PL180066B1 - Bialkowy chimeryczny receptor blonowy, zmodyfikowana komórka,DNA kodujacy bialkowy chimeryczny receptor blonowy i wektor zawierajacy taki DNA PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Bialkowy chimeryczny receptor blonowy, zmodyfikowana komórka,DNA kodujacy bialkowy chimeryczny receptor blonowy i wektor zawierajacy taki DNA PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL180066B1
PL180066B1 PL95315908A PL31590895A PL180066B1 PL 180066 B1 PL180066 B1 PL 180066B1 PL 95315908 A PL95315908 A PL 95315908A PL 31590895 A PL31590895 A PL 31590895A PL 180066 B1 PL180066 B1 PL 180066B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cells
cell
seq
protein
transmembrane
Prior art date
Application number
PL95315908A
Other languages
English (en)
Other versions
PL315908A1 (en
Inventor
Brian Seed
Babak Banapour
Charles Romeo
Waldemar Kolanus
Original Assignee
Gen Hospital Corp
The General Hospital Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gen Hospital Corp, The General Hospital Corp filed Critical Gen Hospital Corp
Publication of PL315908A1 publication Critical patent/PL315908A1/xx
Publication of PL180066B1 publication Critical patent/PL180066B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70514—CD4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/023—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a poxvirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Abstract

1. Bialkowy chimeryczny receptor blonowy, zawierajacy (a) pozakomórkowa czesc zawierajaca fragment CD4 obej- mujacy aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) czesc wewnatrzkomórkowa, która stanowi przenoszaca sygnal czesc bialka receptora komórki T, bialka receptora komórki B lub bialka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielo- ny od wewnatrzkomórkowej czesci domena zawierajaca sekwencje aminokwasowa w ybrana z grupy obejmujacej: fragment CD7 posiadajaca SEQ ID NO: 35, zawiase domen CH2 i CH3 ludzkiej czasteczki IgG posiadajaca SEQ ID NO:33, czesc przezblonowa CD7, czesc przezblonowa CD5, czesc przezblonowa CD3 4, bialkowa -a -h elise. 4. Zmodyfikowana komórka pochodzaca z grupy obejmujacej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) natu- ralne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) em- brionalne komórki macierzyste, wytwarzajaca w wyniku ekspresji zwiazany z blona, bialkowy chimeryczny receptor, zawierajacy (a) pozakomórkowa czesc zawierajaca fragment CD4 obejmujacy aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) czesc wewnatrzkomórkowa, która stanowi przenoszaca sygnal czesc bialka receptora komórki T, bialka receptora komórki B lub bialka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnatrzkomórkowej czesci domena przezblonowa, zawierajaca sekwencje aminokwasowa w ybrana z grupy obejmujacej. CD7 posiadajaca SEQ ID NO:35, za- wiase domen CH2 i CH3 ludzkiej czasteczki IgG posiadajaca SEQ ID NO:33, czesc przezblonowaCD7, czesc przezblonowa CD5, czesc przezblonowa CD34, jedna lub wiecej bialkowych a-helis. 9. Wektor zawierajacy DNA kodujacy bialkowy chimeryczny receptor blonowy zawierajacy (a) pozakomórkowa czesc zawierajaca fragment CD4 obejmujacy aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) czesc wewnatrzkomórkowa, która stanowi przenoszaca sygnal czesc bialka receptora komórki T, bialka receptora komórki B lub bialka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnatrzkomórkowej czesci dom ena przezblonowa, zawierajaca sekwencje amino- kw asow a w ybrana z grupy obejmujacej: CD7 posiadajaca SEQ ID NO:35, zawiase domen CH2 i CH3 ludzkiej czasteczki IgG posiadajaca SEQ ID NO:33, czesc przezblonowa CD7, czesc przezblonowa CD5, czesc przezblonowa CD34, jedna lub wiecej bialkowych a -helis. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są funkcyjne chimery pomiędzy fragmentami CD4 i receptorami komórki odporności, które są zdolne do kierowania komórek odporności, w celu przeprowadzenia lizy komórek zainfekowanych przez HIV, ale nie nadaje komórkom odporności podatności na infekcję HIV. W związku z tym wynalazek dostarcza nowego i skutecznego sposobu terapii HIV.
