CN113543848A - 具有杀伤开关的供体t细胞 - Google Patents

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Abstract

所公开的方法一般涉及预防、治疗、抑制、控制或减轻T细胞疗法的副作用，所述T细胞疗法设计为加速免疫重建，诱导移植物抗恶性肿瘤效应，和/或靶向肿瘤细胞。在一些实施方案中，本公开提供表达载体，所述表达载体包括可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤‑鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的shRNA。

Description

具有杀伤开关的供体T细胞
相关申请的交叉引用
本公开要求于2018年12月23日提交的美国临时申请号62/784,494的申请日的权益，其公开内容整体援引加入本文。
技术领域
本公开一般涉及基因治疗，特别是造血干细胞和/或淋巴细胞，如用表达载体转导的T细胞。本公开还涉及基因编辑，如通过CRISPR-Cas系统。
背景技术
同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)是血液系统恶性肿瘤和血细胞遗传性疾病病症如镰状细胞病的治愈性疗法。与allo-HSCT相关的挑战包括鉴定合适的供体细胞来源。虽然匹配相关供体(matched-related donor)(MRD)和匹配无关供体(matched-unrelateddonor)(MUD)提供相关风险较低的HSC来源，但是与几乎每个人都有直接供体(通常是父母或同胞)的单倍相同(haplo-identical)的供体的可用性相比，这些供体的可用性显著降低。然而，使用单倍相同供体用于allo-HSCT有并发症，其中最重要的是发生移植物抗宿主病(GvHD)的可能性，这仍然是成功的allo-HSCT的障碍。据信接受allo-HSCT的患者中约有一半发生需要治疗的GvHD，并且超过10％的患者可能因此死亡。GvHD表现出涉及多个器官系统的异质症状，包括胃肠道、皮肤、粘膜、肝和肺。免疫抑制药物已用作预防和减少GvHD的核心策略。目前，用皮质类固醇对GvHD的标准治疗取得的成功非常有限，因为许多患者发展为类固醇难治性疾病。对于治疗急性和慢性GvHD的最佳二线和三线方法，目前还没有明确的共识(参见Jamil,M.O.&Mineishi,S.Int J Hematol(2015)101:452)。
为了降低GvHD发展的风险，单倍相同的移植物通常是T细胞去除的。但是，供体T细胞的缺乏使移植受者免疫受损，并且可以导致移植患者的致命感染率增加。此外，最近的工作已显示供体T细胞的存在显著改善供体细胞植入，从而减少对重复HSCT的潜在需求，此外在CD4+和CD8+T细胞植入所需的较长时间内提供T细胞免疫(长达2年)。
在allo-HSCT恶性环境中，供体T细胞的存在提供的益处包括抗肿瘤活性或移植物抗肿瘤(GVT)效应(也称作移植物抗白血病–GVL)。供体淋巴细胞输注(DLI)导致HSCT后复发后疾病缓解的第一次报告是1990年患有慢性髓性白血病(CML)的一名患者。在DLI之前，HSCT后复发的患者可能会死于他们的疾病，并且很少有患者会接受第二次移植。在CML中成功之后，DLI随后用于其他血液系统恶性肿瘤如急性白血病和骨髓瘤。因此，一个重大挑战涉及GVT效应的适当平衡，这是实现持续缓解的原因，但也是与GvHD相关的毒性的原因。
发明内容
修饰人类干细胞的基因治疗策略对于治愈许多人类疾病有广阔前景。据信直到开发出使GvHD最小化同时保持供体T细胞的积极贡献的方法之后，才会实现allo-HSCT的全部治疗潜力。
本公开的第一方面是一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的核酸序列。
在一些实施方案中，所述第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。在一些实施方案中，所述Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子或EF1a启动子。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列。
本公开的第二方面是一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ IDNO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％序列相同性。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA具有SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的核酸序列。
在一些实施方案中，所述第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。在一些实施方案中，所述Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子或EF1a启动子。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述7sk启动子包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述突变的7sk启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列。
本公开的第三方面是一种用表达载体转导的宿主细胞，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。在一些实施方案中，使得所述宿主细胞在用所述表达载体转导之后基本上是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，所述宿主细胞是淋巴细胞，例如T细胞。
本公开的第四方面是一种包含宿主细胞的药物组合物，其中所述宿主细胞与药学上可接受的载剂或赋形剂一起配制，所述宿主细胞已用表达载体转导，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。在一些实施方案中，使得所述宿主细胞在用所述表达载体转导之后基本上是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，所述宿主细胞是淋巴细胞，例如T细胞。
本公开的第五方面是一种产生基本上HPRT缺陷的细胞的方法，其包括：用表达载体转导宿主细胞群，并且通过使转导的宿主细胞群与至少一种嘌呤类似物接触来对HPRT缺陷的细胞进行正选择。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物选自6-硫鸟嘌呤(6TG)和6-巯嘌呤。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
本公开的第六方面是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体正选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；在给药HSC移植物之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ IDNO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自甲氨蝶呤(MTX)或麦考酚酸(MPA)。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。
在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次推注(bolus)给药。在一些实施方案中，向患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。在一些实施方案中，每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
本公开的第七方面是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体正选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；以及在给药HSC移植物的同时或之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者给药一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次团注给药。在一些实施方案中，向患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。在一些实施方案中，每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
本公开的第八方面是一种治疗需要治疗的患者的血液癌症的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体正选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；通过向所述患者给药HSC移植物来诱导至少一部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者给药至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂以抑制GvHD或CRS的至少一种症状。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次团注给药。在一些实施方案中，向患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。在一些实施方案中，每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
本公开的第九方面是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体正选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；在给药HSC移植物之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药MTX。
在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％相同性的向导RNA，以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQID NO:25-39中的任一个具有至少95％相同性的向导RNA，以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，所述递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者给药一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次团注给药。在一些实施方案中，向患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。在一些实施方案中，每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
本公开的第十方面是一种治疗需要治疗的患者的血液癌症的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体正选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；通过向所述患者给药HSC移植物来诱导至少一部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。
在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％相同性的向导RNA，以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少95％相同性的向导RNA，以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，所述递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者给药至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂以抑制GvHD或CRS的至少一种症状。在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。在一些实施方案中，所述正选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次团注给药。在一些实施方案中，向患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。在一些实施方案中，每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
本公开的第十一方面是一种用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺陷的淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；(c)将转导的分离的淋巴细胞暴露于正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品；(d)在造血干细胞移植之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞制品；以及(e)任选地，在所述患者发展移植物抗宿主病(GvHD)之后，给药甲氨蝶呤或麦考酚酸。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ IDNO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。
本公开的第十二方面是一种用HPRT缺陷的淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物接触以提供HPRT缺陷的淋巴细胞群；(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品；(d)在造血干细胞移植之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞制品；以及(e)任选地，在所述患者发展移植物抗宿主病(GvHD)之后，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。
在一些实施方案，所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，6TG的量为约1至约15μg/mL。
在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的向导RNA。在一些实施方案中，适合敲除HPRT的组分进一步包含Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，所述递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
本公开的第十三方面是修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；以及(c)将转导的分离的淋巴细胞暴露于正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2和5–11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
本公开的第十四方面是修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物接触以提供HPRT缺陷的淋巴细胞群；以及(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。在一些实施方案中，所述递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含与SEQ ID NO:25 39中的任一个具有至少95％序列相同性的gRNA以及Cas蛋白(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白或Cas12b蛋白)。
本公开的第十五方面是一种药物组合物，其包含(i)慢病毒表达载体，其中所述慢病毒表达载体包括可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性；以及(ii)药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ IDNO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。
本公开的第十六方面是一种试剂盒，其包含(i)与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少97％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA包含SEQ ID NO:25-39中任一个的序列。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是Cas12a。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是Cas12b。
本公开的第十七方面是一种纳米胶囊，其包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少97％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA包含SEQ ID NO:25-39中任一个的序列。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。在一些实施方案中，所述聚合物纳米胶囊不含具有咪唑基团的单体。
本公开的第十八方面是一种宿主细胞，其用纳米胶囊转染，其中所述纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少95％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少97％序列相同性。在一些实施方案中，所述向导RNA包含SEQ ID NO:25-39中任一个的序列。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。在一些实施方案中，所述聚合物纳米胶囊不含具有咪唑基团的单体。
本公开的第十九方面是修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与纳米胶囊接触，所述纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA；和(ii)Cas蛋白；以及(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。在一些实施方案中，所述gRNA包含SEQ ID NO:25-39中任一个的序列。
本公开的第二十方面是一种纳米胶囊，其包含表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。
与其他“关闭开关”方法相比，根据所公开的方法处理的造血干细胞(HSC)(包括T细胞)不需要表达“自杀基因”。相反，所公开的方法提供内源基因的敲低或敲除，其不会在血液细胞中引起不期望的影响，并且总体上产生优异的结果。申请人提出，鉴于根据本文所述方法的基因修饰的细胞的离体6TG化学选择，可以提供HSC(或淋巴细胞)群用于给药至受试者，其允许通过用二氢叶酸还原酶抑制剂(例如甲氨蝶呤(MTX))剂量给药在体内定量消除细胞。此外，根据所公开的方法的治疗提供与未结合“杀伤开关”的疗法相比，供体T细胞的潜在的更高剂量和更积极的疗法。此外，使用二氢叶酸还原酶抑制剂来调节修饰的T细胞的数量在临床上与治疗GvHD的现有方法是相容的，即其中MTX用来帮助减轻未接受所公开的修饰的T细胞的患者中的GvHD症状。
申请人进一步提出，与用单纯疱疹胸苷激酶基因转导的供体淋巴细胞相比，根据所公开的方法的治疗减轻了限制，包括导致细胞消除的免疫原性，并且排除未来输注的可能性(参见Zhou X,Brenner MK,"Improving the safety of T-Cell therapies using aninducible caspase-9gene,"Exp Hematol.2016Nov；44(11):1013-1019，其公开内容整体援引加入本文)。而且，申请人提出，本方法允许将更昔洛韦用于除GvHD以外的并发临床疾病状况，而不会导致不期望的HSV-tk供体淋巴细胞的清除(例如更昔洛韦不会被排除用于控制CMV感染，当使用当前描述的方法时，这在allo-HSCT环境中很常见)。
附图说明
图1说明使T细胞与适合敲低HPRT的表达载体或与包括配置为敲除HPRT的有效载荷(例如Cas蛋白和gRNA)的纳米胶囊接触的一般方法。该图进一步说明可以激活杀伤开关，如在观察到用修饰的T细胞治疗的副作用的情况下。
图2说明sh734(还参见SEQ ID NO:1)的二级结构和理论一级DICER切割位点(箭头)。二级结构具有约-30.9kcal/mol的MFE值。
图3说明sh616(还参见SEQ ID NO:5)的二级RNA结构和最小自由能(dG)。
图4说明sh211(还参见SEQ ID NO:6)的二级RNA结构和最小自由能(dG)。
图5说明sh734(sh734.1)(还参见SEQ ID NO:7)的修改版本。二级结构具有-36.16kcal/mol的MFE值。
图6说明人工miRNA734(111nt)的从头设计。5'和3'DROSHA靶位点以及5'和3'DICER切割位点由二级结构中的箭头指示(还参见SEQ ID NO:8)。
图7说明人工miRNA211(111nt)的从头设计(还参见SEQ ID NO:9)。
图8说明嵌入在miRNA-3G骨架中的sh734，这是源自天然miRNA 16-2结构的第三代miRNA支架(还参见SEQ ID NO:11)。
图9说明嵌入在miRNA-3G骨架中的sh211，这是源自天然miRNA 16-2结构的第三代miRNA支架(还参见SEQ ID NO:10)。
图10说明人7sk启动子突变。说明相对于TATA框(高、细框)，在7sk启动子的顺式远端序列增强子(DSE)和近端序列增强子(PSE)元件(长、宽框)中引入的突变(箭头)和缺失。Boyd,D.C.,Turner,P.C.,Watkins,N.J.,Gerster,T.&Murphy,S.Functional Redundancyof Promoter Elements Ensures Efficient Transcription of the Human 7SK Gene invivo,Journal of Molecular Biology 253,677-690(1995)描述了这些突变和其他突变，其公开内容整体援引加入本文。
图11是说明制备修饰的T细胞和向有需要的患者给药那些修饰的T细胞的步骤的流程图。
图12A和12B描述了用6TG成功离体选择和扩增修饰的细胞(通过LV转导敲低或通过CRISPR/Cas9纳米胶囊敲除HPRT)。这些最初的初步实验是在K562细胞(人永生化髓性白血病细胞系)中进行的(rsh7-GFP＝用于敲低HPRT的HPRT/GFP慢病毒载体的短发夹；nanoRNP-HPRT＝用于敲除HPRT的CRISPR/Cas9核糖核蛋白纳米胶囊)。图12A说明用shHPRT-GFP载体以MOI＝5(感染复数)＝5转导的K562细胞可以用6TG离体选择以在10天内达到超过95％细胞携带shHPRT的状态。图12B说明通过CRISPR RNP纳米胶囊的HPRT敲除细胞在600nM或900nM的6TG下于10天内也可以达到总群体的95％以上。这些数据表明通过6TG化学选择产生高含量的基因修饰的细胞的可行性。
图13A说明用6TG(离体)对CEM细胞正选择的效果。
图13B说明在6TG的处理下，CEM细胞的HPRT敲除群体从第3天增加至第17天。
图14A和14B说明用MTX对K562细胞负选择的效果。
图15A和15B说明用MTX或MPA对CEM细胞负选择的效果。
图16说明用MTX对K562细胞负选择的效果。
图17说明三磷酸脱氧胸苷(dTTP)合成的从头途径。
图18说明在6TG的存在下选择HPRT缺陷的细胞。
图19是说明制备修饰的T细胞和在干细胞移植之后向患者给药那些修饰的T细胞的步骤的流程图，从而患者的免疫系统可以是至少部分重建的。
图20是说明制备修饰的T细胞和在干细胞移植之后向患者给药那些修饰的T细胞的步骤的流程图，从而修饰的T细胞辅助诱导GVM效应。
图21是说明制备修饰的T细胞(HRPT缺陷的CAR-T细胞)和向有需要的患者给药那些修饰的T细胞的步骤的流程图。
图22说明HPRT的相对表达水平，并且进一步说明可以用嘌呤类似物选择HPRT缺陷的细胞的截断值。
图23示出说明检查命中靶标和脱靶效应的各种向导RNA的表。
图24提供描绘HPRT敲除Jurkat细胞中发光对6TG浓度的图。
图25提供HPRT敲除和野生型Jurkat细胞的蛋白印迹，其中肌动蛋白用作蛋白对照。
图26示出绿色荧光蛋白(GFP)对HPRT敲除存活优势的图，其中该图提供活细胞百分比对时间。
图27来自GFP与HPRT敲除细胞的荧光激活细胞分选(FACS)的数据。
图28提供示出确定野生型Jurkat细胞的甲氨蝶呤(MTX)剂量反应的图，其中该图示出活细胞的百分比。
图29提供说明确定HPRT敲除和野生型Jurkat细胞的甲氨蝶呤剂量反应的图，其中该图说明剂量反应对甲氨蝶呤浓度的变化。
图30A提供对应于用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP转导的HPRT敲低Jurkat T细胞的FACS数据。
图30B提供对应于用慢病毒载体TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734转导的HPRT敲低Jurkat T细胞的FACS数据。
图31提供说明用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP或TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734转导的HPRT敲低CEM细胞的6TG选择的图。
图32说明根据本公开的一些实施方案的慢病毒载体内包括的元件。该图进一步说明某些元件相对于其他元件的相对方向。例如，与UbC驱动的GFP相比，7sk驱动的sh734元件可以朝向相同方向或相反方向。此外，该图说明7sk驱动的sh734元件可以位于其他载体元件的上游或下游，例如UbC驱动的GFP的上游或下游。
图33提供用四种载体之一转导之后表达GFP的细胞的百分比。
序列表
利用如37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示所附核酸和氨基酸序列。序列表作为ASCII文本文件提交，命名为“Calimmune-072WO_ST25.txt”，创建于2019年12月19日，26KB，其援引加入本文。
具体实施方式
定义
还应当理解，除非明确指出相反，在本文要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必限于列举所述方法的步骤或动作的顺序。
如本文所用，单数术语“一个(a)”、“一个(an)和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。相似地，词语“或”意图包括“和”，除非上下文另有明确指示。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个元素的列表，短语“至少一个”应当理解为表示选自元素列表中的任何一个或多个元素的至少一个元素，但是不必包括元素列表内具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。这个定义还允许除了短语“至少一个”所指的元素列表内具体标识的元素以外的元素可以任选地存在，无论与那些具体标识的元素相关或不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者相等地，“A或B中的至少一个”，或者相等地，“A和/或B中的至少一个”)在一实施方案中可以指至少一个，任选地包括一个以上，A，不存在B(并且任选地包括除B以外的元素)；在另一实施方案中，指至少一个，任选地包括一个以上，B，不存在A(并且任选地包括除A以外的元素)；在另一实施方案中，指至少一个，任选地包括一个以上，A，以及至少一个，任选地包括一个以上，B(并且任选地包括其他元素)；等等。
如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等可互换使用，并且具有相同含义。相似地，“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等可互换使用，并且具有相同含义。具体地，每个术语解释为开放术语含义“至少以下”，并且还解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的设备”表示所述设备至少包括组件a、b和c。相似地，短语：“包括步骤a、b和c的方法”表示所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，虽然本文中可能以特定顺序列出步骤和过程，但技术人员会认识到排序步骤和过程可以变化。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应答理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或者“和/或”应当解释为包含性的，即，包含若干元素或元素列表中的至少一个，但是还包括一个以上，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语，如“仅其中一个”或“恰好其中一个”，或者，当用于权利要求书时，“由…组成”，是指包括若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般来说，当前面是排他性术语，如“任一”、“其中一个”、“仅其中一个”或“恰好其中一个”，如本文所用的术语“或”应当仅解释为表示排他性可选物(即“一个或另一个但不是两个”)。当在权利要求书中使用时，“基本上由…组成”应当具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文所用，术语“给药(administer)”或“给药(administering)”表示向需要治疗的受试者(例如人类患者)提供组合物、制剂或特定药剂，包括本文描述的那些。
如本文所用，术语“Cas蛋白”是指RNA引导的核酸酶，其包含Cas蛋白或其片段。Cas蛋白也可以称作CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复)相关核酸酶。CRISPR是一种适应性免疫系统，提供针对可移动遗传元件(病毒、转座元件和接合质粒)的保护。CRISPR簇包含间隔区、与先行移动元件互补的序列和靶侵入核酸。CRISPR簇被转录并加工为CRISPR RNA(crRNA)。Cas蛋白包括但不限于Cas9蛋白、Cas9直系同源物编码的Cas9样蛋白、Cas9样合成蛋白、Cpf1蛋白、Cpf1直系同源物编码的蛋白、Cpf1样合成蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白以及它们的变体和修饰。Cas蛋白的其他实例包括但不限于Cpf1、C2c1、C2c3、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b和Cas13c。Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称作Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c3、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b和Cas13c。
在一些实施方案中，Cas蛋白是2类CRISPR相关蛋白。如本文定义的“2类型CRISPR-Cas系统”是指以单一蛋白作为效应复合物(如Cas9)发挥作用的CRISPR-Cas系统。如本文定义的，“2类II型CRISPR-Cas系统”是指在其cas基因中包含Cas9基因的CRISPR-Cas系统。“2类II型-A CRISPR-Cas系统”是指包含cas9和Csn2基因的CRISPR-Cas系统。“2类II型-BCRISPR-Cas系统”是指包含cas9和cas4基因的CRISPR-Cas系统。“2类II型-C CRISPR-Cas系统”是指包含cas9基因但既不包含Csn2也不包含Cas4基因的CRISPR-Cas系统。“2类V型CRISPR-Cas系统”是指在其cas基因中包含cas12基因(Cas12a、12b或12c基因)的CRISPR-Cas系统。“2类VI型CRISPR-Cas系统”是指在其Cas基因中包含Cas13基因(Cas13a、13b或13c基因)的CRISPR-Cas系统。每个野生型Cas蛋白与一个或多个同源多核苷酸(最典型的是RNA)相互作用以形成核蛋白复合物(最典型的是核糖核蛋白复合物)。Haft et.al.,"AGuild of 45 CRISPR-Associated(Cas)Protein Families and Multiple CRISPR/CasSubtypes Exist in Prokaryotic Genomes,PLoS Comput.Biol.,2005,Nov；1(6):e60描述了额外的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白是修饰的Cas蛋白，例如本文鉴定的任何Cas蛋白的修饰的变体。
