ES2249766T3 - Citolisis dirigida de celulas infectadas por hiv mediante celulas quimericas portadoras del receptor cd4. - Google Patents

Abstract

SE EXPONE UN METODO PARA DIRIGIR UNA RESPUESTA INMUNO-CELULAR CONTRA LA CELULA VIH INFECTADA EN UN MAMIFERO QUE IMPLICA ADMINISTRAR AL MAMIFERO UNA CANTIDAD EFECTIVA DE CELULAS TERAPEUTICAS QUE MUESTRAN UN RECEPTOR QUIMERICO PROTEINACEO UNIDO A UNA MEMBRANA QUE COMPRENDE (A) UNA PORCION EXTRACELULAR QUE INCLUYE UN FRAGMENTO DE CD4 QUE ES CAPAZ DE RECONOCER ESPECIFICAMENTE Y UNIR LA CELULA VIH INFECTADA PERO QUE NO INTERVIENE EN LA INFECCION DE VIH (B) UNA PORCION INTRACELULAR QUE ES CAPAZ DE INDICAR A LA CELULA TERAPEUTICA QUE DESTRUYA LA CELULA UNIDA AL RECEPTOR INFECTADA POR VIH. TAMBIEN SE EXPONEN CELULAS QUE MUESTRAN LOS RECEPTORES QUIMERICOS Y ADN Y VECTORES QUE CODIFICAN LOS RECEPTORES QUIMERICOS.

Description

Citolisis dirigida de células infectadas por HIV mediante células quiméricas portadoras del receptor CD4.

Campo de la invención

La invención concierne a quimeras funcionales entre fragmentos CD4 y receptores de células inmunes que son capaces de dirigir a las células inmunes para que lisen a células infectadas con HIV, pero que no hacen que las células inmunes se vuelvan susceptibles a la infección con HIV.

Antecedentes de la invención

El reconocimiento de antígenos por las células T a través del receptor de las células T es la base de una gama de fenómenos inmunológicos. Las células T dirigen lo que se denomina inmunidad mediada por células. Ésta supone la destrucción mediante células del sistema inmune de tejidos extraños o de células infectadas. Existe una variedad de células T, que incluyen las células "ayudantes" y "supresoras", que modulan la respuesta inmune, y las células citotóxicas (o "asesinas"), que pueden matar directamente a las células anormales.

Una célula T, que reconoce y se enlaza a un único antígeno manifestado sobre la superficie de otra célula, se activa; a continuación se puede multiplicar, y, si es una célula citotóxica, puede matar a la célula enlazada.

HIV e inmunopatogénesis

En 1984 se mostró que el HIV era el agente etiológico del SIDA. Desde ese momento la definición de SIDA ha sido revisada varias veces con respecto a qué criterios se deben incluir en el diagnóstico. Sin embargo, a pesar de la fluctuación de los parámetros de diagnóstico, el denominador simple común del SIDA es la infección con HIV y el subsiguiente desarrollo de síntomas constitucionales persistentes y enfermedades que definen el SIDA tales como infecciones secundarias, neoplasmas y enfermedades neurológicas. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12ava ed., McGraw Hill (1991).

El HIV es un retrovirus de ser humano del grupo de los lentivirus. Los cuatro retrovirus de ser humano reconocidos pertenecen a dos grupos distintos: los retrovirus linfotrópicos (o leucémicos) de células T de ser humano, HTLV-1 y HTLV-2, y los virus de la inmunodeficiencia de los seres humanos, HIV-1 y HIV-2. Los primeros son virus transformantes mientras que los últimos son virus citopáticos.

El HIV-1 ha sido identificado como la causa más común del SIDA en el mundo. La homología de secuencias entre HIV-2 y HIV-1 es aproximadamente 40%, estando el HIV-2 más estrechamente relacionado con algunos miembros de un grupo de virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV). Véase Curran, J. et al., Science 329: 1357-1359 (1985), Weiss, T. et al., Nature 324: 572-575 (1986).

El HIV tiene los genes retrovíricos usuales (env, gag, y pol) así como seis genes extra involucrados en la replicación y otras actividades biológicas de los virus. Como se especificó previamente, el denominador común del SIDA es una inmunosupresión profunda, predominantemente de la inmunidad mediada por células. Esta inmunosupresión conduce a una variedad de enfermedades oportunistas, particularmente ciertas infecciones y neoplasmas.

La causa principal del defecto inmune en el SIDA ha sido identificada como una deficiencia cuantitativa y cualitativa en la subserie de linfocitos derivados del timo (T), la población T4. Esta subserie de células está fenotípicamente definida por la presencia de la molécula de la superficie CD4, que se ha demostrado que es el receptor celular del HIV. Dalgleish et al., Nature 312: 763 (1984). Aunque las células T4 son el principal tipo de células infectadas con HIV, esencialmente cualquier célula humana que exprese la molécula CD4 sobre su superficie es capaz de enlazarse a y de ser infectada con el HIV.

Tradicionalmente, a las células T CD4^{+} se les ha asignado el papel de ayudantes/inductoras, que indica su función de proporcionar una señal activante a las células B, o que inducen a los linfocitos T que portan el marcador recíproco CD8 a que lleguen a ser células citotóxicas/supresoras. Reinherz y Schlossman, Cell 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).

El HIV se enlaza específicamente y con alta afinidad, vía un tramo de aminoácidos de la envoltura vírica (gp120), a una porción de la región V1 de la molécula CD4 localizada cerca de su extremo terminal N. Tras el enlace, el virus se funde con la membrana de la célula diana y se internaliza. Una vez internalizado, usa la enzima transcriptasa inversa para transcribir su RNA genómico al DNA, que se integra en el DNA celular en el que existe durante la vida de la célula como un "provirus".

El provirus puede permanecer latente o activarse para transcribir mRNA y RNA genómico, lo que conduce a la síntesis de proteínas, ensamblaje, nueva formación de viriones, y al brote del virus en la superficie celular. Aunque no se ha establecido el mecanismo preciso mediante el cual el virus induce la muerte celular, se cree que el principal mecanismo es el brote vírico masivo en la superficie celular, que conduce al desbaratamiento de la membrana plasmática y da lugar a un desequilibrio osmótico.

Durante el curso de la infección, el organismo huésped desarrolla anticuerpos contra las proteínas víricas, que incluyen las principales glicoproteínas de la envoltura gp120 y gp41. A pesar de esta inmunidad humoral, la enfermedad progresa, dando lugar a una inmunosupresión letal caracterizada por múltiples infecciones oportunistas, parasitemia, demencia y muerte. El fallo de los anticuerpos antivíricos del huésped para detener la progresión de la enfermedad representa uno de los aspectos más engorrosos y alarmantes de la infección, y augura escaso éxito de los esfuerzos de vacunación basados en enfoques convencionales.

Dos factores pueden jugar un papel en la eficacia de la respuesta humoral a los virus de la inmunodeficiencia. En primer lugar, como otros virus con RNA (y en particular, retrovirus semejantes), los virus de la inmunodeficiencia muestran una alta velocidad de rotación en respuesta a la vigilancia inmune del huésped. En segundo lugar, las glicoproteínas de la envoltura son en sí mismas moléculas fuertemente glicosiladas que presentan pocos epítopes adecuados para el enlace de anticuerpos de alta afinidad. La diana pobremente antígena que presenta la envoltura vírica no permite al huésped muchas oportunidades de restringir la infección vírica mediante la producción de anticuerpos específicos.

Las células infectadas con el virus HIV expresan sobre su superficie la glicoproteína gp120. La gp120 media eventos de fusión entre las células CD4^{+} vía una reacción similar mediante la cual el virus entra en las células no infectadas, lo que conduce a la formación de células gigantes multinucleadas de corta vida. La formación del sincitio depende de una interacción directa de la glicoproteína gp120 de la envoltura con la proteína CD4. Dalgleish et al., supra; Klatzman, D. et al., Nature 312: 763 (1984): McDougal, J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 322: 470 (1986); Lifson, J.D. et al., Nature 323: 725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321: 412 (1986).

Las evidencias de que el enlace CD4-gp120 es responsable de la infección vírica de células que portan el antígeno CD4 incluyen el hallazgo de que se forma un complejo específico entre gp120 y CD4 (McDougal et al., supra). Otros investigadores han mostrado que los linajes celulares, que no son infectables por el HIV, se convirtieron en linajes celulares infectables tras la transfección y expresión del gen de cDNA de la proteína CD4 de ser humano. Maddon et al., Cell 46: 333-348 (1986).

Se han propuesto programas terapéuticos basados en la proteína CD4 soluble como agente pasivo para interferir con la adsorción vírica y la transmisión celular mediada por el sincitio, y han sido demostrados con éxito in vitro por varios grupos (Deen et al., Nature 331: 82-84 (1988); Fisher et al., Nature 331: 76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78-81 (1988); Smith et al., Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)); y subsiguientemente se han desarrollado proteínas de fusión CD4 e inmunoglobulinas con semividas alargadas y modesta actividad biológica (Capon et al., Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339: 68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344: 667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)). Aunque los conjugados o proteínas de fusión de CD4 e inmunotoxinas muestran una potente citotoxicidad para las células infectadas in vitro (Chaudhary et al., Nature 335: 369-372 (1988); Till et al., Science 242: 1166-1168 (1988)), la latencia del síndrome de inmunodeficiencia hace improbable que ninguna terapia de tratamiento único sea efectiva para eliminar la carga del virus, y es probable que la antigenicidad de las proteínas de fusión foráneas limite su aceptabilidad en tratamientos que requieran dosis repetitivas. Las pruebas con monos afectados con SIV han mostrado que si la proteína CD4 soluble se administra a animales sin una marcada citopenia para CD4, puede reducir los títulos de SIV y mejorar in vitro las medidas del potencial mieloide (Watanabe et al., Nature 337: 267-270 (1989)). Sin embargo, después de parar el tratamiento se observó un pronto resurgimiento vírico, sugiriendo que podría ser necesaria la administración a lo largo de toda la vida para impedir la debilitación progresiva del sistema inmune.

Células T y receptores Fc

La expresión en la superficie de las células de la forma más abundante del receptor de antígenos de células T (TCR) requiere la coexpresión de al menos 6 cadenas polipéptidas distintas (Weiss et al., J. Exp. Med. 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)), las cadenas \alpha/\beta que se enlazan antígenos, los tres polipéptidos del complejo CD3, y \zeta. Si cualquiera de las cadenas está ausente, no se produce la expresión estable de los miembros restantes del complejo. \zeta es el polipéptido limitante de la expresión superficial del complejo completo (Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)) y se piensa que media al menos una fracción de los programas de activación celular activados por el reconocimiento del ligando del receptor (Weissman et al., EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Frank et al., Science 249: 174-177 (1990)). Un homodímero de 32 kDa del tipo I de la membrana integral, \zeta (zeta) tiene un dominio extracelular de 9 residuos sin ningún sitio para la adición de glicanos unidos por el átomo de N, y un dominio intracelular de 112 residuos (ratón) ó 113 residuos (ser humano) (Weissman et al., Science 238: 1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988)). Un isomorfo de \zeta denominado \eta (eta) (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263: 9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264: 14812-14817 (1989)), que surge de una ruta alternativa que empalma mRNA (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3233 (1990)), está presente en cantidades reducidas en células que expresan el receptor de antígenos. Se piensa que los heterodímeros \zeta-\eta median la formación de fosfatos de inositol, así como la muerte celular programada iniciada por el receptor denominada apoptosis (Mercep et al., Science 242: 571-574 (1988); Mercep et al., Science 246: 1162-1165 (1989)).

Como \zeta y \eta, la cadena \gamma (gamma) asociada al receptor Fc se expresa en los complejos de la superficie celular con polipéptidos adicionales, algunos de los cuales median el reconocimiento de ligandos, y otros de los cuales tienen una función indefinida. \gamma (gamma) porta una estructura homodímera y una organización global muy similar a la de \zeta y es un componente tanto del receptor de IgE, Fc\varepsilonRI, de alta afinidad de las células cebadas/basófilos, que al menos consiste en tres cadenas polipéptidas distintas (Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Ra et al., Nature 241: 752-754 (1989)), como de uno de los receptores de IgG de baja afinidad representado en ratones por Fc\gammaRII\alpha (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), y en seres humanos por la expresión del subtipo de CD16, CD16_{TM} (CD16 transmembranal), por macrofagos y células asesinas naturales (Lanier et al., Ra et al., Nature 342: 803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) y con un polipéptido de función no identificada (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)). Recientemente, se ha informado que \gamma es expresada por un linaje de células T de ratón, CTL, en el que forma homodímeros así como heterodímeros \gamma-\zeta y \gamma-\eta (Orloff et al., Nature 347: 189-191 (1990)).

Los receptores Fc median la fagocitosis de complejos inmunes, la transcitosis, y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); y Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16-25 (1988)). Recientemente, se ha mostrado que uno de los compuestos isomorfos del receptor Fc de baja afinidad de la murina, FcR\gammaIIIB1, media la internalización de dianas revestidas con Ig en cavidades revestidas con clatrina, y que otro receptor de baja actividad, FcR\gammaIIIA, media la ADCC a través de su asociación con uno o más miembros de una pequeña familia de moléculas activantes (Miettinen et al., Cell 58: 317-327 (1989); y Hunziker y Mellman, J. Cell Biol. 109: 3291-3302 (1989)). Estas moléculas activantes, cadena \zeta del receptor de células T (TCR), cadena \eta del TCR, y cadena \gamma del receptor Fc, interaccionan con los dominios de reconocimiento de ligandos de diferentes receptores del sistema inmune y pueden iniciar autónomamente, tras la agregación, programas efectores celulares, incluyendo la citolisis (Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239: 1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki y Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990); e Irving y Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)).

Sin embargo, buscando paralelismos entre las familias de receptores Fc de baja afinidad de murina y de ser humano ha llegado a quedar claro que los isomorfos C y FcR\gammaIIA de ser humano no tienen ninguna contrapartida en la murina. En parte debido a esto, todavía no se ha definido su función.

Debido a que los agentes humorales basados sólo en la proteína CD4 pueden tener una utilidad limitada in vivo, el trabajo previo exploró la posibilidad de aumentar la inmunidad celular al HIV. Se han identificado preparaciones de quimeras de proteínas en las que el dominio extracelular de CD4 se funde con los dominios transmembranales y/o intracelulares de elementos que transducen la señal del receptor de células T, receptor Fc de IgC, o del receptor de células B (documentos U.S.S.N. 07/847.566 y 07/665.961). Las células T citolíticas que expresan quimeras que incluyen un dominio extracelular de CD4 muestran una potente destrucción independiente de MHC de dianas celulares que expresan proteínas de la envoltura del HIV. Un componente extremadamente importante y nuevo de este enfoque ha sido la identificación de cadenas simples del receptor de células T, receptor Fc, y del receptor de células B cuya agregación basta para iniciar la respuesta celular. Una aplicación particularmente útil de este enfoque ha sido la invención de quimeras entre CD4 y \zeta, \eta o \gamma que dirigen a los linfocitos T citolíticos a reconocer y matar las células que expresan la glicoproteína gp150 del HIV (documentos U.S.S.N. 07/847.566 y 07/665.961).

Sumario de la invención

En general, la invención caracteriza un DNA que codifica a un receptor quimera de naturaleza proteica enlazado a la membrana, comprendiendo dicho receptor: (a) una porción extracelular que incluye una porción de CD4 que comprende los aminoácidos 1-394 ó 1-200 de CD4, y (b) una porción intracelular que es capaz de transmitir una señal a una célula para que destruya a una célula infectada con HIV enlazada al receptor, en el que porción intracelular es la porción transductora de la señal de una proteína receptora de células T, una proteína receptora de células B o una proteína receptora Fc en la que dicha porción extracelular (a) y dicha porción intracelular (b) están separadas por al menos 48 angstroms mediante una porción transmembranal que incluye una porción transmembranal de CD7, una porción transmembranal de CD4, una porción transmembranal de CD34, una hélice alfa de naturaleza proteica, los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 de ser humano, o una hélice alfa de naturaleza proteica fundida con el dominio transmembranal de CD 34.

En un segundo aspecto, la invención caracteriza una célula que expresa el DNA anteriormente mencionado.

