HU220100B

HU220100B - HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására képes kimérareceptort expresszáló terápiás sejtek és alkalmazásuk

Info

Publication number: HU220100B
Application number: HU9602182A
Authority: HU
Inventors: Babak Banapour; Waldemar Kolanus; Charles Romeo; Brian Seed
Original assignee: The General Hospital Corp.
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 2001-10-28
Also published as: HUT75375A; EP0750457A4; CN1146136A; CA2182890C; FI120264B; DE69534589T2; US5851828A; US7094599B2; FI963150A0; MX9603384A; IL112390A; FI963150A; EP0750457A1; HU9602182D0; JP3832850B2; WO1995021528A1; KR970701004A; BR9506783A; NZ279123A; ES2249766T3

Abstract

A találmány tárgyát CD4-fragmensekből és immunsejt-receptorokbóllétrehozott funkcionális kimérákat expresszáló terápiás sejtekképezik, amelyek képesek emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembenisejtszintű immunválasz kiváltására. A találmány tárgyát képezi továbbáa találmány szerinti terápiás sejtek HIV-fertőzött sejtekkel szembenisejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazása. A találmányszerinti terápiás sejtek membránhoz kötött, proteintermészetűkimérareceptort expresszálnak, amely receptorok az alábbiakattartalmazzák: (a) egy extracelluláris részt, amely tartalmazza a CD4-antigén egy fragmensét, amely képes az említett HIV-fertőzött sejtetspecifikusan felismerni és ahhoz kötődni, de nem közvetíti HIV-vírussal történő fertőződés létrejöttét, valamint (b) egyintracelluláris részt, amely képes az említett terápiás sejtek számáraolyan jelzést közvetíteni, amely azokat a receptorhoz kötött, HIV-fertőzött sejtek elpusztítására készteti. A találmány tárgyát képezika találmány szerinti sejtek által expresszált kimérareceptort kódolóDNS-ek, valamint az ilyen DNS-eket tartalmazó vektorok is. ŕ

Description

A találmány tárgyát CD4-fragmensekből és immunsejtreceptorokból létrehozott funkcionális kimérákat expresszáló terápiás sejtek képezik, amelyek képesek emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására. A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti terápiás sejtek HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazása.

A találmány szerinti terápiás sejtek membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptort expresszálnak, amely receptorok az alábbiakat tartalmazzák: (a) egy extracelluláris részt, amely tartalmazza a CD4-antigén egy fragmensét, amely képes az említett HIV-fertőzött sejtet specifikusan felismerni és ahhoz kötődni, de nem közvetíti HIV-vírussal történő fertőződés létrejöttét, valamint 0?) egy intracelluláris részt, amely képes az említett terápiás sejtek számára olyan jelzést közvetíteni, amely azokat a receptorhoz kötött, HIV-fertőzött sejtek elpusztítására készteti.

A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti sejtek által expresszált, kimérareceptort kódoló DNS-ek, valamint az ilyen DNS-eket tartalmazó vektorok is.

A találmány szerinti megoldás alkalmazása új és hatékony terápiás lehetőséget jelent HIV-fertőzés kezelésére.

Antigének T-sejtek által történő felismerése a Tsejt-receptoron keresztül immunológiai jelenségek széles skálájának alapját képezi. A T-sejtek irányítják az úgynevezett sejt által közvetített immunitást. Ez vonatkozik idegen szöveteknek vagy fertőzött sejteknek az immunrendszer sejtjei által történő elpusztítására. Különböző T-sejtek ismertek, ezen belül „helper” és „szupresszor” sejtek, amelyek az immunválasz szabályozásában játszanak szerepet, valamint citotoxikus („killer”) sejtek, amelyek közvetlenül képesek rendellenes sejtek elpusztítására.

Egy másik sejt felszínén megjelenő egyedi antigén felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes T-sejt aktiválódik, majd osztódásnak indulhat, és amennyiben az citotoxikus sejt, képes a kötődött sejt elpusztítására.

HÍV és annak immunpatogenezise

1984-ben mutatták ki, hogy az AIDS kórokozója HIV-vírus. Azóta az AIDS definíciója többször változott arra vonatkozólag, hogy a diagnózisnak milyen ismérveken kell alapulnia. A diagnosztikai paraméterek változékonyságának ellenére azonban az AIDS egyszerű általános jellemzője a HIV-vírussal történő fertőződés, majd azt követően állandó szervi tünetek és az AIDS-tünetegyüttest meghatározó betegségek kifejlődése, úgymint másodlagos fertőzések, neoplazmák és idegrendszeri betegségek jelentkezése [„Harrison’s Principles of Internál Medicine”, 12. kiadás, „McGraw Hill” (1991)].

A HÍV a lenti vírusok csoportjába tartozó humán retrovírus. Az eddig ismert négy humán retrovírus két, egymástól elkülöníthető csoportra osztható: a humán T-limfotróp (vagy leukémia-) retrovírusok közé tartoznak a HTLV-1 és a HTLV-2, a humán immundeficiencia-vírusok közé tartoznak a HIV-1- és a HÍV-2vírusok. Az előbbiek transzformációt előidéző vírusok, míg az utóbbiak citopatogén vírusok.

A HIV-1-vírust a világon az AIDS leggyakoribb okozójaként azonosították. A HIV-2 és HIV-1 között kimutatható szekvenciaazonosság körülbelül 40%, és a HIV-2 közelebbi rokonságban áll a majom-immundeficienciavírusok (SIV) csoportjának egyes tagjaival. [Lásd Curran J. és munkatársai: Science, 329, 1357 (1985); Weiss R. és munkatársai: Natúré, 324, 572 (1986).]

A HÍV tartalmazza a szokásos retrovírusgéneket (env, gag és pol), ezenkívül tartalmaz hat olyan gént, amelyek a vírus replikációjában és egyéb biológiai aktivitásaiban játszanak szerepet. Amint azt a fentiekben megállapítottuk, az AIDS szokásos ismérve súlyos immunszupresszió, elsősorban a sejt által közvetített immunitás szupressziója. Ez az immunszupresszió különböző opportunista betegségekhez vezet, közelebbről bizonyos fertőzések és neoplazmák kialakulásához vezet.

Megállapították, hogy az immunhiány fő oka AIDS-ben a timusz eredetű (T-) limfociták alcsoportjának, a T4-populációnak mennyiségi és minőségi elégtelensége. Ezt a sejtalcsoportot fenotípusosan CD4-molekulák sejtfelszíni jelenléte jellemzi, amelyről kimutatták, hogy a HÍV sejtreceptora [Dalgleish és munkatársai: Natúré, 312, 763 (1984)]. Bár a T4-sejtek képviselik a HÍV által elsősorban fertőzött sejttípust, lényegében bármely, a felszínén CD4-molekulát expresszáló humán sejt képes HIV-hez történő kötődésre és azzal történő fertőződésre.

A CD4+-T-sejteknek hagyományosan „helper/inducer” szerepet tulajdonítanak, utalva arra, hogy funkciójuk aktiválószignál közvetítése a B-sejtek számára vagy a reciprok, CD8-markerrel rendelkező T-limfociták indukálása citotoxikus/szupresszor sejtekké történő átalakulásra [Reinherz és Schlossman: Cell, 19, 821 (1980); Goldstein és munkatársai: Immunoi. Rév., 68, 5 (1982)].

A HÍV a vírusburokban található aminosavszakaszon keresztül (gpl20) specifikusan és nagy affinitással kötődik a CD4-molekula N-terminális végének közelében található VI-régió részletéhez. A kötődést követően a vírus a célsejt membránjával fuzionálódik és a sejtbejut. Miután a sejtbe került, a vírus genomi RNS-e reverz transzkriptáz enzim segítségével DNS-sé íródik át, amely beépül a sejt DNS-ébe, ahol az a sejt további élete során „provírusként” van jelen.

A provírus maradhat látens állapotban vagy aktiválódhat, ezáltal mRNS-sé és genomi RNS-sé íródhat át, ez pedig proteinszintézishez, összeépüléshez, új virionok keletkezéséhez és a sejtfelszínen át vírusok kiszabadulásához vezethet. Bár annak a mechanizmusnak a részletei még nem ismertek, amelyen keresztül a vírus a sejt pusztulását okozza, feltehető, hogy a fő mechanizmus a sejtfelszínen át történő tömeges vírusfelszabadulás, amely a plazmamembrán károsodásához és az ozmotikus egyensúly felborulásához vezet.

A fertőzés folyamán a gazdaszervezetben ellenanyagok termelődnek a vírusproteinekkel szemben, például a gpl20 és gp41 elnevezésű, fő burok-glikoproteinekkel szemben. A humorális immunitás ellenére a betegség előrehalad, halálos kimenetelű immunszupressziót

HU 220 100 Β eredményezve, melyet opportunista fertőzések sokasága, parazitémia, demencia és halál jellemeznek. Az a tény, hogy a gazdaszervezet vírusellenes ellenanyagai nem képesek megakadályozni a betegség előrehaladását, képezi a betegség legnyugtalanítóbb és legriasztóbb sajátságainak egyikét, és nem sok sikert jósol a szokásos eljárásokon alapuló vakcinázási próbálkozásoknak.

Az immundeficiencia-vírusokkal szemben létrejövő Immorális válasz hatékonyságának meghatározásában két faktor játszhat szerepet. Először más RNS-vírusokhoz hasonlóan (és különösen retrovírusokhoz hasonlóan) az immundeficiencia-vírusok magas mutációs aránnyal válaszolnak a gazdaszervezet immunrendszere által történő beavatkozásra. Másodszor a burok-glikoproteinek nagymértékben glikozilezett molekulák, amelyek nagy affinitású ellenanyag-kötődés számára kevés alkalmas epitópot mutatnak fel. A vírusburok által képviselt gyenge antigén hatású célpont a gazdaszervezet számára kevés lehetőséget teremt a vírusfertőzés specifikus ellenanyagok termelődésével történő visszaszorítására.

A HIV-vírussal fertőzött sejtek felszínükön expresszálják a gpl20 glikoproteint. A gpl20 burokprotein hasonló reakción keresztül, mely révén a vírus a nem fertőzött sejtekbe bejut, fúzió létrejöttét közvetíti a CD4+sejtek közt, rövid életű, többmagvú óriássejtek keletkezéséhez vezetve. A szincíciumképződés a gpl20 elnevezésű burok-glikoproteinnek a CD4-proteinnel történő közvetlen kölcsönhatásán alapul [Dalgleish és munkatársai: lásd fent; Klatzman D. és munkatársai: Natúré, 312, 763 (1984); McDougal J. S. és munkatársai: Science, 231, 382 (1986); Sodorski J. és munkatársai: Natúré, 322, 470 (1986); Lifson J. D. és munkatársai: Natúré, 323, 725 (1986); Sodorski J. és munkatársai: Natúré, 321, 412 (1986)].

A bizonyítékok között, melyek szerint a CD4-gpl20 kötődés felelős a CD4-antigént hordozó sejtek vírussal történő fertőződéséért, megemlítendő az a tény, hogy a gpl20 és CD4 specifikus komplexet képez (McDougal és munkatársai: lásd fent). Más kutatók kimutatták, hogy HIV-vírussal nem fertőzhető sejtvonalak fertőzhető sejtvonalakká váltak azt követően, hogy azokat humán CD4-cDNS génnel transzfektálták és azokban a gén expresszálódott [Maddon és munkatársai: Cell, 46, 333 (1986)].

Számos kutatócsoport olyan terápiás programok kidolgozását javasolta és azok alkalmazását in vitro sikeresen szemléltette, amelyek oldható CD4-antigén alkalmazásán alapulnak, melyet passzív ágensként, a vírusadszorpció gátlására és a szincícium által közvetített, sejtről sejtre történő vírusátvitel megakadályozására használtak [Deen és munkatársai: Natúré, 3321, 82 (1988); Fisher és munkatársai: Natúré, 331, 76 (1988); Hussey és munkatársai: Natúré, 331, 78 (1988); Smith és munkatársai: Science, 238, 1074 (1997); Traunecker és munkatársai: Natúré, 331, 84 (1988)], ezt követően elnyújtott felezési idővel és mérsékelt biológiai aktivitással rendelkező CD4-immunglobulin fúziós proteinek kifejlesztésére is sor került [Capon és munkatársai: Natúré, 337, 525 (1989); Traunecker és munkatársai: Natúré, 339, 68 (1989); Bym és munkatársai: Natúré, 344, 667 (1990); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi., 9, 347 (1990)]. Bár a CD4-immunotoxin-konjugátumok vagy fúziós proteinek a fertőzött sejtekkel szemben in vitro jelentős citotoxikus hatást mutatnak [Chaudhary és munkatársai: Natúré, 335, 369 (1988); Till és munkatársai: Science, 242, 1166 (1988)], az immundeficiencia-szindróma kialakulásának latenciaideje valószerűtlenné teszi azt, hogy bármely egyszeri kezelésből álló terápia hatékony lehetne a vírusterhelés megszüntetésére, ezenfelül az idegen fúziós proteinek antigenitása valószínűleg korlátozza azok alkalmazhatóságát ismételt adagolást szükségessé tevő kezelésekben. SIV-vírussal fertőzött majmokon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy oldható CD4, olyan állatoknak beadva, melyek nem szenvednek jelentős CD4-citopéniában, képes a SIV-titer csökkentésére és a mieloid funkciók in vitro fokmérőiként használt eredmények javítására [Watanabe és munkatársai: Natúré, 337, 267 (1989)]. A kezelés megszakítását követően azonban megfigyelhető volt a vírus azonnali újbóli megjelenése, ami azt jelenti, hogy az immunrendszer előrehaladó legyengülésének megelőzése érdekében a kezelésre az egész élet során szükség lehet.

T-sejt-receptorok és Fc-receptorok A T-sejt-antigén-receptorok (TCR) legelterjedtebb formájának sejtfelszíni expresszálódásához legalább hat különálló polipeptidlánc együttes expresszálódására van szükség [Weiss és munkatársai: J. Exp. Med., 160, 1284 (1984); Orloffhashi és munkatársai: Natúré, 316, 606 (1985); Berkhout és munkatársai: J. Bioi. Chem., 263, 8528 (1988); Sussman és munkatársai: Cell, 52, 85 (1988)], nevezetesen az α/β antigénkötő láncokra, a CD3-komplex három polipeptidjére, valamint ζ-láncra. Ha bármelyik lánc hiányzik, a komplex fennmaradó tagjainak stabil expresszálódása nem valósul meg. A teljes komplex sejtfelszíni expresszálódása szempontjából a korlátozó tényező a ζ-polipeptid [Sussman és munkatársai: Cell, 52, 85 (1988)], amelyről feltételezik, hogy a ligandum által történő receptorfelismerés által beindított sejtaktivációs programok legalább egy része ennek közvetítésével zajlik [Weissman és munkatársai: EMBO J., 8, 3651 (1989); Frank és munkatársai: Science, 249, 174 (1990)]. A ζ- (zéta-) polipeptid egy 32 kD nagyságú, I. típusú, membránba beépülő homodimér, amely kilenc aminosavból álló extracelluláris domént tartalmaz N-kötésű glikánkapcsolódási helyek nélkül, valamint 112 (egér) vagy 113 (humán) aminosavból álló intracelluláris domént tartalmaz [Weissman és munkatársai: Science, 238,1018(1988); Weissman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 9709 (1988)]. A ζ-lánc egy izoformja, amelyet η-nak (étának) neveznek [Baniyash és munkatársai: J. Bioi. Chem., 263, 9874 (1988); Orloff és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 14 812 (1989)], és amely egy eltérő mRNS-összeillesztési folyamat eredményeképp jön létre [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 3319 (1990)], kisebb mennyiségben van jelen az antigénreceptort expresszáló sejtek3

HU 220 100 Β ben. A ζ-η heterodimerekről feltételezik, hogy inozitol-foszfátok képződését közvetítik, valamint az apoptózisnak nevezett, receptorfiiggő programozott sejthalálért felelősek [Mercep és munkatársai: Science, 242, 571 (1988); Mercep és munkatársai: Science, 246, 1162 (1989)].

Hasonlóképp a ζ- és η-polipeptidekhez, az Fc-receptorral kapcsolódó γ-lánc is további polipeptideket tartalmazó sejtfelszíni komplexekben expresszálódik, melyek közül egyesek a ligandumfelismerést közvetítik, mások ismeretlen funkcióval rendelkeznek. A γ(gamma-) polipeptid homodimer struktúrával és a ζlánchoz igen hasonló általános szerveződéssel rendelkezik - alkotórésze mind a hízósejtekben és bazofil sejtekben található, FcsRI-nek nevezett, nagy affinitású IgE-receptomak, amely legalább három különböző polipeptidláncból áll [Blank és munkatársai: Natúré, 337, 187 (1989); Ra és munkatársai: Natúré, 241, 752 (1989)] és az alacsony affinitású IgG-receptorok egyikének, amelyet egérben az FcyRIIa képvisel [Ra és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 15 323 (1989)], emberben pedig a makrofágok és természetes ölősejtek által expresszált CD16 altípus, a CD 16™ (CD16 transzmembrán) [Lainer és munkatársai: Natúré, 342, 803 (1989); Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 2274 (1990)], valamint egy ismeretlen funkcióval rendelkező polipeptid képvisel [Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 2274 (1990)]. A közelmúltban közölték, hogy a γ-lánc expresszálódik a CTL elnevezésű egér-T-sejt eredetű sejtvonalban, amelyben az homodimereket, valamint γ-ζ és γ-η heterodimereket képez [Orloff és munkatársai: Natúré, 347, 189 (1990)].

Az Fc-receptorok immunkomplexek fagocitózisának, transzcitózis és ellenanyagfüggő celluláris citotoxicitás („antibody dependent cellular cytotoxicity”, ADCC) közvetítésében vesznek részt [Ravetch és Kinet: Annu. Rév. Immunoi., 9, 457 (1991); Unkeless és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi., 6, 251 (1988); és Melman: Curr. Opin. Immunoi., 1, 16 (1988)]. Nemrégiben kimutatták, hogy az alacsony affinitású, egérFc-receptor-izoformok egyike - az FcRylIIBl - Ig-vel fedett célzott antigének felvételét közvetíti klatrinnal fedett sejtfelszíni behúzódásokba (retikulumokba), egy másik alacsony affinitású receptor - az FcrylIIA - pedig jelközvetítő („trigger”) molekulák egy kis családjának egy vagy több tagjával történő kapcsolódáson keresztül vesz részt ADCC közvetítésben [Miettinen és munkatársai: Cell, 58, 317 (1989); Hunziker és Mellmán: J. Cell. Bioi., 109, 3291 (1989)]. A fenti jelközvetítő molekulák, a T-sejt-receptor (TCR) ζ-lánc, a TCR-q-lánc, valamint az Fc-receptor γ-lánc különböző immunrendszeri receptorok ligandumfelismerő doménjaival lépnek kölcsönhatásba és autonóm módon sejteffektorprogramok beindítására, ezen belül aggregációt követően citolízis kiváltására képesek [Samelson és munkatársai: Cell, 43, 223 (1985); Weissman és munkatársai: Science, 239, 1018 (1988); Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 3319 (1990); Blank és munkatársai: Natúré, 337,187 (1989); Lanier és munkatársai: Natúré, 342, 803 (1989); Kurosaki és

Ravetch: Natúré, 342, 805 (1989); Hibbs és munkatársai: Science, 246, 1608 (1989); Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87,2274 (1990); valamint Irvin és Weiss: Cell, 64, 891 (1991)].

Párhuzamot vonva az alacsony affinitású egér- és humán Fc-receptor-családok között azonban nyilvánvaló, hogy a humán FcRylIA- és -C-izoformoknak egérben nincs megfelelője. Részben a fentiek következtében ezek funkciója még meghatározásra vár.

Mivel a csupán CD4-receptoron alapuló humorális hatóanyagoknak in vivő alkalmazhatósága korlátozott lehet, a korábbiakban olyan kutatások indultak, amelyek a HÍV-vei szemben a celluláris immunitás fokozásának lehetőségét vizsgálták. Olyan proteinkimérákat állítottak elő, amelyekben a CD4 extracelluláris doménjét T-sejt-receptor, IgG-Fc-rceptor vagy B-sejt-receptor szignáltranszdukciós elemeinek transzmembrán és/vagy intracelluláris doménjaival fuzionáltatták (lásd a WO 92/15322 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely teljes teijedelmében a kitanítás részét képezi). Extracelluláris CD4-domént tartalmazó kimérákat expresszáló citolitikus T-sejtek MHC-independens módon, hatékonyan elpusztítják a HIV-burokproteineket expresszáló célsejteket. A fenti megközelítési mód különösen fontos és új összetevőjeként azonosították a különálló Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor- és B-sejt-receptorláncokat, amelyek aggregációja elegendő a sejtek válaszreakciójának kiváltásához. Ennek a megközelítési módnak egy különösen előnyös alkalmazási módja szerint CD4, valamint ζ-, η- és γ-láncok közti kimérákat állítottak elő, amelyek citolitikus T-limfocitákat HIV-gpl20 antigént expresszáló sejtek felismerésére és elpusztítására késztemek (lásd a WO 92/15322 számú nemzetközi közzétételi iratot, amely teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi).

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

Általánosságban a találmány tárgyát képezik emlősökben HIV-fertőzött sejtekkel szemben celluláris immunválasz kiváltására alkalmazható eljárások. A találmány szerinti eljárásokban emlősnek terápiás sejtek hatékony mennyiségét adjuk be, amely terápiás sejtek membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptorokat expresszálnak, amely receptorok a következőket tartalmazzák: a) a CD4-antigén egy ffagmensét tartalmazó extracelluláris részt, amely képes HIV-fertőzött sejtek specifikus felismerésére és azokhoz történő kötődésre, de nem közvetíti a HIV-vel történő fertőződést, és b) egy intracelluláris részt, amely képes a terápiás sejtet a receptorhoz kötött, HIV-fertőzött sejt elpusztítására késztetni.

A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptorokat expresszáló terápiás sejtek alkalmazása gyógyászati készítmény formájában HIV-vel kapcsolatos betegségek kezelésére, amely receptorok a következőket tartalmazzák: a) a CD4 egy ffagmensét tartalmazó extracelluláris részt, amely képes HIV-fertőzött sejtek specifikus felismerésére és azok4

HU 220 100 Β hoz történő kötődésre, de nem közvetíti a HIV-vel történő fertőződést, és b) egy intracelluláris részt, amely képes a terápiás sejtet a receptorhoz kötött, HIV-fertőzött sejt elpusztítására késztetni.

Másrészt a találmány tárgyát képezik membránhoz kötött, proteintermészetű kimérareceptorokat expresszáló sejtek, amely receptorok a következőket tartalmazzák: a) a CD4 egy fragmensét tartalmazó extracelluláris részt, amely képes HIV-fertőzött sejtek specifikus felismerésére és azokhoz történő kötődésre, de nem közvetíti a HIV-vel történő fertőződést, és b) egy intracelluláris részt, amely képes a terápiás sejtet a receptorhoz kötött, HIV-fertőzött sejt elpusztítására késztetni.