如本文所用，术语“Cas9”或“Cas9蛋白”是指可以表现出由CRISPR RNA(crRNA)引导的最小内切核酸酶活性(例如切割多核苷酸内的磷酸二酯键)的酶(野生型或重组的)，所述CRISPR RNA携带靶多核苷酸的互补序列。Cas9多肽是本领域已知的，并且包括来自各种生物来源中任一种的Cas9多肽，包括例如原核生物来源，如细菌和古细菌。细菌Cas9包括放线菌(例如，内氏放线菌)Cas9、产水菌(Aquificae)Cas9、拟杆菌Cas 9、衣原体Cas9、绿弯菌Cas9、蓝细菌(Cyanobacteria)Cas9、Elusimicrobia Cas9、纤维杆菌Cas9、厚壁菌Cas9(例如，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9、无害李斯特菌Cas9、无乳链球菌Cas9、变形链球菌Cas9和屎肠球菌Cas9)、梭杆菌Cas9、变形菌(例如，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、空肠弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌)Cas9、螺旋体(例如，齿垢密螺旋体)Cas9等。古细菌Cas 9包括广古菌(Euryarchaeota)Cas9(例如，海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)Cas9)等。各种Cas9和相关多肽是已知的，并且在例如Makarova et al.(2011)Nature ReviewsMicrobiology 9:467-477,Makarova et al.(201 1)Biology Direct 6:38,Haft et al.(2005)PLOS Computational Biology I:e60和Chylinski et al.(2013)RNA Biology10:726-737；K.Makarova et al.,An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.(2015)Nat.Rev.Microbio.13:722-736；以及B.Zetsche et al.Cpf1 is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.(2015)Cell.163(3):759-771中进行了综述。
其他Cas9多肽包括土拉弗朗西斯菌亚种novicida Cas9、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)Cas9、鸡毒支原体(mycoplasma gallisepticum)str.F Cas9、Nitratifractor salsuginis str DSM 16511Cas9、Parvibaculum lavamentivoransCas9、Roseburia intestinalis Cas9、Neisseria cinera Cas9、Gluconacetobacterdiazotrophicus Cas9、固氮螺菌B510 Cas9、Spaerochaeta globus str.Buddy cas9、柱状黄杆菌Cas9、Fluviicola taffensis Cas9、Bacteroides coprophilus Cas9、运动型支原体(mycoplasma mobile)Cas9、香肠乳杆菌Cas9、Streptococcus pasteurianus Cas9、约氏乳酸杆菌Cas9、伪中间型葡萄球菌(Staphlococcus pseudintermedius)Cas9、filifactoralocis Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、嗜肺军团菌str.巴黎Cas9、华德萨特菌Cas9和白喉杆菌(Corynebacter diptheriae)Cas9。术语“Cas9”包括任何Cas9家族的Cas9多肽，包括Cas9的任何同种型。超出本文具体陈述或提供的那些的各种Cas9同系物、直系同源物和变体的氨基酸序列是本领域已知的，并且可公开获得，在本领域技术人员的范围内，因此在本公开的精神和范围内。
如本文所用，术语“Cas12”或“Cas12蛋白”是指任何Cas12蛋白，包括但不限于Cas12蛋白如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e。在一些实施方案中，Cas12蛋白具有与功能性Cas12蛋白的氨基酸序列至少85％(或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列，特别是来自氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)菌株BV3L6的Cas12a/Cpf1蛋白(Uniprot Entry：U2UMQ6；UniprotEntry Name：CS12A_ACISB)或来自土拉弗朗西斯菌的Cas12a/Cpf1蛋白(Uniprot Entry：A0Q7Q2；Uniprot Entry Name：CS12A_FRATN)。在一些实施方案中，Cas12蛋白可以是与自然界中发现的蛋白基本上相同的Cas12多肽，或者与自然界中发现的Cas12蛋白具有至少85％序列相同性(或至少90％序列相同性、或至少95％序列相同性、或至少96％序列相同性、或至少97％序列相同性、或至少98％序列相同性、或至少99％序列相同性)且具有基本上相同的生物活性的Cas12多肽。Cas12a蛋白的实例包括但不限于FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a；Cas12a优选是LbCas12a。Cas12b蛋白的实例包括但不限于AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b、AcCas12b。
如本文所用，短语“有效量”是指本文描述的组合物或制剂的量，其会引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师正在寻求的组织、系统、动物或人的诊断、生物学或医学反应。
如本文所用，术语“表达盒”是指载体内的一个或多个基因序列，其可以表达RNA，并且在一些实施方案中，随后表达蛋白。表达盒包含至少一个启动子和至少一个所关注的基因。在一些实施方案中，表达盒包括至少一个启动子，至少一个所关注的基因，以及至少一个编码用于表达的分子(例如RNAi)的额外核酸序列。在一些实施方案中，表达盒在载体内按位置和顺序定向，从而盒中的核酸可以在转化的细胞(例如转导的干细胞)中转录为RNA，并且在必要时翻译为蛋白或多肽，进行活性所需的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当的细胞内区室或分泌至细胞外区室来移位至生物活性的适当区室。在一些实施方案中，盒的3'和5'末端适合插入载体，例如，其在每个末端具有限制性内切核酸酶位点。
如本文所用，术语“功能性核酸”是指具有通过与编码蛋白的转录物直接相互作用来减少蛋白表达的能力的分子。siRNA分子、核酶和反义核酸构成示例性功能性核酸。
如本文所用，术语“基因”泛指与生物学功能相关的任何DNA片段。基因涵盖序列，包括但不限于编码序列、启动子区、顺式调节序列、调节蛋白的特异性识别序列的非表达的DNA片段、有助于基因表达的非表达的DNA片段、设计为具有期望参数的DNA片段，或者它们的组合。
如本文所用，术语“基因沉默”旨在描述基因、转录物和/或多肽产物的下调、敲低、降解、抑制、压制、阻遏、预防或表达降低。基因沉默和干扰还描述了防止mRNA转录物翻译为多肽。在一些实施方案中，通过降解mRNA转录物或阻断mRNA翻译来防止、抑制或减少翻译。
如本文所用，术语“基因表达”是指从DNA序列产生生物活性多肽的细胞过程。
如本文所用，术语“向导RNA”或“gRNA”是指能够引导具有核酸酶活性的CRISPR效应子靶向并切割特定靶核酸的RNA分子。
如本文所用，术语“造血细胞移植物”或“造血细胞移植”是指骨髓移植、外周血干细胞移植、脐静脉血移植或多能造血干细胞的任何其他来源。同样地，术语“干细胞移植物”或“移植物”是指包含与药学上可接受的载剂接触(例如悬浮于其中)的干细胞的组合物。这类组合物能够通过导管给药至受试者。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指将利用本公开的方法修饰的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是其中表达载体可以表达的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞以及Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开的表达载体的宿主细胞是造血细胞，如造血祖细胞/干细胞(例如CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或树突细胞。用本公开的表达载体转导的造血细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体的或来自匹配的兄弟姐妹。在一些实施方案中，造血祖细胞/干细胞是CD34阳性的，并且可以分离自患者的骨髓或外周血。在一些实施方案中，用如本文描述的表达载体转导分离的CD34阳性造血祖细胞/干细胞(和/或本文描述的其他造血细胞)。
如本文所用，术语“次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶”或“HPRT”是指由HPRT1基因编码的参与嘌呤代谢的酶(参见，例如，SEQ ID NO:12)。HPRT1位于X染色体上，因此在男性中以单拷贝形式存在。HPRT1编码转移酶，其通过将5-磷酸核糖基从5-磷酸核糖基1-焦磷酸转移至嘌呤来催化次黄嘌呤转化为肌苷单磷酸和鸟嘌呤转化为鸟苷单磷酸。该酶的主要功能是从降解的DNA回收嘌呤用于重新合成嘌呤。
如本文所用，术语“插入缺失(indel)”是指以插入和缺失的混合命名的突变。它是指两个等位基因之间的长度差异，其中无法知道该差异最初是由序列插入还是由序列缺失引起的。如果插入/缺失中的核苷酸数量不能被3整除，并且其发生在蛋白编码区，则其还是移码突变(移码突变一般会导致突变之后密码子的阅读编码不同的氨基酸)。
如本文所用，术语“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)，人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；visna-maedi，其引起绵羊的脑炎(visna)或肺炎(maedi)；山羊关节炎-脑炎病毒，其引起山羊的免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，其引起马的自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其引起猫的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其引起牛的淋巴结病、淋巴细胞增多和可能的中枢神经系统感染；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其引起亚人灵长类的免疫缺陷和脑病。
如本文所用，术语“慢病毒载体”用来表示源自慢病毒并用来通过转导将遗传物质转移至细胞中的任何形式的核酸。该术语涵盖慢病毒载体核酸，如DNA和RNA，这些核酸的包裹形式，以及其中已包装病毒载体核酸的病毒颗粒。
如本文所用，当用来指RNAi对基因表达的影响时，术语“敲低(knock down)”或“敲低(knockdown)”表示基因表达水平被抑制，或者降低至低于在基本上相同的条件但不存在RNAi下检查时通常观察到的水平。
如本文所用，术语“敲除(knock-out)”或“敲除(knockout)”是指部分或完全抑制内源基因的表达。这一般是通过缺失一部分基因或通过用第二序列替代一部分来完成的，但是还可以由对基因的其他修饰引起，如引入终止密码子、关键氨基酸的突变、去除内含子连接点(junction)等。因此，“敲除”构建体是核酸序列，如DNA构建体，当引入细胞时，其导致细胞中内源DNA编码的多肽或蛋白的表达的抑制(部分或完全)。在一些实施方案中，“敲除”包括突变如点突变、插入、缺失、移码或错义突变。
如本文所用，术语“感染复数”或“MOI”表示试剂(例如噬菌体或更一般的病毒、细菌)比感染靶标(例如细胞)的比例。例如，当提到用病毒颗粒接种的一组细胞时，感染复数或MOI是限定空间中存在的病毒颗粒数量比靶细胞数量的比例。
如本文所用，术语“小细胞”是指细菌细胞的无核形式，由二分裂期间细胞分裂与DNA分离的协调紊乱产生。小细胞不同于在某些情况下自发产生和释放的其他小囊泡，并且与小细胞相反，不是由于特定遗传重排或游离基因表达。本公开的小细胞是大肠杆菌或其他细菌细胞的无核形式，由二分裂期间细胞分裂与DNA分离的协调紊乱产生。原核染色体复制与正常二分裂有关，其包括中细胞隔膜形成。例如，在大肠杆菌中，min基因如minCD的突变可以消除细胞分裂期间对细胞极处隔膜形成的抑制，导致产生正常的子细胞和无核小细胞。参见de Boer et al.,1992；Raskin&de Boer,1999；Hu&Lutkenhaus,1999；Harry,2001。小细胞不同于在某些情况下自发产生和释放的其他小囊泡，并且与小细胞相反，不是由于特定遗传重排或游离基因表达。为了实施本公开，期望小细胞具有完整的细胞壁(“完整的小细胞”)。除了min操纵子突变，在影响隔膜形成的一系列其他遗传重排或突变之后也产生无核小细胞，例如在枯草芽孢杆菌的divIVB1中。参见Reeve and Cornett,1975；Levin etal.,1992。在参与细胞分裂/染色体分离的蛋白的基因表达水平发生扰动之后也可以形成小细胞。例如，minE的过量表达导致极性分裂和小细胞的产生。相似地，无染色体小细胞可能由染色体分离缺陷所致，例如枯草芽孢杆菌中的smc突变(Britton et al.,1998)、枯草芽孢杆菌中的spoOJ缺失(Ireton et al.,1994)、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga et al.,1989)和大肠杆菌中的parC突变(Stewart and D'Ari,1992)。基因产物可以反式提供。例如，当从高拷贝数质粒过量表达时，CafA可以提高细胞分裂的速度和/或抑制复制后的染色体分配(Okada et al.,1994)，导致链状细胞和无核小细胞的形成(Wachi et al.,1989；Okada et al.,1993)。小细胞可以制备自革兰氏阳性或革兰氏阴性来源的任何细菌细胞。
如本文所用，术语“突变的”是指序列的变化，如核苷酸或氨基酸序列，从各自序列的天然、野生型、标准或参考版本，即非突变的序列发生变化。突变的基因可以导致突变的基因产物。突变的基因产物与非突变的基因产物的不同之处在于一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，导致突变的基因产物的突变的基因可以与相应的非突变的核苷酸序列具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或更大的序列相同性。
如本文所用，术语“纳米胶囊”是指具有壳的纳米颗粒，例如聚合物壳，包裹一种或多种组分，例如一种或多种蛋白和/或一种或多种核酸。在一些实施方案中，纳米胶囊的平均直径为小于或等于约200纳米(nm)，例如约1至200nm，或约5至约200nm，或约10至约150nm，或15至100nm，或约15至约150nm，或约20至约125nm，或约50至约100nm，或约50至约75nm。在其他实施方案中，纳米胶囊的平均直径为约10nm至约20nm，约20至约25nm，约25nm至约30nm，约30nm至约35nm，约35nm至约40nm，约40nm至约45nm，约45nm至约50nm，约50nm至约55nm，约55nm至约60nm，约60nm至约65nm，约70至约75nm，约75nm至约80nm，约80nm至约85nm，约85nm至约90nm，约90nm至约95nm，约95nm至约100nm或约100nm至约110nm。在一些实施方案中，纳米胶囊设计为在约1小时，或约2小时，或约3小时，或约4小时，或约5小时，或约6或约12小时，或约1天，或约2天，或约1周，或约1个月内降解。在一些实施方案中，纳米胶囊的表面可以具有约1至约15毫伏(mV)的电荷(如在标准磷酸盐溶液中测量的)。在其他实施方案中，纳米胶囊的表面可以具有约1至约10mV的电荷。
如本文所用，术语“带正电荷的单体”或“阳离子单体”是指具有净正电荷的单体，即+1、+2、+3。在一些实施方案中，带正电荷的单体是包括带正电荷的基团的单体。如本文所用，术语“带负电荷的单体”或“阴离子单体”是指具有净负电荷的单体，即–1、–2、–3。在一些实施方案中，带负电荷的单体是包括带负电荷的基团的单体。如本文所用，术语“中性单体”是指具有净中性电荷的单体。
如本文所用，术语“聚合物”定义为包括均聚物、共聚物、互穿网络和低聚物。因此，术语聚合物在本文中可与术语均聚物、共聚物、互穿聚合物网络等互换使用。术语“均聚物”定义为衍生自单一种类单体的聚合物。术语“共聚物”定义为衍生自一种以上单体的聚合物，包括通过两种单体种类的共聚反应获得的共聚物，获得自三种单体种类的那些(“三聚物”)，获得自四种单体种类的那些(“四聚物”)等。术语“共聚物”进一步定义为包括无规共聚物、交替共聚物、接枝共聚物和嵌段共聚物。作为通常使用的术语，共聚物包括互穿聚合物网络。术语“无规共聚物”定义为包含大分子的共聚物，其中在链中的任何给定位点找到给定单体单元的概率与相邻单元的性质无关。在无规共聚物中，单体单元的顺序分布遵循Bernoullian统计学。术语“交替共聚物”定义为包含大分子的共聚物，其包括交替顺序的两种单体单元。
如本文所用，术语“交联剂”是指在两个或更多个分子链、结构域或其他部分之间提供连接(例如分子内连接或分子间连接)的键或部分。在一些实施方案中，交联剂是在分子链之间形成连接以形成连接分子的分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子、信号序列、增强子或转录因子结合位点的阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中当适当的分子(例如，转录激活蛋白)结合至表达控制序列时，表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录可操作地连接至启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中可使用的启动子包含位于转录起始位点上游约25-30个碱基处的富含AT的区域和/或在转录开始上游70-80个碱基处发现的另一序列，CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂或赋形剂”是指可用于制备通常是安全、无毒且不是生物学上或其他方面不可取的药物制剂的载剂或赋形剂，并且包括兽医学使用以及人类制药使用可接受的载剂或赋形剂。
如本文所用，术语“逆转录病毒”是指这样的病毒，其具有通过逆转录病毒逆转录酶逆转录为整合入宿主细胞基因组的cDNA拷贝的RNA基因组。逆转录病毒载体和制备逆转录病毒载体的方法是本领域已知的。简单地说，为了构建逆转录病毒载体，将编码所关注的基因的核酸插入病毒基因组代替某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建包含gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann et al.,Cell,Vol.33:153-159,1983)。当将包含cDNA的重组质粒连同逆转录病毒LTR和包装序列引入这个细胞系时，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装为病毒颗粒，然后将其分泌至培养基中。然后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并且用于基因转移。
如本文所用，术语“siRNA”或“小干扰RNA”是指由约十个核苷酸至几十个核苷酸组成的短双链RNA，其诱导RNAi(RNA干扰)，即诱导靶mRNA的降解或通过切割靶mRNA来抑制靶基因的表达。RNA干扰(“RNAi”)是一种基因表达的转录后抑制的方法，在许多真核生物体中是保守的，并且它是指一种现象，其中将由具有与靶基因的mRNA同源序列的正义RNA和具有与其互补序列的反义RNA组成的双链RNA引入细胞等，从而其可以选择性地诱导靶基因的mRNA降解或者可以抑制靶基因的表达。RNAi是由细胞中存在的短(即，少于约30个核苷酸)双链RNA分子诱导的(Fire A.et al.,Nature,391:806-811,1998)。当将siRNA引入细胞时，具有与siRNA互补的核苷酸序列的靶基因的mRNA表达会被抑制。
如本文所用，术语“小发夹RNA”或“shRNA”是指包含反义区、环部分和正义区的RNA分子，其中正义区具有与反义区碱基配对以形成双链茎的互补核苷酸。转录后加工之后，小发夹RNA通过酶介导的切割事件转化为小干扰RNA，所述酶是RNase III家族的成员。如本文所用，短语“转录后加工”是指发生在转录之后并由例如酶和/或Drosha介导的mRNA加工。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物如人、小鼠或灵长类动物。通常，所述哺乳动物是人(智人)。
如本文所用，术语“基本上HPRT缺陷”是指细胞，例如宿主细胞，其中HPRT基因表达水平降低至少约50％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约55％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约60％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约65％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约75％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约85％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约90％。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约95％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约40％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因是最多约35％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约30％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约25％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约20％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约15％。在其他实施方案中，残余的HPRT基因表达是最多约10％。
如本文所用，术语“转导(transduce)”或“转导(transduction)”是指利用病毒或逆转录病毒载体通过感染而不是通过转染来递送基因。例如，可以将逆转录病毒载体(用于将核酸引入细胞的用作表达载体的修饰的逆转录病毒)携带的抗HPRT基因通过感染和原病毒整合转导至细胞中。因此，“转导的基因”是已通过慢病毒或载体感染以及原病毒整合引入细胞的基因。病毒载体(例如，“转导载体”)将基因转导至“靶细胞”或宿主细胞中。
如本文所用，术语“转染”是指通过非病毒方法将裸DNA引入细胞的过程。
如本文所用，术语“转导”是指利用病毒载体将外源DNA引入细胞基因组。
如本文所用，关于特定疾病状况，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗(treat)”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。在完全或部分预防疾病或其症状方面，效果可以是预防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响方面，效果可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者，特别是人的疾病或病症的任何治疗，并且包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断为患有该疾病的受试者中发生疾病或病症；(b)抑制疾病或病症，即，阻止其发展；以及(c)缓解或减轻疾病或病症，即，引起疾病或病症的消退和/或缓解一种或多种疾病或病症症状。“治疗”还可以涵盖药剂的递送或治疗的给药以提供药理效应，甚至在不存在疾病、病症或疾病状况的情况下。在一些实施方案中，术语“治疗”用来指给药本公开的化合物以减轻宿主，优选哺乳动物受试者，更优选人的疾病或病症。因此，术语“治疗”可以包括：预防宿主中发生病症，特别是当宿主易患疾病但尚未诊断患有该疾病时；抑制病症；和/或缓解或逆转病症。就本公开的方法涉及预防病症而言，应当理解术语“预防”不要求完全阻止疾病状态。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员鉴定易患病症的群体的能力，从而本公开的化合物的给药可以在疾病发作之前发生。该术语并不表示必须完全避免疾病状态。
如本文所用，术语“载体”是指能够介导另一核酸分子进入(例如，转移、转运等)细胞的核酸分子。转移的核酸一般连接至(例如，插入)载体核酸分子。载体可以包括指导自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合至宿主细胞DNA中的序列。对本领域普通技术人员来说显而易见的是，除了介导转移的核酸进入的核酸之外，病毒载体可以包括各种病毒组分。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒以及病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)等。
表达载体
在一些实施方案中，本公开提供包括至少一种用于表达的核酸序列的表达载体(例如慢病毒表达载体)。在一些实施方案中，表达载体包括第一核酸序列，其编码设计为敲低HPRT基因或以其他方式实现HPRT基因表达降低的物质。在一些实施方案中，HPRT基因表达降低80％或更多。
在一些实施方案中，本公开提供一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQID NO:2、5、6和7中任一个的核酸序列。在一些实施方案中，敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA是表达载体中唯一用于表达的转基因。
在一些实施方案中，提供一种表达载体，其基本上由可操作地连接至作为用于表达的转基因的第一核酸序列的第一表达控制序列组成，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。具体地，在一些实施方案中，提供一种表达载体，其基本上由作为唯一用于表达的转基因的第一核酸序列组成，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。
在其他方面，提供一种表达载体，其包含可操作地连接至作为转基因的第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性，其中所述第一核酸序列是唯一用于表达的元件。具体地，在一些实施方案中，提供一种表达载体，其包含作为唯一用于表达的转基因的第一核酸序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。
在一些实施方案中，表达载体是自我失活的慢病毒载体。在其他实施方案中，表达载体是逆转录病毒载体。慢病毒基因组一般组织为5'长末端重复(LTR)、gag基因、pol基因、env基因、辅助基因(nef、vif、vpr、vpu)和3'LTR。病毒LTR分为三个区域，称作U3、R和U5。U3区包含增强子和启动子元件。U5区包含多腺苷酸化信号。R(重复序列)区将U3和U5区分开，并且R区的转录序列出现在病毒RNA的5'和3'末端。参见，例如，"RNA Viruses:A PracticalApproach"(Alan J.Cann,Ed.,Oxford University Press,(2000))；O Narayan andClements(1989)J.Gen.Virology,Vol.70:1617-1639；Fields et al.(1990)FundamentalVirology Raven Press.；Miyoshi H,Blamer U,Takahashi M,Gage F H,Verma I M.(1998)J Virol.,Vol.72(10):8150 7和美国专利第6,013,516号。已用来感染HSC的慢病毒载体的实例在以下出版物中进行了描述，每个出版物均整体援引加入本文：Evans et al.,Hum Gene Ther.,Vol.10:1479-1489,1999；Case et al.,Proc Natl Acad Sci USA,Vol.96:2988-2993,1999；Uchida et al.,Proc Natl Acad Sci USA,Vol.95:11939-11944,1998；Miyoshi et al.,Science,Vol.283:682-686,1999；和Sutton et al.,J.Virol.,Vol.72:5781-5788,1998。
在一些实施方案中，表达载体是修饰的慢病毒，因此能够感染分裂和非分裂细胞。在一些实施方案中，修饰的慢病毒基因组缺少病毒复制所需的慢病毒蛋白的基因，因此防止不期望的复制，如在靶细胞中的复制。在一些实施方案中，在产生重组逆转录病毒或慢病毒期间，在包装细胞系中反式提供修饰的基因组复制所需的蛋白。
在一些实施方案中，表达载体包含来自慢病毒的5'和3'长末端重复(LTR)的序列。在一些实施方案中，载体包含来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自我失活的3'LTR。在一些实施方案中，LTR序列是HIV LTR序列。
美国专利申请公开号2018/0112220公开了慢病毒表达载体的额外组分(以及合成和/或产生这类载体的方法)，其公开内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:16具有至少90％相同性的TL20c骨架。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:16具有至少95％相同性的TL20c骨架。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:17具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:17具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含WPRE元件或Rev应答元件中的至少一个(分别参见，例如，SEQ ID NO:18和19)。
在一些实施方案中，本文考虑的慢病毒载体可以是整合的或非整合的(也称作整合缺陷的慢病毒)。如本文所用，术语“整合缺陷的慢病毒”或“IDLV”是指具有整合酶的慢病毒，所述整合酶缺少将病毒基因组整合至宿主细胞基因组中的能力。在一些应用中，使用整合慢病毒载体可以避免整合慢病毒诱导的潜在的插入诱变。整合缺陷的慢病毒载体通常通过突变慢病毒整合酶基因或通过修饰LTR的附着序列来产生(参见，例如Sarkis et al.,Curr.Gene.Ther.,6:430-437(2008))。慢病毒整合酶由HIV-1Pol区编码，并且不可以将该区缺失，因为其编码其他关键活性，包括逆转录、核输入和病毒颗粒组装。改变整合酶蛋白的pol中的突变属于两类之一：选择性地仅影响整合酶活性的那些(I类)；或者具有多效性效应的那些(II类)。贯穿整合酶蛋白的N和C末端以及催化核心区的突变产生影响多种功能的II类突变，包括颗粒形成和逆转录。I类突变限制了它们对催化活性、DNA结合、线性附加体(episome)加工和整合酶的多聚化的影响。最常见的I类突变位点是整合酶催化核心处的三联体残基，包括D64、D116和E152。每个突变已显示有效抑制整合，整合频率比正常整合载体低达四个对数，同时维持NILV的转基因表达。抑制整合的另一可选方法是在分别在5'和3'LTR末端的U3区的12个碱基对区内或U5区的11个碱基对区内的整合酶DNA附着位点(LTRatt位点)引入突变。这些序列包括在整合酶介导的末端加工之后暴露的保守的末端CA二核苷酸。在保守的CA/TG二核苷酸处的单突变或双突变导致整合频率降低达3-4个对数；但是，其保留有效病毒转导的所有其他必需功能。
在一些实施方案中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。如本文所用，术语“腺相关病毒(AAV)载体”表示包含AAV载体基因组(其又包含本文提到的第一和第二表达盒)的AAV病毒颗粒。其意在包括所有血清型的AAV载体，优选AAV-1至AAV-9，更优选AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9和它们的组合。由不同血清型的组合产生的AAV载体可以称作杂合AAV载体。在一实施方案中，AAV载体选自AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5和AAV-6，以及它们的组合。在一实施方案中，AAV载体是AAV-5载体。在一实施方案中，AAV载体是包含AAV-2反向末端重复序列(ITR)的AAV-5载体。本公开还考虑包含天然存在的病毒蛋白(例如，一种或多种衣壳蛋白)的变体的AAV载体。
实现HPRT基因敲低的组分
在一些实施方案中，编码设计为敲低HPRT基因的物质的核酸序列是RNA干扰剂(RNAi)。在一些实施方案中，RNAi剂是shRNA、microRNA或它们的杂合体。
RNAi
在一些实施方案中，表达载体包含编码RNAi的第一核酸序列。RNA干扰是一种通过复杂的多步酶促过程(例如涉及序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)的过程)触发同源转录物的降解，从而使基因表达转录后沉默的方法。RNAi途径的简化模型是基于两个步骤，每个步骤涉及核糖核酸酶。在第一步中，通过RNase II酶DICER和Drosha将触发RNA(dsRNA或miRNA初级转录物)加工为短的干扰RNA(siRNA)。在第二步中，将siRNA加载至效应复合物RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。siRNA在RISC组装期间解开，并且单链RNA与mRNA靶标杂交。据信基因沉默是通过RNase H酶Argonaute(Slicer)对靶向mRNA进行溶核降解的结果。如果siRNA/mRNA双链体包含错配，则mRNA不被切割。相反，基因沉默是翻译抑制的结果。
在一些实施方案中，RNAi剂是抑制或沉默核酸。如本文所用，“沉默核酸”是指能够与特异性序列相互作用以抑制基因表达的任何多核苷酸。沉默核酸的实例包括RNA双链体(例如siRNA、shRNA)、锁核酸(“LNA”)、反义RNA、编码siRNA或shRNA的正义和/或反义序列的DNA多核苷酸、DNA酶或核酶。技术人员会理解基因表达的抑制不必是来自特定列举序列的基因表达，并且可以是例如来自该特定序列控制的序列的基因表达。
