CN1318576C - 由携载嵌合cd4受体的细胞针对hiv感染细胞的细胞溶解作用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种指导哺动物体内针对HIV感染细胞的细胞免疫应答的方法，包括给哺乳动物施用有效量治疗细胞，所述治疗细胞表达膜结合的蛋白质嵌合受体，所述嵌合受体包括(a)含有能特异性识别和结合HIV感染细胞，但不介导HIV感染的CD4片段的胞外部分，和(b)能给予治疗细胞以信号，使之破坏该受体结合HIV-感染细胞的胞内部分。也公开了表达该嵌合受体的细胞，以及编码该嵌合受体的DNA和载体。

Description

由携载嵌合CD4受体的细胞针对 HIV感染细胞的细胞溶解作用
本发明是遵从国家卫生组织签发的#AI27849合同，在政府资助下完成的。政府对本发明享有一定权利。
本发明涉及能指导免疫细胞溶解HIV感染细胞，而不使免疫细胞对HIV感染敏感的CD4片段和免疫细胞受体之间的功能性嵌合体，因此本发明提供新的有效HIV治疗法。
通过T细胞受体进行的抗原T细胞识别作用，是一些免疫学现象之基础。所述T细胞指导所谓的细胞介导的免疫。该作用包括借助免疫系统细胞来破坏外来组织或受感染细胞。存在各种不同T细胞，包括“辅助”细胞及“抑制”细胞，这些细胞可调节免疫反应，和细胞毒(或“杀死”)细胞，它可直接杀死不正常细胞。
T细胞识别和结合另一细胞表面上显示的独特抗原后被激活，然后可倍增，并且，如果它是细胞毒性细胞，便可杀死该结合细胞。
HIV和免疫发病机理
1984年发现HIV是爱滋病的病原剂。自那时起，有关爱滋病的定义，就其在诊断中涉及何种标准的问题已作过多次修改。然而尽管诊断参数不一，但爱滋病的简单共同特征是HIV感染，和随后的持续性全身症状出现，以及仅限于爱滋病的疾患，例如继发性感染，肿瘤，神经疾病等。见Harrison的 内脏医学原理，第十二版(Principles of Internal Medicine，12th ed.)，McGrawHill(1991)。
HIV是慢病毒属(lentivirus)的人反转录病毒。四种已识别的人反转录病毒分属于两不同类：人T嗜淋巴性(或白血病)反转录病毒，HTLV-1和HTLV-2，和人免疫缺损病毒HIV-1和HIV-2。前者是转化病毒，而后者是细胞病病毒。
HIV-1是被鉴定为全世界最共同的爱滋病病因。HIV-1和HIV-2之间的同源性约为40％，同时HIV-2更为接近猿免疫缺损病毒(SIV)族的某些病毒。见Curran，J.等人， 科学(Science)，329：1357-1359(1985)；Weiss，R.等人， 自然(Nature)，324：572-575(1986)。
HIV有通常的反转录病毒基因( env， gag和 pol)以及涉及复制和病毒其它生物活性的另外六个基因。正如前面所述，爱滋病的共同特征是明显的免疫抑制作用，最为重要的是对细胞介导的免疫性的抑制作用。此种免疫抑制导致了各种机会致病菌引起的疾病，特别是某些感染和肿瘤。
爱滋病免疫缺损的主要原因，经鉴定是由于胸腺衍生的(T)淋巴细胞亚群T4群体，在数量和质量上的缺损。从CD4表面分子的存在，来从表型上定义此种细胞亚群，所述CD4表面分子，被证明是HIV的细胞受体。见Dalgleish等人， 自然312：763(1984)。虽然T4细胞是受HIV感染的主要细胞类型，但基本上在其表面表达CD4分子的任何人细胞均能与HIV结合并受其感染。
传统上认为，CD4+T细胞起辅助因子/诱导因子的作用，在对B细胞提供激活信号，或诱导携载交互CD8标志的T淋巴细胞，使其变成胞毒性/抑制细胞方面发挥功能。见Reinherz和Schlossman， 细胞(Cell)，19：821-827(1980)；Goldstein等人， 免疫学评论(Immunol.Rev.)68：5-42(1982)。
借助病毒被膜(gp 120)中的一段氨基酸，HIV与靠近CD4分子N-末端的V1区域的一部分进行特异性结合，并且其亲和性极高。结合之后，该病毒与靶细胞膜融合，并进入其中。一旦进入其中，它便使用逆转录酶，使其基因组RNA转录成DNA，该DNA整合进细胞DNA中，在其中，该病毒以“原病毒”的方式存在于细胞的整个生命期。
该“原病毒”可保持潜伏，或者被激活转录mRNA或基因组RNA，导致蛋白合成，组装，新的病毒核粒子形成，并使病毒从细胞表面萌生。虽然病毒诱导细胞死亡的准确机理尚无定论，但已确信主要的机理是大量的病毒从细胞表面萌生，导致胞质膜破裂并引起渗透失衡。
感染过程中，宿主机体便产生抗病毒蛋白的抗体，包括抗主要被膜糖蛋白gp120和gp41的抗体。尽管存在该体液免疫，疾病仍进一步发展，结果产生以多发性机会致病菌感染、寄生物血症、疾呆和死亡为特征的致命性免疫抑制作用。宿主抗病毒抗体对控制该病无能为力，这表明了该感染最为令人苦脑和使人恐慌，并且预示着根据常规方法采用免疫接种将无济于事。
在对免疫缺损病毒的体液反应效力上，有两种因素起作用。第一，象其它RNA病毒(具体说象逆转录病毒)一样，在对宿主免疫监督的反应上，免疫缺损病毒表现出高突变率。第二，被膜糖蛋白本身是高度糖基化的分子，不存在很多适于高亲合性抗体结合的表位。即病毒被膜缺乏抗原靶，使得宿主难有机会通过产生特异性抗体来限制病毒感染。
由HIV病毒感染的细胞在其表面表达gp120糖蛋白。借助类似于病毒进入未感染细胞的反应，gp120介导CD4+细胞中的融合作用，导致短寿多核巨大细胞的形成。合胞体的形成取决于gp120被膜糖蛋白与CD4蛋白的直接相互作用。见Dalgleish等人，前述文献；Klatzman，D.等人， 自然，312：763(1984)；McDougal，J.S.等人， 科学231：382(1986)；Sodroski，J.等人，自然，322：470(1986)；Lifson，J.D.等人， 自然，323：725(1986)；Sodroski，J.等人， 自然，321：412(1986)。
CD4-gp120结合是造成携载CD4抗原的细胞被病毒感染的原因的证据，包括发现了gp120和CD4之间形成特异性复合物。见McDougal等人前述文献。其它研究人员证明，不感染HIV的细胞系，在人CD4cDNA基因转染和表达之后，转变成可感染细胞系。Maddon等人， 细胞46：333-348(1986)。
根据以可溶性CD4作为被动治疗剂，干扰病毒吸附和合胞体介导的细胞传导这一治疗方案，已有许多研究组提出过，并证明其于体外是成功的(Deen等人， 自然331：82-84(1988)；Fisher等人， 自然，331：76-78(1988)；Hussey等人， 自然331：78-81(1988)；Smith等人， 科学238：1704-1707(1987)；Traunecker等人， 自然，331：84-86(1988))；并且随后开发出具有延长半衰期和适度生物活性的CD4免疫球蛋白融合蛋白(Capon等人， 自然337：525-53 1(1989)；Traunecker等人， 自然339：68-70(1989)；Byrn等人， 自然344：667-670(1990)；Zettlmeissl等人 DNA细胞生物学(DNA Cell Biol.)9：347-353(1990))。虽然CD4免疫毒素连接物或融合蛋白表现出体外对感染细胞有强的胞毒性(Chaudhary等人， 自然335：369-372(1988)；Till等人， 科学242：1166-1168(1988))，但免疫缺损综合症的潜伏性使得它不大可能以单一处理方式治疗便能有效消除病毒负载，而且外来融合蛋白的抗原性，又很可能限制其在重复给药治疗中的可接受性。以受到SIV感染的猴进行试验表明，假如将可溶性CD4给予明显CD4血细胞减少症的动物，可降低SIV效价，并改善体外骨髓电位测量值(Watanabe等人， 自然337：267-270(1989))。但是治疗中断之后，很快可发现病毒再现，这表明需要长期给药，方能预防进行性免疫系统衰竭。
T细胞和Fc受体
T细胞抗原受体(TCR)最大量形式的细胞表面表达要求至少6种不同的多肽链的共表达(Weiss等人， 试验医学杂志(J.Exp.Med.)160：1284-1299(1984)；Orloffhashi等人， 自然316：606-609(1985)；Berkhout等人， 生 物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：8528-8536(1988)；Sussman等人， 细胞52：85-95(1988))，即要求α/β抗原结合链，三种CD3复合物多肽链，以及ζ链。如果缺少任何一种链，均不能保证复合物剩下的各成分的稳定表达。ζ是该完全复合物表面表达的限制性多肽(Sussman等人， 细胞52：85-95(1988))，被认为能介导至少一部分由配体受体识别起动的细胞激活程序(Weissman等人， EMBO杂志8：3651-3656(1989)；Frank等人， 科学249：174-177(1990))。作为32KDa I型完整膜均二聚体，ζ(Zeta)有不带N-连接的聚糖加成位点的9残基胞外区，和112残基(小鼠)或113残基(人)胞内区(Weissman等人， 科学238：1018-1020(1988)；Weissman等人， 国家学术研 究规章(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 85：9709-9713(1988))。ζ的异型称为η(eta)(Baniyash等人， 生物化学杂志263：9874-9878(1988)；Orloff等人， 生 物化学杂志264：14812-14817(1989))，由mRNA拼接途径改变而产生(Jin等人， 国家学术研究规章USA87：3319-3233(1990))，以减量存在于表达抗原受体的细胞中。ζ-η杂二聚体被认为能介导磷酸肌醇酯形成，以及介导受体引发的，称之为“细胞程序死亡”(apoptosis)的程序化细胞死亡(Mercep等人， 科学242：571-574(1988)；Mercep等人， 科学246：1162-1165(1989))。
像ζ和η一样，Fc受体缔合的γ链与其它多肽在细胞表面复合物中表达，所述其它多肽有的介导配体识别，而其它的功能不太明确。γ(gamma)具均二聚体结构，其整体组织与ζ非常相似，它既是肥大细胞/嗜碱细胞高亲合性IgE受体Fc∈RI(它由至少三个不同多肽链组成，见Blank等人， 自然337：187-189(1989)；Ra等人， 自然241：752-754(1989))的成分，也是IgG的一个低亲合受体，在鼠中的代表为FcγRIIα(Ra等人， 生物化学杂志264：15323-15327(1989))，人类中由巨噬细胞和天然杀伤细胞表达的CD16亚型CD16TM(CD16透膜，见Lanier等人， 自然342：803-805(1989)；Anderson等人， 国家学术研究规章USA87：2274-2278(1990))代表，并带有未验明功能的多肽(Anderson等人， 国家学术研究规章USA 87：2274-2278(1990))。目前已有报导，γ由小鼠T细胞系CTL表达，于该细胞系中，它形成均二聚体，以及γ-ζ和γ-η杂二聚体(Orloff等人， 自然347：189-191(1990))。
Fc受体介导免疫复合物的吞噬作用，透胞作用，和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Ravetch和Kinet， 免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)9：457-492(1991)；Unkeless等人， 免疫学年度评论.6：251-281(1988)；Mellman， 免 疫学最新进展(Curr.Opin.Immunol.)1：16-25(1988))。最近发现鼠低亲合性Fc受体异形之一FcRγIIIB1，介导Ig-包覆的靶进入披有网格蛋白的小窝的内在化作用，而另一低亲合性受体Fcrr IIIA，则通过其与“触发分子”小族的一个或多个成员缔合而介导ADCC(Miettinen等人， 细胞58：317-327(1989)；Hunziker和Mellman， 细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)109：3291-3302(1989))。这些触发分子，T细胞受体(TCR)的ζ链，TCRη链和Fc受体γ链，与不同免疫系统受体的配位体识别区相互作用，并可自动引发细胞效应物反应，包括细胞溶解作用，随后的集聚作用(Samelson等人.， 细胞43：223-231(1985)；Weissman等人.， 科学239：1018-1020(1988)；Jin等人.，国家学术研究规章USA 87：3319-3323(1990)；Blank等人.， 自然337：187-189(1989)；Lanier等人.， 自然342：803-805(1989)；Kurosaki和Ravetch，自然342：805-807(1989)；Hibbs等人.， 科学246：1608-1611(1989)；Anderson等人.， 国家学术研究规章USA 87：2274-2278(1990)；和Irving和Weiss， 细胞64：891-901(1991))。
然而，在鼠和人低亲合性Fc受体家族之间作个比较，很清楚，人FcRγIIA和C异型没有鼠相应物。部分因此原因。其功能尚无定论。
因为基于CD4的体液因子单独在体内作用有限，以前的工作探索了提高对HIV的细胞免疫性的可能性。CD4胞外区与T细胞受体、IgG Fc受体、或B细胞受体信号转导元件的跨膜区和/或胞内区相融合的蛋白嵌合体制剂已经过鉴定(U.S.S.N.07/847566和07/665961，引入本文作为参考)。表达包括胞外CD4区的嵌合体的溶胞T细胞，表现出能使表达HIV被膜蛋白的细胞靶发生了强烈的MHC非依赖性破裂。该方法的极端重要和新的因素，是鉴定出单个T细胞受体、Fc受体和B细胞受体链，它们的聚集足以引发细胞应答。该方法的特别有用的应用，是发明指导溶胞T淋巴细胞识别和杀死表达HIV gp 120之细胞的CD4和ζ、η、或γ之间的嵌合体(U.S.S.N.07/847566和07/665961，引入本文作为参考)。
总的来说，本发明特征是指导哺乳动物中针对HIV感染细胞的细胞免疫应答的方法。该方法包括给哺乳动物施用有效量的治疗细胞，该治疗细胞表达膜结合蛋白质嵌合受体，所述受体包含(a)包括CD4片段的胞外部分，该CD4片段能特异性识别和结合HIV感染细胞，但不介导HIV感染，和(b)胞内部分，该部分能给治疗细胞以信号，使之破坏该受体结合的HIV感染细胞。
在一相关方法中，本发明特征是将该表达膜结合的蛋白质嵌合受体的治疗细胞，用于制造治疗HIV相关疾病的药物，所述嵌合受体包含(a)包括CD4片段的胞外部分，该CD4片段能特异性识别和结合HIV感染细胞，但不介导HIV感染，和(b)胞内部分，该部分能给治疗细胞以信号，使之破坏该受体结合的HIV感染细胞。
第二个方面，本发明特征是一种表达蛋白质膜结合嵌合受体的细胞，所述嵌合受体包含(a)包括CD4片段的胞外部分，该CD4片段能特异性识别和结合HIV感染细胞，但不介导HIV感染和(b)胞内部分，该部分能给治疗细胞以信号使之破坏该受体结合的HIV感染细胞。