A találmány mindkét előnyös megvalósítási módja szerint a CD4-fragmens a CD4-antigén 1-394. vagy 1-200. pozícióiban található aminosavakat tartalmazza; a CD4-fragmenst az intracelluláris résztől a 26. ábrán látható CD7 eredetű transzmembrándomén vagy a humán IgGl-molekula 25. ábrán látható („hinge”) kapocsrégiója, valamint CH2- és CH3-régiója választja el; a receptor egy CD7 transzmembránrészt tartalmaz; a receptor egy CD5 transzmembránrészt tartalmaz; a receptor egy CD34 transzmembránrészt tartalmaz; a CD4fragmenst a terápiás sejt membránjától egy vagy több, proteintermészetű alfa-hélix választja el; a CD4-fragmenst a terápiás sejt membránjától legalább 48 angström vagy legalább 72 angström távolság választja el; az intracelluláris rész egy T-sejt-receptor-protein (például ζlánc), egy B-sejt-receptor-protein vagy egy Fc-receptorprotein szignáltranszdukciós része; és a terápiás sejt a következők közül valamelyik: (a) T-limfocita; (b) citotoxikus T-limfocita; (c) természetes ölősejt; (d) neutrofil sejt; (e) granulocita; (f) makrofág; (g) hízósejt; (h) HeLa-sejt; és (i) embrionális törzssejt (ES).

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti kimérareceptorokat kódoló DNS-ek, valamint az említett kimérareceptorokat kódoló DNS-eket tartalmazó vektorok.

Bár a találmány szerinti megoldást közelebbről a CD4-antigén és zéta-lánc közti kimérán keresztül szemléltetjük, a találmány szerinti célra bármely - például granuloticákban vagy B-limfocitákban - a fenti molekulákhoz hasonló funkciót betöltő receptorlánc alkalmazható. Előnyös immunsejt-indukáló molekulának az alábbi megkülönböztető tulajdonságokkal kell rendelkeznie: legyen képes autonóm módon (azaz különálló láncként) expresszálódni; legyen egy extracelluláris doménnal fuzionáltatható úgy, hogy a kapott kiméra megjelenjen a terápiás sejt felszínén; valamint célzott ligandummal történő találkozást követően létrejövő aggregáció révén legyen képes sejteffektorprogramok kiváltására.

Jelenleg kiméráknak az immunrendszer sejtjeibe való bejuttatására legáltalánosabban a génterápia valamilyen formáját alkalmazzák. Az immunrendszer sejtjeinek kimérareceptorokkal történő ellátása oly módon, hogy a sejteket megfelelőképp szolubilizált, tisztított kiméraproteinnel elegyítjük, szintén módosított sejtpopulációt eredményez, amely képes reagálni HlV-fertőzött célsejtekre. Hasonló eljárásokat alkalmaztak például a CD4-molekulának terápiás célból, eritrocitákba történő bejuttatására. Ebben az esetben a módosított sejtpopuláció nem képes önmaga megújítására.

A találmány tárgyához tartoznak CD4-ffagmensek és Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- és Fc-receptor-alegységek által alkotott funkcionális és egyszerűsített kimérák, amelyek képesek immunsejteket HIV-fertőzött sejtek felismerésére és lizálására késztetni. Emlősben a sejtszintű válaszreakciók kiváltására szolgáló eljárás szerint az emlősnek olyan terápiás sejtek (például citotoxikus T-limfociták) hatékony mennyiségét adjuk be, amely sejtek képesek a HIV-fertőzött sejteket felismerni és elpusztítani.

A találmány tárgyát képezik ezenfelül a citotoxikus T-limfocitákat HIV-fertőzött sejtek felismerésére és elpusztítására késztető kimérareceptor-proteinek, a kimérareceptorokat tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek, valamint a kimérareceptorokkal szemben irányuló ellenanyagok.

Ezek és a találmány további, nem korlátozó jellegű megvalósítási módjai szakember számára világosak lesznek a találmány alábbi, részletes leírása alapján.

Az alábbi részletes leírás során utalunk molekuláris biológiában és immunológiában jártas szakember számára ismert eljárásokra. Az említett ismert eljárásokat ismertető közlemények és egyéb szakirodalmi helyek, melyekre utalás történt, teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, mintha azokat teljes egészükben közöltük volna.

Rekombináns DNS-technológia általános elveit ismertetik például a következő szakirodalmi helyek: Watson és munkatársai: „Molecular Biology of the Gene”, 1. és 2. kötet, „Benjamin/Cummings Publishing Company”, Inc., Menlo Park, CA (1987); Damell és munkatársai: „Molecular Cell Biology”, „Scientific American Books”, Inc., New York, N. Y. (1986); Lewin: „Genes II”, „John Wiley & Sons”, New York, N. Y. (1985); Old és munkatársai: „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2. kiadás, „University of Califomia Press”, Berkeley, CA (1981); Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás: „Cold Spring Harbor Laboratory”, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); valamint Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology”, „Wiley Press”, New York, N. Y. (1989).

Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok egyértelműen értelmezhetőek legyenek, az alábbi definíciókat adjuk meg.

„Klónozás” alatt in vitro rekombinációs technikák alkalmazását értjük adott génnek vagy egyéb DNS-szekvenciának vektormolekulába történő inszertálására.

A leírásban „cDNS” alatt olyan komplementer vagy másolat DNS-t értünk, mely RNS-templát alapján jött létre RNS-függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzim közreműködésével. „CDNS-klón” alatt tehát klónozóvektor által hordozott, adott RNS-molekulával komplementer, kettős szálú DNS-szekvenciát értünk.

A „cDNS-génkönyvtár” kifejezés cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjtemé5

HU 220 100 Β nyére vonatkozik, mely DNS-molekulák olyan mRNSről készült DNS-kópiákat tartalmaznak, amelyek a sejtekben a cDNS-génkönyvtár előállításának idejében expresszálódtak. Ilyen cDNS-génkönyvtárat előállíthatunk szakember számára ismert eljárásokkal, ilyen eljárásokat ismertetnek például Ausubel és munkatársai (lásd fent), valamint Maniatis és munkatársai (lásd fent). Általánosságban először RNS-t izolálunk az organizmus sejtjeiből, amelynek genomjából egy adott gént klónozni kívánunk. A találmány céljára előnyös emlősés különösen humán limfocita-sejtvonalak alkalmazása. A találmány szerinti célra előnyös vektor a vacciniavírus WR törzs.

„Vektor” kifejezés alatt például plazmid, bakteriofág vagy emlős- vagy rovarvírus eredetű DNS-molekulát értünk, amelybe DNS-fragmensek inszertálhatók vagy klónozhatok. Egy vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítási helyet tartalmaz és meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozószervezetben autonóm replikációra képes úgy, hogy a klónozott szekvencia reprodukálható. „DNS-expressziós vektor’-nak tehát bármely olyan autonóm elemet nevezünk, amely egy rekombináns peptid szintézisét irányítani képes. Ilyen DNS-expressziós vektorok lehetnek bakteriális eredetű plazmidok és fágok, valamint emlős és rovar eredetű plazmidok és vírusok.

„Lényegében tiszta” kifejezés alatt olyan vegyületet, például proteint, polipeptidet vagy ellenanyagot értünk, amelyik a természetben azzal együtt előforduló összetevőktől lényegében mentes. Általánosságban egy vegyületről akkor mondjuk, hogy az „lényegében tiszta”, ha a mintában az adott vegyület aránya legalább 60%, előnyösen 75% és legelőnyösebben 90%. A tisztasági fok bármely alkalmas eljárással meghatározható, például oszlopkromatográfiával, poliakrilamid-gélelektroforézissel vagy HPLC-analízissel. Nukleinsavak vonatkozásában a „lényegében tiszta” kifejezés olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmenst vagy -fragmenst jelöl, amelyik nem csatlakozik közvetlenül (azaz nem kapcsolódik kovalensen) azokhoz a kódolószekvenciákhoz (azaz az 5’-végen, valamint a 3’-végen található szekvenciákhoz), melyekhez közvetlenül kapcsolódik az organizmus természetben előforduló genomjában, amelyből a találmány szerinti DNS-származik.

Egy molekula „fragmensének” - ilyen például a találmány szerinti cDNS-szekvenciák bármelyike - a molekula valamely folyamatos nukleotid-alcsoportját nevezzük. Egy molekula „analógjának” olyan, a természetben elő nem forduló molekulát nevezünk, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy az egy másik molekulához „lényegében hasonló”, ha a két molekula aminosavszekvenciája lényegében megegyezik. Aminosavakból álló, lényegében hasonlónak mondott molekulák lényegében hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. A leírásban egy molekula „kémiai származékán” olyan molekulát értünk, amelyik a molekula részét rendesen nem képező kémiai csoportokat tartalmaz. Ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, felszívódását, biológiai felezési idejét stb. A csoportok csökkenthetik továbbá a molekula toxicitását, megszüntethetik vagy csökkenthetik a molekula valamely nem kívánt mellékhatását stb. Ilyen hatások közvetítésére képes csoportokat írnak le például az alábbi szakirodalmi helyen: „Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 16. kiadás, „Mack Publishing Co.”, Easton, Pennsylvania (1980).

Hasonlóképp a találmány szerinti receptor kiméragén „funkcionális származéka” kifejezés vonatkozik a gén olyan „fragmenseire” vagy „analógjaira”, amelyek nukleinsavszekvenciája „lényegében hasonló”, és amelyek például Τ-sejt-, B-sejt- vagy Fc-receptor-kimérákhoz hasonló aktivitással rendelkező molekulákat kódolnak. A származék a vad típusú receptorkiméra aktivitásának legelőnyösebben 90%-ával, előnyösebben 70%-ával, előnyösen 40%-ával rendelkezik. Egy funkcionális kimérareceptor-származék aktivitása vonatkozik (annak extracelluláris CD4-részén keresztül) egy HIVfertőzött sejthez történő specifikus kötődésre és a kötődés következményeképp az adott sejt elpusztítására; ezenfelül a kimérareceptor nem teszi a receptort hordozó sejtet fogékonnyá HlV-fertőzéssel szemben. A kimérareceptor aktivitása tesztelhető például valamely, a leírásban ismertetett vizsgálati módszer alkalmazásával.

A találmány szerinti CD4-receptorkimérát vagy annak funkcionális származékát kódoló DNS-szekvenciát rekombináns úton vektor-DNS-sel kapcsolhatjuk össze szokásos technikák alkalmazásával, például ligálás céljából tompa végek vagy lépcsőzetes végek létrehozásával, megfelelő végek kialakítása céljából restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel, szükség esetén a ragadós végek feltöltésével, a nem kívánt összekapcsolódás megelőzése céljából alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel, valamint megfelelő ligázokkal történő ligálással. Ilyen technikákat írnak le például Maniatis T. és munkatársai (lásd fent), és azok a technika állása szerint jól ismertek.

Egy nukleinsavmolekuláról, például DNS-ről akkor mondjuk, hogy „képes egy polipeptid expresszálására”, ha transzkripciós és transzlációs szabályozóinformációkat hordozó nukleotidszekvenciákat tartalmaz, és az említett szekvenciák a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákkal „funkcionálisan kapcsoltak”. Funkcionális kapcsolódásnak olyan kapcsolódást nevezünk, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és az expresszálható DNS-szekvenciák oly módon kapcsolódnak, hogy génexpresszió jöhessen létre. A gén expresszálódásához szükséges szabályozórégiók közelebbi természete organizmusról organizmusra változhat, de általánosságban tartalmazniuk kell egy promoterrégiót, amely prokarióták esetében tartalmazza a promotert (amely az RNS-transzkripció megindulását irányítja), valamint olyan DNS-szekvenciákat, melyek RNS-sé átíródva szignált képeznek a proteinszintézis megindulása számára. Ezek a régiók általában tartalmazzák azokat az 5’-végi, nem kódoló szekvenciákat, amelyek a transzkripció és a transzláció megindításában játszanak szerepet, például a „TATA-box” régiót, a „capping”-szekvenciát, CAAT-szekvenciát és hasonlókat.

Kívánt esetben a proteint kódoló génszekvenciától 3’-irányban található nem kódoló régiót megkaphatjuk a fent leírt módszerek alkalmazásával. Ezt a régiót meg6

HU 220 100 Β tarthatjuk az abban található transzkripciós terminációszabályozó szekvenciák, ezen belül a terminációt és poliadenilezést szabályozó szekvenciák kedvéért. A proteint kódoló DNS-szekvenciával természetben kapcsolódó 3’-régiót megtartva tehát rendelkezésre állnak a transzkripció végét jelző szignálok. Amennyiben a transzkripció végét jelző szignálok nem működnek kielégítően az expresszálásra felhasznált gazdasejtben, azt a gazdasejtben működőképes 3’-régióval helyettesíthetjük.

Két DNS-szekvenciáról (például egy promoterrégió-szekvenciáról és CD4-receptorkimérát kódoló szekvenciáról) akkor mondjuk, hogy azok „funkcionálisan kapcsoltak”, ha a két DNS-szekvencia közti kötődés természete (1) nem eredményez fáziseltolódással járó („iramé shift”) mutációt, (2) nem gátolja a promoterrégiót alkotó szekvencia azon képességét, hogy irányítsa a receptorkiméra génszekvenciájának transzkripcióját, vagy (3) nem gátolja a receptorkimérát alkotó génszekvencia azon képességét, hogy az a promoterrégiószekvencia által átíródjon. Egy promoterrégió funkcionálisan kapcsolt egy DNS-szekvenciával, ha a promoter képes létrehozni egy adott DNS-szekvencia transzkripcióját. A protein expresszálódásához tehát szükség van a megfelelő gazdasejt által felismert transzkripciós és transzlációs szignálokra.

A találmány tárgyát képezi CD4-receptorkiméra proteinek (vagy funkcionális származékaiknak) expresszálása prokarióta vagy eukarióta sejtekben, bár eukarióta sejtekben (különösen humán limfocitákban) történő expresszálás előnyösebb.

A találmány szerinti ellenanyagok számos különböző eljárással előállíthatók. Például egy állatnak a CD4receptorkiméra proteineket vagy azok funkcionális származékát expresszáló sejteket adhatunk be abból a célból, hogy a kimérához kötődni képes poliklonális ellenanyagokat tartalmazó szérum termelődését váltsuk ki.

Egy előnyös eljárás szerint a találmány szerinti ellenanyagok monoklonális ellenanyagok. Ilyen monoklonális ellenanyagokat előállíthatunk hibridómatechnológiával [Kohler és munkatársai: Natúré, 256, 495 (1975); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 6, 511 (1976); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 6, 292 (1976); Hammerling és munkatársai: „Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas”, „Elsevier”, N. Y., 563-684. oldal (1981)]. Általánosságban a fenti eljárások során állatot immunizálunk a CD4-receptorkiméra antigénnel. Az ilyen állat lépsejtjeit extraháljuk és megfelelő mielóma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. A találmány szerinti megvalósítási módokban bármely alkalmas mielóma-sejtvonal alkalmazható. A fúziót követően az így kapott hibridómasejteket szelektív módon, HAT tápfolyadékban tartjuk fönn, majd Wands és munkatársai módszere szerint [Gastroenterology, 80, 225 (1981)], határhígításos eljárással klónozzuk. A fenti szelekcióval kapott hibridómasejteket ezután a kimérához kötődni képes ellenanyagokat szekretáló kiónok azonosítása céljából átvizsgáljuk.

A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek poliklonális ellenanyagok is vagy előnyösebben régióspecifikus poliklonális ellenanyagok.

A találmány szerinti CD4-receptorkimérával szemben irányuló ellenanyagok alkalmazhatók betegekben a kimérareceptor (vagy kimérareceptort hordozó sejtek) mennyiségének meghatározására. Ilyen ellenanyagok alkalmasak a technika állása szerint ismert, standard immundiagnosztikai vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásra, például immunometriás vagy „szendvics” vizsgálati eljárásokban, például „forward szendvics”, „reverz szendvics” és „szimultán szendvics” elrendezésű vizsgálati eljárásokban. Amint az szakember számára további kísérletek elvégzése nélkül világos, az ellenanyagokat alkalmazhatjuk bármilyen kombinációban, hogy megfelelő specifitással, érzékenységgel és pontossággal rendelkező immunvizsgálati eljárásokhoz jussunk.

Az immunológia általános elveit ismertető, ismert szakirodalmi helyek például az alábbiak: Roitt: „Essential Immunology”, 6. kiadás, „Blackwell Scientific Publications”, Oxford (1988); Kimball: „Introduction to Immunology”, 2. kiadás, „Macmillan Publishing Co.”, New York (1986); Roitt és munkatársai: „Immunology”, „Gower Medical Publishing Ltd.”, London (1985); Campbell: „Monoclonal Antibody Technology”, Burdon és munkatársai (szerkesztő), „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, 13. kötet, „Elsevier”, Amszterdam (1984); Klein: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination”, „John Wiley & Sons Publisher”, New York (1982); valamint szerkesztő: Kennett és munkatársai: „Monoclonal Antibodies”, „Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses”, „Plenum Press Publisher”, New York (1980).

„Kimutatás” kifejezésen egy anyag jelenlétének vagy hiányának kimutatását vagy egy anyag mennyiségének meghatározását értjük. A kifejezés vonatkozik tehát a találmány szerinti anyagok, készítmények és eljárások alkalmazásával történő kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásokra.

A találmány szerinti ellenanyagok és lényegében tisztított antigének ideálisan megfelelnek vizsgálati reagenskészletek előállítására. Ilyen vizsgálati reagenskészletek tartalmazhatnak rekeszekre osztott hordozóeszközt, hogy azokba szorosan egy vagy több tartályt, például üvegcséket, csöveket és hasonlókat lehessen helyezni, és az egyes tartályok külön-külön tartalmazzák a vizsgálati eljárásban alkalmazandó elemeket.

Vizsgálati reagenskészlet formájában számos típusú vizsgálati eljárás kivitelezhető, ezek lehetnek például kompetitív és nem kompetitív vizsgálati eljárások. A találmány szerinti ellenanyagok tipikusan alkalmazhatók például az alábbi vizsgálati eljárásokban: radioimmunvizsgálati eljárások (RIA), enzim-immunvizsgálati eljárások (EIA), enzimhez kötött immunszorbens-vizsgálati eljárások (ELISA), valamint immunometriás vagy szendvics immunvizsgálati eljárások.

Az „immunometriás vizsgálati eljárás” vagy „szendvics immunvizsgálati eljárás” kifejezés vonatkozik szimultán szendvics, „forward” szendvics és reverz szendvics immunvizsgálati eljárásokra. Ezek a kifejezések szakember számára jól ismertek. Szakember számára nyilvánvaló az is, hogy a találmány szerinti ellenanya7

HU 220 100 Β gok alkalmazhatók jelenleg ismert vagy a jövőben kifejlesztendő vizsgálati eljárások egyéb variációiban és formáiban is. Az utóbbiak szintén a találmány tárgyát képezik.

„Specifikus módon felismer és kötődik” kifejezés alatt azt értjük, hogy az ellenanyag felismeri a kimérareceptor-polipeptidet és ahhoz kötődik, de lényegében nem ismer fel a mintában - például biológiai mintában - található egyéb, az adott ellenanyagokkal nem kapcsolatos molekulákat és azokhoz nem kötődik.

„Terápiás sejtnek” olyan sejteket nevezünk, amelyeket a találmány szerinti CD4-receptorkimérával transzformáltunk úgy, hogy azok képesek HIV-fertőzött sejtek felismerésére és elpusztítására; a fenti terápiás sejtek előnyösen vérképzőrendszeri sejtek.

„Extracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a sejtfelszínen jelenik meg. „Intracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájával érintkezik. A „transzmembrán” kifejezés arra vonatkozik, hogy a molekula legalább egy része átszeli a plazmamembránt. A leírás szerint egy „extracelluláris rész”, „intracelluláris rész” vagy „transzmembránrész” tartalmazhat olyan határoló aminosavszekvenciákat, melyek szomszédos sejtterekbe nyúlnak át.

„Oligomerképzés” kifejezés alatt más proteinekkel történő komplexképzést értünk, mely révén dimerek, trimerek, tetramerek keletkeznek vagy egyéb, több elemből álló oligomer jön létre. Ilyen oligomerek lehetnek homooligomerek vagy heterooligomerek. „Oligomerképző résznek” nevezzük egy molekula azon részét, amely a komplexképződést (azaz az oligomerképződést) irányítja.

„Citolitikus”-nak nevezünk valamit, ha az képes sejtek (például HIV-fertőzött sejtek) elpusztítására vagy képes egy fertőző ágens (például HIV-vírus) elpusztítására.

„Immundeficiencia-vírus”-nak olyan retrovírust nevezünk, amely vad típusú formában képes főemlős-gazdaszervezet T4-sejtjeinek fertőzésére, és amelyet a lentivírusok alcsaládjának vírusmorfogenezise jellemez, valamint annak morfológiai sajátságaival rendelkezik. A kifejezés - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vonatkozik a HÍV- és SIV-vírusok valamennyi variánsára, ezen belül a HIV-1-, HIV-2-, SlVmac-, SIVagm-, SlVmnd-, SlVsmm-, SlVman-, SlVmand- és SlVcpz-vírusokra.

„MHC-independens” kifejezésen azt értjük, hogy a celluláris citolitikus válasz létrejöttéhez nincs szükség a célzott sejt felszínén II. osztályba tartozó MHC-antigén jelenlétére.

„Funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származék”-nak olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékokat nevezünk, amelyek a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 40%-ával, előnyösebben 70%-ával, és legelőnyösebben legalább 90%-ával rendelkeznek. Egy „funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származék” a leírásban használt értelemben kifejtheti hatását közvetlenül, jelezve a terápiás sejtnek, hogy a receptorhoz kötődött ágenst vagy sejtet el kell pusztítania (pédlául egy intracelluláris kimérareceptor-részlet esetében), vagy kifejtheti hatását közvetve oly módon, hogy elősegíti a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukciós proteinjeivel történő oligomerizálódást (például egy transzmembrándomén esetében). Ilyen származékok hatékonyságát például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük.

„HIV-burokhoz kötődő funkcionális származéknak” nevezünk minden olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékot, amelyik képes valamely HlV-burokproteinhez kötődni. Funkcionális származékokat azonosíthatunk például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti transzformált sejtek terápiás alkalmazásának lehetőségét.

A találmány szerinti transzformált sejtek immundeficiencia-vírus okozta betegségek terápiájában alkalmazhatók. Ilyen transzformált sejtek beadására jelenleg ismert eljárások például az adoptiv immunterápiás eljárás vagy a sejttranszfer terápia. Ezek az eljárások lehetővé teszik transzformált immunrendszeri sejtek visszajuttatását a vérkeringésbe [Rosenberg: Scientifíc American, 62 (1990. május); Rosenberg és munkatársai : The New England Journal of Medicine, 323(9), 570(1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely olyan állatnak beadhatók, amelyekben a találmány szerinti vegyületek előnyös hatást fejtenek ki. Az említettek közül - anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk - azok elsősorban embernek adhatók be.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a CD4-ffagmens (1-369. aminosavak) és különböző receptorláncok közti fúzió helyének aminosavszekvenciáját mutatja. Az aláhúzott szekvencia a fúzió létrehozására felhasznált BamHI hely által kódolt aminosavak pozícióját jelöli. A transzmembrándomén kezdetét függőleges oszloppal jelöltük. Az η-szekvencia az amino-terminális végen megegyezik a ζ-lánc szekvenciájával, de a karboxi-terminális végen attól eltér [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 3319(1990)].