构建干扰RNA的方法是本领域已知的。例如，干扰RNA可以由两条独立的寡核苷酸组装而成，其中一条链是正义链，另一条是反义链，其中反义链和正义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；如其中反义链和正义链形成双链体或双链结构)；反义链包含与靶核酸分子或其部分(即，不期望的基因)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且正义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，干扰RNA可以由单个寡核苷酸组装而成，其中自身互补的正义和反义区通过基于核酸或基于非核酸的接头连接。干扰RNA可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，具有自身互补的正义区和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且正义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。干扰RNA可以是环状单链多核苷酸，其具有两个或更多个环结构以及包含自身互补的正义区和反义区的茎，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且正义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中环状多核苷酸可以在体内或体外加工以产生能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有正义区、反义区和环区的自身互补的RNA分子。当表达时，这样的RNA分子理想地形成“发夹”结构，并且在本文中称作“shRNA”。在一些实施方案中，环区的长度一般为约2至约10个核苷酸(仅作为实例，参见SEQ ID NO:20)。在其他实施方案中，环区的长度为约6至约9个核苷酸。在一些实施方案中，正义区和反义区的长度为约15至约30个核苷酸。转录后加工之后，小发夹RNA通过酶DICER介导的切割事件转化为siRNA，所述酶DICER是RNase III家族的成员。然后siRNA能够抑制与其享有同源性的基因的表达。进一步的细节描述参见Brummelkamp et al.,Science 296:550-553,(2002)；Lee et al,Nature Biotechnol.,20,500-505,(2002)；Miyagishi and Taira,Nature Biotechnol 20:497-500,(2002)；Paddison et al.Genes&Dev.16:948-958,(2002)；Paul,Nature Biotechnol,20,505-508,(2002)；Sui,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,99(6),5515-5520,(2002)；和Yu et al.Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052,(2002)，其公开内容整体援引加入本文。
shRNA
在一些实施方案中，第一核酸序列编码靶向HPRT基因的shRNA。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1(在本文中称作“sh734”)的序列具有至少90％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少96％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少97％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少98％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少99％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的核酸序列可以是修饰的。在一些实施方案中，所述修饰包括：(i)掺入hsa-miR-22环序列(例如CCUGACCCA)(SEQ ID NO:21)；(ii)添加5'–3'核苷酸间隔区，如具有两个或三个核苷酸的间隔区(例如TA)；(iii)5'起始修饰，如添加一个或多个核苷酸(例如G)；和/或(iv)将两个核苷酸5'和3'添加添加至茎和环(例如5'A和3'T)。一般来说，将第一代shRNA加工为小RNA的异质混合物，并且已显示前体转录物的积累在体内诱导序列依赖性和非依赖性的非特异性脱靶效应。因此，基于目前对DICER加工和特异性的理解，应用设计规则来优化sh734的结构以及DICER持续合成能力(processivity)和效率(还参见Gu,S.,Y.Zhang,L.Jin,Y.Huang,F.Zhang,M.C.Bassik,M.Kampmann,andM.A.Kay.2014.Weak base pairing in both seed and 3′regions reduce RNAi off-targets and enhances si/shRNA designs.Nucleic Acids Research 42:12169-12176)。
在一些实施方案中，通过将两个核苷酸(例如，分别为G和C)5'和3'添加至发夹环(SEQ ID NO:20)来修饰SEQ ID NO:1的核酸序列，从而将引导链的长度从约19个核苷酸延长至约21个核苷酸，并且用hsa-miR-22环CCUGACCCA(SEQ ID NO:21)替代环，以提供SEQ IDNO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQID NO:2的序列具有至少90％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少95％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少96％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少97％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少98％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少99％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ IDNO:2的序列。据信与SEQ ID NO:1相比，SEQ ID NO:2编码的shRNA实现相似的HPRT敲低。同样地，据信通过表达SEQ ID NO:2编码的shRNA敲低HPRT来使基本上HPRT缺陷的细胞允许利用硫鸟嘌呤类似物(例如6TG)进行选择。
在一些实施方案中，存在于载体内的RNAi编码核酸分子，如与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4之一具有至少90％序列相同性的核酸分子。在一些实施方案中，存在于载体内的RNAi编码核酸分子，如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少95％序列相同性的核酸分子。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少90％序列相同性的核酸分子存在于宿主细胞的细胞质中。
在一些实施方案中，本公开提供一种宿主细胞，其包括至少一种与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少90％序列相同性的核酸分子。在一些实施方案中，本公开提供一种宿主细胞，其包括至少一种与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少95％序列相同性的核酸分子。在一些实施方案中，本公开提供一种宿主细胞，其包括至少一种具有SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4之一的核酸分子。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:5(在本文中称作“shHPRT 616”)的序列具有至少80％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少90％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少95％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少96％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少97％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5的序列具有至少98％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQID NO:5的序列具有至少99％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5的序列(还参见图3)。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:6(在本文中称作“shHPRT 211”)的序列具有至少80％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少95％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少96％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少97％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6的序列具有至少98％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQID NO:6的序列具有至少99％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6的序列(还参见图4)。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7(在本文中称作“shHPRT 734.1”)的序列具有至少80％相同性的序列(还参见图5)。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少90％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQID NO:7的序列具有至少95％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少96％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少97％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少98％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7的序列具有至少99％相同性的序列。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7的序列(还参见图5)。
MicroRNA
MicroRNA(miR)是一组非编码RNA，其转录后调控其靶基因的表达。据信这些单链分子与其他蛋白形成miRNA介导的沉默复合物(miRISC)，所述其他蛋白结合至它们的靶mRNA的3'非翻译区(UTR)以防止它们在细胞质中翻译。
在一些实施方案中，shRNA序列包埋在micro-RNA二级结构中(“基于micro-RNA的shRNA”)。在一些实施方案中，靶向HPRT的shRNA核酸序列包埋在micro-RNA二级结构内。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA靶向HPRT内的编码序列以实现HPRT表达的敲低，据信这等同于利用靶向HPRT的shRNA而没有伴随的途径饱和和细胞毒性或脱靶效应。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA是从头人工microRNA shRNA。Fang,W.&Bartel,David P.The Menu of Features that Define Primary MicroRNAs and Enable De NovoDesign of MicroRNA Genes.Molecular Cell 60,131-145描述了这类从头基于micro-RNA的shRNA的产生，其公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少80％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少96％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少98％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8的序列具有至少99％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有SEQ ID NO:8(“miRNA734-Denovo”)的序列(还参见图6)。SEQ ID NO:8的RNA形式具有SEQ ID NO:22。
在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少80％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQID NO:9的序列具有至少95％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少96％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少97％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少98％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9的序列具有至少99％相同性的序列。在一些实施方案中，基于micro-RNA的shRNA具有SEQ ID NO:9(“miRNA211-Denovo”)的核酸序列(还参见图7)。SEQ ID NO:9的RNA形式具有SEQ ID NO:23。
在其他实施方案中，基于micro-RNA的shRNA是第三代miRNA支架修饰的miRNA 16-2(以下称为“miRNA-3G”)(参见，例如，图8和9)。Watanabe,C.,Cuellar,T.L.&Haley,B."Quantitative evaluation of first,second,and third generation hairpin systemsreveals the limit of mammalian vector-based RNAi,"RNA Biology 13,25-33(2016)描述了这类miRNA-3G分子的合成，其公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少80％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少95％相同性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少96％相同性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少97％相同性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少98％相同性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10的序列具有至少99％相同性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有SEQ ID NO:10(“miRNA211-3G”)的核酸序列(还参见图9)。
在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少80％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少90％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少96％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少98％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11的序列具有至少99％相同性的核酸序列。在其他实施方案中，miRNA-3G具有SEQ ID NO:11(“miRNA734-3G”)的核酸序列(还参见图8)。
在一些实施方案中，sh734 shRNA适合模拟具有17个核苷酸碱基对茎和4-核苷酸环的miRNA-451(参见SEQ ID NO:24)结构(miR-451调节药物转运蛋白P-糖蛋白)。值得注意的是，这个结构不需要通过DICER进行加工。据信pre-451mRNA结构被Ago2切割，随后被poly(A)-特异性核糖核酸酶(PARN)切割以产生成熟的miRNA-451结构模拟物。据信Ago-shRNA模拟内源miR-451的结构，并且可能具有不依赖于DICER的优势。据信这限制随从链(passenger)加载的脱靶效应，具有可变的3'-5'核酸外切活性(23-26nt成熟)(参见Herrera-Carrillo,E.,and B.Berkhout.2017.DICER-independent processing of smallRNA duplexes:mechanistic insights and applications.Nucleic Acids Res.45:10369-10379)。还认为利用shRNA的非DICER依赖性加工替代物具有优势，包括单个RNAi活性向导的有效减少的脱靶效应，细胞RNAi DICER机制的不饱和，以及较短的RNA双链体不太可能触发先天RIG-I应答。
RNAi的替代物
作为掺入RNAi的替代方案，在一些实施方案中，表达载体可以包括编码反义寡核苷酸的核酸序列，所述反义寡核苷酸结合信使RNA(mRNA)中的位点。本公开的反义寡核苷酸与编码蛋白的核酸特异性地杂交并干扰所述蛋白的转录或翻译。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向DNA并干扰其复制和/或转录。在其他实施方案中，反义寡核苷酸与RNA(包括pre-mRNA(即前体mRNA，它是mRNA的未成熟单链)和mRNA)特异性地杂交。这类反义寡核苷酸可以影响例如RNA易位至蛋白翻译位点，蛋白从RNA翻译，RNA剪接以产生一种或多种mRNA种类，以及RNA可能参与或促进的催化活性。这种干扰的总体效果是调节、减少或抑制靶蛋白表达。
在一些实施方案中，表达载体并入编码外显子跳跃剂或外显子跳跃转基因的核酸序列。如本文所用，短语“外显子跳跃转基因”或“外显子跳跃剂”是指编码可以产生外显子跳跃的反义寡核苷酸的任何核酸。“外显子跳跃”是指在蛋白产生期间在pre-mRNA水平被跳跃或去除的外显子。据信反义寡核苷酸可以干扰外显子内的剪接位点或调节元件。尽管存在基因突变，这可以导致截短、部分功能的蛋白。一般来说，反义寡核苷酸可能是突变特异性的，并且结合至前信使RNA中的突变位点以诱导外显子跳跃。
外显子跳跃转基因编码可以导致外显子跳跃的物质，并且这类物质是反义寡核苷酸。尽管存在基因突变，反义寡核苷酸可以干扰外显子内的剪接位点或调节元件以导致截短、部分功能的蛋白。此外，反义寡核苷酸可能是突变特异性的，并且结合至前信使RNA中的突变位点以诱导外显子跳跃。用于外显子跳跃的反义寡核苷酸是本领域已知的，并且一般称作AON。这类AON包括小核RNA(“snRNA”)，其是限制于细胞核内并参与剪接或其他RNA加工反应的一类小RNA分子。例如，在美国公开号20150225718、20150152415、20150140639、20150057330、20150045415、20140350076、20140350067和20140329762中公开了反义寡核苷酸的实例、设计它们的方法和相关生产方法，其公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，本公开的表达载体包括编码外显子跳跃剂的核酸，所述外显子跳跃剂在HPRT表达期间导致外显子跳跃或引起HPRT复制突变(例如外显子4中的复制突变)(参见Baba S,et al.Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error withmultiple variations.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2017Jan 2；36(1):1-6，其公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，可以通过剪接体反式剪接用修饰的突变序列替代HPRT，因此促进HPRT。在一些实施方案中，这(1)需要突变的编码区以替代靶RNA中的编码区，(2)5'或3'剪接位点，和/或(3)结合结构域，即，反义寡核苷酸序列，其与靶HPRT RNA互补。在一些实施方案中，需要所有三个组分。
启动子
各种启动子可以用来驱动并入所公开的表达载体内的每个核酸序列的表达。例如，编码RNAi(例如抗HPRT shRNA)的第一核酸序列可以从选自Pol III启动子或Pol II启动子之一的第一启动子表达。同样地，作为另一实例，编码基于micro-RNA的shRNA以下调HPRT的第一核酸序列可以从选自Pol III启动子或Pol II启动子之一的第一启动子表达。在一些实施方案中，启动子可以是本领域普通技术人员已知的组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子包括至少一部分的HIV LTR(例如TAR)。
合适的启动子的非限制性实例包括但不限于RNA聚合酶I(pol I)、聚合酶II(polII)或聚合酶III(pol III)启动子。“RNA聚合酶III启动子”或“RNA pol III启动子”或“聚合酶III启动子”或“pol III启动子”表示任何无脊椎动物、脊椎动物或哺乳动物启动子，例如，人、鼠、猪、牛、灵长类、猿猴等，在其细胞中的天然环境中，与RNA聚合酶III相关或相互作用以转录其可操作地连接的基因，或者其任何变体，天然的或工程化的，会在所选宿主细胞中与RNA聚合酶III相互作用以转录可操作地连接的核酸序列。适合用于本公开的表达载体的RNA pol III启动子包括但不限于人U6、小鼠U6和人H1等。
pol III启动子的实例包括但不限于Ef1α、CMV和泛素。其他特定的pol II启动子包括但不限于锚蛋白启动子(Sabatino DE,et al.,Proc Natl Acad Sd USA.(24):13294-9(2000))、血影蛋白启动子(Gallagher PG,et al.,J Biol Chem.274(10):6062-73,(2000))、转铁蛋白受体启动子(Marziali G,et al.,Oncogene.21(52):7933-44,(2002))、带3/阴离子转运蛋白启动子(Frazar TF,et al.,MoI Cell Biol(14):4753-63,(2003))、带4.1启动子(Harrison PR,et al.,Exp Cell Res.155(2):321-44,(1984))、BcI-Xl启动子(Tian C,et al.,Blood 15；101(6):2235-42(2003))、EKLF启动子(Xue L,et al.,Blood.103(11):4078-83(2004)).Epub 2004Feb 5)、ADD2启动子(Yenerel MN,et al.,ExpHematol.33(7):758-66(2005))、DYRK3启动子(Zhang D,et al.,Genomics 85(1):117-30(2005))、SOCS启动子(Sarna MK,et al.,Oncogene 22(21):3221-30(2003))、LAF启动子(To MD,et al.,bit J Cancer l；115(4):568-74,(2005))、PSMA启动子(Zeng H,et al.,JAndrol(2):215-21,(2005))、PSA启动子(Li HW,et al.,Biochem Biophys Res Commun334(4):1287-91,(2005))、Probasin启动子(Zhang J,et al.,145(l):134-48,(2004)).Epub 2003Sep 18)、ELAM-I启动子/E-选择素(Walton T,et al.,Anticancer Res.18(3A):1357-60,(1998))、突触蛋白启动子(Thiel G,et al.,ProcNatl Acad Sd USA.,88(8):3431-5(1988))、Willebrand因子启动子(Jahroudi N,Lynch DC.MoI Cell-5zo/.14(2):999-1008,(1994))、FLTl(Nicklin SA,et al.,Hypertension 38(l):65-70,(2001))、Tau启动子(Sadot E,et al.,JMoI Biol.256(5):805-12,(1996))、酪氨酸酶启动子(Lillehammer T,et al.,Cancer Gene Ther.(2005))、pander启动子(Burkhardt BR,etal.,Biochim Biophys Acta.(2005))、神经元特异性烯醇化酶启动子(Levy YS,et al.,JMolNeurosci.21(2):121-32,(2003))、hTERT启动子(Ito H,et al.,Hum Gene Ther 16(6):685-98,(2005))、HRE应答元件(Chadderton N,et al.,IntJRadiat Oncol BiolPhys.62(l):2U-22,(2005)),lck promoter(Zhang DJ,et al.,J Immunol.174(11):6725-31,(2005))、MHCII启动子(De Geest BR,et al.,Blood.101(7):2551-6,(2003),Epub2002Nov21)和CDl Ic启动子(Lopez-Rodriguez C,et al.,J Biol Chem.272(46):29120-6(1997))。
在一些实施方案中，驱动设计为敲低HPRT的物质表达的启动子是RNA pol III启动子。在一些实施方案中，驱动设计为敲低HPRT的物质表达的启动子是7sk启动子(例如7SK人7S K RNA启动子)。在一些实施方案中，7sk启动子具有ACCESSION AY578685提供的核酸序列(智人细胞系HEK-293 7SK RNA启动子区，完整序列，ACCESSION AY578685)。
在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少96％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少98％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的核酸序列具有至少99％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有SEQ IDNO:14示出的核酸序列。
在一些实施方案中，与7sk启动子相比，使用的7sk启动子在其核酸序列中包含至少一个突变和/或缺失。Boyd,D.C.,Turner,P.C.,Watkins,N.J.,Gerster,T.&Murphy,S.Functional Redundancy of Promoter Elements Ensures Efficient Transcriptionof the Human 7SK Gene in vivo.Journal of Molecular Biology 253,677-690(1995)描述了合适的7sk启动子突变，其公开内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，7sk启动子中的功能性突变或缺失是在顺式调节元件中进行的，以便调节启动子驱动的转基因(包括sh734)的表达水平。所述突变用来建立由Pol III启动子驱动的sh734表达水平之间的相关性，并且引入功能性以在6TG疗法以及长期稳定性和安全性的情况下进行稳定选择。7sk启动子突变的位置在图10中示出。
在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少95％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少96％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少97％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少98％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的核酸序列具有至少99％相同性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有SEQ IDNO:15示出的核酸序列。
在其他实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。可以使用的组织特异性启动子的几个非限制性实例包括lck(参见，例如，Garvin et al.,MoI.Cell Biol.8:3058-3064,(1988))和Takadera et al.,MoI.Cell Biol.9:2173-2180,(1989))、肌细胞生成蛋白(Yee et al.,Genes and Development 7:1277-1289(1993)和thyl(Gundersen et al.,Gene 113:207-214,(1992))。
可操作地连接至启动子的核酸序列的组合的非限制性实例在下表中示出：
<u>编号</u> <u>启动子类型</u> <u>启动子</u> <u>shRNA SEQ ID NO:</u>
1 Pol III 7sk 1
2 Pol III 具有单一突变的突变7sk 1
3 Pol III 具有两个突变的突变7sk 1
4 Pol III 具有三个突变的突变7sk 1
5 Pol III H1 1
6 Pol II EF1a 5
7 Pol II EF1a 6
8 Pol II EF1a 7
载体的产生
在一些实施方案中，将表达盒(如包括适合敲低HPRT的核酸序列的表达盒)插入表达载体，如慢病毒表达载体，以提供具有至少一种用于表达的转基因的载体。在一些实施方案中，慢病毒表达载体可以选自pTL20c、pTL20d、FG、pRRL、pCL20、pLKO.1puro、pLKO.1、pLKO.3G、Tet-pLKO-puro、pSico、pLJM1-EGFP、FUGW、pLVTHM、pLVUT-tTR-KRAB、pLL3.7、pLB、pWPXL、pWPI、EF.CMV.RFP、pLenti CMV Puro DEST、pLenti-puro、pLOVE、pULTRA、pLJM1-EGFP、pLX301、pInducer20、pHIV-EGFP、Tet-pLKO-neo、pLV-mCherry、pCW57.1、pLionII、pSLIK-Hygro和pInducer10-mir-RUP-PheS。在其他实施方案中，慢病毒表达载体可以选自AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLAβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体和BCL11A shmir载体。在一些实施方案中，慢病毒表达载体可以选自pTL20c、pTL20d、FG,pRRL和pCL20。在其他实施方案中，慢病毒表达载体是pTL20c。
在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在其他实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少96％序列相同性的核酸序列。在其他实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在其他实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少98％序列相同性的核酸序列。在其他实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少99％序列相同性的核酸序列。在其他实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO:13的核酸序列。
在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少90％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少96％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少98％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少98％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒具有SEQ ID NO:17的核酸序列。
在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQID NO:16的序列具有至少90％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQID NO:16的序列具有至少96％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQID NO:16的序列具有至少98％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括TL20病毒骨架，所述TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16的序列具有至少99％序列相同性的核酸序列。在一些实施方案中，所述质粒包括具有SEQ ID NO:16的核酸序列的TL20病毒骨架。