上述两方面的各优选方案中，所述CD4片段是CD4的第1-394氨基酸，或者CD4的第1-200氨基酸；该CD4片段，以图26所示CD7跨膜区，或以图25所示人IgG1分子的绞链区，CH2、及CH3区，同胞内部分分隔开来；所述受体包括CD7跨膜部分；该受体包括CD5跨膜部分；该受体包括CD34跨膜部分；该CD4片段，以一个或多个蛋白性α螺旋，同治疗细胞膜分隔开来；或该CD4片段以至少48埃或至少72埃，同治疗细胞膜分隔开来；所述胞内部分是T细胞受体蛋白(例如ζ)，B细胞受体蛋白，或Fc受体蛋白的信号转导部分；所述治疗细胞选自：(a)T淋巴细胞，(b)胞毒性T淋巴细胞，(c)天然杀伤细胞，(d)嗜中性白细胞，(e)粒细胞，(f)巨噬细胞，(G)肥大细胞，(h)海拉(HeLa)细胞，(i)胚胎干细胞(ES)。
另一方面，本发明特征是编码本发明嵌合受体的DNA，以及包括该嵌合受体DNA的载体。
虽然本发明具体实施方案中是CD4和ζ之间的嵌合体，但任何与这些分子有相似功能的受体链，例如粒细胞中或B淋巴细胞中的受体链，均可用于此处公开的目的。所期望的免疫细胞触发分子的区别特征，包括具自动表达的能力(即作为单链表达)，具与胞外CD4区融合的能力，以使所得嵌合体存在于治疗细胞的表面，以及当与靶配体相遇而后聚集时，具引发细胞效应过程的能力。
传递嵌合体到免疫系统细胞的现有最便利方法是通过某些基因治疗形式。但通过将细胞与适当可溶性纯化嵌合蛋白相混合，而重建携嵌合受体的免疫系统细胞，也能形成对HIV感染靶有应答的工程细胞群体。例如，已使用相似方法将CD4分子导入红细胞，用作治疗目的。在这种情况下，该工程细胞群体将不能自我更新。
本发明涉及CD4片段和T细胞受体、B细胞受体、和Fc受体亚单位之间的功能性的，且简化的嵌合体，该嵌合体能指导免疫细胞识别和溶解HIV感染细胞。该指导哺乳动物细胞应答的方法，包括给哺乳动物施用有效量治疗细胞(例如胞毒性T淋巴细胞)，该细胞能识别和破坏HIV感染细胞。
本发明也包括指导胞毒性T淋巴细胞识别和溶解HIV感染细胞的嵌合受体蛋白，包括用包含嵌合受体之载体转化的宿主细胞，以及抗该嵌合受体的抗体。
从下述本发明详细介绍中，本发明以上这些方案及其它非限制性方案，对于专业人员来说是显而易见的。
下面详细描述，将参考由分子生物学和免疫学领域专业人员熟知的各种方法。作为参考的描述此类方法的公开文献及其它材料，以其全文引入本文作为参考。
介绍重组DNA技术一般原理的标准参考作品包括：Watson等人.， 基 因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)，卷I和II，theBenjamin/Cummings出版公司(Publishing Company)，Inc.，出版商(Publisher)，Menlo Park，CA(1987)；Darnell等人.， 细胞分子生物学(Molecular CellBiology)，美国科学图书公司(Scientific American Books，Inc.)，出版商，NewYork，N.Y.(1986)；Lewin，GenesII，John Wiley&Sons，出版商，New York，N.Y.(1985)；Old等人.， 基因操作原理：基因工程介绍(Principles of GeneManipulation：An Introduction to Genetic Engineering)，第二版，加州大学出版社，出版商，Berkeley，CA(1981)；Maniatis等人.，分子克隆：试验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)第二版.冷泉港实验室(Cold SpringHarbor Laboratory)，出版商，冷泉港实验室，NY(1989)；和Ausubel等人.，分子生物学最新规章(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley Press，纽约，NY(1989)。
定义
所谓“克隆”，意指使用体外重组技术，将特定基因或其它DNA顺序插入载体分子中。
“cDNA”意指借助RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶)作用，从RNA模板产生的互补DNA或拷贝DNA。这样，“cDNA克隆”便指互补于所研究RNA分子，载于克隆载体中的双链DNA顺序。
“cDNA文库”意指含cDNA插入段的重组DNA分子的汇集，这些cDNA插入段包括该cDNA文库建立时，由细胞表达的mRNA的DNA拷贝。此种cDNA文库可由专业人员已知方法制备，例如Ausubel等人前述文献，及Maniatis等人前述文献所介绍的。一般是首先将RNA从生物体细胞中分离出来，其基因组含有需要克隆的特定基因。从本发明目的出发，优选哺乳动物，特别是人淋巴细胞系。而为此目的优选的载体是牛痘病毒WR株。
“载体”意指衍生自质粒、噬菌体或哺乳动物或昆虫病毒的DNA分子，DNA片段可以插入或克隆入其中。载体可含一个或多个独特限制性位点，并能在一定宿主或载体生物体中自动复制，以使克隆顺序能复制。因此，所谓“DNA表达载体”意指任何能指导重组肽合成的自动元件。这样，DNA表达载体包括细菌质粒和噬菌体，以及哺乳动物和昆虫质粒及病毒。
“基本上纯的”是指化合物，例如蛋白，多肽或抗体，基本上不含与其天然相伴的成分。一般来说，若样品中总物质量的至少60％，更好的至少75％，最好的至少90％是目的化合物，则该化合物属基本上纯的。纯度可采用适当方法测定，例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析。本文中核酸“基本上纯的”是指两侧都不与一种编码顺序紧相邻接(即共价连接)的核酸顺序，断片，或片段；而这种编码顺序在衍生本发明DNA的生物体的天然存在的基因组中，与所述编码顺序紧相邻接(即5′端的一个编码顺序和3′端的一个编码顺序)。
所谓一个分子的“片段”，例如本发明的任何cDNA顺序的片段，是指该分子的任何邻接的核苷酸子集。所谓分子的“类似物”，是指基本上与整个分子或其片段相似的非天然分子。假如两分子中氨基酸顺序基本上相同，那么可以说一个分子与另一分子基本上相似。基本上相似的氨基酸分子具有相似的生物学活性。如本文中所用的，当一个分子含有正常情况下不是该分子之一部分的化学部分时，可称该分子是原分子的化学衍生物。所述部分可以改善该分子的溶解性，吸附性，生物半衰期等等。该部分还可不同程度降低分子毒性，消除或减小该分子任何不希望的副反应等。能够介导此种效应的部分已被公开过，例如在 雷明敦药学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第十六版，MackPublishing Co.，Easton，Penn.(1980)中有所介绍。
本发明的受体嵌合基因的“功能性衍生物”意味着包括该基因的“片段”或“类似物”，它们在核苷酸顺序上基本相似，且编码与T细胞、B细胞或Fc受体嵌合体具有相似活性的分子。优选该衍生物具有野生型受体嵌合体活性的40％，更优选为70％，最优选为90％。功能性嵌合受体衍生物的活性，包括与HIV感染细胞特异性结合(以其胞外CD4部分)，并最后破坏该细胞；此外，该嵌合受体不会使携载该受体的细胞对HIV感染产生易感性。使用例如本文所述任何检测法，可以试验嵌合受体活性。
编码本发明CD4受体嵌合体的DNA顺序，或其功能性衍生物，可以根据常规技术，与载体DNA重组，包括平齐末端或交错末端连接，限制酶消化提供适当末端，适当情况下填平粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，用适当连接酶连接。此类操作技术已由Maniatis，T.等人前述文献公开过，属本领域已知技术。
若核酸分子，例如DNA，含有包括转录及翻译调节信息的核苷酸顺序，且此种顺序以“可操纵方式连接”于编码多肽的核苷酸顺序上，则该核酸分子称之为“能表达”多肽的分子。可操纵性连接是调节DNA顺序和试图表达的DNA顺序之间，以允许基因表达的方式所进行的连接。基因表达所需调节区域的精确性质在生物体与生物体之间有所不同，但一般来说包括启动子区域。原核细胞中，所述启动子区域包括启动子(它指导RNA转录的引发作用)，以及包括当转录为RAN后给以蛋白合成引发作用的信号的DNA顺序。正常情况下此类区域包括参与转录和翻译引发作用的5′非编码顺序，例如TATA框、核苷帽顺序、CAAT顺序等等。
假如需要，通过上述方法，可以获得编码蛋白的基因顺序3′端的非编码区。作为其转录终止调节顺序，例如起终止作用和聚腺苷酸化作用的顺序，这些区域可以保留。因此，借助保留天然邻接于编码蛋白的DNA顺序的3′-区域，可以提供转录终止信号。如果在表达宿主细胞中，转录终止信号功能不足，可以替换该宿主细胞中的3′功能区。
假如两DNA顺序之间的连接性质不出现下面几种情况，那么该两DNA顺序(例如启动子区域顺序和CD4受体嵌合体编码顺序)可以说是按可操纵方式连接的，即(1)不引起移码突变，(2)不妨碍启动子区域顺序指导受体嵌合体基因顺序转录的能力，或(3)不妨碍受体嵌合体基因顺序由启动子区域顺序转录的能力。如果启动子能够使一个DNA顺序的转录，那么该启动子区域便是与该DNA以可操纵方式连接的。因此，为表达蛋白，必需有由适当宿主识别的转录和翻译信号。
本发明包括CD4-受体嵌合蛋白(或其功能性衍生物)在真核细胞中和在原核细胞中的表达，但在真核细胞中(特别是人淋巴细胞中)的表达是优选的。
本发明的抗体可以由任一方法制备。例如，可将表达CD4-受体嵌合体蛋白或其功能性衍生物的细胞施用于动物，诱导其产生含有能与该嵌合体结合的多克隆抗体的血清。
在一优选方法中，依照本发明的抗体是单克隆抗体。此种单克隆抗体可使用杂交瘤技术制备(Kohler等人.， 自然256：495(1975)；Kohler等人.， 欧洲 免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6：511(1976)；Kohler等人.， 欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等人.， 单克隆抗体和T-细胞杂交(In：MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas)，Elsevier，N.Y.，pp.563-684(1981))。一般来说，此种方法涉及用CD4-受体嵌合体抗原给动物免疫接种。提取该动物脾细胞，并与适当的骨髓瘤细胞系融合。任何适宜的骨髓瘤细胞系可用于本发明中。融合之后，所得杂交瘤细胞被选择性地保留于HAT培养基中，然后按Wands等人( 胃肠病学80：225-232(1981))所述，通过有限稀释克隆。随后将通过如此选择所获得的杂交瘤细胞进行检测，鉴定出能分泌与嵌合体结合的抗体的克隆。
依照本发明的抗体也可以是多克隆的，或者优选区域特异性多克隆抗体。
依照本发明的抗CD4-受体嵌合体的抗体，可用来检测患者体内的嵌合受体量(或携载嵌合受体的细胞的量)。此类抗体非常适用于本领域已知的标准免疫诊断检测法，包括如正向“三明治”检测，反向“三明治”检测，及同步“三明治”检测之类的免疫测量或“三明治”检测法。该抗体可用于任何多种方式组合中，由本领域熟练技术人员无需过分实验便可决定，以获得具可接受的特异性，敏感性，和准确性的免疫检测法。
介绍免疫学一般原理的标准参考作品包括Roitt， 免疫学精义(EssentialImmunology)，第六版，Blackwell Scientific Publications，出版商，Oxford(1988)；Kimball， 免疫学介绍(Introduction to Immunology)，第二版，MacmillanPublishing Co.，出版商，New York(1986)；Roitt等人.，免疫学，Gower MedicalPublishing Ltd.，出版商，London，(1985)；Campbell，“单克隆抗体技术(Monoclonal Antibody Technology)，”Burdon等人.，eds.，生物化学和分子生物学实验室技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)，卷13，Elsevier，出版商，Amsterdam(1984)；Klein，免疫学：自体和非自体甄别的科学(Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination)，John Wiley& Sons，出版商，New York(1982)；和Kennett等人.，eds.，单克隆抗体，杂交生物学分析的新领域(Monoclonal Antibodies，Hybrioma：A New Dimension InBiological Analyses)，Plenum Press，出版商，New York(1980)。
所谓“检测”，包括测定一种物质是否存在，或测定一种物质的含量。因此该术语关系到为进行定性和定量测定使用本发明的材料，成分及方法。
本发明的抗体和基本上纯的抗原，极为适合于制备试剂盒。所述试剂盒可包括隔开的，同时容纳紧紧密封的一个或多个容器单元(如小瓶，管等等)的承载装置，所述每个容器单元含有用于检测的分离开的元件。
可以组合成试剂盒形式的检测类型有许多，例如竞争性或非竞争性检测。可利用本发明抗体的检测的典型例是放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)，酶联免疫吸附检测法(ELISA)，和免疫测量或“三明治”免疫测定法。
所谓“免疫测量检测法”或“三明治免疫测定法”意味着包括同步三明治，正向三明治，反向三明治免疫检测法。这些术语是本领域熟练技术人员所熟知的。这些技术人员也很清楚，根据本发明的抗体，将会用于目前已知的，或即将开发的其它检测种类和形式中。这些均包括在本发明范围之内。
“特异性识别和结合”意指该抗体只识别和结合该嵌合受体多肽，但基本不识别和结合样品(例如生物学样品)中的其它无关分子。
“治疗细胞”意指由本发明的CD4-受体嵌合体转化的细胞，以便使其能识别和破坏HIV感染细胞，优选此类治疗细胞是造血系统细胞。
“胞外”意指至少分子一部分暴露于细胞表面，而“胞内”意指至少分子一部分暴露于治疗细胞的胞质。“跨膜”意指至少分子的一部分跨越质膜。本文所用“胞外部分”、“胞内部分”和“跨膜部分”可以包括延伸进毗邻细胞空间的侧接氨基酸顺序。
“寡聚合”意指与其它蛋白质复合形成二聚体，三聚体、四聚体或其它较高级寡聚体。此种寡聚体可以是均寡聚体，或杂寡聚体。“寡聚合部分”是指导复合物(即寡聚物)形成的分子区域。
“细胞溶解”是指能够破坏细胞(例如HIV感染细胞)，或能够破坏感染剂(如HIV病毒)的作用。
“免疫缺损病毒”意指一种逆转录病毒，该病毒的野生型能感染灵长类宿主T4细胞，并具有慢病毒亚族的病毒形态发生及形态学特征。该术语包括(但不限于)HIV和SIV的所有变种。包括HIV-1、HIV-2、SIVmac、SIVagm、SIVmnd、SIVsmm、SIVman、SIVmand和SIVcpz。
“MHC非依赖性”意指该细胞溶胞反应不需靶细胞表面存在MHCII类抗原即可进行。
“功能性细胞溶解信号转导衍生物”意指能够指导至少40％，优选70％，最优选至少90％野生型分子生物学活性的功能性衍生物(正如上面的定义)。如本文中使用的，所述“功能性细胞溶解信号转导衍生物”，可以通过直接给治疗细胞以信号，破坏受体结合物或细胞来起作用(如胞内嵌合受体部分的情况)，或可通过启动与治疗细胞的细胞溶解信号转导蛋白的寡聚作用而间接起作用(例如跨膜区的情况)。使用本文所述体外检测法，可试验此种衍生物的效力。