Az lb. ábra CD4, CD4^ és CD4^ sejtfelszíni expresszálódásának áramlásos citometriás („flow”-citometriás) analízisét szemlélteti CVl-sejtekben. A sejteket CD4-kimérákat vagy CD16_Prt expresszáló vírusokkal fertőztük, 9 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd fikoeritrinnel konjugált, Leu3A jelű, anti-CD4 Mab-bal (monoklonális ellenanyaggal) festettük.

A 2. ábra CD 17·^ sejtfelszíni expresszálódását ábrázolja csak CDló-pM-mel (sűrű pontozás) vagy ezenfelül CD4:y-t (szaggatott vonal) vagy CD4^-t (folyamatos vonal) expresszáló vírussal történő fertőzést követően. A ritka pontozás csak CD4^-val fertőzött sejteket jelöl, amelyeket 3G8 ellenanyaggal festettünk [Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 3275 (1982)] (anti-CD16-Mab).

A 3. ábra CD 16_TM sejtfelszíni expresszálódását ábrázolja CDlójM-et és a következő ζ-kimérákat exp8

HU 220 100 Β resszáló vírusokkal történő együttes fertőzést követően: CD4^ (vastag vonal), CD4^-C11G (folyamatos vonal), CD4^ (CD4^-D15G) (szaggatott vonal), CD4^-C11G/D15G (sűrű pontozás); társfertőzés nélkül (csak CDIŐjm, ritka pontozás). A sejteket 3G8 jelű anti-CD16 monoklonális ellenanyaggal, majd egérIgG-vel szemben kecskében termelt, fikoeritrinnel konjugált, F(ab’)₂ ellenanyaggal inkubáltuk. A ζ-kimérák expresszálódásának szintje a különböző vizsgált mutánsok esetében lényegében megegyezett, a sejtek CDlójM-et és ζ-kimérákat expresszáló vírusokkal történő együttes fertőzése nem változtatta meg észrevehető mértékben a kimérák sejtfelszíni expresszálódását.

A 4a-d. ábrák az intracelluláris szabad kalciumionkoncentráció emelkedését ábrázolják T-sejtekben mutáns ζ-kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. Jurkat-féle E6-sejteket [Weiss és munkatársai: J. Immunoi., 133, 123 (1984)] rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk és áramlásos citometriával analizáltunk. A bemutatott eredmények a kapuzott („gated”) CD4⁺-populációt képviselik úgy, hogy csak a kérdéses kiméraproteint expresszáló sejteket analizáltuk. Az Indo-1-fluoreszcencia violából kékké történő változásának átlagos aránya az intracelluláris szabad kalciumion-koncentrációt tükrözi a teljes populációban, a válaszreakciót adó sejtek százalékos aránya pedig a sejtek azon frakciójának felel meg, amelyek egy előre meghatározott küszöbértéknek megfelelő arányt túlléptek (az utóbbit úgy állapítottuk meg, hogy e szerint a kezeletlen sejtek 10%-a volt pozitívnak tekinthető). A 4a. és 4b. ábrákon CD4^- (folyamatos vonal) vagy CD16^kimérákat (szaggatott vonal) expresszáló Jurkat-sejtek vizsgálatával kapott eredményeket ábrázoltunk; a sejteket Leu3A jelű (fikoeritrinnel konjugált) anti-CD4 monoklonális ellenanyaggal érintkeztettük, majd az utóbbiak között kecskében, egér-IgG-vel szemben termelt ellenanyaggal keresztkötéseket hoztunk létre. A pontozott vonal nem fertőzött sejtek válaszreakcióját mutatja OKT3 jelű anti-CD3-MAb hozzáadására. A 4c. és 4d. ábrák a 4a. és 4b. ábráknál ismertetettekkel azonos módon kezelt és analizált, 0Β4:ζΟ15Ο- (folyamatos vonal), CD4^C11G/D15G- (szaggatott vonal) vagy CD4^C11G- (pontozott vonal) kimérákat expresszáló Jurkat-sejtek eredményeit ábrázolják.

Az 5a-c. ábrák azt szemléltetik, hogy a CD4^-, CD4:r|- és CD4:y-receptorok képessé teszik a citolitikus T-limfocitákat (CTL-eket) HIVl-gpl20/41 antigént expresszáló célsejtek elölésére. 5a. ábra: sötét karikák: gpí20/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált CD4^-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: nem fertőzött HeLa-sejtekkel inkubált CD4.^-t expresszáló CTL-ek; sötét négyzetek: gpl20/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek; üres négyzetek: nem fertőzött HeLa-sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek. 5b. ábra: sötét karikák: gpl20/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4:q-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: gpl20/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4:y-t expresszáló CTL-ek; üres négyzetek: gp 120/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4^-C11G/D15G kettős mutáns CD4^-kimérát expresszáló CTL-ek. 5c. ábra: az 5b. ábra szerinti CTL-ek CD4-expressziójának áramláscitometriás analízise. A célsejt/effektorsejt arány korrekciója céljából a CD4-kimérákat expresszáló sejtek százalékos arányát úgy határoztuk meg, hogy hisztogramszuperpozícióval kivontuk a negatívnak minősített (nem fertőzött) populációt; ezen az ábrán a viszonyíthatóság céljából a nem fertőzött sejteknek egy önkényes küszöbértéket adtunk, melynek alkalmazásával az egyéb sejtpopulációk esetében a sejtek körülbelül ugyanolyan arányban bizonyulnak pozitívnak, mint a hisztogram-szuperpozíciós módszer szerint.

A 6a-b. ábrák a CD4-irányította citolízis specifitását mutatják. 6a. ábra: sötét karikák: CD16_PI-t expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4: ζ-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: gpl20-at expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4-et expresszáló CTL-ek; sötét négyzetek: gpl20/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD16: ζ-t expresszáló CTL-ek; üres négyzetek: gp 120/41 antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD16_Prt expresszáló CTL-ek. 6b. ábra: sötét karikák: Raji- (MHC-II+ osztályú) sejtekkel inkubált, CD4^-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: RJ2.2.5(MHC-II Raji mutáns) sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-sejtek; sötét négyzetek: Raji- (MHC-II⁺ osztályú) sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek; üres négyzetek: RJ2.2.5- (MHC-II^- Raji mutáns) sejtekkel inkubált, CD4: ζ-t expresszáló CTL-ek. Az ordináta beosztását elnyújtottuk.

A 7a-b. ábrák a CD16^ kimérareceptor jellemzését mutatják. A 7a. ábra a CD16: ζ fúziós protein vázlatos ábrázolása. A monomer CD 16 foszfatidil-inozitol kötött formájának extracelluláris részét dimer ζ-lánchoz kapcsoltuk, a transzmembrándoméntól közvetlenül extemálisan. Az ábra alján jelöltük a fúzió helyén létrejött proteinszekvenciát. A 7b. ábra a kalciummobilizáció áramlásos citometriás meghatározásának eredményeit mutatja TCR-pozitív, valamint TCR-negatív sejtvonalakban, a ΰϋ16:ζ kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. Az ábrán „0” időpontban ellenanyagokkal kezelt sejtpopulációk esetében a kibocsátott fluoreszcencia violából kékké történő változásának átlagos arányát ábrázoltuk (amely a relatív kalciumion-koncentrációt tükrözi). Sötét négyzetek: Jurkat-sejtek válaszreakciója OKT3 jelű anti-CD3-MAb-ra; sötét háromszögek: ΰϋ16:ζ kimérák által kiváltott válaszreakció a 3G8 jelű ani-CD16-MAb-bal történő keresztkötések létrehozására REX33A jelű TCR-mutáns sejtvonalban; üres négyzetek: CD16:ζ-kimérák közti keresztkötések létrehozására adott válaszreakció JRT3.T3.5 jelű, Jurkat-féle TCR -mutáns sejtvonalban; üres háromszögek: CD16^ keresztkötések létrehozására adott válaszreakció Jurkat-sejtekben; keresztek: nem kiméra CD16-ra adott válaszreakció Jurkatsejtekben; pontok: nem kiméra CD16-ra adott válaszreakció a REX33A jelű, TCR -mutáns sejtvonalban.

A 8a-b. ábrák a citolitikus képesség analízisének eredményeit ábrázolják deléciók létrehozását követően. A 8a. ábra a ζ-deléció végpontjainak helyét mutatja. Amint azt máshol is, a ζ-láncban létrehozott mutá9

HU 220 100 Β ciókat a következőképp jelöltük: eredeti aminosav egyezményes jele - pozíció - mutáns aminosav egyezményesjele; a D16* például azt jelenti, hogy a 66. pozícióban található Asp aminosavat terminációs kodon helyettesíti. A 8b. ábra deléciót nem hordozó CD16^ kiméra, valamint „csendes” (kimutatható következménnyel nem járó) ζ-deléciók citolitikus vizsgálata során kapott eredményeket mutat. CD16-antigénnel szemben felületi ellenanyagokat expresszáló hibridómasejteket ⁵¹Cr-mal telítettük, és azokat CD16 ·^ kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött, humán citolitikus limfociták (CTL-ek) növekvő mennyiségével inkubáltuk. Az ^5ICr-felszabadulás százalékos arányát az effektorsejt (CTL)/célsejt (hibridómasejt) arány („effector/target”, e/t) függvényében ábrázoltuk. Sötét karikák: CD16: ζ kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis („mean fluorescence intensity”, átlagos fluoreszcenciaintenzitás; mfí: 18,7); sötét négyzetek: CD16^-Asp66* kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 940,2); üres négyzetek: CD16^-Glu60* kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 16,0); üres karikák: CD16'^-Tyr51* kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 17,4); sötét háromszögek: CD16^-Phe34* kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 17,8); üres háromszögek: nem kiméra CD16-ot expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 591). Bár ebben a kísérletben a CD16^-Asp66* kiméra expressziójának mértékét nem hasonlítottuk össze a többi fúziós protein expressziójának mértékével, ugyanebben a kísérletben a CD16^-t azonos szinten expresszáló sejtek által közvetített citolízis eredménye lényegében megegyezett a CD16^-Asp66* kimérát expresszáló sejtek eredményével.

A 9a-d. ábrák azt szemléltetik, hogy a transzmembrán-kölcsönhatások létrehozására való képesség megszüntetésével egy olyan rövid z-szegmenst sikerült azonosítani, amely képes citolízis közvetítésére. A 9a. ábra a monomer, két részből álló és három részből álló kimérák vázlatos ábrázolása. Az ábra felső részén azt a CD 16: ζ konstrukciót látjuk, amely a 65. aminosavpozíciónál csonka, és amelyből a transzmembrán Cys és Asp aminosavak hiányoznak. Ez alatt a CD16:CD5^, CDI 6 :ϋϋ7:ζ konstrukciókat és a megfelelő kontrollokat ábrázoltuk. Az intracelluláris doménok peptidszekvenciája az ábra alján található. A 9b. ábra monomer, kiméradeléciós mutánsok citolitikus aktivitását szemlélteti. A ϋϋ16:ζ konstrukciót expresszáló sejtek citolitikus aktivitását (sötét karikák, mfi: 495) összehasonlítottuk CD16: ζ-Asp66* kimérát expresszáló sejtek citolitikus aktivitásával (sötét négyzetek, mfi: 527) vagy a CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Asp66* (üres négyzetek, mfi: 338) és a CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* (sötét háromszögek, mfi: 259) mutánsokat expresszáló sejtek aktivitásával. A 9c. ábra három részből álló fúziós proteinek által közvetített citolitikus aktivitást ábrázol. Sötét háromszögek: CD16: ζ-Αβρόό*; üres négyzetek: CD16:5^-(48-65); sötét négyzetek: ϋϋ16:7:ζ-(48-65); üres háromszögek:

ϋϋ16:7:ζ-(48-59); üres karikák: CD16:5; sötét karikák: CD16:7. A 9d. ábra mutáns és három részből álló kimérák által JRT.3T3.5 jelű, TCR-negativ Jurkat-sejtvonalban létrehozott kalciummobilizációt ábrázol. Üres karikák: dimer CD16:í-Asp66*-t expresszáló sejtek válaszreakciója; sötét négyzetek: CD16: ζ-Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66* kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója; üres négyzetek: CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója; sötét háromszögek: ϋϋ16:7:ζ-(48-65) kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója; üres háromszögek: ϋϋ16:ζ-(48-59) kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója.

A lOa-f. ábrák azt mutatják, hogy az egyes aminosavak mennyiben járulnak hozzá a 18 aminosavból álló, citolitikus szignáltranszdukciós elem aktivitásához. A 10a. és 10b. ábrák citolitikus aktivitást ábrázolnak, a 10c. és lOd. ábrák pedig a karboxi-terminális tirozin (Y62) közelében pontmutációkat hordozó kimérák által közvetített kalciumion-mobilizációt szemléltetik. A 10a. és 10b. ábrák a CD16: ζ fúziós proteineket kis és nagy mennyiségben expresszáló sejtek vizsgálatával kapott adatokat mutatnak. A kalciummobilizációs és a citolitikus vizsgálati eljárás esetében azonos szimbólumokat alkalmaztunk, azokat egybetűs kódokkal a jobb oldalon jelöltük. Sötét karikák: CD16-ot expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 21, a b. ábrán: 376); sötét négyzetek: CD16:7:ζ-(48-65) kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 31, a b. ábrán: 82); üres négyzetek: CD16:7^-(48-65)-Glu60Gln kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 33, a b. ábrán: 92); keresztek: CD16:7^-(48-65)-Asp63Asn kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 30, a b. ábrán: 74); sötét háromszögek: CD16:7^-(48-65)-Tyr62Phe kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 24, a b. ábrán: 88); üres karikák: CD16:7^-(48-65)-Glu61Gln kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 20, a b. ábrán: 62); üres háromszögek: CD16:7^-(48-65)-Tyr62Ser kimérát expresszáló sejtek (mfi a b. ábrán: 64). A lOd. és lOe. ábrák citolitikus aktivitást ábrázolnak, a lOf. ábra pedig az amino-terminális tirozin (Y51) közelében pontmutációkat hordozó kimérák által közvetített kalciumion-mobilizációt szemléltetik. A kalciummobilizációs és a citolitikus vizsgálati eljárások esetében azonos szimbólumokat alkalmaztunk, azokat a jobb oldalon jelöltük. Sötét karikák: CD 16-t expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 21,2, az e. ábrán: 672); sötét négyzetek: ϋϋ16:7:ζ-(48-65) kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 31,3, az e. ábrán: 179); sötét háromszögek: CD16:7^-(48-65)-Asn48Ser kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 22,4, az e. ábrán: 209); üres négyzetek: CD16:7^-(48-65)-Leu50Ser kimérát expresszáló (mfi a d. ábrán: 25,0, az e. ábrán: 142); üres háromszögek: CD16:7: ζ-(48-65)-Τ>τ5lPhe kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 32,3, az e. ábrán: 294).

A lla-b. ábrák a ζ-lánc belső ismétlődő egységeinek összevetését, valamint azok azon képességének összehasonlítását mutatja, hogy mennyiben képesek citolízis létrejöttének elősegítésére. A lla. ábra olyan ki10

HU 220 100 Β mérák vázlatos ábrázolása, amelyeket úgy állítottunk elő, hogy a ζ-lánc intracelluláris doménjét három részre osztottuk, majd azokat CD16:7 kiméra transzmembrándoménjához kapcsoltuk. Az intracelluláris doménok szekvenciáját az ábra alján jelöltük; a közös aminosavakat bekereteztük, az egymással rokonságban álló aminosavakat pedig csillaggal jelöltük. A 1 lb. ábra a három ζ-szubdomén citolitikus képességét mutatja. Sötét karikák: CD16:£-t expresszáló sejtek (mfi: 476); sötét négyzetek: CD16:7:£-(33-65) (mft: 68); üres négyzetek: CD16:7:£-(71-104) (mfi: 114); sötét háromszögek: CD16:7:£-(104-138) (mfi: 104).

A 12. ábra CD16:FcRyII kimérák vázlatos ábrázolása.

A 13a-b. ábrák kalciummobilizációs vizsgálat eredményeit mutatják CD4:FcRyII kimérák és CD16:FcRyII kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. A 13a. ábrán a kalciumszenzitív indo-1fluorofórral feltöltött sejtek által kibocsátott flureszcencia violából kékké történő változásának arányát ábrázoltuk az idő függvényében, miután a CD 16 extracelluláris doménjai közt ellenanyagokkal keresztkötéseket hoztunk létre. A 13b. ábrán az előzőhöz hasonló analízis során CD4:FcRyII kimérákat hordozó sejtek által kibocsátott fluoreszcencia violából kékké történő átmenete arányának növekedését ábrázoltuk ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően.

A 14a-b. ábrákon CD4:FcRyII kimérákat és CD16:FcRyII kimérákat expresszáló sejtekkel végzett citolízisvizsgálat eredményeit ábrázoltuk. A 14a. ábra anti-CD16 hibridómasejtekből (célsejtekből) felszabaduló ⁵¹Cr százalékos arányát mutatja, miután a sejteket növekvő mennyiségű, CD16:FcRyII kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfocitával (effektorsejtekkel) érintkeztettük. A 14b. ábra CD4:FcRyII kimérák által közvetített citotoxicitás analízisét ábrázolja HlV-burok-glikoproteineket expresszáló célsejtekkel szemben, a vizsgálatot az előzőhöz hasonló módon végeztük.

A 15a-e. ábrákon az FcRyII-A végződésen belül a citolízis szempontjából lényeges aminosavak azonosításának eredményét ábrázoltuk. A 15a. ábra a deléciós konstrukciók vázlatos ábrázolása. A 15b. és 15c. ábrákon CD16:FcRyII-A kimérák karboxiterminális deléciós variánsaival végzett kalciummobilizációs vizsgálat és citolízisvizsgálat eredményeit mutatjuk be. A 15d. és 15e. ábrákon a CD16:FcRyII-A intracelluláris részének amino-terminális végéből fokozatosan kevesebbet tartalmazó, három részből álló kimérákkal végzett kalciummobilizációs vizsgálat és citolízisvizsgálat eredményeit ábrázoltuk.

A 16. ábra (24. azonosító számú szekvencia) a CD3-delta-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 17. ábra (25. azonosító számú szekvencia) a T3-gamma-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 18. ábra (26. azonosító számú szekvencia) az mbl-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja;

a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 19. ábra (27. azonosító számú szekvencia) a B29receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 20a-e. ábrák a CD4-kimérák vázlatos ábrázolását tartalmazzák. Az „A” molekula CD4(Dl-D4):Ig:CD7, a ,3” molekula CD4(Dl,D2):Ig:CD7, a „C” molekula CD4(Dl-D4):Ig:CD7:£, a „D” molekula CD4(Dl,D2):Ig:CD7:£, az „E” molekula pedig CD4:£. A humán CD4-molekula extracelluláris doménját, amely megfelel a prekurzor 1-394. pozícióiban található aminosavaknak, egy BamHI helyen keresztül humán IgGl-molekula kapocsrégiójával, valamint CH1- és CH2-doménjával kapcsoltuk össze a korábbiakban leírtak szerint [Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi., 9, 347 (1990)], azzal az eltéréssel, hogy a humán Ig-szekvenciák cDNS-változatát alkalmaztuk vacciniavírus-rekombinánsokban expresszió létrehozására. A CD4-kimérák két doménból álló változatát úgy állítottuk elő, hogy a CD4-prekurzor-cDNS egyedi Nhel helyére (amely megfelel a 200. aminosavnak) BamHI adaptert inszertáltunk. A membránhoz kötődő szekvencia a humán, membránhoz kötött IgGl első exonjának 22 aminosavából áll, ezt a CD7-antigén 146-203. pozícióiban található aminosavak követték. A négy részből álló konstrukciók (C és D) jelközvetítő elemét („trigger motif”) a £-lánc 55-163. pozíciójában található aminosavak képezték. A ζ-láncot tartalmazó, négy részből álló konstrukciókban a ζ-lánc intracelluláris expresszálódását az intracelluláris doménnal reagáló, kereskedelemben hozzáférhető ellenanyag alkalmazásával mutattuk ki (Coulter).

A 21. ábra HIV-l-burok-glikoproteineket expresszáló célsejtek citolízisét szemlélteti, melyet a WH3 jelű, effektormolekulaként különböző CD4eredetű kimérákat expresszáló, citotoxikus T-sejt-klón közvetített. A citotoxicitási vizsgálathoz a WH3 jelű, humán CD8+, CD4 , HLA-B44 korlátozott T-sejt-vonalat 10% humán szérummal kiegészített IMDM tápfolyadékban tartottuk fenn, a korábbiakban leírtak szerint. A sejteket gamma-besugárzott (3000 rád), B44antigént hordozó mononukleáris sejtekkel, valamint 1 pg/ml koncentrációban alkalmazott phytohemagglutininnel (PHA) stimuláltuk. Egynapos stimulálást követően a PHA-t friss tápfolyadék hozzáadásával 0,5 pg/ml-re hígítottuk; 3 nap múlva a tápfolyadékot teljes egészében lecseréltük. A sejteket a citotoxicitási vizsgálatokban történő felhasználást megelőzően legalább 10 napig tenyésztettük. A sejteket a megfelelő rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, amint azt a vPE16 esetében leírtuk. A fertőzést további 3-4 órán át komplett tápfolyadékban végeztük, ezt követően a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és 1 χ 10⁷/ml sűrűségben szuszpendáltuk. „U” alakú fenékkel rendelkező mikrotitrálólemezek minden egyes mélyületéhez, melyek 100-100 μΐ komplett tápfolyadékot tartalmaztak, 100-100 μΐ sejtszuszpenziót adtunk, és kettes léptékű sorozathígításokat készítettünk. Valamennyi minta eseté11

HU 220 100 Β ben a spontán krómfelszabadulás és teljes krómfelvétel meghatározása céljából két-két mélyület nem tartalmazott limfocitákat. A célsejteket - az S3 jelű HeLa-alvonalat (HeLa-S3, ATCC) - a fent ismertettek szerint 10 cm átmérőjű edényekben vPE16-tal fertőztük. 10⁶fertőzött sejtet 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS alkalmazásával az edény faláról leválasztottunk, centrifugáltunk, és 1 órán át 37 °C-on 100 μΐ ⁵¹Cr-nátrium-kromát-oldatban szuszpendáltunk (1 mCi/ml, PBS-ben oldva), majd PBS-sel háromszor mostuk. Valamennyi mélyülethez 100 μΐ jelölt célsejtet adtunk. A mikrotitrálólemezeket 750 g-n 1 percig centrifugáltuk, majd 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő végén a sejteket valamennyi mélyületben óvatos pipettázással felszuszpendáltuk, és azokból a teljes beépült beütésszám meghatározása céljából egy-egy mintát eltávolítottunk, majd a mikrotitrálólemezeket 750 g-n 1 percig centrifugáltuk. A felülúszókból mintákat vettünk (100 μΐ), és gamma-sugár szcintillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Az effektorsejt: célsejt arányt áramlásos citometriával történő meghatározás alapján a fertőzött sejtek százalékos arányával korrigáltuk.

