을 때의 경우에 대응하고, 대조적으로 아래쪽 것은 약물 선택이 이루어지지 않았던 것이다; 일(Day) 0 (D0)는 TRAC 및 dCK TALE-뉴클레아제들에 의한 이중 전기천공이 현실이 된(realized) 날이다;
- 도 10은 전기천공 후 다른 시기들(D1, D3 및 D6)에 T-세포들에서 이중 KO dCK/TRAC의 약효를 유전적으로 체크하기 위한 엔도 T7 분석에 대응한다. 각각의 자리들에 대하여 사용된 프라이머들은 예에서 나타나 있으며, 단순한(simple) KO dCK T-세포 (+-) 및 단순한 KO TRAC T-세포 (-+), 이중(double) KO dCK/TRAC T-세포들 (++) 및 WT T 세포들 (--)이다; 아래쪽 밴드들은 정확한(correct) dCK 및 TRAC 유전자 가공(processing)을 의미한다;
- 도 11은 TRAC 불활성화와 같이 (+) 또는 없이 (-), 클로파라빈(clofarabine)의 부존재 (-) 또는 존재 (+) 하 dCK 불활성화의 약효를 체크하기 위한 딥 시퀀싱 데이터 및 엔도 T7 분석에 대응한다, 범례(legend)는 도 10보다 동일하다; 삽입-결실(indel) 빈도는 dCK 자리에서 삽입들/결실들의 비율(rate)을 평가하기 위하여 수행되었다;
- 도 12A는 항 TCR mAb-PE의 부존재 하 (표지되지 않은 T 세포들) 또는 존재 하 (표지된 T 세포들) T 세포들로 수행된 표지 대조군 실험을 나타낸다; 도 12B는 TRAC KO T 세포들 정제 전 및 후 클로파라빈의 존재 또는 부존재 하 배양 후 수집된 TCAR 음성(negative) 세포들을 모니터하는 것이다. 이들 세포들은 또한 dCK 유전자에 대하여 불활성화되었다;
- 도 13은 전기천공 후 12일의 기간 동안 클로파라빈의 부존재 하 WT T-세포들 대(versus) 이중 KO dCK/TRAC T 세포들 및 단순한 KO dCK 및 TRAC T-세포들의 성장 속도를 보여준다;
- 도 14는 11일의 기간 동안 (클로파라빈과 같이 또는 없이) CAR T 세포들에 비교하여 다른 클로파라빈(clofarabine) 투여량들(doses)(0.1 부터 10 μM까지)를 갖는 배지들에서 dCK/TCAR 이중 KO CAR T-세포들의 성장 속도 곡선(cuves)들을 보여준다;
- 도 15는 다른 클로파라빈(clofarabine) 투여량들(doses) (1 nM 부터 100 μM까지)을 갖는 배지들에서 WT T-세포들 대(versus) 단순한 KO dCK 또는 TRAC T 세포들, 이중 KO dCK/TCAR T-세포들에 대한 세포 생존능의 퍼센트를 보여준다; 이 그래프는 각각의 T 세포들 군집 상 클로파라빈에 대한 IC50의 결정을 하게 한다;
- 도 16은 WT T 세포들 (KO 없음 그리고 CAR 없음) 및 이중 KO TRAC/dCK T 세포들 (CAR 없음, 그러므로 CD19 항원을 발현시키지 않음) 대(versus) CAR FMC63 T 세포들에 비교한 이중 KO TRAC/dCK CAR T 세포들 (둘다 CD19 항원을 발현시킴)에 대한 특이적 세포독성의 퍼센트를 나타낸다;
- 도 17은, 이들 T-세포들이 증가하는 투여량들(doses)의 클로파라빈(clofarabine) (10 ng 내지 100μg, 위쪽 그래프), 및 플루다라빈(fludarabine) (10 μM 내지 100 μM, 아래쪽 그래프)에서 배양될 때, CAR T-세포들 대조군 대(versus) 이중 KO dCK/TCAR CAR T-세포들에 대한 세포 생존능을 보여준다. 이들 그래프들은 두 약물들 클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)에 대한 IC50의 결정을 하게 한다;
- 도 18은 WT 세포들 (-) 대(versus) (5 μg의 dCK TALE-뉴클레아제을 코드하는 mRNA가 사용된) 다우디(Daudi) 세포들 (+)에서 dCK 불활성화의 약효를 유전적으로 체크하기 위하여, 일(Day) 2 (D2)에서의 엔도 T7 분석에 대응한다. 위쪽의 밴드는 가공되지 않은 dCK 유전자에 대응하는 반면, 2 개의 아래쪽 밴드들은 dCK 불활성화의 산물들에 대한 것이다;
- 도 19는 증가하는 야의 클로파라빈(clofarabine) (0.1 내지 1 μM)의 존재 또는 부존재 하 WT 다우디(Daudi) 세포들 대(versus) KO dCK 다우디(Daudi) 세포들의 7일의 기간 동안 (x106 세포들로 발현된) 성장 속도를 나타낸다;
- 도 20은 다른 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들(그것들 모두는 엑손 2에 있음)의 위치 및 엑손들 및 인트론들)의 면에서 전체 HPRT 유전자 건축을 보여준다;
- 도 21은 HPRT KO T 세포들을 만들고 특징화하는데 사용되는 작업흐름을 묘사한다;
- 도 22는 일(Day) 4 (D4), TALE-뉴클레아제 HPRT 쌍들 번호(n°) 1 및 T 쌍 번호(n°) 2에 의하여 T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을 나타낸다(2 투여량들(doses)이 시험되었다; 5 μg 및 10 μg);
- 도 23은 WT T 세포들 대조군 1 및 대조군 2 대(versus), 5 또는 10 μg의 TALE-뉴클레아제 HPRT 1 쌍(pair) (HPRT1) 또는 TALE-뉴클레아제 HPRT 2 쌍(pair) (HPRT2)를 이용하여, KO HPRT T 세포들의 13일의 기간 동안 (x106 세포들로 발현된) 성장 속도를 나타낸다;

- 도 24는 이들 T-세포들이 1 μM의 약물 6TG에서 배양될 때, D8 및 D18에서 [파(par) (-)로 상징된] WT T 세포들 대(versus), 5 또는 10 μg TALE-뉴클레아제 HPRT 쌍들 번호(n°) 1 (TALE-뉴클레아제 HPRT 1)을 이용한, T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을 나타낸다;
- 도 25는 4G7 CAR의 존재 또는 부존재 하 T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을 나타낸다, 이 분석은 6TG 선택 없이 수행되었다;
- 도 26은 WT T 세포들 (KO 없음 그리고 CAR 없음) 및 CAR 4G7 T 세포들에 비교한 KO HPRT CAR T 세포들에 대한 특이적 세포독성 (둘다 CD19 항원을 발현시킴)의 퍼센트를 보여준다;
- 도 27은 증가하는 투여량들(doses)의 6TG 약물에서 (10 ng 내지 50 μM) WT T 세포들 대(versus) KO HPRT CAR T-세포들에 대한 세포 생존능의 퍼센트를 보여준다.
본 발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 면역 세포들의 조작 방법들을 제공하는데, 이는 그것들을 클로파라빈(clorofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)과 같은 퓨린(purine) 뉴클레오타이드(nucleotide) 유사체들(analogs) (PNA)과 같은 화학요법 약물들에 저항성으로 만들어, 그것들을 현재의 화학요법들로 사전처리된 환자들에서 암 면역요법 치료들에 사용될 수 있게 한다. 면역(immune) 세포들은 자기유래(autologous) 치료들을 수행하는 것을 고려하여, TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes)의 경우와 같이 환자로부터 또는 동종이형(allogeneic) 치료들에서 사용될 수 있는, 동종이형(allogeneic) 세포들을 생산하는 것을 고려하여 기증자로부터 유래할 수 있다.
후자의 경우에서, 면역 세포들이 T-세포들일 때, 본 발명은 또한 화학요법 약물들에 저항성이고 동종이형 둘 다로 만들어진 T-세포들을 조작하는 방법들을 제공한다. 이러한 방법들은 dcK 및 HPRT 유전자들과 같은 약물 민감성(sensitizing) 유전자의 불활성화에 더하여, T-세포(T-Cell) 수용체(Receptor) (TCR) 요소, 특히 TCR알파, TCR베타 유전자들을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
또다른 측면에 따라, 약물 저항성 유전자을 발현함으로써 T-세포에 약물들에 대한 저항성이 부여될 수 있다. 디하이드로폴레이트(dihydrofolate) 리덕타제(reductase) (DHFR), 이노신(inosine) 모노포스페이트(monophosphate) 다히아드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2), 칼시뉴린(calcineurin) 또는 메틸구아닌(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT)와 같은 몇몇 유전자들의 여러가지 대립형질들(alleles)이 본 발명에 따른 세포에 약물 저항성을 부여하는 것으로 확인되어 왔다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 분리된 세포들 또는 세포주들, 더욱 특히 여기에 기재된 단백질들, 폴리펩타이드들, 대립(allelic) 변이체들(variants), 변화된(altered) 또는 결실된 유전자들 또는 벡터들을 포함하는 분리된 면역 세포들을 포함한다.
본 발명의 면역 세포들 또는 세포주들은 외인성(exogenous) 재조합 폴리뉴클레오타이드들, 특히 CAR들 또는 자살 유전자들을 더 포함할 수 있고, 또는 그것들은 이상적으로 "기성품인(off the shelf)" 산물로서, 치료적 산물로서 그것들의 효율에 공헌하는 체크포인트 단백질들 또는 그것의 리간드들을 코드하는 변화된 또는 결실된 유전자들을 포함할 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 수득가능한 조작된 면역 세포를 투여함으로써 환자에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 대한 것이다.
본 발명의 자세한 기술
여기에서 특별히 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 요법, 생화학, 유전학 및 분자 생물학의 영역에서 당업자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에서 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 모든 방법들 및 물질들은, 여기에서 기재된 적절한 방법들 및 물질들과 함께, 본 발명의 시험 또는 실행에 사용될 수 있다. 여기에서 언급된 모든 공개들, 특허 출원들, 특허들 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고로서 포함된다. 충돌의 경우에, 정의들을 포함하는 본 명세서가 우선된다. 나아가, 물질들, 방법들 및 예들은 설명을 위한 것일 뿐이며, 다르게 특정되지 않는한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 실행은, 다르게 표시되지 않는 한, 기술(art)의 기술(skill) 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식(transgenic) 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 현재의 기술들(techniques)을 이용할 것이다. 이러한 기술(techniques)들은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.
- 약물 저항성 T-세포들
여기에서 사용된 대로 용어들 "치료 제제(therapeutic agent)", "화학요법 제제(chemotherapeutic agent)" 또는 "약물(drug)" 은 암 세포와 상호작용을 할 수있어, 이로써 세포의 증식 상황(status)을 감소시키고 그리고/또는 세포를 죽이는 화합물 또는 그 유도체(derivative)를 가리킨다. 화학요법 제제들의 예들은 알킬화제들(alkylating agents) (예를 들어, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosamide)), 대사(metabolic) 길항제들(antagonists) (예를 들어, 클로파라빈(clofarabine), 플루다라빈(fludarabine) 또는 2'-디옥시아데노신(deoxyadenosine), 메토트렉사트(methotrexate) (MTX), 5-플루오로우라실(fluorouracil) 또는 그 유도체들과 같은 퓨린(purine) 뉴클레오사이드 대사저해제(antimetabolite)), 항종양 항생제들 (예를 들어, 미토마이신(mitomycin), 아드리아마이신(adriamycin)), 식물-유래 항종양 제제들 (예를 들어, 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 탁솔(Taxol)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 에토포시드(etoposide) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 제제들은 항암 제제들은 TRIMETHOTRIXATE™ (TMTX), TEMOZOLOMIDE™, RALTRITREXED™, S-(4-나이트로벤질(Nitrobenzyl))-6-티오이노신(thioinosine) (NBMPR), 6-벤질구아니딘(benzyguanidine) (6-BG), 비스(bis)-클로로나이트로소우리(chloronitrosourea) (BCNU) 및 CAMPTOTHECIN™, 또는 임의의 그것의 치료적 유도체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에서 사용된 대로, 제제에 "저항성(resistant) 또는 잘 견디는(tolerant)" 세포는 유전적으로 변형되어, 변형 없는 세포의 증식을 예방하거나 또는 억제하는 제제의 상당량 존재 하, 세포가 증식하는 세포를 의미한다.
약물 저항성 유전자들의 발현
특정 예에서, 상기 약물 저항성(drug resistance)은 적어도 하나의 약물 저항성 유전자의 발현에 의하여 T-세포에 부여될 수 있다. 상기 약물 저항성 유전자는 화학요법 제제 (예를 들어 메토트렉사트(methotrexate))와 같은 제제에 "저항성(resistance)"을 코드하는 핵산 서열을 가리킨다. 다시 말해서, 세포 내 약물 저항성 유전자의 발현은 약물 저항성 유전자가 없는 상응하는 세포의 증식보다 더 큰 정도로 제제의 존재 하 세포들의 증식을 가능하게 한다. 본 발명의 약물 저항성 유전자는 항-대사물질(metabolite), 메토트렉사트(methotrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 시스플라틴(cisplatin), 알킬화제들(alkylating agents), 안트라사이클린들(anthracyclines), 세포독성 항생제(antibiotics), 항-이뮤노필린(immunophilins), 그것들의 유사체들 또는 유도체들, 등에 대한 저항성을 코드(encode)할 수 있다.
몇몇 약물 저항성 유전자들은 타겟인 세포들에 약물 저항성을 부여하는데 잠재적으로 이용될 수 있는 것으로 확인되어 왔다 (Takebe, Zhao et al. 2001; Sugimoto, Tsukahara et al. 2003; Zielske, Reese et al. 2003; Nivens, Felder et al. 2004; Bardenheuer, Lehmberg et al. 2005; Kushman, Kabler et al. 2007).
약물 저항성 유전자의 한 예는 또한 디하이드로폴레이트(Dihydrofolate) 리덕타제(reductase) (DHFR)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. DHFR은 세포에서 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate)의 양을 조절하는데 관련된 효소이며, DNA 합성에 필수이다. 메토트렉사트(methotrexate) (MTX)와 같은 엽산(Folate) 유사체들(analogs)은 DHFR을 억제하고, 그러므로 임상에서(in clinic) 항-신생(neoplastic) 제제들로서 사용된다. 치료에서 사용되는 항-엽산(folates)에 의한 억제에 대하여 증가된 저항성을 갖는 DHFR의 다른 돌연변이 형태가 기재되어 왔다. 특정 예에서, 본 발명에 따른 약물 저항성 유전자는 메토트렉사트(methotrexate)와 같은 항-엽산(folate) 치료에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 인간 야생형 DHFR (서열번호: 14, GenBank: AAH71996.1)의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일 수 있다. 특정 예에서, DHFR의 돌연변이 형태는 G15, L22, F31 또는 F34 위치에서, 바람직하게는 L22 또는 F31 위치들에서 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산을 포함한다 ((Schweitzer, Dicker et al. 1990); International application WO94/24277; US patent US6,642,043). 특정 예에서, 상기 DHFR 돌연변이 형태는 L22 및 F31 위치들에서 두 개의 돌연변이된 아미노산들을 포함한다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성(correspondence)은 서열번호: 14 의 야생형 DHFR 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다. 특정 예에서, 위치 15 의 세린(serine) 잔기는 바람직하게는 트립토판(tryptophan) 잔기로 대체된다. 또다른 특정 예에서, 위치 22의 류신(leucine) 잔기는 바람직하게는 돌연변이 DHFR의 항엽산제들(antifolates)에 대한 결합을 방해할 아미노산으로, 바람직하게는 페닐알라닌(phenylalanine) 또는 티로신(tyrosine)과 같은 전하가 없는(uncharged) 아미노산 잔기들로, 대체된다. 또다른 특정 예에서, 위치들 31 또는 34 의 페닐알라닌(phenylalanine) 잔기는 바람직하게는 알라닌(alanine), 세린(serine) 또는 글라이신(glycine)과 같은 작은 친수성 아미노산으로 대체된다.
여기에서 사용된 대로 "항엽산 제제(antifolate agent)" 또는 "엽산(folate) 유사체들(analogs)"은 상당(some) 수준에서 엽산(folate) 대사 경로와 상호작용하도록 향해지는 분자를 가리킨다. 항엽산 제제들의 예들은 예를 들어, 메토트렉사트(methotrexate) (MTX); 아미놉테린(aminopterin); 트리메트렉사트(trimetrexate) (Neutrexin™); 에다트렉사트(edatrexate); N10-프로파르길(propargyl)-5,8-디데아자폴릭 액시드(dideazafolic acid) (CB3717); ZD1694 (Tumodex), 5,8-디데아자이소폴릭 액시드(dideazaisofolic acid) (IAHQ); 5,10-디데아자테트라하이드로폴릭 액시드(dideazatetrahydrofolic acid) (DDATHF); 5-디아자폴릭 액시드(deazafolic acid); PT523 (N 알파-(4-아미노-4-디옥시프테로일(deoxypteroyl)-N 델타-헤미프탈로일(hemiphthaloyl)-L-오르니틴(ornithine)); 10-에틸-10-디아자아미노프테린(deazaaminopterin) (DDATHF, 로마트렉솔(lomatrexol)); 피리트렉심(piritrexim); 10-EDAM; ZD1694; GW1843; 페메트렉사트(Pemetrexate) 및 PDX (10-프로파르길(propargyl)-10-디아자아미노프테린(deazaaminopterin))을 포함한다.