在一个或多个实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列可以以相对于其他载体元件的不同方向插入表达载体(比较，例如，图32之间7sk启动子的方向)。例如，与转基因(如实施例中描述的UbC驱动的GFP)相比，7sk驱动的sh734元件可以朝向相同方向或相反方向。在其他实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列可以插入到表达载体的不同位置，即，其他载体元件的上游或下游，例如UbC驱动的GFP的上游或下游。据信7sk表达盒相对于其他载体元件的不同位置和/或方向可以增强sh734的表达。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒位于相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP的上游。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒位于相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP的下游。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒和其他载体元件如UbC驱动的GFP朝向相同方向。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒和其他载体元件如UbC驱动的GFP朝向相反方向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒朝向反向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒位于上游并朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒位于上游并朝向反向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒位于下游并朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其他载体元件如UbC驱动的GFP，7sk/sh734表达盒位于下游并朝向反向。
下调HPRT或敲除HPRT的物质的非病毒递送
在一些实施方案中，设计为敲低HPRT基因的物质(包括包含RNAi的表达构建体)可以通过其他非病毒递送媒介物之外的纳米胶囊递送。通过这种方法递送这样的物质代表通过来自表达载体的表达的RNAi或其他物质来实现HPRT下调的替代方案。如本文进一步描述的，利用纳米胶囊递送反义RNA、设计用于外显子跳跃的寡核苷酸或基因编辑机制是可能的。
一般来说，纳米胶囊是表现出典型的核-壳结构的囊泡系统，其中活性分子被限制在聚合物膜或包衣包围的库或者空腔中。在一些实施方案中，典型的纳米胶囊的壳是由聚合物膜或包衣制成的。在一些实施方案中，纳米胶囊源自可生物降解或可生物侵蚀的聚合物材料，即纳米胶囊是可生物降解和/或可侵蚀的聚合物纳米胶囊。例如，将用于敲低和/或敲除的组分包裹在纳米胶囊内，所述纳米胶囊包含一种或多种可生物降解的聚合物如聚交酯-聚乙醇酸交酯、聚(原酸酯)和聚(酐)。在一些实施方案中，所述聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。在一些实施方案中，所述纳米胶囊是酶促可降解的纳米胶囊。在一些实施方案中，所述纳米胶囊由单一蛋白核心和通过肽交联的薄聚合物壳组成。在一些实施方案中，可以选择纳米胶囊，从而其是可以特异性识别的，并且能够被蛋白酶切割。在一些实施方案中，可切割的交联剂包括作为蛋白酶或另一种酶的底物的肽序列或结构。
纳米胶囊的实例包括但不限于美国专利号9,782,357中描述的那些；美国专利申请公开号2017/0354613和2015/0071999中描述的那些；以及PCT公开号WO2016/085808和WO2017/205541中描述的那些，其公开内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，可以修饰上述出版物中描述的纳米胶囊以携带和/或包裹用于敲低和/或敲除的组分，例如Cas蛋白和/或gRNA。美国专利申请号2011/0274682中进一步公开了其他合适的纳米胶囊、它们的合成方法和/或包裹方法，其公开内容整体援引加入本文。PCT公开号WO2013/138783、WO2013/033717和WO2014/093966中描述了可以修饰以携带和/或包裹组分来实现HPRT的敲低或敲除的其他合适的纳米胶囊，其公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，所述纳米胶囊适合在体内靶向特定细胞类型(例如T细胞、CD34造血干细胞和祖细胞)。例如，所述纳米胶囊可以包括一个或多个偶联至聚合物纳米胶囊的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分将聚合物纳米胶囊递送至特定细胞类型，其中所述细胞类型选自免疫细胞、血细胞、心脏细胞、肺细胞、视细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、中枢神经系统细胞、周围神经系统细胞、癌细胞、感染病毒的细胞、干细胞、皮肤细胞、肠细胞和/或听细胞。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。
在一些实施方案中，所述纳米胶囊进一步包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，所述纳米胶囊包含2-6个靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。在一些实施方案中，靶向部分靶向CD117、CD10、CD34、CD38、CD45、CD123、CD127、CD135、CD44、CD47、CD96、CD2、CD4、CD3和CD9标记中的任一种。在一些实施方案中，靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，靶向部分靶向人造血干细胞CD标记中的任一种，包括CD34、CD38、CD45RA、CD90和CD49。
这类纳米胶囊的合适有效载荷包括靶向HPRT的合成寡核苷酸、shRNA、miRNA和Ago-shRNA。在一些实施方案中，有效载荷可以在Pol III或Pol II驱动的启动子盒中表达。
在其他实施方案中，可以将下调HPRT的物质配制在生物纳米胶囊内，所述生物纳米胶囊是通过基因工程微生物产生的纳米大小的胶囊。在一些实施方案中，生物纳米胶囊是病毒蛋白衍生的或修饰的病毒蛋白衍生的颗粒，如病毒表面抗原颗粒(例如，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)颗粒)。在其他实施方案中，生物纳米胶囊是一种纳米大小的胶囊，其包含脂质双层膜以及病毒蛋白衍生的或修饰的病毒蛋白衍生的颗粒如病毒表面抗原颗粒。这类颗粒可以纯化自真核细胞，如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。胶囊的大小可以为约10nm至约500nm。在其他实施方案中，胶囊的大小可以为约20nm至约250nm。在其他实施方案中，胶囊的大小可以为约80nm至约150nm。
反义RNA
反义RNA(asRNA)是与细胞内转录的信使RNA(mRNA)链互补的单链RNA。不希望受任何特定理论的束缚，据信可以将反义RNA引入细胞以通过与其碱基配对和物理阻碍翻译机制来抑制互补mRNA的翻译。换句话说，反义RNA是表现出与特定mRNA的互补关系的单链RNA分子。
反义RNA可以用于基因调节并特异性地靶向用于蛋白合成的mRNA分子。反义RNA可以与互补mRNA物理配对并结合，从而抑制mRNA在翻译机制中被加工的能力。在一些实施方案中，硫代磷酸酯修饰的反义寡核苷酸可以用来靶向HPRT mRNA编码区内的序列。如上所述，可以利用靶向纳米胶囊将这些寡核苷酸递送至特定细胞群和解剖部位细胞。
外显子跳跃
如本文所述，外显子跳跃可以用来在HPRT基因内产生导致HPRT缺乏的缺陷。在一些实施方案中，可以通过纳米胶囊递送寡核苷酸(包括修饰的寡核苷酸)，所述寡核苷酸设计为靶向未剪接的HPRT mRNA并介导活性所需的内含子的过早终止或跳跃。可以引入HPRT复制突变，例如外显子4中的复制突变(参见Baba S,et al.,"Novel mutation in HPRT1causing a splicing error with multiple variations,"Nucleosides NucleotidesNucleic Acids.2017Jan 2；36(1):1-6)，以便引起HPRT蛋白的剪接错误和功能失活。通过剪接体反式剪接用修饰的突变序列替代HPRT是敲低HPRT的潜在治疗策略。据信这需要(1)突变的编码区以替代靶RNA中的编码区，(2)5'或3'剪接位点，以及(3)结合结构域，例如，反义寡核苷酸序列，其与靶RNA互补。
可以对寡核苷酸进行结构修饰，从而它们是核酸酶抗性的。在一些实施方案中，寡核苷酸具有修饰的骨架或非天然的核苷间键。具有修饰的骨架的这类寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中没有磷原子的那些。在一些实施方案中，在其核苷间骨架中没有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以认为是寡核苷酸。在其他实施方案中，修饰寡核苷酸，从而用新基团替代核苷酸单元的糖和核苷间键，即，骨架。保持碱基单元以与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已显示具有优异杂交特性的寡核苷酸模拟物，被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，用包含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架，替代寡核苷酸的糖骨架。保留核碱基并直接或间接结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。修饰的寡核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基特别可用于增加本公开的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括但不限于5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高约0.6至约1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
敲除HPRT的基因编辑
本公开还提供用于敲除HPRT的组合物。在一些实施方案中，基因编辑方法可以用于敲除HPRT。例如，可以用靶向HPRT的CRISPR/Cas9 RNP或靶向HPRT的CRISPR/Cas12a RNP处理分离的细胞。如本文提供的“核糖核蛋白复合物”是指包括核蛋白和核糖核酸的复合物或颗粒。如本文提供的“核蛋白”是指能够结合核酸(例如，RNA、DNA)的蛋白。当核蛋白结合核糖核酸时，它被称作“核糖核蛋白”。核糖核蛋白和核糖核酸之间的相互作用可以是直接的，例如，通过共价键，或者是间接的，例如，通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤素键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦分散)、环堆积(pi效应)、疏水相互作用等)。在一些实施方案中，核糖核蛋白包括非共价结合至核糖核酸的RNA结合基序。例如，RNA结合基序中带正电荷的芳香族氨基酸残基(例如，赖氨酸残基)可以与RNA的负核酸磷酸骨架形成静电相互作用，从而形成核糖核蛋白复合物。核糖核蛋白的非限制性实例包括核糖体、端粒酶、RNAseP、hnRNP、CRISPR相关蛋白9(Cas9)和小核RNP(snRNP)。核糖核蛋白可以是酶。在实施方案中，核糖核蛋白是内切核酸酶。因此，在一些实施方案中，核糖核蛋白复合物包括内切核酸酶和核糖核酸。在一些实施方案中，内切核酸酶是CRISPR相关蛋白9。在一些实施方案中，内切核酸酶是CRISPR相关蛋白12a。
在一些实施方案中，核糖核酸是向导RNA(参见，例如，SEQ ID NO:25–39)。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白9结合至核糖核酸，从而形成核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是向导RNA。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白12a结合至核糖核酸，从而形成核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是向导RNA。在一些实施方案中，CRISPR相关蛋白12b结合至核糖核酸，从而形成核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是向导RNA。因此向导RNA(或gRNA)可以包括能够结合核蛋白的核糖核苷酸序列，从而形成核糖核蛋白复合物。在一些实施方案中，向导RNA包括一种或多种RNA分子。在一些实施方案中，向导RNA包括与靶位点互补的核苷酸序列。互补的核苷酸序列可以介导核糖核蛋白复合物结合至靶位点，从而提供核糖核蛋白复合物的序列特异性。因此，在一些实施方案中，向导RNA与靶核酸互补。
在一些实施方案中，向导RNA(例如SEQ ID NO:25–39中的任一个)结合靶核酸序列。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约50％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约55％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约60％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约65％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约70％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约75％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约80％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约85％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约90％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约95％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约96％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约97％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约98％的序列相同性。在一些实施方案中，向导RNA的互补体与靶核酸具有约99％的序列相同性。
如本文提供的靶核酸序列是通过细胞表达的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是外源核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是内源核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列形成细胞基因的一部分。因此，在一些实施方案中，向导RNA与细胞基因或其片段互补。在一些实施方案中，向导RNA与靶核酸序列约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。在一些实施方案中，向导RNA与细胞基因的序列约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。在一些实施方案中，向导RNA结合细胞基因序列。
在一些实施方案中，本公开提供一种组合物，其包括靶向人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因(SEQ ID NO:12)内的序列的gRNA。在一些实施方案中，在纳米胶囊内提供gRNA和基因编辑必需的另一组分。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向人染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列，并且其中靶向的序列具有约14至约28个连续碱基对的长度。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列，并且其中靶向的序列具有约15至约26个连续碱基对的长度。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列，并且其中靶向的序列具有约16至约24个连续碱基对的长度。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列，并且其中靶向的序列具有约17至约22个连续碱基对的长度。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA靶向染色体X内约134460145至约134500668的位置处的序列，并且其中靶向的序列具有约18至约22个连续碱基对的长度。
在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少95％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少96％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少97％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ IDNO:25–39中的任一个具有至少98％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少99％相同性的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物包括含有SEQ ID NO:25–39中任一个的gRNA。在一些实施方案中，所述组合物是纳米胶囊，并且所述纳米胶囊内包含gRNA和用于基因编辑的另一组分(例如Cas蛋白)。
在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少90％序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少95％序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少96％序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少97％序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少98％序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括gRNA，所述gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668的位置处的靶序列具有至少99％序列相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，染色体X内在约134460145至约134500668的位置处的靶序列的互补体(complement)与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％相同性。在一些实施方案中，染色体X内在约134460145至约134500668的位置处的靶序列的补体与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少95％相同性。在一些实施方案中，染色体X内在约134460145至约134500668的位置处的靶序列的补体与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少97％相同性。在一些实施方案中，染色体X内在约134460145至约134500668的位置处的靶序列的补体与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少99％相同性。
宿主细胞
本公开还提供包含本公开的新表达载体的宿主细胞。“宿主细胞”或“靶细胞”表示利用本公开的组合物如表达载体或纳米胶囊转化(即转导或转染)的细胞。在一些实施方案中，在用编码适合敲低HPRT的核酸的表达载体转导之后，宿主细胞基本上是HPRT缺陷的。在其他实施方案中，在用包含设计为实现HPRT敲除的组分的纳米胶囊转染之后，宿主细胞基本上是HPRT缺陷的。共同待决的美国专利申请号16/038,643中描述了用表达载体转导宿主细胞以敲低HPRT或用纳米胶囊转染宿主细胞以敲除HPRT的方法，其公开内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的和/或纯化的。
在一些实施方案中，宿主细胞是其中表达载体可以表达的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞以及Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开的表达载体的宿主细胞是造血细胞，如造血祖细胞/干细胞(例如CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞或树突细胞。
本公开的用表达载体转导或用纳米胶囊转染的造血细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体的或来自匹配的兄弟姐妹。在一些实施方案中，造血祖细胞/干细胞是CD34阳性的，并且可以分离自患者的骨髓或外周血。在一些实施方案中，用如本文描述的表达载体转导分离的CD34阳性造血祖细胞/干细胞(和/或本文描述的其他造血细胞)。
在一些实施方案中，将修饰的宿主细胞与药学上可接受的载剂组合。在一些实施方案中，用PLASMA-LYTE A(例如用于静脉内给药的无菌的、非致热性的等渗溶液；其中一升的PLASMA-LYTE A的离子浓度为140mEq钠、5mEq钾、3mEq镁、98mEq氯化物、27mEq乙酸盐和23mEq葡萄糖酸盐)配制宿主细胞或转导的宿主细胞。在其他实施方案中，将宿主细胞或转导的宿主细胞配制于PLASMA-LYTE A溶液中，所述溶液包含约8％至约10％二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，每mL包含PLASMA-LYTE A和DMSO的制剂中存在少于约2x107个宿主细胞/转导的宿主细胞。
在一些实施方案中，用根据本公开的表达载体转导之后，使得宿主细胞基本上是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，HPRT基因表达水平降低至少约80％。据信具有20％或更少残留HPRT基因表达的细胞对嘌呤类似物如6TG敏感，允许它们用嘌呤类似物选择(参见，例如，图22)。在一些实施方案中，宿主细胞包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的至少一个具有至少90％相同性的核酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包括与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4中的至少一个具有至少95％相同性的核酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包括包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的至少一个的核酸分子。
在一些实施方案中，可以通过使宿主细胞在体外、离体或体内与本公开的表达载体以及一种或多种增加转导效率的化合物接触来增加宿主细胞的转导。例如，在一些实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物是刺激前列腺素EP受体信号传导途径的化合物，即与不存在一种或多种化合物的情况下前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性相比，增加与一种或多种化合物接触的细胞中前列腺素EP受体下游的细胞信号传导活性的一种或多种化合物。在一些实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物是前列腺素EP受体配体，包括但不限于前列腺素E2(PGE2)或者其类似物或衍生物。在其他实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物包括但不限于RetroNectin(重组人纤连蛋白片段的63kD片段，可获得自Takara)；Lentiboost(膜密封泊洛沙姆，可获得自Sirion Biotech)、硫酸鱼精蛋白、环胞素H和雷帕霉素。在其他实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物包括泊洛沙姆(例如泊洛沙姆F127)。
药物组合物
本公开还提供组合物，包括药物组合物，其包含如本文公开的一种或多种表达载体和/或非病毒递送媒介物(例如纳米胶囊)。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的至少一种如本文描述的表达载体和/或非病毒递送媒介物以及药学上可接受的载剂。例如，在某些实施方案中，所述药物组合物包含有效量的表达载体和药学上可接受的载剂。本领域技术人员可以基于诸如体型、体重、年龄、健康、受试者的性别、种族和病毒滴度的因素容易地确定有效量。
本公开的另一方面是一种药物组合物，其包含(a)表达载体，包括编码靶向HPRT基因的shRNA的核酸序列；和(b)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，所述组合物配制为乳剂。在一些实施方案中，所述药物组合物配制于胶束内。在一些实施方案中，所述药物组合物包裹在聚合物内。在一些实施方案中，所述药物组合物包裹在脂质体内。在一些实施方案中，所述药物组合物包裹在小细胞(minicell)或纳米胶囊内。
本公开的另一方面是一种药物组合物，其包含(a)纳米胶囊群，每个胶囊包括适合敲除HPRT的有效载荷(例如Cas9蛋白或Cas12a蛋白和/或gRNA，如SEQ ID NO:25–39中任一个的gRNA)；和(b)药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，所述纳米胶囊是聚合物纳米胶囊。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊进一步包含至少一个靶向部分以促进将核糖核蛋白或核糖核蛋白复合物递送至特定类型的细胞。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊是可侵蚀的或可生物降解的。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包含pH敏感的交联剂。
在一些实施方案，聚合物纳米胶囊的大小为约50nm至约250nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径少于或等于约200纳米(nm)。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约1至200nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约5至约200nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约10至约150nm或15至100nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约15至约150nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约20至约125nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约50至约100nm。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊的平均直径为约50至约75nm。在一些实施方案中，纳米胶囊的表面可以具有约1至约15毫伏(mV)的电荷(如在标准磷酸盐溶液中测量的)。在其他实施方案中，纳米胶囊的表面可以具有约1至约10mV的电荷。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当给药至动物或人时不产生有害、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。例如，可以用药学上可接受的载剂配制表达载体。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，可接受用于配制药物，如适合给药至人的药物。用药物载剂配制化合物制剂的方法是本领域已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Science,(17th ed.Mack Publishing Company,Easton,Pa.1985)；和Goodman&Gillman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics(11th Edition,McGraw-Hill Professional,2005)；其各自的公开内容整体援引加入本文。
在一些实施方案中，所述药物组合物可以包含任何浓度的本文公开的任何表达载体、纳米胶囊或组合物，其允许给药的沉默核酸达到约0.1mg/kg至约1mg/kg范围内的浓度。在一些实施方案中，所述药物组合物可以包含约0.1重量％至约99.9重量％的量的表达载体。适合包括在任何药物组合物内的药学上可接受的载剂包括水、缓冲水、盐水溶液如生理盐水或平衡盐水溶液如Hank's或Earle's平衡溶液)、甘氨酸、透明质酸等。可以配制药物组合物用于肠胃外给药，如静脉内、肌肉内或皮下给药。用于肠胃外给药的药物组合物可以包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性或非水性载剂、溶剂、稀释剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素和它们的混合物、植物油(如橄榄油)、可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。
所述药物组合物可以配制用于口服给药。用于口服给药的固体剂型可以包括例如片剂、糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，所述组合物可以包含至少一种药学上可接受的载剂如柠檬酸钠和/或磷酸二钙和/或填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠；湿润剂如乙酰醇、甘油单硬脂酸酯；吸收剂如白陶土和膨润土；和/或润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，以及它们的混合物。用于口服给药的液体剂型可以包括例如药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型可以包括惰性稀释剂如水或其他溶剂，增溶剂和/或乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如，棉子油、玉米油、胚芽油、蓖麻油、橄榄油、芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
所述药物组合物可以包含渗透促进剂以增强它们的递送。渗透促进剂可以包括脂肪酸如油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、reclineate、甘油单油酸酯、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、单甘油酯和二-甘油酯，以及它们的生理学上可接受的盐。所述组合物可以进一步包括螯合剂，例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐、高香草酸盐(homovanilate))。
所述药物组合物可以包含包裹形式的本文公开的任何表达载体。例如，表达载体可以被可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)、聚(原酸酯)和聚(酐))包裹，或者可以包裹在脂质体中或分散在微乳液内。脂质体可以是例如lipofectin或lipofectamine。在另一实例中，组合物可以在无核细菌小细胞中或之上包含本文公开的表达载体(Giacalone et al,Cell Microbiology 2006,8(10):1624-33)。本文公开的表达载体可以与纳米颗粒组合。
稳定的生产者细胞系
本公开的另一方面是用于产生病毒滴度的稳定的生产者细胞系，其中所述稳定的生产者细胞系源自GPR、GPRG、GPRT、GPRGT或GPRT-G包装细胞系之一。在一些实施方案中，所述稳定的生产细胞系源自GPRT-G细胞系。在一些实施方案中，所述稳定的生产者细胞系是通过以下产生的：(a)通过至少将编码抗HPRT shRNA的核酸序列克隆至重组质粒中来合成表达载体(即合成的载体可以是本文描述的任一种载体)；(b)从合成的载体产生DNA片段；(c)由(i)从合成的载体产生的DNA片段，和(ii)源自抗生素抗性盒质粒的DNA片段形成多联阵列；(d)用形成的多联阵列转染包装细胞系之一；以及(e)分离稳定的生产者细胞系。2016年5月12日提交的国际申请号PCT/US2016/031959中公开了形成稳定的生产者细胞系的其他方法，其公开内容整体援引加入本文。
试剂盒
在一些实施方案中是包含如本文所述的表达载体或包含表达载体的组合物的试剂盒。所述试剂盒可以包括容器，其中所述容器可以是包含口服或肠胃外剂型的表达载体或组合物的瓶子，每个剂型包含单位剂量的表达载体。所述试剂盒可以包括标签等，指示根据本文描述的方法对受试者进行的治疗。同样地，在其他实施方案中是包含组合物的试剂盒，所述组合物包含一群纳米胶囊，所述纳米胶囊包含如本文所述适合敲除HPRT的有效载荷。