A 22. ábra HIV-l-vírus replikációját ábrázolja transzfektált sejtvonalakban. Vad típusú CD4-antigént és különböző rekombináns kimérákat stabilan expresszáló sejtvonalakat állítottunk elő a 293 jelű humán, embrionális vesesejtvonal egy alvonalában. Előállítottuk a HIV-1 IIIB izolátum vírustörzstenyészetét, amely határhígításos analízis szerint milliliterenként körülbelül 10⁶ fertőző részecskét tartalmazott; az analízisben indikátorként a C8166 jelű, humán T-sejtvonalat alkalmaztuk. A fertőzésnél a fertőzési többszörös („multiplicity of infection”, MO1) értéke körülbelül 1 volt, a fertőzést 8-12 órán át 37 °C-on végeztük. A következő napon a sejteket PBS-sel háromszor mostuk, tripszineztük, új edényekbe oltottuk, és a tenyészet felülúszójából a p24-titer meghatározása céljából mintát vettünk (a mintavétel napját 0. napként jelöltük). Ezt követően 3-4 napos időközökben a sejttenyészet felülúszójából mintákat vettünk, és azokat p24-analízis céljára félretettük. A sejteket 100 pg/ml koncentrációban hygromycin-B-t tartalmazó friss tápfolyadékkal láttuk el. A sejttenyészetből származó felülúszók analízisét a kereskedelemben hozzáférhető, ELISA-eljáráson alapuló, HÍV - l-p24 antigén kimutatására szolgáló reagenskészlet alkalmazásával végeztük (Coulter) a gyártó utasításai szerint. Az eredmények két hasonló ideig tartó, egymástól független kísérlet eredményeit képviselik.

A 23. ábra aCD4 D1-D4 doménjainak nukleinsavés aminosavszekvenciáját mutatja (CD4-Bam).

A 24. ábra a CD4 D1-D2 doménjainak nukleinsavés aminosavszekvenciáját mutatja (CD4-Nhe).

A 25. ábra a humán IgGl kapocsrégiójának, valamint CH2- és CH3-doménjainak nukleinsav- és aminosavszekvenciáját mutatja (Igh23-Bam).

A 26. ábra a CD7 transzmembrándomén nukleinsavés aminosavszekvenciáját mutatja (TM7-Bam-Mlu).

A 27. ábra a zéta-lánc intracelluláris doménjának nukleinsav- és aminosavszekvenciáját mutatja (Zéta-Mlu-Not).

A 28. ábra szintetikus alfa-hélix DNS-szekvenciáját és elsődleges aminosavszekvenciáját mutatja.

1. példa

Humán IgGl :receptorkimérák előállítása

Humán IgGl nehézlánc-szekvenciákat úgy állítottunk elő, hogy a CH3-doménban található szekvenciákat az ellenanyag-mRNS transzmembrán formájának 3’-végéből származó cDNS-fragmenshez kapcsoltuk. A 3’-végi fragmenst polimeráz-láncreakciós eljárással, szubsztrátként tonsilla-cDNS-génkönyvtár felhasználásával, a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotidok alkalmazásával kaptuk meg: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (7. azonosító számú szekvencia), valamint CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (8. azonosító számú szekvencia), amelyek megfeleltek a kívánt DNSfragmens 5’- és 3’-végének. Az 5’-végi oligonukleotid komplementer a humán IgGl C_Hl-doménjában található hellyel, a 3’-végi oligonukleotid pedig komplementer a membránt átszelő domént kódoló szekvenciától közvetlenül 5’-irányban található hellyel. A PCRterméket BstXI és BamHI enzimekkel emésztettük, majd egy variábilis és konstans régiókat hordozó, félszintetikus IgGl ellenanyaggén BstXI és BamHI hasítási helyei közé ligáltuk. A BstXI-BamHI fragmens inszertálását követően a konstrukció amplifikált részeit a C_H3-doménban található Smal hasítási helyig bezárólag restrikciós fragmens cserével helyettesítettük úgy, hogy csak a Smal hely és a 3’-oligonukleotid közti rész származott a PCR-reakcióból.

Humán IgGl: ζ kimérareceptor előállítása céljából a BamHI hellyel végződő nehézlánc-gént az alábbiakban ismertetett ζ-kiméra BamHI hasítási helyével kapcsoltuk össze úgy, hogy az ellenanyag-szekvenciák képezzék az extracelluláris részt. A kimérát kódoló plazmiddal transzfektált COS-sejtek áramlási citométeres analízisével - amennyiben a sejteket egyidejűleg könnyűlánccDNS-t kódoló expressziós plazmiddal transzfektáltuk ellenanyag-determinánsok nagy mennyiségű expresszálódását sikerült kimutatni, és mérsékelt szintű expresszálódást tudtunk kimutatni abban az esetben, ha a könnyűlánc expressziós plazmid nem volt jelen.

Hasonló kimérákat, például η- vagy γ-láncokkal (lásd az alábbiakban) vagy egy T-sejt-receptor-protein vagy Fc-receptor-protein bármely szignáltranszdukciós részével fuzionáltatott humán IgGl-et, általánosságban a fentiekben ismertetettek szerint, a molekuláris biológiában ismert technikák alkalmazásával állíthatunk elő.

Olyan különálló transzkripciós egység előállítása céljából, amely egyetlen promoterről mind nehéz-, mind könnyűláncok expresszálódását lehetővé teszi, nehéz- és könnyűlánc-kódoló szekvenciákból és a másképp grp78-proteinként vagy BiP-ként ismert, 78 kD molekulatömegű, glükózszabályozás alatt álló proteint kódoló mRNS 5’-végi nem transzlálódó részéből bicisztronos mRNS-t kódoló plazmidot állítottunk elő. A grp78-szekvenciákat humán genomi DNS-ről, PCRreakcióval kaptuk az 5’- és 3’-végen a következő oligo12

HU 220 100 Β nukleotidok felhasználásával: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (9. azonosító számú szekvencia), valamint CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (10. azonosító számú szekvencia). A fenti oligonukleotidok alkalmazásával végzett polimeráz-láncreakciót 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében végeztük. A PCR-ral kapott fragmenst NotI és HincII enzimekkel emésztettük és humán IgGl kódolószekvenciáktól 3’-irányban található NotI és Hpal helyek közé inszertáltuk. Ezt követően a grp78 vezetőszekvenciától 3’-irányban humán IgGkappa-könnyűlánc-cDNS-t kódoló szekvenciákat inszertáltunk a HincII hely és egy, a vektorban található másik hasítási hely felhasználásával. A fenti manipulációk eredményeképp létrejött expressziós plazmid a következőket tartalmazta: a félszintetikus nehézláncgént, ezt követően a grp78 gén eredetű vezetőszekvenciákat, majd kappa-könnyűlánc-cDNS-szekvenciákat, végül SV40 DNS-fragmens erdetű poliadenilezési szignálokat. COS-sejtek transzfektálása a fenti expressziós plazmiddal nehézlánc-determinánsok lényegesen magasabb szintű expresszálódását eredményezte, mint a csak nehézlánc-determinánsokat kódoló plazmiddal történő transzfektálás.

Olyan bicisztronos gének előállítása céljából, amelyek nehézlánc/receptorkimérát és könnyűláncot tartalmaznak, az 5’-végi nehézlánc-szekvenciákat bármely, a leírásban ismertetett kiméra, nehézlánc/receptor génnel helyettesíthetjük.

2. példa

CD4-receptorkimérák előállítása

Humán ζ- [Weissman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 9709 (1988)] és γ- [Küster és munkatársai: J. Bioi. Chem., 265, 6448 (1990)] cDNS-eket polimeráz-láncreakcióval állítottunk elő a HPB-ALL jelű tumorsejtvonalból [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8573 (1987)], valamint humán természetes ölősejtekből készített génkönyvtárak alapján, míg η-cDNS-t [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 3319 (1990)] egér-thymocitagénkönyvtárból izoláltunk. A ζ-, η- és γ-cDNS-eket a CD4 egy olyan módosított formájának extracelluláris doménjához kapcsoltuk, amely a membránt átszelő doméntól közveltenül 5’-irányban egy BamHI hasítási helyet tartalmazott [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8573 (1987); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi., 8, 347 (1990)]; ezt a hasítási helyet a ζ- és η-cDNS-ekben hasonló pozícióban, a membránt átszelő doméntól 5’-irányban, attól néhány nukleotid távolságra található, természetben előforduló BamHI hasítási hellyel kapcsoltuk össze (1., 3., 4. és 6. azonosító számú szekvenciák). A γ-lánccal alkotott fúziós protein előállítása céljából a szekvenciában az előzővel körülbelül azonos pozícióban, géntechnikai eljárással egy BamHI helyet hoztunk létre (1. ábra, 2. és 5. azonosító számú szekvenciák). A génfúziókat szelekciós markerként az E. coli gpt génjét hordozó vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk és homológ rekombinációs technikával, valamint mikofenolsav jelenlétében növekedésre történő szelekcióval [Falkner és munkatársai: J. Virol., 62, 1849 (1988); Boyle és munkatársai: Gene, 65, 123 (1988)] a vaccinia-WR törzs genomjába inszertáltuk. Áramlásos citométerrel végzett analízis szerint a vacciniarekombinánsok a sejtfelszínen CD4^ és CD4:y fúziós proteinek nagy mennyiségű termelődését eredményezték, míg a CD4:r| lényegesen gyengébben expresszálódott (lb. ábra). Az utóbbi jelenség összhangban van egy nemrégiben megjelent közleménnyel, mely szerint egér-hibridómasejtvonal η-cDNS expressziós plazmiddal történő transzfekciója lényegesen kisebb mértékű expressziót eredményezett, mint a megfelelő ζ-cDNS expressziós plazmiddal történő transzfekció [Clayton és munkatársai: J. Exp. Med., 172, 1243 (1990)]. A vacciniarekombinánsokkal fertőzött sejtek immunprecipitációja azt mutatta, hogy a fúziós proteinek a természetben előforduló CD4-antigéntől eltérően kovalens dimereket képeznek. A CD4^ és CD4:y fúziós proteinek monomer formáinak, valamint a natív CD4antigénnek a molekulatömege 63, 55 és 53 kD-nak bizonyult. A fúziós proteinek nagyobb molekulatömege körülbelül megfelel az intracelluláris rész nagyobb méretének, amely 75 (CD4^) vagy 5 (CD4:y) aminosavval hosszabb, mint a natív CD4-ben található megfelelő rész.

3. példa

A CD4-kimérák képesek más receptorláncokkal történő összekapcsolódásra

Transzfektánsokban a humán FcyRIII (CD16_TM) makrofágokban és természetes ölősejtekben előforduló formájának sejtfelszíni expresszálódását egér- [Korosaid és munkatársai: Natúré, 342, 805 (1989)] vagy humán [Hibbs és munkatársai: Science, 246, 1608(1989)] γ-lánccal vagy humán ζ-lánccal történő egyidejű transzfekció elősegíti [Lanier és munkatársai: Natúré, 342, 803 (1989)].

A fenti közleményekkel összhangban a kimérák expresszálódása akkor is lehetővé tette CD16_TM sejtfelszíni expresszióját, ha kimérákat kotranszfekcióval vagy rekombináns vacciniavírusokkal történő fertőzéssel juttattuk a célsejtekbe (2. ábra). A CD16_TM sejtfelszíni expresszálódását a vizsgált sejtvonalakban a ζkiméra sokkal nagyobb mértékben segítette elő, mint a γ-kiméra (2. ábra), míg a natív CD4 nem fokozta a CD16_tm sejtfelszíni expresszálódását.

4. példa

Az Asp-Cj-mutánsok nem kapcsolódnak Fc-receptorokkal

Létező antigénnel vagy Fc-receptorokkal nem kapcsolódó kimérák előállítása céljából olyan mutáns ζlánc fúziós proteineket állítottunk elő, amelyekben a membrán belsejében található Asp aminosav vagy a membrán belsejében található Cys aminosav vagy mindkettő hiányzott. Áramlásos citométerrel végzett analízis szerint a különböző mutáns kimérák sejtfelszíni expresszálódásának intenzitása nem tért el lényegesen a mutációt nem tartalmazó prekurzorokétól, immunprecipi13

HU 220 100 Β tációs kísérletek pedig azt mutatták, hogy a kimérák által létrehozott expresszió összességében hasonló mértékű volt. A várakozásnak megfelelően a transzmembrán cisztein aminosavat nem tartalmazó mutáns kimérák nem képeztek diszulfídhidak által összekapcsolt kimérákat. Az Asp aminosavakat nem tartalmazó mutáns kimérák nem voltak képesek CD 16™ sejtfelszíni expressziójának elősegítésére, míg a Cys aminosavat nem, de Asp aminosavat tartalmazó monomer kimérák lehetővé tették CD16_TM expresszálódását, bár az eredeti dimemél kisebb hatékonysággal (3. ábra).

5. példa

A mutáns receptorok megtartják kalcium-válaszreakciót kiváltó képességüket

Annak meghatározása céljából, hogy a fúziós proteinek közti keresztkötések létrehozása - ismereteink szerint a T-sejtes antigénreceptorok esetében történtekhez hasonló módon - lehetővé teszi-e szabad intracelluláris kalcium felhalmozódását, a Jurkat-E6 jelű, humán T-sejtes leukémia-sejtvonal (ATCC nyilvántartási szám: TIB 152, „American Type Culture Collection”, Rockville, MD) sejtjeit a vacciniarekombinánsokkal fertőztük, és az extracelluláris doménok között ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően meghatároztuk a relatív citoplazmáris kalciumkoncentrációt. Aramlásos citométeres meghatározásokat végeztünk a kalciumszenzitív Indo-1-festékkel feltöltött sejtek alkalmazásával [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem., 260, 3340 (1985); Rabinovitc és munkatársai: J. Immunoi., 137, 952 (1986)]. A 4a-d. ábrák a kalciumáramlási kísérletek eredményeit ábrázolják CD4^ kimérával, valamint az Asp és Cys^_^-mutánsokkal fertőzött sejtek esetében. A kimérák közti keresztkötések létrehozása reprodukálható módon fokozta az intracelluláris kalciumkoncentrációt. A CD4:r| és CD4:y kimérák hasonlóképp lehetővé tették az intracelluláris kalcium felhalmozódását a fertőzött sejtekben. A Jurkat-sejtek esetében alacsony szintű, sejtfelszíni CD4-expresszió mutatható ki, a natív CD4-ek közti keresztkötések létrehozása azonban sem CD16^ jelenlétében, sem hiányában nem változtatta meg az intracelluláris kalciumszintet (4a-b. ábrák).

6. példa

CD4:C,-, η- és y-kimérák HIV-gpl20/41 antigéneket expresszáló célsejtek citolízisét közvetítik

Annak megállapítása céljából, hogy a kimérareceptorok képesek-e citolitikus effektorprogramok kiváltására, a gpl20/gp41 jelű HlV-burokprotein-komplex CD4 által történő felismerésén alapuló célsejt :effektorsejt rendszerből álló modellt dolgoztunk ki. HeLasejteket gpl20/gp41 komplexeket expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk [Chakrabarti és munkatársai: Natúré, 320, 535 (1986); Earl és munkatársai: J. Virol., 64, 2448 (1990)] és⁵'Cr-mal jelöltünk. A jelölt sejteket olyan humán, allospecifikus, citotoxikus T-limfocita sejtvonalból (CD8⁺, CD4 ) származó sejtekkel inkubáltuk, amelyeket ΰΟ4:ζ-, η- vagy γ-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal vagy a CD4^-CysllGly:Aspl5Gly kettős mutáns kimérával fertőztünk. Az 5a-c. ábrák azt mutatják, hogy a gpl20/gp41 komplexeket expresszáló HeLa-sejteket a CD4-kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfociták (CTL-ek) specifikus módon lizálják. A nem fertőzött HeLa-sejteket a CD4^ kimérákkal felfegyverzett CTL-ek nem támadták meg célzottan, és a gpl20/gp41 komplexeket expresszáló HeLa-sejteket nem fertőzött T-limfociták nem ismerték fel. A különböző kimérák hatékonyságának összehasonlítása céljából az effektorsejt: célsejt arány a CD4-kimérákat expresszáló CTL-ek, valamint a gpl20/gp41 komplexeket expresszáló HeLa-sejtek részarányának megfelelően korrigáltuk, mely arányokat aramlásos citométeres analízissel határoztunk meg. Az 5c. ábra az 5a. és 5b. ábrákon látható citolízises kísérletekben felhasznált CTL-ek által történő CD4-expresszió citometriás analízisét ábrázolja. Bár a CD4 ^-^ átlagos sejtfelszíni denzitása nagymértékben meghaladta a CD4:q denzitásának átlagos mértékét, bármely formát expresszáló sejtek hasonló citolitikus képességgel rendelkeztek. A gpl20-antigént expresszáló célsejtek részarányára történő korrekciót követően a CD4: ζ és CD4: η proteinek által közvetített citolízis hatékonysága összehasonlítható mértékű volt specifikus T-sejt-receptor-célsejt:effektorsejt párok esetében közölt legjobb hatékonysági mutatókkal (CD4^ kimérákat expresszáló T-sejtek esetében az 50%-os felszabadulást eredményező, átlagos effektorsejt:célsejt arány 1,9+/-0,99 volt, n=10). A CD4:y fúzió, valamint a transzmembrán Asp és Cys aminosavakat nem tartalmazó CD4: ζ fúziók kevésbé bizonyultak aktívnak. Mindkét esetben azonban szignifikáns mértékű citolízis volt megfigyelhető (5b-c. ábrák).

Annak a lehetőségnek a kizárása céljából, hogy a vacciniafertőzés esetleg a komplexek CTL-ek által történő mesterségesen előidézett felismerését hozza létre, az előzőhöz hasonló citolíziskísérleteket végeztünk a CD16 foszfatidil-inozitol kötött formáját (CD16_P[-t) expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött és ⁵¹Cr-mal jelölt célsejtek, valamint CD17_PI-t vagy CD16^-t expresszáló kontrollrekombinánsokkal fertőzött CTL-ek alkalmazásával. A 6a. ábra azt mutatja, hogy nem CD4kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a natív HeLa-sejteket vagy a gpl20/gp40 komplexeket expresszáló HeLa-sejteket, hasonlóképp a CD4-kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a vacciniavírus által kódolt egyéb felszíni proteineket expresszáló HeLasejteket. Ezenfelül nem kiméra CD4-et expresszáló CTL-ek nem eredményezik a gpl20/gp41 komplexeket expresszáló HeLa-sejtek szignifikáns mértékű citolízisét (6a. ábra).

7. példa

Az MHC-Il-antigént hordozó sejteket nem ismerik fel célzottan a kimérák

A CD4-ről leírták, hogy kölcsönhatásba lép egy, a

II. osztályú MHC-antigén által expresszált, nem polimorf szekvenciával [Gay és munkatársai: Natúré, 328, 626 (1987); Sleckman és munkatársai: Natúré, 328, 351 (1987)]. Bár a CD4 és a II. osztályú MHC-antigén

HU 220 100 Β közti specifikus kölcsönhatás létrejöttét tisztított proteinek alkalmazásával soha nem mutatták ki, CD4-et expresszáló sejtek és II. osztályú MHC-molekulákat expresszáló sejtek között bizonyos körülmények között adhézió mutatható ki [Doyle és munkatársai: Natúré, 330, 256 (1987); Clayton és munkatársai: J. Exp. Med., 172, 1243 (1990); Lamarre és munkatársai: Science, 245, 743 (1989)]. Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a sejtlízis kimutatható-e a II. osztályú antigéneket hordozó sejtekkel szemben. A 6b. ábra azt mutatja, hogy a Οϋ4:ζ kiméra nem eredményezi a nagy mennyiségű II. osztályú antigént expresszáló Raji-féle B-sejt eredetű sejtvonal specifikus citolízisét. Bár mérsékelt (körülbelül 5%) citolízis megfigyelhető volt, a Raji-féle sejtvonal RJ2.2.5 jelű, II. osztályú antigénre nézve negatív mutánsai [Accola: J. Exp. Med., 157, 1053 (1983)], valamint nem fertőzött T-sejtekkel inkubált Raji-sejtek hasonló érzékenységet mutattak.

8. példa

A T-sejt-antigén/Fc-receptor-zéta-lánc által kiváltott citolízis kiváltásához szükséges szekvenciák azonosítása

Bár a CD4 és a ζ-lánc közti kimérák citotoxikus Tlimfocitákat (CTL-eket) képessé tesznek HIV-gpl20 antigéneket expresszáló célsejtek elpusztítására, a humán T-sejtes sejtvonalakba bejuttatott zéta-kimérák sajátságainak egyértelmű összehasonlíthatósága céljából a CD4 alkalmazásán kívül egyéb lehetőségeket is megvizsgáltunk. Az ilyen sejtvonalak képesek CD4 expresszálására, ami megnehezíti a kalciummobilizáció típusa vagy foka, valamint a különböző kimérák citotoxikus képessége közti viszony pontos meghatározását. Ennek áthidalására olyan ζ-lánc és CD16 alkotta kimérákat állítottunk elő, amelyekben a CD16 extracelluláris doménjét a ζlánc transzmembrán- és intracelluláris szekvenciáival kapcsoltuk össze (7a. ábra). A génfúziót szelekciós markéiként az E. coli gpt génjét hordozó, vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk, majd homológ rekombinációs eljárással, valamint mikofenolsav jelenlétében történő szaporodásra végzett szelekcióval vaccinia-WR törzs genomjába inszertáltuk [Falkner és Moss.: J. Virol., 62, 1849 (1988); Boyle és Coupar: Gene, 65, 123 (1988)].

A vacciniarekombinánsokkal T-sejteket fertőztünk, és az extracelluláris doménok közt ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően meghatároztuk a citoplazmában a relatív szabad kalciumionkoncentrációt. Indo-l-festékkel telített sejtek alkalmazásával spektrofluorometriás (a sejtpopuláció egészére vonatkozó), valamint áramlásos citométeres (az egyes sejtekre vonatkozó) analízist végeztünk [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem., 260, 3340 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi., 137, 952 (1986)]. A 7b. ábra ϋϋ16:ζ fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött Jurkat-féle humán T-sejtes leukémia-sejtvonal esetében kapott adatok analízisét ábrázolja. A kimérák közti keresztkötések létrehozása reprodukálható módon fokozta az intracelluláris kalciumkoncentrációt, míg nem kiméra CDI 6-ot expresszáló sejtek hasonló kezelésének kismértékű hatása volt, vagy a kezelés hatástalan volt. Amennyiben a kimérákat antigénreceptort nem tartalmazó REX33A jelű [Breitmeyer és munkatársai: J. Immunoi., 138, 726 (1987); Sancho és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 20 760 (1989)] vagy Jurkat-féle sejtvonalból származó JRT3.T3.5 jelű mutáns sejtvonalakban expresszáltattuk [Weiss és munkatársai: J. Immunoi., 135, 123 (1984)], a CD16 keresztkötések létrehozását követően erős válaszreakció volt megfigyelhető. Hasonló eredményeket kaptunk a REX20A jelű mutáns sejtvonal [Breitmeyer és munkatársai: lásd fent (1987); Blumberg és munkatársai: J. Bioi. Chem., 265, 14 036 (1990)], valamint laboratóriumunkban kifejlesztett, a Jurkat-féle sejtvonalból származó CD3/Ti-negatív mutánsok alkalmazásával. A CD16^-t expresszáló rekombinánsokkal történő fertőzés nem állította helyre az anti-CD3-ellenanyagra adott válaszreakciót, ami azt jelenti, hogy a fúziós protein nem az intracelluláris CD3 komplexláncok kimentésén („rescueing”) keresztül fejti ki hatását.