약물 저항성 유전자의 또다른 예는 또한 구아노신(guanosine) 뉴클레오타이드들의 데노보(de novo) 합성에서 속도(rate)-제한(limiting) 효소인, 이오니신(ionisine)-5'-모노포스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제(dehydrogenase) II (IMPDH2)의 돌연변이 또는 변형된 형태일 수 있다. IMPDH2의 돌연변이 또는 변형된 형태는 IMPDH 억제제 저항성 유전자이다. IMPDH 억제제들은 마이코페놀릭 액시드(mycophenolic acid) (MPA) 또는 그것의 프로드러그(prodrug) 마이코페놀레이트(mycophenolate) 모페틸(mofetil) (MMF)일 수 있다. 돌연변이 IMPDH2는 IMPDH 억제제(inhibitor)에 상당히 증가된 저항성으로 이어지는 야생형 인간 IMPDH2 (서열번호: 15; NP_000875.2)의 MAP 결합 자리(site)에서 적어도 하나, 바람직하게는 두 개의 돌연변이들을 포함할 수 있다. 돌연변이들은 바람직하게는 위치들 T333 및/또는 S351 이다 (Yam, Jensen et al. 2006; Sangiolo, Lesnikova et al. 2007; Jonnalagadda, Brown et al. 2013). 특정 예에서, 위치 333의 트레오닌(threonine) 잔기는 이소류신(isoleucine) 잔기로 대체되고, 그리고 위치 351의 세린 잔기는 티로신(tyrosine) 잔기로 대체된다. 여기에서 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 서열번호: 15의 야생형 인간 IMPDH2 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 약물 저항성 유전자는 칼시뉴린( calcineurin)의 돌연변이 형태이다. 칼시뉴린(calcineurin) (PP2B)은 많은 생물학적 공정들에 관련되고 T-세포 활성화에 중요한 도처에 존재하는(ubiquitously) 발현된 세린/트레오닌 단백질 포스파타제(phosphatase)이다. 칼시뉴린(calcineurin)은 촉매 서브유닛(subunit) (CnA; 3개의 이소형태들(isoforms)) 및 조절 서브유닛(CnB; 2 개의 이소형태들)을 포함하는(compose) 헤테로다이머(heterodimer)이다. T-세포 수용체의 참여(engagement) 후, 칼시뉴린은 전사 인자 NFAT을 탈인산화하고(dephosphorylates), 그것이 IL2와 같은 활성(active) 가장 중요한(key) 타겟 유전자 및 핵으로 이동하는(translocate) 것을 가능하게 한다. FKBP12와 복합체인(complex) FK506 또는 CyPA와 복합체인 사이클로스포린(cyclosporine) A (CsA) 는 NFAT이 칼시뉴린의 활성 자리(active site)로의 접근하는 것으 막고, 그것의 탈인산화(dephosphorylation)를 방지하여 이로써 T-세포 활성화를 억제한다(Brewin, Mancao et al. 2009). 본 발명의 약물 저항성 유전자는 FK506 및/또는 CsA 와 같은 칼시뉴린 억제제에 저항성인 칼시뉴린의 돌연변이 형태를 코드하는 핵산 서열일 수 있다. 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 위치들: V314, Y341, M347, T351, W352, L354, K360 에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머(heterodimer) a의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 위치들 T351 및 L354 또는 V314 및 Y341에서 이중(double) 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 위치 341 의 발린(valine) 잔기는 라이신(lysine) 또는 아르기니(arginine) 잔기로 대체될 수 있고, 위치 341 의 티로신 잔기는 페닐알라닌(phenylalanine) 잔기로 대체될 수 있다; 위치 347 의 메티오닌(methionine)은 글루타민산(glutamic acid), 아르기닌 또는 트립토판(tryptophane) 잔기로 대체될 수 있다; 위치 351 의 트레오닌은 글루타민산 잔기로 대체될 수 있다; 위치 352 의 트립토판 잔기는 시스테인(cysteine), 글루타민산 또는 알라닌(alanine) 잔기로 대체될 수 있고, 위치 353 의 세린은 히스티딘(histidine) 또는 아스파라긴들(asparagines) 잔기로 대체될 수 있고, 위치 354 의 류신(leucine)은 알라닌 잔기로 대체될 수 있다; 위치 360 의 라이신은 서열번호: 16 페닐알라닌 또는 알라닌 잔기로 대체될 수 있다. 여기에서 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 서열번호: 16 의 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 a 폴리펩타이드의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 종종 표현된다(GenBank: ACX34092.1).
또다른 특정 예에서, 상기 돌연변이 형태는 위치들: V120, N123, L124 또는 K125 에서 야생형 칼시뉴린 헤테로다이머 b의 적어도 하나의 돌연변이된 아미노산, 바람직하게는 위치들 L124 및 K125 에서 이중(double) 돌연변이들을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 위치 120 에서 발린은 세린, 아스파르트산(aspartic acid), 페닐알라닌 또는 류신 잔기에 의하여 대체될 수 있다; 위치 123 의 아스파라긴들은 트립토판, 라이신, 페닐알라닌, 아르기닌, 히스티딘 또는 세린에 의하여 대체될 수 있다; 위치 124 의 류신은 트레오닌 잔기에 의하여 대체될 수 있다; 위치 125 에서 라이신은 알라닌, 글루타민산, 트립토판, 또는 류신-아르기닌과 같은 두 잔기들로 치환될 수 있고 또는 이소류신-글루타민산은 서열번호: 17의 아미노산 서열의 위치 125에서 라이신 후 첨가될 수 있다. 여기에 기재된 아미노산 위치들의 관련성은 서열번호:17 의 야생형 인간 칼시뉴린 헤테로다이머 b 폴리펩타이드 (GenBank: ACX34095.1)의 형태의 아미노산들의 위치들의 면에서 자주 표현된다.
또다른 약물 저항성 유전자는 인간 알킬(alkyl) 구아닌(guanine) 트랜스페라제(transferase) (hAGT) 을 코드하는 0(6)-메틸구아닌(methylguanine) 메틸트랜스페라제(methyltransferase)이다. AGT는 나이트로소우레아들(nitrosoureas) 및 테모졸로마이드(temozolomide) (TMZ) 와 같은 알킬화제들의 세포독성 효과에 저항성을 부여하는 DNA 수선(repair) 단백질이다. 6-벤질구아닌(benzylguanine) (6-BG)은 나이트로소우레아 독성을 강하게 하는 AGT의 억제제이고 이 제제의 독성 효과들을 강하게 하기 위하여 TMZ와 함께 투여된다. AGT의 변이체들을 코드하는 MGMT의 몇몇 돌연변이 형태들은 6-BG에 의한 불활성화에 매우 저항성이지만, DNA 손상을 수선하는 그것들의 능력을 유지한다 (Maze, Kurpad et al. 1999). 특정 예에서, AGT 돌연변이 형태는 서열번호: 18 의 아미노산 서열에서 야생형 AGT 위치 P140의 돌연변이된 아미노산을 포함할 수 있다(UniProtKB: P16455). 바람직한 예에서, 위치 140에서 상기 프롤린(proline)은 라이신 잔기로 대체된다.
또다른 약물 저항성 유전자는 다중약물(multidrug) 저항성(resistance) 단백질(protein) 1 (MDR1) 유전자일 수 있다. 이 유전자는 세포막을 가로질러 대사 부산물들의 수송에 관련된 P-당단백질(glycoprotein) (P-GP)로 알려진 막 당단백질을 코드한다. P-Gp 단백질은 몇몇 구조적으로 관련없는 화학요법 제제들에 대하여 넓은 특이성을 보인다. 그러므로 MDR-1 (NP_000918)을 코드하는 핵산 서열의 발현에 의하여 세포들에 약물 저항성이 부여될 수 있다.
약물 저항성 유전자는 또한 ble 유전자 또는 mcrA 유전자와 같은 세포독성 항생제들일 수 있다. 면역 세포에서 ble 유전자 또는 mcrA의 이소성(ectopic) 발현은 각각 블레오마이신(bleomycine) 또는 마이토마이신(mitomycin) C로, 화학 요법 제제에 노출될 때, 선택적인 이점을 준다.
유전자 치료에 대한 가장 현실적인 접근은 벡터들(vectors), 바람직하게는 바이러스 벡터로 효과적인 유전자 전달을 이용함으로써 T-세포를 조작하기 위한 유전자 첨가이다. 이런 식으로, 특정 예에서, 상기 약물 저항성 유전자는 바람직하게는 세포 내로 적어도 하나의 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자(transgene)를 도입함으로써 세포 내에서 발현될 수 있다.
게놈(genome) 내로 유전자들의 무작위 삽입은 삽입 자리(site) 근처 유전자 또는 삽입된 유전자의 부적당한 발현으로 이어질 수 있다. 게놈 내 특이적 자리들로 유전자들을 타겟하기 위하여 내인성(endogenous) 서열들을 포함하는 외인성(exogenous) 핵산의 상동(homologous) 재조합을 이용한 특이적 유전자 치료는 확실한(secure) T-세포들을 조작할 수 있다. 전술한 바와 같이, 본 방법의 유전적 변형 단계는 내인성(endogenous) 유전자 및 외인성(exogeneous) 핵산 사이에서 상동 재조합이 발생하는, 내인성(endogenous) 유전자의 부분 및 약물 저항성 유전자를 코드하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 외인성(exogeneous) 핵산의 세포들 내로 도입의 단계를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 상기 내인성(endogenous) 유전자는, 상동 재조합 후, 야생형 유전자가 상기 내인성(endogenous) 유전자는 약물에 저항성을 부여하는 유전자의 돌연변이 형태에 의하여 대체되는, 야생형 "약물(drug) 저항성(resistance)" 유전자일 수 있다.
엔도뉴클레오리틱(endonucleolytic) 파손(break)은 상동 재조합 비율(rate)를 활발하게 하는 것으로 알려져 있다. 이런 식으로, 특정 예에서, 본 발명의 방법은 내인성(endogenous) 유전자 내 타겟 서열을 쪼갤 수 있는 희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 세포 내에서 발현시키는 단계를 더 포함한다. 상기 내인성(endogenous) 유전자는 예를 들어 DHFR, IMPDH2, 칼시뉴린 또는 AGT을 코드할 수 있다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제(nuclease), 징크(Zinc) 핑거(finger) 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 엔도뉴클레아제(endonuclease), MBBBD-뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제(meganuclease)일 수 있다.
약물 민감성( dsensitizing ) 유전자들의 불활성화
또다른 특정 예에서, 상기 약물 저항성은 약물 민감성 유전자의 불활성화에 의하여 T-세포에 부여될 수 있다. 처음으로, 본 발명자는 면역 요법을 위하여 T-세포를 조작하기 위한 잠재적 약물 민감성 유전자를 불활성화시키려 했다.
유전자를 불활성화시킴으로써, 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는 것이 유도되었다. 특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형은, 조작하도록 제공된 세포들 내에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 하나의 타겟인 유전자에서 절단(cleavage)을 특이적으로 촉매화하여, 이로써 상기 타겟인 유전자를 불활성화시키게 한다. 특정 예에서, 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성화시키는 단계는 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 방해(disrupt) 할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 더욱 특정 예에서, 상기 세포들은 약물 민감성 유전자를 방해할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환되고(transformed) 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 상기 세포들 내로 발현된다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, a 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 뉴클레아제, A MBBBD-뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.
선호되는 예에서, 불활성화되어 T-세포에 약물 저항성을 부여할 수 있는 약물 민감성 유전자는 인간 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제(kinase (dCK) 유전자이다. 이 효소는 디옥시뉴클레오사이드들(deoxyribonucleosides) 디옥시사이티딘(deoxycytidine) (dC), 디옥시구아니신(deoxyguanosine) (dG) 및 디옥시아데노신(deoxyadenosine) (dA)의 인산화에 요구된다. 퓨린(purine) 뉴클레오타이드(nucleotide) 유사체들(analogs) (PNAs)은 모노- 디- 및 트리-포스페이트 PNA 내로 dCK에 의하여 대사작용된다. 그것들의 트리포스페이트 형태들 및 특히 클로파라빈(clofarabine) 트리포스페이트은 DNA 합성을 위하여 ATP와 경쟁하고, 프로아폽토틱(proapoptotic) 제제로서 역할을 하며, 트리뉴클레오타이드(trinucleotide) 생산에 관련된 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide) 리덕타제(reductase) (RNR)의 강한 억제제들이다 (도 1의 작용의 추정된 메커니즘 참조).
바람직하게는, T 세포들의 dCK의 불활성화는 TALE 뉴클레아제에 의하여 조정된다. 이 목표를 달성하기 위하여 몇몇 쌍의 dCK TALE-뉴클레아제가 설계되었고, 폴리뉴클레오타이드 레벨에서 조립(assembled)되었고, 시퀀싱에 의하여 입증되었다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 TALE-뉴클레아제 쌍들의 예들은 서열번호 63 및 서열번호 64 에 의하여 묘사된다. 이 TALE-뉴클레아제 쌍이 사용될 때, dCK 타겟 서열은 서열번호 62 에 부합한다.
예들에서 나타난 바와 같이, T 세포들에서 이 dCK 불활성화는 클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)과 같은 퓨린(purine) 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사체들(analogs) (PNAs)에 저항성을 부여한다.
또다른 선호되는 예에서, T 세포들에서 dCK 불활성화는 동종이형일 뿐 아니라 클로파라빈(clofarabine)과 같은 약물에 저항성인 이들 이중(double) 넉아웃(knock out) (KO) T 세포들을 만드는(rendering) TRAC 유전자들의 불활성화와 결합된다. 이 이중 특징들은 특히 치료적 목표들에 유용하여, 화학요법과 함께 면역요법을 위한 "기성품인(off-the-shelf)" 동종이형(allogeneic) 세포들이 암환자를 치료하게 한다. 이 이중 KO 불활성화 dCK/TRAC는 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 본 발명에서 성공을 주는 TALE-뉴클레아제 dCK/TRAC 쌍들의 한 예는 각각 서열번호 63 및 서열번호 64 및 서열번호 66 및 번호 67의 이용이다. 2 자리들 (dCK 및 TRAC)에서 타겟 서열들은 각각 서열번호 62 및 서열번호 65 에서 묘사된다.
불활성화될 수 있는 효소의 또다른 예는 인간 하이포크산틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포라이보실(phosphoribosyl) 트랜스페라제(transferase) (HPRT) 유전자 (Genbank: M26434.1)이다. 특히 HPRT는 조작된 T-세포들에서 불활성화되어, 세포분열을 억제하는(cytostatic) 메타볼라이트(metabolite), HPRT에 의하여 세포분열을 억제하는 티오구아닌(thioguanine) 뉴클레오타이드로 전환되고 현재 암, 특히 백혈병(leukemias) 환자들을 치료하는데 사용되는 6-티오구아닌(thioguanine) (6TG)에 저항성을 부여할 수 있다 (Hacke, Treger et al. 2013). 구아닌들(Guanines) 유사체들(analogs)은 TGMP의 형성을 가능하게 하고 포스포라이보실(phosphoribosyl) 모이어티(moiety)의 첨가를 촉매화하는 HPRT 트랜스페라제(transferase)에 의하여 대사작용된다(도 2). 6 머캅토퓨린(mercapthopurine) (6MP) 및 6 티오구아닌(thioguanine) (6TG)을 포함하는 구아닌 유사체들은 보통 ALL을 치료하기 위한 림프구고갈(lymphodepleting) 약물들로서 사용된다. 그것들은 TGMP 형성을 가능하게 하고 포스포라이보실 모이어티의 첨가를 촉매화하는 HPRT (하이포크산틴 포스포라이보실 트랜스페라제)에 의하여 대사작용된다. 그것들의 그 다음의 인산화들은 결국 DNA 내로 통합되는(integrate) 그것들의 삼인산화된(triphosphorylated) 형태들의 형성으로 이어진다. 일단 DNA 내로 통합(incorporate)되면, 티오(thio) GTP는 그것의 티올레이트(thiolate) 편성(groupment)을 통하여 DNA 복제(replication)의 정확성을 악화시키고 세포의 온전한 상태(integrity)에 매우 해로운 무작위 점(point) 돌연변이를 만든다.
또다른 예에서, T-세포의 표면에서 보통 발현되는 CD3의 불활성화는 테플리주맙(teplizumab)과 같은 항-CD3 항체들에 대한 저항성을 부여할 수 있다.
약물 저항성 동종이형 CRT T 세포들에 의한 세포독성 시험을 위한 CD19+/luc+ 약물 저항성 Daudi 세포들
본 발명은 저항성 유전자 및 CAR T 세포들 특이적인 표면 수용체 둘다를 발현시키는 타겟 세포들을 제조하는 방법을 포함한다. 이들 타겟 세포들은 특히 CAR T 세포들의 세포독성을 시험하는데 유용하다. 이들 세포들은 루시페라제(lupciferase) 활성을 품고(harbor) 클로파라빈(clofarabine)의 임상적으로 적절한(relevant) 투여량(dose)에 손쉽게 저항성이다. 특징들의 이러한 결합은 마우스 모델에서 인 비보에서 그것들을 추적하는 것을(traking) 가능하게 한다. 더욱 특히, 그것들은 클로파라빈(clofarabine) 또는 다른 PNA들의 존재 하 마우스들에서 세포독성 물성들 약물 저항성 T 세포들을 평가하는데 이용될 수 있다. 클로파라빈 저항성 다우디(Daudi) 세포들은 약물 저항성 B 세포 악성종양들(malignancies)을 품는(harbor), 형성(form) 유도(induction) 요법(therapy)으로 다시 돌아간(relapsing) 급성(acute) 림프모세포성(lymphoblastic) 백혈병(leukemia) (ALL) 환자들의 생리학적 상태를 모방한다(mimick). 이런 식으로, 이들 세포들은 약물 저항성 CAR T 세포들의 세포독성 및 신뢰성을 평가하는데 흥미있다. 바람직하게는, 이들 타겟 세포들은 CD19+ 루시페라제(Luciferase)+ 다우디(Daudi) 세포들이다. 분리된 세포.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 의하여 수득가능한 분리된 세포에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 T-세포 수용체 구성요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 방해된(disrupted) 유전자를 포함하는 약물에 저항성인 분리된 T-세포에 대한 것이다. 특정 예에서, 상기 T-세포는 적어도 하나의 약물 저항성 유전자, 바람직하게는 ble 유전자 또는 mcrA 유전자 또는 돌연변이 DHFR, 돌연변이 IMPDH2, 돌연변이 AGT 또는 돌연변이 칼시뉴린를 코드하는 유전자를 발현시킨다. 또다른 특정 예에서, 상기 T-세포는 dCK 또는 HPRT 유전자와 같은 적어도 하나의 방해된 약물 민감성 유전자를 포함한다. 더욱 특정 예에서, 상기 분리된 T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고, DHFR 돌연변이를 발현시킨다; 상기 분리된 T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 IMPDH2 돌연변이를 발현시킨다; 상기 분리된 T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 칼시뉴린 돌연변이를 발현시킨다; 상기 분리된 T-세포는 방해된 HPRT 유전자를 포함하고 AGT 돌연변이를 발현시킨다. 또다른 선호되는 예에서, 상기 분리된 세포는, CD19 또는 CD123일 수 있는 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체(Receptor) (CAR)를 발현시킨다.
약물에 저항성인 동종이형 T-세포
특히, 본 발명은 면역요법에 특이적으로 적합한, 약물에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포에 대한 것이다. 약물의 저항성은 전술한 것과 같은 약물 저항성 유전자들의 발현에 의하여 또는 약물 민감성 유전자들의 불활성화에 의하여 부여될 수 있다. 본 발명에 맞춰진 약물들의 몇몇 예들은 클로파라빈(clofarabine) 또는 플루다라빈(fludarabine)과 같은 퓨린 뉴클레오사이드 유사체들 (PNAs), 또는 6-머캅토퓨린(Mercaptopurine) (6MP) 및 6 티오(thio)-구아닌(guanine) (6TG)와 같은 다른 약물들이다.