Stan techniki wynalazku
Rozpoznawanie przez komórki T antygenu za pomocą receptora komórki T stanowi podstawę szeregu zjawisk immunologicznych. Komórki T kierujątak zwaną odpornością z udziałem komórek. Obejmuje ona niszczenie przez komórki układu odpornościowego obcych tkanek lub zainfekowanych komórek. Znanych jest szereg komórek T, obejmujących komórki „wspomagające” i „supresyjne”, które modulująreakcję odpornościową oraz komórki cytotoksyczne (lub „zabijacze”), które mogą bezpośrednio zabijać nieprawidłowe komórki.
Komórka T, która rozpoznaje i wiąże się z unikatowym antygenem występującym na powierzchni innej komórki, uaktywnia się; może się następnie mnożyć, a w przypadku, gdy jest to komórka cytotoksyczna, może ona zabijać związaną komórkę.
HIV i immunopatogeneza
W 1984 roku wykazano, że HIVjest czynnikiem etiologicznym AIDS. Od tego czasu definicję AIDS korygowano szereg razy w odniesieniu do kryteriów, które powinny zostać uwzględnione w diagnozie. Jednak pomimo płynności parametrów diagnostycznych prostym wspólnym mianownikiem AIDS jest infekcja HIV, a następnie rozwój trwałych uogólniających objawów oraz chorób związanych z AIDS, takich jak wtórne infekcje, nowotwory i choroba neurologiczna. Harrison’s Principles of Intemal Medicine, 12th Ed., McGraw Hill (1991).
HIV jest ludzkim retrowirusem należącym do grupy wirusów wolno działających. 4 rozpoznane ludzkie retrowirusy należą do dwóch różnych grup: ludzkie wirusy T-limfotropowe (białaczki), HTLV-1 i HTLV-2, oraz ludzkie wirusy upośledzenia odporności, HIV-1 i HIV-2. Pierwsze należą do wirusów przekształcających, drugie do wirusów cytopatycznych.
HIV-1 zidentyfikowano jako najczęstszą przyczynę AIDS w całym świecie. Homologia sekwencji między HIV-1 i HIV-2 wynosi około 40%, przy czym HIV-2 jest ściślej spokrewniony z pewnymi składnikami grupy małpich wirusów upośledzenia odporności (SIV). Patrz Curran J. i inni, Science, 329:1357-1359 (1985); Weiss R. i inni, Naturę, 324:572-575 (1986).
HIV zawiera zwykłe geny retrowirusowe (env, gag oraz poi), a także 6 dodatkowych genów uczestniczących w replikacji i innych czynnościach biologicznych wirusa. Jak to zaznaczono powyżej, wspólnym mianownikiem AIDS jest znaczące upośledzenie odporności, przede wszystkim odporności z udziałem komórek. Takie upośledzenie odporności prowadzi do różnych chorób oportunistycznych, zwłaszcza pewnych infekcji i nowotworów.
Jako główną przyczynę niedoboru odporności w AIDS zidentyfikowano ilościowe i jakościowe zubożenie w podzbioru limfocytów pochodzących z grasicy (T), populacji T4. Ten podzbiór komórek jest określany fenotypowo przez obecność powierzchniowej cząsteczki CD4, która, jak to wykazano, jest komórkowym receptorem dla HIV. Dalgleish i inni, Naturę 312:763 (1984). Jakkolwiek komórki T4 stanowią główny typ komórek infekowanych przez HIV, to zasadniczo dowolna ludzka komórka, która w wyniku ekspresji zawiera na swojej powierzchni cząsteczkę CD4, może wiązać HIV i być przezeń zainfekowana.