A kimérák módosított irányú, sejt által közvetített immunitást létrehozó képességének értékelésére CTL-eket CD16-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és a sejtekkel membránhoz kötött antiCD16-ellenanyagokat expresszáló hibridómasejteket specifikusan lizáltattuk. Ez a vizsgálati eljárás a hibridóma-citotoxicitási vizsgálati eljárás kiterjesztett változata, amelyet eredetileg Fc-receptorokat hordozó sejtek effektormechanizmusainak analízisére fejlesztettek ki [Graziano és Fanger: J. Immunoi., 138, 945 (1987); Graziano és Fanger: J. Immunoi., 139, 35 (1987); Shen és munkatársai: Mól. Immunoi., 26, 959 (1987); Fanger és munkatársai: Immunoi. Today, 10, 92 (1989)]. A 8b. ábra azt mutatja, hogy CD16^-^ kimérák citotoxikus T-limfocitákban történő expresszálódása képessé teszi a felfegyverzett CTL-eket 3G8 jelű [anti-CD16; Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 3275 (1982)] hibridomasejtek elpusztítására, míg a CD16 foszfatidil-inozitol kötött formáját expresszáló CTL-ek inaktívak. A CD16: ζ kimérákkal felfegyverzett CTL-ek egyéb ellenanyagot expresszáló hibridómasejtek elpusztítására nem képesek.

A citolízis létrehozásához szükséges minimális zszekvenciák meghatározására olyan deléciós mutánsokból álló sorozatot állítottunk elő, amelyekben a ζ-lánc intracelluláris doménja karboxi-terminális végéről fokozatosan egyre többet távolítottunk el (8a. ábra). A ζlánc intracelluláris doménjának nagyobb része eltávolítható anélkül, hogy az a citolitikus képességet nagyobb mértékben befolyásolná; a teljes hosszúságú CD16^ kiméra hatékonysága lényegében megegyezett a 65. aminosavig bezárólag deletált, CD16^Asp66* kiméráéval (8b. ábra). A citotoxicitás jelentős mértékű csökkenése volt megfigyelhető az 59. ζ-aminosavig terjedő deletálást követően (CD16^Glu60* kiméra), az 50. aminosavig teijedő további deléció pedig az aktivitás további kismértékű csökkenését eredményezte. Az aktivitás teljes mértékű elvesztése azonban még abban az esetben sem volt megfigyelhető, ha az intracelluláris

HU 220 100 Β domént három aminosavból álló transzmembrán horgonyszekvenciára csökkentettük (8b. ábra).

Mivel a ζ-lánc egy diszulfidhidakkal összekapcsolt dimer, a citolitikus képesség megmaradásának egy lehetséges magyarázata szerint a deléciót hordozó kiméra ζ-lánccal endogén ζ-lánc képez heterodimert, ezáltal helyreállítva annak aktivitását. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára a ζ-lánc 11. és 15. pozícióiban található Asp és Cys aminosavakat Gly aminosavakkal helyettesítettük (CysllGly/Aspl5Gly), és az alábbiak szerint immunprecipitációt végeztünk. Körülbelül 2xl0⁶CV1-sejtet egy órán át szérummentes DME tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett. A fertőzést követően 6-8 órával a sejteket 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk, majd laktoperoxidáz és H2O2 alkalmazásával, Clark és Einfeld eljárása szerint („Leukocyte Typing II”, 155. oldal, Springer-Verlag, NY, 1986), 2χ 10⁶ sejtre számítva 0,2 mCi ¹²⁵I-dal jelöltük. Ajelölt sejteket centrifúgálással összegyűjtöttük és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 Tris (pH=8,0), 5 mmol/1 MgCl2, 5 mmol/1 KC1, 0,2 mol/1 jód-acetamid és 1 mmol/1 PMSF. A sejtmagokat centrifúgálással eltávolítottuk, és a CD16-proteineket 3G8 ellenanyaggal [Fleit és munkatársai: lásd fent (1982); Medarex] és anti-egér-IgG-agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáltuk. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS gélen nem redukáló körülmények mellett vagy 10%-os gélen redukáló körülmények mellett elektroforetizáltuk. A fenti immunprecipitációs kísérletek igazolták, hogy a CD16: ζCysllGly/Aspl5Gly kiméra nem képez diszulfidhidakkal összekapcsolt dimer struktúrákat.

Teszteltük a mutáns receptorok citolitikus aktivitását is. A 65. aminosavig deletált mutáns kiméra (CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*) - a vizsgálati eljárásban alkalmazott körülményektől függően - a citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásban kétszer-nyolcszor bizonyult kevésbé aktívnak, mint a mutációt nem tartalmazó megfelelő kiméra ^ϋ16:ζΑ8ρ66*), amelynek a CD16^ kiméra aktivitásához viszonyított aktivitása rendszerint a kétszeres faktoron belül maradt vagy attól megkülönböztethetetlen mértékű volt (9b. ábra). A mutáns kimérák aktivitásának csökkenése összehasonlítható mértékű volt a hasonló struktúrával rendelkező CD4-kimérák esetében tapasztalt csökkenéssel (lásd fent), és az legvalószínűbben a ζ-monomerek dimerekhez viszonyított alacsonyabb hatékonyságának tudható be. Ezzel szemben az 59. aminosavpozícióig deletált Asp -, Cys~-mutáns kiméra nem rendelkezett citolitikus aktivitással (9b. ábra), ami azt a feltevést támasztja alá, hogy a 65. aminosavpozíciónál amino-terminális irányban továbbteqedő deléciót tartalmazó kimérák citolitikus aktivitásának alacsony szintű fennmaradásáért a transzmembrán Cys és/vagy Asp aminosavak által közvetített, más láncokkal létrejövő kapcsolódás felelős.

Aramlásos citométeres vizsgálatok szerint a transzmembrán Cys és Asp aminosavakat nem tartalmazó deléciós mutánsok TCR -mutáns Jurkat-féle sejtvonalban még képesek elősegíteni az ellenanyagokkal történő keresztkötések hatására bekövetkező szabad intracelluláris kalciumionkoncentráció-növekedést (9d. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk az eredeti Jurkat-féle sejtvonalban expresszáltatott kimérákkal is. A CD16^CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* kiméra esetében ezek az adatok azt mutatják, hogy a kalcium-válaszreakciót közvetítő képesség mutációk létrehozásával elkülöníthető a citolízist előidéző képességtől.

Abból a célból, hogy a ζ-lánc transzmembrán aminosavainak esetleges szerepét egyértelműen kizárjuk, a ζ-láncban található transzmembrán aminosavakat és az első 17 citoplazmáris aminosavat olyan szekvenciával helyettesítettük, amely a CD5- vagy CD7-antigénekben a membránt átszelő aminosavakat, valamint az első 14 vagy első 17 citoplazmáris aminosavat kódolta (9a. ábra). Az így kapott, három részből álló fúziós proteinek - a ϋΟ16:5:ζ(48-65) és a ϋϋ16:7:ζ(48-65) - az egyszerűbb CDló-ζ kimérákkal szemben nem képeznek diszulfidhidakkal összekapcsolt dimereket, mivel azokból hiányzik a ζ transzmembrándoménban található Cys aminosav. Mindkét, három részből álló kiméra képes volt Jurkat-sejtekben és TCR -negatív sejtvonalakban kalciummobilizáció kiváltására (9d. ábra), és CTL-ekben citolitikus válaszreakció előidézésére (a 9c. ábra, valamint az ábrán fel nem tüntetett adatok szerint). A CD16:7^(48-59) kimérában a ζ-résznek az 59. aminosavpozícióig terjedő megcsonkítása azonban megszünteti a három részből álló fúziós protein TCRpozitív vagy -negatív Jurkat-sejtekben kalcium-válaszreakciót közvetítő képességét, valamint érett CTL-ek esetében citolízist létrehozó képességét (a 9c. és 9d. ábrák, valamint az ábrán fel nem tüntetett adatok szerint).

A 18 aminosavból álló szekvencián belül az egyes aminosavak szerepének vizsgálata céljából helyspecifikus mutagenezissel számos mutáns variánst állítottunk elő, és meghatároztuk, hogy azok mennyiben képesek a kimérareceptor alacsony (10a. és lOd. ábra) és magas szintű (10b. és lOe. ábra) expressziója mellett receptor által közvetített sejtlizist létrehozni. A lOa-f. ábrák azt mutatják, hogy míg számos, az 59-63. aminosavak közé eső, viszonylag konzervatív szubsztitúció (azaz savas aminosavaknak rokon amidokkal vagy tirozinnak fenilalaninnal történő helyettesítése) mérsékelt fokban csökkentette a citolízis hatékonyságát, általánosságban a variánsok kalciummobilizációt kiváltó képességüket megtartották. Ezek az aminosavak azonban együttesen egy fontos almotívumot képeznek, amennyiben deléciójuk megszünteti a citolitikus aktivitást. A 62. pozícióban található Tyr helyettesítése Phe vagy Ser aminosavakkal mind a citotoxikus, mind a kalciumválaszt megszüntette. A 18 aminosavból álló szegmens amino-terminális végén az 51. pozícióban található Tyr helyettesítése Phe aminosawal mind a kalciummobilizációt, mind a citolitikus aktivitást megszüntette, míg az 50. pozícióban található Leu helyettesítése Ser aminosawal megszüntette a kalciumválaszt, de csak kismértékben csökkentette a citolízist. Anélkül, hogy igényünket egy adott feltevésre korlátoznánk, úgy gondoljuk, hogy a Leu50Ser mutáns kalciummobilizációs képességének a rövid távú áramlá16

HU 220 100 Β sós citométeres vizsgálatokban megfigyelhető elvesztése nem tükrözi teljes mértékben annak szabad intracelluláris kalciumion-koncentrációt jelentősen fokozó képességét a hosszabb időtartamot átölelő citolitikus vizsgálati eljárás során. Egyes citolitikus T-sejtvonalak esetében azonban kalciuminszenzitív citolitikus aktivitás létét írták le, és nem zárható ki az a lehetőség sem, hogy eredményeinknek hasonló jelenség képezi az alapját. Az Asn48 helyettesítése Ser aminosavval egyes kísérletekben részben csökkentette a citotoxicitást, míg más kísérletek során kismértékű hatást fejtett ki.

A redundáns szekvenciaelemek esetleges szerepének vizsgálata céljából a ζ-lánc intracelluláris doménját három szegmensre osztottuk, amelyek a 33-65., a 71-104. és a 104-138. aminosavakat fedték át. Valamennyi fenti szegmenst CD16:CD7 kimérával kapcsoltuk össze oly módon, hogy a CD7 intracelluláris doménjának membránkötő alapszekvenciájától közvetlenül disztális irányban egy Miül hasítási helyet iktattunk be (lásd az alábbiakban, lla. ábra). A három elem citolitikus hatékonyságának összehasonlítása azt mutatta, hogy azok hatékonysága lényegében megegyezik (llb. ábra). A szekvenciaösszehasonlítás szerint (1 la. ábra) a második szegmens tizenegy tirozin aminosavak közé eső aminosavat tartalmaz, míg az első és harmadik szegmens tizet.

Bár a T-sejt-aktiválás folyamata pontosan nem ismert, nyilvánvaló, hogy az antigénreceptor vagy ζ intracelluláris szekvenciákat hordozó receptorkimérák aggregációja kalciummobilizációt idéz elő, valamint citokinek és granulák tartalmának felszabadulását, és az aktivációs állapotra jellemző sejtfelszíni markerek megjelenését váltja ki. A ζ-lánc aktív helye - egy rövid lineáris peptidszekvencia, amely feltehetően túl kis méretű ahhoz, hogy belső enzimaktivitással rendelkezzék - valószínűleg egy vagy legfeljebb néhány proteinnel lép kölcsönhatásba a sejtaktiváció létrehozásához. Világos az is, hogy a szabad kalcium mobilizációja önmagában nem elegendő a sejtaktiváció kiváltásához, amint az is, hogy a citolízist közvetítő képesség mutációk létrehozásával elkülöníthető a kalciumfelhalmozódást kiváltó képességtől.

Amint azt a fentiekben leírtuk, a ζ-lánc intracelluláris doménjából származó, 18 aminosavból álló szegmens hozzákapcsolása két, azzal rokonságban nem álló protein transzmembrán- és intracelluláris doménjához képessé teszi a kapott kimérákat a fúziós proteinek extracelluláris részéhez kötődő célsejtekkel szemben citolitikus aktivitás létrehozására. A 18 aminosavból álló szegmenst hordozó kimérák azonban körülbelül nyolcszor kevésbé aktívak, mint a teljes ζ-láncon alapuló kimérák; a csökkent aktivitás transzmembrán-kölcsönhatások elvesztésének tudható be, amelyek normális körülmények között lehetővé teszik, hogy a vad típusú ζláncok diszulfidhidakkal összekapcsolt dimereket képezzenek. A szekvenciaelemmel azonos karboxi-terminális véggel rendelkező, de transzmembrán Cys és Asp aminosavakat nem tartalmazó ζ-lánc deléciós konstrukciók tehát tipikusan kissé alacsonyabb aktivitással rendelkeznek, mint a csak a 18 aminosavból álló szekvenciaelemet hordozó kimérák.

A citolitikus képességért felelős elem, amelyre a leírásban összpontosítottunk, két tirozint tartalmaz, és nem tartalmaz szerin vagy treonin aminosavakat, ami csökkenti annak lehetőségét, hogy az aktivitáshoz foszforilezésre van szükség. Bármelyik tirozin mutációja megszünteti azonban az aktivitást, és bár előzetes kísérletek nem mutatnak arra, hogy a 18 aminosavból álló szekvenciaelemet tartalmazó kiméra felületi antigének közti keresztkötések létrejöttét követően jelentős mértékű tirozinfoszforilezés következne be, nem zárható az a lehetőség, hogy ilyen foszforilezés alacsony szinten szerepet játszik az aktivitás létrehozásában. A két tirozinaminosav esetében említett hatásokon felül alacsony receptordenzitás mellett a szekvenciaelem amino- és karboxi-terminális végén számos aminosav helyettesítése gyengíti az aktivitást.

A ζ-lánc aktivitásáért felelős szekvenciaelemhez hasonló szekvenciák megtalálhatók több más transzmembránprotein citoplazmáris doménjában, például a CD3-6és -γ-molekulákban, a felszíni IgM-mel kapcsolt mbl- és B29-proteinekben, valamint az FceRI jelű, nagy affinitású IgE-receptor β- és γ-láncában [Reth és munkatársai: Natúré, 338, 383 (1989)]. Bár ezen szekvenciák funkciója még nem ismert, hatékony expresszálódás esetén valamennyi képes autonóm T-sejt-aktiválás létrehozására, és az ilyen aktivitás magyarázatul szolgálhat a zéta-negatív mutáns sejtvonalakban megfigyelhető, fennmaradó TCR-válaszkészségre [Sussman és munkatársai: Cell, 52, 85 (1988)].

Maga a ζ-lánc három, egymástól körülbelül egyforma távolságban elhelyezkedő ilyen szekvenciát tartalmaz; és az intracelluláris dómén három részre történő hozzávetőleges felosztása azt mutatja, hogy mindegyik képes citolitikus válaszreakció kiváltására. Az η-láncból, amely a ζ-lánc eltérő összeillesztési folyamat eredményeképp létrejövő („splice”) izoformja [Jin és munkatársai: lásd fent (1990); Clayton és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 5202 (1991)], hiányzik a harmadik szekvenciaelem karboxi-terminális fele. Mivel az első szekvenciaelem karboxi-terminális felének eltávolítása az aktivitás elvesztésével jár, valószínűnek látszik, hogy az η-lánc biológiai hatékonyságának nagyobb részéért az első két szekvenciaelem felelős. Az η-lánc az antigén által közvetített citokinfelszabadulás [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 3842 (1991)] vagy a célzott citolízis kiváltását tekintve (lásd fent) a ζ-lánc aktivitásával azonos - bár eltérő mértékű - aktivitással rendelkezik, az η-lánc receptorstimulálás hatására nem foszforileződik [Bauer és munkatársai: lásd fent (1991)]. A foszforileződés létrejöttéhez tehát vagy mindhárom szekvenciaelem jelenlétére szükség van, vagy a harmadik szekvenciaelem egy meg nem határozott tirozinkináz számára képez előnyös szubsztrátot.

9. példa

Humán Fc-receptor által közvetített citolitikus szignáltranszdukció

Különböző humán Fc-receptor-altípusok hatásainak vizsgálata céljából olyan kiméramolekulákat állítottunk elő, amelyekben a humán CD4-, CD5- vagy CDI 617

HU 220 100 Β antigének extracelluláris doménjét az FcRIIy-A, Bl, B2 és C altípusok transzmembrán- és intracelluláris doménjaival kapcsoltuk össze [Ravetch és Kinet nevezéktana szerint: Ann. Rév. Immunoi., 9, 457 (1991)]. Közelebbről, az előzőekben említett FcRII-, A-, Bl- és B2-izoformok transzmembrán- és citoplazmáris doménjainak megfelelő cDNS-szekvenciákat a korábbiakban már létező, PC23 jelű klón vagy humán tonsillából származó (ismert technikákkal előállított) cDNS-génkönyvtár alkalmazásával amplifikáltuk, az alábbi mesterséges úton előállított láncindító oligonukleotidok felhasználásával: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT [18. azonosító számú szekvencia; előre irányuló („forward”) FcRII-A]; CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT [19. azonosító számú szekvencia; ellenirányú („reverse”) FcRII-a]; GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G [20. azonosító számú szekvencia; előre irányuló („forward”) FcRII-Bl és FcRII-B2]; valamint GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC [21. azonosító számú szekvencia; ellenirányú („reverse”) FcRII-Bl és FcRII-B2]. Ezek a láncindító oligonukleotidok az 5’végtől 6 nukleotid távolságra hasítási helyeket tartalmaztak a BamHI vagy NotI enzimek számára. A NotI helyet közvetlenül egy antiszensz stopkodon - CTA vagy TTA - követte. Valamennyi láncindító oligonukleotid a kívánt fragmens 5’- vagy 3’-végével komplementer, 18 vagy több nukleotidot tartalmazott. Az FcRyII-C citoplazmáris doménjának megfelelő cDNSfragmenst, amely csak egy aminosav vonatkozásában tér el a IIA-izoformtól (a 268. pozícióban P helyett L található), helyspecifikus mutagenezissel, átfedő PCRreakcióval állítottuk elő a következő szekvenciákkal rendelkező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (22. azonosító számú szekvencia); valamint TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (23. azonosító számú szekvencia). A PCR-fragmenseket a CDI 6 vagy CD4 extracelluláris doménjait tartalmazó vacciniavírus expressziós vektorokba inszertáltuk, majd ezeket a timidinkináz lokusznál történő rekombinációval és a kívánt rekombinánsok azonosításának megkönnyítésére az E. coli gpt gén együttes beépülésére történő szelekcióval vad típusú vacciniavírusba inszertáltuk. Valamennyi izoform azonosságát (lásd

12. ábra) didezoxi-szekvenálással ellenőriztük.

A kimérareceptor-proteinek termelődését immunprecipitációs vizsgálatokkal is igazoltuk. Körülbelül 10⁷ JRT3.T35 sejtet egy órán át szérummentes IMDM tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett. A sejteket a fertőzést követően tizenkét órával összegyűjtöttük, és a laktoperoxidáz/glükóz-oxidáz módszer alkalmazásával (Clark és Einfeld, lásd fent) felszínüket 10⁷ sejtre számítva 0,5 mCi ¹²⁵I-dal jelöltük. A jelölt sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1 mmol/1 MgCl₂, 5 mmol/1 KC1, 0,2 mol/1 jód-acetamid és 1 mmol/1 PMSF. A sejtmagokat centrifúgálással eltávolítottuk, és a CD16 fúziós proteineket 4G8 ellenanyaggal és anti-egér-IgG-agarózzal immunprecipitáltuk. A mintákat redukáló körülmények mellett elektroforetizáltuk. Valamennyi immunprecipitált kimérareceptor a várakozásnak megfelelő molekulatömeggel rendelkezett.

Annak tesztelésére, hogy a kimérareceptorok mennyiben képesek a citoplazmáris szabad kalciumion-koncentráció fokozására, a rekombináns vírusokkal JRT3.T3.5 jelű, TCR”-mutáns Jurkat-sejtvonalat fertőztünk (a leírtak szerint), majd a receptorok extracelluláris doménjai közt 3G8 vagy Leu-3A jelű monoklonális ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően a sejtekben meghatároztuk a citoplazmáris szabad kalciumkoncentrációt (a fent leírtak szerint). A fenti kísérletek azt mutatták, hogy az FcRyII-A és -C intracelluláris doménjai az extracelluláris doménok közti keresztkötések létrehozását követően képesek voltak közvetíteni a citoplazmáris szabad kalciumkoncentráció fokozását, míg az FcRylIBl és -B2 intracelluláris doménjai hasonló körülmények mellett inaktívak voltak (13a. és 13b. ábrák). Az FcRyII-A CD4, CD5 és CD16 hibridjei lényegében azonos mértékben voltak képesek a kalciumválaszreakció létrejöttének elősegítésére (13a-b. ábrák). Más sejtvonalak - mind monocita, mind limfocita eredetű sejtvonalak - képesnek bizonyultak az extracelluláris doménok közti keresztkötések által közvetített szignálra adott válaszreakcióra.

Az FcRylI különböző intracelluláris doménjai citolízisben játszott szerepének vizsgálatára humán citotoxikus T-limfocitákat (CTL-eket) CD16:FcRyII-A, -Bl és -C kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk. A fertőzött sejteket olyan, ⁵¹Cr-mal feltöltött hibridómasejtekkel (azaz 3G8-10-2 sejtekkel) tenyésztettük együtt, amelyek CD16-antigénnel szemben sejtfelszíni ellenanyagokat expresszáltak. A fenti vizsgálatban a CD16-kimérákat hordozó CTL-ek - amennyiben a kiméra CD16-antigén eredetű extracelluláris doménját a limfocita effektorprogram aktiválására képes intracelluláris szegmenshez kapcsoltuk - elpusztították a hibridóma-célsejteket (lehetővé téve a szabad ⁵¹Cr felszabadulását); a citolízis meghatározására szolgáló fenti vizsgálati eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük. A 14a. ábra azt szemlélteti, hogy CD16: FcRyII-A és -C kimérákkal felfegyverzett CTL-ek képesek voltak sejtfelszíni anti-CD16 ellenanyagokat expresszáló célsejtek lizálására, míg a CD16:FcRyII-Bl vagy -B2 kimérákkal felfegyverzettek nem.

Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a specifikus citolízis valamiképp a CD16-csoporttal történő kölcsönhatás eredménye lenne, olyan citolíziskísérleteket végeztünk, amelyekben FcRII intracelluláris doménjait a CD4 extracelluláris doménjával kapcsoltuk össze. Ebben az esetben célsejtekként gpl20/41 jelű HlV-burokproteineket expresszáló HeLa-sejteket (közelebbről a vPE16 jelű vacciniavektorral fertőzött HeLa-sejteket; „National Institution of Allergy and Infectious Disease AIDS Depository”, Bethesda, MD) alkalmaztunk. Hasonlóképp a CD16-rendszerhez a HlV-burokproteineket expresszáló célsejtek érzékenyek voltak a

HU 220 100 Β

CD4: FcRylI-A kimérákat expresszáló T-sejtek lizálóhatásával szemben, de nem voltak érzékenyek a CD4:FcRyII-Bl vagy -B2 kimérákat expresszáló sejtekkel szemben (14b. ábra).

Az FcRyII-Α és -C nem mutat értékelhető szekvenciahomológiát semmilyen más proteinnel, beleértve a tágan értelmezett FcRγ/TCRζ család tagjait. A citolízis kiváltásáért felelős szekvenciaelemek meghatározása céljából olyan deléciós mutánsokat állítottunk elő, amelyek az intracelluláris domént kódoló szekvencia 5’- vagy 3’-végén deléciót hordoznak (lásd az alábbiakban és a 15a. ábrán), és kalciummobilizációs, valamint citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásokban (a leírtak szerint) vizsgáltuk azok hatékonyságát. Azokban a kísérletekben, amelyekben az intracelluláris dómén amino-terminális vége került eltávolításra, az FcRylI transzmembrándoménját az azzal rokonságot nem mutató CD7-antigén transzmembrándoménjával helyettesítettük, hogy a membránt átszelő dómén által közvetített kölcsönhatások esetleges szerepét kizárjuk.

A 15b. és 15c. ábrák azt mutatják, hogy a 14 karboxi-terminális aminosav - ezen belül a 298. pozícióban található tirozin - eltávolítása a citolitikus képesség teljes mértékű elvesztését és a kalciummobilizációs képesség jelentős mértékű csökkenését eredményezte. Közvetlenül a 282. pozícióban található tirozinig terjedő további deléció a fentivel megegyező fenotípust hozott létre (15b. és 15c. ábrák). Az intracelluláris dómén N-terminális végétől a 268. aminosavig terjedő deléciónak sem a kalciummobilizációs profilra, sem a citolitikus képességre nem volt jelentős hatása, míg a 275. aminosavig terjedő deléció jelentősen csökkentette a szabad kalciumfelszabadulást, de alig volt hatása a citolízisre (15d. és 15e. ábrák). A 282. pozícióban található aminosavig terjedő további deléció olyan FcRylIvégeket eredményezett, amelyek sem kalciummobilizációs képességgel, sem citolízist kiváltó képességgel nem rendelkeztek (15d. és 15e. ábrák). A fenti hozzávetőleges mérések szerint az „aktív elem” viszonylag nagyméretű (36 aminosavból áll) és 16 aminosawal elválasztott két tirozint tartalmaz.

10. példa

A fertőződést elő nem segítő CD4-kimérareceptorokat tartalmazó limfociták által kiváltott célzott citolízis

Amint azt a fentiekben leírtuk, géntechnikai eljárásokkal olyan effektormolekulák állíthatók elő, amelyek a CTL-ek citolitikus aktivitását MHC-independens módon célzottan irányítják. Például a CD4 extracelluláris doménja és a ζ-lánc fúziójával létrejött kiméra egy WH3 jelű, humán CTL-klónban a gpl20 jelű HIV-1 felszíni burok-glikoproteint expresszáló célsejtek specifikus elpusztítását eredményezi. Mivel a CD4molekula extracelluláris doménja a sejteket HlV-fertőzéssel szemben fogékonnyá teszi, a felfegyverzett CTL-ek a vírus célpontjaivá válhatnak, ami azok hatékonyságát hátrányosan befolyásolja [Dalgleish és munkatársai: Natúré, 312, 767 (1984)]. Ennek megakadályozására olyan CD4-antigénen alapuló, kiméra effektormolekulákat tervezünk, amelyek hatékonyan közvetítik HIV-fertőzött sejtek specifikus kiválasztását, ezáltal azok sejt által közvetített elpusztítását, de amelyek nem teszik a sejteket HIV-fertőzéssel szemben fogékonnyá.

Három részből álló fúziós proteint állítottunk elő úgy, hogy a CD4 extracelluláris doménját (23. ábra) genetikai úton, a humán IgGl nehézláncának részét képező kapocsrégió, valamint annak második és harmadik konstans doménja alkotta szekvenciával kapcsoltuk össze [Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi., 9, 347 (1990)] (25. ábra), amelyet ebben az esetben a humán, membránhoz kötött IgGl első transzmembránexonjával kapcsoltunk össze, ezt a humán CD7-antigén egy része követte, amely az egyetlen, Ig-hez hasonló domént és a transzmembrándomént követően található stop-transzferszekvencia közti szekvenciákat tartalmazta [Aruffo és Seed: EMBo J., 6, 3313 (1987)] (26. ábra). A CD7-szegmens extracelluláris részének elsődleges aminosavszekvenciája egy prolinban gazdag régiót tartalmaz, ami az Ig-hez hasonló dómén sejtfelszíntől történő távol tartását eredményező nyélszerű struktúrára utal [Aruffo és Seed: EMBO J., 6, 3313 (1987)] (26. ábra). A fenti és az ehhez hasonló kimérák expresszálása céljából a leírtak szerint rekombináns vacciniavírusokat állítottunk elő. Közelebbről CV-l-sejtekben homológ rekombinációval rekombináns vacciniavírusokat állítottunk elő. Valamennyi törzstenyészet esetében OKT4 vagy Leu3A ellenanyagokkal legalább két alkalommal végeztünk plakkelőhívást, majd plakktisztítást, mielőtt CV-l-sejtekben előállított, magas titerű törzstenyészeteket kaptunk.

A három részből álló kiméra [CD4(D1 -D4): lg: CD7] (20. ábra), („A molekula) sejtfelszínen hatékonyan expresszálódott; a kimérának azt a sajátságát, hogy HIV-receptorként képes-e működni, vacciniavíruson alapuló szincíciumképződési vizsgálati eljárásban teszteltük [Lifson és munkatársai: Natúré, 323, 725 (1986); Ashom és munkatársai: J. Virol., 64, 2149 (1990)]. HeLa-sejteket fertőztünk a HIV-1 burok-glikoproteinjét kódoló rekombináns vacciniavírusokkal (vPE16) [Earl és munkatársai: J. Virol., 64, 2448 (1990)], és azokat CD4-antigénnel vagy Ο04:ζ vagy CD4(Dl-D4):Ig:CD7 kimérával fertőzött HeLa-sejtekkel tenyésztettük együtt. Hat (6) m átmérőjű lemezeken, 50%-ig összefüggő tenyészetet alkotó HeLa-sejteket (ATCC, Rockville, MD) fertőztünk 1 órán át szérummentes tápfolyadékban, körülbelül 10es fertőzési multiplicitási (Moi) érték mellett. A sejteket további 5-6 órán át komplett tápfolyadékban inkubáltuk, majd 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó foszfátpufferes fiziológiás sóoldattal (PBS-sel) az edények faláról leválasztottuk. A burokproteint és a CD4-kimérát expresszáló sejteket 1:1 arányban elegyítettük és komplett tápfolyadékban, 6 cm átmérőjű szövettenyésztő edényekbe oltottuk. A szincíciumok keletkezését az együttes tenyésztést követően 6-8 órával feljegyeztük és lefényképeztük.

A CD4 és vEP16 fertőzött sejtek együttes tenyésztése könnyen kimutatható, többmagvú óriássejtek kelet19

HU 220 100 Β kezéséhez vezetett. A CD4 extracelluláris doménjából és a TCR ζ-láncából álló kiméra (27. ábra) (Όϋ4:ζ) szintén képes volt szincíciumképződés közvetítésére, míg a CD4(Dl-D4):Ig:CD7 kimérát expresszáló sejtek esetében nem volt megfigyelhető sejtfúzió. Olyan konstrukciót is teszteltünk, amely a CD4-antigénnek csak az első és második doménját expresszálta (24. ábra) [CD4(Dl,D2):Ig:CD7; 20. ábra, „B” molekula], mivel a CD4 amino-terminális két doménjáról más vonatkozásban kimutatták, hogy azok jelenléte feltételét képezi a HIV-vírussal történő fertőződésnek [Landau és munkatársai: Natúré, 334, 159 (1988)]. Ez a molekula HIV-vírus által kiváltott szincíciumképződésre sem bizonyult fogékonynak. Oldható, ¹²⁵I jelölt gpl20-antigénnel végzett kötődési vizsgálatok szerint a CD4(Dl-D4):Ig:CD7 és CD4(Dl,D2):Ig:CD7 kimérák változatlan affinitást mutattak a gpl20-antigénnel szemben.

Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a szincíciumképződésnek ellenálló kiméramolekulák képesek-e célzott sejtpusztulást kiváltani, amennyiben azokat a találmány szerinti jelközvetítő elemmel látjuk el. A ζ-lánc intracelluláris doménját (27. ábra) a CD4(Dl-D4):Ig:CD7 és CD4(Dl,D2):Ig:CD7 kimérák 3’-végével fúzionáltattuk, és előállítottuk a megfelelő rekombináns vacciniavírusokat. Ezeket a konstrukciókat [CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ és CD4(Dl,D2):Ig:CD7^], WH3 jelű, humán CTL-klónban expresszáltattuk, és azon képességre nézve teszteltük (a leírásban ismertetett módszerek alkalmazásával), hogy képesek-e a HÍV eredetű, felszíni burok-glikoproteint expresszáló HeLasejtek célzott felismerésére és elölésére. A 21. ábra azt szemlélteti, hogy a ζ-lánc intracelluláris doménja mind CD4(D1 -D4): lg: CD7, mind CD4(D1 ,D2): lg: CD7 kimérákkal fuzionáltatva képes a sejtölő képesség átvitelére; a ζ-láncot nem tartalmazó konstrukciók viszont nem voltak képesek a fenti aktivitás közvetítésére. A pozitív kontrollt képező 0Ε>4:ζ kissé hatékonyabb volt, a CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ pedig valamivel kevésbé volt hatékony a citotoxicitás közvetítésében, mint a CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ (21. ábra). Világos azonban, hogy mind a CD4(Dl-D4):lg:CD7^, mind a CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ kimérák képesek felszínükön HIV-burokproteineket expresszáló sejtek specifikus elpusztítását közvetíteni. A négy részből álló kimérák a vacciniavíruson alapuló vizsgálati eljárás során következetesen képtelenek voltak szincíciumképződés közvetítésére. Kimutattuk azt is, hogy a 11a. ábrán bemutatott típusú egyetlen ζ-szekvenciaelem elegendő ahhoz, hogy a CD4(D1-D4) kimérának citolitikus aktivitást kölcsönözzön.

Radioimmunprecipitációs kísérletek szerint a fúziós molekulák elsősorban - ha nem teljes egészében - dimerek voltak. Ezekben a kísérletekben protein-A agarózgyöngyöket alkalmaztunk CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ vagy CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ kimérákat expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőzött, metabolikus úton jelölt HeLa-sejtekből készült, szolubilizált extraktum immunprecipitálására. Az immunprecipitációval kapott anyagot poliakrilamid-gélelektroforézissel, redukáló és nem redukáló körülmények mellett frakcionáltuk. Közelebből, körülbelül 5xl0⁶ HeLa-S3-sejtet fertőztünk a vPEló esetében fent leírtak szerint a megfelelő vacciniavírus-törzstenyészettel. A sejteket metabolikus úton 200 pCi/ml Tran³⁵S jelölőanyaggal (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) jelöltük 6-8 órán át cisztein- és metioninmentes tápfolyadékban, majd 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel az edények faláról leválasztottuk. A sejteket ezt követően centrifúgálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 150 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris (pH=7,5), 5 mmol/1 EDTA, 0,5% NP-40,0,1% SDS és 1 mmol/1 PMSF. Miután a sejtmagokat centrifúgálással eltávolítottuk, valamennyi sejtextraktum egyötödét 2 órán át 4 °C-on, protein-A-val konjugált, mosott agarózgyöngyökre adszorbeáltuk. A gyöngyöket ezután 1% ΝΡ-40-et tartalmazó PBS-sel mostuk és merkapto-etanol jelenlétében vagy annak hiányában SDS-t tartalmazó mintapufferben eluáltuk. A fenti kísérletek eredményei azt mutatták, hogy az immunprecipitált CD4(Dl-D4):Ig:CD7^ és CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ kimérák nagy része nem redukáló körülmények mellett a várt molekulatömegnek megfelelően dimerként vándorolt.

A CD4 fúziós molekulákat expresszáló sejtek azon képességének közvetlen meghatározására, hogy mennyiben képesek HIV-vírussal történő fertőződés létrejöttét elősegíteni, hosszú távú fertőzési kísérleteket végeztünk CD4(Dl-D4):Ig:CD7 és CD4(Dl,D2):Ig:CD7 kimérákat expresszáló transzfektánsok alkalmazásával. Stabil CD4(Dl-D4):Ig:CD7, CD4(Dl,D2):Ig:CD7 és CD4 transzfektánsokat állítottunk elő a 293 jelű sejtvonal egy alvonalában, amely egy könnyen transzfektálható, humán embrionális vese eredetű sejtvonal. A kiméramolekulákat olyan kétirányú vektorokba szubklónoztuk, amelyben a hygromycin-B gén a herpes simplex vírus timidinkináz promoterének irányítása alatt áll. Tíz (10) cm átmérőjű lemezeken, 60-70%-ig összefüggő tenyészetet alkotó sejteket transzfektáltunk kalcium-foszfát koprecipitációs módszerrel, 10 pg fenti plazmidDNS-sel. A transzfekciót megelőzően a plazmidokat az egyedi Sfil helyen linearizáltuk, és a végeket T4-DNSpolimerázzal feltöltöttük. A transzfekciót követően 24 órával a sejteket négy részre osztottuk, majd a transzfekciót követően 48 órával 400 pg/ml Hygromycin-B (Sigma, St. Louis, Mo) alkalmazásával szelekciónak vetettük alá. A sejteket 3-4 naponként Hygromycin-B-t tartalmazó friss tápfolyadékkal láttuk el.

Rezisztens telepeket gyűjtöttünk, azokat felszaporítottuk és expressziós sajátságaikat indirekt immunfluoreszcenciás eljárással, feluoreszceinnel konjugált anti-humán IgG-Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) vagy Q4120 - egy, a humán CD4-antigénnel reagáló ellenanyag (Sigma) - alkalmazásával, majd áramlásos citométerrel (Coulter, Hialeah, FL) meghatároztuk. Mindkét konstrukcióból két olyan, egymástól független kiónt választottunk ki további analízis céljára, amelyek sejtfelszíni CD4-szintje hasonló volt más sejtvonalak esetében mérhetővel. A 22. ábra azt mutatja, hogy HIVvírussal történő érintkeztetést követően a stabil CD4transzfektáns tenyészetekben a fertőzés után már három

HU 220 100 Β nappal p24 volt kimutatható. A többmagvú óriássejtek és a jellemző felfuvott alakok jelenléte ezekben a tenyészetekben már a fertőzést követően 5 nappal nyilvánvaló volt A nem transzfektált szülői sejtvonalban, valamint a CD4(D1 -D4): lg: CD7 és CD4(D1,D2): lg: CD7 transzfektánsok két, egymástól függetlenül kapott izolátumában 32 napos tenyésztést követően sem volt kimutatható szignifikáns p24-szint vagy többmagvú óriássejtek jelenléte (22. ábra).

A fertőzési kísérletek befejeztével a sejteket CD4antigén sejtfelszíni expressziójára nézve analizáltuk. A CD4 felszíni epitóp sűrűsége a vírus által történő negatív szabályozásnak megfelelően CD4-et expresszáló fertőzött tenyészetekben szignifikánsan csökkent, de változatlan volt a CD4(Dl-D4):Ig:CD7 és CD4(D1 ,D2): lg: CD7 kimérákat expresszáló tenyészetekben. A fenti kísérletek szerint lehetséges olyan, a CD4 két apikális doménját tartalmazó kiméramolekulák előállítása, amelyek T-sejt-receptor ζ-láncával füzionáltatva képesek HIV-fertőzött sejtek célzott felismerésére és elpusztítására, de nem teszik lehetővé CD4antigén által közvetített HIV-fertőzés létrejöttét.

További kísérletek arra utalnak, hogy a HlV-fertőzéssel szembeni rezisztenciáért a CD4-molekula extracelluláris doménja és a lipid kettős réteg közti fizikai távolság felelős. Egy első kísérletben olyan kiméramolekulát állítottunk elő, amely a CD7 nyélszerű struktúráját és transzmembrándoménját alkotó szekvenciában deléciót hordozott; ez a deléció eltávolította a CD7 transzmembránrészének prolinban gazdag régióját. Amikor ezt a domént CD4 extracelluláris doménjával fuzionáltattuk, az a CD4-molekula sejtfelszíni expresszálódásának (a leírásban ismertetett módon történő) meghatározása szerint megtartotta azt a képességét, hogy a CD4-molekula extracelluláris doménját hatékonyan lehorgonyozza. A HIV-burok-glikoprotein által kiváltott szincíciumképződéssel szemben mutatott rezisztenciaképessége azonban elveszett. A CD7-molekula prolinban gazdag régiójának - egy, feltehetően α-hélix spirális struktúrát felvevő régiónak - a deléciója tehát hatékonyan csökkentette a CD4 extracelluláris doménja és a lipid kettős réteg közti távolságot és megszüntette a kimérának azt a képességét, hogy a szincíciumképződésnek ellenálljon.

Egy második kísérletben azt szemléltettük, hogy a szincíciumképződéssel szemben mutatott rezisztencia CD4/CD5 kimérára is átvihető, amelyről a korábbiakban kimutattuk, hogy a transzmembránhorgony funkcióját töltheti be a CD4 extracelluláris doménja számára, de amely nem volt képes ellenállást mutatni HIV-vírus által kiváltott szincíciumképződéssel szemben. Ebben a kísérletben a humán IgGl nehézláncának kapocsrégióját, valamint CH2- és CH3-doménját a CD4/CD5 molekulába inszertáltuk; az így kapott kiméra rezisztenciát mutatott a szincíciumképződéssel szemben, ami ismét arra utal, hogy az immunglobulin-doménok által létrehozott távolság egyenlő HIV-vírus által kiváltott szincíciumképződéssel szembeni rezisztencia létrehozásához.

Egy harmadik kísérlet során a CD4-domént különböző hosszúságú, mesterséges úton előállított alfa-hélixek alkalmazásával különböző távolságra kinyújtottuk a sejtmembrántól. Közelebbről, olyan szintetikus oligonukleotidokat terveztünk, amelyek két alanin által határolt lizin és glutaminsav aminosavakból álló, ismétlődő alfa-hélix struktúrákat tartalmaztak (az elsődleges nukleinsavszekvenciát és aminosavszekvenciát lásd a 28. ábrán). Korábbi vizsgálatokban kimutatták, hogy ilyen aminosavszekvenciák nagy gyakorisággal fordulnak elő alfa-hélixekben, ami arra utal, hogy az ilyen ismétlődő elemek alfa-helikális struktúrát vesznek fel, és ilyen alfa-hélixeknek a CD4 transzmembrándoménja és extracelluláris doménja közé történő helyezése a CD4et a sejtmembrántól eltávolítja. Az alfa-helikális szegmens hosszának változtatásával az alfa-helikális struktúra emelkedésére és csavarodására vonatkozó adatok ismeretében meghatároztuk azt a CD4 és sejtmembrán közti távolságot, amely a HIV-vírus bejutásával szemben mutatott rezisztencia létrehozásához szükséges. Az eredményeket az 1. táblázatban összegeztük.

1. táblázat

	Szincícium- képződés	Thy-1- expresszió
A) CD4+H+CH2+CH3 + CD7tm+stk	-	-
B) CD4(D1,D2)+H+CH2+ CH3+CD7tm+stk	-	-
C) CD4+CD7tm+stk	+/-<»>	+
D) CD4+CD7tm (hosszú változat)	+	+
E) CD4+CD7tm (rövid változat)	+	+
F) CD4+CD5tm	+	+
G) CD4+CH2+CH3+CD5tm	-	-
H) CD4+CH3+CD5tm	-	ND
I) CD4+CD34tm	+	+
J) CD4+szintetikus alfa-hélix (24 angström)+CD34tm	ND	4-
K) CD4+szintetikus alfa-hélix (48 angström)+CD34tm	ND	+/-<»)
L) CD4+szintetikus alfa-hélix (72 angström)+CD34tm	ND	-

³: A szincíciumképző vagy thy- 1-exprcsszáló sejtek jelentős mértékű csökkenése.

A fenti táblázatban „CD4” CD4(Dl-D4)-et jelent, hacsak másképp nem kötjük ki; „H”, „CH2” és „CH3” a humán IgGl nehézláncának kapocsrégióját, valamint CH2- és CH3-régióit jelöli; a „CD7tm” (hosszú változat) és a „CD7tm” (rövid változat) a CD7 transzmembránrégióját és a prolinban gazdag doménban deletált CD7 transzmembránrégiót jelenti (lásd fent); „CD5tm” a CD5 transzmembránrégiót jelöli; és a „CD34tm” a CD34 transzmembránrégiót jelöli. A J-L sorokban az alfa-helikális régió hosszát angströmben (Á) adtuk

HU 220 100 Β meg; ezek az értékek azon a tényen alapulnak, hogy egy alfa-hélixben csavarulatonként 3,6 aminosav található, ami 5,4 angströmnek (vagy másképp aminosavanként 1,5 angströmnek) felel meg. Eszerint egy 16 aminosavból álló alfa-hélix a CD4 extracelluláris doménját körülbelül 24 angströmre távolítja el a lipid kettős rétegtől. A 48 és 72 angström nagyságú alfahélixeket a BstYl-fragmensnek a fragmens egyedi BamHI helyére (lásd 28. ábra) történő egymást követő konkatemerizációjával (lánckapcsolásával), majd a megfelelő orientációval rendelkező kiónok szelekciójával állítottuk elő.

A szincíciumképződést úgy határoztuk meg, hogy a vPE16 vacciniavírus-konstrukcióból származó HIV-1burok-glikoproteint expresszáló HeLa-sejtekkel együtttenyésztési vizsgálatokat végeztünk (lásd fent).