在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括额外的活性物质。额外的活性物质可以装在与容纳载体或包含载体的组合物的容器分开的容器中。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含一个或多个剂量的嘌呤类似物(例如6TG)以及任选存在的剂量给药用于调理(conditioning)和/或化学选择的嘌呤类似物的说明书(如本文进一步描述的那些步骤)。在其他实施方案中，所述试剂盒可以包含一个或多个剂量的MTX或MPA以及任选存在的如本文所述剂量给药用于负选择的MTX或MPA的说明书。
基本上HPRT缺陷的淋巴细胞(“修饰的淋巴细胞”)的制备
本公开的一方面是一种制备HPRT缺陷的淋巴细胞如T细胞的方法(在本文中也称作“修饰的淋巴细胞”或“修饰的T细胞”)。参考图11，首先从供体收集宿主细胞，即淋巴细胞(例如T细胞)(步骤110)。在还从供体收集造血干细胞(HSC)的实施方案中，可以从收集HSC移植物的同一供体或不同供体收集淋巴细胞，例如T细胞。在这些实施方案中，可以在与用于HSC移植物的细胞相同的时间或不同的时间收集细胞。在一些实施方案中，从相同的动员的外周血HSC收获物收集细胞。在一些实施方案中，这可以是CD34阴性级分(按照供体移植物护理标准收集的CD34阳性细胞)，或者CD34阳性HSC移植物的一部分(如果设想祖T细胞移植物)。
技术人员会理解可以通过任何方式收集细胞。例如，可以通过血液分离术、白细胞除去术或仅通过简单的静脉抽血来收集细胞。在与用于修饰的细胞同时收集HSC移植物的实施方案中，将HSC移植物冷冻保存以便留出时间来操作和测试收集的淋巴细胞，例如T细胞。T细胞的非限制性实例包括T辅助性T细胞(例如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh)、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞和细胞毒性淋巴细胞(CTL)。
收集细胞之后，分离淋巴细胞，例如T细胞(步骤120)。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方式从收集的细胞聚集体分离淋巴细胞，例如T细胞。例如，可以通过CD3微珠和MACS分离系统(Miltenyi Biotec)从收集的细胞分离CD3+细胞。据信CD3标记在所有T细胞上表达，并且与T细胞受体相关。据信约70至约80％的人外周血淋巴细胞和约65–85％的胸腺细胞是CD3+。在一些实施方案中，用CD3MicroBeads磁性标记CD3+细胞。然后将细胞悬浮液加载到置于MACS分离器磁场中的MACS柱上。磁性标记的CD3+细胞保留在柱上。未标记的细胞穿过，并且这个细胞级分去除了CD3+细胞。从磁场取出柱之后，磁性保留的CD3+细胞可以作为阳性选择的细胞级分被洗脱。
或者，可以通过IBA生命科学CD62L Fab Streptamer分离试剂盒从收集的细胞分离CD62L+T细胞。通过阳性选择进行人CD62L+T细胞的分离。用磁性CD62L Fab Streptamers标记PBMC。在强磁体中分离标记的细胞，在那里它们向磁体一侧的管壁迁移。收集这种CD62L阳性细胞级分，并且通过在强磁体中添加生物素来从所有标记试剂释放细胞。磁性Streptamers向管壁迁移，并且不含标记的细胞保留在上清液中。通过洗涤去除生物素。所得的细胞制品高度富集CD62L+T细胞，纯度超过90％。不需要去除步骤且不需要柱。
在可选实施方案中，不在步骤120分离淋巴细胞，例如T细胞，而是将步骤110收集的细胞聚集体用于随后的修饰。虽然在一些实施方案中，细胞聚集体可以用于随后的修饰，但是在一些情况下，修饰方法可以是总细胞聚集体内的特定细胞群体特异性的。这可以通过许多方式完成；例如，通过靶向性基因载体递送将遗传修饰靶向特定细胞类型，或者通过将例如抗HPRT shRNA的表达靶向特定细胞类型(即T细胞)。
分离T细胞之后，处理T细胞以降低HPRT活性(步骤130)，即减少HPRT基因的表达。例如，可以处理T细胞，从而它们具有约50％或更少的残留HPRT基因表达，约45％或更少的残留HPRT基因表达，约40％或更少的残留HPRT基因表达，约35％或更少的残留HPRT基因表达，约30％或更少的残留HPRT基因表达，约25％或更少的残留HPRT基因表达，约20％或更少的残留HPRT基因表达，约15％或更少的残留HPRT基因表达，约10％或更少的残留HPRT基因表达，或者约5％或更少的残留HPRT基因表达。
可以根据几种方法修饰淋巴细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，可以通过用表达载体转导来修饰T细胞，例如慢病毒载体，其编码靶向HPRT基因的shRNA，如本文所述。例如，表达载体可以包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。作为另一个实例，表达载体可以包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，表达载体包裹在纳米胶囊内。
或者，可以通过用纳米胶囊转染来修饰淋巴细胞(例如T细胞)，所述纳米胶囊包含适合敲除HPRT的有效载荷，即基因编辑方法可以用来敲除HPRT。例如，如本文所述，可以用靶向HPRT的CRISPR/Cas9 RNP、CRISPR/Cas12a RNP或CRISPR/Cas12b RNP处理T细胞。在一些实施方案中，所述纳米胶囊可以包含与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA。在其他实施方案中，所述纳米胶囊可以包含与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少95％序列相同性的gRNA。
在步骤130修饰T细胞之后，选择和/或扩增HPRT缺陷的T细胞群(步骤140)。在一些实施方案中，培养物可以同时选择和扩增具有增强的植入能力的细胞(例如中枢记忆或T干细胞表型)。在一些实施方案中，培养期少于14天。在一些实施方案中，培养期少于7天。
在一些实施方案中，选择和扩增细胞的步骤包括用鸟苷类似物抗代谢物(如6-硫鸟嘌呤(6TG)、6-巯嘌呤(6-MP)或硫唑嘌呤(azathiopurine，AZA))离体处理HPRT缺陷(或基本上HPRT缺陷)的淋巴细胞(例如T细胞)群。在一些实施方案中，将淋巴细胞(例如T细胞)在6-硫鸟嘌呤(“6TG”)的存在下培养，因此杀死在步骤130未被修饰的细胞。6TG是可以干扰细胞中的dGTP生物合成的鸟嘌呤类似物。可以将Thio-dG在复制期间掺入DNA代替鸟嘌呤，并且当掺入时，通常被甲基化。这种甲基化可以干扰正确的错配DNA修复，并且可以导致细胞周期停滞，和/或启动细胞凋亡。由于其对快速分裂细胞的毒性，6TG已在临床上用来治疗患有某些类型的恶性肿瘤的患者。在6TG的存在下，HPRT是负责将6TG整合至细胞中的DNA和RNA中的酶，导致正确的多核苷酸合成和代谢的阻断(见图18)。在另一方面，补救途径在HPRT缺陷的细胞中被阻断(见图18)。因此细胞使用从头途径进行嘌呤合成(见图17)。但是，在HPRT野生型细胞中，细胞使用补救途径，并且在HPRT的存在下将6TG转化为6TGMP。6TGMP通过磷酸化转化为硫鸟嘌呤二磷酸(TGDP)和硫鸟嘌呤三磷酸(TGTP)。同时，通过酶核糖核苷酸还原酶形成脱氧核糖基类似物。鉴于6TG具有高细胞毒性，其可以用作选择剂以杀死具有功能性HPRT酶的细胞。
然后使产生的HPRT缺陷的细胞与嘌呤类似物离体接触。对于敲低方法，据信在细胞中仍然可能有残留的HPRT，并且HPRT敲低的细胞可以耐受一定范围的嘌呤类似物，但在高剂量/量下会被杀死。在这种情况下，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度为约15μM至约200nM。在一些实施方案中，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度为约10μM至约50nM。在一些实施方案中，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度为约5μM至约50nM。在一些实施方案中，浓度为约2.5μM至约10nM。在其他实施方案中，浓度为约2μM至约5nM。在其他实施方案中，浓度为约1μM至约1nM。
对于敲除方法，据信可以从HPRT敲除的细胞完全消除或几乎完全消除HPRT，并且产生的HPRT缺陷的细胞会对嘌呤类似物高度耐受。在一些实施方案中，在这种情况下用于离体选择的嘌呤类似物的浓度为约200μM至约5nM。在一些实施方案中，在这种情况下用于离体选择的嘌呤类似物的浓度为约100μM至约20nM。在一些实施方案中，浓度为约80μM至约10nM。在其他实施方案中，浓度为约60μM至约10nM。在其他实施方案中，浓度为约40μM至约20nM。
在其他实施方案中，细胞的修饰(例如通过HPRT的敲低或敲除)可以是足够有效的，从而不需要对HPRT缺陷的细胞进行离体选择，即不需要用6TG或其他类似化合物进行选择。
在一些实施方案中，使产生的HPRT缺陷的细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触，别嘌醇是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂。通过抑制XO，更多可用的6TG被HPRT代谢。当6TG被HPRT代谢时，其形成6TGN，这是对细胞有毒的代谢物(6TGN包括单磷酸盐(6TGMP)、二磷酸盐(6-TGDP)和三磷酸盐(6TGTP))(见图14)。(参见，例如，Curkovic et.al.,Low allopurinoldoses are sufficient to optimize azathioprine therapy in inflammatory boweldisease patients with inadequate thiopurine metabolite concentrations.Eur JClin Pharmacol.2013Aug；69(8):1521-31；Gardiner et.al.Allopurinol might improveresponse to azathioprine and 6-mercaptopurine by correcting an unfavorablemetabolite ratio.J Gastroenterol Hepatol.2011Jan；26(1):49-54；Seinen et.al.Theeffect of allopurinol and low-dose thiopurine combination therapy on theactivity of three pivotal thiopurine metabolizing enzymes:results from aprospective pharmacological study.J Crohns Colitis.2013Nov；7(10):812-9；和Wallet.al.Addition of Allopurinol for Altering Thiopurine Metabolism to OptimizeTherapy in Patients with Inflammatory Bowel Disease.Pharmacotherapy.2018Feb；38(2):259-270，其各自的公开内容整体援引加入本文)。
在一些实施方案中，在引入嘌呤类似物之前将别嘌醇引入产生的HPRT缺陷的细胞。在其他实施方案中，在引入嘌呤类似物的同时将别嘌醇引入产生的HPRT缺陷的细胞。在其他实施方案中，在引入嘌呤类似物之后将别嘌醇引入产生的HPRT缺陷的细胞。
选择和扩增之后，测试修饰的淋巴细胞(例如T细胞)产品。在一些实施方案中，根据标准释放测试来测试修饰的淋巴细胞(例如T细胞)产品(例如活性、支原体、活力、稳定性、表型等；参见Molecular Therapy:Methods&Clinical Development Vol.4 March 201792-101，其公开内容整体援引加入本文)。
在其他实施方案中，测试修饰的淋巴细胞(例如T细胞)产品对二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)的敏感性。据信包括MTX和MPA的二氢叶酸还原酶抑制剂抑制嘌呤的从头合成，但是具有不同的作用机制。例如，据信MTX竞争性地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，这是一种参与四氢叶酸(THF)合成的酶。DHFR催化二氢叶酸转化为活性四氢叶酸。DNA合成所需的核苷胸苷的从头合成需要叶酸。而且，叶酸盐是嘌呤和嘧啶碱基生物合成所必需的，因此合成会受到抑制。麦考酚酸(MPA)是肌苷-5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)的有效、可逆、非竞争性的抑制剂，肌苷-5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)是从肌苷-5'-单磷酸(IMP)从头合成鸟苷-5'-单磷酸(GMP)所必需的酶。
因此包括MTX或MPA的二氢叶酸还原酶抑制剂抑制DNA、RNA、胸苷酸和蛋白的合成。MTX或MPA通过抑制DHFR来阻断从头途径。在HPRT-/-细胞中，没有补救或从头途径功能，导致没有嘌呤合成，因此细胞死亡。但是，HPRT野生型细胞具有功能性补救途径，它们的嘌呤合成发生，并且细胞存活。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞(例如T细胞)是基本上HPRT缺陷的。在一些实施方案中，至少约70％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约75％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约80％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约85％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在其他实施方案中，至少约90％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在其他实施方案中，至少约95％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。在其他实施方案中，至少约97％的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群体对MTX或MPA敏感。
在一些实施方案中，可选试剂可以用于代替MTX或MPA，包括但不限于利巴韦林(ribavarin)(IMPDH抑制剂)；VX-497(IMPDH抑制剂)(参见Jain J,VX-497:a novel,selective IMPDH inhibitor and immunosuppressive agent,J Pharm Sci.2001 May；90(5):625-37)；洛美曲索(lometrexol)(DDATHF,LY249543)(GAR和/或AICAR抑制剂)；噻吩类似物(LY254155)(GAR和/或AICAR抑制剂)，呋喃类似物(LY222306)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Habeck et al.,A Novel Class of Monoglutamated Antifolates ExhibitsTight-binding Inhibition of Human Glycinamide RibonucleotideFormyltransferase and Potent Activity against Solid Tumors,Cancer Research54,1021-2026,Feb.1994)；DACTHF(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Cheng et.al.Design,synthesis,and biological evaluation of 10-methanesulfonyl-DDACTHF,10-methanesulfonyl-5-DACTHF,and 10-methylthio-DDACTHF as potent inhibitors ofGAR Tfase and the de novo purine biosynthetic pathway；Bioorg Med Chem.2005May16；13(10):3577-85)；AG2034(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Boritzki et.al.AG2034:anovel inhibitor of glycinamide ribonucleotide formyltransferase,Invest NewDrugs.1996；14(3):295-303)；LY309887(GAR和/或AICAR抑制剂)((2S)-2-[[5-[2-[(6R)-2-氨基-4-氧代-5,6,7,8-四氢-1H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]乙基]噻吩-2-羰基]氨基]戊二酸)；力比泰(alimta)(LY231514)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Shih et.al.LY231514,apyrrolo[2,3-d]pyrimidine-based antifolate that inhibits multiple folate-requiring enzymes,Cancer Res.1997Mar 15；57(6):1116-23)；dmAMT(GAR和/或AICAR抑制剂)，AG2009(GAR和/或AICAR抑制剂)；呋咯地辛(Immucillin H，BCX-1777；商品名Mundesine和Fodosine)(嘌呤核苷磷酸化酶[PNP]的抑制剂)(参见Kicska et.al.,Immucillin H,a powerful transition-state analog inhibitor of purinenucleoside phosphorylase,selectively inhibits human T lymphocytes(T-cells),PNAS April 10,2001.98(8)4593-4598)；以及immucillin-G(嘌呤核苷磷酸化酶[PNP]的抑制剂)。
鉴于根据步骤110至140产生的修饰的T细胞对MTX或MPA的敏感性，MTX或MPA(或另一种二氢叶酸还原酶抑制剂)可以用来选择性地消除HPRT缺陷的细胞，如本文所述。在一些实施方案中，MTX或MPA的类似物或衍生物可以取代MTX或MPA。美国专利申请号5,958,928和PCT公开号WO/2007/098089中描述了MTX的衍生物，其公开内容整体援引加入本文。
治疗方法
在一些实施方案中，将根据步骤110-140制备的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)给药至患者(步骤150)。在一些实施方案中，在单次给药中(例如单次推注，或在设定的时间段内给药，例如在约1-4小时或更长时间内输注)向患者提供修饰的淋巴细胞，例如T细胞(或如本文所述的CAR T细胞或TCR T细胞)。在其他实施方案中，进行修饰的淋巴细胞(例如T细胞)的多次给药。如果给药多个剂量的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)，每个剂量可以相同或不同(例如递增剂量、递减剂量)。
在一些实施方案中，基于CD3阳性T细胞含量/kg受试者体重确定修饰的T细胞的剂量的量。在一些实施方案中，修饰的T细胞的总剂量为约0.1x106/kg体重至约730x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的总剂量为约1x106/kg体重至约500x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的总剂量为约1x106/kg体重至约400x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的总剂量为约1x106/kg体重至约300x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的总剂量为约1x106/kg体重至约200x106/kg体重。
当提供多剂量时，剂量给药的频率可以为约1周至约36周。同样地，当提供多剂量时，修饰的T细胞的每个剂量为约0.1x106/kg体重至约240x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的每个剂量为约0.1x106/kg体重至约180x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的每个剂量为约0.1x106/kg体重至约140x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的每个剂量为约0.1x106/kg体重至约100x106/kg体重。在其他实施方案中，修饰的T细胞的每个剂量为约0.1x106/kg体重至约60x106/kg体重。Gozdzik J et al.,Adoptivetherapy with donor lymphocyte infusion after allogenic hematopoietic SCT inpediatric patients,Bone Marrow Transplant,2015Jan；50(1):51-5)描述了其他剂量给药策略，其公开内容整体援引加入本文。
修饰的淋巴细胞(例如T细胞)可以单独给药或作为整体治疗策略的一部分给药。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞(例如T细胞)可以在HSC移植之后给药，如HSC移植之后约2至约4周。例如，在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞(例如T细胞)可以在进行HSC移植之后给药以防止或减轻移植后免疫缺陷。据信修饰的淋巴细胞(例如T细胞)可以提供短期(例如约3至约9个月)免疫重建和/或保护。作为另一实例，并且在其他实施方案中，将修饰的淋巴细胞(例如T细胞)作为癌症治疗的一部分给药以帮助诱导移植物抗恶性肿瘤(GVM)效应或移植物抗肿瘤(GVT)效应。作为另一实例，修饰的T细胞是CAR-T细胞或TCR修饰的T细胞，其是HPRT缺陷的，并且作为癌症治疗策略的一部分进行给药。在本文中更详细地描述了根据这些治疗途径中的每一种给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞。当然，技术人员会理解对任何潜在疾病状况的其他治疗可以发生在给药修饰的淋巴细胞(例如T细胞)之前、之后或同时进行。
向患者给药淋巴细胞(例如T细胞)可能导致不需要的副作用，包括本文列举的那些。例如，移植物抗宿主病可能在用淋巴细胞(包括修饰的T细胞(例如通过HPRT的敲低或敲除))治疗患者之后发生。在本公开的一些方面，给药修饰的淋巴细胞(例如T细胞)之后，在步骤150，监测患者的任何副作用的发生，包括但不限于GvHD。如果出现任何副作用，如GvHD(或GvHD的症状)，在步骤160向患者(体内)给药MTX或MPA以去除至少一部分修饰的淋巴细胞(例如T细胞)，力图抑制、减少、控制或减轻副作用，例如GvHD。在一些实施方案中，在单一剂量中给药MTX或MPA。在其他实施方案中，给药多剂量的MTX和/或MPA。
据信本公开的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)(一旦离体选择并给药至患者或哺乳动物受试者)，鉴于它们对二氢叶酸还原酶抑制剂(包括MTX或MPA)的敏感性，可以用作可调节的“开”/“关”开关。可调节开关允许通过向出现任何副作用的患者给药MTX来在体内选择性地杀死至少一部分修饰的淋巴细胞(例如T细胞)，以便调节免疫系统重建。可以通过在MTX给药之后向患者给药进一步修饰的淋巴细胞(例如T细胞)来进一步调节这种可调节开关，以允许在副作用减少或减轻之后进一步的免疫系统重建。同样地，可调节开关允许如果出现任何副作用，通过给药MTX来在体内选择性地杀死至少一部分修饰的淋巴细胞(例如T细胞)，以便调节移植物抗恶性肿瘤效应。再次，一旦副作用减少或减轻，可以通过随后向患者剂量给药进一步等分试样的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)来微调GVM效应。这种相同原理应用于CAR-T细胞疗法或用TCR修饰的T细胞的疗法，其中再次可以通过MTX给药将CAR-T细胞或TCR修饰的T细胞选择性地打开/关闭。有鉴于此，本领域普通技术人员会理解任何监督患者治疗的医学专业人员都可以平衡免疫系统重建和/或GVM效应，同时避免副作用或将副作用保持在可容忍或可接受的范围内。由于以上所述，可以增强患者治疗，同时减轻副作用。
在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约100mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约90mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约80mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约70mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约60mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约50mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约40mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约30mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约20mg/m2/输注至约20mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约10mg/m2/输注。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约8mg/m2/输注。在其他实施方案中，给药的MTX量为约2.5mg/m2/输注至约7.5mg/m2/输注。在其他实施方案中，给药的MTX量为约5mg/m2/输注。在其他实施方案中，给药的MTX量为约7.5mg/m2/输注。
在一些实施方案中，进行2-6次输注，并且每次输注可以包含相同剂量或不同剂量(例如递增剂量、递减剂量等)。在一些实施方案中，给药可以每周或每两个月进行一次。
在其他实施方案中，滴定给药的MTX的量，从而解决不受控制的副作用，例如GvHD，同时保留至少一些修饰的淋巴细胞(例如T细胞)，以及它们在重建免疫系统、靶向癌症或诱导GVM效应方面的伴随效应。在这方面，据信仍然可以识别修饰的淋巴细胞(例如T细胞)的至少一些益处，同时缓解副作用，例如GvHD。在一些实施方案中，用MTX治疗之后，即解决、抑制或控制副作用，例如GvHD之后，给药额外的修饰的淋巴细胞，例如T细胞。
在一些实施方案中，受试者在给药修饰的淋巴细胞(例如T细胞)之前接收一定剂量的MTX，以便控制或预防HSC移植后的副作用。在一些实施方案中，在给药修饰的淋巴细胞(例如T细胞)之前停止现有的MTX治疗，然后在用修饰的淋巴细胞(例如T细胞)之后出现副作用时，以相同或不同剂量(并且使用相同或不同剂量给药方案)继续。在这方面，技术人员可以根据需要并与医疗行业已知的护理标准一致地给药MTX。
额外的治疗策略
图19说明在症状发生时减少、抑制或控制GvHD的一种方法。最初，在步骤210从供体收集细胞。可以从提供HSC用于移植的同一供体(见步骤260)或不同供体收集细胞。然后从收集的细胞分离淋巴细胞(步骤220)并进行处理，从而它们变成HPRT缺陷的(步骤230)(即通过HPRT的敲低或敲除)。处理分离的细胞的方法如本文所示。为了达到基本上HPRT缺陷的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群，将处理的细胞阳性选择并扩增(步骤240)，如本文所述。然后将修饰的淋巴细胞(例如T细胞)储存以备后用。在接受HSC移植物(步骤260)之前，按照护理标准对患者进行清髓性调理(步骤250)(例如高剂量调理辐射、化疗和/或用嘌呤类似物治疗；或者低剂量调理辐射、化疗和/或用嘌呤类似物治疗)。在一些实施方案中，在用调理方案治疗后约24和约96小时之间用HSC移植物治疗患者(步骤260)。
图20说明在症状发生时减少、抑制或控制GvHD的一种方法。最初，在步骤310从供体收集细胞。可以从提供HSC用于移植的同一供体(见步骤335)或不同供体收集细胞。然后从收集的细胞分离淋巴细胞(步骤320)并进行处理，从而它们变成HPRT缺陷的(步骤330)。处理分离的细胞的方法如本文所示。为了达到基本上HPRT缺陷的修饰的淋巴细胞(例如T细胞)群，选择处理的细胞并扩增(步骤340)，如本文所述。然后将修饰的淋巴细胞(例如T细胞)储存以备后用。可以在癌症出现和分期时根据患者可用的护理标准治疗患有癌症(例如血液癌症)的患者(例如辐射和/或化疗，包括生物制剂)(步骤315)。患者还可以是HSC移植的候选者，并且如果是，则实施调理方案(步骤325)(例如通过高剂量调理辐射或化疗)。据信对于恶性肿瘤，在一些实施方案中，人们希望完全“清除”血液系统，或尽可能接近完全，因此杀死尽可能多的恶性细胞。这种调理方案的目标是集中治疗癌细胞，从而降低癌症复发的可能性，灭活免疫系统以减少干细胞移植排斥的可能性，并且使供体细胞能够进入骨髓。在一些实施方案中，调理包括给药环磷酰胺、阿糖胞苷(AraC)、依托泊苷、美法仑、白消安或高剂量全身辐射中的一种或多种。然后用同种异体HSC移植物治疗患者(步骤335)。在一些实施方案中，同种异体HSC移植物诱导至少一部分GVM、GVT或GVL效应。移植之后，监测患者(步骤350)的残留或复发疾病。如果这种残留或复发疾病本身出现，则向患者给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞(在步骤340制备)(步骤360)，从而可以诱导GVM、GVT或GVT效应。修饰的淋巴细胞(例如T细胞)可以在几次给药的疗程中的单次给药中输注。在一些实施方案中，在HSC移植后约1天和约21天之间给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，在HSC移植后约1天和约14天之间给药修饰的T细胞。在一些实施方案中，在HSC移植后约1天和约7天之间给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，在HSC移植后约2天和约4天之间给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，与HSC移植同时或在HSC移植的几小时内(例如HSC移植后1、2、3或4小时)给药修饰的淋巴细胞，例如T细胞。
本公开的另一方面是一种通过向有需要的患者给药修饰的CAR T细胞来治疗患有癌症的患者的方法，所述修饰的CAR T细胞是HPRT缺陷的。图21说明治疗患有癌症的患者并且随后减少、抑制或控制任何有害副作用的一种方法。最初，在步骤410从供体收集细胞。然后从收集的细胞分离淋巴细胞(步骤420)并进行修饰以提供HPRT缺陷的CAR T细胞。
实施例
实施例1–使用6TG选择的HPRT敲低比敲除
在第零天(0)，将K562细胞用表达载体转导，所述表达载体包括设计为敲低HPRT的核酸序列和编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列(MOI＝1/2/5)；或者用纳米胶囊转染，所述纳米胶囊包含CRISPR/Cas9和用于敲除HPRT的sgRNA(100ng/5x104个细胞)。从第3天至第14天将6TG添加至培养基中。每3-4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且用T7E1测定分析InDel％。图12A说明在6TG处理下，转导的K562细胞的GFP+群体从第3天增加至第14天；而GFP+群体在没有处理的情况下几乎稳定。图12B说明在6TG处理下，K562细胞的HPRT敲除群体从第3天增加至第14天，并且与300/600nM的6TG剂量相比，更高剂量(900nM)的6TG导致更快的选择。应当注意在相同浓度的300nM的6TG下，从第3天至第14天，与HPRT敲低细胞(MOI＝1)相比，在HPRT敲除细胞上6TG选择过程发生得更快。敲低和敲除之间的差异可以由与通过敲除方法完全消除HPRT相比，通过RNAi敲低方法的一些水平的残留HPRT来解释(还参见图22)。因此，与HPRT敲低细胞相比，据信HPRT敲除细胞对6TG具有更高的耐受性，并且据信在更高剂量的6TG(900nM)下生长得更快。
在第0天，将CEM细胞用表达载体转导，所述表达载体包括设计为敲低HPRT的核酸序列和编码绿色荧光蛋白的核酸序列，或者用纳米胶囊转染，所述纳米胶囊包含CRISPR/Cas9和HPRT的sgRNA。从第3天至第17天将6TG添加至培养基中。每3-4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且通过T7E1测定分析InDel％。图13A说明在6TG处理下，转导的K562细胞的GFP+群体从第3天增加至第17天；而GFP+群体几乎稳定无增加。图13B说明在6TG处理下，CEM细胞的HPRT敲除群体从第3天增加至第17天，并且与300/600nM的6TG剂量相比，更高剂量(900nM)的6TG导致更快的选择。应当注意在相同浓度的6TG下，从第3天至第17天，6TG选择过程在HPRT敲除细胞上发生得比HPRT敲低细胞(MOI＝1)更快。
实施例2–用MTX或MPA进行负选择
从第0天至第14天，在有或没有MTX的情况下培养转导或转染的K562细胞(如来自实施例1的那些细胞)。每3-4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且通过T7E1测定分析插入缺失％(InDel％)。图14A显示在0.3μM的MTX处理下，转导的K562细胞的GFP-群体减少。在另一方面，细胞群体在没有MTX的情况下是稳定的。图14B说明与HPRT敲低群体相比，在0.3μM的MTX处理下以更快速度消除转染的K562细胞。
从第0天至第14天，在有或没有MTX的情况下培养转导或转染的CEM细胞(如来自实施例1的那些细胞)。每3-4天更新培养基。在流动机器上分析GFP，并且通过T7E1测定分析InDel％。图15A显示在1μM的MPA或0.3μM的MTX或10μM的MPA的处理下，转导的K562的GFP-群体减少，而未处理组的细胞群体稳定。图15B说明在1μM的MPA或0.3μM的MTX或10μM的MPA的处理下，以更快速度消除CEM细胞的HPRT敲除群体。