본 발명에 따른 세포는 선천(innate) 및/또는 입양(adaptative) 면역 반응의 시작 및/또는 실행(execution)과 기능적으로 관련된 조혈(hematopoietic) 기원(origin)의 세포를 가리킨다. 본 발명에 따른 세포는 바람직하게는 기증자로부터 수득된 T-세포이다. 본 발명에 따른 상기 T 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 배아embryonic 줄기 세포들, 더욱 특히 비-인간 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간(progenitor)세포들, 골수 줄기 세포들, 전분화(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈(hematopoietic) 줄기 세포들일 수 있다. 대표적인 인간 줄기 세포들은 CD34+ 세포들이다. 상기 분리된 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만 세포, NK-세포, B-세포 또는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성되는 군으로부터 선택되는 T-세포일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포들의 유전적 변형 및 확장에 앞서, 세포들의 소스(source)는 제한되지 않는 여러가지 방법을 통하여 대상(subject)로부터 수득될 수 있다. 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선(thymus) 조직, 감염 자리로부터의 조직, 복수(ascites), 흉수(pleural effusion), 비장 조직, 및 종양들을 포함하는 다수의 제한되지 않는 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예들에서, 당업자에게 알려지고 이용가능한 임의의 수의 T-세포주들이 이용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 바람직하게는 건강한 기증자로부터 유래된다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형 특성들을 보이는 혼합된 세포들 군집(population)의 부분이다.
다중(multiple) 약물 저항성
또다른 특정 예에서, 본 발명자들은 환자가 다른 약물들로 치료될 때 조작된 T-세포들의 선택을 조절하기 위하여 다중(multiple) 약물들에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포들을 이용하여 "기성품인" 면역요법 전략을 발전시키려 하였다. 치료적 효율은 다중 약물 저항성 동종이형(allogeneic) T-세포들을 유전적으로 조작함으로써 상당히 증강될 수 있다. 이러한 전략은 시너지 효과들을 보이는 약물 조합에 응하는 종양을 치료하는데 특히 효과적이다. 게다가 다중 저항성인 조작된 T-세포들은 확장(expand)되고 약물 제제들의 최소 투여량(dose)을 이용하여 선택될 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 방법은 상기 T-세포에 대한 다중 약물 저항성을 부여하도록 T-세포를 변형하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 다중 약물 저항성은 하나보다 많은 약물 저항성 유전자를 발현시키거나 또는 하나보다 많은 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 부여될 수 있다. 또다른 특정 예에서, 다중 약물 저항성은 적어도 하나의 약물 저항성 유전자를 발현시킴에 의하여 또는 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성시킴으로써 상기 T-세포에 부여될 수 있다. 특히, 다중 약물 저항성은 mcrA 유전자, ble 유전자, MGMT의 돌연변이 형태, 칼시뉴린의 돌연변이 형태, IMPDH2의 돌연변이 형태, DHFR의 돌연변이 형태와 같은 적어도 하나의 약물 저항성 유전자를 발현시키으로써 그리고 HPRT 유전자와 같은 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 T-세포에 부여될 수 있다. 선호되는 예에서, 다중 약물 저항성은 HPRT 유전자를 불활성화시키고 DHFR의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; 또는 HPRT 유전자를 불활성화시키고 IMPDH2의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; 또는 HPRT 유전자를 불활성화시키고 칼시뉴린의 돌연변이 형태을 발현시킴으로써; HPRT 유전자를 불활성화시키고 MGMT의 돌연변이 형태를 발현시킴으로써; HPRT 유전자를 불활성시키고 ble 유전자를 발현시킴으로써; HPRT 유전자를 불활성화시키고 mcrA 유전자를 발현시킴으로써 부여될 수 있다.
약물 저항성 동종이형 ( allogeneic ) T-세포들의 조작 방법
동종이형(allogeneic) T-세포들의 선택적 이식(engraftment) 및 암 치료를 개선하기 위하여, 약물 저항성이 화학요법 제제의 독성 부작용들로부터 세포들을 보호하기 위하여 상기 세포들에 부여된다. T-세포들의 약물 저항성은 또한 약물 저항성 유전자를 발현시키는 T-세포들이 살아남고 약물 민감성인 세포들에 비례하여 크게 증가하기 때문에, 인 또는 엑스 비보로 그것들의 풍부함(enrichment)을 가능하게 한다. 특히 본 발명은
(a) Providing a T-세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의 약물을 선택하는 단계;
(c) T-세포 수용체 (TCR) 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 T-세포를 변형시키는 단계;
(d) T-세포를 변형하여 상기 T-세포에 약물 저항성을 부여하는 단계;
(e) 상기 약물의 존재 하 상기 조작된 T-세포를 확장시키는 단계
를 포함하는 면역요법을 위하여 저항성인, 동종이형(allogeneic)이며 약물 저항성인 T-세포들을 조작하는 방법에 대한 것이다.
- 동종이형 T-세포들
본 발명은 동종이형(allogeneic) 면역요법에 대한 것이다. 동종이형(allogeneic) T-세포들의 이식은 TCR 구성요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 가능하다. TCR은 TCR 알파 유전자 및/또는 TCR 베타 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 세포들에서 기능적이지 않도록 만든다. 동종이형(allogeneic) T-세포들에서 TCR 불활성화는 GvHD를 피한다. 유전자를 불활성화시킴으로써 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않도록 의도된다. 특정 예들에서, 본 방법의 유전적 변형은, 조작하도록 제공된 세포들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 하나의 타겟인 유전자에서 절단(cleavage)을 특이적으로 촉매화하고 이로써 상기 타겟인 유전자를 불활성화시킨다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제에 의하여 야기된 핵산 가닥 파손들(breaks)은 비상동(non-homologous) 말단(end) 결합(joining)(NHEJ) 또는 상동 재조합의 분명한 메커니즘들을 통하여 보통 수선된다. 그러나, NHEJ은 불완전한 수선 공정이어서, 가끔 절단(cleavage)의 자리에서 DNA 서열에 변화를 야기한다. 메카니즘들은 간접적인 재-연결(ligation)을 통하여 (Critchlow and Jackson 1998) 또는 소위 미세상동성(microhomology)-매개 말단(end) 결합(joining) (Betts, Brenchley et al. 2003; Ma, Kim et al. 2003)을 거쳐 두 개의 DNA 말단들(ends)에 남는 결합(rejoining)을 포함한다. 비상동(non-homologous) 말단(end) 결합(joining) (NHEJ)을 통한 수선은 가끔 작은 삽입 또는 결실을 야기하며, 특이적 유전자 넉아웃의 창조에 이용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 절단(cleavage)-유도된 돌연변이 이벤트, 즉, NHEJ 이벤트에 연이은 돌연변이 이벤트가 발생하는 세포들은, 이 분야에서 잘 알려진 방법에 의하여 확인 및/또는 선택될 수 있다. 특정 예에서, 각각의 개별적인 샘플의 세포들 내로 T-세포 수용체 (TCR)의 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계는 T-세포 수용체 (TCR)의 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 방해(disrupt)할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 더욱 특정 예에서, 각각의 개별적인 샘플의 상기 세포들은 T-세포 수용체 (TCR)의 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 방해할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환되고(transform), 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 상기 세포들 내로 발현된다.
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR/Cas9 뉴클레아제, TALE-뉴클레아제 또는 MBBBD-뉴클레아제일 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제에 의하여 전사(Transcription) 액티베이터(Activator) 유사(Like) 효과기(Effector) (TALE)로부터 유래된 하나의 DNA-결합 도메인(domain) 및 핵산 타겟 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매적(catalytic) 도메인으로 구성되는 융합 단백질이 유도된다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012). 본 발명에서 새로운 TALE-뉴클레아제들이 입양 면역요법 정책들을 위한 관련 유전자들을 정확하게 타겟팅하기 위하여 설계되었다.
본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호 : 1 내지 5 (TCR알파), 서열번호 : 6 및 7 (TCR베타)로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단(cleaving)하는 것들이다. 상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 서열번호 : 8 내지 서열번호 : 13 으로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또다른 예에서, 추가적인 촉매적 도메인은 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제로 세포 내로 더 도입되어 타겟된 유전자들을 불활성화시키는 그것들의 능력을 증강시키기 위하여 돌연변이를 증가시킬 수 있다. 특히, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 DNA 말단(end) 가공(processing) 효소이다. DNA 말단(end)-가공(processing) 효소들의 제한되지 않는 예들은 5-3' 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 3-5' 엑소뉴클레아제들, 5-3' 알칼라인(alkaline) 엑소뉴클레아제들, 5' 플랩(flap) 엔도뉴클레아제들, 헬리카제들(helicases), 호스파타제(hosphatase), 하이드롤라제들(hydrolases) 및 주형-독립적 DNA 폴리메라제들(polymerases)이다. 이러한 촉매적 도메인의 제한되지 않는 예들은 단백질 도메인 또는 hExoI (EXO1_HUMAN), 효모 ExoI (EXO1_YEAST), 대장균 ExoI, 인간 TREX2, 마우스 TREX1, 인간TREX1, 소(Bovine) TREX1, 래트(Rat) TREX1, TdT (말단(terminal) 디옥시뉴클레오티딜(deoxynucleotidyl) 트랜스페라제) 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)로부터 선택되는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 유도체를 포함한다. 선호되는 예에서, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 포함하고, 더욱 선호되는 예에서, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 TREX이고, 더욱 바람직하게는 TREX2 촉매적 도메인이다 (WO2012/058458). 또다른 선호되는 예에서, 상기 촉매적 도메인은 단일 사슬 TREX2 폴리펩타이드에 의하여 코드된다. 상기 추가적인 촉매적 도메인은 펩타이드 링커에 의하여 선택적으로 본 발명에 따른 키메라 단백질 또는 뉴클레아제 융합 단백질에 융합될 수 있다.
엔도뉴클레오리틱(Endonucleolytic) 파손들(breaks)은 상동 재조합의 비율(rate)을 활발하게 하는 것으로 알려져 있다. 이런 식으로, 또다른 예에서, 본 방법의 유전적 변형 단계는 적어도 타겟 핵산 서열의 부분에 상동인 서열을 포함하는 외인성(exogeneous) 핵산의 세포들 내로의 도입 단계를 더 포함한다. 특정 예들에서, 상기 외인성(exogenous) 핵산은 각각 타겟 핵산 서열 5' 및 3' 영역에 상동인 첫 번째 및 두 번째 부분들을 포함한다. 이들 예들에서 상기 외인성(exogenous) 핵산은 또한 타겟 핵산 서열의 5' 및 3' 영역들과 상동성(homology)을 포함하지 않는 첫 번째 및 두 번째 부분 사이에 위치한 세 번째 부분을 포함한다. 타겟 핵산 서열의 절단(cleavage) 후 상동 재조합 이벤트는 타겟 핵산 서열 및 외인성(exogenous) 핵산 사이에서 활발하게 된다. 바람직하게는 적어도 50 bp, 바람직하게는 100 bp보다 많은, 그리고 더욱 더욱 바람직하게는 200 bp가 넘는 상동성 서열들이 상기 기증자 매트릭스(matrix) 내에 사용된다. 특정 예에서, 상동 서열은 200 bp 부터 6000 bp 까지, 더욱 바람직하게는 1000 bp 부터 2000 bp 까지일 수 있다. 정말로, 공유된 핵산 상동성들은 파손(break) 자리의 다운스트림 및 업스트림 측면에 있는 영역들에 위치하며, 도입되는 핵산 서열은 두 팔(arms)들 사이에 위치되어야 한다.
특정 예에서, 상기 외인성(exogenous) 핵산은 본 발명에 따른 약물 저항성 유전자를 코드하는 이식유전자를 포함할 수 있다.
더 가능한 T-세포들 속성들의 조작
본 발명에 따른 면역 세포들은 그것들의 더 특이적 또는 효율적인 치료적 이용에 참가하는 추가적인 속성들을 습득하기 위하여 더 조작될 수 있다.
- 키메라 항원 수용체들
키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체들(Receptors) (CAR)은 리간드-결합 도메인 특성들을 활용하는 선택된 타겟을 향하여 면역 세포 특이성 및 반응성을 방향수정(redirect)할 수 있다. 이런 식으로, 또다른 특정 예에서, 본 방법은 키메라 항원 수용체를 상기 림프구들 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 상기 키메라 항원 수용체는, 예를 들어, 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 보이는 키메라 단백질을 만들기 위하여 T-세포 수용체-활성 세포내(intracellular) 도메인으로 원하는 항원 (예를 들어, 종양 항원)을 위한 항체-베이스의 특이성인, 타겟 세포에 존재하는 구성요소에 대항한 결합 도메인과 결합한다. 일반적으로 CAR는 T-세포 항원 수용체 복합체(complex) 제타(zeta) 사슬(chain) (scFv:ζ)의 세포내(intracellular) 신호전달(signaling) 도메인에 융합된 세포외(extracellular) 단일 사슬 항체 (scFv)로 구성되고, T-세포들에서 발현될 때, 단일클론 항체의 특이성에 기초하여 항원 인식을 방향수정하는 능력을 갖는다. 본 발명에서 사용된 CAR의 한 예는 CD19 항원에 대항하여 향하는 CAR이고, 제한되지 않는 예로서 아미노산 서열 : 서열번호 : 19 또는 20을 포함할 수 있다.
- 면역(Immune)-체크포인트(checkpoint) 유전자들의 불활성화
T-세포-매개된 면역은 항원 특이적 세포들의 클론 선택, 그것들의 활성화 및 이차 림프 조직에서 증식, 염증 및 항원의 자리로의 그것들의 수송(trafficking), 직접적인 효과기(effector) 기능의 실행 및 다수의 효과기 면역 세포들을 위한 (사이토카인들 및 멤브레인 리간드들을 통한) 도움의 제공을 포함하는 복수개의 순차적인 단계들을 포함한다. 이들 단계들 각각은 반응을 미세조정하는 자극 및 억제 신호를 상쇄함으로써 조절된다. 당업자는, 용어 "면역(immune) 체크포인트들(checkpoints)"이 T-세포들에 의하여 발현되는 일군의 분자들을 의미한다는 것을 이해할 것이다. 이들 분자들은 면역 반응을 억제 또는 하향-조절하기 위하여 "브레이크들"로서 효과적으로 역할을 한다. 면역 체크포인트 분자들은 Programmed Death 1 (PD-1, PDCD1 또는 CD279로도 알려짐, 수탁(accession) 번호(number): NM_005018), 세포독성(Cytotoxic) T-림프구(Lymphocyte) 항원(Antigen 4) (CTLA-4, CD152로도 알려짐, GenBank 수탁 번호 AF414120.1), LAG3 (CD223로도 알려짐, 수탁 번호: NM_002286.5), Tim3 (HAVCR2로도 알려짐, GenBank 수탁 번호: JX049979.1), BTLA (CD272로도 알려짐, 수탁 번호: NM_181780.3), BY55 (CD160로도 알려짐, GenBank 수탁 번호: CR541888.1), TIGIT (VSTM3로도 알려짐, 수탁 번호: NM_173799), LAIR1 (CD305로도 알려짐, GenBank 수탁 번호: CR542051.1, (Meyaard, Adema et al. 1997)), SIGLEC10 (GeneBank 수탁 번호: AY358337.1), 2B4 (CD244로도 알려짐, 수탁 번호: NM_001166664.1), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7 (Nicoll, Ni et al. 1999), SIGLEC9 (Zhang, Nicoll et al. 2000; Ikehara, Ikehara et al. 2004), TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF (Quigley, Pereyra et al. 2010), GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3 로 직접적으로 면역 세포들을 억제하는 것들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, CTLA-4는 어떤 CD4 및 CD8 T-세포들 상에서 발현되는 세포-표면 단백질이다; 세포들을 제시하는 항원 상 그것의 리간드들 (B7-1 및 B7-2)에 의하여 개입(engaged)될 때 T-세포 활성화 및 효과기(effector) 기능이 억제된다. 이런 식으로 본 발명은 면역 체크-포인트, 특히 PD1 및/또는 CTLA-4에 관련된 적어도 하나의 단백질을 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계를 더 포함하는, 약물에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포의 조작 방법에 대한 것이다. 선호되는 예에서, 면역 체크포인트에 관련된 적어도 하나의 단백질을 불활성화시키는 단계는 면역 체크포인트 유전자에서 타겟 서열을 특이적으로 절단(cleave)할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시킴으로써 실현된다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 예를 들어 상기 TALE-뉴클레아제는 서열번호 : 21 내지 23 (CTLA-4) 및 서열번호 : 24 및 서열번호 : 25 (PDCD1)로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 특이적으로 절단할 수 있고, 그리고 더욱 선호되는 예에서 상기 TALE-뉴클레아제는 서열번호 : 26 내지 서열번호 : 35로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
- 면역억제제(immunosuppressive) 저항성 T 세포들
동종이형 세포들은 숙주 면역 시스템에 의하여 신속히 거부된다. 비-방사선조사된(irradiated) 혈액 산물들에 존재하는 동종이형(allogeneic) 백혈구들(leukocytes)이 겨우 5 내지 6 일 동안 지속된다는 것이 입증되어 왔다 (Boni, Muranski et al. 2008). 이런 식으로, 동종이형(allogeneic) 세포들의 거부를 방지하기 위하여, 숙주의 면역 시스템은 보통 어느 정도 억제되어야 한다. 그러나 입양 면역요법의 경우, 면역억제제 약물들 또한 도입된 치료적 T 세포들에 대하여 해로운 효과를 갖는다. 그러므로 이러한 조건들 하 입양 면역요법 접근을 효과적으로 이용하기 위하여, 도입된 세포들은 또한 면역억제제 치료에 저항성일 필요가 있다. 이런 식으로, 특히 예에서, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 면역억제 제제의 타겟을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써, T-세포들을 변형시켜 면역억제 제제에 저항성으로 그것들을 만드는 단계를 더 포함한다. 면역억제 제제는 작용의 몇몇 메커니즘들 중 하나에 의하여 면역 기능을 억제하는 제제이다. 즉, 면역억제 제제는 면역 반응의 정도를 감소시키는 능력에 의하여 보여지는 화합물에 의하여 역할을 한다. 본 발명에 따른 방법은 T 세포들에서 면역억제 제제의 타겟을 불활성화시킴으로써 면역요법을 위하여 T 세포들에 면역억제제 저항성을 부여하게 한다. 제한되지 않는 예로서, 면역억제 제제에 대한 타겟들은 CD52, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체 (GR), FKBP 패밀리(family) 유전자 멤버 및 사이클로필린(cyclophilin) 패밀리 유전자 멤버와 같은 면역억제 제제를 위한 수용체일 수 있다. 특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형은 조작되도록 제공된 세포들에서, 하나의 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제가 하나의 타겟인 유전자의 절단(cleavage)을 특이적으로 촉매화하고 이로써 상기 타겟된 유전자를 불활성화시킨다. 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제이다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호 : 36 내지 41 (GR), 및 서열번호 : 54 내지 59 (CD52) 로 구성되는 군으로부터 선택되는 타겟 서열을 인식하고 절단하는 것들이다. 상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 서열번호 : 42 내지 서열번호 : 53 및 서열번호 : 60 내지 서열번호 : 61 로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
- 자살 유전자들
또다른 측면에서, 조작된 T-세포들이 투여 후 몇 년 동안 확장되고 계속될 수 있기 때문에, 투여된 T-세포들의 선택적 삭제(deletion)를 가능하게 하는 안전한 메커니즘을 포함하는 것이 바람직하다. 이런 식으로, 몇몇 예들에서, 본 발명의 방법은 재조합 자살(suicide) 유전자로 하는 상기 T-세포들의 형질전환(transformation)을 포함할 수 있다. 상기 재조합 자살 유전자는 대상에서 일단 투여된 상기 T-세포들의 통제되지 않은 증식 및/또는 직접적인 독성의 위험을 감소시키는데 이용된다 (Quintarelli C, Vera F, blood 2007; Tey SK, Dotti G. , Rooney CM, boil blood marrow transplant 2007). 자살 유전자들은 인 비보에서 형질전환된(transformed) 세포들의 선택적 삭제를 가능하게 한다. 특히 자살 유전자는 비-독성 프로드러그를 세포독성 약물로 변환시키거나 또는 독성 유전자 발현 산물을 발현하는 능력을 갖는다. 즉, "자살 유전자"는 다른 화합물들의 존재 하 또는 그것 자체에 의하여 세포사를 야기하는 산물인 산물을 코드하는 핵산이다. 이러한 자살 유전자의 대표적인 예는 헤르페스(herpes) 심플렉스(simplex) 바이러스의 티미딘(thymidine) 키나제(kinase)를 코드하는 것이다. 추가적인 예들은 5-플루오로사이토신(fluorocytosine)을 매우 독성 화합물인 5-플루오로우라실(fluorouracil)로 변화시킬 수 있는 박테리아 유전자 사이토신(cytosine) 디아미나제(deaminase) 및 바리셀라(varicella) 조스터(zoster) 바이러스의 티미딘 키나제이다. 자살 유전자들은 또한 제한되지 않는 예들로서 카스파제(caspase)-9 또는 카스파제-8 또는 사이토신 디아미나제를 포함한다. 카스파제-9은 특이적 이합체화의 화학적 유도제(hemical inducer of dimerization) (CID)를 이용하여 활성화될 수 있다. 자살 유전자들은 세포의 표면에서 발현되는 폴리펩타이드들일 수 있고, 세포들을 치료적 단일클론 항체들에 민감성으로 만들 수 있다. 여기에서 사용된 대로 "프로드러그(prodrug)"는 독성 산물로 변환될 수 있는 본 발명의 방법에 유용한 임의의 화합물을 의미한다. 프로드러그는 본 발명의 방법에서 자살 유전자의 유전자 산물에 의하여 독성 산물로 변환된다. 이러한 프로드러그의 대표적인 예는 HSV-티미딘 키나제에 의하여 독성 화합물로 인 비보(in vivo)에서 변환되는 간시클로비르(ganciclovir)이다. 간시클로비르 유도체는 그 다음에 종양 세포들에 독성이다. 프로드러그들의 다른 대표적인 예들은 아시클로비르(acyclovir), FIAU [1-(2-디옥시(deoxy)-2-플루오로(fluoro)-β-D-아라비노퓨라노실(arabinofuranosyl))-5-아이오도우라실(iodouracil)], VZV-TK를 위한 6-메톡시퓨린 아라비노사이드 및 사이토신 디아미나제를 위한 5-플루오로사이토신(fluorocytosine)을 포함한다.