Tradycyjnie komórkom CD4+ przypisuje się rolę pomocnika/induktora, co wskazuje na ich rolę w dostarczaniu sygnału uaktywniającego do komórek B, albo indukowaniu limfocytów T przenoszących zwrotny marker CD8, tak że stają się komórkami cytotoksycznymi/supresyjnymi. Reinherz i Schlossman, Celi 19:821-827 (1980); Goldstein i inni, ImmunoL Rev. 68:5-42 (1982).
180 066
HIV wiąże się specyficznie z wysokim powinowactwem poprzez ciąg aminokwasów w kopercie wirusowej (gp 120) z częścią regionu VI cząsteczki CD4 zlokalizowaną w pobliżu jej N-końca. Po związaniu, wirus zlewa się z błoną docelowej komórki i intemalizuje ją. Po internalizacji wykorzystuje on enzym odwrotnątranskryptazę do transkrybowania swojego genomowego RNA w DNA, który integruje się z komórkowym DNA, gdzie istnieje przez cały okres życia komórki jako „prowirus”.
Prowirus może pozostać uśpiony lub uaktywnić się i transkrybować mRNA i genomowy RNA, co prowadzi do syntezy białka, złożenia, powstania nowego wiriona oraz odszczepienia się wirusa od powierzchni komórki. Jakkolwiek dokładny mechanizm, według którego wirus wywołuje śmierć komórki, nie został ustalony, uważa się, że podstawowy mechanizm obejmuje masowe odszczepianie się wirusów z powierzchni komórki, co prowadzi do zniszczenia błony plazmowej i powoduje utratę równowagi osmotycznej.
W czasie infekcji organizm gospodarza wytwarza przeciwciała przeciw białkom wirusa, obejmuj ącym podstawowe glikoproteiny kopertowe gp 120 i gp41. Pomimo tej humoralnej odporności choroba rozwija się, co prowadzi do śmiertelnego upośledzenia odporności charakteryzującego się licznymi oportunistycznymi infekcjami, obecnością pasożytów we krwi, otępieniem i śmiercią. Niemożność przeciwwirusowych przeciwciał gospodarza do zatrzymania postępu choroby stanowi jeden z najbardziej dotkliwych i alarmujących aspektów infekcji i źle wróży próbom zastosowania szczepionek, opartych na konwencjonalnych rozwiązaniach.
Dwa czynniki mogą odgrywać rolę w skuteczności reakcji humoralnej na wirusy upośledzenia odporności. Po pierwsze, podobnie jak inne wirusy RNA (a zwłaszcza podobne retrowirusy), wirusy upośledzenia odporności wykazują wysoką szybkość mutacji w odpowiedzi na nadzór odpornościowy gospodarza. Po drugie, same glikoproteiny kopertowe stanowiąsilnie glikozylowane cząsteczki zawierające niewiele epitopów przydatnych w wiązaniu przeciwciała z wysokim powinowactwem. Słaby cel antygenowy, który stanowi koperta wirusowa, stwarza gospodarzowi niewiele szans na ograniczenie infekcji wirusowej poprzez wytwarzanie określonych przeciwciał.
Komórki zainfekowane wirusem HIV wytwarzają w wyniku ekspresji glikoproteinę gpl20 na powierzchni Gp 120 uczestniczy w zjawiskach fuzj i między komórkami CD4+ poprzez reakcj e zbliżone do tych, dzięki którym wirus wnika do niezainfekowanych komórek, co prowadzi do powstania krótko żyjących wielojądrowych komórek olbrzymich. Powstawanie zespólni jest uzależnione od bezpośredniego oddziaływania glikoproteiny kopertowej gpl20 z białkiem CD4. Dalgleish i inni, supra; Klatzman D. i inni, Naturę 312:763 (1984); MCDougal J.S. i inni, Science 231:382 (1986); Sodroski J. i inni, Naturę 322:470 (1986); Lifson J.D. i inni, Naturę 323:725 (1986); Sodroski, J. i inni, Naturę 321:412 (1986).