En realizaciones preferidas de ambos aspectos, el fragmento de la proteína CD4 es el de los aminoácidos 1-394 de la proteína CD4 o es el de los aminoácidos 1-200 de la proteína CD4; el fragmento de CD4 está separado de la porción intracelular por el dominio transmembranal de CD7 mostrado en la fig. 26, o por los dominios bisagra, CH_{2} y CH3 de la molécula IgG1 de ser humano mostrada en la fig. 25; el receptor incluye una porción transmembranal de CD7; el receptor incluye una porción transmembranal de CD5; el receptor incluye una porción transmembranal de CD34; el fragmento de CD4 está separado de la membrana de la célula terapéutica por una o más hélices alfa de naturaleza proteica; el fragmento de CD4 está separado de la membrana de la célula terapéutica por al menos 48 angstroms o por al menos 72 angstroms; la porción intracelular es la porción transductora de señales de una proteína receptora de células T (por ejemplo, \zeta), una proteína receptora de células B, o una proteína receptora de Fc; y las células terapéuticas se seleccionan del grupo que consta de: (a) linfocitos T; (b) linfocitos células T citotóxicos; (c) células asesinas naturales; (d) neutrófilos; (e) granulocitos; (f) macrofagos; (g) células cebadas; y (h) células HeLa.

En otros aspectos, la invención caracteriza a un vector, incluyendo ese DNA del receptor quimera.

Aunque la realización específica de la presente invención es una quimera entre las proteínas CD4 y zeta, para los fines descritos en la presente memoria se podría usar cualquier cadena receptora que tuviera una función similar a estas moléculas, por ejemplo, en granulocitos o linfocitos B. Los rasgos distintivos de una molécula activante de células inmunes deseable comprenden la capacidad de expresarse autónomamente (es decir, como una única cadena), la capacidad de fundirse con un dominio extracelular de CD4 tal que la quimera resultante esté presente sobre la superficie de una célula terapéutica, y la capacidad de iniciar programas celulares efectores tras la agregación secundaria para encontrase con un ligando diana.

Actualmente, el método más conveniente para suministrar las quimeras a las células del sistema inmune es por medio de alguna forma de terapia genética. Sin embargo, la reconstitución de células del sistema inmune con receptores quimera mediante mezclado de las células con una proteína quimera purificada adecuadamente solubilizada también daría lugar a la formación de una población de células diseñadas por ingeniería genética capaz de responder a dianas infectadas con HIV. Enfoques similares se han usado, por ejemplo, para introducir la molécula CD4 en eritrocitos con fines terapéuticos. En este caso, la población de células diseñadas por ingeniería genética no sería capaz de autorrenovarse.

La presente invención se refiere a quimeras funcionales y simplificadas entre fragmentos de CD4 y subunidades de los receptores de células T, células B y de Fc que son capaces de dirigir a las células inmunes a reconocer y lisar a células infectadas con HIV. El método para dirigir la respuesta celular en un mamífero comprende administrar una cantidad efectiva de células terapéuticas (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos) al mamífero, células que son capaces de reconocer y destruir a la células infectada con HIV.

La invención también incluye las proteínas receptoras quimera que dirigen a los linfocitos T citotóxicos a reconocer y lisar a células infectadas con HIV y las células huésped transformadas con un vector que comprende los receptores quimera.

Estas y otras realizaciones no limitantes de la presente invención serán evidentes para los expertos a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

En la siguiente descripción detallada se hará referencia a varias metodologías conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular y de la inmunología.

Los trabajos de referencia estándar que ponen de manifiesto los principios generales de la tecnología del DNA recombinante incluyen Watson et al., Molecular Biology of the Gene, volúmenes I y II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., publisher, Nueva York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, publishers, Nueva York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2ª ed., University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, Nueva York, NY (1989).

Definiciones

Por "clonación" se quiere decir el uso de técnicas de recombinación in vitro para insertar un gen particular u otra secuencia de DNA en una molécula vector.

Por "cDNA" se quiere decir un DNA complementario o copia producido a partir de un templado de RNA por la acción de una DNA polimerasa (transcriptasa inversa) dependiente del RNA. Por tanto, un "clon de cDNA" quiere decir una secuencia dúplex de DNA complementaria con una molécula de RNA de interés, transportada en un vector de clonación.

Por "biblioteca de cDNA" se quiere decir una colección de moléculas de DNA recombinante que contiene insertos de cDNA que comprenden copias de DNA de mRNA que fue expresado por la célula en el momento en el que se hizo la biblioteca de cDNA. Tal biblioteca de cDNA se puede preparar por métodos conocidos por los expertos, y, por ejemplo, se describen en Ausubel et al., supra, y Maniatis et al., supra. Generalmente, en primer lugar el RNA se aísla de las células de un organismo cuyo genoma se desea para clonar un gen particular. Para el fin de la presente invención se prefieren los linajes de células linfocíticas de mamíferos, y particularmente de seres humanos. Un vector actualmente preferido para este fin es la cepa WR del virus de la viruela vacuna.

Por "vector" se quiere decir una molécula de DNA derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, o virus de mamíferos o insectos, en la cual se pueden insertar o clonar fragmentos de DNA. Un vector contendrá uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en un huésped u organismo vehículo definido tal que la secuencia clonada sea reproducible. Por tanto, por "vector de expresión de DNA" se quiere decir cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de un péptido recombinante. Tales vectores de expresión de DNA incluyen plásmidos y fagos bacterianos, y plásmidos y virus de mamíferos e insectos.

Por "sustancialmente puro" se quiere decir un compuesto, por ejemplo una proteína, un polipéptido o un anticuerpo, que está sustancialmente exento de los componentes que lo acompañan en la naturaleza. Generalmente, un compuesto es sustancialmente puro cuando al menos 60%, más preferiblemente al menos 75%, y mucho más preferiblemente al menos 90% del material total de una muestra es el compuesto de interés. La pureza se puede medir por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC. En el contexto de un ácido nucleico, "sustancialmente puro" quiere decir una secuencia, segmento o fragmento de ácido nucleico que no está inmediatamente contigua con (es decir, covalentemente unida a) ambas secuencias codificantes con las que es inmediatamente contiguo (es decir, una en el extremo 5' y otra en el extremo 3') en el genoma del organismo que se encuentra en la naturaleza, a partir del cual se deriva el DNA de la invención.

Un "fragmento" de una molécula, tal como cualquiera de las secuencias de cDNA de la presente invención, se refiere a cualquier subserie nucleótida contigua de la molécula. Un "análogo" de una molécula se refiere a una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula entera o a uno de sus fragmentos. Se dice que una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos de ambas moléculas es sustancialmente la misma. Moléculas de aminoácidos sustancialmente similares poseerán una actividad biológica similar. Como se usa en la presente memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos que normalmente no son parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc., de la molécula. Alternativamente, los restos pueden disminuir la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Restos capaces de mediar tales efectos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ava ed., Mack Publishing Co., Easton, PA. (1980).

Un "derivado funcional" de un gen de un receptor quimera de la presente invención quiere decir que incluye "fragmentos" o "análogos" del gen, que son "sustancialmente similares" en la secuencia de nucleótidos y que codifican una molécula que posee una actividad similar a, por ejemplo, una quimera del receptor Fc, una célula B o una célula T. Más preferiblemente, el derivado posee 90%, más preferiblemente 70% y preferiblemente 40% de la actividad del receptor quimera natural. La actividad de un derivado funcional de un receptor quimera incluye el enlace específico (con su porción extracelular de CD4) a una célula infectada con HIV y la destrucción resultante de esa célula; además, el receptor quimera no vuelve a la célula que porta el receptor susceptible a la infección con HIV. La actividad del receptor quimera se puede ensayar usando, por ejemplo, cualquiera de los ensayos descritos en la presente memoria.

Una secuencia de DNA que codifica al receptor quimera de CD4 de la presente invención, o a sus derivados funcionales, se puede recombinar con un DNA vector según técnicas convencionales, que incluyen terminales para ligar con extremos ciegos o extremos escalonados, digestión con enzimas de restricción para proporcionar terminales apropiadas, relleno de extremos cohesivos cuando sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligadura con ligasas apropiadas. Técnicas para tales manipulaciones son descritas por Maniatis et al., supra, y son bien conocidas en la técnica.

Se dice que una molécula tipo ácido nucleico, tal como el DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora transcripcional y translacional, y tales secuencias se "unen operablemente" a secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido. Una unión operable es una unión en la que las secuencias reguladoras de DNA y la secuencia de DNA que se busca se exprese están conectadas de tal forma que se permita la expresión de genes. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión de genes puede variar de organismo a organismo, pero en general incluirá una región promotora que, en los procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de la transcripción de RNA) así como las secuencias que, cuando se transcriben en RNA, transmitirán la señal de iniciación de la síntesis de proteínas. Normalmente, tales regiones incluyen las secuencias 5' no codificantes involucradas en la iniciación de la transcripción y la translación, tales como la caja TATA, una secuencia de remate, una secuencia CAAT y semejantes.

Si se desea, la región 3' no codificante de la secuencia del gen que codifica la proteína se puede obtener por los métodos anteriormente descritos. Esta región se puede retener por sus secuencias reguladoras de la terminación transcripcional, tales como terminación y poliadenilación. Por tanto, reteniendo la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de DNA que codifica la proteína se pueden transmitir señales de terminación transcripcional. Cuando las señales de terminación transcripcional no sean satisfactoriamente funcionales en la célula huésped de expresión, entonces la región 3' funcional de la célula huésped puede estar sustituida.

Se dice que dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de una región promotora y una secuencia que codifica la quimera del receptor CD4) están operablemente unidas si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de DNA: (1) no da lugar a la introducción de una mutación por cambio de marco, (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia del gen del receptor quimera, o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia del gen del receptor quimera para ser transcrito por la secuencia de la región promotora. Una región promotora estaría operablemente unida a una secuencia de DNA si el promotor fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de DNA. Por tanto, para expresar la proteína, son necesarias señales transcripcionales y translacionales reconocidas por un huésped apropiado.

La presente invención engloba la expresión de una proteína quimera del receptor CD4 (o de uno de sus derivados funcionales) en células procariotas o eucariotas, aunque se prefiere la expresión de células eucariotas (y, particularmente, linfocitos de ser humano).

Mediante "detectar" se pretende incluir la determinación de la presencia o ausencia de una sustancia o la cuantificación de la cantidad de una sustancia. Por tanto, la expresión se refiere al uso de los materiales, composiciones y métodos de la presente invención para determinaciones cualitativas y cuantitativas.

Por "específicamente reconoce y se enlaza" se quiere decir que un anticuerpo reconoce y se enlaza al polipéptido receptor quimera pero que sustancialmente no reconoce ni se enlaza a otras moléculas no relacionadas de una muestra, por ejemplo, una muestra biológica.

Por "célula terapéutica" se quiere decir una célula que ha sido transformada por una quimera del receptor CD4 de la invención para que sea capaz de reconocer y destruir a una célula infectada con HIV; preferiblemente, tales células terapéuticas son células del sistema hematopoyético.

Por "extracelular" se quiere decir que al menos tiene una porción de la molécula expuesta a la superficie celular. Por "intracelular" se quiere decir que al menos tiene una porción de la molécula expuesta al citoplasma de la célula terapéutica. Por "transmembranal" se quiere decir que al menos tiene una porción de la molécula extendiéndose por la membrana plasmática. Como se usan en la presente memoria, una "porción extracelular", una "porción intracelular", y una "porción transmembranal", pueden incluir secuencias de aminoácidos flanqueantes que se extienden en compartimentos celulares contiguos.

Por "oligomerizar" se quiere decir formar un complejo con otras proteínas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, u otros oligómeros de orden superior. Tales oligómeros pueden ser homo-oligómeros o hetero-oligómeros. Una "porción oligomerizante" es la región de una molécula que dirige la formación de un complejo (es decir, de un oligómero).

Por "citolítico" se quiere decir que es capaz de destruir una célula (por ejemplo, una célula infectada con HIV) o es capaz de destruir un agente infeccioso (por ejemplo, un virus HIV).

Por "virus de inmunodeficiencia" se quiere decir un retrovirus que, en forma natural, es capaz de infectar células T4 de un huésped primate y posee una morfogénesis y morfología víricas características de la subfamilia de los lentivirus. El término incluye, sin limitación, todas las variantes de HIV y SIV, que incluyen HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand, y SIVcpz.

Por "independiente de MHC" se quiere decir que la respuesta citolítica celular no requiere la presencia de un antígeno MHC clase II sobre la superficie de la célula diana.

Por un "derivado citolítico funcional que transduce una señal" se quiere decir un derivado funcional (como se definió anteriormente) que es capaz de dirigir al menos 40%, más preferiblemente 70%, o mucho más preferiblemente al menos 90% de la actividad biológica de la molécula natural. Como se usa en la presente memoria, un "derivado citolítico funcional que transduce una señal" puede actuar directamente transmitiendo una señal a la célula terapéutica para que destruya un agente o célula enlazada al receptor (por ejemplo, en el caso de una porción intracelular de un receptor quimera) o puede actuar indirectamente promoviendo la oligomerización con proteínas de la célula terapéutica (por ejemplo, en el caso de un dominio transmembranal) que transducen una señal citolítica. Tales derivados se pueden ensayar respecto a su eficacia, por ejemplo, usando los ensayos in vitro descritos en la presente memoria.

Por un "derivado funcional que se enlaza a la envoltura del HIV" se quiere decir un derivado funcional (como se definió anteriormente) que es capaz de enlazar cualquier proteína de la envoltura del HIV. Los derivados funcionales se pueden identificar usando, por ejemplo, los ensayos in vitro descritos en la presente memoria.

Administración terapéutica

Las células transformadas de la presente invención se pueden usar para la fabricación e un medicamento para la aplicación terapéutica en una infección con HIV. Los métodos actuales de administrar tales células transformadas implican la inmunoterapia adoptiva o la terapia de transferencia celular. Estos métodos permiten el retorno de las células transformadas del sistema inmune a la corriente sanguínea. Rosenberg, Scientific American 62 (mayo de 1990); Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine 323 (9): 570 (1990).

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar a cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de los compuestos de la invención. Ante todo, entre tales animales están los seres humanos, aunque no se pretende que la invención se limite a los mismos.

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Descripción detallada

En primer lugar se describirán los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A presenta la secuencia de aminoácidos cerca del sitio de fusión entre cadenas de CD4 (residuos 1-369) y de diferentes receptores. La secuencia subrayada muestra la posición de los aminoácidos codificados dentro del sitio BamHI usado para la construcción de la fusión. El comienzo del dominio transmembranal está marcado con una barra vertical. La secuencia de \eta es idéntica a la secuencia de \zeta en el extremo terminal amino, pero diverge en el extremo terminal carboxilo (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990)). La Fig. 1B presenta un análisis por citometría de flujo de la expresión superficial de CD4, CD4:\zeta, CD4:\gamma y CD4:\eta en células CV1. Las células se infectaron con virus que expresaban quimeras de CD4 o CD16_{PI}, incubadas durante 9 horas a 37ºC, y teñidas con MAb Leu3A anti-CD4 conjugado con ficoeritrina.

La Fig. 2 muestra la expresión superficial de CD16_{TM} tras la coinfección de CD16_{TM}solo (puntos densos), o coinfectado con el virus que expresa CD4:\gamma (trazos) o CD4:\zeta (línea sólida). Los puntos poco densos se refieren a células infectadas con CD4:\zeta solo, teñidas con 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275-3279 (1982) (MAb anti-CD16).

La Fig. 3 muestra la expresión superficial de CD16_{TM} tras la coinfección por virus que expresan CD16_{TM} y las siguientes quimeras de \zeta: CD4:\zeta (línea gruesa); CD4:\zeta C11G (línea sólida); CD4:\zeta (línea a trazos), CD4:\zeta C11G/D15G (puntos densos); ninguna coinfección (CD16_{TM} solo, puntos poco densos). Las células se incubaron con MAb 3G8 anti-CD16 y anticuerpos de cabra Fab'_{2} para IgG de ratón conjugados con ficoeritrina. El nivel de expresión de las quimeras de \zeta fue esencialmente idéntico para los diferentes mutantes analizados, y la coinfección de células con virus que expresaban CD16_{TM} y quimeras de \zeta no alteró apreciablemente la expresión superficial de las quimeras.