- 전달 방법들
전술한 다른 세포 내로 약물 저항성 유전자, 희귀-절단 엔도뉴클레아제, 키메라 항원 수용체 (CAR), 자살 유전자와 같은 관심있는 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 상기 관심있는 단백질은 바람직하게는 적어도 하나의 플라스미드 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자로서 그것의 도입에 의하여 세포에서 발현될 수 있다. 폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 결과로서 세포에서 발현될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되고 그 다음에 거기로 도입될 수 있다. 세포들 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체(construct)를 도입하는 방법들은 당업계에 알려져 있으며, 제한되지 않는 예들로서, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되는(integrated) 안정된 형질전환(transformation) 방법들, 세포의 게놈 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체가 통합되지 않는 일시적인(transient) 형질전환(transformation) 방법들 및 바이러스 매개 방법들을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터들 (예를 들어 레트로바이러스들, 아데노바이러스들), 리포좀(liposome) 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 일시적인 형질전환 방법들은 예를 들어 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation) 또는 유전자 총(particle bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포들에서 발현되는 것을 고려하여, 벡터들, 더욱 특히 플라스미드들 또는 바이러스에 포함될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 받는 세포들의 선택 및/또는 확인을 위하여 제공되는 선택 마커를 포함할 수 있다. 다른 이식유전자들이 하나의 벡터에 포함될 수 있다. 상기 벡터는 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은 라이보좀 스킵(skip) 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 아프타바이러스(Aphthovirus) 서브그룹에서 확인된 2A 펩타이드들은 코돈들에 의하여 코드되는 두 개의 아미노산들 사이의 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈에서 그 옆으로 라이보좀의 "스킵(skip)"을 야기한다 (Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007) 참조). "코돈"에 의하여 라이보좀에 의하여 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA 상의 (또는 DNA 분자의 센스 가닥 상의) 세 개 뉴클레오타이드들이 의미된다. 이런 식으로 프레임 내인 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 폴리펩타이드들이 분리될 때, 두 개의 폴리펩타이드들은 mRNA 내에 단일의 근접한 오픈(open) 리딩(reading) 프레임(frame)으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀의 스킵 메커니즘들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저 RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위한 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 더욱 선호되는 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은, 예를 들어 전기천공에 의하여 세포들 내로 직접적으로 도입되는 mRNA일 수 있다. 본 발명자들은 T-세포에서 mRNA 전기천공의 최적 조건을 결정하였다. 본 발명자들은 펄스된 전기장들의 사용에 의하여, 세포들 내로 물질의 전달(delivery)을 위하여 살아있는 세포들이 일시적으로 투과성으로(permeabilize) 되게 하는 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 이용하였다. 펄스아질(PulseAgile) (BTX Havard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, MA 01746, USA) 전기천공 파형들(waveforms)의 이용에 기초한, 그 기술은 펄스들(pulses) 사이의 간격과 더불어 펄스 나비(duration), 강도의 정확한 통제를 허락한다 (U.S. 특허 6,010,613 및 국제 PCT 출원 WO2004083379). 이들 파라미터들 모두는 최소의 치사율(mortality)로 높은 형질감염(transfection) 효율을 위한 최고의 조건에 도달하기 위하여 변형될 수 있다. 기본적으로 첫 번째 높은 전기장 펄스들은 구멍(pore) 형성을 가능하게 하는 반면, 그 다음의 더 낮은 전기장 펄스들은 세포 내로 폴리뉴클레오타이드가 움직이는 것을 가능하게 한다.
- T-세포들의 확장 및 활성화
T-세포들의 유전적 변형에 앞서 또는 그 후에, T-세포들은 예를 들어, U.S. 특허들 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 U.S. 특허 출원 공개번호 20060121005 에 기재된 대로 방법들을 이용하여 일반적으로 확장되고 활성화될 수 있다. T-세포들은 인 비트로 또는 인 비보로 확장될 수 있다. 일반적으로 본 발명의 T 세포들은 T-세포를 위한 활성화 신호를 만들기 위하여 T-세포들의 표면 상 공(co)-자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 활성화시키는 제제와의 접촉에 의하여 확장된다. 예를 들어, 칼슘 운반체(ionophore) A23187, 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate) (PMA), 또는 피토헤마글루티닌 유사 미토겐성 렉틴들(mitogenic lectins like phytohemagglutinin) (PHA)과 같은 화학물질들이 T-세포를 위한 활성화 신호를 만드는데 사용될 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, T-세포 군집들은 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정된 항-CD2 항체와의 접촉에 의하는 것, 또는 칼슘 운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(activator) (예를 들어, 브리오스타틴(bryostatin))과의 접촉에 의하는 것과 같이 하여 인 비트로에서 자극(stimulate)될 수 있다. T-세포들의 표면 상 보조(accessory) 분자의 공-자극을 위하여 보조 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 예를 들어, T-세포들의 군집은 T-세포들의 증식을 자극하기에 적합한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T-세포들 또는 CD8+ T-세포들의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 예를 들어, 각 신호전달을 제공하는 제제들은 용액이거나 또는 표면에 커플링(coupled)될 수 있다. 당업자는 입자들의 세포들에 대한 비율이 타겟 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
T-세포 배양에 적합한 조건들은 혈청 (예를 들어, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g , 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, IL-21 및 TNF- 또는 당업자들에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 임의의 첨가제들을 포함하는, 생육 및 증식에 필요한 인자들을 포함할 수 있는 적합한 배지들 (예를 들어, 최소(Minimal) 필수(Essential) 배지들(Media) 또는 RPMI 배지들(Media) 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))을 포함한다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은 N-아세틸-시스테인(cysteine) 및 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 같은 환원 제제들, 플라스마네이트(plasmanate) 및 표면활성제(surfactant)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지들은 RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, 첨가된 아미노산들과, 최적화제(Optimizer), 소듐(sodium) 피루베이트(pyruvate) 및 비타민들, 적절한 양의 혈청 (또는 혈장)으로 보충된 또는 혈청-이 없거나, 또는 규정된(defined) 세트의(set) 호르몬들 및/또는 T-세포들의 성장 및 확장에 충분한 상당량의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신인 항생제들은 실험 배양에서만 포함되며, 대상으로 융합되는 세포들의 배양에서는 아니다. 타겟 세포들은 성장을 지지하는데 필요한 조건들, 예를 들어, 적절한 온도 (예를 들어, 37 ℃) 및 공기 (예를 들어, 공기 더하기 5% C02), 하 유지된다. 다른 자극 시간들에 노출되어 온 T 세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.
치료적 적용들
또다른 예에서, 전술한 대로 수득된 상기 분리된 T-세포들은 동종이형(allogeneic) 면역 세포 면역요법에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 상기 T-세포들은 그것을 필요로 하는 환자의 암, 감염들, 또는 자가면역 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 전술한 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득가능한 분리된 T-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 환자에게 상기 세포들을 투여하는 단계.
한 예에서, 본 발명의 상기 T-세포들은 인 비보 확장을 탄탄하게 겪을 수 있고, 더 많은 시간 동안 지속될 수 있다.
상기 치료는 개선(ameliorating), 치유(curative) 또는 예방(prophylactic)일 수 있다. 본 발명은 그것이 비-동종반응성(alloreactive) 세포들 내로, 보통 기증자로부터 수득한, T-세포들의 형질전환(transformation)을 가능하게 하는 한에 있어서는, 동종이형(allogeneic) 면역요법에 특히 적당하다. 이것은 표준 프로토콜들 하 이루어지고 필요한 만큼 많은 시간 동안 재생산될 수 있다. 그 결과인 변형된 T-세포들이 하나 또는 몇몇의 환자들에게 투여되고, "기성품인" 치료적 제제로서 이용가능하게 만들어진다.
공개된 방법들에 사용될 수 있는 세포들은 이전 섹션에 기재되어 있다. 상기 치료는 암, 바이러스 감염, 자가면역 장애들(disorders)로 진단받은 환자들을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암들은 혈관을 발달시키지(vascularize) 않거나 또는 아직 상당히 혈관을 발달시키자 않은 종양들과 더불어 혈관이 발달된 종양들을 포함한다. 암들은 (예를 들어, 백혈병(leukemias) 및 림프종(lymphomas)과 같은, 혈액(hematological) 종양들과 같은) 비고형 종양들을 포함할 수 있다. 본 발명의 약물들에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포로 치료되는 암들의 종류들은, 상피성암(carcinoma), 아세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병(leukemia) 또는 림프(lymphoid) 악성종양들(malignancies), 양성(benign) 및 악성(malignant) 종양들, 및 악성종양들(malignancies) 예를 들어, 육종들(sarcomas), 상피성암들(carcinomas), 및 흑색종들(melanomas)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다. 본 발명의 예에서, 소아(childhood) 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL) 및 근위축(amyotrophic) 골수종(myeloma) 백혈병(leukemia) (AML) 질병들이 본 발명에 따른 동종이형 약물 저항성 T-세포들에 의하여 보통 치료된다. 이것은 약물 저항성 KO TRAC CD19+ CAR T-세포들 및 약물 저항성 KO TRAC CD123+ T-세포들 각각을 이용함으로써 달성될 수 있다.
그것은 항체들 치료(therapy), 화학요법, 사이토카인 치료, 수지상 세포 치료, 유전자 치료, 호르몬 치료, 레이저 광 치료 및 방사선 치료의 군으로부터 선택되는 암들에 대항한 하나 또는 그보다 많은 치료들과 결합한 치료일 수 있다.
본 발명의 선호되는 예에 따라, 상기 치료는 면역억제제 치료를 겪는 환자들 내로 투여된다. 본 발명은 바람직하게는 약물 저항성 유전자의 발현 또는 약물 민감성 유전자의 불활성화 때문에 본 발명에 따른 적어도 하나의 약물 제제에 저항성으로 만들어진, 세포들 또는 세포들의 군에 의존한다. 이 관점에서, 약물 치료는 환자 내 본 발명에 따른 T-세포들의 확장 및 선택을 도와야 한다.
본 발명에 따른 세포들 또는 세포들 군의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈(transfusion), 주입(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는 임의의 편리한 방식에 의하여 수행될 수 있다. 여기에 기재된 조성물들은 피하로(subcutaneously), 피내로(intradermaliy), 종양내로(intratumorally), 결절내로(intranodally), 척수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 두개내로(intracranially), 정맥 내(intravenous) 또는 림프내(intralymphatic) 주사에 의하여, 또는 복강내로(intraperitoneally) 환자에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥내 주사에 의하여 투여된다.
세포들 또는 세포들의 군의 투여는 kg 체중 당 103-1010 세포들, 바람직하게는 105 내지 106 세포들/체중 kg으로, 상기 범위들 내의 세포 수들의 모든 정수 값들을 포함하는 투여로 구성될 수 있다. 세포들 또는 세포들의 군은 하나 또는 그보다 많은 투여량들(doses)로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 세포들의 상기 효과적인 양은 단일 투여량(dose)으로 투여된다. 또다른 예에서, 세포들의 상기 효과적인 양은 일정 기간 동안 하나보다 많은 투여량(dose)으로서 투여된다. 투여 시기는 담당하는 의사의 판단 내이며, 환자의 임상적 상태에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 군은 혈액 은행 또는 기증자와 같은 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개별적인 필요가 다른 반면, 당업계의 기술 내 조건들 및 특정 질환의 정해진 세포 타입의 효과적인 양들의 최적 범위들의 결정. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적 이득을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 투여량(dosage)은 수혜자(recipient)의 체중, 건강 및 연령, 동시에 하는 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 및 바람직한 효과의 특성에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 상기 세포들 또는 그 세포들을 포함하는 약학적 조성물은 비경구로(parenterally) 투여된다. 상기 투여는 정맥내 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내 주사에 의하여 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비어(cidofovir) 및 인터루킨-2, MS 환자들을 위한 나탈리주맙(nataliziimab) 치료 또는 시타라빈(Cytarabine)(ARA-C로도 알려져 있음) 또는 건선(psoriasis) 환자들을 위한 에팔리주맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들과 같은 제제들로의 치료를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 많은 관련된 치료 양식들 (예를 들어, 전에, 동시에 또는 후에)과 함께 환자에 투여된다. 나아간 예들에서, 본 발명의 T-세포들은 화학요법, 방사선(radiation), 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉사트(methotrexate), 미코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506와 같은 면역억제 제제들, 항체들, 또는 CAMPATH과 같은 다른 면역제거의(immunoablative) 제제들, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 치료들, 사이톡신, 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린(cyclosporin), FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들 및 방사선 조사(irradiation)과 함께 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제(phosphatase) 칼시뉴린 (사이클로스포린(cyclosporine) 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달(라파마이신(rapamycin))에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다 (Liu et al., Cell 66:807-815, 11; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). 더 나아간 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 플루다라빈(fludarabine), 외부빔(external-beam) 방사선(radiation) 치료(therapy) (XRT), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 화학요법 제제들, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체들을 이용하여 T-세포 제거(ablative) 요법, 골수 이식 (예를 들어, 전, 동시에 또는 그 후)과 함께 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 예를 들어, 리툭산(Rituxan)인 CD20와 반응하는 제제들과 같은 B-세포 제거(ablative) 치료 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상은 높은 투여량(dose) 화학요법 후 말초 혈액 줄기 세포 이식인 표준 치료를 겪을 수 있다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입(infusion)을 받는다. 추가의 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
약학적 조성물
본 발명의 분리된 T-세포들은 단독으로 또는 희석제들 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토카인들 또는 세포 군집들과 같은 다른 구성요소들과 결합하여 약학적 조성물로써 투여될 수 있다. 간략하게, 본 발명의 약학적 조성물들은 하나 또는 그보다 많은 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체들, 희석제들 또는 부형제들(excipients)과 결합하여, 여기에 기재된 대로 T-세포들을 포함할 수 있다. 이러한 조성물들은 중성 완충된(buffered) 식염수(saline), 포스페이트 완충된 식염수 등과 같은 버퍼들; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란스, 만니톨과 같은 탄수화물들; 단백질들; 폴리펩타이드들 또는 글라이신과 같은 아미노산들; 항산화제들; EDTA 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 킬레이트(chelating) 제제들; 아쥬반트들(adjuvants) (예를 들어 알루미늄(aluminum) 하이드록사이드(hydroxide)); 및 보존제들을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물들은 바람직하게는 정맥내 투여를 위하여 만들어진다. 본 발명의 약학적 조성물들은 치료될 (또는 예방될) 질병에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는, 적합한 투여량들은 임상 시험에 의하여 결정될 수 있음에도 불구하고, 환자의 상태, 및 환자의 질병의 타입 및 심각도인 이러한 요인들에 의하여 결정될 수 있다.
분리된 CAR T 세포들의 세포독성 시험 방법 및 그것의 사용을 위한 키트
본 발명의 또다른 예는, 하기를 포함하는, 약물 저항성 타겟 세포들에 대한 전술한 바와 같은 분리된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포들; 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현시키는 상기 분리된 CAR T 세포들 및 적어도 특정 표면 항원 (및 선택적으로 루시페라제와 같은 마커(marker) 유전자)를 발현시키는 타겟 세포들 둘 다의 세포독성의 시험 방법을 포함한다:
(a) 상기 T-세포들의 군집(population) 및 타겟 세포들 둘 다를 준비하는 단계;
(b) 적어도 상기 특이적 타겟 세포들로 상기 T-세포들 군집을 배양하는 단계;
(c) 상기 특이적 타겟 세포들의 생존능(viability) 비율(rate)을 결정하는 단계.
저항성 유전자는 이전 섹션에 나타낸 것들 중에서 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기 저항성 유전자는 dCK이다.
본 발명에서 선택된 표면 항원은 키메라(Chimeric) 항원(Antigen) 수용체들(Receptors) (CAR)에 의하여 T 세포들에서 발현될 수 있고 타겟되는 세포에 의존적이며, 보통 암(cancerous) 세포들에 특이적인 것이다. 바람직하게는, CAR T 세포에서 사용되는 표면 항원은 CD19인데, 이는 이 항원이 특정 림프종들(lymphomas) 또는 급성(acute) 림프성(lymphocytic) 백혈병(leukemia) (ALL)과 같은 백혈병들에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타나기 때문이다.