Do dowodów na to, że wiązanie CD4-gp 120 jest odpowiedzialne za infekcję wirusowąkomórek przenoszących antygen CD4 należy odkrycie, że tworzy się specyficzny kompleks między gpl20 i CD4. MCDougal i inni, supra. Inni badacze wykazali, że linie komórek, które nie są infekowane przez HIV, przekształcają się w dające się zainfekować linie komórek po transfekcji i ekspresji CDNA ludzkiego genu CD4. Maddon i inni, Celi 46:333-348 (1986).
Zaproponowano programy terapeutyczne oparte na rozpuszczalnym CD4 jako pasywnym czynniku zakłócającym adsorpcję wirusa i transmisję komórkową z udziałem zespólni, a liczne grupy wykazały przydatność takiego podejścia in vitro (Deen i inni, Naturę 331:82-84 (1988); Fisher i inni, Naturę 331:76-78 (1988); Hussey i inni, Naturę 331:78-81 (1988); Smith i inni, Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker i inni, Naturę 331:84-86 (1998)); następnie opracowano immunoglobulinowe białka fuzyjne CD4 o wydłużonych okresach półtrwania i nieznacznej aktywności biologicznej (Capon i inni, Naturę 337:525-531 (1989); Traunecker i inni, Naturę 339, 68-70 (1989); Bym i inni, Naturę 344:667-670 (1990); Zettlmeissl i inni, DNA Celi Biol, 9:347-353 (1990)). Jakkolwiek koniugaty immunotoksynowe CD4 lub białka fuzyjne wykazują silną cytotoksyczność względem zainfekowanych komórek in vitro (Chaudhary i inni, Naturę 335:369-372 (1988); Till i inni, Science 242:1166-1168 (1988)), uśpienie zespołu upośledzenia odporności powoduje, że mało prawdopodobne jest, aby jakakolwiek jednorazowa terapia była skuteczna w
180 066 wyeliminowaniu obciążenia wirusowego, a antygenowość obcych białek fuzyjnych ograniczy prawdopodobnie ich przydatność w leczeniu wymagającym powtarzanego dawkowania.
Próby na małpach zainfekowanych SIV wykazały, że rozpuszczalne CD4 podawane zwierzętom bez znaczącej cytopenii CD4 może zmniejszyć miano SIV i poprawić miary in vitro potencjału rdzeniowego (Watanabe i inni, Naturę 337:267-270 (1989)). Jednakże, po przerwaniu leczenia zaobserwowano szybki ponowny rozwój wirusów, co sugeruje, że długotrwałe podawanie może być konieczne, aby zapobiec stopniowemu osłabieniu układu odporności.
Komórka T i receptory Fc
Ekspresja na powierzchni komórki najbardziej rozpowszechnionej formy receptora antygenu komórki T (TCR) wymaga współekspresji co najmniej 6 różnych łańcuchów polipeptydowych (Weiss i inni, J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi i inni, Naturę 316:606-609 (1985); Berkhout i inni, J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman i inni, Celi 52:85-95 (1988)), łańcuchów wiążących antygen α/β, 3 polipeptydów kompleksu CD3 i ζ. Gdy któryś z tych łańcuchów nie występuje, trwała ekspresja pozostałych elementów kompleksu nie zachodzi. ζ jest ograniczającym polipeptydem powierzchniowej ekspresji pełnego kompleksu (Sussman i inni, Celi 52:85-95 (1988)), a ponadto uważa się, że uczestniczy ono w co najmniej części komórkowych programów uaktywniania uruchamianych przez rozpoznawanie ligandu przez receptor (Weissman i inni, EMBO J. 8:3641-3656 (1989); Frank i inni, Science 249:174-177 (1990)). Integralny homodimer błonowy typu I o 32kDa, ζ (zeta) zawiera domenę pozakomórkowąo 9 resztach bez miejsc do N-połączonej addycji glikanu, oraz domenę wewnątrzkomórkową oll2 resztach (mysią) lub 113 resztach (ludzką) (Weissman i inni, Science 238:1018-1020 (1988); Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). Ιζοίοηηηζ określana jako r](eta) (Baniyash i inni, J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff i inni, J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), powstająca przy wariantowej drodze rozszczepiania mRNA (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3233 (1990)), występuje w zmniejszonych ilościach w komórkach, w których zachodzi ekspresja receptora antygenu. Uważa się, że heterodimery ζ-η uczestniczą w tworzeniu się fosforanów inozytolu, a także w zainicjowanej przez receptor programowanej śmierci komórki, określanej jako apoptoza (Merćep i inni, Science 242:571-574 (1988); Merćep i inni, Science 246:1162-1165 (1989)).