“功能性HIV被膜结合衍生物”意指能结合任何HIV被膜蛋白的功能性衍生物(如上面所定义的)。使用本文所述体外检测法，可以鉴定该功能性衍生物。
治疗给药
本发明的转化细胞用于免疫缺损病毒治疗。施用此种转化细胞的现有方法涉及过继性免疫治疗或细胞转移治疗。这些方法使转化的免疫系统细胞返回血液中。见Rosenberg，美洲学报(Scientific American)62(1990年5月)；Rosenberg等人，新英格兰医学杂志(The New England Journal of Medicine)323(9)：570(1990)。
本发明药物组合物可施用于能受益于本发明化合物的任何动物，其中主要是人，尽管本发明并不试图作如此限制。
首先对附图作简要说明：
图1A是CD4(1-369残基)和不同受体链之间融合位点附近的氨基酸顺序。下面划线的顺序表示构建融合体所用BamHI位点中编码的氨基酸位置。跨膜区的开始用垂直杠标明。η顺序与ζ顺序其氨基末端相同，但其羧基末端相异(Jin等人， 国家学术研究规章USA 87：3319-3323(1990)。图1B是CV1细胞中CD4、CD4：ζ、CD4：γ和CD4：η表面表达的流式细胞计数分析。细胞用表达CD4嵌合体或CD16PI的病毒感染，于37℃保温9小时，并用藻红素偶联抗-CD4 MAbLeu 3A染色。
图2表示单用CD16TM(密点线)感染，或用表达CD4：γ(短划线)或CD4：ζ(实线)的病毒共感染后，CD16TM的表面表达。稀疏点线表示只用CD4：ζ感染的细胞，用2G8(Fleit等人， 国家学术研究规章USA 79：3275-3279(1982))(抗-KCD16 MAb)染色。
图3表示用表达CD16TM和下述ζ嵌合体：CD4：ζ(粗线)、CD4：ζC11G(实线)、CD4：ζ(短划线)、CD4：ζC11G/D15G(密点线)的病毒共感染后CD16TM的表面表达；非共感染(只有CD16TM，稀点线)后的CD16TM表面表达。细胞与抗-CD16 MAb 3G8和藻红素偶联的山羊抗小鼠IgG抗体Fab′2一起保温。对不同突变体分析表明，ζ嵌合体的表达水平基本相同，且细胞被表达CD16TM和ζ嵌合体的病毒共感染，不明显地改变嵌合体的表面表达。
图4A-D表明，随着T细胞系中突变体ζ嵌合体交联而提高了胞内游离钙离子。用重组牛痘病毒感染Jurkat E6细胞(Weiss等人， 免疫学杂志133：123-128(1984))，并用流式细胞计数器分析。显示的结果是门控的(gated)CD4+群体，这样仅仅是表达相关嵌合蛋白的细胞被分析。紫色对兰色Indo-1荧光的平均比例，反映作为一个完整的群体中胞内游离钙的浓度，而应答细胞的百分比，反映超过预定临界比例(该临界比例的设置要使10％未处理细胞是阳性)的细胞百分数。图4A和图4B表示表达暴露于抗-CD4MAb Leu3a(藻红素偶联)，接着用山羊抗小鼠IgG抗体交联的CD4：ζ(实线)或CD16：ζ(短划线)的Jurkat细胞。点线表示未感染细胞对抗-CD3 MAbOKT3的反应。图4C和4D表示表达CD4：ζD15G(实线)、CD4：ζC11G/D15G(短划线)、或CD4：ζC11G(点线)的Jurkat细胞，其处理和分析与图4A和4B相同。
图5A-C表示CD4：ζ、CD4：η和CD4：γ受体使得溶胞T淋巴细胞(CTL)杀死表达HIV-1gp120/41的靶细胞。图5A：实心环表示表达CD4：ζ的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养；空心环表示表达CD4：ζ的CTL与CTL与未感染的HeLa细胞一起培养；实心方块表示未感染的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养；空心方块表示未感染的CTL与未感染的HeLa细胞一起培养。图5B：实心环表示表达CD4：η的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养；空心环表示表达CD4：γ的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养；空心方块表示表达C11G/D15G双突变体CD4：ζ嵌合体的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养。图5C：图5B所用CTL的CD4表达的流式计数分析。为校准靶对效应物之比例，通过柱状图叠合，减去负性群体的比例(未感染的)，来测定表达CD4嵌合体的细胞百分比；该图中，为比较之目的，赋予未感染细胞一任意临界值，该值给出与用柱状图减法所得大致相同的其他细胞群体的阳性比例。
图6A-B表示CD4指导的细胞溶解的特异性。图6A：实心环代表表达CD4：ζ的CTL与表达CD16PI的HeLa细胞一起培养；空心环代表表达CD4的CTL与表达gp120的HeLa细胞一起培养；实心方块代表表达CD16：ζ的CTL与表达gp120/41的HeLa细胞一起培养；空心方块表示表达CD16PI的CTL与gp120/41的HeLa细胞一起培养。图6B：实心环代表表达CD4：ζ的CTL与Raji(MHCII+类)细胞一起培养；空心环表示未感染的CTL细胞与RJ2.2.5(MHCII-类Raji突变体)细胞一起培养；实心方块表示未感染的CTL与Raji(MHCII+类)细胞一起培养；空心方块代表表达CD4：ζ的CTL与RJ2.2.5(MHCII-类)细胞一起培养。该图纵坐标尺度被放大过。
图7A-B表示CD16：ζ嵌合受体的特征。图7A是CD16：ζ融合蛋白的简图。单体CD16的磷酯酰肌醇连接形式的胞外部分，与正好位于跨膜区外面的二聚体ζ相接。该融合连接处的蛋白顺序示于底部。图7B表示CD16：ζ嵌合体在TCR阳性或TCR阴性细胞系中交联之后，钙活动作用的流动细胞计数分析。该图表示在时间为0时，用抗体处理的细胞群体中，紫色对兰色荧光的平均比例(相对钙离子浓度的量)。实心方块表明Jurkat细胞对抗-CD3 MAb OKT3的应答；实心三角表示CD16：ζ对在REX 33A TCR-突变体中抗-CD16 MAb 3G8交联的应答；空心方块表示对CD16：ζ交联于JurkatTCR-突受体细胞系JRT3.T3.5的应答；空心三角代表对CD16：ζ交联于Jurkat细胞的应答；十字表示对非嵌合CD16在Jurkat细胞中的应答；而点线表示非嵌合CD16在REX 33ATCR-细胞系中的应答。
图8A-B表示细胞溶解能力的删除分析。图8A表示ζ删去的端点的位置。此处正如ζ其它位置突变一样，由原先的残基-位置-突变体残基的规则来表示，这样，例如D66*，则表示由终止密码子代替Asp-66。图8B表示对无删除CD16：ζ和显著ζ缺失所作细胞溶解检测的结果。表达抗CD16表面抗体的杂交瘤细胞用51Cr装载，并与数量增长中的用表达CD16：ζ嵌合体的牛痘重组体感染的人细胞溶解性淋巴细胞(CTL)一起培养。51Cr释放的百分比，以效应物(CTL)对靶(杂交瘤)细胞之比(E/T)的函数来作图。其中，实心环表示由表达CD16：ζ(mfi 18.7)的细胞介导的细胞溶解；实心方块表示由表达CD16：ζ Asp66*(mfi 940.2)的细胞介导的细胞溶解；空心方块表示由表达CD16：ζ Glu60*(mfi 16.0)的细胞介导的细胞溶解；空心环代表表达CD16：ζTyr51*(mfi 17.4)的细胞介导的细胞溶解；实心三角表示由表达CD16：ζPhe 34*(mfi 17.8)的细胞介导的细胞溶解；空心三角代表由表达非嵌合CD16(mfi 591)的细胞介导的细胞溶解。虽然该实验中，CD16：ζAsp 66*的表达没有与其它融合蛋白的表达相匹配，但在相同实验中，以相等水平表达CD16：ζ的细胞介导的细胞溶解作用所得结果与表达CD16：ζAsp66的细胞所示结果基本相同。
图9A-D表示跨膜相互作用能力的消除，揭示短ζ片段能介导细胞溶解作用。图9A是单体两合或三合嵌合体的简图。顶部是在第65残基处截断的，缺失跨膜Cys和Asp残基的CD16：ζ构建体。下面是CD16：CD5：ζ和CD16：CD7：ζ构建体及其相应对照构建体。胞内区的肽顺序示于底部。图9B表示单体嵌合缺失突变体的细胞溶解活性。表达CD16：ζ(实心环；mfi 495)的细胞溶胞活性，与表达CD16：ζAsp 66*(实心方块；mfi 527)或突变体CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp 66*(空心方块；mfi 338)，和CD16：ζCys11Gly/Asp 15Gly/Glu 60*(实心三角；mfi 259)的细胞溶胞活性进行比较。图9C表示由三合融合蛋白介导的溶胞活性。实心三角表示CD16：ζAsp 66*；空心方块表示CD16：5：ζ(48-65)；实心方块表示CD16：7：ζ(48-65)；空心三角，表示CD16：7：ζ(48-59)；空心环表示CD16：5；实心环表示CD16：7。图9D表示突变和三合嵌合体在TCR阴性Jurkat JRT3.T3.5突变细胞系中引起的钙活动作用。空心环，表达二聚CD16：ζAsp 66*的细胞应答；实心方块，表达CD16：ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp 66*的细胞应答；空心方块，表达CD16：ζCys11Gly/Asp1 5Gly/Glu 60*的细胞应答；实心三角，表达CD16：7：ζ(48-65)的细胞应答；空心三角，表达CD16：ζ(48-59)的细胞应答。
图10A-F，表示个别氨基酸对含18个残基的溶胞信号转导基元的活性的贡献。图10A和10B表示细胞溶解活性，而图10C表示钙离子活动性，皆由携载靠近羧基末端酪氨酸(Y62)点突变的嵌合体所介导。图10A和10B分别代表从表达低量和高量CD16：ζ融合蛋白的细胞上所得到的数据。对于钙活动性和细胞溶解检测均用相同的符号，于右边以一字母码表示。实心环，表达CD16：ζ(mfi，A中为21、B中为376)的细胞；实心方块，表达CD16：7：ζ(48-65)(mfi，A中为31、B中为82)的细胞；空心方块，CD16：7：ζ(48-65)Glu 60 Gln(mfi，，A中为33，B中为92)；十字号，CD16：7：ζ(48-65)Asp 63 Asn(mfi，A为30，B为74)；实心三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr62 Phe(mfi，A为24，B为88)；空心环，CD16：7：ζ(48-65)Glu 61Gln(mfi，A为20，B为62)；空心三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr 62 Ser(mfi，B为64)。图10D和图10E表示细胞溶解活性，而图F表示钙离子活动性，均由携带靠近氨基末端酪氨酸(Y51)处点突变的嵌合体介导。对于钙活动作用和细胞溶解性检测，均用同样符号表示，且示于右方。实心环，表达CD16：ζ(mfi，D为21.2，E为672)的细胞；实心方块，表达CD16：7：ζ(48-65)(mfi，D为31.3，E为179)；实心三角，CD16：7：ζ(48-65)Asn 48Ser(mfi，D为22.4，E为209)；空心方块，CD16：7：ζ(48-65)Leu 50Ser(mfi，D为25.0，E为142)；空心三角，CD16：7：ζ(48-65)Tyr 51Phe(mfi，D为32.3，E为294)。
图11A-B表示ζ的内部重复单元的排列，和它们支持细胞溶解能力的比较。图11A是将ζ胞内区分成三段，及将其附加于CD16：7嵌合体跨膜区所形成的嵌合体的简图。胞内区顺序示于下面，用方框框出共有残基，并且用星号表示相关残基。图11B表示三个ζ亚区的细胞溶解能力。实心环，表达CD16：ζ(mfi 476)的细胞；实心方块，CD16：7：ζ(33-65)(mfi 68)；空心方块，CD16：7：ζ(71-104)(mfi 114)；实心三角，CD16：7：ζ(104-138)(mfi104)。
图12是CD16：FcRγII嵌合体简图。
图13A-B表示CD4：FcRγII和CD16：FcRγII嵌合体交联后钙的活动作用。图13A表示由载有钙敏感性荧光团Indo-1的细胞发射出的紫色对兰色荧光之比，表达为CD16胞外区与抗体交联后的时间的函数。图13B表示用抗体交联之后，对携带CD4：FcRγII嵌合体的细胞的紫色对兰色荧光之比的提高所进行的类似分析。
图14A-B表示CD4：FcRγII和CD16：FcRγII嵌合体的细胞溶解检测。图14A表示当靶细胞暴露于数量增加中的表达CD16：FcRγII嵌合体的胞毒性T淋巴细胞(效应细胞)时，从抗-CD16杂交瘤(靶)细胞中释放出的51Cr百分比。图14B表示由CD4：FcRγII嵌合体介导的对抗表达HIV被膜糖蛋白的靶细胞的细胞毒性的类似分析。
图15A-E表示对细胞溶解作用至关重要的FcRγIIA尾中残基的鉴定。图15A是有缺失的构建体简图。较15B-15C表示由CD16：FcRγIIA羧基末端缺失变种介导的钙活动作用和细胞溶解作用。图15D和15E表示由携带逐渐缺失CD16：FcRγIIA胞内尾的氨基末端的三合嵌合体介导的钙活动性和细胞溶解作用。
图16(SEQ ID NO：24)表示CD3 delta受体蛋白的氨基酸顺序，方框中顺序表示优选的细胞溶解信号转导部分。
图17(SEQ ID NO：25)表示T3 gamma受体蛋白的氨基酸顺序，方框中顺序代表优选的细胞溶解信号转导部分。
图18(SEQ ID NO：26)表示mbl受体蛋白的氨基酸顺序，方框中顺序代表优选的细胞溶解信号转导部分。
图19(SEQ ID NO：27)表示B29受体蛋白的氨基酸顺序，方框中顺序代表优选的细胞溶解信号转导部分。
图20A-E表示CD4嵌合体的简图。分子“A”是CD4(D1-D4)：Ig：CD7；分子“B”是CD4(D1、D2)：Ig：CD7；分子“C”是CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ；分子“D”是CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ；分子“E”是CD4：ζ。相应于其前体的第1-394氨基酸的人CD4分子胞外区，借助BamHI位点，结合于人IgGl的铰链区，CH1区和CH2区，正如前面介绍的(Zettlmeissl等人，DNA细胞生物学9：347(1990))，只是用人Ig顺序的cDNA形式来使其在牛痘病毒重组体中表达。CD4嵌合体的二功能区形式，通过把BamHI接头插入CD4前体cDNA的单一NheI位点(相应于第200氨基酸)而建立。膜连接顺序由从人膜结合IgG1第一外显子开始的22个残基，接着是CD7残基146-203所组成。ζ的55-163氨基酸作为四合构建体(C和D)的触发基元使用。在含ζ链的四合构建体中，ζ的胞内表达，用市售抗胞内区抗体(Coutler)证明。