결국, 본 발명은 타겟 세포에 관하여, CAR T 세포의 세포독성을 시험하는 방법을 수행하기 위한, 하기를 포함하는 키트(kit)에 의한 것이다:
(d) 항원에 특이적인 CAR를 부여하는(endowed) 상기 T 세포들 군집;
(e) 상기 항원을 발현시키는 상기 타겟 세포들;
(f) 선택적으로 배양 배지;
본 발명에 따른 화학요법 약물들에 저항성으로 만들어진 타겟 세포들 및 T 세포들 둘 다.
본 출원은 6TG 및 퓨린 뉴클레오타이드 유사체들(analogs) (PNA) 약물들에 저항성인 T-세포들의 일반적인 조작(engineering) 방법을 위한 보호만을 추구하는 것이 아니다. 그것은 더욱 대략적으로는 하기 목적들(objects) 중 적어도 하나를 포함하는, 동종이형이며, 화학요법 약물들에 저항성인, T-세포들을 수득하는 방법들에 대한 것이다:
1) 하기를 포함하는 면역요법을 위한 동종이형이고 약물 저항성인 T-세포들의 조작 방법:
(a) T-세포를 제공하는 단계;
b) 상기 T-세포가 민감한, 적어도 하나의 화학요법 약물을 선택하는 단계;
(c) T-세포 수용체 (TCR) 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시켜 상기 T-세포를 변형시키는(modifying) 단계;
(d) 상기 T-세포를 변형시켜 상기 화학요법 약물에 약물 저항성을 부여하는 단계;
(e) 선택적으로 상기 약물의 존재 하, 상기 조작된 T-세포를 확장시키는 단계.
2) 제 1항에 있어서, TCR 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자 내 타겟 서열을 절단할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시킴으로써 TCR 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 유전자가 활성화되는 방법.
3) 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 적어도 하나의 약물 민감성 유전자를 불활성화시킴으로써 상기 약물 저항성이 T-세포에 부여되는 방법.
4) 제 3항에 있어서, 상기 약물 민감성 유전자 내 타겟 서열을 절단할 수 있는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 발현시킴으로써 약물 민감성 유전자가 불활성화되는 방법.
5) 제 4항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제인 방법.
6) 제 3항 내지 제 5항에 있어서, 상기 약물 민감성 유전자는 dCK인 방법.
7) 제 6항에 있어서, dCK 유전자가 TALE-뉴클레아제들에 의하여 불활성화되는 방법.
8) 제 7항에 있어서, TALE-뉴클레아제들 dCK 유전자 불활성화가 서열번호 63 및 서열번호 64의 TALE-뉴클레아제들을 이용하여 수행되고, dCK 타겟 서열은 서열번호 62인 방법.
9) 제 3항 내지 제 5항에 있어서, 상기 약물 민감성 유전자는 HPRT인 방법.
10) 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 약물 저항성 유전자를 발현시킴으로써 상기 약물 저항성이 T-세포에 부여되는 방법.
11) 제 10항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자는, 바람직하게는 메토트렉사트(methotrexate) (MTX)인, 항-엽산(folate) 치료에 저항성을 부여하는 돌연변이된 디하드로폴레이트(dihydrofolate) 리덕타제(reductase) (DHFR) 단백질인 방법.
12) 제 11항에 있어서, 상기 돌연변이된 DHFR은 서열번호 : 14의 G15, L22, F31, 또는 F34 로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 방법.
13) 제 12항에 있어서, 상기 돌연변이된 DHFR은 서열번호 : 14의 위치들 L22 및 F31 에 두 개의 아미노산 돌연변이들을 포함하는 방법.
14) 제 10항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자는 바람직하게는 마이코페놀레이트(mycophenolate) 모페틸(mofetil) (MMF)인, IMPDH 억제제에 저항성을 부여하는 돌연변이된 이노신(inosine)-5'-모노포스페이트(monophosphate) 다이하이드로게나제(deshydrogenase) II (IMPDH2)인 방법.
15) 제 14항에 있어서, 상기 돌연변이된 IMPDH2가 서열번호 : 15의 위치 T333 및/또는 S351에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 방법.
16) 제 10항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자는 바람직하게는 FK506 및/또는 CsA인, 칼시뉴린 억제제에 저항성을 부여하는 돌연변이된 칼시뉴린 (CN) 헤테로다이머 a 및/또는 b인 방법.
17) 제 16항에 있어서, 상기 돌연변이된 칼시뉴린 헤테로다이머 a는 서열번호 : 16에서 V314, Y341, M347, T351, W352, L354 및 K360으로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 방법.
18) 제 17항에 있어서, 상기 돌연변이된 칼시뉴린 헤테로다이머 a는 서열번호 : 16에서 위치들: T351 및 L354 에서 아미노산 돌연변이들을 포함하는 방법.
19) 제 17항에 있어서, 상기 돌연변이된 칼시뉴린 헤테로다이머 a는 서열번호 : 17 에서 위치들 V314 및 Y341에서 아미노산 돌연변이들을 포함하는 방법.
20) 제 16항에 있어서, 상기 돌연변이된 칼시뉴린 헤테로다이머(heteromdimer) b는 서열번호 : 17에서 V120, N123, L124 및 K125로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에서 적어도 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 방법.
21) 제 20항에 있어서, 상기 돌연변이된 칼시뉴린 헤테로다이머 b는 서열번호 : 17의 위치들: L124 및 K125 에서 아미노산 돌연변이들을 포함하는 방법.
22) 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자는 상기 약물 저항성 유전자를 코드하는 이식유전자를 T-세포 내로 도입함으로써 T-세포에서 발현되는 방법.
23) 제 10항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자는 약물 저항성 유전자를 코드하는 서열 및 내인성(endogenous) 유전자의 적어도 하나의 상동 서열을 포함하는 기증자 매트릭스를 T-세포 내로 도입함으로써, T-세포에서 발현되어, 내인성(endogenous) 유전자들 및 상기 기증자 매트릭스 사이에서 상동 재조합이 일어나는 방법.
24) 제 23항에 있어서, 상기 내인성(endogenous) 유전자 내에서 타겟 서열을 선택적으로 절단할 수 있는 T-세포 내로 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 도입하여, 상동 재조합 비율(rate)이 활발해지는(stimulate) 단계를 더 포함하는 방법.
25) 제 24항에 있어서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제인 방법.
26) 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체를 T-세포에서 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
27) 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 CD19+ 또는 CD123+인 방법.
28) 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 면역-체크포인트 유전자를 불활성화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
29) 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T-세포들은 환자의 혈액에서 확장되는 방법.
30) 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T-세포들은 인-비트로에서 확장되는 방법.
31) 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T-세포들은 상기 약물의 존재 하 확장되는 방법.
32) 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득가능한 분리된 T-세포 또는 세포주.
33) T-세포 수용체 구성요소를 코드하는 적어도 하나의 방해된(disrupted) 유전자를 포함하는 약물에 저항성인 분리된 T-세포.
34) 제 33항에 있어서, 적어도 하나의 약물 저항성 유전자를 발현시키는 분리된 T-세포.
35) 제 33항에 있어서, 상기 약물 저항성 유전자가 돌연변이 DHFR, 돌연변이 IMPDH2, 돌연변이 칼시뉴린 및 돌연변이 AGT를 코드하는 ble 유전자, mcrA 유전자 및 유전자들:로 구성되는 군으로부터 선택되는 분리된 T-세포.
36) 제 33항에 있어서, 바람직하게는 HPRT 유전자인, 적어도 하나의 방해된 약물 민감성 유전자를 포함하는 분리된 T-세포.
37) 제 32항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 T-세포는 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)를 부여(endow)하는 분리된 T-세포.
38) 제 37항에 있어서, 상기 CAR는 CD19+ 세포들 또는 CD123+ 세포들을 타겟으로 하는 분리된 T-세포;
39) 제 32항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 그것의 의약으로의 사용을 위한 분리된 T-세포.
40) 제 32항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 암, 자가-면역 질환 또는 병원균에 의한 감염의 치료를 위한 분리된 T-세포.
41) 제 40항에 있어서, 급성(acute) 림프모세포성(lymphoblasic) 백혈병(leukemia) (ALL) 또는 근위축(amyotrophic) 골수종(myeloma) 백혈병(leukemia) (AML)의 치료로서의 그것의 사용을 위한 분리된 T-세포.
42) 제 32항 내지 제 41항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 약학적 조성물.
43) 하기를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법:
(a) 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 방법에 따라 T-세포들의 군집을 준비하는 단계;
(b) 상기 환자에 상기 형질전환된 T-세포들을 투여하는 단계.
44) 제 36항에 있어서, 상기 환자는 제 1항 내지 제 31항의 방법에서 사용되는 상기 약물로 치료되는 방법.
45) 하기를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 상기 분리된 CAR T 세포들 및 적어도 하나의 특정 표면 항원(및 선택적으로 루시페라제와 같은 마커 유전자를) 발현시키는 타겟 세포들 둘 다인, 약물 저항성인 타겟 세포들 상에 제 32항 내지 제 41항 중 어느 하나에 따른 분리된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포들의 세포독성을 시험하는 방법:
(a) 타겟 세포들 및 T-세포들의 상기 군집 둘 다를 준비하는 단계;
(b) 적어도 상기 특이적 타겟 세포들로 상기 T-세포들 군집을 배양하는 단계;
(c) 상기 특이적 타겟 세포들의 생존능 비율(rate)을 결정하는 단계.
46) 제 45항에 있어서, 상기 저항성 유전자는 dCK인 방법.
47) 제 44항 또는 제 45항에 있어서, 상기 표면 항원은 CD19인 방법.
48) 제 47항에 있어서, 상기 타겟은 CD19+ 루시페라제(Luciferase)+ 다우디(Daudi) 세포들인 방법.
49) 하기를 포함하는, 타겟 세포에 대한 CAR T 세포의 세포독성 시험 방법을 수행하기 위한 키트:
(a) 항원에 특이적인 CAR를 부여하는(endow) T 세포들 군집;
(b) 상기 항원을 발현시키는 타겟 세포들;
화학요법 약물에 저항성으로 만들어져 온 상기 타겟 세포들 및 T 세포들 둘 다.
정의들
전술한 기재에서, 다수의 용어들이 널리 사용된다. 하기 정의들은 본 예들의 이해를 용이하게 하기 위하여 제공된다.
폴리펩타이드 서열 내 아미노산 잔기들은 Q가 Gln 또는 글루타민(Glutamine) 잔기를 의미하고, R이 Arg 또는 아르기닌(Arginine) 잔기를 의미하고 그리고 D가 Asp 또는 아스파르트산(Aspartic acid) 잔기를 의미하는, 1-문자 코드에 따라 여기에서 지정된다.
- 뉴클레오타이드들은 하기와 같이 설계된다: 1-문자 코드는 뉴클레오사이드의 염기를 지정하는데 사용된다: a는 아데닌(adenine)이고, t는 티민(thymine)이고, c는 사이토신(cytosine)이고, 그리고 g는 구아닌(guanine)이다. 축퇴된 뉴클레오타이드들을 위하여, r은 g 또는 a (퓨린 뉴클레오타이드들)를 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, y는 t 또는 c (피리미딘 뉴클레오타이드들)을 나타내고, d는 g, a 또는 t를 나타내고, v는 g, a 또는 c를 나타내고, b는 g, t 또는 c를 나타내고, h는 a, t 또는 c를 나타내고, 그리고 n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 여기에서 사용된 대로, "핵산" 또는 "핵산 분자"가 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid (DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid) (RNA), 올리고뉴클레오타이드들, 폴리메라제(polymerase) 체인(chain) 반응(reaction) (PCR)에 의하여 발생하는 단편들, 및 연결(ligation), 절단(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의하여 발생하는 단편들과 같은, 뉴클레오타이드들 및/또는 폴리뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 (DNA 및 RNA와 같은) 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들, 또는 (예를 들어, 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체(enantiomeric) 형태들인) 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 유사체들, 또는 둘다의 조합인 모노머들로 이루어져 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- "유전자"에 의하여 특정 단백질 또는 단백질의 부분(segment), 작은(small) RNA 등을 코드하는, 염색체(chromosome)를 따라 선형 방식으로 배열된 DNA의 부분으로 구성되는, 유전의 기본적 단위가 의미된다. 유전자는 보통, 프로모터, 5' 비번역 영역, 하나 또는 그보다 많은 코딩 서열들(엑손들(exons)), 선택적으로 인트론들(introns), 3' 비번역 영역을 포함한다. 유전자는 터미네이터(terminator), 인핸서들(enhancers) 및/또는 사일런서들(silencers)을 더 포함할 수 있다.
- 용어 "이식 유전자(transgene)"는 그것이 도입되는 숙주 세포에 부분적으로 또는 완전히 이종기원(heterologous) 즉 외래(foreign)이거나, 또는 그것이 도입되는 숙주 세포의 내인성(endogenous) 유전자에 상동(homologous)이나, 그러나 (예를 들어 자연적 유전자의 것과는 다른 위치에 삽입되거나 또는 그것의 삽입이 넉아웃(knockout)을 야기하는) 그것이 삽입되는 세포의 게놈을 변화시킬 수 있는 방식으로, 세포 게놈 내로 삽입되도록 디자인될 수 있거나 또는 삽입(insert)될 수 있는, (예를 들어 하나 또는 그보다 많은 폴리펩타이드들을 코드하는) 핵산 서열을 의미한다. 이식유전자는 폴리펩타이드를 코드하는 선택된 핵산의 최적의 발현에 필요할 수 있는, 인트론들과 같은, 임의의 다른 핵산 및 하나 또는 그보다 많은 전사 조절 서열들을 포함할 수 있다. 이식유전자에 의하여 코드되는 폴리펩타이드는 이식유전자가 삽입(insert)되는 세포들에서, 발현되지 않거나 또는 발현되나 생물학적으로 활성이지 않을 수 있다.
- "게놈(genome)"에 의하여, 핵 게놈, 엽록체 게놈, 미토콘드리아 게놈과 같은 세포에 포함되는 전체 유전 물질이 의미된다.
- "돌연변이"에 의하여, 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, gene) 또는 a 폴리펩타이드 서열에서 하나 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 상기 돌연변이는 유전자 또는 그것의 조절(regulatory) 서열의 코딩 서열에 영향을 미칠 수 있다. 그것은 또한 코드되는 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조에 영향을 미칠 수 있다.
- 용어 "희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들의 가수분해(절단((cleavage))을 촉매화할 수 있는 야생형 또는 변형(variant) 효소를 가리킨다. 특히, 상기 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제, 더욱 바람직하게는 10 부터 45 염기쌍들(base pairs)까지의 (bp) 길이의 범위인, 보통 10 내지 35 염기쌍들 길이의 범위인 핵산 타겟 자리들을 인식하는, 매우 특이적인, 희귀-절단 엔도뉴클레아제일 수 있다. 본 발명에 따른 엔도뉴클레아제는, 나아가, "타겟 서열"로 나타내어지는, 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열들에서 핵산을 인식하고 자른다. 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 특이적 폴리뉴클레오타이드들 서열들에서 단일- 또는 이중-가닥 파손(break)을 인식하고 만들어낼 수 있다.
특정 예에서, 본 발명에 따른 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 Cas9 엔도뉴클레아제일 수 있다. 과연, 최근 새로운 게놈 조작 수단(tool)이 타입 II 원핵(prokaryotic) CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats) 입양 면역 시스템으로부터 RNA-가이드된(guided) Cas9 뉴클레아제에 기초하여 개발되어 왔다 (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013)(리뷰를 위하여 (Sorek, Lawrence et al. 2013) 참조). CRISPR 관련(Associated) (Cas) 시스템은 박테리아에서 처음 발견되었으며 외래(foreign) DNA, 바이러스 또는 플라스미드에 대항한 방어로서 기능한다. CRISPR-매개 게놈 조작은 처음 프로토(proto)-스페이서(spacer) 인접(adjacent) 모티프(motif) (PAM)로서 나타내어지는, 짧은 서열 모티프에 의하여 자주 측면에 배치되는 타겟 서열의 선택에 의하여 진행된다. 타겟 서열 선택 후, 이 타겟 서열에 상보적인, 특이적 crRNA이 조작된다. CRISPR 타입 II 시스템들에서 요구되는 전사를 촉진하는(Trans-activating) crRNA (tracrRNA)는 crRNA와 짝을 짓고 제공된 Cas9 단백질에 결합된다. Cas9는 tracRNA의 cRNA과의 염기 짝짓기를 가능하게 하는 분자 닻anchor)으로서 역할을 한다 (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). 이 삼중(ternary) 복합체에서, 이중(dual) tracrRNA:crRNA 구조체는 엔도뉴클레아제를 관련있는(cognate) 타겟 서열로 향하게 하는 가이드 RNA 로서 역할을 한다. Cas9-tracrRNA:crRNA 복합체에 의한 타겟 인식은 타겟 서열 및 crRNA 사이의 상동성(homology)을 위한 타겟 서열의 스캔(scanning)에 의하여 시작된다. 타겟 서열-crRNA 상보적 상태(complementarity)에 더하여, DNA 타겟팅은 프로토스페이서(protospacer)에 인접한 짧은 모티프 (프로토스페이서(protospacer) 인접(adjacent) 모티프 - PAM)의 존재를 요구한다. 이중-RNA 및 타겟 서열 사이의 짝짓기 후, Cas9 는 그 뒤에 PAM 모티프의 3 염기들 업스트림(upstream)에 블런트(blunt) 이중 가닥 파손(break)를 도입한다 (Garneau, Dupuis et al. 2010). 본 발명에서, 가이드 RNA는 예를 들어 TCR 구성요소를 코드하는 유전자를 특이적으로 타겟으로 하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 및 타겟 서열 사이의 짝짓기 후, Cas9 는 TCR 유전자 내 절단(cleavage)을 유도한다.
희귀-절단 엔도뉴클레아제는 또한 메가뉴클레아제(meganuclease)의 이름 하로도 알려진, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제일 수 있다. 이러한 호밍 엔도뉴클레아제들은 업계에 잘 알려져 있다 (Stoddard 2005). 호밍 엔도뉴클레아제들은 12 부터 45 염기쌍들 (bp) 길이의 범위, 보통 14 내지 40 bp 길이의 범위인 DNA 타겟 자리들을 인식하는, 매우 특이적이다. 본 발명에 따른 호밍 엔도뉴클레아제는 예를 들어 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제에, HNH 엔도뉴클레아제에, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 일치할 수 있다. 본 발명에 따른 선호되는 호밍 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변형(variant)일 수 있다. "변형(variant)" 엔도뉴클레아제, 즉 자연에서 자연적으로 존재하지 않고 무작위 돌연변이 또는 유전적 조작에 의하여 수득되는 엔도뉴클레아제는 야생형 엔도뉴클레아제들에 의하여 인식되는 것과는 다른 DNA 서열들에 결합할 수 있다 (국제 특허출원 WO2006/097854 참조).