Podobnie j ak ζ i η, zasocj owany z receptorem Fc łańcuch γ j est wytwarzany w wyniku ekspresji w występujących na powierzchni komórki kompleksach z dodatkowymi polipeptydami, z których część uczestniczy w rozpoznawaniu ligandu, a rola innych nie jest określona, γ (gamma) wykazuje homodimeryczną strukturę i ogólną organizację podobną do ζ, stanowiąc składnik zarówno receptora IgE z wysokim powinowactwem względem komórki tucznej/zasadochłonnej, FceRI, który zawiera co najmniej 3 różne łańcuchy polipeptydowe (Blank i inni, Naturę 337:187-189 (1989); Ra i inni, Naturę 241:752-754 (1989)), oraz jednego z receptorów z niskim powinowactwem względem IgG, reprezentowanych u myszy przez FcyRIIa (Ra i inni, J. Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), a także u ludzi przez ekspresję podtypu CD 16 w makrofagach i naturalnych komórek zabijaczy, CD16TM (przezbłonowy CD16) (Lanier i inni, Naturę 342:803-805 (1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)) oraz z polipeptydem o nieokreślonym znaczeniu (Anderson i inni, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Ostatnio doniesiono, że γ powstaje w wyniku ekspresji w mysiej linii komórek T. CTL, w których tworzy on homodimery oraz heterodimery γ-ζ i γ-η (Orloff i inni, Naturę 347:189-191 (1990)).
Receptory Fc uczestniczą w fagocytozie kompleksów immunologicznych, transcytozie oraz cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) (Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless i inni, Annu. Rev. Immunol 6:251-281 (1988); oraz Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Ostatnio wykazano, że jedna z mysich izoform receptora Fc z niskim powinowactwem, FcRylllBl, uczestniczy w internalizacji celów powleczonych Ig w powleczonych klatryną studzienkach, a inny receptor z niskim powinowactwem, F ery III A uczestniczy w ADCC poprzez zasocjowanie z jednym lub więcej elementami z małej grupy „cząsteczek wyzwalających” (Miettinen i inni, Celi 58:317-327 (1989); oraz Hunziker i Mellman, J. Celi Biol. 109:3291-3302 (1989)). Te cząsteczki wyzwalające, receptor komórki T
180 066 (TCR) łańcuch ζ, tłuszczowy η TCR oraz łańcuch γ receptora Fc oddziałują z domenami rozpoznawania ligandu różnych receptorów układu odpornościowego oraz mogą autonomicznie inicjować komórkowe programy efektorowe, w tym cytolizę, po agregacji (Samelson i inni, Celi 43:223-231 (1985); Weissman i inni, Science 239:1018-1020 (1988); Jini inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Blank i inni, Naturę 337:187-189 (1989); Lanier i inni, Naturę 342:803-805 (1989); Kurosaki i Ravetch, Naturę 342:805-807 (1989); Hibbs i inni, Science 246:1608-1611 (1989); Anderson i inni, Proc. Natl. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); orazlrving i Weiss, Celi 64:891-901 (1991)).