图21表示由表达作为效应物分子的各种CD4衍生的嵌合体的胞毒性T细胞克隆WH3介导的对表达HIV-1被膜糖蛋白的靶细胞溶解作用。为进行细胞毒性检测，将人CD8+CD4-HLA B44限制的T细胞系，WH3，维持于补充了10％人血清的IMDM中，正如本文前面所述。用gamma辐射的(3000rad)携载B44的单核细胞和植物血球凝集素(PHA)(1μg/ml)刺激该细胞。刺激一天之后，加入新鲜培养基，使PHA稀释到0.5μg/ml；三天之后，将培养基全部更换。使该细胞至少生长10天，然后用于细胞毒性检测。将该细胞用如本文对vPE16所述的适当重组牛痘病毒感染。感染作用在完全培养基中再进行3-4小时，此后，离心收集细胞，并以1×107/ml的密度再配成悬浮液。取100μl加入U形底微量滴定板的各孔中，该各孔含100μl完全培养基，并按2倍的量进行系列稀释。每个样品有两个孔不含淋巴细胞，使之自发释放铬，测量总铬量。靶细胞，HeLa亚系S3(HeLa-S3，ATCC)如上在10cm盘中用vPE16感染。用PBS和1mM EDTA洗下106个感染细胞，离心分离，并于37℃再悬浮于100μl51Cr铬酸钠盐中(1mCi/ml的PBS溶液)1小时，然后用PBS洗三次。将100μl经标记的靶细胞加入到各孔中。将该微量滴定板于750×g条件下旋转1分钟，并于37℃保温4小时。保温期结束时，用吸液管慢慢将各孔中细胞维持悬浮状态，移出一个样品测定整合进细胞的总计数，并再将该微量滴定板于750×g旋转1分钟。移出上清液等分样(100μl)并于γ射线闪烁计数器上计数。将效应物：靶之比用流式细胞计数器测量的感染细胞的百分数校准。
图22表示HIV-1在转染细胞系中的复制。稳定表达野生型CD4和各种重组嵌合体的细胞系以人胚胎肾细胞系29的亚系来建立。制备HIV-1IIIB分离株的病毒贮存液，配制为具有每毫升约106感染颗粒的效价，该值系使用人T细胞系C8166作为指示剂，采用终点稀释分析法测得。感染于37℃，以近似MOI值为1进行8-12小时。第二天，将细胞用PBS洗三次，胰蛋白酶处理，再铺于新的皿中，将培养上清液取样，进行p24效价测定(此时定为0天)。此后按3-4天之间隔，收集细胞培养上清液再进行p24效价分析。该细胞中再补充入含潮霉素B(浓度100μg/ml)的新鲜培养基。该培养上清液的分析采用市售以ELISA为基础的HIV-1p24抗原检测药盒(Coulter)进行，按制造商提供的说明书操作。结果是相似持续时间的两个独立实验的代表值。
图23表示CD4(CD4 Bam)D1-D4区的核酸顺序及氨基酸顺序。
图24表示CD4(CD4 Nhe)D1-D2区的核酸及氨基酸顺序。
图25表示人IgGl(Igh23 Bam)的铰链，CH2和CH3区的核酸及氨基酸顺序。
图26表示CD7(TM7 Bam Mlu)的跨膜区的核酸和氨基酸顺序。
图27表示ζ(ζMlu Not)胞内区的核酸和氨基酸顺序。
图28表示合成α螺旋的DNA顺序和一级氨基酸顺序。
实施例1
构建人IgG1：受体嵌合体
人IgG1重链顺序，通过将CH3区顺序结合于衍生自跨膜形式抗体mRNA的3′端的cDNA片段而制备。该3′端片段，使用扁桃体cDNA文库作为底物，并使用分别相应于所需DNA片段5′端和3′端的寡核苷酸作引物，通过聚合酶链反应而获得，所述寡核苷酸顺序如下：
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC(SEQ ID NO：7)和
CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGTCCT GGG CCT CA(SEQ ID NO：8)
该5′寡核苷酸与人IgG1 CH1区一个位点互补，而3′寡核苷酸与紧接编码膜跨越区顺序5′端的一个位点互补。用BstXI和BamHI消化PCR产物，并连接到携带可变区和恒定区的半合成IgG1抗体基因的BstXI和BamHI位点之间。BstXI到BamHI之间的片段插入之后，将构建体的扩增部分中直达CH3中的SmaI位点处通过限制性片段互换而替代，以便只有SmaI位点和3′寡核苷酸之间的部分是从PCR反应衍生出的。
为建立人IgG1：ζ嵌合受体，将以BamHI位点为末端的重链基因结合于下述ζ嵌合体的BamHI位点，这样该抗体顺序形成胞外部分。对用编码该嵌合体的质粒转染的COS细胞进行流式胞计数表明，当编码轻链cDNA的表达质粒共转染时，表现出高水平抗体决定簇表达，而不存在轻链表达质粒时，表现出少量的抗体决定簇表达。
包括融合于η或γ(见下面)，或T细胞受体或Fc受体蛋白任何信号转导部分的人IgG1的相似嵌合体，可以使用分子生物学标准技术，一般按上面所述进行构建。
为建立能使重链和轻链从单个启动子表达的单个转录单元，从重链和轻链编码顺序，和编码78KD葡萄糖调节蛋白(或称之为grp78或Bip)的mRNA5′非翻译部分构建编码双顺反子mRNA的质粒。分别使用下述顺序的5′端和3′端引物，进行人基因组DNA PCR反应获得grp78。
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCAAGACAG CAC(SEQ ID NO：9)和
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG(SEQ ID NO：10)
以这些寡核苷酸进行聚合酶链反应，是于10％二甲基亚砜存在下完成的。将PCR获得的片段用NotI和HineII消化，并插入人IgGl编码顺序下游的NotI和HpaI位点之间。编码人IgG Kapa轻链cDNA顺序，使用HincII位点和载体中的另一位点，插入grp78前导顺序下游。从这些操作所得表达质粒，由半合成重链基团，接着是grp78前导顺序，下面是Kappa轻链cDNA顺序，再后是衍生自SV40 DNA片段的聚腺苷酸信号组成。同只编码重链决定簇的质粒的转染相比，用该表达质粒转染COS细胞，明显改进了重链决定簇的表达。
为构建含重链/受体嵌合体和轻链的双顺反子基因，上游重链顺序可以由本文所述任何嵌合重链/受体基因取代。
实施例2
构建CD4受体嵌合体
将人ζ(Weissman等人， 国家学术研究规章USA85：9709-9713(1988b))和γ(Kuster等人， 生物学，化学杂志J.Biol，Chem.)265：6448-6452(1990))cDNA，通过聚合酶链反应，从HPB-ALL肿瘤细胞系(Aruffo等人， 国家 学术研究规章USA84：8573-8577(1987b))和人天然杀伤细胞制备的基因文库中分离出来，而η cDNA(Jin等人， 国家学术研究规章USA 87：3319-3323(1990))则从鼠胸腺细胞文库中分离出。ζ，η和γcDNA结合于具有紧贴跨膜区上游的BamHI位点的工程型CD4胞外区(Aruffo等人， 国家学术研 究规章USA84：8573-8577(1987b)；Zettlmeissl等人， DNA细胞生物学9：347-353(1990))，该CD4跨膜区于相似位置(跨膜区上游几个残基)结合于ζ和ηcDNA天然存在的BamHI位点(SEQ ID NOS：1、3、4和6)。而为同γ形成融合蛋白，将BamHI位点于相同接近位置通过工程手段引入顺序中(图1；SEQ ID NO：2和5)。该基因融合物被导入携带E.coli gpt基因作为选择性标志的牛痘病毒表达质粒中，并通过同源重组，和在霉酚酸中选择生长，而插入牛痘WR株基因组(Falkner等人， 病毒学杂志62：1849-1854(1988)；Boyle等人，Gene 65：123-128(1988))。流式细胞计数分析表明，该牛痘重组体指导CD4：ζ和CD4：γ融合蛋白在细胞表面大量产生，而CD4：η的表达明显较弱(图1B)。后一发现与最近的一些报导相一致，即η cDNA表达质粒转染入鼠杂交瘤细胞系，比起相类似的ζ表达质粒的转染，得到明显较小的表达(Clayton等人， 试验医学杂志172：1243-1253(1990))。用牛痘重组体感染的细胞的免疫沉淀揭示，融合蛋白形成共价二聚体。不象天然存在的CD4抗原。单体CD4：ζ和CD4：γ融合蛋白，及天然CD4的分子量分别是63，55和53KD。融合蛋白分子量较大可能与其胞内部分较长相一致，即其胞内部分超过天然CD4该部分75(CD4：ζ)或5(CD4：γ)个残基。
实施例III
CD4嵌合体可与其它受体链协同表达
人FcγRIII(CDl6TM)的噬菌体/天然杀伤细胞型在转染子上的细胞表面表达，通过同鼠(Kurosaki等人， 自然342：805-807(1989))或人(Hibbs等人，科学246：1608-1611(1989))γ，以及人ζ(Lanier等人，Natllre 342：803-805(1989))共转染而得以改善。
与这些报道相一致，若通过与重组牛痘病毒共转染，或共感染转输到靶细胞，则该嵌合体的表达也引起CD16TM的表面表达(图2)。所试验的细胞系中，由ζ促进的CD16TM表面表达，比由γ促进的更为明显(图2)，而天然CD4不提高CD16TM表面表达。
实施例IV
Asp ζ突变体不与Fc受体协同表达
为建立不与存在的抗原或Fc受体协同表达的嵌合体，制备缺失膜内Asp或膜内Cys残基、或者缺失二者的突变ζ融合蛋白。流式细胞计数表明，由不同突变嵌合体进行的细胞表面表达强度，并不明显有别于其未突变前体，而免疫沉淀实验证明，由这些嵌合体进行的总表达是相似的。正如所预期的，缺失跨膜半胱氨酸残基的突变嵌合体不形成二硫键连接的二聚体。缺失Asp的二突变嵌合体不能支持CD16TM的表面表达，而缺失Cys，但携带Asp的单体嵌合体都允许CD16TM共表达，但比其亲代二聚体效率要低(图3)。
实施例V
突变受体保持引发钙应答的能力
为测定融合蛋白交联是否会引起胞内游离钙，以相似于用T细胞抗原受体所出现的已知方式聚集，将人T细胞白血病细胞系，Jurkat E6(ATCC入藏号TIB152，美国品种培养物保藏(American Type Culture Collection)，Rockville，MD)用牛痘重组体感染，并测量胞外区与抗体交联后，胞质钙的相对浓度。流式细胞计数测定以用钙敏感染料Indo-1染色的细胞进行(Grynkiewicz等人， 生物化学杂志260：3340-3450(1985)；Rabinovitch等人，免疫学杂志(J.Immunol.)137：952-961(1986))。图4A-D表示以CD4：ζ和ζ的Asp-及Cys-突受体感染的细胞进行的钙流量实验结果。嵌合体的交联，可提高胞内钙，并且该结果可重复获得。CD4：η和CD4：γ使感染细胞中钙聚集的作用相似。Jurkat细胞在细胞表面表达CD4水平低，但天然CD4在存在或不存在CD16：ζ情况下交联并不改变胞内钙水平(图4A-B)。
实施例VI
CD4：ζ、η和γ嵌合体介导表达HIV gp120/41的靶细胞的细胞溶解作用
为测定嵌合受体是否触发细胞溶解效应过程，建立一个以HIV被膜gp120/gp 41复合物的CD4识别作用为基础的靶：效应物系统模型。用表达gp120/gp 41的重组牛痘病毒感染HeLa细胞(Chakrabarti等人， 自然320：535-537(1986)；Earl等人，J.Virol.64：2448-2451(1990))，并用51Cr标记。该经标记细胞与来自人异型特异性allospecific(CD8+、CD4-)胞毒性T淋巴细胞系的细胞一起培养，所述胞毒性T淋巴细胞系已被表达CD4：ζ、CD4：η或CD4：γ嵌合体，或者CD4：ζCys 11Gly：Asp15Gly双突变嵌合体的牛痘重组体感染过。图5A-C表示表达gp 120/41的HeLa细胞，被表达CD4嵌合体的胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异性溶解。未感染的HeLa细胞不是具有CD4：ζ嵌合体的CTL的攻击靶，并且表达gp120/41的HeLa细胞没有被未感染的CTL所识别。为了比较各嵌合体的效力，将效应物与靶的比例按用流式细胞计数测得的表达CD4嵌合体的CTL的比率，及表达gp120/41的HeLa细胞的比率加以校准。图5C表示图5A和5B所示细胞溶解实验中所用CTL进行的CD4表达的细胞计数分析。虽然表面CD4：ζ平均密度大大超过CD4：η平均密度，但表达两种形式的细胞的溶胞效力却相似。经对表达gp120的靶比率加以校准，由CD4：ζ和CD4：η蛋白介导的细胞溶解效力，与报导过的特异性T细胞受体靶：效应物对的最佳效力差不多(对于由表达CD4：ζ的T细胞具50％释放的情况来说，相应效应物与靶的平均比率是1.9±0.99，n＝10)。CD4：γ融合体活性较低，与缺失跨膜Asp和Cys残基的CD4：ζ融合体一样。但两种情况下，均观察到明显的细胞溶解作用(图5B-C)。
为了核查牛痘感染可能促进CTL的人为识别作用这一可能性，用表达磷酯酰肌醇连接型CD16(CD16PI)的牛痘重组体感染，并用51Cr标记的靶细胞，和用表达CD16PI或CD16：ζ的对照重组体感染的CTL，进行相似的细胞溶解实验。图6A表示表达非CD4嵌合体的T细胞不识别天然HeLa细胞，或表达gp120/41的HeLa细胞，同样，表达CD4嵌合体的T细胞也不识别表达其它牛痘编码的表面蛋白的HeLa细胞。此外，表达非嵌合CD4的CTL不明显溶解表达gp120/41的HeLa细胞(图6A)。
实施例VII
携带MHCII类的细胞不是嵌合体的攻击靶
CD4被认为能与由MHCII类抗原表达的非多态性顺序相互作用(Gay等， 自然328：626-629(1987)；Sleckman等人， 自然328：351-353(1987))。虽然CD4和II类抗原之间特异性相互作用，对于纯蛋白来说从未证实过，但在一定条件下，表达CD4的细胞和表达II类分子的细胞之间的粘合可以看到(Doyle等人， 自然330：256-259(1987)；Clayton等人， 试验医学杂志172：1243-1253(1990)；Lamarre等人， 科学245：743-746(1989))。下一步试验是否可以检测出杀死携带II类抗原的细胞。图6B表明，不存在由CD4：ζ指导的，针对大量表达II类抗原的Raji B细胞系的特异性溶胞作用。即使可以观察到较低(约5％)的细胞溶解作用，Raji的II类阴性突受体，RJ2.2.5(Aceolla， 试验医学杂志157：1053-1058(1983))仍表现出相似敏感性，正如Raji细胞与未感染T细胞一起培养的情况一样。
实施例VIII
为诱导由T细胞抗原/Fc受体ζ链介导的细胞溶解作用的顺序要求。
虽然CD4和ζ之间的嵌合体可以装备胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀死表达HIV gp120的靶细胞，但为可清楚地比较导入人T细胞系的各ζ嵌合体的性质，需找到CD4的一种替换物。所述人T细胞系可以表达CD4，这使得特异性地定义不同嵌合体的钙流动性类型或程度和胞毒性之间的关系十分困难。为克服这一弊病，构建ζ和CD16之间的嵌合体，其中CD16的胞外区连接于ζ的跨膜和胞内区(图7A)。该基因融合物被引入携带 E. coli gpt基因作为选择性标志的牛痘病毒表达质粒中，并通过同源重组一插入牛痘WR株基因组中并在霉酚酸中生长进行选择(Falkner和Moss，J.Virol.62：1849(1988)；Boyle和Coupar，基因(Gene)65：123(1988))。
用该牛痘重组体感染T细胞系，胞外区与抗体交联后测定相对胞质游离钙离子浓度。用以Indo-1染料染色的细胞进行荧光分光光度测量(大批量群体)，和流式细胞计数测定(单个细胞)(Grynkiewicz等人， 生物化学杂志260：3440(1985)；Rabinovitch等人， 免疫学杂志137：952(1986))。图7B表示从用表达CD16：ζ融合蛋白的牛痘重组体感染的Jurkat人T细胞白血病细胞系细胞收集的数值进行的分析。嵌合体交联可提高胞内钙，该结果可重复得到，而表达非嵌合体CD16的细胞相似处理，却效果甚小或根本无效果。若该嵌合体在缺失抗原受体的突变细胞系，即REX 33A(Breitmeyer等人， 免疫学杂 志138：726(1987)；Sancho等人， 生物化学杂志264：20760(1989))，或Jurkat突变体JRT3.T3.5(Weiss等人， 免疫学杂志135：123(1984)中表达，则可见对CD16抗体交联有很强应答。用本实验室构建的REX 20A(Breitmeyer等人前述文献(1987)；Blumberg等人， 生物化学杂志265：14036(1990))突变细胞系，和Jurkat细胞系的CD3/Ti阴性突变体，得到相似数据。用表达CD16：ζ的重组体感染，不会恢复对抗-CD3抗体的应答，这表明该融合蛋白不会借助挽救胞内CD3复合链而起作用。