La Fig. 4A-D muestra el aumento intracelular del ion calcio libre que sigue a la reticulación de quimeras de \zeta mutantes en el linaje de células T. Se infectaron células Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133: 123-128 (1984)) con virus recombinantes de la viruela vacuna y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados mostrados son para la población CD4^{+} bloqueada, de modo que sólo se analicen las células que expresen la proteína quimera relevante. La relación media de fluorescencia Indo-1 violeta a azul refleja la concentración intracelular de calcio libre en la población en total y el porcentaje de células que responden refleja la fracción de células que excede de una relación umbral predeterminada (ajustada para que 10% de las células no tratadas sean positivas). La Fig. 4A y la Fig. 4B muestran células Jurkat que expresan CD4:\zeta (línea sólida) o CD16:\zeta (línea a trazos), que se expusieron a MAb Leu3a anti-CD4 (conjugado con ficoeritrina), seguido por reticulación con un anticuerpo de cabra para IgG de ratón. La línea de puntos muestra la respuesta de células no infectadas a MAb OKT3 anti-CD3. Las Figs. 4C y 4D muestran células Jurkat que expresan CD4:\zetaD15G (línea sólida); CD4:\zetaC11G/D15G (trazos); o CD4:\zetaC11G (puntos), que se trataron y analizaron como en las Figs. 4A y 4B.

La Fig. 5A-C muestran que los receptores CD4:\zeta, CD4:\eta, y CD4:\gamma permiten a los linfocitos T citolíticos (CTL) matar dianas que expresan el complejo gp120/41 del HIV-1. Fig. 5A: círculos sólidos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41; círculos abiertos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa no infectadas; cuadrados sólidos, CTL no infectados incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41; cuadrados abiertos, CTL no infectados incubados con células HeLa no infectadas. Fig. 5B: círculos sólidos, CTL que expresan CD4:\eta incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41; círculos abiertos, CTL que expresan CD4:\gamma incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41; cuadrados abiertos, CTL que expresan la quimera CD4:\zeta doble mutante C11G/D15G incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41. Fig. 5C: análisis por citometría de flujo de la expresión de CD4 por los CTL usados en la fig. 5B. Para corregir las relaciones diana a efector, se determinó el porcentaje de células que expresan la quimera de CD4 restando la población negativa (no infectada) ajustada a escala por superposición en un histograma; con fines comparativos, en esta figura a las células no infectadas se les asignó un valor umbral arbitrario que da aproximadamente la misma fracción positiva para las otras poblaciones de células que daría la sustracción en el histograma.

La Fig. 6A-B muestra la especificidad de la citolisis dirigida por CD4. Fig. 6A: círculos sólidos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa que expresan CD16_{PI}; círculos abiertos, CTL que expresan CD4 incubados con células HeLa que expresan la glicoproteína gp120; cuadrados sólidos, CTL que expresan CD16:\zeta incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41; cuadrados abiertos, CTL que expresan CD16_{PI} incubados con células HeLa que expresan el complejo gp120/41. Fig. 6B: círculos sólidos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células Raji (MHC clase II^{+}); círculos abiertos, CTL no infectados incubados con células RJ2.2.5 (mutante Raji de MHC clase II^{-}); cuadrados sólidos, CTL no infectados incubados con células Raji (MHC clase II^{+}); cuadrados abiertos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células RJ2.2.5 (MHC clase II^{-}). La escala de la ordenada está expandida.

La Fig. 7A-B muestra la caracterización del receptor quimera CD16:\zeta. La Fig. 7A es un diagrama esquemático de la proteína de fusión CD16:\zeta. La porción extracelular de la forma de CD16 monómera unida a fosfatidilinositol se unió a \zeta dímero justo en la zona externa del dominio transmembranal. La secuencia de proteína en el empalme de fusión se muestra en la parte inferior. La Fig. 7B muestra un análisis de citometría de flujo de la movilización del calcio tras la reticulación de la quimera CD16:\zeta en un linaje celular TRC positivo o TRC negativo. Se muestra la relación media de fluorescencia violeta a azul (una medida de la concentración relativa del ion calcio) entre las poblaciones de células tratadas con anticuerpos en el instante 0. Cuadrados sólidos, la respuesta de células Jurkat a MAb OKT3 anti-CD3; triángulos sólidos, la respuesta de CD16:\zeta a MAb 3G8 anti-CD16 que se reticula en el mutante REX33A TCR^{-}; cuadrados abiertos, la respuesta a CD16:\zeta que se reticula en el linaje Jurkat mutante TCR^{-} JRT3.T3.5; triángulos abiertos, la respuesta a CD16:\zeta que se reticula en células Jurkat; cruces, la respuesta a CD16 no quimera en células Jurkat; y puntos, la respuesta a CD16 no quimera en el linaje celular REX33A TCR^{-}.

La Fig. 8A-B muestra el análisis por supresión del potencial citolítico. La Fig. 8A muestra las localizaciones de los puntos finales de supresiones en \zeta. Aquí como en otra parte, las mutaciones en \zeta se representan por la convención de residuos originales residuo-localización-mutante, de modo que, por ejemplo, D66* denote la sustitución de Asp-66 por un codón de terminación. La Fig. 8B muestra los resultados del ensayo de citolisis de CD16:\zeta no suprimido y de supresiones salientes de \zeta. Se cargaron con ^{51}Cr células del hibridoma que expresan anticuerpos superficiales de CD16 y se incubaron con números crecientes de linfocitos citolíticos de ser humano (CTL) infectados con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresaban quimeras CD16:\zeta. El tanto por ciento de ^{51}Cr liberado se representa en función de la relación (e/t) de células efectoras (CTL) a células diana (hibridoma). Círculos sólidos, citolisis mediada por células que expresan CD16:\zeta (mfi 18,7); cuadrados sólidos, citolisis mediada por células que expresan CD16:\zeta Asp66* (mfi 940,2); cuadrados abiertos, citolisis mediada por células que expresan CD16:\zeta Glu60* (mfi 16,0); círculos abiertos, citolisis mediada por células que expresan CD16:\zeta Tir51* (mfi 17,4); triángulos sólidos, citolisis mediada por células que expresan CD16:\zetaPhe34* (mfi 17,8); y triángulos abiertos, citolisis mediada por células que expresan CD16 no quimera (mfi 591). Aunque en este experimento la expresión de CD16:\zetaAsp66* no se igualó a la de otras proteínas de fusión, la citolisis mediante células que expresaban CD16:\zeta en cantidades equivalentes en el mismo experimento dio resultados esencialmente idénticos a los mostrados por células que expresaban CD16:\zetaAsp66.

La Fig. 9A-D muestra que la eliminación del potencial de interacciones transmembranales revela un segmento corto de \zeta capaz de mediar en la citolisis. La Fig. 9A es un diagrama esquemático de las quimeras bipartitas y tripartitas monómeras. En la parte superior está la construcción CD16:\zeta truncada en el residuo 65 y que carece de los residuos transmembranales Cys y Asp. Debajo están las construcciones CD16:CD5:\zeta y CD16:CD7:\zeta y los testigos relacionados. Las secuencias de péptidos de los dominios intracelulares se muestran debajo. La Fig. 9B muestra la actividad citolítica de mutantes por supresión de quimeras monómeras. La actividad citolítica de células que expresan CD16:\zeta (círculos sólidos; mfi 495) se comparó con la de células que expresan CD16:\zetaAsp66* (cuadrados sólidos; mfi 527) o los mutantes CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (cuadrados abiertos; mfi 338) y CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Glu60* (triángulos rellenos; mfi 259). La Fig. 9C muestra la actividad citolítica mediada por proteínas tripartitas de fusión. Triángulos sólidos, CD16:\zetaAsp66*; cuadrados abiertos, CD16:5:\zeta(48-65); cuadrados sólidos CD16:7:\zeta(48-65); triángulos abiertos, CD16:7:\zeta(48-59); círculos abiertos, CD16:5; círculos sólidos, CD16:7. La Fig. 9D muestra la movilización del calcio por quimeras mutantes y tripartitas en el linaje celular mutante TCR negativo Jurkat JRT3.T3.5. Círculos abiertos, respuesta de células que expresan CD16:\zetaAsp66* dímero; cuadrados sólidos, respuesta de células que expresan CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*; cuadrados abiertos, respuesta de células que expresan CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*; triángulos sólidos, respuesta de células que expresan CD16:7:\zeta(48-65); y triángulos abiertos, respuesta de células que expresan CD16:\zeta(48-59).

La Fig. 10A-F muestra la contribución de aminoácidos individuales a la actividad del resto de 18 residuos que transduce la señal citolítica. Las Figs. 10A y 10B muestran la actividad citolítica y la Fig. 10C muestra la movilización de iones calcio mediada por quimeras que portan mutaciones puntuales cerca de la tirosina (Y62) del extremo terminal carboxilo. Las Figs. 10A y 10B representan datos recogidos de células que expresan cantidades bajas y altas, respectivamente, de las proteínas de fusión CD16:\zeta. Símbolos idénticos se usan para los ensayos de movilización del calcio y de citolisis, y se muestran a la derecha en un código de letras. Círculos sólidos, células que expresan CD16:\zeta (mfi en A, 21; B, 376); cuadrados sólidos, células que expresan CD16:7:\zeta (48-65) (mfi A, 31; B, 82); cuadrados abiertos, CD16:7:\zeta(48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); cruces, CD16:7:\zeta(48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); triángulos sólidos, CD16:7:\zeta (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); círculos abiertos, CD16:7:\zeta(48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); y triángulos abiertos, CD16:7:\zeta(48-65)Tyr62Ser (mfi B, 64). Las Figs. 10D y 10E muestran la actividad citolítica y la Fig. 10F muestra la movilización del ion calcio por quimeras que portan mutaciones puntuales cerca de la tirosina (Y51) del extremo terminal amino. Para los ensayos de movilización del calcio y los ensayos de citolisis se usan símbolos idénticos y se muestran a la derecha. Círculos sólidos, células que expresan CD16:\zeta (mfi en D, 21,2; en E, 672); cuadrados sólidos, células que expresan CD16:7:\zeta(48-65) (mfi D, 31,3; E, 179); triángulos sólidos, CD16:7:\zeta(48-65)Asn48Ser (mfi D, 22,4; E, 209); cuadrados abiertos, CD16:7:\zeta(48-65)Leu50Ser (mfi D, 25,0; E, 142); y triángulos abiertos, CD16:7:\zeta(48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32,3; E, 294).

La Fig. 11A-B muestra la alineación de repeticiones internas de \zeta y la comparación de su capacidad para soportar la citolisis. La Fig. 11A es un diagrama esquemático de quimeras formadas dividiendo el dominio intracelular de \zeta en tercios y adjuntándolos al dominio transmembranal de una quimera C16:7. Las secuencias de los dominios intracelulares se muestran debajo, con los residuos compartidos encajonados, y los residuos relacionados denotados por asteriscos. La Fig. 11B muestra la potencia citolítica de los tres subdominios de \zeta. Círculos sólidos, células que expresan CD16:\zeta (mfi 476); cuadrados sólidos, CD16:7:\zeta(33-65) (mfi 68); cuadrados abiertos, CD16:7:\zeta(71-104) (mfi 114); y triángulos sólidos, CD16:7:\zeta(104-138) (mfi 104).

La Fig. 12 es un diagrama esquemático de las quimeras CD16:FcR\gammaII.

La Fig. 13A-B muestra la movilización del calcio tras la reticulación de quimeras CD4:FcR\gammaII y CD16:FcR\gammaII. La Fig. 13A muestra la relación de fluorescencia violeta a azul emitida por células cargadas con el fluoróforo Indo-1 sensible al calcio, mostrada en función del tiempo tras la reticulación del dominio extracelular de CD16 con anticuerpos. La Fig. 13B muestra un análisis similar del aumento de la relación de fluorescencia violeta a azul de células que portan quimeras CD4:FcR\gammaII, tras la reticulación con anticuerpos.

La Fig. 14A-B muestra los ensayos de citolisis de quimeras CD4:FcR\gammaII y CD16:FcR\gammaII. La Fig. 14A muestra el tanto por ciento de ^{51}Cr liberado de células de hibridoma (diana) anti-CD16 cuando las células se exponen a números crecientes de linfocitos T citotóxicos que expresan quimeras CD16:FcR\gammaII (células efectoras). La Fig. 14B muestra un análisis de citotoxicidad similar mediado por quimeras CD4:FcR\gammaII contra células diana que expresan glicoproteínas de la envoltura del HIV.

La Fig. 15A-E muestra la identificación de residuos en la cola de FcR\gammaII A, que son importantes para la citolisis. La Fig. 15A es un diagrama esquemático de las construcciones por supresión. Las Figs. 15B y 15C muestran la movilización del calcio y la citolisis mediante variantes de CD16:FcR\gammaII A con supresiones en el extremo terminal carboxi. Las Figs. 15D y 15E muestran la movilización del calcio y la citolisis por quimeras tripartitas que portan progresivamente menos del extremo terminal amino de la cola intracelular de CD16:FcR\gammaII A.

La Fig. 16 (SEQ ID NO: 24) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora CD3 delta; la secuencia encajonada representa una porción preferida que transduce una señal citolítica.

La Fig. 17 (SEQ ID NO: 25) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora T3 gamma; la secuencia encajonada representa una porción preferida que transduce una señal citolítica.

La Fig. 18 (SEQ ID NO: 26) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora mb1; la secuencia encajonada representa una porción preferida que transduce una señal citolítica.

La Fig. 19 (SEQ ID NO: 27) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora B29; la secuencia encajonada representa una porción preferida que transduce una señal citolítica.

La Fig. 20A-E muestra un diagrama esquemático de las quimeras de CD4. La molécula "A" es
CD4(D1-D4):Ig:CD7; la molécula "B" es CD4(D1,D2):Ig:CD7; la molécula "C" es CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta; la molécula "D" es CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta; y la molécula "E" es CD4:\zeta. El dominio extracelular de la molécula CD4 de ser humano correspondiente a los aminoácidos 1-394 del precursor se unió por un sitio BamHI a los dominios bisagra, CH1 y CH2 de IgG1 de ser humano como se describió previamente (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) excepto que para permitir la expresión en recombinantes de virus de la viruela vacuna se usó una versión de cDNA de las secuencias de Ig de ser humano. La versión de dos dominios de las quimeras de CD4 se creó por inserción de un adaptador BamHI en el sitio único NheI (que corresponde al aminoácido 200) en el cDNa precursor de CD4. Las secuencias de fijación a la membrana consistían en 22 residuos desde el primer exón de IgG1 de ser humano enlazada a la membrana, seguido por los residuos de CD7 146-203. Los aminoácidos 55 a 163 de \zeta sirvieron como resto activante de las construcciones tetrapartitas (C y D). En las construcciones tetrapartitas que contenían la cadena \zeta, la expresión intracelular de \zeta se documentó con un anticuerpo comercialmente disponible contra el dominio intracelular (Coulter).