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 모듈식(modular) DNA 결합 뉴클레아제일 수 있다. 모듈식 DNA 결합 뉴클레아제에 의하여, 핵산 타겟 서열을 특정하는 적어도 하나의 DNA 결합 도메인 또는 단백질 및 엔도뉴클레아제의 적어도 하나의 촉매적 도메인을 포함하는 임의의 융합 단백질들이 의미된다. DNA 결합 도메인은 일반적으로 이중- 또는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드들을 인식하는 적어도 하나의 모티프를 포함하는 독립적으로 접히는(folded) 폴리펩타이드 또는 단백질 도메인에 의하여 형성되는 RNA 또는 DNA-결합 도메인이다. 많은 이러한 폴리펩타이드들이 업계에서 특이적 핵산 서열들에 결합하는 능력을 갖는다고 기재되어 왔다. 이러한 결합 도메인들은, 제한되지 않는 예들로서 헬릭스-턴 헬릭스 도메인들, 류신 지퍼 도메인들, 날개 달린(winged) 헬릭스(helix) 도메인들, 헬릭스-루프(loop)-헬릭스 도메인들, HMG-박스 도메인들, 이뮤노글로빈(immunoglobin) 도메인들, B3 도메인 또는 조작된 징크 핑거 도메인을 자주 포함한다.
본 발명의 선호되는 예에 따라, DNA 결합 도메인은 전사(Transcription) 액시테이터(Activator) 유사(like) 효과기(Effector) (TALE)로부터 유래되며, 이때 서열 특이성은 잔토모나스(Xanthomonas) 또는 랄스토니아(Ralstonia) 박테리아 단백질들로부터 비롯되는 일련의 33-35 아미노산들 반복들(repeats)에 의하여 만들어진다. 이들 반복들은 염기쌍과 상호작용을 명확히 하는 두 개의 아미노산들 위치들이 본질적으로 다르다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009). DNA 타겟의 각각의 염기쌍은 반복의 두 개의 변형(variant) 아미노산들로부터 야기되는 특이성을 갖고, 단일 반복에 의하여 접촉된다 (소위, 반복(repeat) 가변(variable) 다이펩타이드(dipeptide), RVD). TALE 결합 도메인들은 핵(nuclear) 위치화(localization) 신호들(signals) (NLS)을 포함하는 C-말단(terminal) 도메인 및 타겟된 서열의 첫 번째 티민(thymine) 염기 (T0)의 요구에 원인이 있는 N-말단 자리이동(translocation) 도메인을 더 포함할 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 일반적으로, TALE 인식 자리의 각각의 뉴클레오타이드들 염기에 특이적인 RVD를 포함하는 각각의 반복들인, 수많은 TALE 반복 서열들을 포함하는, 조작된 코어(core) TALE 스캐폴드(scaffold)에 대응한다. 본 발명에서, 상기 코어 스캐폴드의 각각의 TALE 반복 서열은 30 내지 42 아미노산들, 더욱 바람직하게는 33 또는 34 로 만들어지고, 이때 위치들 12 및 13에 위치한 두 개의 매우 중요한 아미노산들 (소위 반복(repeat) 가변(variable) 다이펩타이드(dipeptide), RVD)이 상기 TALE 결합 자리 서열의 하나의 뉴클레오타이드의 인식을 매개한다; 등가의 두 개의 매우 중요한 아미노산들은 33 또는 34 아미노산들 길이보다 더 긴 TALE 반복 서열에서 특히 12 및 13 이 아닌 위치들에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 다른 뉴클레오타이드들의 인식과 관련된 RVD들은 C의 인식을 위한 HD, T의 인식을 위한 NG, A의 인식을 위한 NI, A 또는 G의 인식을 위한 NN이다. 또다른 예에서, 매우 중요한 아미노산들 12 및 13은 뉴클레오타이드들 A, T, C 및 G에 대한 그것들의 특이성을 조절하기 위하여, 특히 이 특이성을 증강시키기 위하여, 다른 아미노산 잔기들에 돌연변이될 수 있다. TALE 핵산 결합 도메인은 보통 8 및 30 TALE 반복 서열들 사이를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 코어 스캐폴드는 8 및 20 TALE 반복 서열들 사이; 다시 더욱 바람직하게는 15 TALE 반복 서열들을 포함한다. 그것은 또한 TALE 반복 서열들의 상기 세트의 C-말단(terminus)에 위치한 20 아미노산들로 만들어진 추가의 단일 끝이 잘린(truncated) TALE 반복 서열, 즉 추가의 C-말단 반(half)-TALE 반복 서열을 포함할 수 있다.
다른 조작된 DNA 결합 도메인들은 모듈식 염기-당(per)-염기 특이적 핵산 결합 도메인들 (MBBBD)이다 (PCT/US2013/051783). 상기 MBBBD는, 예를 들어, 내생공생동물(endosymbiont) 진균(fungi) 부르크홀데리아(Burkholderia) 리조시니카(Rhizoxinica)의 최근에 시퀀싱된 게놈으로부터 새로 확인된 단백질들, 즉 EAV36_BURRH, E5AW43_BURRH, E5AW45_BURRH 및 E5AW46_BURRH 단백질들로부터 조작될 수 있다 (Lackner, Moebius et al. 2011). MBBBD 단백질들은 염기 특이적인 약 31 내지 33 아미노산들의 모듈들(modules)을 포함한다. 이들 모듈들은 잔토모나스(Xanthomonas) TALE 보통 반복들과의 40 % 미만(less)의 서열 동일성(identity)을 보이는 반면, 그것들은 더 많은 폴리펩타이드들 서열 가변성(variability)을 보인다. 그것들이 서로 조립될 때, 이들 모듈식 폴리펩타이드들은 그럼에도 불구하고 잔토모나스(Xanthomonas) TALE-뉴클레아제들과 매우 유사한 식으로 특이적 핵산 서열들을 타겟으로 할 수 있다. 본 발명의 선호되는 예에 따라, 상기 DNA 결합 도메인은 10 및 30 모듈들 사이, 바람직하게는 16 및 20 모듈들 사이를 포함하는 조작된 MBBBD 결합 도메인이다. 부르크홀데리아(Burkholderia) 및 잔토모나스(Xanthomonas)로부터 (모듈들, N 및 C-말단들) 상기 단백질들로부터 달느 도메인들은 특이적 핵산 서열들에 결합 특성들을 갖는 스캐폴드들 또는 새로운 단백질들을 조작하는데 유용하다. 특히, 조작된 MBBBD의 추가의 N-말단 및 C-말단 도메인들은 제한되지 않는 예들로서, 자연적인 TALE 같은 AvrBs3, PthXo1, AvrHah1, PthA, Tal1c로부터 유래될 수 있다.
- "TALE-뉴클레아제(nuclease)" 또는 "MBBBD-뉴클레아제(nuclease)"는 엔도뉴클레아제 촉매적 도메인과 MBBBD 결합 도메인 또는 전사(Transcription) 액티베이터(Activator) 유사(like) 효과기(Effector) 단백질들 (TALE)로부터 보통 유래된 DNA 결합 도메인의 융합으로부터 생긴 조작된 단백질들을 가리킨다. 이러한 촉매적 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고, 더욱 바람직하게는 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은, 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 예에서, 상기 뉴클레아제는 모노머(monomeric) TALE-뉴클레아제 또는 MBBBD-뉴클레아제이다. 모노머 뉴클레아제는 WO2012138927에 기재된 I-TevI의 촉매적 도메인과 조작된 DNA 결합 도메인의 융합과 같은, 특이적 인식 및 절단(cleavage)을 위한 이합체화(dimerization)를 요구하지 않는 뉴클레아제이다. 또다른 특정 예에서, 상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는, 바람직하게는 FokI에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는, 다이머 TALE-뉴클레아제 또는 MBBBD-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제는 이미 기재되어 왔고, 유전자 타겟팅 및 유전자 변형들을 자극하는데 사용되어 왔다 (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010). 이러한 조작된 TALE-뉴클레아제들은 상표 TALENTM (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France) 하 상업적으로 이용가능하다.
- 용어 "절단(cleavage)"은 폴리뉴클레오타이드의 공유(covalent) 백본의 파손(breakage)을 가리킨다. 절단(cleavage)은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 제한되지 않는 여러가지 방법들에 의하여 시작될 수 있다. 단일가닥 절단(cleavage) 및 이중가닥 절단(cleavage) 둘다 가능하며, 이중가닥 절단(cleavage)은 두 개의 구별되는 단일 가닥 절단(cleavage) 이벤트들의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼성(hybrid) 절단(cleavage)은 블런드(blunt) 말단들(ends) 또는 엇갈린(staggered) 말단들의 생산을 야기할 수 있다.
- "키메라 항원 수용체" (CAR) 에 의하여, 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인, 막관통(transmembrane) 도메인 및 신호(signaling) 전달(transducing) 도메인을 포함하는 키메라 수용체가 의미된다.
- 여기에서 사용된 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로서 정의된다. 바람직하게는, 그 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인는 특정 질병 상태와 관련된 타겟 세포들 상에 세포 표면 마커로서 역할하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다.
선호되는 예에서, 상기 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인은 플렉서블(flexible)한 링커(linker)에 의하여 연결(join)되는 타겟 항원 특이적 단일클론 항체의 가벼운(VL) 그리고 무거운(heavy) (VH) 가변 단편을 포함하는 단일 사슬 항체 단편(fragment) (scFv)을 포함한다. 선호되는 예에서, 상기 scFV는 CD19 또는 CD123 항체로부터 유래된다. 바람직하게는, 본 발명의 상기 scFV는 CD19 단일클론 항체 4G7로부터 유래된 scFV을 포함한다 (Peipp, Saul et al. 2004)
- 본 발명에 따른 CAR의 신호(signal) 전달(transducing) 도메인 또는 세포내(intracellular) 신호전달(signaling) 도메인은 면역 세포 및 면역 반응의 활성화를 야기하는 타겟에 대한 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인의 결합 후 세포내(intracellular) 신호전달의 원인이다. CAR에 사용을 위한 신호 전달 도메인의 선호되는 예들은 항원 수용체 참여(engagement) 후 신호 전달을 시작하는 것과 협력하여 역할하는 공(co)-수용체들 및 T-세포 수용체의 세포질 서열들일 수 있다. 신호(signal) 전달(transduction) 도메인은 세포질 신호전달(signaling) 서열의 두 개의 다른 종류들(classes), 항원-의존적 일차 활성화를 시작하는 그것들 및 이차 또는 공-자극 신호를 제공하는 항원-독립적 방식으로 역할하는 그것들을 포함한다. 일차 세포질 신호전달(signaling) 서열은 ITAM들의 면역수용체 티로신-기반의(based) 활성화 모티프들로 알려진 신호전달(signaling) 모티프들을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR의 신호(signal) 전달(transduction) 도메인은 공-자극 신호 분자를 포함한다. 공-자극 분자는 효율적인 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그것들의 리간드들이 아닌 세포 표면 분자이다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 공자극 분자들의 예들은 CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구(lymphocyte) 기능(function)-관련(associated) 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.
본 발명에 따른 CAR는 세포의 표면 막 상에 발현된다. 이런 식으로, CAR는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 적절한 막관통 도메인들의 구별되는 특징들은 세포, 본 발명에서 바람직하게는 면역 세포, 특히 림프구 세포들 또는 자연(Natural) 살해(killer) (NK) 세포들의 표면에서 발현되는, 그리고 미리 정해진 타겟 세포에 대항한 면역 세포의 세포 반응을 향하기 위하여 서로 상호작용하는 능력을 포함한다. 막관통 도메인은 상기 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인 및 상기 막관통 도메인 사이의 스토크(stalk) 영역을 더 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "스토크(stalk) 영역"은 보통 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인에 막관통 도메인을 연결(link)하는 작용을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히 스토크 영역은 더 많은 유연성 및 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인에 대한 접근성을 제공하는데 사용된다. 스토크 영역은 300 아미노산들까지, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산들 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산들을 포함할 수 있다. 스토크 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외(extracellular) 영역의 모두 또는 부분, 또는 항체 불변(constant) 영역의 모두 또는 부분으로부터와 같은, 자연적으로 발생하는 분자들의 모두 또는 부분으로부터 유래될 수 있다. 대체하여, 스토크 영역은 자연적으로 발생하는 스토크 서열에 대응하는 합성 서열일 수 있고, 또는 완전히 합성 스토크 서열일 수 있다.
타겟 항원들의 돌연변이 또는 하향조절은 보통 암 세포들, 항원-손실 탈출(escape) 변이체들(variants)을 만드는 데에서 관찰된다. 이런 식으로, 종양 탈출(escape)를 상쇄하고 타겟에 더욱 특이적인 면역 세포들을 만들기 위하여, CD19 특이적 CAR는 또다른 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인들을 포함하여, 동시에 타겟 내 다른 요소들에 결합하고, 이로써 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시킬 수 있다. CD19 특이적 CAR의 예들은 ScFv FMC63 (Kochenderfer JN, Wilson WH, Janik JE, et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood 2010;116(20):4099-410) 또는 ScFv 4G7 CAR (PCT/EP2014/059662 번호로 출원된 것에 기재됨)이다. 또다른 예에서, 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인들은 동일한 막관통 폴리펩타이드 상에 나란히(tanmdem) 위치될 수 있으며, 선택적으로 링커에 의하여 분리될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 다른 세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인들은 CAR를 구성(composing)하는 다른 막관통 폴리펩타이드들 상에 위치할 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명은 각각 하나의 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR들의 군집에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및, 상기 세포의 표면에서 각각 하나가 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR의 군집을 발현시키는 단계를 포함하는 면역 세포들의 조작 방법에 대한 것이다. 또다른 특정 예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 각각 하나가 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR의 군집을 구성하는 폴리펩타이드들을 코드하는 상기 세포 폴리뉴클레오타이드들 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역 세포의 조작 방법에 대한 것이다. CAR들의 군집에 의하여, 각각 하나가 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들을 포함하는, 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그보다 많은 CAR들이 의미된다. 본 발명에 따른 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들은 바람직하게는 타겟에서 다른 요소들에 동시에 결합(bind)하여 면역 세포 활성화 및 기능을 증가시킬 수 있다. 본 발명은 또한 각각 하나가 다른 세포외(extracellular) 리간드 결합 도메인들을 포함하는 CAR들의 군집을 포함하는 분리된 면역 세포에 대한 것이다.
- 용어 "벡터"는 그것이 연결(link)되는 또다른 핵산으로 전달(transport)하는 것이 가능한 핵산 분자를 가리킨다. 본 발명에서 "벡터"는 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터 또는 염색체의, 비염색체의, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는, 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 선호되는 벡터들은 그것들이 연결(link)되는 핵산들의 발현 (발현 벡터들) 및/또는 자가(autonomous) 복제가 가능(에피솜(episomal) 벡터)한 것들이다. 수많은 적합한 벡터들이 당업자들에게 알려져 있으며 상업적으로 이용가능하다.
- "전달(delivery) 벡터"에 의하여 본 발명에서 필요로 하는 제제들/화학물질들 및 분자들 (단백질들 또는 핵산들)을 세포 접촉으로 놓거나(즉, "접촉(contacting)") 또는 세포들 또는 세포 이하(subcellular) 구획들(compartments) 내로 전달하기(즉, "도입(introducing)") 위하여 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터가 의도된다. 그것은, 리포좀(liposomal) 전달 벡터들, 바이러스 전달 벡터들, 약물 전달 벡터들, 화학물질 담체들, 폴리머 담체들, 리포플렉스들(lipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드리머들(dendrimers), 미세기포들(microbubbles) (초음파(ultrasound) 대조(contrast) 제제들(agents)), 나노입자들, 에멀젼들 또는 다른 적절한 이동(transfer) 벡터들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
- 바이러스 벡터들은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스(parvovirus) (예컨대 아데노관련(adenoassociated) 바이러스들), 코로나바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus)(예컨대 인플루엔자 바이러스)와 같은 음성 가닥 RNA 바이러스들, 랍도바이러스(rhabdovirus) (예컨대, 광견병(rabies) 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대 홍역 및 센다이), 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 가닥 RNA 바이러스들, 및 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(예컨대, 헤르페스(Herpes) 심플렉스(Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)) 및 수두바이러스(poxvirus)(예컨대, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox))를 포함하는 이중-가닥 DNA 바이러스들을 포함한다. 다른 바이러스들은, 예를 들어, 노워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스들(reoviruses), 파포바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염(hepatitis) 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 조류(avian) 백혈증(leukosis)-육종(sarcoma), 포유류 C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스(lentivirus), 스푸마바이러스(spumavirus_ (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스(lentiviral) 벡터"에 의하여, 그것들의 상대적으로 큰 포장 용량, 감소된 면역원성 및 많은 범위의 다른 세포 타입들을 높은 효율로 안정적으로 변환(transduce)할 수 있는 그것들의 능력 때문에 유전자를 위한 매우 유망한 HIV-기반의 렌티바이러스 벡터들이 의미된다. 렌티바이러스 벡터들은 보통 생산자(producer) 세포들 내로의 셋(포장(packaging), 엔벨로프(envelope) 및 이동(transfer)) 또는 그보다 많은 플라스미드들을의 일시적인 형질감염(transfection) 후 만들어진다. HIV처럼, 렌티바이러스 벡터들은 세포 표면 상 수용체들과의 바이러스 표면 당단백질들의 상호작용을 통하여 타겟 세포로 들어간다. 들어가면, 바이러스 RNA는 역전사를 겪는데, 이는 바이러스 역전사효소 복합체에 의하여 매개된다. 역전사의 산물은 이중가닥 선형 바이러스 DNA로, 이는 감염된 세포들의 DNA 내 바이러스 통합(integration)을 위한 기질이다. "통합하는(integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 LV)"에 의하여, 제한되지 않는 예로, 타겟 세포의 게놈을 통합할 수 있는 이러한 벡터들이 의미된다. "비-통합하는(non-integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 NILV)"에 의하여 대조적으로, 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통하여 타겟 세포의 게놈을 통합하지 않는 효율적인 유전자 전달 벡터들이 의도된다.
- 세포 또는 세포들에 의하여 인 비트로 배양들을 위한 이들 생물들(organisms)로부터 유래된 임의의 진핵 살아있는 세포들, 일차(primary) 세포들 및 세포주들이 의미된다.