为评估该嵌合体再指导细胞介导免疫力的能力，用表达CD16嵌合体的牛痘重组体感染CTL，并用于特异性溶解表达膜结合抗-CD16抗体的杂交瘤细胞。该检测法是原来开发出用于分析携带Fc受体的细胞的效应机理的杂交瘤胞毒性检测的扩展(Graziano和Fanger， 免疫学杂志138：945，1987；Graziano和Fanger， 免疫学杂志139：35-36，1987；Shen等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)26：959，1989；Fanger等人， 今日免疫学(Immunol.Today)10：92，1989)。图8B表明CD16：ζ在胞毒性T淋巴瘤中的表达，使得该装备的CTL可杀死3G8(抗CD16；Fleit等人， 国家学术研究规章USA79：3275，1982)杂交瘤细胞，而表达CD16磷酯酰肌醇连接型的CTL是非活性的。用CD16：ζ装备的CTL也不杀死表达不相关抗体的杂交瘤细胞。
为验明细胞溶解作用所需的最小ζ顺序，制备一系列缺失突变体，即从其羧基末端连续地不断增多地除去ζ胞内区(图8A)。大部分ζ胞内区均可除去而对细胞溶解能力无什么影响；全长度嵌合体CD16：ζ效力基本上等于删除至残基65的嵌合体CD16：ζAsp 66*(图8B)。删除ζ残基59(嵌合体CD16：ζ Glu60*)可发现胞毒性有很大下降，而进一步缺失至残基50，剩下很小活性。但是，即使胞内区减至三个残基的跨膜“锚”区时，也未观察到活性完全丧失(图8B)。
因为ζ是二硫键连接的二聚体，保留胞毒性的一个解释是，内源性ζ与嵌合ζ缺失体形成杂二聚体，由此重建其活性。为证实该观点，将ζ的残基11和15分别从Asp和Cys变成Gly(Gysll Gly/Asp15 Gly)，按如下所述进行免疫沉淀测定：将约2×106 CVl细胞在无血清DME培养基中，以感染复数(moi)至少为10的条件下，用重组牛痘病毒感染1小时。感染后6-8小时，用PBS/1mM EDTA将细胞从平板中冲下，并按Clark和Einfeld(LeukocyteTyping II，pp155-167，Springer-Verlag，NY，1986)的方法，使用乳过氧化物酶和H2O2，以每2×106个细胞用0.2 mci125I进行表面标记。离心收集该标记细胞，并裂解于1％NP-40、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.05M Tris(PH 8.0)、5mM MgCl2、4mM KCl、0.2M碘代乙酰胺和1mM PMSF中。离心除去细胞核，用抗体3G8(Fleit等人，前述文献，1982；Medarex)和抗-鼠IgG琼脂糖(Cappel，Durham，NC)将CD16蛋白进行免疫沉淀。样品于非还原条件下通过8％聚丙烯酰胺/SDS凝胶进行电泳，或于还原条件下通过10％凝胶电泳。这些免疫沉淀测定证明，CD16：ζCys 11Gly/Asp 15 Gly嵌合体不结合于二硫键连接的二聚体结构中。
也试验过突变受体的细胞溶解活性。缺失至残基65的突变嵌合体(CD16：ζCys11 Gly/Asp15 Gly/Asp 66*)与其相应的非突受嵌合体(CD16：ζAsp 66*)相比，其检测的细胞溶解活性要小2-8倍(视检测条件而异)，而所述非突变嵌合体(CD16：ζAsp 66*)的活性则通常是在CD16：ζ的2倍以内，或者与其差别不大(图9B)。该突变嵌合体活性的降低与相似结构(见上面)的CD4嵌合体所观察到的降低差不多，很可能是由于与二聚体比较，ζ单体的效力较低。相反地，缺失至残基59的Asp-、Cys-突变嵌合体不具细胞溶解活性(图9B)，这支持了这样的假说：由跨膜Cys和/或Asp残基介导的与其它链的结合，导致了若缺失比残基65更多的氨基末端后，细胞溶解活性仍有较弱保留。
流式细胞计数研究表明，缺失跨膜Asp和Cys残基的缺失突变体，仍可促进应答TCR-突变Jurkat细胞系中抗体交联时游离胞内钙离子的增加(图9D)。从亲代Jurkat细胞系中表达的嵌合体获得相似结果。在CD16：ζCys11Gly/Asp 15Gly/Glu 60*的情况下，这些数据表明，介导钙应答的能力，可通过突变与支持细胞溶解的能力分离开。
为了明确消除ζ跨膜残基的可能影响，ζ的跨膜和开始的17个胞质残基，分别由编码CD5或CD7抗原的跨膜区和开始14个或17个胞质残基的顺序所代替(图9A)。所得三合体融合蛋白CD16：5：ζ(48-65)和CD16：7：ζ(48-65)不形成如较简单的CD16：ζ嵌合体一样的二硫键连接的二聚体，因为在ζ跨膜区它们缺失半胱氨酸残基。两种三合嵌合体均能使Jurkat和TCR阴性细胞系中的钙活动(图9D)，并升高CTL的细胞溶解反应(图9C，数据未注明)。但是截去嵌合体CD16：7：ζ(48-59)中直至残基59处的ζ部分，则失去TCR阳性和阴性Jurkat细胞中的三合融合体指导钙应答的能力，或成熟CTL中细胞溶解的能力(图9C和9D，数据未注明)。
为测定18残基基元中个别残基的作用，我们采用定点突变技术制备一些突变体，并评价其在嵌合受体的低(图10A和10D)表达或高(图10B和10E)表达条件下，介导受体指导的杀伤作用的能力。图10A-F显示，在跨越59-63残基处，即使有一些相对保守的取代(即酸残基用其相应的酰胺取代，或酪氨酸用苯基丙氨酸取代)，只是适度损害细胞溶解效力，一般情况下各突变体保持活动钙能力。但是总的来说鉴于它们的缺失使得细胞溶解活性消失这些残基就成为重要的亚基元。将Tyr62变成Phe或Ser，细胞毒性及钙应答均失去。在该18残基片段的氨基末端用Phe代替Tyr51，既消除了钙活动化也消除了细胞溶解活性，而第50位用Ser代替Leu，则消除钙应答，但只部分损害细胞溶解性。没有局限于特定假说，我们猜测，有关leu 50 Ser失去活动钙的能力这种短期流动细胞计数分析得出的结果，并不完全反映跨越细胞溶解检测这一较长期间内，其介导胞内游离钙明显增加的能力。然而，已报道过一些细胞溶解T细胞系的细胞溶解的钙不敏感性，因此不能排除本文所述结果具有类似现象的可能性。用Ser取代Asn48部分损害某些实验中的细胞毒性，而对其它则效果较小。
为研究冗余顺序元件的潜在作用，将ζ胞内区分成三个片段，即分别跨越第33-65残基，第71-104残基，第104-138残基。每一片段均借助MluI位点连接于CD16：CD7嵌合体，该位点正好被导入CD7胞内区的基本膜锚着顺序的末端(见下面；图11A)。对三个元件细胞溶解效力进行比较发现它们基本上是等效的(图11B)。将其顺序进行比较(图11A)看出，第二基元的酪氨酸之间携载11个残基，而第一和第三基元携载10个。
虽然尚未精确说明T细胞活化作用的过程，但很清楚该过程包括抗原受体的聚集，或携载ζ胞内顺序的受体嵌合体的聚集，触发钙活动化作用，细胞分裂素及颗粒释放，以及出现代表活性作用的细胞表面标志。ζ的活性位点，一种短的线性肽顺序，可能太小而不具有本身的酶促活性，它很可能与一个，或最多与几个蛋白相互作用而介导细胞活化作用。也很清楚，游离钙的活动作用本身并不足以引起细胞活化，因为介导细胞溶解的能力可通过突变与介导钙积聚的能力分离开。
如本发明所述，将来自ζ胞内区的18个残基加入到两个不相关蛋白的跨膜和胞内区，使得所生成的嵌合体能再指导针对结合于该融合蛋白胞外部分的靶细胞的细胞溶解活性。尽管携载该18个残基基元的嵌合体比基于全长ζ的嵌合体活性要小约8倍，但降低的活性可归因于失去了正常情况下使野生型ζ形成二硫键连接的二聚体的跨膜相互作用的缘故。这就是说，具有同样羧基末端作为基元，并缺少跨膜CyS和Asp残基的ζ缺失构建体，比仅携载该18残基基元的嵌合体的活性一般只稍小些。
我们重点讨论的具细胞溶解能力的元件有二个酪氨酸，而无丝氨酸或苏氨酸，限制了磷酸化作用对活性的可能影响。但二酪氨酸之一若有突变，却破坏了活性，尽管初步的试验并未指明，携载该18残基基元的嵌合表面抗原交联之后有实质性酪氨酸磷酸化作用，但并不能排除有低水平的此种磷酸化作用参与的可能。除了已注意到的该两个酪氨酸的影响外，该基元在氨基和羧基末端的一些氨基酸替换后，在低受体密度条件下，均会削弱其活性。
相似于该ζ活性基元的顺序，在几种其它跨膜蛋白的胞质区也可发现，所述蛋白包括CD3δ和γ分子，表面IgM结合蛋白mbl和B29，以及高亲和性IgE受体的β和γ链，FcεRI(Reth， 自然338：383，1989)。虽然这些顺序的功能并不确定，但假如有效表达，均能自动起到T细胞活化作用，而此种活性正好可以解释ζ-阴性突变细胞系中所发现的残留TCR应答(Sussman等人， 细胞52：85，1988)。
ζ本身携载三个此种顺序，其间隔近似相等，而胞内区的大致三等分表明，其每分均能引发细胞溶解应答。η，一种ζ的拼接异型(Jin等人，前述文献，1990；Clayton等人， 国家学术研究规章USA 88：5202，1991)缺少第三基元羧基端的一半。因为若除去第一基元的羧基端之一半，活性便消失，因此看来，很可能η的生物效应主要归因于前两个基元。虽然通过不同测量，在促进抗原介导细胞分裂素释放(Bauer等人， 国家学术研究规章USA88：3842，1991)，或再指导细胞溶解方面(见前面)，η的活性与ζ相等，但η在应答受体刺激时并未被磷酸化(Bauer等人前述文献，1991)。因此，要么磷酸化作用要求三个基元都存在，要么第三个基元代表了未验明的酪氨酸激酶的最适底物。
实施例IX
通过人Fc受体的细胞溶解信号转导作用
为了评估不同人Fc受体亚型的作用，构建嵌合体分子，其中人CD4、CD5或CD6抗原的胞外区结合入FcRIIγA、B1、B2和C亚型的跨膜区和胞内区(Ravetch和Kinet的命名法， 免疫学年度评论(Ann.Rev.Immunol.)9：457，1991)。详细说来，即将相应于前述FcRIIA、B1和B2异型的跨膜和胞质区的cDNA顺序，从已有克隆PC23或从人扁桃体cDNA文库(由标准技术构建体)，使用下述合成寡核苷酸作引物进行扩增：
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT(SEQ ID NO：18：FcRII A正向)；
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTCGTT(SEQ ID NO：19；FcRII A反向)；
GCG GGG GGATCC CAC TGT CCAAGC TCC CAG CTC TTC ACC G(SEQ ID NO：20；FcRII B1和FcRII B2正向)；和
GCG GGG GCG GCC GCC TAAATACGG TTC TGG TC(SEQ ID NO：21；FcRII B1和FcRII B2反向)。这些引物，自5′端6个残基处分别含有酶BamHI和NotI切割位点。NotI位点后紧接着反义终止密码子CTA或TTA。所有引物含有互补于所需片段5′端和3′端的18个或更多残基。相应于FcRIIγC胞质区的cDNA片段，只有一个氨基酸残基(第268残基L代替P)与IIA异型不同，是采用重叠PCR法，通过定点突变而产生，所用引物顺序如下：
TCAGAAAGAGAC AAC CTG AAG AAACCAACAA(SEQ ID NO：22)和
TTG TTG GTT TCT TCAGGT TGT GTC TTT CTG A(SEQ ID NO：23)。该PCR片段插入分别含CD16或CD4胞外区的牛痘病毒表达载体，并随后通过胸苷激酶基因座重组而插入野生型牛痘病毒中，使用E.coli gpt共整合选择作用以便于所需重组体的识别。对所有异型的确认(示于图12)通过双脱氧测序进行。
嵌合受体蛋白的产生由免疫沉淀研究进一步得到证实。将约107个JRT3.T3.5细胞在无血清IMDM培养基中，按至少为10的感染复数，以重组中痘感染1小时。感染后12小时，收集细胞，并使用乳过氧化物酶/葡萄糖氧化酶法(Clark和Einfeld前述文献)，每107个细胞用0.5mCi125I标记其表面。离心收集标记细胞并溶解于1％NP-40，0.1mM MgCl2，5mM KCl，0.2M碘化乙酰胺和1mM PMSF中。离心除去细胞核，用抗体4G8和抗鼠IgG琼脂糖免疫沉淀CD16融合蛋白。样品于还原条件下电泳。所有免疫沉淀的嵌合受体分子有期望的分子量。
为试验该嵌合受体介导提高胞质中游离钙离子的能力，用该重组病毒感染TCR-突变体Jurkat细胞系JRT3.T3.5(如本文中所述)，受体胞外区与单克隆抗体3G8或Leu-3A(如本文所述)交联之后，于细胞中测定胞质游离钙(如本文所述)。这些实验表明，胞外区交联之后，FcRγIIA和C的胞内区能够介导胞质游钙离子增加，而在差不多的条件下FcRγIIB1和B2胞内区却无活性(图13A和B)。FcRγIIA的CD4、CD5及CD16杂合体具有基本相等的促使钙应答的能力(图13A-B)。来自单核细胞和淋细胞系的其它细胞系，能应答由胞外区交联引发的信号。
为探索不同FcRγII胞内区对细胞溶解作用的参与，将人胞毒性T淋巴细胞(CTL)用表达CD16：FcRγIIA、B1、B2和C嵌合体的牛痘重组体感染。将感染细胞与表达细胞表面抗CD16抗体的载51Cr杂交瘤细胞(即3G810-2细胞)共培养。对此进行检测表明，如果该嵌合体的CD16胞外区与能激活淋巴细胞效应过程的胞内片段结合，则携载CD16嵌合体的CTL会杀死杂交瘤靶细胞(使游离51Cr释放出)。该细胞溶解检测下面还要详述。图14A表示，装备有CD16：FcRγIIA和C，而无FcRγIIB1或B2的CTL能够溶解表达细胞表面抗-CD16抗体的靶细胞。
为了消除该特异性细胞溶解从某种程度上说应归因于与CD16部分相互作用这一可能性，进行FcRII胞内区与CD4胞外区相连接的细胞溶解实验。这种情况下，靶细胞是表达HIV被膜gp120/41蛋白的HeLa细胞(具体地说是用牛痘载体vPE16(取自National Institute of Allergy and Infections DiseaseAIDS Depository，Bethesda，MD)感染的HeLa细胞)。正如CD16体系一样，表达HIV被膜的靶细胞，对表达CD4：FcRγIIA嵌合体的T细胞引起的溶解敏感，而对表达FcRγIIB1或B2的T细胞引起的溶解不敏感(图14B)。
FcRγIIA和C的胞内区与任何其它蛋白，包括扩大的FcRγ/TCRζ家族成员，不享有明显顺序同源性。为定义对诱导细胞溶解起作用的顺序元件，制备胞内区编码顺序的5′和3′缺失物(下面叙述，示于图15A)，并评估其钙活动作用和细胞溶解测定的效力(如本文所述)。在除去胞内区的氨基末端部分的实验中，FcRγII的跨膜区用不相关的CD7抗原跨膜区代替，以消除由跨膜区介导的相互作用可能引起的效果。