La Fig. 21 muestra la citolisis de células diana que expresan la glicoproteína de la envoltura del HIV mediada por el clon citotóxico de células T, WH3, que expresa varias quimeras derivadas de CD4 como moléculas efectoras. Para los ensayos de citotoxicidad, el linaje restringido de células T CD8^{+}CD4^{-} HLA B44 de ser humano, WH3, se mantuvo en IMDM suplementado con suero de ser humano al 10% como se describió previamente en la presente memoria. Las células se estimularon con células mononucleares que portaban B44 irradiadas con radiación gamma (300 rad) y fitohemaglutinina (PHA) en una concentración de 1 \mug/ml. Después de un día de estimulación, la PHA se diluyó a 0,5 \mug/ml por adición de medio recién preparado; después de 3 días el medio se cambió completamente. Se hicieron crecer las células durante al menos 10 días antes de su uso en los ensayos de citotoxicidad. Las células se infectaron con los virus recombinantes de la viruela vacuna apropiados como se describió en la presente memoria para vPE16. Se permitió que las infecciones transcurrieran durante 3-4 horas adicionales en un medio completo después de lo cual las células se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron a una densidad de 1 x 10^{7}/ml. Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una placa de microtitulación de fondo en U que contenía 100 \mul de medio completo por pocillo y se diluyeron en etapas seriales dobles. Para permitir que se midiera la liberación espontánea de cromo y la absorción total de cromo, dos pocillos por cada muestra no contenían linfocitos. Las células diana, sublinaje S3 de HeLa (HeLa-S3, ATCC) se infectaron como anteriormente en platos de 10 cm con vPE16. Se desprendieron con PBS en EDTA 1 mM 10^{6} células infectadas, se centrifugaron y se resuspendieron en 100 \mul de cromato de sodio marcado con ^{51}Cr (1 mCi/ml en PBS) durante 1 hora a 37ºC y a continuación se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de células diana marcadas. La placa de microtitulación se hizo girar a 750 x g durante 1 minuto y se incubó durante 4 horas a 37ºC. Al final del período de incubación, las células de cada pocillo se resuspendieron mediante suave pipeteo, se separó una muestra para determinar las cuentas totales incorporadas y la placa de microtitulación se hizo girar a 750 x g durante 1 min. Se separaron alícuotas (100 \mul) del sobrenadante y se contaron en un contador de centelleo de rayos gamma. La relación efector:diana se corrigió respecto al porcentaje de células infectadas que se midió por citometría de flujo.

La Fig. 22 muestra la replicación de HIV-1 en linajes de células transfectantes. Los linajes celulares que expresaban establemente CD4 tipo natural y varias quimeras recombinantes se establecieron en un sublinaje del linaje 293 de células embrionarias de riñón de ser humano. Se preparó una disolución madre del virus HIV-1 IIIB aislado con un título de \approx 10^{6} partículas infecciosas/ml, que se midió por análisis de dilución con punto final usando como indicador el linaje C8166 de células T de ser humano. Las infecciones se llevaron a cabo a un MOI aproximado de 1 durante un período de 8-12 horas a 37ºC. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con PBS, se tripsinizaron, se volvieron a depositar en nuevas placas y se tomaron muestras del sobrenadante de cultivo para una determinación del título de p24 (designado día 0). Seguidamente, a intervalos de 3-4 días, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos celulares y se retuvieron para analizar el antígeno p24. A las células se les volvió a suministrar medio recién preparado que contenía higromicina B en una concentración de 100 \mug/ml. El análisis de los sobrenadantes de los cultivos se llevó a cabo usando un kit de ensayo comercial para el antígeno p24 del HIV-1 basado en un ensayo ELISA (Coulter) según las instrucciones suministradas por el fabricante. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes de duración similar.

La Fig. 23 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los dominios D1-D4 de CD4 (CD4 Bam).

La Fig. 24 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los dominios D1-D2 de CD4 (CD4 Nhe).

La Fig. 25 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la inmunoglobulina IgG1 de seres humanos (Igh23 Bam).

La Fig. 26 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos del dominio transmembranal de CD7 (TM7 Bam Mlu).

La Fig. 27 muestra la secuencia de ácidos nucleicos y de aminoácidos del dominio intracelular de zeta (zeta Mlu Not).

La Fig. 28 muestra la secuencia de DNA y la secuencia primaria de aminoácidos de una hélice alfa sintética.

Ejemplo I Construcción de quimeras receptor:IgG1 de ser humano

Se prepararon secuencias de las cadenas pesadas de IgG1 de ser humano uniendo secuencias del dominio CH3 a un fragmento de cDNA derivado del extremo 3' de la forma transmembranal del mRNA del anticuerpo. El fragmento del extremo 3' se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa usando una biblioteca de cDNA tonsilar como sustrato, y oligonucleótidos que tienen las secuencias: CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7), y CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO: 8), que corresponden, respectivamente, a los extremos 5' y 3' de los fragmentos deseados de DNA. El oligo 5' es complementario de un sitio en el dominio CH1 del anticuerpo IgG1 de ser humano, y el oligo 3' es complementario justo de un sitio 5' de las secuencias que codifican el dominio que se extiende por la membrana. El producto PCR se digirió con BstXI y BamHI y se ligó entre los sitios BstXI y BamHI de un gen semisintético del anticuerpo IgG1 que portaba regiones variables y constantes. Tras la inserción del fragmento BstXI a BamHI, las porciones amplificadas de la construcción se reemplazaron hasta el sitio SmaI en C_{H}3 por intercambio de fragmentos de restricción, para que de la reacción PCR sólo se derivara la porción entre el sitio SmaI y el oligo 3'.

Para crear un receptor quimera IgG1 de ser humano:\zeta, el gen de cadena pesada que finaliza en un sitio BamHI se unió al sitio BamHI de la quimera de \zeta descrita más adelante, para que las secuencias de anticuerpos formaran la porción extracelular. La citometría de flujo de células COS transfectadas con un plásmido que codificaba la quimera mostró un alto valor de expresión de determinantes de anticuerpos cuando se cotransfectó un plásmido de expresión que codificaba un cDNA de cadena ligera, y una modesta expresión de determinantes de anticuerpos cuando estaba ausente el plásmido de expresión de cadena ligera.

Generalmente, se pueden construir quimeras similares que incluyan IgG1 de ser humano fundido con \eta o \gamma (véase más adelante), o con cualquier porción que transduzca una señal de una proteína receptora de células T o proteína receptora Fc, como se describió anteriormente usando técnicas estándar de biología molecular.

Para crear una unidad única de transcripción que permitiera que se expresaran desde un único promotor tanto las cadenas pesadas como las ligeras, se creó un plásmido que codificaba un mRNA bicistrónico a partir de secuencias que codificaban cadenas pesadas y ligeras, y la porción 5' sin traducir del mRNA que codificaba la proteína de 78kD regulada por la glucosa, por lo demás conocida como grp78, o BiP. Las secuencias de grp78 se obtuvieron por PCR de DNA de genoma de ser humano usando cebadores que tenían las secuencias: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO: 9), y CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10), en los extremos 5' y 3', respectivamente. Las reacciones en cadena de la polimerasa con estos oligos se llevaron a cabo en presencia de dimetilsulfóxido al 10%. El fragmento obtenido por PCR se digirió con NotI e HincII y se insertó entre los sitios NotI y HpaI aguas abajo de las secuencias que codificaban el anticuerpo IgG1 de ser humano. A continuación, se insertaron las secuencias que codificaban un cDNA de la cadena ligera kappa de IgG de ser humano, aguas abajo del guía grp78, usando el sitio HincII y otro sitio en el vector. El plásmido de expresión resultante de estas manipulaciones consistía en el gen semisintético de cadena pesada, seguido por las secuencias del guía grp78, seguido por las secuencias de cDNA de cadena ligera kappa, seguido por las señales de poliadenilación derivadas de un fragmento de DNA SV40. La transfección de células COS con el plásmido de expresión dio una expresión marcadamente mejorada de determinantes de cadena pesada, comparada con la transfección del plásmido que codificaba los determinantes de cadena pesada solos.

Para crear un gen bicistrónico que comprenda una quimera cadena pesada/receptor y una cadena ligera, las secuencias de cadena pesada aguas arriba se pueden reemplazar por cualquier gen quimera cadena pesada/receptor descrito en la presente memoria.

Ejemplo II Construcción de quimeras del receptor CD4

Se aislaron cDNAs de \zeta (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988b)) y \gamma (Küster et al., J. Biol. Chem. 265: 6448-6452 (1990)) de ser humano por reacción en cadena de la polimerasa a partir de bibliotecas preparadas a partir del linaje celular tumoral HPB-ALL (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)) y de células asesinas naturales de ser humano, mientras que el cDNa de \eta (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3319-3323 (1990)) se aisló de una biblioteca de timocitos de murina. Se unieron cDNAs de \zeta, \eta y \gamma al dominio extracelular de una forma de CD4 diseñada por ingeniería genética que poseía un sitio BamHI justo aguas arriba del dominio que se extiende por la membrana (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-352 (1990)) que se unió al sitio BamHI naturalmente presente en los cDNAs de \zeta y \eta en una localización similar unos pocos residuos aguas arriba del dominio que se extiende por la membrana (SEQ ID NOS: 1, 3, 4 y 6). Para formar la proteína de fusión con \gamma se diseñó por ingeniería genética un sitio BamHI en la secuencia en la misma localización aproximada (Fig. 1; SEQ ID NO: 2 y 5). Las fusiones de genes se introdujeron en un plásmido de expresión del virus de la viruela vacuna que portaba el gen gpt de E. Coli como un marcador seleccionable, y se insertaron en el genoma de la cepa WR del virus de la viruela vacuna por recombinación homóloga y selección para el crecimiento en ácido micofenólico (Falkner et al., J. Virol. 62: 1849-1854 (1988)); Boyle et al., Gene 65: 123-128 (1988)). El análisis por citometría de flujo mostró que los recombinantes del virus de la viruela vacuna dirigen la producción abundante de las proteínas de fusión CD4:\zeta y CD4:\gamma en la superficie celular, mientras que la expresión de CD4:\eta es sustancialmente más débil (Fig. 1B). El último hallazgo es consistente con un reciente informe de que la transfección de un plásmido de expresión del cDNA de \eta en un linaje celular de hibridoma de murina dio una expresión sustancialmente menor que la transfección de un plásmido de expresión de \zeta comparable (Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243-1253 (1990)). La inmunoprecipitación de células infectadas con los recombinantes del virus de la viruela vacuna reveló que las proteínas de fusión forman dímeros covalentes, a diferencia del antígeno de CD4 que se encuentra en la naturaleza. Se encontró que las masas moleculares de las proteínas de fusión monómeras CD4:\zeta y CD4:\gamma y de la proteína CD4 nativa eran 63, 55 y 53 kD, respectivamente. Las mayores masas moleculares de las proteínas de fusión son aproximadamente consistentes con la mayor longitud de la porción intracelular, que excede a la de la proteína CD4 nativa en 75 (CD4:\zeta) ó 5 (CD4:\gamma) residuos.

Ejemplo III Las quimeras de CD4 se pueden asociar con otras cadenas receptoras

La expresión en la superficie celular de la forma macrofago/célula asesina natural de Fc\gammaRIII (CD16_{TM}) de ser humano en transfectantes se facilita por cotransfección con \gamma de murina (Kurosaki et al., Nature 342: 805-807 (1989)) o de ser humano (Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989)), así como con \zeta de ser humano (Lanier et al., Nature 342: 803-805 (1989)).

Consistente con estos informes, la expresión de las quimeras también permitió la expresión superficial de CD16_{TM} cuando se suministra a la célula diana por cotransfección o por coinfección con virus recombinantes de la viruela vacuna (Fig. 2). La promoción de la expresión superficial de CD16_{TM} por \zeta fue más pronunciada que la promoción por \gamma (Fig. 2) en los linajes celulares examinados, mientras que la proteína CD4 nativa no aumentó la expresión superficial de CD16_{TM}.

Ejemplo IV Los mutantes Asp de \zeta no se coasocian con el receptor Fc

Para crear quimeras que no se asociarían con el antígeno o los receptores Fc existentes se prepararon proteínas de fusión de mutantes de \zeta que carecían del residuo Asp intramembranal o del residuo Cys intramembranal, o de ambos. La citometría de flujo mostró que la intensidad de expresión en la superficie celular de las diferentes quimeras mutantes no fue apreciablemente diferente del precursor sin mutar, y los experimentos de inmunoprecipitación mostraron que la expresión total de las quimeras fue similar. Como se esperaba, no se encontró que las quimeras mutantes que carecían del residuo de cisteína transmembranal formaran dímeros unidos por puentes disulfuro. Las dos quimeras mutantes que carecían de Asp fueron incapaces de soportar la expresión superficial de CD16^{TM}, mientras que las quimeras monómeras que carecían del residuo Cys pro que portaban el residuo Asp permitieron que se coexpresara CD16_{TM}, pero con una menor eficiencia que el dímero original (Fig. 3).

Ejemplo V Los receptores mutantes retienen la capacidad de iniciar una respuesta al calcio

Para determinar si la reticulación de las proteínas de fusión permitiría la acumulación de calcio libre intracelular de manera similar a la que se sabe ocurre con el receptor de antígenos de células T, se infectaron células del linaje de células T de leucemia de ser humano, Jurkat E6 (número de acceso ATCC TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) con recombinantes del virus de la viruela vacuna y se midió la concentración relativa de calcio citoplasmático tras la reticulación del dominio extracelular con anticuerpos. Se llevaron a cabo medidas por citometría de flujo con células cargadas con el colorante Indo-1 sensible al calcio (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952-961 (1986)). La figura 4A-D muestra los resultados de los experimentos de flujo de calcio con células infectadas con CD4:\zeta y los mutantes Asp^{-} y Cis^{-} de \zeta. La reticulación de las quimeras aumentó reproduciblemente el calcio intracelular. Similarmente, CD4:\eta y CD4:\gamma permitieron la acumulación de calcio intracelular en células infectadas. Las células Jurkat expresan bajas cantidades de CD4 en la superficie celular, sin embargo, la reticulación de la CD4 nativa en presencia o ausencia de CD16:\zeta no altera las concentraciones intracelulares de calcio (Fig. 4A-B).

Ejemplo VI Las quimeras CD4:\zeta, \eta y \gamma median la citolisis de dianas que expresan el complejo gp120/41 del HIV

Para determinar si los receptores quimera activarían los programas efectores citolíticos, se creó un sistema modelo diana:efector basado en el reconocimiento por CD4 del complejo gp120/gp41 de la envoltura del HIV. Se infectaron células HeLa con virus recombinantes de la viruela vacuna que expresaban el complejo gp120/gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320: 535-537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64: 2448-2451 (1990)) y marcados con ^{51}Cr. Las células marcadas se incubaron con células de un linaje de linfocitos T citotóxicos aloespecífico de ser humano (CD8^{+}, CD4^{-}) que había sido infectado con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresaban las quimeras CD4:\zeta, CD4:\eta, o CD4:\gamma, o la quimera doble mutante CD4:\zetaCys11Gly;Asp15Gly. La Fig. 5A-C muestra que las células HeLa que expresan el complejo gp120/gp41 fueron específicamente lisadas por los linfocitos T citotóxicos (CTL) que expresan quimeras de CD4. CTL armados con quimeras CD4:\zeta no hicieron diana en células HeLa no infectadas, y las células HeLa que expresan el complejo gp120/41 no fueron reconocidas por CTL no infectados. Para comparar la eficacia de varias quimeras, las relaciones efector a diana se corrigieron respecto a la fracción de CTL que expresa quimeras de CD4, y respecto a la fracción de células HeLa que expresan el complejo gp120/41, que se miden por citometría de flujo. La fig. 5C muestra un análisis citométrico de la expresión de CD4 por los CTL usados en el experimento de citolisis mostrado en las figs. 5A y 5B. Aunque la densidad media de CD4:\zeta en la superficie excede grandemente la densidad media de CD4:\eta, las eficiencias citolíticas de células que expresan ambas formas fueron similares. Corrigiendo respecto a la fracción de dianas que expresan la glicoproteína gp120, las eficiencias de la citolisis mediada por las proteínas CD4:\zeta y CD4:\eta son comparables a las mejores eficiencias de las que se ha informado para pares diana:efector de receptores específicos de células T (la relación media efector a diana para una liberación del 50% por células T que expresan CD4:\zeta fue 1,9 \pm 0,99, n = 10). La fusión CD4:\gamma fue menos activa, como fue la fusión CD4:\zeta que carece de los residuos transmembranales Asp y Cys. Sin embargo, en ambos casos se observó una citolisis significativa (fig. 5B-C).

Para controlar la posibilidad de que la infección con el virus de la viruela vacuna pudiera promover el reconocimiento artefactual por CTL se llevaron a cabo experimentos similares de citolisis con células diana infectadas con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresan la forma de CD16 unida a fosfatidilinositol (CD16_{PI}) y marcados con ^{51}Cr, y con CTL infectados con recombinantes testigo que expresan CD16_{PI} o CD16:\zeta. La fig. 6A muestra que las células T que expresan quimeras no CD4 no reconocen a las células HeLa nativas o a las células HeLa que expresan el complejo gp120/41, y similarmente que las células T que expresan quimeras de CD4 no reconocen a las células HeLa que expresan otras proteínas de la superficie codificadas por el virus de la viruela vacuna. Además, los CTL que expresan CD4 no quimera no lisan significativamente a las células HeLa que expresan el complejo gp120/41 (fig. 6A).