实施例3–用MTX对K562细胞进行负选择
将K562细胞用(i)稀释因子为16的TL20cw-GFP病毒汤，(ii)稀释因子为16的TL20cw-Ubc/GFP-7SK/sh734病毒汤(其顺序编码GFP和设计为敲低HPRT)；或(iii)稀释因子为16的TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP病毒汤(其顺序编码设计为敲低HPRT的shRNA和GFP)转导(见图16)。还通过稀释因子为1024的TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP病毒汤(编码核酸的一种，所述核酸编码设计为敲低HPRT的shRNA)转导K562细胞(还在图16中示出)。转导后3天，用包含0.3μM的MTX 3的培养基培养所有细胞。如图16说明的，从大于90％的GFP+群体开始，GFP或GFP-sh734转导的细胞没有表现出GFP+群体的减少，而sh734-GFP转导的细胞表现出GFP+群体的取消选择(在高稀释(1024)和低稀释(16)水平下)。测量sh734-GFP转导的细胞和GFP-sh734转导的细胞的每个载体拷贝数(VCN)的相对sh734表达。结果表明甲氨蝶呤只可以取消选择用sh734-高表达慢病毒载体(TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP)而不是用sh734-低表达慢病毒载体(TL20cw-UBC/GFP-7SK/sh734)转导的细胞。这个实施例证实不同的载体设计(甚至具有相同shRNA的那些)对shRNA发夹的表达有影响，并且可以用来确定是否可以通过MTX处理来选择转导的细胞。
实施例4–修饰的T细胞的转染/转导、选择和扩增
使用源自散装血沉棕黄包(bulk buffy pack)(澳大利亚红十字血液服务)的外周血单个核细胞(PBMC)进行原代人T细胞纯化，允许富集足够数量的T细胞用于下游应用。将剩余的细胞冷冻保存用于未来的T细胞功能分析，如对同种异体抗原反应的T细胞增殖的评价。在体外用固定的抗CD3和重组人(rh)IL-2刺激纯化的T细胞(按照目前公布的方案REF)48小时，然后用慢病毒转导，或者用包含DNA的纳米颗粒转染，用于HPRT基因的修饰。培养这些修饰的T细胞(2-3天)，然后在rhIL-2的存在下进一步扩增达14天。在整个培养条件下，采集样品用于评价已成功经历基因修饰的细胞的比例，如通过检测荧光示踪剂(例如GFP)以及用于检测HPRT基因表达水平的定量RT-PCR(qPCR)确定的。
在基因修饰后14天，使用6-硫鸟嘌呤(6TG)进行基因修饰的T细胞的选择以评价负选择所有未修饰的T细胞所需要的剂量。6TG剂量的滴定还允许评价对这种选择方法的潜在供体依赖性敏感性，以及这可能如何与已知的对嘌呤类似物的TPMT基因型依赖性敏感性相关。6TG剂量滴定的研究还用来评价基于shRNA表达水平的剂量-窗口可变性的可能性。选择之后用各种细胞因子组合(IL-2/IL-7/IL-15/IL-21)的选择来扩增修饰的T细胞。最后通过使用甲氨蝶呤测试扩增的T细胞群对“杀伤开关”激活的敏感性。
实施例5–修饰的原代人T细胞的功能评价
利用体外方法评价修饰的T细胞的功能能力以了解基因修饰和培养条件的潜在后果。表型分析培养物内的T细胞亚型比例，包括评价幼稚T细胞、效应T细胞亚型、记忆T细胞亚型、调节性T细胞等，并且包括细胞表面T细胞标记如CD3/CD4/CD8/CD25/CD27/CD28/CD45RA/RO/CD56/CD62L/CD127或FoxP3和CD44)。还利用流式细胞术评价作为延长培养条件的结果的T细胞耗竭的潜在发展。利用T细胞增殖和细胞因子释放测定评价基因修饰的T细胞与病毒肽反应的功能能力。据信这种对来自病毒如埃巴病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的病毒肽的功能性反应特别相关，因为这些是在免疫抑制的背景下重新激活的主要病毒，并且与诊所中的患者相关。
最后，利用体外增殖测定评价每个供体修饰的T细胞培养物对冷冻保存的单倍相同的供体PBMC的同种异体反应性(并进行基因分型)。这设计为模拟和测量移植背景下的潜在同种异体反应性。在这种背景下还可能评价基因修饰的T细胞池内调节性T细胞区室的功能能力。
实施例6–甲氨蝶呤剂量给药后“残留”基因修饰的T细胞群的表型和功能表征
对诱导杀伤开关以及消除疾病状况(如GvHD或CRS)后受者内存在的剩余基因修饰的细胞的能力的理解是基因修饰的细胞以适当数量和相关功能扩增和重建的能力。因此，理解随后有适当的可扩增能力和功能活性的供体细胞去除的最低阈值水平是重要的。第三方进行的临床试验表明杀伤开关激活导致在2小时内体内供体T细胞>99％去除，并且在24-48小时内GvHD和CRS的症状消除。此外，受者中剩余的<1％的修饰的细胞能够重新扩增而不导致GvHD或CRS的重新激活。假设杀伤开关的激活导致活跃扩增的供体同种异体反应性T细胞优先死亡，因此导致可能引起GvHD/CRS复发的T细胞库去除。重新扩增的细胞的离体分析表明，剩余的库能够识别病毒抗原并对其作出反应，表明受者不会免疫受损。此外，这些试验中的受者在100天内保持无病状态，在此有限的随访期之后尚无数据可用。最后，如果由于供体细胞相关的并发症而需要在以后去除这些细胞，则会确定残留/重新扩增的群体是否在第二轮时仍然容易受到杀伤开关诱导的影响。
实施例7–小鼠模型中的体内概念验证研究
进行动物研究以探索修饰的T细胞在GvHD抗性和GvHD敏感的人源化NSG小鼠中的体内行为和特性。初始研究旨在评价修饰的T细胞中的T细胞植入和MTX诱导的“杀伤开关”功能。这些研究会在GvHD抗性小鼠中进行。后续研究旨在建立GvHD的小鼠模型，提供临床相关的体内环境，在其中测试“杀伤开关”。随着对T细胞剂量、分布和功能的清楚理解，连同对MTX响应性的理解，在接受白血病攻击的GvHD敏感小鼠中进行体内POC研究。将显示可以通过触发MTX“杀伤开关”来操纵修饰的T细胞以最小化GvHD，同时保持发动GVT反应的能力。
实施例8–理解T细胞剂量、植入、分布、存活和甲氨蝶呤敏感性
用不同剂量的修饰的T细胞移植MHC KO NSG小鼠(GvHD抗性的)，以便建立用于持续植入的最佳T细胞剂量。在不同的时间点，分析T细胞在淋巴和非淋巴器官中的分布。
使用如本文所述确定的最佳T细胞剂量(i)，在植入之后用不同剂量的甲氨蝶呤处理小鼠24-48小时。在设计为理解消除修饰的T细胞的速度有多快的分析时间-过程中确定淋巴和非淋巴器官中剩余T细胞的数量。
开始平行研究以探索修饰的T细胞移植物的寿命和这些T细胞随时间的MTX敏感性。使接受最佳剂量的修饰的T细胞的小鼠变老6个月，然后触发MTX诱导的“杀伤开关”。在以前确定的最佳分析时间确定淋巴和非淋巴器官中剩余T细胞的数量。将显示在稍后的时间点触发时，修饰的T细胞对MTX“杀伤开关”的反应有多好，如迟发性急性或慢性GvHD中的情况。
实施例9–GvHD小鼠模型的建立和表征以及修饰的T细胞移植物的分析
为了启动GvHD，在调理后2-24h内用最佳剂量的修饰的T细胞移植辐射调理的NSG小鼠。根据已发表的文献，在这些小鼠中在大约第25天GvHD发展(监测的身体姿势、活动、毛皮和皮肤状况以及体重减轻)，在～第55天达到疾病终点(>20％体重减轻，具有GvHD的临床症状)。如果疾病进展显著更慢或更具侵袭性，则可以分别测试高于或低于最佳剂量(基于文献，约106-107个T细胞)的T细胞剂量。
用优化的T细胞剂量和疾病动力学，将在时间-过程分析中探索T细胞植入。不同器官的T细胞接种是GvHD的特征，并且这将在我们的模型中进行探索。通过观察到的GvHD的发生和严重程度会确定时间过程分析时间点。
当在淋巴器官中可清楚地检测到修饰的T细胞时，分析T细胞(CD4+和CD8+)功能性。用各种刺激物(例如PMA、CD3/CD28)体外刺激T细胞，并且分析表型、增殖、细胞因子产生和离体抗肿瘤细胞毒性。特别分析T细胞对病毒肽如CMV、EBV&FLU(Proimmune ProMix CEF肽池)的反应能力，作为它们对潜伏病毒重新激活反应能力的度量。
实施例10–GvHD模型中甲氨蝶呤-诱导“杀伤开关”的激活
按照先前确定的最佳条件辐射NSG小鼠并用修饰的T细胞移植。在GvHD的急性期或慢性期，向小鼠给药不同剂量的MTX，包括最佳剂量。每周确定外周血中修饰的T细胞的百分比直至实验结束。监测GvHD发展以证明是否可以从发展进行性疾病中拯救小鼠。对修饰的T细胞在各种器官中的浸润进行定量，以在系统水平理解GvHD的严重程度。
实施例11–GVT/GvHD小鼠模型中修饰的T细胞POC
按照先前确定的最佳条件辐射NSG小鼠并用修饰的T细胞移植。辐射后24内，小鼠会接受一个剂量的P815 H2-Kd细胞系以建立白血病。预先转导P815细胞以表达GFP用于体内生物分布和肿瘤生长的评价。在GvHD发生时，用最佳剂量的MTX治疗小鼠，并且监测疾病进展以及白血病负荷直至实验结束。
实施例12–HPRT敲除向导RNA
图23和下表示出各种向导RNA，检测它们的在靶和脱靶效应。将“IDT-4”(SEQ IDNO:36)选作先导gRNA用于其余的敲除实验，如本文描述的那些。SEQ ID NO:39(“NatPaper”)源自Yoshioka,S.et al.(2016).Development of a mono-promoter-drivenCRISPR/Cas9 system in mammalian cells.Scientific Reports,5,18341，其公开内容整体援引加入本文。
<u>SEQ ID NO:</u> <u>名称</u> <u>核苷酸序列</u>
33 IN-1 ATTATGCTGAGGATTTGGAA
34 IDT-1 GATGATCTCTCTCAACTTTAAC
35 IDT-6 CATACCTAATCATTATGCTG
36 IDT-4 GGTTATGACCTTGATTTATT
37 IDT-2 CATGGACTAATTATGGACAG
38 IDT-3 TAGCCCTCTGTGTGCTCAAG
27 Cl-gRNA3 CGTGACGTAAAGCCGAACCC
26 Cl-gRNA2 GCGGGTCGCCATAACGGAGC
25 Cl-gRNA1 GTTATGGCGACCCGCAGCCC
39 Nat Paper GCCCTGGCCGGTTCAGGCCCACG
实施例13–HPRT靶向敲除对6-TG的抗性
方法
将Jurkat细胞用包含向导RNA(gRNA；GS-4；指定为IDT-4)以及Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合物电穿孔。使用荧光激活细胞分选(FACS)纯化证实通过tracr RNA用gRNA转染的细胞，随后培养72小时。然后向转导的培养细胞给药增加浓度的6-硫鸟嘌呤(6-TG)以评价抗性。将野生型(未修饰的)Jurkat细胞用作对照。
结果
发光(ATP检测)用来评价细胞活力。IDT-4修饰的细胞证实对于增加剂量的6-TG(测试达10uM)的抗性。未修饰的Jurkat细胞(野生型)显示随着6-TG的浓度增加，细胞活力降低(见图24)。
还使用蛋白印迹分析未修饰的(WT)和IDT-4修饰的Jurkat细胞的HPRT蛋白(见图25)。未修饰的Jurkat细胞(WT)显示可检测水平的预期大小(25kDA)的HPRT，而IDT-4修饰的细胞具有不可检测水平的HPRT。肌动蛋白检测(下图)用作蛋白上样对照。
实施例14–长期细胞活力/存活
方法
将HPRT敲除Jurkat细胞(用向导RNA IDT-4修饰；如实施例1所述；指定为HPRT-/-)与修饰为单独表达GFP(WT GFP)的Jurkat细胞以大约相等的比例混合在一起。
将细胞在标准培养条件下培养18天，然后重新评价培养物中GFP+细胞的比例。
结果
在第18天，细胞的GFP比例基本上与第1天相似(见图26)，GFP+野生型细胞的起始比例随时间没有显著变化(见图27)，表明缺乏HPRT蛋白的细胞没有存活优势或劣势。这进一步证实在6-TG的存在下修饰的细胞的存活优势是由于不存在活性HPRT酶。
实施例15–HPRT敲除Jurkat细胞-甲氨蝶呤敏感性
方法和结果
(A)MTX剂量反应
将Jurkat细胞(未修饰的；WT)用增加浓度的甲氨蝶呤(MTX)培养以确定杀死WT细胞所需要的MTX剂量窗口(见图28)。选择0.00625-0.025μM MTX的剂量用于HPRT敲除(IDT-4修饰的)Jurkat细胞的后续评价。
(B)HPRT敲除MTX剂量反应
将HPRT敲除(IDT-4修饰的)Jurkat细胞对MTX的剂量反应与未修饰的Jurkat细胞(WT)进行比较以确定对MTX的敏感性(见图29)。当培养5天时，与野生型细胞相比，HPRT敲除(IDT-4修饰的)Jurkat细胞证实对浓度为0.00625和0.0125μM的MTX的敏感性增加。
实施例16–HPRT敲低Jurkat细胞
方法
将Jurkat T细胞用慢病毒载体(A)TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP或(B)TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734修饰。使用1ml未稀释的包含病毒的培养基(VCM)连同8ng/ml的聚凝胺，通过在室温下以2,500rpm离心90分钟，然后在37℃下孵育60分钟，用各自的慢病毒载体转导Jurkat细胞。在转导和去除VCM后将细胞培养4天，之后利用流式细胞术确定转导效率(GFP阳性细胞)。
结果
Jurkat细胞在旋转接种后第4天证实高转导效率，sh734-GFP(见图30A)在第4天导致76.2％GFP+细胞，而GFP-sh734病毒(见图30B)导致77.2％GFP+细胞。将修饰的Jurkat细胞置于6-TG选择(10uM，基于先前评价野生型未修饰的Jurkat细胞对6-TG的敏感性而产生的数据)下3天。选择方案导致每个修饰的细胞系增加至87％(见图30A)和90％(见图30B)GFP+细胞，表明未修饰的细胞的死亡和包含sh734的细胞的存活率提高。
实施例17–HPRT敲低CEMT细胞
方法
将CEM T细胞用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP(sh734-GFP)和TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734(GFP-sh734)修饰。
用1ml未稀释的包含病毒的培养基(VCM)连同10ng/ml聚凝胺，通过在室温下以2,500rpm离心90分钟，然后在37℃下孵育60分钟，旋转感染CEM细胞。4天之后通过流式细胞术确定GFP+细胞的比例。转导效率相对较低。
用5uM 6-TG对修饰的CEM细胞进行6-TG选择，总共17天。通过6-TG成功选择包含sh734的细胞，在sh734-GFP的情况下增加至28.8％GFP+，在GFP-sh734的情况下增加至42.4％GFP+，表明这些细胞具有超过非转导细胞的存活优势(见图31)。
实施例18–载体产生–HPRT敲低
通过将包含7SK/sh734的表达盒插入pTL20cw载体来制备候选载体(参见，例如，图32)。具体地，产生下表中列出的包含短发夹的载体。
<u>载体</u> <u>7SK/sh734的相对位置/方向</u>
TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP 上游/正向
TL20cw-r7SK/sh734-UbC/GFP 上游/反向
TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734 下游/正向
TL20cw-UbC/GFP-r7SK/sh734 下游/反向
实施例19–转导/转染
将K562或Jurkat细胞用载体转导，所述载体包括设计为敲低HPRT的核酸序列和编码绿色荧光蛋白(GFP)的核酸序列(MOI为0.1-5)；或者用纳米胶囊转染，所述纳米胶囊包含CRISPR/Cas9和HPRT的sgRNA(100ng/5x104个细胞)。
实施例20–HPRT的敲低和6TG抗性
在转导/转染后第3或4天，将6-TG储备溶液添加至包含转导/转染的K562或Jurkat细胞的培养基中。直至第14天或更长时间，将6-TG维持在最终浓度，例如对于K562细胞为300nM，而对于Jurkat细胞为2.5uM。每3-4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，通过VCNddPCR测定分析VCN，并且用T7E1测定分析InDel％。在下表中提供图33中的结果。
Figure BDA0003211676790000641
额外的实施方案
第一个额外的实施方案是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生HPRT缺陷的淋巴细胞；离体阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向患者给药HSC移植物；给药HSC移植物之后向患者给药修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药甲氨蝶呤(MTX)。在一些实施方案中，治疗的患者受益于接受T细胞以对抗感染，支持移植和防止疾病复发。此外，如果发生GvHD，可以通过给药一个或多个剂量的MTX来去除T细胞。
在一些实施方案中，通过敲除HPRT基因产生HPRT缺陷的淋巴细胞，如通过用纳米胶囊群转染淋巴细胞，所述纳米胶囊包含适合敲除HPRT的有效载荷(例如包括具有SEQ IDNO:25–39中任一个的序列的向导RNA的有效载荷)。在其他实施方案中，通过敲低HPRT基因产生HPRT缺陷的淋巴细胞，如通过用表达载体转导淋巴细胞，所述表达载体包括编码RNA干扰剂的核酸序列(例如编码具有SEQ ID NO:1、2和5–11中任一个的序列的shRNA的核酸)。在一些实施方案中，阳性选择包括使产生的HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物(例如6-硫鸟嘌呤(6TG)、6-巯嘌呤(6-MP)或硫唑嘌呤(AZA))接触。在一些实施方案中，阳性选择包括使产生的HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和第二物质(例如别嘌醇)接触。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物是6TG。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。在一些实施方案中，修饰的淋巴细胞以多剂量给药。在一些实施方案中，每个剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。在一些实施方案中，在GvHD的诊断后任选地给药MTX。在一些实施方案中，给药的MTX量为约2mg/m2/输注至约8mg/m2/输注。在一些实施方案中，以滴定的剂量给药MTX。
据信本公开的方法通过修饰编码促进嘌呤再循环的酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的基因来利用嘌呤补救途径。通过基因敲除或基因敲低抑制HPRT表达使得修饰的细胞仅依赖于从头嘌呤生物合成途径存活。在未修饰的细胞中，通过HPRT转化的嘌呤类似物6-硫鸟嘌呤(6TG)的递送最终导致6-硫鸟嘌呤核苷酸(6TGN)的积累，其通过几种机制对细胞有毒，包括在S-期掺入DNA。在基因修饰的细胞中抑制HPRT酶并随后用6TG(一种已用于治疗各种白血病以及严重炎性疾病的药物)治疗为这些细胞提供优于未修饰的细胞的存活优势，因此是在体外和可能在体内选择修饰的细胞的机制。此外，在这些HPRT酶缺陷的细胞中抑制从头嘌呤生物合成途径，如用甲氨蝶呤(MTX)，导致细胞凋亡(由于同样无功能的嘌呤补救途径)，从而提高一种机制，通过这种机制，另一批准的药物在修饰的细胞中可以用作“杀伤开关”诱导剂。
第二个额外的实施方案是一种组合物，其包括减少或消除造血干细胞(“HSC”)中的HPRT表达的组分。在一些实施方案中，所述HSC是淋巴样细胞。在一些实施方案中，所述淋巴样细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含实现HPRT基因敲低的第一组分。在其他实施方案中，所述组合物包含实现HPRT基因敲除的第一组分。在一些实施方案中，所述组合物包括慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体包括编码适合敲低HPRT基因的物质(例如RNA干扰剂(RNAi))的第一核酸。在一些实施方案中，可以将所述慢病毒表达载体掺入纳米胶囊内，如适合靶向HSC的纳米胶囊。
第三个额外的实施方案是一种表达载体，其包含编码RNAi的核酸序列以实现HPRT的敲低。在一些实施方案中，慢病毒表达载体适合产生可选择的遗传修饰的细胞，如HSC。在一些实施方案中，可以向需要治疗的患者给药离体转导的HSC。在一些实施方案中，编码RNAi的核酸编码靶向HPRT的小发夹核糖核酸分子(“shRNA”)。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％相同性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1的序列具有至少97％相同性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:1的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变变体。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:2的序列具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少95％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少97％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:5、6和7中的任一个具有至少80％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一个具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一个具有至少95％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一个具有至少97％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:5、6和7中任一个的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是智人细胞系HEK-293 7sk RNA启动子(参见，例如，SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子，与SEQ ID NO:14相比，其在核酸序列中包括单个突变。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子，与SEQ ID NO:14相比，其在核酸序列中包括多个突变。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子，与SEQ ID NO:14相比，其在核酸序列中包括缺失。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子，与SEQID NO:14相比，其在核酸序列中包括突变和缺失。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％相同性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14的序列具有至少97％相同性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14的序列具有至少98％相同性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14的序列具有至少99％相同性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至具有SEQ ID NO:14的启动子。
第四个额外的实施方案是一种慢病毒表达载体，其包含编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一个具有至少80％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ IDNO:8、9、10和11中的任一个具有至少90％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一个具有至少95％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一个具有至少97％相同性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT基因的基于micro-RNA的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III或Pol II启动子，包括本文描述的那些中的任何。
第五个额外的实施方案是一种多核苷酸序列，其包括(a)编码靶向HPRT的shRNA的第一部分；以及(b)编码第一启动子的第二部分，所述第一启动子驱动编码靶向HPRT的shRNA的序列的表达。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含(c)编码中央多嘌呤束元件的第三部分；以及(d)编码Rev应答元件的第四部分(SEQ ID NO:19)。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列进一步包含WPRE元件(例如包含SEQ ID NO:18的WPRE元件)。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列进一步包含绝缘子。
第六个额外的实施方案是已用表达载体转导或用纳米胶囊转染的HSC(例如CD34+HSC)，每个包括设计为减少HPRT表达的物质(例如用于HPRT敲低的RNAi)。在一些实施方案中，所述HSC是T细胞。在一些实施方案中，转导的HSC构成细胞疗法产品，可以将其给药至需要治疗的受试者，例如用转导的HSC治疗的患者受益于接受细胞(如可以离体扩增的T细胞)以对抗感染，支持移植和防止疾病复发。
第七个额外的实施方案是用任何一种表达载体转导的宿主细胞，并且其中所述宿主细胞是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，所述宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第八个额外的实施方案是一种药物组合物，其包含宿主细胞，其中所述宿主细胞与药学上可接受的载剂或赋形剂一起配制。在一些实施方案中，所述宿主细胞是通过用表达载体转导宿主细胞而衍生的HPRT缺陷的宿主细胞。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第九个额外的实施方案是一种产生HPRT缺陷的细胞的方法，其包括：用表达载体转导宿主细胞群，并且通过使转导的宿主细胞群与至少一种嘌呤类似物接触来对HPRT缺陷的细胞进行阳性选择。在一些实施方案中，所述嘌呤类似物选自6TG和6-巯嘌呤。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第十个额外的实施方案是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生HPRT缺陷的淋巴细胞，其中HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；给药HSC移植物之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第十一个额外的实施方案是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生HPRT缺陷的淋巴细胞，其中HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；以及在给药HSC移植物的同时或之后向所述患者给药修饰的淋巴细胞群。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述患者给药一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第十二个额外的实施方案是一种治疗需要治疗的患者的血液癌症的方法，其包括：从供体样品产生HPRT缺陷的淋巴细胞，其中HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；通过向所述患者给药HSC移植物来诱导至少一部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发之后向所述患者给药修饰的淋巴细胞群。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向患者给药至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂以抑制GvHD或CRS的至少一种症状。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第十三个额外的实施方案是一种用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺陷的淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；(c)将转导的分离的淋巴细胞暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品；(d)在造血干细胞移植之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞制品；以及(e)任选地，在所述患者中发展移植物抗宿主病(GvHD)之后，给药甲氨蝶呤或麦考酚酸。在一些实施方案中，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％相同性。
第十四个额外的实施方案是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括内切核酸酶和靶向HPRT的gRNA的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；在给药HSC移植物之后，向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药MTX。
第十五个额外的实施方案是一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括Cas蛋白(例如Cas9、Cas12a、Cas12b)和靶向HPRT基因的gRNA的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；在给药HSC移植物之后，向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药MTX。
第十六个额外的实施方案是一种用表达载体转导的淋巴细胞，所述表达载体包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性。在一些实施方案中，所述shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中任一个的序列。在一些实施方案中，使得所述淋巴细胞在用所述表达载体转导之后基本上是HPRT缺陷的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞是T细胞。
本说明书中所引用和/或申请数据表中所列的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均整体援引加入本文。如果需要，可以修改实施方案的方面以采用各种专利、申请和公开的概念，以便提供进一步的实施方案。
虽然已参考许多说明性实施方案描述了本公开，但是应当理解本领域技术人员可以设计出许多其他修改和实施方案，这些修改和实施方案将落在本公开的原理的精神和范围内。更特别地，在不背离本公开的精神的情况下，在前述公开、附图和所附权利要求书的范围内，本主题组合排列的组成部分和/或排列中的合理变化和修改是可能的。除了组成部分和/或排列中的变化和修改，可选用途对于本领域技术人员来说也是显而易见的。
序列表
<110> YAN, Ming
ALMA, Christopher Walter
SYMONDS, Geoffrey
BARTLETT, Jeffrey
LEE, Chi-Lin
<120> 具有杀伤开关的供体T细胞
<130> Calimmune-072WO
<150> US 62/784,494
<151> 2018-12-23
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 734
<400> 1
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcctttt tt 52
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Modified sh734
<400> 2
aggatatgcc cttgactatg ccctgaccca gcatagtcaa gggcatatcc t 51
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene
<400> 3
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcc 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene
<400> 4
tcctatacgg gaactgataa acaggctgta tcagttcccg tatagg 46
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 616
<400> 5
gcaggcagta taatccaaat acctgaccca tatttggatt atactgcctg cttttt 56
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 211
<400> 6
ggttatgacc ttgatttata cctgacccat attaaatcaa ggtcataacc ttttt 55
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 734.1
<400> 7
gggatatgcc cttgactaat acctgaccca tattagtcaa gggcatatcc cttttt 56
<210> 8
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734 de novo (DNA form)