图15B和15C表示，除去包括酪氨酸298在内的14个羧基末端残基，引起细胞溶解作用完全丧失，及钙活动能力的明显降低。进一步删除至紧邻酪氨酸282前面，得到相同的表现型(图15B和15C)。把胞内区N末端至第268残基处删除，对钙活动性或细胞溶解能力均无实质性影响，而若删除至275残基处则明显损害钙的释放，但对细胞溶解作用影响不大(图15D和15E)。进一步删除直至残基282，那么将得到失去钙活动能力也失去触发细胞溶解能力的FcRγII尾(图15D和15E)。从这些初步实验，定义的“活性元件”是相当大的(36个氨基酸)，并含由16个残基分隔开的二个酪氨酸。
实施例X
由携载不支持感染的嵌合CD4受体的淋巴细胞引起的靶细胞溶解作用
正如上面讨论过的，可以构建多种效应分子，这些分子能以MHC非依赖方式，重新指导CTL的细胞溶解活性。例如，在人CTL克隆WH3中，由CD4胞外区融合ζ链组成的嵌合体，能特异性杀死表现HIV-1表面被膜糖蛋白gp120的靶细胞。但是，因为CD4分子的胞外区赋予对HIV感染的敏感性，这样经装备的CTL可能会变成该病毒的攻击靶，结果使其能力降低(Dalgleish等人， 自然312：767(1984)；Klatzmann等人， 自然312：767(1984))。为避免这种后果，设计能特异性以HIV感染细胞为靶来进行细胞介导的杀伤，但又不赋予HIV感染敏感性的CD4为基的嵌合效应分子。
通过遗传并合CD4胞外区(图23)到人IgGl重链的绞链区、第二和第三恒定区(Zettlmeissl等人， DNA细胞生物学9：347(1990))(图25)，构建体三合融合蛋白，这种情况下，它首先合并于人膜结合IgGl的第一跨膜外显子部分，接着是由跨膜区后的唯一的类Ig区和终止转移顺序之间的顺序组成的人CD7抗原部分(Aruffo和Seed，EMBO J.6：3313(1987))(图26)。CD7片段胞外部分的一级氨基酸顺序由富脯氨酸区域组成，该区给出一种柄状结构，使得类Ig区从细胞表面突出来(Aruffo和Seed EMBO杂志6：3313(1987))(图26)。如本文所述制备重组牛痘病毒表达该片段及相关嵌合体。尤其是通过CV-1细胞中的同源重组来产生重组牛痘病毒。在CV-1细胞中要制备出高效价的群体，至少要先对每个群体用OKT4或Leu3a进行二次菌斑显影，接着进行菌斑纯化。
该三合嵌合体(CD4(D1-D4)：Ig：CD7)(图20，分子A)表现出有效细胞表面表达，并被进行以牛痘为基础的合胞体形成检测，以试验其作为HIV受体的能力(Lifson等人， 自然，323：725(1986))；Ashorn等人，J.Virol.64：2149(1990))。用编码HIV-1被膜糖蛋白的重组牛痘病毒(vPE16)感染的HeLa细胞(Earl等人， 病毒学杂志(J.Virol.)64：2448(1990))，与CD4，CD4：ζ，或CD4(D1-D4)：Ig：CD7任意之一感染的HeLa细胞共培养。50％汇合的6cm碟的HeLa细胞(ATCC，Rockville，MD)在无血清培养基中，以约为10的感染复数(MOI)感染1小时。再在完全培养基中将该细胞保温5-6小时，然后用含1mM EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS)将其洗下。表达被膜和CD4嵌合体的细胞以1∶1之比混合，加入完全培养基在6cm碟中再铺板。共培养6-8小时后对合胞体进行计数并拍照。
CD4和vPE16共培养导致易检测的多核巨大细胞的形成。同时，由CD4胞外区融合TCRζ链(图27)组成的嵌合体(CD4：ζ)也能介导合胞体形成，而表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7的细胞没有表现出细胞融合的迹象。因为另一文献中表明CD4的氨基末端的第一和第二区对于HIV的感染是必需的(Landau等人， 自然334：159(1988))，因此我们也试验了表达仅CD4第一和第二区(图24)，CD4(D1、D2)：Ig：CD7(图20、分子B)的构建体。同样也证明该分子对HIV诱导合胞体形成不敏感。与可溶性125I标记gp120的结合研究证实，CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7二者均具有对gp120很肯定的亲合性。
下一步我们测定了假如像本文所述赋予一个触发部分，是否能使抵抗合胞体形成的嵌合体分子能重新指导杀细胞作用。我们将ζ胞内区(图27)与CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7的3′端融合，并制备相应的重组牛痘病毒。将这些构建体CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ(图20、分子C和D)在人CTL克隆WH3中表达，并试验其攻击和杀死表达HIV表面被膜糖蛋白的HeLa细胞的能力(使用本文所述方法)。图21表示，ζ胞内区与CD4(D1-D4)：Ig：CD7或CD4(D1、D2)：Ig：CD7融合可以赋予其杀伤能力；而缺失ζ链的构建体则不能介导此种能力。阳性对照物CD4：ζ介导稍强的胞毒性，而CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ的胞毒性比CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ要小一些(图21)。但是很清楚，CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ嵌合体均能介导特异性杀死其表面表达HIV被膜蛋白的细胞。该四合嵌合体始终不能介导以牛痘为基础的检测中合胞体的形成。我们也证明图11A所示此种单个ζ基元足能赋予CD4(D1-D4)嵌合体细胞溶解活性。
放射免疫沉淀实验证明，该融合蛋白即使不全部是二聚体，也是二聚体占绝对多数。该实验中，用蛋白A琼脂糖珠免疫沉淀用表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ嵌合体的重组牛痘病毒感染的代谢性标记的HeLa细胞可溶性提取物。在还原和非还原条件下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将该免疫沉淀物分级。具体是，将约5×106 HeLa-S3细胞，用前面有关vPE16所述的适当牛痘病毒原始制备物感染。在半胱氨酸和蛋氨酸缺乏的培养基中，将该细胞用200μCi/ml Tran35S-标记物(ICN Radiochemicals，Irvine，CA)进行代谢性标记6-8小时，并用含1mM EDTA的PBS将其洗下。然后将细胞沉降并溶解于150mM NaCl，50mM Tris(pH7.5)、5mM EDTA、0.5％NP-40、0.1％SDS、5mM EDTA、1mM PMSF中。离心除去细胞核后，将每种细胞提取物的1/5吸附在经洗涤的蛋白A-偶联琼脂糖珠上2小时(4℃)。随后用含1％NP-40的PBS洗涤该珠，并在存在或不存在巯基乙醇的条件下，于含SDS的样品缓冲液中洗脱。实验结果证明，大多数免疫沉淀CD4(D1-D4)：Ig：CD7：ζ和CD4(D1、D2)：Ig：CD7：ζ嵌合体，在非还原条件下，以预期分子量的二聚体移动。
为了直接评价表达CD4融合分子的细胞支持HIV感染的能力，我们就表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7的转染子进行了长期感染研究。在293细胞的一种亚系(即人胚肾源的容易转染的细胞系)中制备CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7和CD4的稳定转染子。该嵌合分子被亚克隆进双向载体中，该载体中潮霉素B基因由单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子驱动。10cm碟的60-70％汇合的细胞，通过磷酸钙共沉淀作用，用10μg该质粒DNA转染。转染之前，将该质粒于单独SfiI位点进行线性化处理，并用T4DNA聚合酶使其端平齐。转染后24小时时，细胞被分裂四倍，转染后第48小时细胞被置于400μg/ml潮霉素B(Sigma，St.Louis，MO)选择条件下。每3-4天，该细胞中补充入含潮霉素的新鲜培养基。
挑选出抗性菌落，扩增，并使用荧光素-偶联抗人IgG Fc(OrganonTeknika，West Chester，PA)或Q4120的抗人CD4的抗体(Sigma)，通过间接免疫荧光测定法评估其表达，接着进行流式细胞计数(Coulter，Hialeah，FL)。从每个构建体中挑选出两个独立的其细胞表面CD4水平与其它细胞系显示出的水平差不多的克隆来进行分析。图22表示，暴露于HIV之后，早在感染后三天，便从CD4稳定转染子培养物中检测出p24来。这些培养物中，早在感染后5天，即明显存在多核巨大细胞以及气囊特征。而培养32天后，在未转染亲代细胞系，或CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7转染子的二个独立衍生分离物任意之一中，无显明P24水平，或无多核巨大细胞被检出的证据(图22)。
当完成感染研究时，分析细胞的细胞表面CD4表达。在表达CD4的感染培养物中，CD4表面表位密度明显降低，与病毒的向下调节作用一致，但在表达CD4(D1-D4)：Ig：CD7和CD4(D1、D2)：Ig：CD7的培养物中都无影响。这些实验证明，能够构建携载CD4头两个区的嵌合分子，若当其与T细胞受体ζ链融合时，能够攻击和杀死HIV感染细胞，但它却不支持CD4介导的HIV感染。
其它实验指出，正是CD4分子胞外区和脂质双层之间的物理距离，赋于其抗HIV感染能力。第一个实验中，我们构建了缺失CD7柄和跨膜区的嵌合分子；此种缺失除去了CD7跨膜部分的脯氨酸丰富区。当该区与CD4胞外区融合时，正如CD4分子细胞表面表达测定结果(如本文所述)所示，它保持其有效锚着CD4分子胞外区的能力。但是抗HIV被膜糖蛋白诱导的合胞体形成的能力却失去了。因此缺失CD7分子富脯氨酸区这一可能形成α螺旋结构的区域，有效地缩短了CD4胞外区和脂质双层之间的距离，从而丧失了嵌合体抵抗合胞体形成的能力。
第二个实验中，我们证明了抗HIV诱导的合胞体形成的能力可以赋予CD4/CD5嵌合体，从前曾记载该嵌合体用作CD4胞外区的跨膜锚着点，但它不能抵抗HIV诱导的合胞体的形成。该实验中，将人IgG1重链的铰链、CH2和CH3区插入CD4/CD5分子，所得嵌合体能抗合胞体形成，再一次表明由免疫球蛋白区给出的距离，足以赋予抗HIV-诱导的合胞体的形成的能力。
第三个实验中，使用不同长度的合成α螺旋，将CD4区从细胞膜延伸不同的距离。具体是，设计代表由两个丙氨酸侧接的赖氨酸和谷氨酸残基的重复α螺旋基元的合成寡核苷酸(见图28的核酸和氨基酸一级顺序)。从前面的研究看出，此种氨基酸顺序在α螺旋中出现的频度很高，这暗示此种重复基元将采用α螺放构象，放置这样的α螺旋在CD4的跨膜区和胞外区之间，将使CD4从细胞膜向外突出。通过改变α螺旋片段的长度，抗HIV感染所需突出距离的计算值可根据α螺旋圈高和圈数的已知值得出。这些结果列入表1。
表1
合胞体形成     Thy-1表达
  A.    CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk     -     -
  B.    CD4(D1，D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk     -     -
C.    CD4+CD7tm+stk +/(·) +
D.    CD4+CD7tm(长型) + +
E.    CD4+CD7tm (短型) + +
F.    CD4+CD5tm + +
  G.    CD4+CH2+CH3+CD5tm     -     -
H.    CD4+CH3+CD5tm - 没有检测
I.    CD4+CD34tm + +
  J.    CD4+合成α螺旋(24    埃       )+CD34tm     没有检测     +
  K.    CD4+合成α螺旋(48    埃       )+CD34tm     没有检测     +/-(·)
  L.    CD4+合成α螺旋(72    埃       )+CD34tm     没有检测     -
·合胞体或thy-1表达细胞有实质性下降。
该表中，除非另有说明“CD4”代表CD4(D1-D4)；“H”、“CH2”、“CH3”分别代表人IgG1重链的铰链、CH2、和CH3区；“CD7 tm和stk”代表CD7跨膜和柄区；“CD7tm(长型)”和“CD7tm(短型)”分别代表CD7跨膜区和缺失富脯氨酸区(如上面讨论过的)的CD7跨膜区；“CD5tm”代表CD5跨膜区；而“CD34 tm”代表CD34跨膜区，J-L各条目中α螺旋区的长度用“埃”表示；这些值是根据α螺旋每圈3.6个残基，相当于5.4A(或每个残基1.5A)这一事实得出的。因此，16个残基的α螺旋应使CD4胞外区突出约24埃。48和72Aα螺旋是将BstY1片段连到该片段的唯一BamH1位点的连续联接构建体(见图28)，接着挑选出具适当取向的克隆。
与表达来自牛痘病毒vPE-16构建体(见上面)的HIV-1被膜糖蛋白的HeLa细胞进行共培养检测来计数形成的合胞体。
Thy-1表达按下述方法测定。根据HIV-1的hxb.2克隆构建活的反转录病毒载体。该载体中，非必需nef基因由大鼠thy-1编码顺序代替，所述thy-1，即由磷酯酰肌醇连接锚定于膜的有效表达的细胞表面分子。衍生于该分子克隆的病毒称之为hxb/thy-1，由其细胞病理学效应和由感染C8166细胞(人CD4+白血病T细胞系)的培养上清液中产生p24，作为其感染性的证据。此外，一旦暴露于该hxb/thy-1，HeLa细胞立刻被CD4转染，显示出早在感染后18小时便有thy-1表达的迹象，正如预料的以类似nef方式调节的信息一样。由nef基因编码的信息正常情况下落入多重拼接和缺失rev-应答元件的一类病毒调节蛋白之中。这些信息可以组成性地积聚于胞质中，作为早期病毒基因产物。预料该thy-1信息将受到相似的调节，即出现于病毒生活周期的早期。简言之，可将thy-1表达作为病毒进入的指示，该体系便利了HIV进入的检测。使用标准DEAE-葡聚糖法，将以CD4为基础的各种嵌合体瞬间转染进HeLa细胞中。转染后48小时，将该转染细胞暴露于hxb/HIy-1病毒，并在感染后24-48小时评估其thy-1表达。示于表1中的结果，使用市售Thy-1单克隆抗体(Accurate)，于感染后24小时测量到了HIy-1的表达。
从表1所列数据，我们得出结论，CD4胞外区最好应突出细胞膜至少48A，优选至少72A，以抵抗HIV-1感染。
使用相似于本文上述的一般策略，可以构建以HIV-感染细胞为攻击目标的基于抗HIV被膜抗体的嵌合体。此种抗体的例子描述于Gorny等人的国家学术研究规章USA86：1624(1989)和Marasco等人，J.Clin.Invest.90：1467(1992)中。
实施例XI
其它的T细胞受体和B细胞受体触发蛋白
其它根据本发明的胞内和跨膜信号转导区可以衍生自T细胞受体蛋白：CD3 delta和T3 gamma，以及B细胞受体蛋白：mb1和B29。这些蛋白的氨基酸顺序示于图16(CD3 delta；SEQ ID NO：24)，图17(T3 gamma；SEQ ID NO：25)，图18(md1；SEQ ID NO：26)和图19(B29；SEQ ID NO：27)。足以完成细胞溶解信号转导的这些顺序部分(因此优选包括在本发明的嵌合受体中)用括号注明。如上所述，构建包括这些蛋白区域的嵌合受体，并用于上文描述的本发明的治疗法中。