Ejemplo VII Las quimeras no hacen diana en las células que portan MHC clase II

Se piensa que CD4 interacciona con una secuencia no polimorfa expresada por el antígeno MHC clase II (Gay et al., Nature 328: 626-629 (1987); Sleckman et al., Nature 328: 351-353 (1987)). Aunque nunca se ha documentado una interacción específica entre CD4 y el antígeno clase II con proteínas purificadas, en ciertas condiciones se puede demostrar la adhesión entre células que expresan CD4 y células que expresan moléculas de clase II (Doyle et al., Nature 330: 256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245: 743-746 (1989)). Lo que a continuación se examinó fue si se pudiera detectar la matanza de células que portan moléculas de clase II. La fig. 6B muestra que no hay ninguna citolisis específica dirigida por CD4:\zeta contra el linaje Raji de células B, que expresa abundante antígeno de clase II. Aunque se observa una modesta citolisis (\approx 5%), un mutante de Raji clase II negativo, RJ2.2.5, (Accolla, J. Exp. Med. 157: 1053-1058 (1983)) muestra una susceptibilidad similar, como lo hacen células Raji incubadas con células T no infectadas.

Ejemplo VIII Requisitos de las secuencias para la inducción de citolisis mediante el complejo antígeno de células T/cadena zeta del receptor Fc

Aunque las quimeras entre CD4 y \zeta pueden armar a los linfocitos T citotóxicos (CTL) para que maten células diana que expresen la glicoproteína gp120 del HIV, se contempló una alternativa a CD4 con el fin de comparar sin ambigüedad las propiedades de quimeras de zeta introducidas en linajes de células T de seres humanos. Tales linajes pueden expresar CD4 haciendo difícil definir específicamente la relación entre el tipo o grado de movilización del calcio y el potencial citotóxico de las diferentes quimeras. Para circunvalar esto, se crearon quimeras entre \zeta y CD16 en las que el dominio extracelular de CD16 está unido a las secuencias transmembranales e intracelulares de \zeta (fig. 7A). Las fusiones de genes se introdujeron en un plásmido de expresión del virus de la viruela vacuna que portaba el gen gpt de E. Coli como un marcador seleccionable y se insertaron en el genoma de la cepa WR del virus de la viruela vacuna por recombinación homóloga y selección para el crecimiento en ácido micofenólico (Falkner et al., J. Virol. 62: 1849 (1988); Boyle y Coupar, Gene 65: 123 (1988)).

Los linajes de células T se infectaron con recombinantes del virus de la viruela vacuna y la concentración citoplasmática relativa de ion calcio libre se midió tras la reticulación de los dominios extracelulares con anticuerpos. Tanto las medidas espectrofluorimétricas (población en masa) como las de flujo citométrico (célula única) se llevaron a cabo con células cargadas con el colorante Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952 (1986)). La figura 7B muestra un análisis de los datos recogidos de células del linaje Jurkat de células T de leucemia de ser humano infectadas con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresan la proteína de fusión CD16:\zeta. La reticulación de las quimeras aumentó reproduciblemente el calcio intracelular, aunque un tratamiento similar de células que expresan CD16 no quimera tuvo poco o ningún efecto. Cuando la quimera se expresó en linajes celulares mutantes que carecían del receptor del antígeno, REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989)), o el mutante JRT3.T3.5 de células Jurkat (Weiss et al., J. Immunol. 135: 123 (1984)); o se vio una fuerte respuesta a la reticulación de anticuerpos de CD16. Se han recogido datos similares con el linaje de células mutantes REX20A (Breitmeyer et al., supra, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990)), y un mutante CD3/Ti negativo del linaje de células Jurkat establecido en este laboratorio. La infección con recombinantes que expresan CD16:\zeta no restableció la respuesta a anticuerpos anti-CD3, mostrando que la proteína de fusión no actuaba rescatando cadenas intracelulares del complejo CD3.

Para evaluar la capacidad de las quimeras para redirigir la inmunidad mediada por células, se infectaron CTLs con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresan quimeras de CD16 y se usaron para lisar específicamente células de hibridoma que expresaban anticuerpos anti-CD16 enlazados a la membrana. Este ensayo es una extensión del ensayo de citotoxicidad de hibridomas originalmente desarrollado para analizar los mecanismos efectores de células que portan receptores Fc (Graziano y Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano y Fanger, J. Immunol. 139: 35-36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger et al., Immunol. Today 10: 92, 1989)). La fig. 8B muestra que la expresión de CD16:\zeta en linfocitos T citotóxicos permite a los CTL armados matar a células 3G8 del hibridoma anti-CD16 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982), mientras que los CTL que expresan la forma de CD16 unida al fosfatidilinositol son inactivos. Los CTL armados con CD16:\zeta tampoco matan células del hibridoma que expresan un anticuerpo irrelevante.

Para identificar las secuencias mínimas de \zeta necesarias para la citolisis se prepararon una serie de mutantes por supresión en los que se separó sucesivamente la mayoría del dominio intracelular de \zeta del extremo terminal carboxilo (fig. 8A). La mayor parte del dominio intracelular de zeta se podía separar con pocas consecuencias para el potencial citolítico; la eficacia de la quimera CD16:\zeta de longitud completa fue esencialmente igual a la de la quimera en la que se suprimió el residuo 65, CD16:\zetaAsp66* (fig. 8B). Se observó una disminución sustancial de la citotoxicidad tras la supresión del residuo 59 de \zeta (quimera CD16:\zetaGlu60*), y la posterior supresión del residuo 50 dio lugar a una actividad ligeramente menor. Sin embargo, no se observó pérdida completa de la actividad incluso cuando el dominio intracelular se redujo a un anclaje transmembranal de tres residuos (fig. 8B).

Debido a que \zeta es un dímero unido por puentes disulfuro, una explicación de la retención de la actividad citolítica fue que \zeta exógena estaba formando heterodímeros con la supresión de la \zeta quimera, reconstituyendo de este modo la actividad. Para ensayar esta idea, los restos 11 y 15 de \zeta se cambiaron de Asp y Cys, respectivamente, a Gly (Cys11Gly/Asp15Gly), y se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones como sigue. Se infectaron aproximadamente 2 x 10^{6} células CV1 durante una hora en medio DME exento de suero con un recombinante del virus de la viruela vacuna con una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez. De seis a ocho horas después de la infección, las células se desprendieron de las placas con PBS/EDTA 1 mM y la superficie se marcó con 0,2 mCi de ^{125}I por 2 x 10^{6} células usando lactoperoxidasa y H_{2}O_{2} por el método de Clark y Einfeld (Leukocyte Typing II, pp 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Las células marcadas se recogieron por centrifugación y se lisaron en NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M, pH 8,0, MgCl_{2} 5 mM, KCl 5 mM, yodoacetamida 0,2 M y PMSF 1 mM. Los núcleos se separaron por centrifugación, y las proteínas CD16 se inmunoprecipitaron con anticuerpos 3G8 (Fleit et al., supra (1982); Medarex) y agarosa conjugada con IgG anti-ratón (Cappel, Durham, NC). Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida 8%/SDS en condiciones no reductoras o en un gel de poliacrilamida 10%/SDS en condiciones reductoras. Estas inmunoprecipitaciones confirmaron que la quimera CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly no se asociaba en estructuras dímeras unidas por puentes disulfuro.

También se ensayó la actividad citolítica de los receptores mutantes. La quimera mutada a la que se había suprimido el residuo 65 (CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Asp66*) fue, dependiendo de las condiciones del ensayo, de dos a ocho veces menos activa en el ensayo de citolisis que la quimera no mutada comparable (CD16:\zetaAsp66*), que usualmente estaba dentro de un factor de dos de, o indistinguible de la actividad de, CD16:\zeta (fig. 9B). La reducción de la actividad de las quimeras mutantes es comparable a la reducción vista con las quimeras CD4 de estructura similar (véase anteriormente) y es más probablemente atribuible a la menor eficiencia de los monómeros de \zeta comparados con los dímeros. En contraste, la quimera mutada Asp^{-}, Cis^{-}, a la que se ha suprimido el residuo 59 no tuvo ninguna actividad citolítica (fig. 9B), lo que soporta la hipótesis de que la asociación con otras cadenas mediada por los residuos transmembranales Cys y/o Asp era responsable de la débil persistencia de la actividad citolítica en supresiones de más residuos amino terminales que el residuo 65.

Los estudios de flujo citométrico mostraron que los mutantes por supresión que carecían de los residuos transmembranales Asp y Cys aún podían promover un aumento del ion calcio intracelular libre en respuesta a la reticulación de anticuerpos en un linaje de células Jurkat mutantes TCR^{-} (fig. 9D). Se obtuvieron similares resultados con quimeras expresadas en el linaje Jurkat original. En el caso de CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*, estos datos demuestran que la capacidad para mediar la respuesta del calcio puede estar mutacionalmente separada de la capacidad de soportar la citolisis.

Para eliminar definitivamente la posible contribución de los residuos transmembranales de \zeta, los residuos transmembranales y los primeros 17 residuos citoplasmáticos de \zeta se reemplazaron por secuencias que codificaban los residuos que se extienden por la membrana y los primeros 14 ó 17 residuos citoplasmáticos de los antígenos CD5 o CD7, respectivamente (fig. 9A). Las proteínas tripartitas de fusión resultantes CD16:5:\zeta(48-65) y CD16:7:\zeta(48-65) no formaban dímeros unidos por puentes disulfuro como lo hacían las quimeras más simples CD16:\zeta, porque carecían del residuo de cisteína en el dominio transmembranal de \zeta. Ambas quimeras tripartitas fueron capaces de movilizar el calcio en linajes de células Jurkat y TCR negativas (fig. 9D) y de montar una respuesta citolítica en CTL (fig. 9C y datos no mostrados). Sin embargo, el truncamiento de la porción de \zeta en el residuo 59 de la quimera CD16:7:\zeta(48-59) abroga la capacidad de la fusión tripartita de dirigir la respuesta del calcio en células Jurkat TCR positivas o negativas o la citolisis en CTL maduros (fig. 9C y 9D y datos no mostrados).

Para examinar las contribuciones de residuos individuales dentro del resto de 18 residuos, los presentes inventores prepararon varias variantes de mutantes por mutagénesis sitio-dirigida, y se evaluó su capacidad para mediar la matanza dirigida al receptor en condiciones de baja (figs. 10A y 10D) o alta (figs. 10B y 10E) expresión del receptor quimera. La fig. 10A-F muestra que aunque varias sustituciones relativamente conservadoras (es decir, que reemplazan residuos ácidos con sus amidas afines, o tirosina con fenilalanina) que se extienden por los residuos 59 a 63 dieron un compromiso moderado de eficacia citolítica, en general, las variantes retuvieron la capacidad de movilizar el calcio. Sin embargo, colectivamente, estos residuos comprenden un importante subresto en tanto y cuanto su supresión elimina la actividad citolítica. La conversión de Tyr 62 en Phe o Ser eliminó tanto la respuesta citotóxica como la del calcio. En el extremo terminal amino del segmento de 18 residuos, el reemplazo de Tyr 51 con Phe abolió tanto la movilización del calcio como la actividad citolítica, mientras que la sustitución de Leu con Ser en la posición 50 eliminó la respuesta del calcio mientras que sólo dañó parcialmente la citolisis. Sin ligarse a una hipótesis particular, se sospecha que la incapacidad del mutante Leu50Ser para movilizar el calcio en ensayos de citometría de flujo de corta duración no refleja completamente su capacidad para mediar un aumento sustancial del ion calcio intracelular libre durante el intervalo de tiempo más largo del ensayo de citolisis. Sin embargo, se ha informado de la actividad citolítica insensible al ion calcio de algunos linajes citolíticos de células T, y no se ha excluido la posibilidad de que un fenómeno similar sea la razón fundamental de los resultados descritos en la presente memoria. El reemplazo de Asn48 con Ser dañó parcialmente la citotoxicidad en algunos experimentos mientras que tuvo poco efecto en otros.

Para investigar el papel potencial de elementos de secuencias redundantes, el dominio intracelular de \zeta se dividió en tres segmentos, que se extendían de los residuos 33 a 65, 71 a 104, y 104 a 138. Cada uno de estos segmentos se unió a una quimera CD16:CD7 por medio de un sitio MluI introducido justo distal a las secuencias básicas de anclaje a la membrana del dominio intracelular de CD7 (véase más adelante, fig. 11A). La comparación de la eficacia citolítica de los tres elementos mostró que eran esencialmente equipotentes (fig. 11B). La comparación de secuencias (fig. 11A) muestra que el segundo resto porta once residuos entre tirosinas, mientras que el primer y el tercer resto portan diez.

Aunque no se ha hecho una justificación precisa del procedimiento de activación de las células T, está claro que la agregación del receptor antígeno, o de las quimeras receptoras que portan secuencias intracelulares de \zeta, dispara la movilización del calcio, la liberación de gránulos y citoquinas, y la aparición de marcadores de activación en la superficie celular. El sitio activo de \zeta, una corta secuencia peptídica lineal probablemente demasiado pequeña para tener actividad enzimática intrínseca, probablemente interacciona con una o como máximo unas pocas proteínas para mediar la activación celular. También está claro que la movilización del calcio libre no es por sí misma suficiente para la activación celular, ya que la capacidad para mediar la citolisis se puede separar mutacionalmente de la capacidad para mediar la acumulación de calcio.

Como se muestra en la presente memoria, la adición de 18 residuos del dominio intracelular de \zeta al dominio intracelular y transmembranal de dos proteínas no relacionadas permite que las quimeras resultantes redirijan la actividad citolítica contra células diana que se enlazan a la porción extracelular de las proteínas de fusión. Aunque las quimeras que portan el resto de 18 residuos son aproximadamente ocho veces menos activas que las quimeras basadas en la longitud total de \zeta, la actividad reducida se puede atribuir a la pérdida de interacciones transmembranales que normalmente permiten a la cadena \zeta natural formar dímeros unidos por puentes disulfuro. Esto es, las construcciones con supresiones en \zeta que tienen el mismo extremo terminal carboxi que el resto y que carecen de residuos Cys y Asp transmembranales muestran típicamente una actividad ligeramente menor que las quimeras que sólo portan el resto de 18 residuos.

El elemento de competencia citolítica sobre el que los presentes inventores se han focalizado tiene dos tirosinas y ninguna serina o treonina, restringiendo las posibles contribuciones de la fosforilación a la actividad. Sin embargo, la mutación de ambas tirosinas destruye la actividad, y aunque experimentos preliminares no apuntan a una fosforilación sustancial de la tirosina tras la reticulación de antígenos quimera de la superficie que portan el resto de 18 residuos, no se puede excluir la posible participación de tal fosforilación en un grado bajo. Además de los efectos advertidos en los dos residuos de tirosina, varios reemplazos de aminoácidos en los extremos terminales amino y carboxilo del resto debilitan la actividad en condiciones de baja densidad del receptor.

Secuencias similares del resto activo de \zeta se pueden encontrar en los dominios citoplasmáticos de otras varias proteínas transmembranales, que incluyen moléculas \delta y \gamma de CD3, las proteínas mb1 y B29 de la superficie asociadas con IgM, y las cadenas \beta y \gamma del receptor de IgE de alta afinidad, Fc\varepsilonRI (Reth, Nature 338: 383, 1989). Aunque la función de estas secuencias es incierta, si se expresan eficientemente, cada una puede ser capaz de la activación autónoma de las células T, y tal actividad puede explicar la respuesta TCR residual vista en un linaje celular mutante zeta negativo (Sussman et al., Cell 52: 85, 1988).

Por sí misma, \zeta porta tres de tales secuencias, aproximadamente igualmente espaciadas, y una trisección tosca del dominio intracelular muestra que cada una es capaz de iniciar una respuesta citolítica. \eta, un empalme isomorfo de \zeta (Jin et al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5202, 1991) carece de la mitad carboxilo del tercer resto. Debido a que la separación de la mitad carboxilo del primer resto elimina la actividad, probablemente parece que la mayoría de la efectividad biológica de \eta se puede atribuir a los dos primeros restos. Aunque por diferentes medidas \eta es igualmente tan activo como \zeta para promover la liberación de citoquinas mediada por antígenos (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) o la citolisis redirigida (véase anteriormente), \eta no es fosforilada en respuesta a la estimulación del receptor (Bauer et al., supra, 1991). Por tanto, para la fosforilación se requiere la presencia de los tres restos, o el tercer resto representa un sustrato favorecido de una tirosina quinasa no
identificada.