A Thy-l-expressziót az alábbiak szerint határoztuk meg. A HIV-l-hxb.-2 kiónon alapuló, élő retrovírusvektort állítottunk elő. Ebben a kiónban a vírus számára nem létfontosságú nef gént a patkány-thy-1 kódolószekvenciájával helyettesítettük, amely egy, a membránhoz foszfatidil-inozitol kötéssel kapcsolódó, hatékonyan expresszálódó felszíni molekula. A fenti molekuláris kiónból származó vírus, amelyet hxb/thy- 1-nek neveztünk, fertőzőképesnek bizonyult citopatogén hatásainak, valamint C8166-sejtek (egy humán, CD4+ T-sejtes leukémia-sejtvonal) fertőzött tenyészetének felülúszójában a p24-protein termelődésének kimutatása alapján. Ezenfelül hxb/thy-1 vírussal történő érintkeztetést követően CD4-et kódoló vírussal tranziens módon transzfektált HeLa-sejtek már 18 órával a fertőzést követően thy-l-expresszió jeleit mutatták, amint az a nef gén szabályozásának megfelelő szabályozás alatt álló gén esetében várható volt. A nef gén által kódolt géntermékek rendszerint vírus eredetű szabályozóproteinek csoportjába tartoznak, amelyek többszörös összeillesztési folyamaton mennek át, és amelyekből hiányzik a rév válaszreakciós elem. A fenti kódolt információk a citoplazmában korai vírusgéntermékekként folyamatosan felhalmozódhatnak. Azt vártuk, hogy a thy-1 géntermékek hasonló módon szabályozódnak, azaz a vírus életciklusának korai szakaszában megjelennek. Röviden, ez a rendszer megkönnyítette a HIV-vírus bejutásának vizsgálatát, mivel a vírus bejutásának jeleként a thy-l-expresszió kimutatását alkalmaztuk. Különböző, CD4-antigénen alapuló kimérákat transzfektáltunk tranziens módon HeLa-sejtekbe ismert DEAE-dextrán-eljárás alkalmazásával. A transzfektált sejteket a transzfekciót követően 48 órával hxb/thy-1 vírussal érintkeztettük, majd a fertőzést követően 24-48 órával azokban meghatároztuk a thy- 1-expressziót. Az 1. táblázat a fertőzést követően 24-48 órával mérhető thy-l-expresszió mértékét mutatja, amelyet a kereskedelemben hozzáférhető Thy-1 monoklonális ellenanyag (Accurate) alkalmazásával határoztunk meg. Az 1. táblázat szerinti adatok alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a CD4 extracelluláris doménjának a sejtmembrántól előnyösen legalább 48 angström távolságra és előnyösebben legalább 72 angström távolságra kell lennie ahhoz, hogy a HIV-1-fertőzéssel szemben rezisztens legyen.

A leírásban ismertetett általános stratégiához hasonló stratégiát követve előállíthatok anti-HIV-burokellenanyagokon alapuló kimérák, melyek célpontját HIV-fertőzött sejtek képezik. Ilyen ellenanyagokat ismertetnek például Gomy és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 1624 (1989)], valamint Marasco és munkatársai [J. Clin. Invest, 90, 1467 (1992)].

11. példa

További T-sejt-receptor és B-sejt-receptor eredetű jelközvetítő proteinek („trigger”-proteinek)

A találmány szerinti további intracelluláris és transzmembrán szignáltranszdukciós doménok származhatnak CD3-delta- és T3-gamma-T-sejt-receptor-proteinekből, valamint mbl és B29 jelű B-sejt-receptor-proteinekből. A fenti proteinek aminosavszekvenciáját a 16. ábra (CD3-delta; 24. azonosító számú szekvencia), a 17. ábra (T3-gamma; 25. azonosító számú szekvencia), a 18. ábra (mbl; 26. azonosító számú szekvencia), valamint a 19. ábra (B29; 27. azonosító számú szekvencia) tartalmazza. A szekvenciáknak azt a részét, amely elegendő a citolitikus szignáltranszdukció kiváltásához (amelyeket tehát előnyösen a találmány szerinti kimérareceptomak tartalmaznia kell), zárójelbe tettük. A fenti proteindoménokat tartalmazó kimérareceptorokat általánosságban a fent leírtak szerint állítjuk elő és alkalmazzuk a találmány szerinti terápiás eljárásokban.

12. példa

Kísérleti módszerek

Vacciniafertőzés és radioimmunprecipitáció

Körülbelül 5χ10⁶ CVl-sejtet fertőztünk 1 órán át szérummentes DME tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett (a titert CV1-sejteken határoztuk meg). A sejteket a fertőzést követően friss tápfolyadékba helyeztük és metabolikus úton, hat órán át, metionin- és ciszteinmentes DMEM tápfolyadékban (Gibco; Grand Island, NY), 200 pCi/ml ³⁵S-metioninnal, valamint ciszterinnel (Tran³⁵S jelölőanyag, ICN; Costo Mesa, CA) jelöltük. A jelölt sejteket 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/1 NaCl, 0,05 mol/1 Tris (pH=8,0), 5 mmoVl EDTA és 1 mmol/1 PMSF. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD4-proteineket OKT4 ellenanyaggal és anti-egér-IgG-agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáltuk. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS géleken, nem redukáló körülmények mellett (NR), valamint redukáló körülmények (R) mellett elektroforetizáltuk. A ³⁵S jelölt mintákat tartalmazó géleket az autoradiográfíát megelőzően „En³Hance”-val (New England Nuclear, Boston, MA) impregnáltuk. A CD16 transzmembrán formájának - a CD16_TM-nek - facilitált expresszióját úgy határoztuk meg, hogy annak csak CD16_TM-mel fertőzött CVl-sejtekben történő expresszióját összehasonlítottuk CD16_TM-mel, valamint ζ- és γ-kimérákat kódoló vírusokkal fertőzött sejtekben történő expresszálódás mértékével. A fertőzést

HU 220 100 Β és hat óráig vagy annál hosszabb ideig tartó inkubálást követően a sejteket 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBSpufferrel a lemezekről leválasztottuk, és a CDI vagy a kimérák expresszióját indirekt immunfluoreszcencia- és áramlásos citométeres eljárás alkalmazásával meghatároztuk.

Kalciumáramlási (kalcium-,jlux) vizsgálati eljárás

Az E6 jelű Jurkat-alvonalhoz tartozó sejteket [Weis és munkatársai: Immunoi., 133, 123 (1984)] fertőztünk rekombináns vacciniavírusokkal egy órán át szérummentes IMDM tápfolyadékban 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett, majd a sejteket 3-9 órán át 10% FBS-t (fötális boqúszérumot) tartalmazó IMDM tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és 3 χ 10⁶ sejt/ml sűrűségben, 1 mmol/1 Indo-l-aceto-metoxi-észtert [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem., 260, 3340 (1985)] (Molecular Probes) tartalmazó komplett tápfolyadékban szuszpendáltuk, majd 45 percig 37 °C-on inkubáltuk. Az Indo-l-festékkel feltöltött sejteket ülepítettük, lxlO⁶sejt/ml sűrűségben szérummentes IMDM tápfolyadékban szuszpendáltuk, majd szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk. A sejteket szabad kalciumion-koncentrációra nézve analizáltuk, a viola és kék fluoreszcenciakibocsátás áramlásos citométerrel történő egyidejű meghatározása alapján [Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi., 137, 952 (1986)]. A kalciumáramlás megindítása céljából a sejtszuszpenzióhoz 0-időpontban vagy 1 pg/ml koncentrációban fikoeritrinnel (PE) konjugált Leu3A jelű (anti-CD4) ellenanyagot (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), majd 10 pg/ml nem konjugált, kecskében termelt anti-egér-IgG-t adtunk vagy 0-időpontban 1 pg/ml koncentrációban nem konjugált 3G8 jelű (anti-CD16) monoklonális ellenanyagot, majd 10 pg/ml PE-konjugált, kecskében termelt anti-egérIgG-Fab2’-t adtunk. Viola/kék kibocsátást ábrázoló hisztogramokat gyűjtöttünk a PE-pozitív (fertőzött) sejtpopulációra vonatkozólag, amelyek tipikusan az összes sejt 40-80%-át képviselték. A T-sejtes antigénreceptorválaszt nem fertőzött sejtekben OKT3 ellenanyaggal váltottuk ki keresztkötések létrehozása nélkül. A CD16kimérareceptorokra vonatkozó kísérletekben azokat a mintákat, amelyeknél az alapvonal alacsonyabb intracelluláris kalciumkoncentráció felé történő elmozdulását figyeltük meg (ellenanyag hozzáadása nélkül), az analízisből kizártuk. A hisztogrameredményeket ezt követően a kétváltozós adatoknak ASCII-adatokká történő átalakításával „Write Hand Mari’ programcsomag (Cooper City, FL) alkalmazásával, majd FORTRANprogramok gyűjteményével analizáltuk. A második ellenanyag-reagens hozzáadását megelőzően mért viola/kék kibocsátás aránya alapján határoztuk meg az egységnek tekintett, normalizált kiindulási arányt és a nyugalmi küszöbértéknek megfelelő arányt, amelyet úgy állapítottunk meg, hogy nyugalmi helyzetben a populáció 10%-a haladja meg a küszöbértéket.

Citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárás

Egy WH3 jelű, CD8⁺ CD4~, HLA-B44 korlátozottan citolitikus, humán T-sejtes sejtvonalat 10% humán szérumot tartalmazó, 100 egység/ml IL-2-vel kiegészített IMDM tápfolyadékban tartottunk fenn, és szabályos időszakonként besugárzott (3000 rád), eltérő HLA-típussal rendelkező, perifériás vér eredetű limfocitákkal és 1 pg/ml fitohemagglutininnal (PHA) nem specifikusan vagy besugárzott, HLA-B44 haplotípussal rendelkező mononukleáris sejtekkel specifikusan stimuláltunk. Egy napig tartó, nemspecifikus stimulációt követően a PHA-t friss tápfolyadék hozzáadásával 0,5 pg/ml koncentrációig hígítottuk, és három nap múlva a tápfolyadékot lecseréltük. A stimulációt követően a sejteket legalább 10 napig tenyésztettük citotoxikus vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásukat megelőzően. A sejteket egy órán át szérummentes tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték (Moi) mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd három óráig komplett tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük és milliliterenként lxlO⁷ sejtsűrűségben szuszpendáltuk. U alakú fenékkel rendelkező mikrotitrálólemezek egyes mélyületeihez, amelyek 100 pl komplett tápfolyadékot tartalmaztak, 100 pl sejtszuszpenziót adtunk. A sejteket felező tovafütó hígítással hígítottuk. Mindegyik minta vizsgálata esetében két-két mélyület nem tartalmazott limfocitákat, hogy a spontán krómfelszabadulás és összkrómfelvéteí meghatározható legyen. Az S3 jelű HeLa-alvonalból származó célsejteket 6,0 vagy 10,0 cm átmérőjű lemezeken egy órán át szérummentes tápfolyadékban, körülbelül 10-es /noz-érték mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd három órán át komplett tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket ezt követően 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk és megszámoltuk. 10⁶célsejtet [a CD4-kiméra receptorkísérletek esetében HeLa-Raji vagy -RJ2.2.5 sejteket, a CD16-kiméra receptorkísérletek esetében pedig 3G8-10-2 sejteket [Shen és munkatársai: Mól. Immunoi., 26, 959 (1989)] tartalmazó mintákat centrifugáltunk és 1 órán át 37 °C-on, időközönként megkeverve 50 pl steril ⁵¹Crnátrium-kromát-oldatban szuszpendáltunk (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE), majd háromszor PBS-ben mostunk. Valamennyi mélyülethez 100 pl térfogatú, 10⁵/ml sűrűségben tápfolyadékban szuszpendált, jelölt sejtet adtunk. A Raji- és RJ.2.2.5 célsejteket a HeLasejtekkel azonos módon jelöltük. A mikrotitrálólemezeket 1 percig 750 g mellett centrifugáltuk és 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő végén a sejteket valamennyi mélyületben óvatos pipettázással felszuszpendáltuk, a beépült összbeütésszám meghatározása céljából azokból mintát vettünk, és a mikrotitrálólemezeket 1 percig 750 g mellett centrifugáltuk. A felülúszóból 100 pl térfogatú mintát eltávolítottunk, és gamma-szcintillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Az elölt sejtek százalékos arányát az áramlásos citométeres analízissel meghatározott, fertőzött célsejtek aránya (rendszerint a sejtek 50-90%-a) alapján korrigáltuk. A fertőzött effektorsejtek esetében az effektorsejt/célsejt arányt a fertőzött sejtek százalékos aránya (a CD4-kiméra receptorkísérletek esetében általában 20-50%, a CD16-kiméra receptorkísérletek esetében általában >70%) alapján korrigáltuk.

HU 220 100 Β

A ζ-szekvencia in vitro mutagenezise

Abból a célból, hogy a ζ-szekvencia 11. és/vagy 15. pozíciójában található aminosavak helyén pontmutációkat hozzunk létre, a z-transzmembrándoméntól 5’irányban található BamHI hasítási helytől kiinduló és a 11. pozícióban található natív z-aminosavat Cys-ről Gly-re (Cl 1G) vagy a 15. pozícióban található aminosavat Asp-ról Gly-re (D15G) változtató vagy mindkét pozícióban mutációt létrehozó (C11G/D15G) szintetikus oligonukleotidokat állítottunk elő, és azokat PCR-reakcióban használtuk fel mutációt hordozó fragmensek előállítására, amelyeket aztán a vad típusú Οϋ4:ζ konstrukciókba inszertáltunk.

ζ-lánc deléciók létrehozása céljából ζ-lánc-cDNSszekvenciákat amplifikáltunk PCR-reakcióval, szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyeket úgy terveztünk, hogy azok az 50., 59. vagy 65. aminosavakat követően stopkodont (UAG) hozzanak létre. A láncindító oligonukleotidok az 5’-végtől 5-6 nukleotid távolságra NotI hasítási helyet tartalmaztak - rendszerint a „CGC GGG CGG CCG CTA” szekvencia formájában (11. azonosító számú szekvencia) -, ahol az utolsó három nukleotid felel meg a stopantikodonnak. A NotI és stopantikodon szekvenciákat a fragmens kívánt 3’-végével komplementer, 18 vagy több nukleotid követte. Az így nyert kimérák a következő elnevezéseket kapták: CD16^Y51*, a CD16^E60* és CD16^D66*. A transzmembrándoméntól 5’-irányban található BamHI hasítási helyet, valamint a NotI hasítási helyet használtuk fel olyan fragmensek előállítására, amelyeket aztán a vad típusú CD16^ konstrukcióba juttattunk vissza. Monomer ζ-kimérákat úgy állítottunk elő, hogy a fent ismertetett, Asp^- és Cys-CD4^ konstrukciók BamHI és SacI enzimekkel történő emésztésével a ζ-lánc transzmembrán és membránhoz közel eső intracelluláris szekvenciáit szabaddá tettük, és a fragmenst a CD16: ζΕ60* vagy CD16: ζϋ66* konstrukciókba inszertáltuk.

Οΰ16:7:ζ(48-65) és CD16:7 :ζ(48-69) jelű, három részből álló kimérák előállítása

A CD16:ζD66* konstrukció előállítása céljából a ζlánc transzmembrándoménjának és az azt követő, a citoplazmáris dómén részét képező 17 aminosavnak megfelelő cDNS-szekvenciát a CD5- és CD7-cDNS-ekből származó, megfelelő transzmembrán- és citoplazmáris doménokkal helyettesítettük. A CD5- és CD7-fragmenseket PCR-reakcióval kaptuk, egy BamHI restrikciós hasítási helyet tartalmazó, a CD5-, valamint CD7-antigének transzmembrándoménjától közvetlenül 5’-irányban található régiónak megfelelő, előre irányuló („forward”) oligonukleotid, valamint a CD5- és CD7-szekvenciákat, valamint a z-szekvenciát átfedő, a SacI restrikciós hasítási helyet tartalmazó, az alábbi szekvenciával rendelkező ellenirányú („reverse”) oligonukleotidok felhasználásával: CD5^: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (12. azonosító számú szekvencia); valamint ΰϋ7:ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (13. azonosító számú szekvencia).

A CD5 és CD7 eredetű PCR-termékeket BamHI és SacI enzimekkel emésztettük és BamHI, valamint SacI enzimekkel emésztett CD16 ^E60* konstrukcióval ligáltuk, ezáltal a BamHI-SacI ζ-szekvenciát a CD7-fragmenssel helyettesítettük. A CD16:CD5 és CD16:CD7 konstrukciók előállítása céljából PCR-reakcióval CD5és CD7-fragmenseket állítottunk elő egy NotI restrikciós hasítási helyet, valamint a CD5-antigén esetében a Gln416 a CD7-antigén esetében az Alal93., aminosavakat követően stopkodont (UAA) kódoló oligonukleotid felhasználásával. A CD5- és CD7-antigén eredetű PCRfragmenseket BamHI és NotI enzimekkel emésztettük és a CD16: ζΑβρ66* konstrukcióba inszertáltuk.

A ζ-lánc citolitikus szignáltranszdukciós szekvenciaelemében található N-terminális aminosavak in vitro mutagenezise

Olyan szintetikus láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő, amelyek a ζ-szekvenciaelemen belül található SacI helytől indultak ki, és a 48. natív aminosavat Asn-ról Ser-re (N48S), az 50. aminosavat Leu-ról Ser-re (L50S), az 51. aminosavat pedig Tyr-ról Phe-re (Y51F) változtatták; a fenti oligonukleotidok PCR-reakcióban történő alkalmazásával nyert fragmenseket a vad típusú CDI 6:7: ζ(48-65) konstrukcióba juttattuk vissza.

A ζ-lánc citolitikus szignáltranszdukciós szekvenciaelemében található C-terminális aminosavak in vitro mutagenezise

Olyan szintetikus láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő, amelyek a stopkodontól 3’-irányban található NotI hasítási helynél kezdődtek, és a natív 60. aminosavat Glu-ról Gln-re (E60Q), a 61. aminosavat Gluról Gln-re (E61Q), a 62. aminosavat Tyr-ról Phe-re vagy Ser-re (Y62F vagy Y62S), valamint a 63. aminosavat Asp-ról Asn-re (D63N) változtatták; a fenti oligonukleotidokat PCR-reakcióban alkalmaztuk, és az így nyert fragmenseket a BamHI helytől a NotI helyig terjedően a vad típusú CD16^D66* konstrukcióba szubklónoztuk.

A CD16:7 :ζ(33-65), a CD16:7 :ζ(71-104) és a CDI6:7 :ζ(104-137) kimérakonstrukciók

A transzmembrán- és intracelluláris doménok határánál Miül és NotI helyeket tartalmazó CD7 transzmembránfragmenst PCR-reakcióval állítottunk elő a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotid alkalmazásával: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (14. azonosító számú szekvencia). Az így kapott PCR-ffagmenst BamHI és NotI enzimekkel emésztettük, és a CD17:7^(48-65) konstrukcióba inszertáltuk. A 33-65., 71-104. és 104-137. aminosavakat kódoló z-fragmenseket PCR-reakcióval kaptuk, az előre irányuló láncindító oligonukleotid 5’-végén Miül helyet, az ellenirányú láncindító oligonukleotid 5'-végén pedig stopkodont és azt követő NotI helyet tartalmazó láncindító oligonukleotid-pár alkalmazásával. Valamennyi esetben a restrikciós helyeket a láncindító oligonukleotid 5’-végétől hat nukleotid távolságra iktattuk be, hogy az restrikciós enzimmel hasítható legyen.

ζ-33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (15. azonosító számú szekvencia);

HU 220 100 Β ζ-71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (16. azonosító számú szekvencia); és ζ-104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (17. azonosító számú szekvencia).

FcRyIIA-receptor eredetű deléciós mutánsok előállítása

FcRylIA-receptor eredetű, a karboxi-terminális végen deléciót tartalmazó mutánsokat PCR-reakcióval állítottunk elő, a teljes hosszúságú konstrukcióval azonos módon eljárva, de a 282. és 298. pozíciókban található tirozint kódoló szekvenciákat stopkodonná (TAA) alakítva. Az N-terminális deléciókat úgy hoztuk létre, hogy PCR-reakcióval az intracelluláris dómén egyre kisebb részét amplifikáltuk olyan oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek lehetővé tették a kapott fragmens inszertálását az előzőek szerint előállított expressziós plazmid Miül és NotI hasítási helyei közé, amely expressziós plazmid a CD16 extracelluláris doménjét a CD7 transzmembrándoménjával fuzionáltatva kódolta, és a fúzióban az utóbbi a transzmembrán- és az intracelluláris dómén határán Miül hasítási helyben végződött.

A találmány további megvalósítási módjai

A fenti példákkal azt szemléltettük, hogy a ζ-, ηvagy γ-kimérák aggregációja elegendő T-sejtekben a sejtszintű citolitikus effektorválasz kiváltásához. A ζ-, τιvagy γ-láncok expressziójának ismert köre - amely Tlimfocitákra, természetes ölősejtekre, bazofil granulocitákra, makrofágokra és hízósejtekre terjed ki - arra utal, hogy a hematopoetikus (vérképzőrendszeri) eredetű sejtekben közös szenzoros apparátussal konzervált szekvenciaelemek reagálhatnak, és az immunrendszeren belül a gazdaszervezet védekezőkészségének lényeges összetevőjét receptoraggregációs események közvetíthetik.

A citolitikus válaszreakcióra való képesség és annak MHC-II-receptort hordozó célsejtekkel szemben mutatott hiánya azt mutatja, hogy ζ-, η- vagy γ-láncokon alapuló kimérák adoptív immunterápián keresztül, az AIDS-sel szemben történő genetikai beavatkozás alapját képezhetik. Az endogén ζ- és γ-láncok széles körű elterjedtsége, valamint az a tény, hogy a γ-láncokkal kapcsolódó Fc-receptorok különböző sejttípusokban képesek citotoxicitás közvetítésére [Fanger és munkatársai: Immunoi. Today, 10, 92 (1989)] számos különböző sejt alkalmazhatóságát felveti a fenti célra. Például neutrofil granulociták - amelyek a keringésben igen rövid (körülbelül 4 órás) élettartammal rendelkeznek, és erős citolitikus hatást fejtenek ki - a kimérák expresszálása számára előnyös célsejteket képezhetnek. Neutrofil sejtek HIV-vírussal történő fertőződése nem valószínű, hogy vírusok kiszabadulásához vezetne, és a fenti sejtek bősége (a leukociták között a legelterjedtebb típus) elősegítheti a gazdaszervezet védekezését. Egy további előnyös lehetőség szerint gazdasejtekként érett T-sejteket alkalmazunk, amely napjainkban vált hozzáférhető sejtpopulációvá retrovírussal történő genetikai beavatkozás céljára [Rosenberg S. A.: Sci. Am., 262, 62 (1990)]. Rekombináns IL-2 segítségével T-sejt-populációk tenyészetben viszonylag könnyen felszaporíthatók, és a felszaporított sejtpopulációk a visszainfundálást követően tipikusan korlátozott élettartammal rendelkeznek [Rosenberg és munkatársai: N. Engl. J. Med., 323, 570 (1990)].