Przy porównywaniu mysiej i ludzkiej rodziny receptora FC z niskim powinowactwem okazało się jednak, że ludzkie izoformy FcRyllA i C nie mająmysich odpowiedników. Częściowo z tego względu ich rola nie została dotychczas określona.
W związku z tym, że same czynniki humoralne oparte na CD4 mogą mieć ograniczoną przydatność in vivo, we wcześniejszych pracach rozwijano możliwość zwiększenia odporności komórek na HIV. Zidentyfikowano preparaty chimer białkowych, w których pozakomórkowa domena CDS jest złączona z przezbłonową i/lub wewnątrzkomórkową domeną receptora komórki T, receptora IgG F lub elementów przenoszących sygnał receptora komórki B (zgłoszenia patentowe USA nr 07/847 566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe). Cytolityczne komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery obejmujące pozakomórkowądomenę CD4 powodują silną, niezależną od MHC destrukcję celów komórkowych, w których zachodzi ekspresja białek kopertowych HIV. Wyjątkowo ważnym i nowym elementem takiego podejścia było zidentyfikowanie pojedynczego receptora komórki T, receptora Fc, oraz łańcuchów receptora komórki B, których agregacja wystarcza do zainicjowania odpowiedzi komórkowej. Jednym ze szczególnie użytecznych zastosowań takiego rozwiązania było wynalezienie chimer pomiędzy CD4 orazζ, η lub γ, które kieruj ącytolityczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i zabijają komórki, w których zachodzi ekspresja gpl20 HIV (zgłoszenia patentowe USA nr 07/847 566 i 07/665 961, które wprowadza się jako źródła literaturowe).
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkowączęść zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1 -394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybranąz grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającąSEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, białkowąa-helisę.
Korzystnie chimeryczny receptor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31 oraz równie korzystnie tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną białkowy chimeryczny receptor zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych a-helis.
Korzystnie komórka według wynalazku charakteryzuje się tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A. Również korzystnie białko
180 066 receptora komórki T stanowi ξ. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz(b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domenąprzezbłonową zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych a-helis.
Korzystnie DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że SEQ ID NO:30.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych a-helis.
Korzystnie wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera SEQ ID NO:30.
Wynalazek ujawnia sposób kierowania komórkowej reakcji odpornościowej przeciw zainfekowanym przez HIV komórkom ssaka. Sposób obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości terapeutycznych komórek, przy czym w tych terapeutycznych komórkach zachodzi ekspresja związanego z błoną białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV.
Zgodnie ze zbliżonym rozwiązaniem, przedmiotem ujawnienia jest zastosowanie terapeutycznych komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z błoną białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV, do wytwarzania leku, stosowanego w leczeniu chorób związanych z HIV.
W drugim aspekcie ujawnienie dotyczy komórki, w której zachodzi ekspresja związanego z błoną białkowego chimerycznego receptora obejmującego (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4, zdolny do specyficznego rozpoznawania komórki zainfekowanej przez HIV i wiązania się z nią ale nie uczestniczy w infekcji HIV, oraz (b) część wewnątrzkomórkową która jest zdolna do sygnalizowania komórce terapeutycznej zniszczenie, związanej z receptorem komórki zainfekowanej przez HIV.
W korzystnym wykonaniu obydwu aspektów fragment CD4 stanowią aminokwasy 1-394 z CD4 lub aminokwasy 1-200 z CD4; fragment CD4 oddzielony jest od części wewnątrzkomórkowej przezbłonową domeną pokazaną na fig. 26 lub przez zawiasę, domeny CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG 1 pokazaną na fig. 25;receptor obejmuje część przezbłonową CD7;receptor obejmuje część przezbłonową CD5; receptor obejmuje część przezbłonową CD34; fragment CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej jedną lub więcej białkowymi a-helisami; fragment CD4 oddzielony jest od błony komórki terapeutycznej o co najmniej 48A lub o co najmniej 72A; wewnątrzkomórkowa część przenoszącej sygnał części białka receptora komórki T (np ζ), białka receptora komórki B lub białka receptora Fc; a komórka terapeutyczna wybrana jest z grupy obejmującej: (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki żabi
180 066 jacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste układu krwionośnego.