<400> 8
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt tatagtcaag ggcatatcct tgtgtttttt 60
ttgaaggata tgcccttgac tataaactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 9
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211 de novo (DNA form)
<400> 9
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt ataaatcaag gtcataacct tgtgtttttt 60
ttgaaggtta tgaccttgat ttataactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 10
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211-3G
<400> 10
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttttaa 60
atcaaggtca taaccgtagt gaaatatata ttaaacaggt tatgaccttg atttaaaata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 11
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734-3G
<400> 11
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttatag 60
tcaagggcat atcctgtagt gaaatatata ttaaacaagg atatgccctt gactataata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 12
<211> 1435
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1),
mRNA
<400> 12
ggcggggcct gcttctcctc agcttcaggc ggctgcgacg agccctcagg cgaacctctc 60
ggctttcccg cgcggcgccg cctcttgctg cgcctccgcc tcctcctctg ctccgccacc 120
ggcttcctcc tcctgagcag tcagcccgcg cgccggccgg ctccgttatg gcgacccgca 180
gccctggcgt cgtgattagt gatgatgaac caggttatga ccttgattta ttttgcatac 240
ctaatcatta tgctgaggat ttggaaaggg tgtttattcc tcatggacta attatggaca 300
ggactgaacg tcttgctcga gatgtgatga aggagatggg aggccatcac attgtagccc 360
tctgtgtgct caaggggggc tataaattct ttgctgacct gctggattac atcaaagcac 420
tgaatagaaa tagtgataga tccattccta tgactgtaga ttttatcaga ctgaagagct 480
attgtaatga ccagtcaaca ggggacataa aagtaattgg tggagatgat ctctcaactt 540
taactggaaa gaatgtcttg attgtggaag atataattga cactggcaaa acaatgcaga 600
ctttgctttc cttggtcagg cagtataatc caaagatggt caaggtcgca agcttgctgg 660
tgaaaaggac cccacgaagt gttggatata agccagactt tgttggattt gaaattccag 720
acaagtttgt tgtaggatat gcccttgact ataatgaata cttcagggat ttgaatcatg 780
tttgtgtcat tagtgaaact ggaaaagcaa aatacaaagc ctaagatgag agttcaagtt 840
gagtttggaa acatctggag tcctattgac atcgccagta aaattatcaa tgttctagtt 900
ctgtggccat ctgcttagta gagctttttg catgtatctt ctaagaattt tatctgtttt 960
gtactttaga aatgtcagtt gctgcattcc taaactgttt atttgcacta tgagcctata 1020
gactatcagt tccctttggg cggattgttg tttaacttgt aaatgaaaaa attctcttaa 1080
accacagcac tattgagtga aacattgaac tcatatctgt aagaaataaa gagaagatat 1140
attagttttt taattggtat tttaattttt atatatgcag gaaagaatag aagtgattga 1200
atattgttaa ttataccacc gtgtgttaga aaagtaagaa gcagtcaatt ttcacatcaa 1260
agacagcatc taagaagttt tgttctgtcc tggaattatt ttagtagtgt ttcagtaatg 1320
ttgactgtat tttccaactt gttcaaatta ttaccagtga atctttgtca gcagttccct 1380
tttaaatgca aatcaataaa ttcccaaaaa tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1435
<210> 13
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 7sk/sh734 expression cassette sequence
<400> 13
accatcgacg tgcagtattt agcatgcccc acccatctgc aaggcattct ggatagtgtc 60
aaaacagccg gaaatcaagt ccgtttatct caaactttag cattttggga ataaatgata 120
tttgctatgc tggttaaatt agattttagt taaatttcct gctgaagctc tagtacgata 180
agtaacttga cctaagtgta aagttgagat ttccttcagg tttatatagc ttgtgcgccg 240
cctgggtacc tcaggatatg cccttgacta tttgtccgac atagtcaagg gcatatcct 299
<210> 14
<211> 248
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens cell-line HEK-293 7SK RNA promoter region
<400> 14
tcgacgtgca gtatttagca tgccccaccc atctgcaagg cattctggat agtgtcaaaa 60
cagccggaaa tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg 120
ctatgctggt taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta 180
acttgaccta agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg 240
ggtacctc 248
<210> 15
<211> 248
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens cell-line HEK-293 7SK RNA promoter region with
mutation 1
<400> 15
tcgacgtgca gtcgggctac tgccccaccc atagtaccgg cattctggat agtgtcaaaa 60
cagccggaaa tcaagtccgt ttatctcaaa ctttagcatt ttgggaataa atgatatttg 120
ctatgctggt taaattagat tttagttaaa tttcctgctg aagctctagt acgataagta 180
acttgaccta agtgtaaagt tgagatttcc ttcaggttta tatagcttgt gcgccgcctg 240
ggtacctc 248
<210> 16
<211> 3901
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: TL20 viral Backbone
<400> 16
ggccgcctcg gccaaacagc ccttgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg 60
aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact 120
ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga 180
aaagtgaaag tcgagtttac cagtccctat cagtgataga gaaaagtgaa agtcgagttt 240
accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc ctatcagtga 300
tagagaaaag tgaaagtcga gctcgccatg ggaggcgtgg cctgggcggg actggggagt 360
ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg gtctctctgg 420
ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 480
caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 540
aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tggcgcccga 600
acagggactt gaaagcgaaa gggaaaccag aggagctctc tcgacgcagg actcggcttg 660
ctgaagcgcg cacggcaaga ggcgaggggc ggcgactggt gagtacgcca aaaattttga 720
ctagcggagg ctagaaggag agagatgggt gcgagagcgt cagtattaag cgggggagaa 780
ttagatcgcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa tataaattaa 840
aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatact ggcctgttag 900
aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt cagacaggat 960
cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg catcaaagga 1020
tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa aacaaaagta 1080
agaaaaaagc acagcaagca gcaggatctt cagacctgga aattccctac aatccccaaa 1140
gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattatagga caggtaagag 1200
atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 1260
gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 1320
acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 1380
acagggacag cagaaatcca ctttggaaag gaccagcaaa gctcctctgg aaaggtgaag 1440
gggcagtagt aatacaagat aatagtgaca taaaagtagt gccaagaaga aaagcaaaga 1500
tcattaggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 1560
aggattagaa catggaaaag tttagtaaaa caccataagg aggagatatg agggacaatt 1620
ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 1680
ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 1740
tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg acgctgacgg 1800
tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 1860
ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 1920
gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 1980
ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 2040
tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 2100
caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 2160
aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 2220
tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 2280
ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 2340
cccacctccc aaccccgagg ggaccgagct caagcttcga acgcgtgcgg ccgcatcgat 2400
gccgtagtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccacttttta 2460
aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaaa gaagacaaga tccctgcagg 2520
cattcaaggc caggctggat gtggctctgg gcagcctggg ctgctggttg atgaccctgc 2580
acatagcagg gggttggatc tggatgagca ctgtgctcct ttgcaaccca ggccgttcta 2640
tgattctgtc attctaaatc tctctttcag cctaaagctt tttccccgta tccccccagg 2700
tgtctgcagg ctcaaagagc agcgagaagc gttcagagga aagcgatccc gtgccacctt 2760
ccccgtgccc gggctgtccc cgcacgctgc cggctcgggg atgcgggggg agcgccggac 2820
cggagcggag ccccgggcgg ctcgctgctg ccccctagcg ggggagggac gtaattacat 2880
ccctgggggc tttggggggg ggctgtcccc gtgagctccc cagatctgct ttttgcctgt 2940
actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac 3000
ccactgctta agcctcaata aagcttcagc tgctcgagct agcagatctt tttccctctg 3060
ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga 3120
aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat 3180
atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat 3240
atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga 3300
aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt 3360
tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg 3420
ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc 3480
tcttatggag atccctcgac ctgcagccca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 3540
cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 3600
tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 3660
cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagcggatcc gcatctcaat tagtcagcaa 3720
ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt 3780
ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct 3840
ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaaagc 3900
t 3901
<210> 17
<211> 6565
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: pTL20c Plasmid Sequence
<400> 17
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cggccgcctc ggccaaacag 420
cccttgagtt taccactccc tatcagtgat agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc 480
cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa 540
aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agtgatagag aaaagtgaaa gtcgagttta 600
ccagtcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat 660
agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg 720
agctcgccat gggaggcgtg gcctgggcgg gactggggag tggcgagccc tcagatcctg 780
catataagca gctgcttttt gcctgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 840
gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 900
tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 960
ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg aacagggact tgaaagcgaa 1020
agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt gctgaagcgc gcacggcaag 1080
aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga 1140
gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga attagatcgc gatgggaaaa 1200
aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta aaacatatag tatgggcaag 1260
cagggagcta gaacgattcg cagttaatac tggcctgtta gaaacatcag aaggctgtag 1320
acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga tcagaagaac ttagatcatt 1380
atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg atagagataa aagacaccaa 1440
ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt aagaaaaaag cacagcaagc 1500
agcaggatct tcagacctgg aaattcccta caatccccaa agtcaaggag tagtagaatc 1560
tatgaataaa gaattaaaga aaattatagg acaggtaaga gatcaggctg aacatcttaa 1620
gacagcagta caaatggcag tattcatcca caattttaaa agaaaagggg ggattggggg 1680
gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt 1740
acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca gcagaaatcc 1800
actttggaaa ggaccagcaa agctcctctg gaaaggtgaa ggggcagtag taatacaaga 1860
taatagtgac ataaaagtag tgccaagaag aaaagcaaag atcattaggg attatggaaa 1920
acagatggca ggtgatgatt gtgtggcaag tagacaggat gaggattaga acatggaaaa 1980
gtttagtaaa acaccataag gaggagatat gagggacaat tggagaagtg aattatataa 2040
atataaagta gtaaaaattg aaccattagg agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt 2100
ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc 2160
agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt 2220
gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt gctgagggct attgaggcgc aacagcatct 2280
gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag 2340
atacctaaag gatcaacagc tcctggggat ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac 2400
cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag taataaatct ctggaacaga tttggaatca 2460
cacgacctgg atggagtggg acagagaaat taacaattac acaagcttaa tacactcctt 2520
aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa gaatgaacaa gaattattgg aattagataa 2580
atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt 2640
cataatgata gtaggaggct tggtaggttt aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt 2700
gaatagagtt aggcagggat attcaccatt atcgtttcag acccacctcc caaccccgag 2760
gggaccgagc tcaagcttcg aacgcgtgcg gccgcatcga tgccgtagta cctttaagac 2820
caatgactta caaggcagct gtagatctta gccacttttt aaaagaaaag gggggactgg 2880
aagggctaat tcactcccaa agaagacaag atccctgcag gcattcaagg ccaggctgga 2940
tgtggctctg ggcagcctgg gctgctggtt gatgaccctg cacatagcag ggggttggat 3000
ctggatgagc actgtgctcc tttgcaaccc aggccgttct atgattctgt cattctaaat 3060
ctctctttca gcctaaagct ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag 3120
cagcgagaag cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc 3180
ccgcacgctg ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg 3240
gctcgctgct gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg 3300
gggctgtccc cgtgagctcc ccagatctgc tttttgcctg tactgggtct ctctggttag 3360
accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat 3420
aaagcttcag ctgctcgagc tagcagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat 3480
catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat 3540
agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt 3600
aaaacatcag aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc 3660
catgaacaaa ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca 3720
ttccttattc catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt 3780
gttatttttt tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt 3840
cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga 3900
cctgcagccc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 3960
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 4020
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 4080
acctgtcgtg ccagcggatc cgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 4140
tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact 4200
aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta 4260
gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctgtcgactg cagaggcctg 4320
catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc 4380
acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga 4440
gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg 4500
tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg 4560
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 4620
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 4680
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 4740
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 4800
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 4860
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 4920
ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 4980
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 5040
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 5100
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 5160
tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 5220
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 5280
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 5340
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 5400
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 5460
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 5520
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 5580
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 5640
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 5700
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 5760
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 5820
acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 5880
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 5940
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 6000
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 6060
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 6120
atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 6180
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 6240
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 6300