Ejemplo IX Transducción de la señal citolítica mediante el receptor Fc de ser humano

Para evaluar las acciones de diferentes subtipos de receptores Fc de ser humano se crearon moléculas quimeras en las que el dominio extracelular de los antígenos CD4, CD5 o CD16 de ser humano se unieron a los dominios transmembranales e intracelulares de los subtipos FcRII\gammaA, B1, B2 y C (nomenclatura de Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991). Específicamente, las secuencias de cDNA correspondientes a los dominios transmembranales y citoplasmáticos de los isormorfos FcRIIA, B1 y B2 previamente descritos se amplificaron desde el clon PC23 preexistente o desde una biblioteca de cDNA tonsilar de ser humano (construida mediante técnicas estándar) usando los siguientes cebadores oligonucleótidos sintéticos: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; FcRII A directo); CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO: 19; FcRII A inverso); GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO: 20; FcRII B1 y FcRII B2 directos); y GCG GGG GCG GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; FcRII B1 y FcRII B2 inversos).

Estos cebadores contenían sitios de escisión para las enzimas BamHI y NotI, respectivamente, 6 residuos indentados desde el extremo 5'. El sitio NotI estaba inmediatamente seguido por un codón de paro antisentido, CTA o TTA. Todos los cebadores contenían 18 ó más residuos complementarios a los extremos 5' y 3' de los fragmentos deseados. El fragmento de cDNA correspondiente al dominio citoplasmático de FcRII\gammaC, que difiere del isomorfo IIA en sólo un residuo aminoácido (L por P en el residuo 268) se generó por mutagénesis sitio-dirigida mediante PCR de solape usando cebadores de secuencia: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22), y TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23).

Los fragmentos PCR se insertaron en vectores de expresión del virus de la viruela vacuna que contenían los dominios extracelulares de CD16 o CD4, respectivamente, y se insertaron subsiguientemente en el virus de la viruela vacuna tipo natural por recombinación en el locus de la timidina quinasa usando selección para la cointegración de gpt de E. Coli para facilitar la identificación de los recombinantes deseados. Las identidades de todos los isomorfos (mostrados en la fig. 12) se confirmaron mediante secuenciado dideoxi.

La producción de las proteínas receptoras quimeras se confirmó además por estudios de inmunoprecipitación. Se infectaron aproximadamente 10^{7} células JRT3.T3.5 durante una hora en medio IMDM exento de suero con virus recombinantes de la viruela vacuna con una multiplicidad de infección de al menos diez. Doce horas después de la infección, las células se cosecharon y se marcaron en su superficie con 0,5 mCi de ^{125}I por 10^{7} células, usando el método de la lactoperoxidasa/glucosa oxidasa (Clark y Einfeld, supra). Las células marcadas se recogieron por centrifugación y se lisaron en NP-40 al 1%, MgCl_{2} 0,1 mM, KCl 5 mM, yodoacetamida 0,2 M y PMSF 1 mM. Los núcleos se separaron por centrifugación, y las proteínas de fusión de CD16 se inmunoprecipitaron con anticuerpos 4G8 y agarosa conjugada con IgG anti-ratón. Las muestras se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras. Todas las moléculas de los receptores quimera inmunoprecipitados fueron de las masas moleculares esperadas.

Para ensayar la capacidad de los receptores quimera para mediar un aumento del ion calcio libre citoplasmático, se usaron los virus recombinantes para infectar el linaje celular Jurkat mutante TCR^{-} JRT3.T3.5 (como se describe en la presente memoria) y el ion calcio libre citoplasmático se midió en las células (como se describe en la presente memoria) tras la reticulación de los dominios extracelulares de los receptores con anticuerpo monoclonal 3G8 o Leu-3A (como se describe en la presente memoria). Estos experimentos revelaron que los dominios intracelulares de FcR\gammaII A y C eran capaces de mediar un aumento del ion calcio libre citoplasmático después de la reticulación de los dominios extracelulares, mientras que los dominios intracelulares de FcR\gammaII B1 y B2 eran inactivos en condiciones comparables (fig. 13A y 13B). Los híbridos CD4, CD5 y CD16 de FcR\gammaII A compartieron esencialmente igual capacidad para promover la respuesta del calcio (fig. 13A-B). Otros linajes celulares, tanto linajes monocíticos como linfocíticos, fueron capaces de responder a la señal iniciada por la reticulación de los dominios extracelulares.

Para explorar la involucración de los diferentes dominios intracelulares de FcR\gammaII en la citolisis, se infectaron linfocitos T citotóxicos (CTL) de ser humano con recombinantes del virus de la viruela vacuna que expresaban quimeras CD16:FcR\gammaII A, B1, B2 y C. A continuación, las células infectadas se cocultivaron con células de hibridoma cargadas con ^{51}Cr (es decir, células 3G8 10-2) que expresaban anticuerpos de CD16 en la superficie celular. En este ensayo, CTLs que portaban la quimera de CD16 mataban las células diana del hibridoma (permitiendo la liberación de ^{51}Cr libre) si el dominio extracelular de CD16 de la quimera se había unido a un segmento intracelular capaz de activar el programa efector de linfocitos; este ensayo de citolisis se describe con más detalle más adelante. La fig. 14A muestra que los CTL armados con CD16:FcR\gammaIIA y C, pero con FcR\gammaII B1 o B2, son capaces de lisar las células diana que expresan el anticuerpo anti-CD16 en la superficie celular.

Para eliminar la posibilidad de que la citolisis específica fuera de alguna manera atribuible a la interacción con el resto CD16, se llevaron a cabo experimentos de citolisis en los que los dominios intracelulares de FcRII se unieron a un dominio extracelular de CD4. En este caso, las células diana fueron células HeLa que expresaban proteínas gp120/41 de la envoltura del HIV (específicamente, células HeLa infectadas con el vector vPE16 del virus de la viruela vacuna (disponible en el National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Como en el sistema CD16, las células diana que expresaban la envoltura del HIV eran susceptibles de ser lisadas por células T que expresaban la quimera CD4:FcR\gammaII A, pero no FcR\gammaII B1 o B2 (fig. 14B).

Los dominios intracelulares de FcR\gammaII A y C no comparten ninguna homología de secuencia apreciable con ninguna otra proteína, incluyendo los miembros de la familia extendida de FcR\gamma/TCR\zeta. Para definir los elementos de la secuencia responsables de la inducción de la citolisis, se prepararon supresiones 5' y 3' de las secuencias que codifican los dominios intracelulares (descritas más adelante y mostradas en la fig. 15A) y se evaluaron respecto a su eficacia en ensayos de movilización del calcio y de citolisis (como se describe en la presente memoria). En los experimentos en los que se separó la porción terminal amino del dominio intracelular, el dominio transmembranal de FcR\gammaII se reemplazó con el dominio transmembranal del antígeno CD7 no relacionado, para eliminar la posible contribución de las interacciones mediadas por el dominio que se extiende por la membrana.

Las figs. 15B y 15C muestran que la separación de los 14 residuos del extremo terminal carboxi, incluyendo el residuo de tirosina 298, dio lugar a una pérdida completa de la capacidad citolítica y a una reducción sustancial del potencial de movilización del calcio. La supresión adicional justo antes de la tirosina 282 dio un fenotipo idéntico (figs. 15B y 15C). La supresión desde el extremo terminal N del dominio intracelular hasta el residuo 268 no tuvo ningún efecto sustancial en el perfil del calcio o en la potencia citolítica, mientras que la supresión hasta el residuo 275 dañó marcadamente la liberación de calcio libre pero tuvo poco efecto en la citolisis (figs. 15D y 15E). La supresión adicional, hasta el residuo 282, dio colas de FcR\gammaII que carecían de la capacidad de movilizar el calcio o activar la citolisis (figs. 15D y 15E). El "elemento activo" definido mediante estas medidas básicas es relativamente grande (36 aminoácidos) y contiene dos tirosinas separadas por 16 residuos.

Ejemplo X Citolisis dirigida por linfocitos que portan receptores quimera de CD4 que no soportan infección

Como se discutió anteriormente, se pueden diseñar por ingeniería genética moléculas efectoras que redirijan la actividad citolítica de CTLs de una manera independiente de MHC. Por ejemplo, una quimera compuesta del dominio extracelular de CD4 fundido con la cadena \zeta en un clon de CTL de ser humano, WH3, mata específicamente células diana que exhiben la glicoproteína gp120 de la envoltura superficial del HIV. Sin embargo, puesto que el dominio extracelular de la molécula CD4 confiere susceptibilidad a la infección con HIV, los CTLs armados pueden llegar a ser dianas del virus, dando lugar a una disminución de su potencia (Dalgleish et al., Nature 312: 767 (1984); Klatzmann et al., Nature 312: 767 (1984)). Para impedir tal resultado se diseñaron moléculas quimera efectoras basadas en CD4 que son efectivas para hacer diana específicamente en células infectadas con HIV, para la matanza mediada por células pero que no confieren susceptibilidad a la infección con HIV.

Se creó una proteína tripartita de fusión por aposición genética del dominio extracelular de CD4 (fig. 23) con los dominios constantes bisagra, segundo y tercero de la cadena pesada de IgG1 de ser humano (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347 (1990)) (fig. 25), que en este caso se unieron a una porción del primer exón transmembranal de IgG1 de ser humano enlazada a la membrana, seguida por una porción del antígeno CD7 de ser humano que constaba de las secuencias entre el único dominio semejante a Ig y la secuencia de paro de la transferencia que sigue al dominio transmembranal (Aruffo y Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)) (fig. 26). La secuencia de aminoácidos primaria del resto extracelular del segmento de CD7 constaba de una región rica en prolina que sugiere una estructura semejante a un tallo que proyecta el dominio semejante a Ig hacia afuera de la superficie celular (Aruffo y Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)) (fig. 26). Se prepararon virus recombinantes de la viruela vacuna para expresar ésta y otras quimeras relacionadas como se describe en la presente memoria. En particular, se generaron virus recombinantes de viruela vacuna por recombinación homóloga en células CV-1. Para cada disolución madre al menos se realizaron dos rondas de visualización de placas con OKT4 o Leu3a seguidas por la purificación de las placas, antes de la preparación de disoluciones madre con elevados títulos en células CV-1.

La quimera tripartita (CD4(D1-D4):Ig:CD7) (fig. 20, molécula "A") mostró una eficiente expresión en la superficie celular y se ensayó respecto a su capacidad para actuar como receptor del HIV en un ensayo de formación de sincitios basado en el virus de la viruela vacuna (Lifson et al., Nature 323: 725 (1986)); Ashorn et al., J. Virol. 64: 2149 (1990)). Se cocultivaron células HeLa infectadas con un virus recombinante de la viruela vacuna (vPE16) que codificaba la glicoproteína de la envoltura del HIV (Earl et al., J. Virol. 64: 2448 (1990)) con células HeLa infectadas con CD4, CD4:\zeta, o CD4(D1-D4):Ig:CD7. Placas de 6 cm de células HeLa (ATCC, Rockville, MD) con una confluencia del 50% se infectaron en un medio exento de suero durante una hora con una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de 10. Las células se incubaron durante 5-6 horas adicionales en medio completo y a continuación se desprendieron con una disolución salina tamponada con fosfatos (PBS) que contenía EDTA 1 mM. Las células que expresaban la glicoproteína de la envoltura y las quimeras de CD4 se mezclaron en una relación 1:1, y se volvieron a depositar en placas de 6 cm con medio completo. Los sincitios se evaluaron a las 6-8 horas después del cocultivo y se fotografiaron.

Los cocultivos de CD4 y vPE16 condujeron a la formación de células gigantes multinucleadas fácilmente detectables. Asimismo, una quimera que consistía en el dominio extracelular de CD4 fundido con la cadena \zeta del TCR (fig. 27) (CD4:\zeta) fue capaz de mediar la formación de sincitios, mientras que células que expresaban CD4(D1-D4):Ig:CD7 no dieron ningún signo de fusión celular. Los presentes inventores también ensayaron una construcción que sólo expresaba el primer y segundo dominio de CD4 (fig. 24), CD4(D1,D2):Ig:CD7 (fig. 20, molécula "B"), ya que en otro contexto los dos dominios de CD4 con terminales amino habían mostrado que eran necesarios para la infectividad con HIV (Landau et al., Nature 334: 159 (1988)). Asimismo, esta molécula probó que tampoco era susceptible a la formación del sincitios inducida por el HIV. Estudios de enlace con gp120 soluble marcada con ^{125}I establecieron que tanto CD4(D1-D4):Ig:CD7 como CD4(D1,D2):Ig:CD7 no tenían una afinidad firme por gp120.

A continuación, los presentes inventores determinaron si las moléculas quimera que resistieron la formación del sincitio serían capaces de redirigir la matanza de células si estuvieran dotadas de un resto activante como se describe en la presente memoria. Los presentes inventores fundieron el dominio intracelular de \zeta (fig. 27) con el extremo 3' de CD4(D1-D4):Ig:CD7 y CD4(D1,D2):Ig:CD7 y prepararon los correspondientes virus recombinantes de la viruela vacuna. Estas construcciones, CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta y CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta (fig. 20, moléculas "C" y "D"), se expresaron en el clon WH3 de CTL de ser humano y se ensayaron respecto a su capacidad para hacer diana y matar células HeLa que expresaban la glicoproteína de la envoltura superficial del HIV (usando los métodos descritos en la presente memoria). La fig. 21 muestra que el dominio intracelular de \zeta fundido con CD4(D1-D4):Ig:CD7 o CD4(D1,D2):Ig:CD7 puede conferir capacidad de matar; las construcciones que carecen de la cadena \zeta no fueron capaces de mediar esta actividad. CD4:\zeta, un testigo positivo, medió una citotoxicidad ligeramente más efectiva, y CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta una citotoxicidad algo menos efectiva que CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta (fig. 21). Sin embargo, está claro que tanto la quimera CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta como la CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta tienen la capacidad de mediar en la matanza específica de células que expresan las proteínas de la envoltura del HIV sobre su superficie. Las quimeras tetrapartitas fueron consistentemente incapaces de mediar la formación del sincitio en el ensayo basado en el virus de la viruela vacuna. Los presentes inventores también han demostrado que un único resto de \zeta de la clase mostrada en la fig. 11A es suficiente para conferir actividad citolítica a una quimera de CD4(D1-D4).

Los experimentos de radioinmunoprecipitación establecieron que las moléculas de fusión fueron predominantemente, si no enteramente, dímeros. En estos experimentos, se usaron bolas de proteína A-agarosa para inmunoprecipitar el extracto solubilizado de células HeLa metabólicamente marcadas infectadas con virus recombinantes de la viruela vacuna que expresaban las quimeras CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta y CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta. El material inmunoprecipitado se fraccionó por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras y no reductoras. En particular, se infectaron aproximadamente 5 x 10^{6} células HeLa-S3 como se describió anteriormente para vPE16 con la disolución madre apropiada del virus de la viruela vacuna. Las células se marcaron metabólicamente con 200 \muCi/ml de Tran^{35}S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) durante 6-8 horas en medio deficiente en cisteína y metionina y se desprendieron con PBS que contenía EDTA 1 mM. Las células se peletizaron subsiguientemente y se lisaron en NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, NP-40 0,5%, SDS al 0,1%, EDTA 5 mM, y PMSF 1 mM. Tras la separación de los núcleos por centrifugación, se adsorbió un quinto de cada extracto celular sobre bolas lavadas de agarosa conjugada con la proteína A durante 2 horas a 4ºC. Las bolas se lavaron subsiguientemente con PBS que contenía NP-40 al 1% y se eluyeron en una muestra de disolución amortiguadora del pH que contenía SDS en presencia o ausencia de mercaptoetanol. Los resultados de estos experimentos demostraron que la mayoría de las quimeras CD4(D1-D4):Ig:CD7:\zeta y CD4(D1,D2):Ig:CD7:\zeta inmunoprecipitadas migraron como dímeros de la masa molecular esperada en condiciones no reductoras.