- "일차(primary) 세포" 또는 "일차 세포들"에 의하여, 살아 있는 조직(즉, 생검(biopsy)anfwlf)로부터 직접 취해지고, 인 비트로에서의 성장을 위하여 확립된, 군집(population) 배가(doubling)들을 거의 겪지 않아 그러므로 연속적인 종양형성(tumorigenic) 또는 인공적으로 불명화된(immortalized) 세포주들과 비교할 때, 그것들이 유래되는 조직들의 특성들 및 주된 기능적 구성요소들의 더욱 대표적인, 세포들이 의도된다. 제한되지 않는 예들로서, 세포주들은 CHO-K1 세포들; HEK293 세포들; Caco2 세포들; U2-OS 세포들; NIH 3T3 세포들; NSO 세포들; SP2 세포들; CHO-S 세포들; DG44 세포들; K-562 세포들, U-937 세포들; MRC5 세포들; IMR90 세포들; Jurkat 세포들; HepG2 세포들; HeLa 세포들; HT-1080 세포들; HCT-116 세포들; Hu-h7 세포들; Huvec 세포들; Molt 4 세포들로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
- 몇몇 가변성(variability)은 이들 폴리펩타이드들이 유래하는 것으로부터의 게놈 데이터로부터 일어나기 때문에, 또한 중대한 활성의 손실 없이 이들 폴리펩타이드들 내 존재하는 아미노산들 중 일부를 치환할 가능성을 고려할 때(기능적 변이체들), 본 발명은 이 특허출원에서 제공된 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 그리고 더더욱 바람직하게는 적어도 95 % 동일성(identity)을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드들 변이체들을 포함한다.
본 발명은 그러므로 서열번호 : 8 내지 서열번호 : 20 및 서열번호 : 26 내지 서열번호 : 35으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 동일성(identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.
- "동일성(identity)"은 두 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 동일성(identity)을 가리킨다. 동일성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교되는 서열 내 위치가 동일한 염기에 의하여 점유될 때, 그러면 분자들은 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이의 유사도(similarity) 또는 동일성(identity)의 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서 동일하거나 또는 매칭되는(matching) 뉴클레오타이드들의 수의 기능이다. GCG 서열 분석 패키지(package) (University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 부분으로서 이용가능한 FASTA, 또는 BLAST를 포함하여, 여러가지 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 동일성(identity)을 계산하기 위하여 사용될 수 있고, 예를 들어, 디폴트(default) 세팅으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 여기에서 기재된 특정 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성(identity)을 갖고, 바람직하게는, 게다가 이러한 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드와 동일한 기능들을 상당히 보여주는 폴리펩타이드들이 고려된다;
- <<넉아웃(knockout)>>은 유전자가 발현될 수 없을 정도로 돌연변이된 것을 의미한다.
- "TRAC"는 "T 세포 수용체 알파 불변(constant)>>을 가리키며, TCRα 서브유닛(subunit) 불변(constant) 유전자에 대응한다.
이전의 특징들에 더하여, 본 발명은 게다가 첨부된 도면들과, 면역요법을 위한 동종이형(allogeneic)이며 저항성인 T-세포들의 조작 방법을 설명하는 다음의 예들로부터 드러나는 특징들을 더 포함한다.
예 1: 클로파라빈 ( clofarafine ) 저항성 T 세포들의 제조 및 특성화
dCK의 TALE-뉴클레아제-매개 불활성화
dCK를 불활성화시키기 위하여, 두 쌍의 dCK TALE-뉴클레아제들이 설계되고, 조립되고, 시퀀싱에 의하여 입증되었다; 그 다음의 일이 TALE-뉴클레아제 dCK2로 명명되고 서열번호 :63 및 서열번호 :64를 갖는 쌍만을 이용하여 수행되었다. dCK 유전자 전체적인 건축(엑손들 및 인트론들)에 관한 상세한 것들 및 엑손(exon) 2에 위치한 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들의 서열들이 도 3에 표시된다.
TALE-뉴클레아제 dCK2 쌍을 위한 dCK 타겟 서열은 서열번호 62에 대응한다.
일단 입증되면, 두 개의 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 mRNA들이 생산되고, 폴리아데닐화되고(polyadenylated), WO 2013/176915에 기재된 바와 같이 펄스 아질 기술(왼쪽 및 오른쪽 5 또는 10 μg의 TALE-뉴클레아제 mRNA가 사용되었다)을 이용하여 T 세포들을 전기천공하는데 사용되었다. 낮은 온도 충격이 전기천공 후 즉시 및 24 시간 동안 30 ℃에서 T 세포들을 배양함으로써 수행되었다. 재활성화(12.5μl 비드들(beads)/106 세포들)가 D8(전기천공 후 8일)에 수행되었다.
그 결과인 T 세포들은 성장하고, (엔도(Endo) T7 분석 및 dCK 및 TRAC 자리들에서 딥(deep) 시퀀싱(sequencing)에 의하여) 결국 유전자형으로 게다가 표현형으로 특징되는 것이 가능하였다. 그것들의 표현형 특징화는 (i) 약물의 존재 또는 부존재 하 성장하는 그것들의 능력을 체크하고, (ii) T 세포들에 대한 PNA들, 클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)의 IC50을 결정하고, 그리고 (iii) 이중 KO가 수행될 때, FACS 분석에 의한 TRAC 불활성화의 정도를 결정하는 것으로 구성된다.
dCK KO T 세포들의 유전자형 특징화
dCK 유전자 불활성화의 효율을 평가하기 위하여, 5 또는 10 μg 의 TALE-뉴클레아제 mRNA로 형질감염된(transfected) 세포들이 4 일간 성장되었고(D4, 전기천공 후 4일), dCK 자리에서 T7 분석들을 수행하기 위하여 수집되었다(도 5).
이들 T7 분석들에서 사용된 프라이머들의 서열들은 서열번호 68 및 서열번호 69에 대응한다. T7 분석 프로토콜은 Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., and Joung, J. K. (2012) FLASH assembly of TALE-nucleases for high-throughput genome editing. Nat Biotechnologies에 기재되어 있다.
이 엔도(endo) T7 분석은, 5 및 10 μg 의 왼쪽 및 오른쪽 dCK2 TALE-뉴클레아제가 형질감염(transfect)될 때, dCK가 효율적으로 불활성화된다는 것을 가리키는 중요한 유전자 공정(processing)을 보여준다.
dCK KO T 세포들의 성장 속도의 결정
도 6에서 나타낸 바와 같이, dCK KO 세포들은 WT 세포들과 관련하여 유사한 성장 속도를 보여준다. 게다가, 그것들은 WT T 세포들보다 동일한 효율로 D8 에서 재활성화될 수 있었다.
클로파라빈(clofarabine)의 존재 하 dCK KO T 세포의 선택
dCK KO 또는 WT T 세포들은 D8 부터 D13까지 성장하는 것이 허용되었고, 그 다음에 D18까지 1 μM 클로파라빈(clofarabine)과 또는 이것 없이 배양되었다. 세포들은 D8에 (약물 첨가 전), 그리고 D18에 (약물 배양 후) 수집되었고, 엔도 T7 분석을 수행하기 위하여 사용되었다.
도 7에 나타난 결과들은 D18에서 배지들 내 1 μM 클로파라빈(clofarabine)의 존재는 WT T-세포에 비교할 때 선택적으로 dCK KO T 세포들을 강화한다는 것을 보여준다 (WT T-세포들에 대한 더 높은 분자 무게의 단일 밴드에 비교할 때, dCK KO T-세포의 더 낮은 분자 무게의 2 개의 밴드들). 이것은 dCK의 TALE-뉴클레아제-매개된 불활성화가 WT T 세포들보다 약물 저항성인 T 세포들의 선택을 가능하게 한다는 것을 가리킨다. 이런 식으로, dCK KO T 세포들은 European Medecines Agency (EMA)에 의하여 보고된 Cmax에 따른 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL)의 치료를 위한 임상적으로 적절한(relevant) 투여량(dose)에 대응하는 1 μM 클로파라빈(clofarabine)의 존재까지 저항할 수 있다.
dCK KO T 세포들 대(versus) WT T 세포들 상 클로파라빈에 대한 IC50 결정
클로파라빈(clofarabine)에 저항하는 T 세포들의 능력을 더 조사하기 위하여, 이 약물에 대한 IC50이 dCK KO 및 WT T 세포들 상에서 결정되었다. 세포들이 형질감염(transfection) 후 3일에 수집되었고 클로파라빈(clofarabine)의 증가하는 농도의 존재 하 (0 내지 10 μM), 2 일 동안 배양되었다. 클로파라빈(clofarabine) 배양의 마지막에, T 세포들의 생존능(viability)이 FACS 분석2에 의하여 결정되었다.
도 8에 나타내어진 결과들은 TALE-뉴클레아제들에 의하여 매개된 dCK 유전자의 가공이 T 세포들에서 dCK 활성을 효율적으로 불활성화시킨다는 것을 명확히 보여준다. 이러한 불활성화는 WT T 세포들의 민감성(sensitivity)과 대조적으로 클로파라빈과 연관성이 있다. IC50 값들(세포 생존능을 50 %로 저하시키기 위하여 배지들에 첨가되는 약물의 양)은 WT 및 dCK KO T 세포들에 대하여 각각 약 100 nM 및 10 μM 에 해당한다.
완전히, 데이터의 이 첫번째 세트는 dCK 유전자의 TALE-뉴클레아제-매개된 불활성화가 효율적이라는 결론을 가능하게 한다. dCK의 불활성화는 조작된 T 세포들의 성장 속도(rate)를 손상시키지 않으며, 반면 그것들을 클로파라빈의 임상적으로 적절한 투여량(dose)에 저항할 수 있게 한다.
예 2. 클로파라빈 ( clofarabine ) 저항성동종이형 ( allogeneic ) T 세포의 제조 및 특성화
클로파라빈(clofarabine) 저항성 동종이형(allogeneic) CAR T 세포들을 제조하고 발달시키기 위하여, dCK 및 TRAC 유전자들이 동시에 불활성화된다. dCK 불활성화가 성공적이었다는 것이 예 1에서 입증된 후, TRAC/dCK 이중 KO T 세포들이 만들어지고 특징화되었다. 도 9에 나타내어진 두 개의 작업흐름들(workflows)이 평행하게 이어진다. 그것들 중 하나는 클로파라빈의 존재 하 세포들의 배양 5일 동안의 기간에 대응한다.
유전자형(genotypic) 특징화(characterization)
TRAC 및/또는 dCK 유전자 불활성화들의 운동(kinetic)과 더불어 효율을 처음 평가하기 위하여, 형질감염된(transfected) 세포들이 6일 동안 성장되었고, D1, D3 및 D6에 수집되어, dCK 및 TRAC 자리들에서 T7 분석들이 수행되었다. 그것을 달성하기 위하여, 각각 서열번호 68 및 번호 69; 및 서열번호 70 및 번호 71 을 갖는 2 쌍의 프라이머들이 dCK 및 TRAC 자리들에서 T7 분석들에 사용되었다.
사용된 프로토콜은 Reyon, D., Tsai, S. Q., Khayter, C., Foden, J. A., Sander, J. D., and Joung, J. K. (2012) FLASH assembly of TALE-nucleases for high-throughput genome editing. Nat Biotechnol에 기재되어 있다.
도 10에 나타내어진 결과들은 TALE-뉴클레아제-매개된 단일 TRAC 및 dCK KO가 심지어 D1에서도 매우 효율적이라는 것을 보여준다. 이중 KO 세포들가 동종(homogeneous) 군집으로 특징화되지 않더라도, TRAC/dCK 이중 KO가 또한 매우 효율적인 것으로 나타난다.
그 다음에 세포들은 1 μM 클로파라빈의 존재 또는 부존재 하 성장되었다. D6 (형질감염(transfection) 후 6일)에서 및 클로파라빈의 존재 또는 부존재 하 배양 3일 후, 세포들이 수집되었고 dCK KO 효율이 엔도 T7 분석 및 고속대량(high throughput) DNA 시퀀싱에 의하여 결정되었다.
딥(deep) 시퀀싱에 사용된 프로토콜은 Shendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology, 26(10), 1135-1145에 기재되어 있다.
도 11에 나타낸 결과들은 dCK 자리에서 만들어진 삽입-결실들(indels)의 빈도가 모든 실험들에서 약 80-90 % 라는 것을 보여준다. 이것은 dCK TALE-뉴클레아제-매개된 불활성화가, 그것이 동시의 TRAC 불활성화와 결합될 때조차도, 매우 효율적이라는 것을 다시 한 번 가리킨다. 5 일 동안 배양 배지 내 1 μM 클로파라빈의 존재는 실험들의 첫 번째 세트에서 보여진 대로, dCK KO-특이적 T7 밴드를 증가시키지 않는다. 이것은 이 특정 실험에서, dCK 불활성화가 조작된 T 세포들을 클로파라빈(clofarabine)의 존재 하 성장하는 것이 가능하게 할 정도로 충분히 성공적이라는 것을 제안한다. 흥미롭게도, 이것은 만약 dCK KO이 충분히 효율적이라면, 약물 저항성 T 세포들을 얻기 위하여 클로파라빈(clofarabine)의 존재 하 T 세포들을 선택할 필요가 없다는 것을 가리킨다. 그러므로 이 특징은 약물 저항성 동종이형(allogeneic) T 세포들을 생산하는 명확한 이점을 나타낸다.
TCAR KO 효율의 표현형(phenotypic) 평가
이중 KO 실험을 위하여 수집된 TRAC KO T 세포들이 분석되고 FACS (CliniMACS)에 의하여 정제되었다. 도 12A에 나타내어진 결과들은 항 TCR mAb-PE으로 또는 그것 없이 T 세포들의 표지 실험을 보여준다. 도 12B는 또한 TRAC KO T 세포들 정제(purification) 전 및 후, 클로파라빈(clofarabine)으로, 또는 그것 없이 배지에서의 T-세포의 mAb-PE 표지(labeling)에 대한 것이다.
결과들은, TRAC 및 dCK mRNA로 처리된 T 세포들에서, TCR KO의 효율이 높다(약 85%)는 것을 보여준다 (dCK/TRAC 이중 넉아웃). 정제 방법은 TCR 음성(negative) 세포들의 효율적인 선택/정제를 위하여 99.3 %의 순도(purity)까지 가능하게 한다.
TRAC/dCK KO T 세포들의 표현형(phenotypic) 특징화
클로파라빈의 부존재 하 T-세포들의 성장 속도(rate)가 도 13에 보여진다. KO dCK T가 약간의 성장 결함(defect)을 보임에도 불구하고, 이것들은 WT T 세포들보다 동일한 효율로 D10에서 재활성화될 수 있었다.
클로파라빈의 존재 하 T-세포들의 성장 속도는 도 14에 보여진다. 이 실험은 다른 클로파라빈(0.1μM 부터 10μM까지)을 갖는 배지에서 11일 동안 이들 세포들을 배양함으로써, 이중 KO dCK/TCAR T CAR T-세포들 (PCT/EP2014/059662의 출원 번호를 갖는 특허출원에 기재된 FMC63) 상에서 수행되었다. 도 14에 나타내어진 결과들은 약물 없는 이들 세포들의 그것보다 덜 마크(marked)되었음에도 불구하고, 이중 KO dCK/TCAR CAR T-세포들을 위한 세포 확장이 1μM 클로파라빈(clofarabine)까지 수집되었다(Cmax에 대응함)는 것을 명백히 보여준다.
WT T-세포들 대(versus) 조작된 T 세포들 상 클로파라빈에 대한 IC50의 결정
클로파라빈을 다루는 이중(double) KO T 세포들의 능력을 더 조사하기 위하여, 이 약물에 대한 IC50이 결정되었다. T 세포들은 D3 및 D8 사이에서 클로파라빈과 또는 그것 없이 성장되었고(도 9의 작업흐름 2 참조), 그 다음에 다른 농도들의 클로파라빈을 갖는 배지들에서 그것들은 2일 동안 배양되었다 (D15 부터 D17까지). 그 다음에 T 세포들 생존능이 카운트(count) 브라이트(bright) 키트(kit)를 이용하여 FACS 분석에 의하여 평가되었다.
도 15에 나타내어진 결과들은 dCK 및 dCK/TRAC KO T 세포들이 음성 대조군 T 세포들 및 TRAC 단순(simple) KO T 세포들에 비교하여 클로파라빈에 저항하는 중요한 능력을 보인다는 것을 보여준다. D3 및 D8 사이의 5 일 동안 1 μM 클로파라빈(clofarabine)을 이용한, 주목할만한, 세포들 선택은(도 9의 작업흐름 2 참조) 클로파라빈에 저항하는 그것들의 능력을 개선하지 않는다. 이는 dCK 불활성화가 충분히 효율적이며, 약물 선택을 위한 5일 배양이 클로파라빈(clofarabine) 저항성 동종이형(allogeneic) CAR T 세포들을 수득하는데 필요하지 않다는 것을 제안한다.
약물 저항성 동종이형(allogeneic) CAR T 세포들의 세포독성
세포독성 분석은 하기와 같이 수행되었다: 10 CAR T 세포들 (FMC63, 참고문헌 상기 참조)가 5 시간 동안 다우디(DAUDI) 세포들 (특이적 타겟들) 및 K562 세포들 (비특이적 타겟들)과 배양되었다. 세포들은 그 다음에 수집되었고 다우디(DAUDI) 및 K562 세포들의 생존능이 타겟인 세포 용균(lysis)의 빈도를 계산함으로써 결정되었다.
도 16에 나타내어진 결과들은 dCK/TRAC 이중(double) KO CAR T 세포들이 WT CAR T 세포들보다 유사한 타겟인 세포독성을 보인다는 것을 보여준다(타겟된 세포독성의 35 %). 이것은 dCK 및 TRAC 유전자들의 불활성화가 CAR FMC63 T 세포들의 세포독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 가리켰다.
그 다음에 이들 세포들은 전에 수행된 바와 같이 클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)에 대한 그것들의 민감성을 결정하는데 사용되었다. 도 17에 나타내어진 결과들은 dCK/TRAC KO CAR T 세포들이 CAR T 세포들 음성 대조군에 비교하여 클로파라빈에 저항하는 중요한 능력을 갖는다는 것을 보여준다(각각 IC50=500 nM 및 0.1 nM). 유사한 결과들이 플루다라빈으로도 얻어졌다 (이중 KO CAR T 세포들 및 T CAR 각각에 대하여 IC50=400 μM 및 10 μM).
결과들
완전히, 이들 예들은 dCK 및 TRAC 유전자들의 동시의 불활성화가 매우 효율적이며, 단 한 차례(round) 전기천공으로 이중 KO T 세포들을 70 % 보다 많이 만들어내는 것을 가능하게 한다는 것을 보여준다. 흥미롭게도, 이 높은 효율 때문에, 시간을 소비하는 선택 단계는 필요가 없다. 조작된 T 세포들은 클로파라빈에 저항하는 뚜렷한 능력을 보이며, 임상적으로 적절한 클로파라빈(clofarabine) 투여량(dose)의 압력 하, 그것의 최대의 생존능으로 남아있었다.
예 3- 클로파라빈 -저항성 Daudi 세포들의 제조
목표는 클로파라빈(clofarabine) 저항성 동종이형(allogeneic) CAR T 세포들의 세포독성을 평가하기 위하여 약물 저항성 CD19+/Luc+ 다우디(Daudi) 타겟 세포들을 준비하는 것이다.
dCK KO Daudi 세포들의 유전자형 특징화
dCK TALE-뉴클레아제 mRNA가 준비되었고 다우디(Daudi) 세포들이 WO2013/176915에 기재된 프로토콜에 따라 dCK TALE-뉴클레아제 mRNA에 의하여 전기천공되었다.