Megfelelő körülmények mellett CD4-kimérákat expresszáló sejtek által történő HIV-felismerés szintén mitogén stimulust képezhet, lehetőséget teremtve arra, hogy a felfegyverzett sejtpopuláció gyorsan reagáljon a vírusterhelésre. Bár a leírásban a fúziós proteinek citotoxikus T-limfocitákban való viselkedésére összpontosítottunk, a kimérák „helper” T-limfocitákban történő expresszálása citokinek HIV-vírus által mobilizálható forrását képezheti, amely AIDS-betegségben a „helper” sejtek alosztályának csökkenésével szemben fejthet ki hatást. Napjainkban több olyan eljárást írtak le, melyek alkalmazásával géntechnológiai úton, a vírus behatolásának megakadályozásától eltérő fázisban történő beavatkozással fertőzéssel szembeni rezisztenciát hoztak létre [Friedman és munkatársai: Natúré, 335, 452 (1988); Green és munkatársai: Cell, 58, 215 (1989); Malim és munkatársai: Cell, 58, 205 (1989); Trono és munkatársai: Cell, 59, 113 (1989); Buonocore és munkatársai: Natúré, 345, 625 (1990)], melyek arra utalnak, hogy megtervezhetők olyan CD4-kimérákat hordozó sejtek, amelyek a vírustermelődést megfelelő, hatásukat intracellulárisan kifejtő doménokkal rendelkező molekulák expresszálásán keresztül akadályozzák meg.

Az, hogy autonóm kimérák alkalmazásával T-limfociták számára jelzéseket tudunk közvetíteni, retrovírus alkalmazásával géntechnológiai úton módosított limfociták in vivő szabályozását is lehetővé teszi. Keresztkötéseket létrehozó stimulusok - például komplementkötő doménok eltávolítása céljából géntechnológiai eljárással módosított, specifikus IgM ellenanyagok által közvetített stimulusok - lehetővé tehetik az említett limfociták számának in situ növelését, míg hasonló, specifikus IgG ellenanyagokkal (például a kiméraláncban génsebészeti úton létrehozott aminosaveltérést felismerő ellenanyagokkal) történő kezelés szelektív módon képes lehet a géntechnológiai eljárással módosított populációhoz tartozó sejtek számának csökkentésére. Kimutattuk továbbá, hogy anti-CD4-IgM ellenanyagok alkalmazása esetében CD4: ζ kimérákat expresszáló Jurkatféle sejtekben nem szükséges keresztkötések további létrehozása a kalciummobilizáció kiváltásához. Ha a sejtek szervezeten kívül végzett, ismételt felszaporodása nélkül képesek lennénk sejtpopulációk szabályozására, az jelentősen kiterjeszthetné a géntechnológiai eljárással módosított T-sejtek jelenlegi alkalmazási körét és hatékonyságát.

Bár a találmányt a fentiekben bizonyos konkrét megvalósítási módokon keresztül szemléltettük, nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás tovább módosítható, és az igényelt oltalmi kör kiterjed annak variációira, eltérő alkalmazásaira vagy adaptációira, amennyiben az alkalmazott változtatások a találmány szerinti megoldásra vonatkozó technika állásához tartoznak, és amennyiben rájuk olvashatók a találmány szerinti megoldás előzőekben bemutatott - és a csatolt igénypontokban megfogalmazott - lényegi sajátosságai.

HU 220 100 Β

SZEKVENCIALISTA

AZ 1, AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1728 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA 1728

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1389 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

1400

1450

1500

1550

1600

1650

1700

100

150

200

250

300

350

400

HU 220 100 Β

TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200 TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1599 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC 1250 CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300 AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350 GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG 1400 AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450 AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500 CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550 CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599

HU 220 100 Β

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 575 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro

Phe

Arg

Hi s

Leu 10

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

Al a

Leu

Pro 20

Al a

Thr

Gin

Gly 25

Asn

Lys

Val

Leu 30

Gly

Ly s

Lys

Gly

Asp 35

Thr

Val

Glu

Leu

Thr 40

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin 45

Ly s

Lys

Ser

Ile

Gin 50

Phe

Hi s

Trp

Lys

Asn 55

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys 60

Ile

Leu

Gly

Asn

Gin 65

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr 70

Lys

Gly

Pro

Ser

Ly s 75

Leu

Asn

Asp

Arg

Al a 80

Asp

Ser

Arg

Ser 85

Leu

Trp

As p

Gin

Gly 90

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile 95

Ile

Lys

Asn

Leu

Lys 100

Ile

Glu

Asp

Se r

Asp 105

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu 110

Val

Glu

Asp

Gin

Lys 115

Glu

Val

Gin

Leu 120

Leu

Val

Phe

Gly

Leu 125

Thr

Al a

Asn

Ser

Asp 130

Thr

Hi s

Leu

Gin 135

Gly

Gin

Se r

Leu

Thr 140

Leu

Thr

Leu

Glu

Ser 145

Pro

Gly

Ser

Ser 150

Pro

Ser

Val

Gin

Cy s 155

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly 160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly 165

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser 170

Val

Ser

Gin

Leu

Glu 175

Leu

Gin

Asp

Ser

Gly 180

Thr

Trp

Thr

Cy s

Thr 185

Val

Leu

Gin

Asn

Gin 190

Lys

Val

Glu

Phe 195

Lys

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin 205

Lys

Al a

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Lys

Ly s

Glu 215

Gly

Glu

Gin

Val

Glu 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu 225

Al a

Phe

Thr

Va 1

Glu 230

Ly s

Leu

Thr

Gly

Ser 235

Gly

Glu

Leu

Trp

Trp 240

Gin

Al a

Glu

Arg

Al a 245

Ser

Lys

Ser 250

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp 255

Leu

Lys

As n

Lys

Glu 260

Val

Ser

Val

Lys

Arg 265

Val

Thr

Gin

Asp

Pro 270

Lys

Leu

Gin

Me t

Gly 275

Ly s

Leu

Pro

Leu 280

Hi s

Leu

Thr

Leu

Pro Gin 285

Al a

Leu

Pro

Gin 290

Tyr

Alá

Gly

Ser

Gly 295

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a 300

Leu

Glu

Al a

Lys

Thr 305

Gly

Ly s

Leu

Hi s

Gin 310

Glu

Va 1

Asn

Leu

Val 315

Val

Me t

Arg

Al a

Thr 320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn 325

Leu

Thr

Cy s

Glu

Val 330

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser 335

Pro

Lys

Leu

Me t

Leu 340

Ser

Leu

Ly s

Leu

Glu 345

Asn

Lys

Glu

Al a

Ly s 350

Val

Ser

Lys

Arg

Glu 355

Lys

Pro

Val

Trp

Val 360

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a 365

Gly

Me t

Trp

Gin

Cys 370

Leu

Ser

Asp

Ser 375

Gly

Gin

Val

Leu

Leu 380

Glu

Ser

Asn

Ile

Lys 385

Va 1

Leu

Pro

Thr

Trp 390

Ser

Thr

Pro

Va 1

Hi s 395

Al a

Asp

Pro

Ly s

Leu 400

Cys

Tyr

Leu

Asp 405

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile 410

Tyr

Gly

Val

Ile

Ile 415

Thr

HU 220 100 Β

Al a

Leu Tyr

Leu 420

Arg

Al a

Lys

Phe

Ser Arg 425

Ser Alá Glu Thr 430

Al a

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Ly s

Arg

Alá

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Me t

Gly

Lys

Gin

Arg

Asn

Pro

Gin

Glu

Gl y

Val

Tyr

465

470

475

480

Asn

Al a

Leu

Gin

Lys

As p

Lys

Me t

Pro

Glu

Al a

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

485

490

495

Thr

Ly s

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

Hi s

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

500

505

510

Asp

Ser

Hi s

Phe

Gin

Al a

Val

Gin

Phe

Gly

Asn

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Al a

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gin

Ser

Gin

Ser

Cys

Al a

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

545

550

555

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

Ser

Gin

Leu

565 570 575

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 462 bázispár TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: fehéqe

AZ 5.

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro

Phe

Arg

Hi s

Leu 10

Leu

Val

Leu

Gl n 15

Leu

Al a

Leu

Pro 20

Al a

Thr

Gin

Gly 25

Asn

Lys

Val

Leu 30

Gly

Lys

Gly

Asp 35

Thr

Va 1

Glu

Leu

Thr 40

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin 45

Lys

Ser

Ile

Gin 50

Phe

Hi s

Trp

Lys

Asn 55

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys 60

Ile

Leu

Gly

Asn

Gin 65

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr 70

Ly s

Gly

Pro

Ser

Lys 75

Leu

Asn

Asp

Arg

Al a 80

Asp

Ser

Arg

Ser 85

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly 90

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile 95

Ile

Lys

Asn

Leu

Lys 100

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp 105

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu 110

Val

Glu

Asp

Gin

Lys 115

Glu

Val

Gin

Leu 120

Leu

Val

Phe

Gly

Leu 125

Thr

Al a

Asn

Ser

As p 130

Thr

Hi s

Leu

Gin 135

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr 140

Leu

Thr

Leu

Glu

Ser 145

Pro

Gly

Ser

Ser 150

Pro

Ser

Val

Gin

Cy s 155

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly 160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly 165

Gly

Ly s

Thr

Leu

Ser 170

Val

Ser

Gin

Leu

Glu 175

Leu

Gin

As p

Ser

Gly 180

Thr

Trp

Thr

Cy s

Thr 185

Val

Leu

Gin

Asn

Gin 190

Lys

Val

Glu

Phe 195

Lys

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin 205

Ly s

Al a

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Ly s

Lys

Glu 215

Gly

Glu

Gin

Val

Glu 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu 225

Al a

Phe

Thr

Val

Glu 230

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser 235

Gly

Glu

Leu

Trp

Trp 240

Gin

Al a

Glu

Arg

Al a 245

Ser

Ly s

Ser 250

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp 255

Leu

HU 220 100 Β

Lys Asn

Lys

Glu 260

Va 1

Ser

Val

Lys

Arg 265

Val

Thr

Gin

Asp

Pro 270

Lys

Leu

Gin

Me t

Gly

Lys

Ly s

Leu

Pro

Leu

Hi s

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Al a

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Al a

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a

Leu

Glu

Al a

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Ly s

Leu

Hi s

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Me t

Arg

Al a

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cy s

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Me t

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Al a

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Gly

Me t

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lys

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

Hi s

Al a

Asp

Pro

Gin

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Ile

Leu

Asp

Al a

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ile

Val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cys

Arg

Leu

Lys

Ile

Gin

Val

Arg

Ly s

Al a

Asp

Ile

Al a

420

425

430

Ser

Arg

Glu

Lys

Ser

Asp

Al a

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Arg

Asn

435

440

445

Gin

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Ly s

Hi s

Glu

Ly s

Pro

Gin

450

455

460

462

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 532 bázispár TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro

Phe

Arg

Hi s

Leu 10

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

Al a

Leu

Pro 20

Al a

Thr

Gin

Gly 25

Asn

Lys

Val

Leu 30

Gly

Lys

Gly

Asp 35

Thr

Va 1

Glu

Leu

Thr 40

Cys

Thr

Al a

Ser

Gin 45

Lys

Ser

Ile

Gin 50

Phe

Hi s

Trp

Lys

Asn 55

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys 60

Ile

Leu

Gly

Asn

Gin 65

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr 70

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys 75

Leu

Asn

As p

Arg

Alá 80

Asp

Ser

Arg

Ser 85

Leu

Trp

Asn

Gin

Gly 90

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile 95

Ile

Ly s

Asn

Leu

Lys 100

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp 105

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu 110

Val

Glu

Asp

Gin

Lys 115

Glu

Val

Gin

Leu 120

Leu

Val

Phe

Gly

Leu 125

Thr

Al a

Asn

Ser

As p 130

Thr

Hi s

Leu

Gin 135

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr 140

Leu

Thr

Leu

Glu

Ser 145

Pro

Gly

Ser

Ser 150

Pro

Ser

Val

Gin

Cys 155

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly 160

Ly s

Asn

Ile

Gin

Gl y 165

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser 170

Val

Ser

Gin

Leu

Glu 175

Leu

Gin

As p

Ser

Gly 180

Thr

Trp

Thr

Cy s

Thr 185

Va 1

Leu

Gin

Asn

Gin 190

Ly s

Val

Glu

Phe 195

Lys

Ile

Asp

Ile

Val 200

Val

Leu

Al a

Phe

Gin Lys 205

Al a

Ser

HU 220 100 Β

Ser

Ile 210

Val

Tyr

Lys

Glu Gly Glu Gin Val 215

Glu 220

Phe

Ser

Phe

Pro

Leu

Al a

Phe

Thr

Va 1

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Al a

Glu

Arg

Al a

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Va 1

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Ly s

Leu

260

265

270

Gin

Me t

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

Hi s

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Al a

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Al a

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Al a

Leu

Glu

Al a

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

Hi s

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Me t

Arg

Al a

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lys

Leu

Me t

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Al a

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Ly s

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Al a

Gly

Me t

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Ly s

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

Hi s

Al a

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Asp

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

405

410

415

Al a

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

Ly s

Phe

Ser

Arg

Ser

Alá

Glu

Pro

Al a

420

425

430

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

As p

Val

Leu

As p

Lys

Arg

Gly

Arg

As p

Pro

Glu

450

455

460

Me t

Gly

Ly s

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

465

470

475

480

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Me t

Al a

Glu

Al a

Tyr

Ser

Glu

I 1 e

Gly

Me t

485

490

495

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

Hi s

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

500

505

510

Leu

Ser

Thr

Al a

Thr

Lys

Asp

Thr

Tyr

Asp

Al a

Leu

Hi s

Me t

Gin

Al a

515

520

525

Leu

Pro

Arg

530

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 50bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50

HU 220 100 Β

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI :

HOSSZA: 15 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

All. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCTA 15

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 48bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU 220 100 Β

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36 A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 3 3

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 26bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42 A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG 30

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

HU 220 100 Β

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31 A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 171 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu

Hi s

Ser

Thr 5

Phe

Leu

Ser

Gly

Leu 10

Val

Leu

Al a

Thr

Leu 15

Leu

Ser

Gin

Val

Ser

Pro

Phe

Lys

Ile

Pro

Ile

Glu

Leu

Glu

Asp

Arg

20

25

30

Val

Phe

Val

Asn

Cy s

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Trp

Va 1

Gl u

Gly

Thr

Val

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Ser

Asp

Ile

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly

Ly s

Arg

Ile

50

55

60

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

Ile

Tyr

Arg

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ile

Tyr

Ly s

65

70

75

80

Asp

Ly s

Glu

Ser

Thr

Val

Gin

Val

Hi s

Tyr

Arg

Me t

Cy s

Gin

Ser

Cys

85

90

95

Val

Gl u

Leu

Asp

Pro

Al a

Thr

Va 1

Al a

Gly

Ile

Val

Thr

Asp

Val

100

105

110

Al a

Ile

Thr

Leu

Al a

Leu

Gly

Val

Phe

Cys

Phe

Al a

Gly

Hi s

115

120

125

Glu

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Gly

Al a

Asp

Thr

Gin

Al a

Leu

Arg

130

135

140

Asn

As p

Gin

Val

Tyr

Gin

Pro

Leu

Arg

Asp

Arg

Asp

Al a

Gin

Tyr

145

150

155

160

Ser

Hi s

Leu

Gly

Asn

Trp

Al a

Arg

Asn

Ly s

165 170

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 182 aminosav TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: aminosav A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Glu Gin

Gly Lys

Gly

Leu

Al a

Val

Leu

Ile

Leu

Alá

Ile

Leu

5

10

15

Leu

Gin Gly

Thr Leu

Al a

Gin

Ser

Ile

Lys

Gly

Asn

Hi s

Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr Asp

Tyr Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Cy s

Asp

Al a

35

40

45

Glu

Alá Lys

Asn Ile

Thr

Trp

Phe

Ly s

As p

Gly

Ly s

Me t

Ile

Gly

Phe

50

55

60

HU 220 100 Β

Leu

Thr

Glu

Asp

Ly s

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Al a

Lys

Asp

65

70

75

80

Pro

Arg

Gly

Me t

Tyr

Gin

Cys

Ly s

Gly

Ser

Gl n

Asn

Lys

Ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Arg

Me t

Cy s

Gin

Asn

Cy s

Ile

Glu

Leu

Asn

Al a

100

105

110

Al a

Thr

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Al a

Glu

Ile

Val

Ser

Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Al a

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile

Al a

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

Arg

Al a

Ser

As p

Lys

Gin

Thr

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

As p

Arg

Glu

Asp

Gin

Tyr

Ser

Hi s

Leu

Gin

Gly

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Arg

Asn

180

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 220 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t

Pro

Gly

Leu 5

Glu

Al a

Leu

Arg

Al a 10

Leu

Pro

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Ser

Tyr

Al a

Cy s

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gin

Al a

Leu

Arg

Val

Glu

20

25

30

Gly

Pro

Ser

Leu

Thr

Val

Asn

Leu

Gl y

Glu

Al a

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cys

Glu

Asn

Gly

Arg

Asn

Pro

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Asn

Ile

Thr

Trp

Pro

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Gly

Gin

65

70

75

80

Gly

Thr

Gly

Gin

Leu

Phe

Pro

Glu

Val

Asn

Lys

Asn

Thr

Gly

85

90

95

Al a

Cy s

Thr

Gly

Cy s

Gin

Val

Ile

Glu

Asn

Ile

Leu

Ly s

Arg

Ser

100

105

110

Cys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Arg

Val

Arg

Asn

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Phe

Leu

115

120

125

Asp

Me t

Gl y

Glu

Gly

Thr

Lys

Asn

Arg

Ile

Thr

Al a

Glu

Gly

Ile

130

135

140

Ile

Leu

Phe

Cy s

Al a

Val

Pro

Gly

Thr

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Lys

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Lys

Phe

Gly

Val

As p

Me t

Pro

As p

Asp

Tyr

165

170

175

Glu

Asp

Glu

Asn

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Leu

Asp

Cy s

Ser

Me t

180

185

190

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Arg

Gly

Leu

Gin

Gly

Thr

Tyr

Gin

Asp

Val

Gly

195

200

205

Asn

Leu

Hi s

Ile

Gl y

Asp

Al a

Gin

Leu

Glu

Ly s

Pro

210

215

220

A 27.

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 228 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Alá Thr Leu Val Leu Ser Ser Met 5

Pro Cys Hi s 10

Trp Leu Leu 15

Phe

HU 220 100 Β

Leu

Leu 20

Phe

Ser

Gly

Gl u

Pro 25

Val

Pro

Al a

Me t

Thr 30

Ser

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pro

Cys

Ser

Gin

lle

Trp

Gin

35

40

45

Hi s

Pro

Arg

Phe

Al a

Lys

Arg

Ser

Me t

Val

Lys

Phe

Hi s

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

Hi s

Ser

Gly

Al a

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

lle

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

lle

Gin

Asn

lle

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

lle

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Ly s

Cys

Asp

Ser

Al a

Asn

115

120

125

Hi s

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

As p

Gly

lle

145

150

155

160

lle

Leu

lle

Gin

Thr

Leu

lle

Leu

Phe

lle

Val

Pro

lle

165

170

175

Phe

Leu

As p

Lys

As p

Gly

Ly s

Al a

Gly

Me t

Glu

Asp

180

185

190

Hi s

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

lle

Asp

Gin

Thr

Al a

Thr

Tyr

Glu

Asp

195

200

205

lle

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

Glu

Hi s

210

215

220

Pro

Gly

Gin

Glu

225

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Proteintermészetű, membránhoz kötött kiméra- 35 receptort expresszáló terápiás sejtek emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor a következő részeket tartalmazza: 40 (i) a CD4-antigén egy, a HIV-fertőzött sejteket specifikusan felismerni és azokhoz kötődni képes fragmensét tartalmazó, HIV-fertőződés kialakulását azonban nem közvetítő extracelluláris részt, valamint (ii) a terápiás sejt számára - a terápiás sejtet a recep- 45 torhoz kötődött HIV-fertőzött sejt elpusztítására késztető - jelzést közvetíteni képes intracelluláris részt.
2. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunvá- 50 lasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor extracelluláris része CD4-fragmensként a CD41-394. vagy 1-200. aminosavait tartalmazza.
3. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunvá- 55 lasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptorban a CD4-fragmenst az intracelluláris résztől a CD7-antigén transzmembrándoménja (26. ábra) vagy a humán IgGl-molekula kapocsrégiója, CH2- és CH3-doménja (25. ábra) választja el. 60
4. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor CD4-fragmensét a terápiás sejt membránjától legalább 48 angström vagy legalább 72 angström távolság választja el.
5. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor intracelluláris része egy T-sejtreceptor-protein, egy B-sejt-receptor-protein vagy egy Fc-receptor-protein szignáltranszdukciós része.
6. Az 5. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor intracelluláris része egy T-sejtreceptor-protein, közelebbről egy ζ-lánc.
7. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, amely sejtek (a) T-limfociták; (b) citotoxikus T-limfociták; (c) természetes ölősejtek; (d) neutrofil sejtek; (e) granulociták; (f) makrofágok; (g) hízósejtek; (h) HeLa-sejtek vagy (i) embrionális törzssejtek (ES).
8. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptor CD7-antigén eredetű transz36

HU 220 100 Β membránrészt, CD5-antigén eredetű transzmembránrészt vagy CD4-antigén eredetű transzmembránrészt tartalmaz.
9. Az 1. igénypont szerinti terápiás sejtek, emlősben HIV-fertőzött sejtekkel szembeni sejtszintű immunválasz kiváltására történő alkalmazásra, ahol az expresszált kimérareceptorban a CD4-ffagmenst a terápiás sejt membránjától egy vagy több proteintermészetű alfa-hélix választja el.
10. Proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptort expresszáló sejt, azzal jellemezve, hogy a kimérareceptor a következőket tartalmazza:

(i) a CD4-antigén egy, a HIV-fertőzött sejteket specifikusan felismerni és azokhoz kötődni képes fragmensét tartalmazó, HIV-fertőződés kialakulását azonban nem közvetítő extracelluláris részt, valamint (ii) a terápiás sejt számára - a terápiás sejtet a receptorhoz kötődött HIV-fertőzött sejt elpusztítására késztető - jelzést közvetíteni képes intracelluláris részt.
11. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptor extracelluláris része CD4-fragmensként a CD4 1-394. vagy 1-200. aminosavait tartalmazza.
12. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptorban a CD4-fragmenst az intracelluláris résztől a CD7-antigén transzmembrándoménja (26. ábra) vagy a humán IgGl-molekula kapocsrégiója, CH2- és CH3-doménja (25. ábra) választja el.
13. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptor CD4-fragmensét a terápiás sejt membránjától legalább 48 angström vagy legalább 72 angström távolság választja el.
14. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptor extracelluláris része egy T-sejt-receptorprotein, egy B-sejt-receptor-protein vagy egy Fc-receptor-protein szignáltranszdukciós része.
15. A 14. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptor extracelluláris része egy T-sejt-receptorprotein, közelebbről egy ζ-lánc.
16. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptor CD7-antigén eredetű transzmembránrészt, CD5-antigén eredetű transzmembránrészt vagy CD34-antigén eredetű transzmembránrészt tartalmaz.
17. A 10. igénypont szerinti sejt, ahol az expresszált kimérareceptorban a CD4-fragmenst a terápiás sejt membránjától egy vagy több proteintermészetű alfahélix választja el.
18. DNS, amely a 10. igénypont szerinti kimérareceptort kódol.
19. Vektor, amely 18. igénypont szerinti kimérareceptort kódoló DNS-t tartalmaz.