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Para evaluar directamente la capacidad de las células que expresan las moléculas de fusión con CD4 de soportar la infección con HIV, los presentes inventores realizaron estudios de infectividad de larga duración sobre transfectantes que expresan CD4(D1-D4):Ig:CD7 y CD4(D1,D2):Ig:CD7. Se prepararon transfectantes estables de CD4(D1-D4):Ig:CD7 y CD4(D1,D2):Ig:CD7 y CD4 en un sublinaje de células 293, un linaje celular fácilmente transfectable de origen embrionario del riñón de ser humano. Las moléculas quimera se subclonaron en vectores bidireccionales en los que el gen de la higromicina B fue dirigido mediante el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simplex. Una placa de células de 10 cm con una confluencia de 60-70% se transfectó con 10 \mug de este DNA plásmido por coprecipitación con fosfato cálcico. Antes de la transfección, los plásmidos se linealizaron en el sitio único Sfi I, y los extremos se hicieron fluir con T4 DNA polimerasa. A las 24 horas después de la infección, las células se dividieron cuatro veces, y a las 48 horas después de la infección las células se pusieron bajo selección con higromicina B (Sigma, St. Louis, Mo) a una concentración de 400 \mug/ml. Cada 3-4 días, a las células se les suministró medio recién preparado que contenía higromicina.

Se recogieron y expandieron colonias resistentes, y se evaluó su expresión por inmunofluorescencia indirecta usando Fc de IgG anti-ser humano conjugado con fluoresceína (Organon Teknika, West Chester, PA) o Q4120, un anticuerpo reactivo con CD4 de ser humano (Sigma), seguido por citometría de flujo (Coulter, Hialeah, FL). Se seleccionaron para su análisis dos clones independientes de cada construcción con cantidades de CD4 en la superficie celular comparables con las mostradas por los otros linajes celulares. La fig. 22 muestra que, tras la exposición al HIV, se detectó p24 en los cultivos transfectantes estables de CD4 tan tempranamente como a los 3 días después de la infección. En estos cultivos, la presencia de células gigantes multinucleadas y del englobamiento característico fue evidente tan tempranamente como a los 5 días después de la infección. No se detectaron cantidades significativas de p24 o evidencia de células gigantes multinucleadas en el linaje celular original no transfectado o en los dos aislados independientemente derivados de transfectantes de CD4(D1-D4):Ig:CD7 y CD4(D1,D2):Ig:CD7 después de 32 días en el cultivo (fig. 22).

Tras la finalización de los estudios de infectividad, las células se analizaron respecto a la expresión de CD4 en la superficie celular. La densidad de epítopes de CD4 en la superficie se redujo significativamente en cultivos infectados que expresaban CD4, consistente con la modulación descendente vírica, pero no fue afectada en cultivos que expresaban CD4(D1-D4):Ig:CD7 y CD4(D1,D2):Ig:CD7. Estos experimentos establecieron que es posible crear moléculas quimera que porten los dos dominios apicales de CD4 que, cuando se funden con la cadena \zeta del receptor de células T, tienen la capacidad de hacer diana en y de matar las células infectadas con HIV, pero que no soportan la infección del HIV mediada por CD4.

Experimentos adicionales sugieren que es la distancia física entre el dominio extracelular de la molécula CD4 y la bicapa de lípidos la que confiere la capacidad de resistir la infección del HIV. En un primer experimento, los presentes inventores construyeron una molécula quimera que portaba una supresión del tallo y del dominio transmembranal de CD7; esta supresión separó la región rica en prolina de la región transmembranal de CD7. Cuando este dominio se fundió con el dominio extracelular de CD4 mantuvo su capacidad de anclar eficientemente el dominio extracelular de la molécula CD4, como se midió mediante la expresión en la superficie celular de la molécula CD4 (como se describe en la presente memoria). Sin embargo, se perdió el potencial de resistir la formación del sincitio inducido por la glicoproteína de la envoltura del HIV. Por tanto, la supresión de la región rica en prolina de la molécula CD7, una región que probablemente forme una estructura de ovillo \alpha-helicoidal, redujo efectivamente la distancia entre el dominio extracelular de CD4 y la bicapa de lípidos y abrogó la capacidad de la quimera de resistir la formación del sincitio.

En un segundo experimento, los presentes inventores demostraron que la capacidad de resistir la formación del sincitio inducido por el HIV puede ser conferida por una quimera CD4/CD5 que previamente se había documentado que servía como un anclaje transmembranal de un dominio extracelular de CD4 pero que era incapaz de resistir la formación del sincitio inducida por el HIV. En este experimento, los dominios bisagra, CH2, y CH3 de la cadena pesada de IgG1 de ser humano se insertaron en la molécula CD4/CD5; la quimera resultante resistió la formación del sincitio, sugiriendo de nuevo que la distancia proporcionada por los dominios de la inmunoglobulina es suficiente para conferir resistencia a la formación del sincitio inducida por el HIV.

En un tercer experimento, se extendió un dominio de CD\textdollar variando las distancias desde la membrana celular usando hélices alfa sintéticas de longitud variable. En particular, se diseñaron oligonucleótidos sintéticos que representaban restos alfa-helicoidales repetidos de residuos de lisina y de ácido glutámico flanqueados por dos residuos de alanina (véase la fig. 28 para las secuencias primarias de ácidos nucleicos y de aminoácidos). En estudios previos, se encontró que tales secuencias de aminoácidos se producían con alta frecuencia en hélices alfa, sugiriendo que tales restos repetidos adoptarían una conformación alfa-helicoidal y que la colocación de tales hélices alfa entre el dominio transmembranal y los dominios extracelulares de CD4 proyectaría a CD4 hacia afuera de la membrana celular. Variando la longitud del segmento alfa-helicoidal, se calculó la distancia de proyección necesaria para resistir la entrada del HIV, cálculo basado en valores conocidos de altura entre vueltas de hélice y de la longitud de una vuelta alfa-helicoidal. Estos resultados se presentan en la tabla 1.

TABLA 1

	Formación de	Expresión de
	sincitios	Thy-1
A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk	-	-
B. CD4(D1,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk	-	-
C. CD4+CD7tm+stk	+/-^{(a)}	+
D. CD4+CD7tm (versión larga)	+	+
E. CD4+CD7tm (versión corta)	+	+
F. CD4+CD5tm	+	+
G. CD4+CH2+CH3+CD5tm	-	-
H. CD4+CH3+CD5tm	-	ND
I. CD4+CD34tm	+	+
J. CD4 + hélice alfa sintética (24 angstroms) + CD34tm	ND	+
K. CD4 + hélice alfa sintética (48 angstroms) + CD34tm	ND	+/-^{(a)}
L. CD4 + hélice alfa sintética (72 angstroms) + CD34tm	ND	-
^{a} Reducción sustancial del número de sincitios o de células que expresan Thy-1.

En esta tabla, "CD4" representa CD4(D1-D4), a menos que se advierta lo contrario; "H", "CH2" y "CH3" representan las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada de IgG1 de ser humano, respectivamente; "CD7tm y stk" representan las regiones transmembranal y tallo de CD7; "CD7tm (versión larga") y "CD7tm (versión corta)" representan, respectivamente, la región transmembranal de CD7 y la región transmembranal de CD7 en la que se ha suprimido el dominio rico en prolina (como se discutió anteriormente); "CD5tm" representa la región transmembranal de CD5; y "CD34tm" representa la región transmembranal de CD34. En las entradas J-L, la longitud de la región alfa-helicoidal se denota en angstroms; estos valores se basan en el hecho de que hay 3,6 residuos por vuelta de alfa-hélice, que corresponden a 5,4 \ring{A} (ó 1,5 \ring{A} por residuo). Por consiguiente, una alfa-hélice de 16 residuos proyectaría el dominio extracelular de CD4 aproximadamente 24 angstroms. Las hélices alfa de 48 y 72 angstroms se construyeron por concatemerización secuencial del fragmento BstY1 en el sitio BamH1 único del fragmento (véase la fig. 28), seguido por selección de clones con la orientación apropiada.

La formación de sincitios se evaluó en ensayos de cocultivo con células HeLa que expresaban la glicoproteína de la envoltura del HIV a partir de una construcción con vPE16 del virus de la viruela vacuna (véase anteriormente).

La expresión de Thy-1 se midió como sigue. Se construyó un vector de un retrovirus vivo basado en el clon hxb.2 de HIV-1. En este vector, el gen nef no esencial se reemplazó con la secuencia codificante de thy-1 de rata, una molécula de la superficie celular expresada eficientemente que está anclada a la membrana por una unión fosfatidilinositol. El virus derivado de este clon molecular, designado hxb/thy-1, era infeccioso como se puso en evidencia por sus efectos citopatológicos y por la producción de p24 en sobrenadantes de cultivos de células C8166 infectadas (un linaje de células T leucémicas CD4^{+}). Además, tras la exposición a hxb/thy-1, las células HeLa transitoriamente transfectadas con CD4 mostraron signos de expresión de thy-1 tan tempranamente como 18 horas después de la infección, como sería de esperar de un mensaje regulado de una manera semejante al nef. Los mensajes codificados por el gen nef normalmente caen en una clase de proteínas víricas reguladoras que están múltiplemente empalmadas y que carecen del elemento de respuesta rev. Estos mensajes se pueden acumular constitutivamente en el citoplasma como productos primeros de genes víricos. Se esperaba que los mensajes de thy-1 se regularan similarmente, esto es, que se produjeran tempranamente en el ciclo de vida del virus. En pocas palabras, este sistema facilitaba el ensayo de entrada del HIV, empleándose la expresión de thy-1 como un sustituto de la entrada vírica. Se transfectaron transitoriamente en células HeLa varias quimeras basadas en CD4 usando métodos estándar DEAE-dextrano. Las células transfectadas se expusieron al virus hxb/thy-1 48 horas después de la transfección y se evaluaron respecto a la expresión de thy-1 a las 24-48 horas después de la infección. En los resultados mostrados en la tabla 1, la expresión de thy-1 se midió 24 horas después de la infección usando un anticuerpo monoclonal de Thy-1 comercialmente disponible
(Accurate).

\newpage

A partir de los datos presentados en la tabla 1, los presentes inventores concluyeron que, con el fin de resistir la infección con HIV-1, los dominios extracelulares de CD4 deben proyectarse óptimamente al menos 48 angstroms hacia afuera de la membrana celular, y preferiblemente al menos 72 angstroms.

Usando una estrategia similar a la estrategia general descrita en la presente memoria, se pueden construir quimeras basadas en anticuerpos anti-envoltura del HIV que hagan diana en células infectadas con HIV. Ejemplos de tales anticuerpos se describen en Gorny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1624 (1989), y Marasco et al., J. Clin. Invest. 90: 1467 (1992).

Ejemplo XI Proteínas adicionales activantes receptoras de células T y receptorqs de células B

Otros dominios intracelulares y transmembranales que transducen señales según la invención se pueden derivar de las proteínas receptoras de células T, CD3 delta y T3 gamma, y de las proteínas receptoras de células B, mb1 y B29. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se muestran en la fig. 16 (CD3 delta; SEQ ID NO: 24), fig. 17 (T3 gamma; SEQ ID NO: 25), fig. 18 (mb1; SEQ ID NO: 26), y fig. 19 (B29; SEQ ID NO: 27). Las porciones de las secuencias suficientes para la transducción de la señal citolítica (y, por lo tanto, preferiblemente incluidas en un receptor quimera de la invención) se muestran entre corchetes. Los receptores quimera que incluyen estos dominios proteicos se construyen y usan en los métodos terapéuticos de la invención, en general como se describió anteriormente.

Ejemplo XII Métodos experimentales Infección con el virus de la viruela vacuna y radioinmunoprecipitación

Se infectaron aproximadamente 5 x 10^{6} células CV1 durante una hora en medio DME exento de suero con el virus de la viruela vacuna recombinante con una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez (título medido en células CV1). Después de la infección las células se colocaron en medio recién preparado y se marcaron metabólicamente durante seis horas con 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina más cisteína (Trans^{35}S-label, ICN; Costo Mesa, CA) en DMEM exento de metionina y cisteína (Gibco, Grand Island, NY). Las células marcadas se desprendieron con PBS que contenía EDTA 1 mM, se recogieron por centrifugación, y se lisaron en NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M pH 8,0, EDTA 5 mM, y PMSF 1 mM. Los núcleos se separaron por centrifugación, y las proteínas CD4 se inmunoprecipitaron con el anticuerpo OKT4 y el conjugado de agarosa con IgG anti-ratón (Cappel, Durham, NC). Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida 8%/SDS en condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R). Los geles que contenían muestras marcadas con ^{35}S se impregnaron con En^{3}Hance (New England Nuclear, Boston, MA) antes de realizar una autorradiografía. La expresión facilitada de la forma transmembranal de CD16, CD16_{TM}, se midió comparando su expresión en células CV1 únicamente infectadas con CD16_{TM} con expresión en células coinfectadas con virus que codifican quimeras de CD16_{TM} y \zeta o \gamma. Después de infectar y de incubar durante seis horas o más, las células se desprendieron de los platos con PBS y EDTA 1 mM, y la expresión de CD16TM o de las quimeras se midió por inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo.

Ensayo de flujo del calcio

Se infectaron células Jurkat del sublinaje E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133: 123-128 (1984)) con virus recombinantes de la viruela vacuna durante una hora en medio IMDM exento de suero con una moi de 10 y se incubaron durante tres a nueve horas en IMDM, FBS al 10%. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en una concentración de 3 x 10^{6} células/ml en medio completo que contenía acetometoxiéster de Indo-1 1 mM (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos. Las células cargadas con Indo-1 se peletizaron y resuspendieron en una concentración de 1 x 10^{6}/ml en IMDM exento de suero y se almacenaron a temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se analizaron por citometría de flujo respecto a su contenido en ion calcio libre por medida simultánea de la emisión de fluorescencia violeta y azul (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952-961 (1986)). Para iniciar el flujo de calcio, se añadió a la suspensión de células Leu-3A (anti-CD4) conjugado con ficoeritrina (PE) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) en una concentración de 1 \mug/ml, seguido por 10 \mug/ml de IgG de cabra anti-ratón sin conjugar en el momento 0, o se añadió anticuerpo monoclonal 3G8 (anti-CD16) no conjugado a la suspensión de células en una concentración de 1 \mug/ml, seguido por 10 \mug/ml de IgG anti-ratón de cabra Fab2' conjugado con PE en el momento 0. Se recogieron los histogramas de la relación de emisión violeta/azul de la población de células PE positivas (infectadas), que típicamente representaba el 40-80% de todas las células. La respuesta del receptor de antígenos de células T en células no infectadas fue activada por el anticuerpo OKT3, sin reticulación. Para los experimentos que involucraron receptores quimera de CD16, las muestras que mostraron una deriva de la línea base hacia un menor calcio intracelular (sin anticuerpo) se excluyeron del análisis. Los datos de los histogramas se analizaron subsiguientemente por conversión de los datos binarios a ASCII usando el paquete informático Write Hand Man (Cooper City, FL), seguido por análisis con una colección de programas en FORTRAN. Para establecer la relación inicial normalizada, ajustada igual a la unidad, y la relación umbral en reposo, ajustada para que el 10% de la población en reposo excediera la relación umbral, se usó la relación de emisión violeta/azul antes de la adición de los segundos anticuerpos reactivos.