엔도 T7 분석이 예 1과 같이 dCK KO 효율을 평가하기 위하여 수행되어 왔다. 분석이 형질감염(transfection) 후 2일에 수행되었다. 프라이머들은 서열번호 68 및 번호(N°) 69를 갖는다.
도 18에 나타내어진 결과들은 dCK 유전자의 높은 불활성화를 보여준다.
dCK KO Daudi 세포들의 표현형 특성화
Daudi 세포들이 다른 농도들의 클로파라빈을 갖는 배지들에서 며칠 간 배양되었고(0; 0.1; 0.25; 0.5 및 1 μM), 각 길(passage)에서 숫자를 세었다.
도 19에 나타내어진 결과들은 dCK KO 다우디(Daudi) 세포들이 1 μM 클로파라빈까지의 존재 하 성장할 수 있었다는 것을 보여준다. 그것들의 성장 속도는 클로파라빈의 부존재 하 성장된 WT T 세포들의 그것과 유사하였는데, 이는 dCK 불활성화가 성장하는 다우디(Daudi)의 능력을 손상시키지 않는다는 것을 제안한다. 예상대로, WT 다우디(Daudi) 세포들 성장은 명백히 손상되었다. 이 결과들은 dCK KO-CD19+-Luc+-GFP+ 세포들이 성공적으로 제조되었다는 것을 입증한다.
예 4. 6TG 저항성 T 세포들의 제조 및 특징화
6MP 및 6TG 저항성 T 세포들 (HPRT KO T 세포들)을 개발하기 위하여, HPRT 유전자가 하기와 같이 TALE-뉴클레아제-매개 불활성화되었다. 전체의 HPRT 유전자 건설(architecture) (엑손들 및 인트론들) 및 다른 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들(sites)의 위치는 도 20에 보여진다.
HPRT 유전자의 TALE-뉴클레아제- 매개된 불활성화
HPRT 단일 KO T 세포들을 만들고 특징화하기 위한 이 실험에서 사용한 작업흐름이 도 21에 기록되어 있다. HPRT 유전자를 불활성화시키기 위하여, 2 쌍의 HPRT TALE-뉴클레아제들이 설계되었고, 조립되었고, 시퀀싱에 의하여 입증되었다 (HPRT 1을 위하여: 서열번호 74 및 서열번호 75; HPRT2을 위하여: 서열번호 77 및 서열번호 78). HPRT 유전자 전체 건축에 대한 상세한 내용들(엑손들 및 인트론들) 및 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들에 대한 위치는 도 20에 나타내어진다. HPRT1 및 HPRT2 TALE-뉴클레아제들 쌍들을 위한 타겟 서열들은 각각 서열번호 76 및 서열번호 79에 대응한다.
HPRT KO T 세포들의 유전자형 특징화
HPRT KO T 세포들은 T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 보여주는 엔도 T7 분석에 의하여 D4에서 유전자형으로 특징화되었다. 이 분석에서 사용된 프라이머들 쌍은 서열번호 72 및 서열번호 73을 갖는다. 도 22에 나타내어진 결과들은 HPRT TALE-뉴클레아제들의 쌍이 HPRT 유전자를 매우 효율적으로 가공(process)할 수 있었다는 것을 보여준다.
HPRT KO T 세포들의 성장 속도
도 23에 나타내어진 결과들에 따르면, TALE-뉴클레아제 HPRT2 쌍에 대하여 다소 더 낮음에도 불구하고 (TALE-뉴클레아제의 10 μg 으로 수행됨) KO HPRT 세포들은 WT T 세포들에 유사한 성장 속도를 보인다. 그렇기는 하지만, 10 μg 의 TALE-뉴클레아제 HPRT2 쌍에 의하여 불활성화된 T 세포들은 WT T 세포들보다 동일한 효율을 갖고 D10에서 재활성화되었는데, 이는 HPRT 불활성화가 T 세포들 성장을 중요하게 손상시키지 않는다는 것을 가리킨다. TALE-뉴클레아제 HPRT1 쌍은 하기 실험들에서 선택되었다.
6TG의 존재 하 HPRT KO T 세포들의 선택
HPRT KO 또는 WT T 세포들이 D8 부터 D13까지 성장하도록 허용되었고, 그다음에 D18까지 1μM 6TG의 존재 또는 부존재 하 배양되었다 (도 22에 보이는 작업흐름). 세포들은 D8 (약물 첨가 전) 및, D18 (약물 배양 후)에서 수집되었고, 엔도 T7 분석을 수행하는데 사용되었다. 사용된 프라이머들의 쌍은 서열번호 72 및 서열번호 73의 서열들을 갖는다.도 24에 나타내어진 결과들은 배지들 내 1 μM 6TG의 존재가 (D18에서 6TG의 존재 하 덜 빽빽한(dense) WT 밴드에 의해 보이는 바와 같이) HPRT KO T 세포들의 선택적 강화(enrichment)를 가능하게 한다는 것을 보여준다.
HPRT KO CAR T 세포들의 제조
HPRT 불활성화의 CAR T 세포들의 세포독성 활성에 대한 영향을 조사하기 위하여, (PCT/EP2014/059662의 번호 하 출원된 출원에 기재된 것과 같이) CAR 4G7 렌티바이러스 벡터로 형질도입된(transduced) T 세포들이 TALE-뉴클레아제 HPRT1를 코드하는 mRNA로 전기천공되었다. 하기에 기재된 모든 실험들은 임의의 6TG 선택 없이 만들어진 조작된 T 세포들로 수행되었다. HPRT 가공(processing)의 효율은 엔도 T7 분석에 의하여 평가되었다. 이 분석에 사용된 프라이머들의 쌍은 서열번호 72 및 서열번호 73에 대응된다. 도 25에 나타내어진 결과들은 HPRT 유전자가 CAR 4G7의 존재 또는 부존재 하 성공적으로 불활성화되었다는 것을 보여준다. HPRT의 더 나은 불활성화는 CAR T 세포들보다 T 세포들에서 수득된다.
HPRT KO CAR-T 세포들의 Daudi 세포들에 대한 세포독성 특성들
세포독성 분석은 도 27에 개략적으로 제시되는 대로 수행되었다. 10 CAR T 세포들의 세트가 5 시간 동안 다우디(Daudi) 세포들 (특이적 타겟들) 및 K562 세포들 (비특이적 타겟들)과 배양된다. 세포들은 그 다음에 수집되고, 다우디(Daudi) 및 K562 세포들의 생존능은 타겟인 세포 용균(lysis)의 빈도를 계산하기 위하여 결정되었다. 도 26에 나타내어진 결과들은 HPRT KO CAR T 세포들이 WT CAR T 세포들의 그것과 유사한 타겟된 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다. 이것은 HPRT 유전자의 불활성화가 CAR 4G7 T 세포들의 세포독성에 영향을 미치지 않는다는 것을 가리킨다.
WT T 세포들 대(versus) 조작된 T 세포들 상 6TG에 대한 IC50의 결정
도 27에 나타내어진 결과들은 (T7 분석에 의하여 먼저 보여진 바와 같이) HPRT 유전자의 가공(processing)이 T 세포들에서 HPRT 활성을 효율적으로 불활성화시킨다는 것을 보여준다. 이러한 불활성화는 6TG 저항성을 부여하는데, 이는 이 약물에 대하여 WT T 세포들의 민감성과 뚜렷한 차이를 보인다. IC50은 WT 및 HPRT KO T 세포들 각각에 대하여 10 nM 및 >100 μM으로 대략적으로 결정될 수 있다.
결론
완전히, 이들 결과들은 HPRT 유전자의 불활성화가 효율적이라는 것을 보여준다. 이러한 불활성화는 T 세포들을 시간을 소모하는 공정에 의하여 정제될 필요 없이, 높은 투여량(dose)의 6TG 에 저항할 수 있게 한다. HPRT 불활성화가 약간 더 낮은 정도로 CAR T 세포에서 수행될 수 있다는 것 또한 보여진다. 이러한 불활성화는 다우디(Daudi) 세포들에 대한 CAR T 세포들의 세포독성 특성들을 손상시키지 않는다.
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cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 75 <211> 2814 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN HPRT 1 RIGHT <400> 75 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120 aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180 acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240 aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300 ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360 agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420 gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 840 ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900 caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 960 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020 agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc 1080 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200 ccggagcagg tggtggccat cgccagccac gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc 1260 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320 atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380 ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1440 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1680 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 1740 aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920 caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040 agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100 ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160 cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220 aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280 gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340 aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400 aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460 gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga gtggtggaag 2580 gtgtacccct ccagcgtgac cgagttcaag ttcctgttcg tgtccggcca cttcaagggc 2640 aactacaagg cccagctgac caggctgaac cacatcacca actgcaacgg cgccgtgctg 2700 tccgtggagg agctcctgat cggcggcgag atgatcaagg ccggcaccct gaccctggag 2760 gaggtgagga ggaagttcaa caacggcgag atcaacttcg cggccgactg ataa 2814 <210> 76 <211> 49 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(49) <223> Target HPRT 1 <400> 76 tgaccttgat ttattttgca tacctaatca ttatgctgag gatttggaa 49 <210> 77 <211> 3201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN HPRT 2 LEFT <400> 77 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgaccc cattcgttcg cgcacaccaa gtcctgcccg cgagcttctg 120 cccggacccc aacccgatgg ggttcagccg actgcagatc gtggggtgtc tccgcctgcc 180 ggcggccccc tggatggctt gccggctcgg cggacgatgt cccggacccg gctgccatct 240 ccccctgccc cctcacctgc gttctcggcg ggcagcttca gtgacctgtt acgtcagttc 300 gatccgtcac tttttaatac atcgcttttt gattcattgc ctcccttcgg cgctcaccat 360 acagaggctg ccacaggcga gtgggatgag gtgcaatcgg gtctgcgggc agccgacgcc 420 cccccaccca ccatgcgcgt ggctgtcact gccgcgcggc ccccgcgcgc caagccggcg 480 ccgcgacgac gtgctgcgca accctccgac gcttcgccgg cggcgcaggt ggatctacgc 540 acgctcggct acagccagca gcaacaggag aagatcaaac cgaaggttcg ttcgacagtg 600 gcgcagcacc acgaggcact ggtcggccac gggtttacac acgcgcacat cgttgcgtta 660 agccaacacc cggcagcgtt agggaccgtc gctgtcaagt atcaggacat gatcgcagcg 720 ttgccagagg cgacacacga agcgatcgtt ggcgtcggca aacagtggtc cggcgcacgc 780 gctctggagg ccttgctcac ggtggcggga gagttgagag gtccaccgtt acagttggac 840 acaggccaac ttctcaagat tgcaaaacgt ggcggcgtga ccgcagtgga ggcagtgcat 900 gcatggcgca atgcactgac gggtgccccg ctcaacttga ccccccagca ggtggtggcc 960 atcgccagca ataatggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1020 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 1080 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1140 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 1200 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1260 gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1320 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1380 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1440 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 1500 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1560 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1620 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1680 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1740 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag 1800 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1860 ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1920 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1980 atcgccagca atattggtgg caagcaggcg ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg 2040 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag caatattggt 2100 ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 2160 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 2220 acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 2280 gtggccatcg ccagcaataa tggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 2340 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 2400 aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 2460 cacggcttga cccctcagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggcgg caggccggcg 2520 ctggagagca ttgttgccca gttatctcgc cctgatccga gtggcagcgg aagtggcggg 2580 gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg 2640 aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac 2700 agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc 2760 tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc 2820 tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg 2880 cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag 2940 cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc 3000 ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac 3060 atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg 3120 atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc 3180 aacttcgcgg ccgactgata a 3201 <210> 78 <211> 3201 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TALEN HPRT 2 RIGHT <400> 78 atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgaccc cattcgttcg cgcacaccaa gtcctgcccg cgagcttctg 120 cccggacccc aacccgatgg ggttcagccg actgcagatc gtggggtgtc tccgcctgcc 180 ggcggccccc tggatggctt gccggctcgg cggacgatgt cccggacccg gctgccatct 240 ccccctgccc cctcacctgc gttctcggcg ggcagcttca gtgacctgtt acgtcagttc 300 gatccgtcac tttttaatac atcgcttttt gattcattgc ctcccttcgg cgctcaccat 360 acagaggctg ccacaggcga gtgggatgag gtgcaatcgg gtctgcgggc agccgacgcc 420 cccccaccca ccatgcgcgt ggctgtcact gccgcgcggc ccccgcgcgc caagccggcg 480 ccgcgacgac gtgctgcgca accctccgac gcttcgccgg cggcgcaggt ggatctacgc 540 acgctcggct acagccagca gcaacaggag aagatcaaac cgaaggttcg ttcgacagtg 600 gcgcagcacc acgaggcact ggtcggccac gggtttacac acgcgcacat cgttgcgtta 660 agccaacacc cggcagcgtt agggaccgtc gctgtcaagt atcaggacat gatcgcagcg 720 ttgccagagg cgacacacga agcgatcgtt ggcgtcggca aacagtggtc cggcgcacgc 780 gctctggagg ccttgctcac ggtggcggga gagttgagag gtccaccgtt acagttggac 840 acaggccaac ttctcaagat tgcaaaacgt ggcggcgtga ccgcagtgga ggcagtgcat 900 gcatggcgca atgcactgac gggtgccccg ctcaacttga ccccggagca ggtggtggcc 960 atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1020 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 1080 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1140 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agcaatattg gtggcaagca ggcgctggag 1200 acggtgcagg cgctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg 1260 gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 1320 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat 1380 attggtggca agcaggcgct ggagacggtg caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1440 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagca atattggtgg caagcaggcg 1500 ctggagacgg tgcaggcgct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1560 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1620 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1680 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1740 caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1800 caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1860 ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat aatggtggca agcaggcgct ggagacggtc 1920 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc 1980 atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 2040 ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc 2100 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 2160 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 2220 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 2280 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 2340 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 2400 ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 2460 cacggcttga cccctcagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggcgg caggccggcg 2520 ctggagagca ttgttgccca gttatctcgc cctgatccga 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Claims (32)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 퓨린 유사체 약물에 저항성인 엑스(ex)-비보(vivo) 면역 세포들을 생산하는 방법:
    (a) 면역 세포를 제공하는 단계;
    (b) 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제 활성을 갖는 효소를 발현시키는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 희귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산 서열로 상기 면역 세포를 형질감여(transfect)시키는 단계 (dcK-EC 2.7.1.74);
    (c) 상기 엔도뉴클레아제를 상기 면역 세포들 내로 발현시켜 상기 dcK 유전자의 타겟된 불활성화를 얻는 단계;
    d) 단계 c)에서 얻어진 조작된 면역 세포들을 선택적으로 상기 퓨린 유사체 약물의 존재 하 확장시키는 단계.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 면역 세포들은 T-세포들인 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 면역 세포들은 CD8+ 세포들인 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포들은 TIL (종양(Tumor) 침윤(Infiltrating) 세포들(Cells))인 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포들은 암으로 진단된 환자로부터 비롯되는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    추가의 단계 e)로 상기 환자 내로 상기 면역 세포들이 주입(inject)되는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나에 있어서,
    상기 면역 세포들은 기증자로부터 비롯되는 방법.
  8. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역 세포들은 TCR알파 또는 TCR베타를 코드하는 그것들의 유전자에서 더 불활성화시켜, 그것들을 동종이형으로 만드는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제인 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    TALE-뉴클레아제들 dCK 유전자 불활성화는 서열번호 63 또는 서열번호 64의 TALE-뉴클레아제들을 이용함으로써 수행되고, dCK 타겟 서열은 서열번호 62인 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 e)에서 상기 조작된 세포들은 인(in)-비보(vivo)에서 확장되는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 세포들은 인-비트로(vitro)에서 확장되는 방법.
  13. 제 2항에 있어서,
    키메라 항원 수용체를 T-세포에서 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체는 CD19+ 또는 CD123+인 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역-체크포인트 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 퓨린 유사체 약물은 클로파라빈(clofarabine) 또는 플루다라빈(fludarabine)인 방법.
  17. 퓨린 유사체 약물에 저항성인, 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 수득가능한 분리된 면역 세포.
  18. T-세포 수용체 구성요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 방해된(disrupted) 유전자를 포함하는, 퓨린 유사체에 저항성인 분리된 T-세포.
  19. 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)가 부여되는, 퓨린 유사체에 저항성인 분리된 T-세포.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 CAR는 CD19+ 세포들 또는 CD123+ 세포들을 타겟으로 하는 분리된 T-세포.
  21. 제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
    의약으로서 그것의 사용을 위한 분리된 T-세포.
  22. 제 20항에 있어서,
    퓨린 유사체 약물의 사용과 결합인, 분리된 T-세포.
  23. 제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 치료로서 그것의 사용을 위한, 분리된 T-세포.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 암은 급성(acute) 림프모세포성(lymphoblasic) 백혈병(leukemia) (ALL) 또는 근위축(amyotrophic) 골수종(myeloma) 백혈병(leukemia)인 분리된 T-세포.
  25. 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 하기를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법:
    (a) 제 17항 내지 제 24항 중 어느 하나의 방법에 따른 T-세포들의 군집을 준비하는 단계;
    (b) 상기 환자에게 상기 형질전환된 T-세포들을 투여하는 단계.
  27. 제 26항에 있어서,
    퓨린 유사체 약물의 투여와 결합하는 단계를 더 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  28. 하기를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 상기 분리된 CAR T 세포 및 적어도 특정 표면 항원 (및 선택적으로 루시페라제와 같은 마커 유전자)를 발현시키는 타겟 세포들 둘 다, 약물 저항성 타겟 세포들 상에 제 13항 또는 제 14항에 따른 분리된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포들의 세포독성을 시험하는 방법;
    (a) 타겟 세포들 및 T-세포들의 상기 군집 둘다를 준비하는 단계;
    (b) 적어도 상기 특이적 타겟 세포들로 상기 T-세포들 군집을 배양하는 단계;
    (c) 상기 특이적 타겟 세포들의 생존능 비율(rate)을 결정하는 단계.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 저항성 유전자는 dCK인 방법.
  30. 제 28항 또는 제 29항에 있어서,
    상기 표면 항원은 CD19인 방법.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 타겟은 CD19+ 푸시페라제(Luciferase)+ 다우디(Daudi) 세포들인 방법.
  32. 하기를 포함하는, 타겟 세포에 대한 CAR T 세포의 세포독성 시험 방법을 수행하기 위한 키트:
    (a) 항원에 대한 CAR 특이적이 부여된 상기 T 세포 군집;
    (b) 상기 항원을 발현시키는 상기 타겟 세포들;
    (c) 선택적으로 배양 배지;
    본 발명에 따른 화학요법 약물들에 저항성으로 만들어진 T 세포들 및 타겟 세포들 둘다.
KR1020167016611A 2013-11-22 2014-11-21 면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 ｔ―세포들의 조작 방법 KR102348577B1 (ko)

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