实施例XII
实验方法
牛痘感染和放射免疫沉淀测定
将约5×106CV1细胞在无血清DME培养基中，用重组牛痘病毒以至少10(用CV1细胞所测效价)的感染复数(moi)使其感染。感染后将该细胞放入新鲜培养基中，并在无蛋氨酸和半胱氨酸DMEM(Gibco；Grand Island，NY)中用200μCi/ml35S-蛋氨酸加半胱氨酸(Tran35S-标记物，ICN；Costo Mesa，CA)进行代谢标记6小时。用含1mM EDTA的PBS洗下经标记的该细胞，离心收集并溶解于1％NP-40、0.1％SDS、0.15NaCl、0.05MTris(pH8.0)、5mM EDTA和1mM PMSF。离心除去细胞核，用OKT4抗体和抗鼠IgG琼脂糖(Cappel，Durham，NC)使CD4蛋白免疫沉淀。在非还原(NR)和还原(R)条件下将样品通过8％聚丙烯酰胺/SDS凝胶进行电泳。将含35S-标记样品的凝胶在进行放射自显影前用En3Hance(New England Nuclear，Boston，MA)浸渗。将用CD16TM单独感染的CV1细胞中的表达，同用编码CD16TM和ζ或γ嵌合体的病毒共感染的细胞中的表达进行比较，测定出CD16跨膜型，即CD16TM的表达。感染和孵育6小时或更长时间后，用PBS，1mM EDTA将细胞从板上洗下，并用间接免疫荧光法和流式细胞计数法测定CD16TM或嵌合体的表达。
钙流动检测
在无血清IMDM中，以moi为10的条件，用重组牛痘病毒感染Jurkat亚系E6(Weiss等人， 免疫学杂志133：123-128(1984))1小时，并在IMDM，10％FBS中培养3-9小时。离心收集细胞，并将其再悬浮于含1mM Indo-1乙酸甲氧酯(Grynkiewicz等人， 生物化学杂志260：3340-3450(1985))(分子探针Molecular Probes)的完全培养基中，该悬浮液浓度3×106个细胞/ml，并于37℃保温45分钟。将该带有Indo-1的细胞胞沉降并以1×106/ml浓度再悬浮于无血清IMDM中，并于室温下暗室存放。采用流式细胞计数器，通过同时测定紫色和兰色荧光发射分析细胞的游离钙离子(Rabinovitch等人，免疫学杂志137：952-961(1986))。为了引发钙流动，将藻红素(PE)偶联的Leu-3A(抗CD4)(Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)，以1μg/ml的量加入到细胞悬浮液中，接着加入10μg/ml非偶联山羊抗鼠IgG(此时时间设为0)，或者按1μg/ml的量加入未偶联的3G8(抗CD16)单克隆抗体到该悬浮液中，接着加入10μg/ml PE偶联的Fab2′山羊抗鼠IgG(时间设为0)。从PE阳性(感染的)细胞群体得到紫色/兰色发射比例的柱状图，所述阳性群体一般代表所有细胞的40-80％。T细胞抗原受体在未感染细胞的应答由抗体OKT3触发，不交联。对于涉及CD16嵌合受体的实验，从分析中排除有基线朝较低胞内钙漂移表现(不带抗体)的样品。使用Write HandMan(Cooper City；FL)软件，通过将二进制数据转换成ASCII，然后分析柱状图数据，接着进行FORTRAN程序分析。将加入第二种抗体试剂以前的紫色/兰色发射比率，用于确立标准化原始比例，设其等于一个单位，而静息临界比例的设置，要使静息群体的10％超过该临界值。
细胞溶解分析
将人T细胞系WH3，一种CD8+CD4-HLA B44限制性细胞溶解细胞系，保持在IMDM，带有100U/ml IL-2的10％人血清中，通过辐射的(3000rad)HLA未配对外周血淋巴细胞和1μg/ml植物血球凝集素进行非特异性周期性刺激，或辐射的携载B44的单核细胞进行特异周期性刺激。非特异性刺激一天之后，加入新鲜培养基，将PHA稀释至0.5μg/ml，三天之后更换培养基。刺激后细胞生长至少10天再用于胞毒性检测。在无血清培养基中，以至少10的感染复数，用重组牛痘病毒感染该细胞1小时，接着在完全培养基中培养3小时。离心收集细胞，以1×107细胞/ml的密度再配成悬浮液。将其100μl加入完全培养基(100μl/孔)的U形底微量滴定板各孔中。将细胞进行两倍系列稀释。每种样品有两孔不含淋巴细胞，以测定其自发释放铬和吸收的总铬量。在无血清培养基中，将来自HeLa亚系S3的靶细胞，以约为10的moi，在6.0或10.0cm平皿中感染1小时，接着在完全培养基中培养3小时。然后用PBS、1mM EDTA将其从平皿中洗下，并计数。将106靶细胞等分样(HeLa，Raji或RJ2.2.5细胞用于CD4嵌合受体实验，而3G810-2细胞(Shen等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)26：959(1989))用于CD16嵌合受体实验)离心处理，并于37℃，伴随间歇式混合将其再悬浮于50μl无菌51Cr-铬酸钠(1mCi/ml，Dupont Wilmington，DE)中1小时，然后用PBS洗三次。以105个细胞/ml的量再悬浮于培养基中的经标记的细胞，以100μl加于各孔中。Raji和RJ2.2.5靶细胞，以和HeLa细胞相同方式进行标记。该微量滴定板于750×g转速下旋转1分钟，并于37℃保温4小时。培养结束，通过轻柔吹吸使各孔中细胞再呈悬浮状态，移出样品测定结合的总数，并将该平板于750×g下再旋转1分钟。取出100μl上清液等分样在γ射线闪烁计数器上计数。杀死的百分率要针对相应于由流式细胞计数测量的感染靶细胞百分数(一般50-90％)校准。对于感染的效应细胞而言，效应物：靶的比例，要针对相应于细胞感染的百分数(CD4嵌合受体实验一般为20-50％，CD16嵌合受体实验通常＞70％)而校准。
ζ顺序的体外突变
为创立ζ顺序的残基11和/或残基15的点突变，制备从ζ跨膜区上游的BamHI位点延伸的，并将天然ζ残基11从Cys变成Gly(C11G)，或残基15从Asp变成Gly(D15G)，或两残基均变换(C11G/D15G)的合成寡核苷酸引物，并用于PCR反应，产生突变片段，再插入野生型CD4：ζ构建体。
为建立ζ缺失体，使用在残基50，59或65后设计创立终止密码子(UAG)的合成寡核苷酸引物，通过PCR反应使ζcDNA顺序扩增。该引物自5′端5或6个残基处含酶NotI裂解位点，其顺序通常是CGC GGG CGG CCG CTA(SEQ ID NO：11)，其中后三个残基相应于终止反密码子。NotI和终止反密码子顺序随后是互补于片段所需3′端的18个或更多残基。所得嵌合体分别称为CD16：ζY51*，CD16：ζE60*和CD16：ζD66*。跨膜区上游的BamHI位点和NotI位点用于产生再导入野生型CD16：ζ构建体的片段。如通过上面所述Asp-和Cys-CD4：ζ构建体的BamHI和SacI消化，释放ζ跨膜和膜接近胞内顺序，并将该片段分别插入CD16：ζ E60*和CD16：ζD66*构建体来构建单体ζ嵌合体。
CD16：7：ζ(48-65)和CD16：7：ζ(48-59)三合嵌合构建体
为构建CD16：ζD66*构建体，将相应于跨膜区和接着的胞质区17个残基的ζcDNA顺序，用从CD5和CD7 cDNA获得的相应跨膜区和胞质区替换。使用包括BamHI限制裂解位点并相应于正好分别是CD5和CD7跨膜区上游区域的正向寡核苷酸，和下面的分别与CD5和CD7重叠并含SacI限制裂解位点的ζ顺序反向寡核苷酸作引物，进行PCR反应产生CD5和CD7片段。
CD5：ζ：CGC GGG CTC GTT ATAGAG CTG GTT CTG GCG CTG CTTCTT CTG(SEQ ID NO：12)
CD7：ζ：CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGCCGAATT CTT ATC CCG(SEQ ID NO：13)。用BamHI和SacI消化CD5和CD7PCR产物，并连接到BamHI和SacI消化的CD16：ζ E60*上，并用CD7片段代替ζ顺序的BamHI到SacI一段。为制得构建体CD16：CD5和CD16：CD7，使用含NotI限制裂解位点，和分别编码CD5和CD7的残基Gln416和Ala 193后终止密码子(UAA)的寡核苷酸进行PCR反应，获得CD5和CD7片段。用BamHI和NotI消化CD5和CD7 PCR片段，并插入CD16：ζAsp 66*构建体中。
ζ细胞溶解信号转导基元中的N末端残基体外突变。
合成从ζ基元内SacI位点延伸，并将残基48从Asn变为Ser(N48S)，残基50从Leu变成Ser(L50S)，及残基51从Tyr变成Phe(Y51F)的合成寡核苷酸引物，并用于PCR反应，产生再导入野生型CD16：7：ζ(48-65)构建体中的片段。
ζ细胞溶解信号转导基元中的C末端残基体外突变
合成从终止密码子3′端的NotI位点延伸的，并将天然残基60从Glu变成Gln(E60Q)，残基61从Glu变成Gln(E61Q)，残基62从Tyr变成Phe或Ser(Y62F或Y62S)，以及残基63从Asp变成Asn(D63N)的合成寡核苷酸引物，并用于PCR反应，产生从BamHI位点到NotI位点亚克隆进野生型CD16：ζD66*构建体的片段。
CD16：7：ζ(33-65)，CD16：7：ζ(71-104)、CD16：7：ζ(104-137)嵌合体的构建。
在跨膜区与胞内区之间的连接处携载MluI和NotI位点的CD7跨膜片段，使用下面顺序的寡核苷酸进行PCR反应获得：
CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA(SEQ ID NO：14)。用BamHI和NotI消化所得的PCR片段，并再插进CD16：7：ζ(48-65)构建体中。编码残基33-65，71-104，104-137的ζ片段，使用正向引物在5′端含MluI位点，和反向引物5′端含终止密码子接NotI位点的一对引物进行PCR反应获得。每种情况下均使限制位点距引物5′端6个残基，保证限制性酶的裂解作用。
ζ33：CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA(SEQ ID NO：15)；
ζ71：CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGAAAG(SEQID NO：16)；和
ζ104：CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAAGGC GAG CGC(SEQID NO：17)。
FcRγIIA缺失突变体的构建
如全长构建体一样的方式，由PCR构建羧基末端FcRγIIA缺失突变体，转换编码282位和298位酪氨酸的顺序为终止密码子(TAA)。使用能使所得片段于MluI和NotI限制位点之间，插进前面构建的编码融合于CD7跨膜区的CD16胞外区(所述CD7跨膜区终止于跨膜区和胞内区之间连接处前面的MluI位点)的表达质粒内的寡核苷酸作引物，通过PCR反应，将编码连续缺失胞内区的片段扩增，产生N-末端缺失体。
其它实施方案
从上述实施例证明，ζ，η或γ嵌合体聚集足能引发T细胞中细胞溶解效应细胞的应答。ζ，η和γ的已知表达范围，包括T淋巴细胞，天然杀伤细胞，嗜碱性粒细胞，巨噬细胞和肥大细胞在内，表明保守的顺序基元，可以和与造血细胞起源的细胞共同的感受器相互作用，并且免疫系统中，宿主抵抗力的重要成份，可以由受体聚合作用介导。
细胞溶解应答的能力，以及对携带MHCII类受体的靶细胞的应答缺乏，  证明以ζ，η或γ为基础的嵌合体，构成了通过过继免疫治疗来遗传干预爱滋病的基础。内源ζ和γ的广泛分布，以及Fc受体与γ结合在不同类型细胞中介导细胞毒性的证据(Fanger等人， 今日免疫学10：92-99(1989))，使得为此目的可考虑很多种不同细胞。例如嗜中性粒细胞，在循环系统中它的寿命很短(约4小时)，而有很强细胞溶解性，是用以表达所述嵌合体很吸引人的靶细胞。嗜中性白细胞受HIV感染很可能不会引起病毒释放，而这些细胞的丰富存在(即白细胞中最“多”)应当有利于宿主的抵抗力。另一种吸引人的可能的宿主细胞是成熟T细胞，它是一种现在可以进行病毒工程处理的种群(Rosenberg，S.A.Sci.Am.262：62-69(1990))。借助重组IL-2的帮助，T细胞群体可以相对容易地进行培养扩增，扩增的群体一般输回后寿命有限(Rosenberg等人，新英格兰医学杂志323：570-578(1990))。
在适当条件下，由表达CD4嵌合体的细胞识别HIV，也应当提供促有丝分裂刺激，给与装备的细胞群体可以高效能应答病毒载荷的可能性。虽然我们在本文中主要集中讨论细胞溶解性T淋巴细胞中融合蛋白的行为，但该嵌合体在辅助淋巴细胞中的表达，也可以提供HIV调动的细胞分裂素源，所述细胞分裂素在爱滋病中可以抵抗辅助细胞亚群体的崩溃。设计在病毒穿透步骤之外的其它步骤抵抗感染的几种途径的最新介绍(Friedman等人， 自然335：452-454(1988)；Green等人， 细胞58：215-223(1989)；Malim等人， 细 胞58：205-214(1989)；Trono等人， 细胞59：113-120(1989)；Buonocore等人， 自然345：625-628(1990))表明，携载CD4嵌合体的细胞可以被设计表达具有胞内作用位点的适当因子来阻止病毒的产生。
通过自主性嵌合体将信号转移到T淋巴细胞的能力，也提供体内反转录病毒工程淋巴细胞的调节能力。交联刺激，例如由设计的除去补体结合区的特异性IgM抗体介导的刺激，可使此种淋巴细胞在原位的数量增加，而用相似特异性IgG抗体处理(例如识别设计进嵌合链中的氨基酸突变)则可选择性地耗尽设计制造的该群体。此外，抗-CD4 IgM抗体不要求附加的交联来使表达CD4：ζ嵌合体的Jurkat细胞中钙活动。不依赖反复体外扩增来调节细胞群体的能力，可以大大拓宽遗传工程T细胞目前的应用范围和效力。
虽针本发明已结合其特定实施方案加以介绍，但应了解，它还可以进一步加以调整，而本申请包括本发明的变化，应用或修改，并且包括纳入本发明所从属领域的所谓“偏离”本文公开的内容，像可以适用于本文前述基本特征一样，也适用于所附权利要求的范围。
顺序表
(1)一般资料
(i)申请人：Seed，Brian等人
(ii)发明题目：由携载嵌合CD4受体的细胞针对HIV感染细胞的细胞溶解作用
(iii)顺序数量：27
(iv)通信地址：
(A)收信人：Fish和Richardson
(B)街道：225 Franklin Street
(C)城市：Boston
(D)州：MA
(E)国家：USA
(F)邮政编码：02110-2804
(V)计算机可读形式：
(A)媒介类型：3.5″Diskette，1.44Mb
(B)计算机：IBM PS/2 Model 50Z或55SX
(C)操作系统：IBM PC.DOS(Version 3.30)
(D)软件：Wordperfect(Version 5.0)
(Vi)现申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：
(vii)先前申请资料：
(A)申请号：07/847566
(B)申请日：1992年3月6日
(C)分类：
(vii)先前申请资料：
(A)申请号：07/665961
(B)申请日：1991年3月7日
(C)分类：
(viii)代理人/代理机关资料
(A)姓名：Clark，Paul T.