Ensayo de citolisis

El linaje WH3 de células T de ser humano, un linaje citolítico CD8^{+} CD4^{-} HLA B44 restringido, se mantuvo en IMDM, suero humano al 10% con 100 U/ml de IL-2 y se estimuló periódicamente no específicamente con linfocitos de sangre periférica no adaptados con HLA irradiados (3000 rad) y 1 \mug/ml de fitohemaglutinina, o específicamente con células mononucleares irradiadas que portaban B44. Después de un día de estimulación no específica, la PHA se diluyó a 0,5 \mug/ml por adición de medio recién preparado, y el medio se cambió después de tres días. Las células se hicieron crecer durante al menos 10 días después de la estimulación antes de su uso en ensayos de citotoxicidad. Las células se infectaron con virus recombinantes de la viruela vacuna con una multiplicidad de infección de al menos 10 durante una hora en medio exento de suero, seguido por incubación en medio completo durante tres horas. Las células se cosecharon por centrifugación y se resuspendieron con una densidad de 1 x 10^{7} células/ml. Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una placa de microtitulación de fondo en U que contenía 100 \mul/pocillo de medio completo. Las células se diluyeron en etapas seriales dobles. Dos pocillos por cada muestra no contenían linfocitos para permitir medir la liberación espontánea del cromo y la absorción total de cromo. Las células diana, del sublinaje S3 de células HeLa, se infectaron en placas de 6,0 ó 10,0 cm con una moi aproximada de 10, durante una hora en medio exento de suero, seguido por incubación en medio completo durante tres horas. A continuación, se desprendieron de los platos con PBS, EDTA 1 mM y se contaron. Una parte alícuota de 10^{6} células diana (células HeLa, Raji, o RJ2.2.5 para los experimentos con el receptor quimera de CD4, y células 10-2 de 3G8, Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959 (1989), para los experimentos con el receptor quimera de CD16) se centrifugó y resuspendió en 50 \mul de cromato de sodio estéril marcado con ^{51}Cr (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) durante una hora a 37ºC con mezclado intermitente, y a continuación se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de células marcadas resuspendidas en medio en una concentración de 10^{5} células/ml. Las células diana Raji y RJ2.2.5 se marcaron de la misma manera que las células HeLa. La placa de microtitulación se hizo girar a 750 x g durante 1 minuto y se incubó durante 4 horas a 37ºC. Al final del período de incubación, las células de cada pocillo se resuspendieron por pipeteo suave, se separó una muestra para determinar las cuentas totales incorporadas, y la placa de microtitulación se hizo girar a 750 x g durante 1 minuto. Se separaron partes alícuotas de 100 \mul de sobrenadante y se contaron en un contador de centelleo de rayos gamma. El porcentaje de muertes se corrigió respecto a la fracción de células diana infectadas (usualmente 50-90%) medida por citometría de flujo. Para las células efectoras infectadas, la relación efector:diana se corrigió respecto al porcentaje de células infectadas (usualmente 20-50% en los experimentos con los receptores quimera de CD4 y > 70% en los experimentos con los receptores quimera de CD16).

Mutagéneis in vitro de la secuencia de \zeta

Para crear mutaciones puntuales en los residuos aminoácidos 11 y/o 15 de la secuencia de \zeta, se prepararon cebadores oligonucleótidos sintéticos que se extendían desde el sitio BamHI aguas arriba del dominio transmembranal de \zeta, y que convertían el residuo 11 nativo de \zeta de Cys a Gly (C11G) o el residuo 15 de Asp a Gly (D15G) o ambos (C11G/D15G), y se usaron en reacciones PCR para generar fragmentos mutados que se reinsertaron en construcciones CD4:\zeta de tipo natural.

Para crear supresiones en \zeta, se amplificaron secuencias de cDNA de \zeta por PCR usando cebadores oligonucleótidos sintéticos diseñados para crear un codón de paro (UAG) después de los residuos 50, 59 ó 65. Los cebadores contenían el sitio de escisión de la enzima NotI indentado cinco o seis residuos desde el extremo 5', usualmente en una secuencia de la forma CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11), en la que los tres últimos residuos corresponden al anticodón de paro. Las secuencias de NotI y del anticodón de paro estaban seguidas por 18 ó más residuos complementarios con el extremo 3' deseado del fragmento. Las quimeras resultantes se designaron CD16:\zetaY51*, CD16:\zetaE60* y CD16:\zetaD66*, respectivamente. El sitio BamHI aguas arriba del dominio transmembranal y el sitio NotI se usaron para generar fragmentos que se reintrodujeron en la construcción CD16:\zeta de tipo natural. Se crearon quimeras monómeras de \zeta liberando las secuencias de \zeta transmembranal e intracelular próxima a la membrana por digestión con BamHI y SacI de la construcción CD4:\zeta Asp^{-} y Cys^{-} descrita anteriormente e insertando el fragmento en las construcciones CD16:\zetaE60* y CD16:\zetaD66*, respectivamente.

Construcción de las quimeras tripartitas CD16:7:\zeta(48-65) y CD16:7:\zeta(48-59)

Para preparar la construcción CD16:\zetaD66*, se reemplazó la secuencia de cDNA de \zeta que correspondía al dominio transmembranal y los 17 residuos siguientes del dominio citoplasmático por los correspondientes dominios transmembranal y citoplasmático obtenidos del cDNA de CD5 y CD7. Los fragmentos de CD5 y CD7 se generaron mediante una reacción PCR usando oligonucleótidos directos que incluían un sitio de escisión de la enzima de restricción BamHI y que corresponde a la región justo aguas arriba del dominio transmembranal de CD5 y CD7, respectivamente, y los siguientes oligonucleótidos inversos que solapan las secuencias de CD5 y CD7, respectivamente, y la secuencia de \zeta que contenía el sitio de escisión de la enzima de restricción SacI.

CD5:\zeta CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO: 12).

CD7:\zeta CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO: 13).

Los productos PCR de CD5 y CD7 se digirieron con BamHI y SacI y se ligaron a CD16:\zetaE60* digerida con BamHI y SacI y se reemplazó la secuencia de \zeta de BamHI a SacI por el fragmento CD7. Para fabricar las construcciones CD16:CD5 y CD16:CD7, se obtuvieron fragmentos de CD5 y CD7 por PCR usando un oligonucleótido que contenía un sitio de escisión de la enzima de restricción NotI y que codificaba un codón de paro (UAA) después del residuo Gln416 y Ala193 de CD5 y CD7, respectivamente. Los fragmentos de CD5 y CD7 obtenidos por PCR se digirieron con BamHI y NotI y se insertaron en la construcción CD16:\zetaAsp66*.

Mutagénesis in vitro de los residuos N-terminales dentro del resto de \zeta que transduce la señal citolítica

Se sintetizaron cebadores oligonucleótidos sintéticos que se extendían desde el sitio SacI dentro del resto de \zeta y que convertían el residuo nativo 48 de Asn en Ser (N48S), el residuo 50 de Leu en Ser (L50S) y el residuo 51 de Tyr en Phe (Y51F), y se usaron en una reacción PCR para generar fragmentos que se reintrodujeron en la construcción CD16:7:\zeta(48-65) de tipo natural.

Mutagénesis in vitro de los residuos C-terminales dentro del resto de \zeta que transduce la señal citolítica

Se sintetizaron cebadores oligonucleótidos sintéticos que se extendían desde el extremo 3' del sitio NotI al codón de paro y que convertían el residuo nativo 60 de Glu en Gln (E60Q), el residuo 61 de Glu en Gln (E61Q), el residuo 62 de Tyr en Phe o Ser (Y62F o Y62S), y el residuo 63 de Asp en Asn (D63N), y se usaron en una reacción PCR para generar fragmentos que se subclonaron en la construcción CD16:\zetaD66* de tipo natural desde el sitio BamHI al sitio NotI.

Construcción de las quimeras CD16:7:\zeta(33-65), CD16:7:\zeta(71-104) y CD16:7:\zeta(104-137)

Se obtuvo por PCR un fragmento transmembranal de CD7 que portaba sitios MluI y NotI en la unión entre los dominios transmembranal e intracelular mediante PCR usando un oligonucleótido con la siguiente secuencia: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO:14). El fragmento resultante por PCR se digirió con BamHI y NotI y se reinsertó en la construcción CD16:7:\zeta(48-65). Se obtuvieron fragmentos de \zeta que codificaban los residuos 33 a 65, 71 a 104, y 104 a 137 por reacción PCR usando pares de cebadores que contenían sitios MluI en el extremo 5' de los cebadores directos y codones de paro seguidos por sitios NotI en el extremo 5' de los cebadores inversos. En cada caso, en los sitios de restricción se indentaron seis residuos desde el extremo terminal 5' del cebador para asegurar la escisión con la enzima de restricción.

\zeta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 15);

\zeta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16); y

\zeta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17).

Construcción de mutantes de FcR\gammaIIA por supresión

Se construyeron por PCR mutantes de FcRIIA por supresión desde el extremo terminal carboxi, de la misma manera que para las construcciones de longitud completa, convirtiendo las secuencias que codifican la tirosina en las posiciones 282 y 298 en codones de paro (TAA). Las supresiones N-terminales se generaron amplificando por PCR fragmentos que codificaban sucesivamente menos del dominio intracelular, usando oligonucleótidos que permitían que los fragmentos resultantes se insertaran entre los sitios de restricción MluI y NotI en un plásmido de expresión previamente construido que codificaba el dominio extracelular de CD16 fundido con el dominio transmembranal de CD7, terminando el último en un sitio MluI y la unión entre el dominio transmembranal y el intracelular.

Otras realizaciones

Los ejemplos descritos anteriormente demuestran que la agregación de quimeras de \zeta, \eta o \gamma basta para iniciar la respuesta citolítica de células efectoras en células T. El intervalo conocido de expresión de \zeta, \eta y \gamma, que incluye linfocitos T, células asesinas naturales, granulocitos basófilos, macrofagos, y células cebadas, sugiere que los restos conservados de las secuencias pueden interaccionar con un aparato sensorial común a las células de origen hematopoyético y que un importante componente de defensa en el sistema inmune del huésped puede mediarse mediante fenómenos de agregación de receptores.

La potencia de la respuesta citolítica y la ausencia de una respuesta a las células diana que portan receptores de MHC clase II demuestra que las quimeras basadas en \zeta, \eta o \gamma forman la base de una intervención genética en el SIDA a través de inmunoterapia adoptiva. La amplia distribución de \zeta y \gamma endógenas y la evidencia de que los receptores Fc asociados con \gamma median en la citotoxicidad en diferentes tipos de células (Fanger et al., Immunol. Today 10: 92-99 (1989)) permite que para este propósito se consideren una variedad de células. Por ejemplo, los granulocitos neutrófilos, que tienen un ciclo vital muy corto (\approx 4 h) en circulación y que son intensamente citolíticos, son células diana atractivas para la expresión de quimeras. La infección de neutrófilos con HIV no es probable que dé lugar a la liberación de virus, y la abundancia de estas células (las más extendidas de los leucocitos) debe facilitar la defensa del huésped. Otra posibilidad atractiva para las células huésped son las células T maduras, un población actualmente accesible para el diseño retrovírico por ingeniería genética (Rosenberg, Sci. Am. 262: 62-69 (1990)). Con la ayuda de IL-2 recombinante, las poblaciones de células T se pueden expandir con facilidad relativa en cultivos, y las poblaciones expandidas tienen típicamente un ciclo de vida limitado cuando se reinfunden (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570-578 (1990)).

En las condiciones apropiadas, el reconocimiento del HIV por células que expresan quimeras de CD4 también debe proporcionar estímulos mitogénicos, permitiendo la posibilidad de que la población de células armadas pudiera responder dinámicamente a la carga vírica. Aunque los presentes inventores se han focalizado en la presente memoria en el comportamiento de las proteínas de fusión en linfocitos T citolíticos, la expresión de las quimeras en linfocitos ayudantes podría proporcionar una fuente de citoquinas movilizadas por el HIV que podrían contrarrestar el colapso de la subserie de células ayudantes en el SIDA. La reciente descripción de varios esquemas de diseñar por ingeniería genética resistencia a la infección en etapas distintas a la de penetración del virus (Friedman et al., Nature 335: 452-454 (1988); Green et al., Cell 58: 215-223 (1989); Malim et al., Cell 58: 205-214 (1989); Trono et al., Cell 59: 113-120 (1989); Buonocore et al., Nature 345: 625-628 (1990)) sugiere que podrían diseñarse células que portan quimeras de CD4 para obstaculizar la producción del virus por expresión de agentes apropiados que tengan un sitio de acción intracelular.

La capacidad de transmitir señales a linfocitos T a través de quimeras autónomas también proporciona la capacidad de regular los linfocitos diseñados retrovíricamente por ingeniería genética in vivo. Los estímulos por reticulación, mediados por ejemplo por anticuerpos IgM específicos diseñados por ingeniería genética para separar dominios enlazantes de complementos pueden permitir que aumente el número de tales linfocitos in situ, mientras que el tratamiento con anticuerpos IgG específicos similares (que por ejemplo reconocen en la cadena quimérica una variación de aminoácidos diseñada por ingeniería genética) podría disminuir selectivamente la población diseñada por ingeniería genética. Adicionalmente, los anticuerpos IgM anti-CD4 no requieren reticulación adicional para movilizar el calcio en células Jurkat que expresan quimeras CD4:\zeta. La capacidad para regular poblaciones celulares sin recurso a una amplificación extracorpórea repetida puede extender sustancialmente la gama y la eficacia de los usos actuales propuestos para las células T genéticamente diseñadas.

Aunque la invención se ha descrito en conexión con sus realizaciones específicas, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales y se pretende que esta solicitud cubra las variaciones, usos o adaptaciones de la invención, incluyendo desviaciones de la presente descripción tales como las que están dentro de la técnica con la que la invención está relacionada y que pueden aplicarse a las características esenciales puestas de manifiesto antes en la presente memoria como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTES: Seed, Brian et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Citolisis dirigida de células infectadas con HIV mediante células que portan receptores quimera de CD4

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 27

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Fish & Richardson

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(B)

CALLE: 225 Franklin Street

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(C)

CIUDAD: Boston

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(D)

ESTADO: MA

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(E)

PAIS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02110-2804

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(v)

FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete de 3,5'' . 1,44 Mb

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(B)

ORDENADOR: IBM PS/2, Modelo 50Z ó 55SX

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS (versión 3.30)

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(D)

PAQUETE INFORMÁTICO: Wordperfect (versión 5.0)

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(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/847.566

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 6 Marzo, 1992

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 07/665.961

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 Marzo, 1991

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:

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(A)

NOMBRE: Clark, Paul T.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 30.162

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 00786/212001

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(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: (617) 542-5070

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(B)

FAX: (617) 542-8906

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(C)

TELEX: 200154

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1728 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

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1

2

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1389 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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3

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1599 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE HEBRA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

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5

6

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 575 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácida

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Val Leu Gln Leu}

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 462 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 532 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCGGC CGCTA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 182 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 220 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 228 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

17

Claims (8)

1. Un DNA que codifica un receptor quimera de naturaleza proteica enlazado a la membrana, comprendiendo dicho receptor: (a) una porción extracelular que incluye una porción de CD4 que comprende los aminoácidos 1-394 ó 1-200 de CD4, y (b) una porción intracelular que es capaz de transmitir una señal a una célula para que destruya a una célula infectada con HIV enlazada al receptor, en el que dicha porción intracelular es la porción transductora de señales de una proteína receptora de células T, una proteína receptora de células B o una proteína receptora Fc, y en la que dicha porción extracelular (a) y dicha porción intracelular (b) están separadas por al menos 48 angstroms mediante una porción transmembranal que incluye una porción transmembranal de CD7, una porción transmembranal de CD5, una porción transmembranal de CD34, una hélice alfa de naturaleza proteica, los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG1 de ser humano, o una hélice alfa de naturaleza proteica fundida con el dominio transmembranal de CD 34.

2. Un DNA que codifica un receptor quimera de naturaleza proteica enlazado a la membrana según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de CD4 está separado de la membrana celular de la célula mediante una o más alfa hélices de naturaleza proteica.

3. Un DNA que codifica un receptor quimera de naturaleza proteica enlazado a la membrana según la reivindicación 2, en el que dicha proteína receptora de células T es \zeta.

4. Un vector, que comprende el DNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un receptor quimera de naturaleza proteica enlazado a la membrana, codificado por un DNA según cualquiera de las reivindicaciones.

6. Una célula, que comprende un DNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó un vector según la reivindicación 4.

7. Una célula según la reivindicación 6, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en: (a) linfocitos T; (b) linfocitos T citotóxicos; (c) células asesinas naturales; (d) neutrófilos; (e) granulocitos; (f) macrofagos; (g) células cebadas y (h) células HeLa.

8. Uso de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, para la fabricación de un medicamento para la aplicación terapéutica en una infección con HIV.