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 6360
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 6420
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 6480
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 6540
aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 6565
<210> 18
<211> 592
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: WPRE Sequence
<400> 18
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592
<210> 19
<211> 769
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: REV response element
<400> 19
aggaggagat atgagggaca attggagaag tgaattatat aaatataaag tagtaaaaat 60
tgaaccatta ggagtagcac ccaccaaggc aaagagaaga gtggtgcaga gagaaaaaag 120
agcagtggga ataggagctt tgttccttgg gttcttggga gcagcaggaa gcactatggg 180
cgcagcgtca atgacgctga cggtacaggc cagacaatta ttgtctggta tagtgcagca 240
gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 300
gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 360
gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 420
tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 480
ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 540
ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 600
ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 660
cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 720
atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggaccg 769
<210> 20
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Hairpin loop sequence of sh734
<400> 20
ttgtccgac 9
<210> 21
<211> 9
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hsa-miR-22 loop sequence
<400> 21
ccugaccca 9
<210> 22
<211> 111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734 de novo (RNA form)
<400> 22
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu uauagucaag ggcauauccu uguguuuuuu 60
uugaaggaua ugcccuugac uauaaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 23
<211> 111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211 de novo (RNA form)
<400> 23
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu auaaaucaag gucauaaccu uguguuuuuu 60
uugaagguua ugaccuugau uuauaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA 451 hairpin sequence
<400> 24
aaaccgttac cattactgag tttagtaatg gtaatggttc tc 42
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 25
gttatggcga cccgcagccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 26
gcgggtcgcc ataacggagc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 27
cgtgacgtaa agccgaaccc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 28
ggcacggaaa gcgaccacct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 29
catgcgtatt tgacacacga 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 30
gctaagtgct agagttacgg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 31
gaggcgcggg atccgcagtg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 32
ttattactgt tccccgccag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IN-1
<400> 33
attatgctga ggatttggaa 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-1
<400> 34
gatgatctct ctcaacttta ac 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-6
<400> 35
catacctaat cattatgctg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-4
<400> 36
ggttatgacc ttgatttatt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-2
<400> 37
catggactaa ttatggacag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-3
<400> 38
tagccctctg tgtgctcaag 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nat Paper
<400> 39
gccctggccg gttcaggccc acg 23

Claims (145)

1.一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性。
2.权利要求1的表达载体，其中所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少95％相同性的核酸序列。
3.权利要求1的表达载体，其中所述shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少97％相同性的核酸序列。
4.权利要求1的表达载体，其中所述shRNA具有SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的核酸序列。
5.前述权利要求中任一项的表达载体，其中所述第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。
6.权利要求5的表达载体，其中所述Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子或EF1a启动子。
7.权利要求6的表达载体，其中所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。
8.权利要求6的表达载体，其中所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。
9.权利要求6的表达载体，其中所述7sk启动子具有SEQ ID NO:14的核酸序列。
10.权利要求6的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。
11.权利要求6的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。
12.权利要求6的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有SEQ ID NO:15的核酸序列。
13.一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低HPRT的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少90％序列相同性。
14.权利要求13的表达载体，其中所述shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少95％相同性的核酸序列。
15.权利要求13的表达载体，其中所述shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的序列具有至少97％相同性的核酸序列。
16.权利要求13的表达载体，其中所述shRNA具有SEQ ID NO:8、9、10和11中任一个的核酸序列。
17.权利要求13–16中任一项的表达载体，其中所述第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。
18.权利要求17的表达载体，其中所述Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子或EF1a启动子。
19.权利要求18的表达载体，其中所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。
20.权利要求18的表达载体，其中所述7sk启动子具有与SEQ ID NO:14的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。
21.权利要求18的表达载体，其中所述7sk启动子具有SEQ ID NO:14的核酸序列。
22.权利要求18的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少95％序列相同性的核酸序列。
23.权利要求18的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15的序列具有至少97％序列相同性的核酸序列。
24.权利要求18的表达载体，其中所述突变的7sk启动子具有SEQ ID NO:15的核酸序列。
25.一种用权利要求1–24中任一项的表达载体转导的宿主细胞，其中使得所述宿主细胞在转导之后基本上是HPRT缺陷的。
26.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T细胞。
27.权利要求26的宿主细胞，其中所述T细胞选自辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆T细胞、调节性CD4+T细胞、自然杀伤T细胞、粘膜相关恒定(mucosal associatedinvariant)T细胞和γδT细胞。
28.权利要求25的宿主细胞，其中所述宿主细胞是淋巴细胞。
29.一种药物组合物，其包含权利要求25–28中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞与药学上可接受的载剂或赋形剂一起配制。
30.一种产生HPRT缺陷的细胞的方法，其包括：用权利要求1-24中任一项的表达载体转导宿主细胞群；并且通过使转导的宿主细胞群与至少一种嘌呤类似物接触来对HPRT缺陷的细胞进行阳性选择。
31.权利要求30的方法，其中所述嘌呤类似物选自6TG和6-巯嘌呤。
32.一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用权利要求1–24中任一项的表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药造血干细胞(HSC)移植物；给药HSC移植物之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。
33.权利要求32的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自甲氨蝶呤(MTX)或麦考酚酸(MPA)。
34.权利要求32–34中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。
35.权利要求34的方法，其中所述嘌呤类似物是6-硫鸟嘌呤(6TG)。
36.权利要求35的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
37.权利要求32–34中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
38.权利要求32–37中任一项的方法，其中所述修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。
39.权利要求32–37中任一项的方法，其中向所述患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。
40.权利要求39的方法，其中每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。
41.权利要求40的方法，其中修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
42.一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用权利要求1–24中任一项的表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；以及在给药HSC移植物的同时或之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。
43.权利要求42的方法，其中所述方法进一步包括向所述患者给药一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
44.权利要求43的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
45.权利要求42–45中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。
46.权利要求45的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
47.权利要求46的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
48.权利要求42–44中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
49.权利要求42–44中任一项的方法，其中所述修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。
50.权利要求42–48中任一项的方法，其中向所述患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。
51.权利要求50的方法，其中每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。
52.权利要求50的方法，其中修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
53.一种治疗需要治疗的患者的血液癌症的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用权利要求1-24中任一项的表达载体转导供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；通过向所述患者给药HSC移植物来诱导至少一部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。
54.权利要求53的方法，其进一步包括向所述患者给药至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂以抑制GvHD或CRS的至少一种症状。
55.权利要求54的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
56.权利要求53–55中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。
57.权利要求56的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
58.权利要求57的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
59.权利要求53–54中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
60.权利要求53–59中任一项的方法，其中所述修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。
61.权利要求53–59中任一项的方法，其中向所述患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。
62.权利要求61的方法，其中每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。
63.权利要求61的方法，其中修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
64.一种向需要治疗的患者提供淋巴细胞输注的益处同时减轻副作用的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；向所述患者给药HSC移植物；在给药HSC移植物之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。
65.权利要求64的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA。
66.权利要求64的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含向导RNA，所述向导RNA靶向选自SEQ ID NO:25–39的核酸序列。
67.权利要求66的方法，其中适合敲除HPRT的组分进一步包含Cas蛋白。
68.权利要求67的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
69.权利要求67的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
70.权利要求69的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
71.权利要求69的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
72.权利要求64–71中任一项的方法，其进一步包括向所述患者给药一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
73.权利要求72的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
74.权利要求64–73中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。
75.权利要求74的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
76.权利要求75的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
77.权利要求64–73中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
78.权利要求64–77中任一项的方法，其中所述修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。
79.权利要求64–77中任一项的方法，其中向所述患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。
80.权利要求79的方法，其中每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。
81.权利要求79的方法，其中修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
82.权利要求64的方法，其中所述递送媒介物是纳米胶囊。
83.权利要求64的方法，其中所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
84.一种治疗需要治疗的患者的血液癌症的方法，其包括：从供体样品产生基本上HPRT缺陷的淋巴细胞，其中基本上HPRT缺陷的淋巴细胞是通过用包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物转染供体样品内的淋巴细胞而产生的；离体阳性选择基本上HPRT缺陷的淋巴细胞以提供修饰的淋巴细胞群；通过向所述患者给药HSC移植物来诱导至少一部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞群。
85.权利要求84的方法，其进一步包括向所述患者给药至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂以抑制GvHD或CRS的至少一种症状。
86.权利要求84的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
87.权利要求84–86中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物接触。
88.权利要求87的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
89.权利要求88的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
90.权利要求84–86中任一项的方法，其中所述阳性选择包括使产生的基本上HPRT缺陷的淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌醇接触。
91.权利要求84–86中任一项的方法，其中所述修饰的淋巴细胞作为单次推注给药。
92.权利要求84–86中任一项的方法，其中向所述患者给药多个剂量的修饰的淋巴细胞。
93.权利要求92的方法，其中每个剂量的修饰的淋巴细胞包含约0.1x106个细胞/kg至约240x106个细胞/kg。
94.权利要求92的方法，其中修饰的淋巴细胞的总剂量包含约0.1x106个细胞/kg至约730x106个细胞/kg。
95.权利要求84-94中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含向导RNA，所述向导RNA与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性。
96.权利要求84-94中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含向导RNA，所述向导RNA靶向选自SEQ ID NO:25–39的核酸序列。
97.权利要求84-94中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分进一步包含Cas蛋白。
98.权利要求97的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
99.权利要求97的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
100.权利要求99的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
101.权利要求99的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
102.权利要求84-101中任一项的方法，其中所述递送媒介物是纳米胶囊。
103.权利要求84-101中任一项的方法，其中所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
104.一种用HPRT缺陷的淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用权利要求1-24中任一项的表达载体转导分离的淋巴细胞；(c)将转导的分离的淋巴细胞暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品；(d)在造血干细胞移植之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞制品；以及(e)任选地，在所述患者中发展移植物抗宿主病(GvHD)之后，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。
105.权利要求104的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
106.权利要求104–105中任一项的方法，其中阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。
107.权利要求106的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
108.权利要求107的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
109.一种用HPRT缺陷的淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物接触以提供HPRT缺陷的淋巴细胞群；(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品；(d)在造血干细胞移植之后向所述患者给药治疗有效量的修饰的淋巴细胞制品；以及(e)任选地，在所述患者发展移植物抗宿主病(GvHD)之后，给药二氢叶酸还原酶抑制剂。
110.权利要求109的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
111.权利要求109–110中任一项的方法，其中阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。
112.权利要求111的方法，其中所述嘌呤类似物是6TG。
113.权利要求112的方法，其中6TG的量为约1至约15μg/mL。
114.权利要求109-113中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA。
115.权利要求109-113中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分包含向导RNA，所述向导RNA靶向选自SEQ ID NO:25–39的核酸序列。
116.权利要求109-113中任一项的方法，其中适合敲除HPRT的组分进一步包含Cas蛋白。
117.权利要求116的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
118.权利要求116的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
119.权利要求118的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
120.权利要求118的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
121.权利要求109-120中任一项的方法，其中所述递送媒介物是纳米胶囊。
122.权利要求109-120中任一项的方法，其中所述递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
123.修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用权利要求1-24中任一项的表达载体转导分离的淋巴细胞；以及(c)将转导的分离的淋巴细胞暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。
124.修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适合敲除HPRT的组分的递送媒介物接触以提供基本上HPRT缺陷的淋巴细胞群；以及(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。
125.一种药物组合物，其包含权利要求1-24中任一项的表达载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。
126.一种试剂盒，其包含(i)与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的向导RNA；以及(ii)Cas蛋白。
127.权利要求126的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
128.权利要求126-127中任一项的试剂盒，其中所述向导RNA与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少95％序列相同性。
129.权利要求126-127中任一项的试剂盒，其中所述向导RNA与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少98％序列相同性。
130.一种试剂盒，其包含(i)包含SEQ ID NO:25–39中任一个的向导RNA；以及(ii)Cas蛋白。
131.权利要求130的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
132.一种纳米胶囊，其包含(i)与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少90％序列相同性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白。
133.权利要求132的纳米胶囊，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
134.权利要求132-133中任一项的纳米胶囊，其中所述向导RNA与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少95％序列相同性。
135.权利要求132-133中任一项的纳米胶囊，其中所述向导RNA与SEQ ID NO:25–39中的任一个具有至少98％序列相同性。
136.权利要求132–135中任一项的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
137.权利要求132–136中任一项的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊包含聚合物壳。
138.权利要求132–136中任一项的纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。
139.一种宿主细胞，其用权利要求132–138中任一项的纳米胶囊转染。
140.修饰的淋巴细胞制品在造血干细胞移植之后向需要治疗的受试者提供淋巴细胞输注益处中的用途，其中所述修饰的淋巴细胞制品通过以下产生：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与权利要求132-136中任一项的纳米胶囊接触；以及(c)将HPRT缺陷的淋巴细胞群暴露于阳性选择HPRT缺陷的淋巴细胞的试剂以提供修饰的淋巴细胞制品。
141.一种纳米胶囊，其包裹权利要求1–26中任一项的表达载体。
142.权利要求141的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊包含聚合物壳。
143.权利要求141的纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊包含两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体和交联剂。
144.一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性，其中所述表达载体不包含用于表达的另一转基因。
145.一种表达载体，其包含可操作地连接至第一核酸序列的第一表达控制序列，所述第一核酸序列编码用于敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)的shRNA，其中所述shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中任一个的序列具有至少90％相同性，其中编码shRNA的第一核酸序列是唯一用于表达的序列。
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