(B)注册号：30162
(C)委托号/案号：00786/212001
(ix)电信通讯资料：
(A)电话：(617)542-5070
(B)传真：(617)542-8906
(C)电报：200154
(2)有关SEQ ID NO：1的资料
(i)序列特征
(A)长度：1728个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC      50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG     100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA     150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC     200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA     250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG     300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA     350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC     400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC     450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA     500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT     550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG     600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA     650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG     700
GCAGTGGGGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT     750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC     800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC     850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC     900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT     950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA    1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG    1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT    1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA    1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC    1200
TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC    1250
CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC    1300
TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG    1350
GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG    1400
CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC    1450
AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG    1500
AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA    1550
AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA    1600
GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT    1650
AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG    1700
GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA                            1728
(2)有关SEQ ID NO：2的资料
(i)序列特征
(A)长度：1389个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC      50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG     100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA     150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC     200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA     250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG    300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA    350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC    400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC    450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA    500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT    550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG    600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA    650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG    700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT    750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC    800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC    850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC    900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT    950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA   1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG   1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT   1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA   1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC   1200
TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT   1250
GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC   1300
GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG   1350
ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG               1389
(2)有关SEQ ID NO：3的资料
(i)序列特征
(A)长度：1599个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC      50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG     100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCSTACAA     150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC     200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA     250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG     300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA     350
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC     400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC     450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA     500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT     550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG     600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA     650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG     700
GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT     750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC     800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC     850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC     900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT     950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA    1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG    1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT    1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA    1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC    1200
TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC    1250
CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC    1300
AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG    1350
GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG    1400
AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA    1450
AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC    1500
CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC    1550
CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA     1599
(2)有关SEQ ID NO：4的资料
(i)序列特征
(A)长度：575个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(XI)序列描述：SEQ ID NO：4
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
  1               5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
             20                  25                  30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
         35                  40                  45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
     50                          55          60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
                85                   90                  95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
            100                 105                         110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
        115                 120                 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
    130                 135                 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
                165                 170                 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
            180                 185                 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225                 230                 235                 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
                245                 250                 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
            260                 265                 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
        275                 280                 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305                 310                 315                 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
                325                 330                 335
Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
            340                 345                 350
Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
        355                 360                 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
    370                 375                 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu
385                 390                 395                 400
Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val  Ile Ile Thr
                405                 410                  415
Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala
            420                 425                 430
Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
        435                 440                 445
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu
    450                 455                 460
Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr
465                 470                 475                 480
Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Pro Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
                485                 490                 495
Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
            500                 505                 510
Asp Ser His Phe Gln Ala Val Gln Phe Gly Asn Arg Arg Glu Arg Glu
        515                 520             525
Gly Ser Glu Leu Thr Arg Thr Leu Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly
    530                 535                 540
Glu Ser Thr Gln Gln Ser Ser Gln Ser Cys Ala Ser Val Phe Ser Ile
555                 550                 565                 560
Pro Thr Leu Trp Ser Pro Trp Pro Pro Ser Ser Ser Ser Gln Leu
                565                 570                 575
(2)有关SEQ ID NO.5的资料
(I)序列特征
(A)长度：462个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO.5
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
  1               5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
             20                  25                  30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
         35                  40                  45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
     50                  55                  60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
                 85                  90                  95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
            100                 105                 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
        115                 120                 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
    130                 135                 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
                165                 170                 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
            180                 185                 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
    210                 215                 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225                 230                 235                 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
                245                 250                 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
            260                 265                 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
        275                 280                 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305                 310                 315                 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
                325                 330                 335
Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
            340                 345                 350
Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
        355                 360                 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
    370                 375                 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gln Leu
385                 390                 395                 400
Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr
                405                 410                 415
Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Asp Ile Ala
            420                 425                 430
Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn
        435                 440                 445
Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
    450                 455                 460     462
(2)有关SEQ ID NO：6的资料
(i)序列特征
(A)长度：532个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
  1               5                  10                  15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys
             20                  25                  30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
         35                  40                  45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
     50                  55                  60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Ash Asp Arg Ala
 65                  70                  75                  80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe  Pro Leu Ile Ile
                 85                  90                   95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
            100                 105                 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
        115                 120                 125
Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
    130                 135                 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145                 150                 155                 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
                165                 170                 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
            180                 185                 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
        195                 200                 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
    210                  215                220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225                 230                 235                 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
                245                 250                 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
            260                 265                 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
        275                 280                 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
    290                 295                 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305                 310                 315                 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
                325                 330                 335
Lye Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
            340                 345                 350
Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
        355                 360                 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
    370                 375                 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu
385                 390                 395                 400
Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr
                405                 410                 415
Ala Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala
            420                 425                 430
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
        435                 440                 445
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
    450                 455                 460
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
465                 470                 475                 480
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
                485                 490                 495
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
            500                 505                 510
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
        515                 520                 525
 Leu Pro Pro Arg
     530
(2)有关SEQ ID NO：7的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7
CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC
(2)有关SEQ ID NO：8的资料
(i)序列特征
(A)长度：50个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8
CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA
(2)有关SEQ ID NO：9的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9
CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC
(2)有关SEQ ID NO：10的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个破基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10
CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG
(2)有关SEQ ID NO：11的资料
(i)序列特征
(A)长度：15个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11
CGCGGGCGGC CGCTA
(2)有关SEQ ID NO：12的资料
(i)序列特征
(A)长度：42个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12
CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG
(2)有关SEQ ID NO：13的资料
(i)序列特征
(A)长度：48个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13
CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG
(2)有关SEQ ID NO：14的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14
CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA
(2)有关SEQ ID NO：15的资料
(i)序列特征
(A)长度：36个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15
 CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA
(2)有关SEQ ID NO：16的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16
CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG
(2)有关SEQ ID NO：17的资料
(i)序列特征
(A)长度：33个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17
 CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC
(2)有关SEQ ID NO：18的资料
(i)序列特征
(A)长度：26个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18
CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT
(2)有关SEQ ID NO：19的资料
(i)序列特征
(A)长度：42个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19
CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT
(2)有关SEQ ID NO：20的资料
(i)序列特征
(A)长度：30个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20
GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG
(2)有关SEQ ID NO：21的资料
(i)序列特征
(A)长度：32个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21
GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC
(2)有关SEQ ID NO：22的资料
(i)序列特征
(A)长度：31个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22
TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A
(2)有关SEQ ID NO：23的资料
(i)序列特征
(A)长度：31个碱基
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23
TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A
(2)有关SEQ ID NO：24的资料
(i)序列特征
(A)长度：171个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
                5                   10                  15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
            20                  25                  30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
        35                   40                  45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
    50                  55                  60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65                  70                  75                  80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
                85                  90                  95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
            100                 105                 110
Ala Ile Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
        115                 120                 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
    130                 135                 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Ser His Leu Gly Gly AsnTrp Ala Arg Asn Lys
                165                170
(2)有关SEQ ID NO：25的资料
(i)序列特征
(A)长度：182个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
                5                   10                  15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
            20                  25                  30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
        35                  40                  45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
    50                  55                  60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
                85                  90                  95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
            100                 105                 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
        115                 120                 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
    130                 135                 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
                165                 170                 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
            180
(2)有关SEQ ID NO：26的资料
(i)序列特征
(A)长度：220个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26
Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe
                5                   10                  15
Leu Ser Tyr Ala Cys Leu Gly Pro Gly Cys Gln Ala Leu Arg Val Glu
            20                  25                  30
Gly Gly Pro Pro Ser Leu Thr Val Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Leu
        35                  40                  45
Thr Cys Glu Asn Asn Gly Arg Asn Pro Asn Ile Thr Trp Trp Phe Ser
    50                  55                  60
Leu Gln Ser Asn Ile Thr Trp Pro Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gln
65                  70                  75                  80
Gly Thr Thr Gly Gln Leu Phe Phe Pro Glu Val Aan Lys Asn Thr Gly
                85                  90                  95
Ala Cys Thr Gly Cys Gln Val Ile Glu Asn Asn Ile Leu Lys Arg Ser
            100                 105                 110
Cys Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg Asn Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu
        115                 120                 125
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile
    130                 135                 140
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val Pro Gly Thr Leu Leu Leu Phe Arg
145                 150                 155                 160
Lys Arg Trp Gln Asn Glu Lys Phe Gly Val Asp Met Pro Asp Asp Tyr
                165                 170                 175
Glu Asp Glu Asn Leu Tyr Glu Gly Leu Asn Leu Asp Asp Cys Ser Met
            180                 185                 190
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu Gln Gly Thr Tyr Gln Asp Val Gly
        195                 200                 205
Asn Leu His Ile Gly Asp Ala Gln Leu Glu Lys Pro
    210                 215                 220
(2)有关SEQ ID NO：27的资料
(i)序列特征
(A)长度：288个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：氨基酸
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27
Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Met Pro Cys His Trp Leu Leu Phe
                5                   10                  15
Leu Leu Leu Leu Phe Ser Gly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Ser Ser
            20                  25                   30
Asp Leu Pro Leu Asn Phe Gln Gly Ser Pro Cys Ser Gln Ile Trp Gln
        35                  40                  45
His Pro Arg Phe Ala Ala Lys Lys Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His
    50                  55                  60
Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys Arg Gly
65                  70                  75                  80
Ser Gln Gln Pro Gln Glu Leu Val Ser Glu Glu Gly Arg Ile Val Gln
                85                  90                  95
Thr Gln Asn Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ile Gln Asn Ile Gln Tyr
            100                 105                 110
Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gln Lys Cys Asp Ser Ala Asn
        115                 120                 125
His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe
    130                 135                 140
Ser Thr Leu Asp Gln Leu Lys Arg Arg Asn Thr Leu Lys Asp Gly Ile
145                 150                 155                 160
Ile Leu Ile Gln Thr Leu Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val Pro Ile
                165                 170                 175
Phe Leu Leu Leu Asp Lys Asp Asp Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp
            180                 185                 190
His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn Ile Asp Gln Thr Ala Thr Tyr Glu Asp
        195                 200                 205
Ile Val Thr Leu Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Glu His
    210                 215                 220
Pro Gly Gln Glu
225

Claims (9)

1、一种治疗细胞，包含DNA，该DNA编码蛋白质膜结合嵌合受体，该受体包含(a)含有能特异性识别和结合所述HIV感染细胞，但不介导HIV感染的CD4片段的胞外部分，其中所述CD4片段包含SEQ IDNO：29的第1-394位氨基酸，或SEQ IDNO：31的第1-200位氨基酸，其中所述CD4片段同所述治疗细胞的细胞膜由下述部分分隔开来至少48埃，所述部分包含CD7跨膜区、CD5跨膜部分、CD34跨膜部分、一个或多个蛋白质α螺旋、或人IgG1分子的绞链、CH2和CH3区，和(b)能给所述细胞以信号，使之破坏受体结合的HIV感染细胞的胞内部分，其中该胞内部分是T细胞受体蛋白、B细胞受体蛋白或Fc受体蛋白的信号转导部分。
2、权利要求1的治疗细胞，其中所述CD4片段同所述治疗细胞的细胞膜分隔开来至少72埃。
3、权利要求1的治疗细胞，其中所述CD4片段，由SEQ IDNO：35的CD7跨膜区，或由SEQ IDNO：33的人IgG1分子的绞链、CH2和CH3区，同所述胞内部分分隔开来。
4、权利要求1的治疗细胞，其中所述T细胞受体蛋白是ζ。
5、一种DNA，其编码蛋白质膜结合嵌合受体，该受体包含(a)含有能特异性识别和结合所述HIV感染细胞，但不介导HIV感染的CD4片段的胞外部分，其中所述CD4片段包含SEQ IDNO：29的第1-394位氨基酸，或SEQIDNO：31的第1-200位氨基酸，其中所述CD4片段同细胞膜由下述部分分隔开来至少48埃，所述部分包含CD7跨膜区、CD5跨膜部分、CD34跨膜部分、一个或多个蛋白质α螺旋、或人IgG1分子的绞链、CH2和CH3区，和(b)能给所述细胞以信号，使之破坏受体结合的HIV感染细胞的胞内部分，其中该胞内部分是T细胞受体蛋白、B细胞受体蛋白或Fc受体蛋白的信号转导部分。
6.权利要求5的DNA，其中所述CD4片段同细胞膜分隔开来至少72埃。
7、含有权利要求5或6的嵌合受体DNA的载体。
8、权利要求1至4中任一项的治疗细胞在制备用于指向哺乳动物体内针对HIV感染的细胞免疫应答的药物组合物中的用途。
9、权利要求8的用途，其中所述治疗细胞选自下述一类细胞：(a)T淋巴细胞；(b)胞毒性T淋巴细胞；(c)天然杀伤细胞；(d)嗜中性白细胞；(e)粒细胞；(f)巨噬细胞；(g)肥大细胞或(h)HeLa细胞。
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