W innych wykonaniach wynalazek ujawnia DNA kodujące chimeryczny receptor według wynalazku; oraz wektora zawierającego ten DNA chimerycznego receptora.
Jakkolwiek konkretne rozwiązanie według wynalazku stanowi chimera pomiędzy CD4 i ζ, to w ujawnionych celach wykorzystać można dowolny łańcuch receptora o działaniu podobnym do tych cząsteczek, np. w granulocytach lub limfocytach. Do wyróżniających cech pożądanej wyzwalającej cząsteczki komórki odpornościowej należy zdolność do autonomicznej ekspresji (jako pojedynczego łańcucha), zdolność do fuzji z pozakomórkową domeną CD4, tak że powstała chimera występuje na powierzchni komórki terapeutycznej, oraz zdolność do inicjowania komórkowych programów efektorowych w wyniku agregacji po napotkaniu docelowego ligandu.
Obecnie najdogodniejszym sposobem dostarczania chimer do komórek układu odporności jest pewnego rodzaju terapia genowa. Jednakże w wyniku odtworzenia komórek układu odpornościowego z chimerycznymi receptorami poprzez zmieszanie komórek z odpowiednio rozpuszczonym, oczyszczonym białkiem chimerycznym, może również doprowadzić do powstania skonstruowanej populacji komórek, zdolnych do rozpoznawania celów zainfekowanych przez HIV. Podobne podejścia wykorzystano np. do wprowadzania cząsteczki CD4 do erytrocytów w celach terapeutycznych. W takim przypadku skonstruowana populacja komórek nie powinna być zdolna do samoodnawiania się.
Ujawnienie dotyczy funkcyjnych i uproszczonych chimer pomiędzy fragmentami CD4 i receptorem komórki T, receptorem komórki B i podjednostkami receptora FC, które są zdolne do ukierunkowania komórek odpornościowych, tak, aby rozpoznawały one i dokonywały lizy komórek zainfekowanych przez HTV. Sposób kierowania reakcją komórkową u ssaków obejmuje podawanie ssakowi skutecznej ilości terapeutycznych komórek (np. cytotoksycznych limfocytów T), które to komórki są zdolne do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HIV.
Przedmiotem ujawnienia są ponadto chimeryczne białka receptorowe, które kierują cytotoksyczne limfocyty T, tak, że rozpoznają one i dokonują lizy komórek zainfekowanych przez HIV, komórki gospodarza transformowane wektorem zawierającym chimeryczne receptory, oraz przeciwciała skierowane przeciw chimerycznym receptorom.
Te i inne warianty nie ograniczające zakresu wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów po zapoznaniu się z poniższym szczegółowym opisem wynalazku.
W poniższym szczegółowym opisie wprowadzone będą odnośniki do różnych metodyk znanych specjalistom biologii molekularnej i immunologii. Publikacje i inne materiały, w których przedstawiono takie znane metodyki, do których podano odnośniki, wprowadza się w całości jako źródła literaturowe.
Do standardowych prac podających ogólne zasady technologii zrekombinowanego DNA, należą: Watson i inni, Mołecular Eiology of the Gene, Vol.I i II, Benjamin/Cummings Pubłishing Company, Inc., wydawca, Menlo Park, CA (1987); Damell i inni, Mołecular Celi Biology, Scientific American Books, Inc., Wydawca, New York, N.Y (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, wydawcy, New York, N.Y. (1985); Old i inni, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2 wydanie, University of Califomia Press, Wydawca, Berkeley, CA (1981); Maniatis i inni, Mołecular Cloning: A Laboratory Manuał, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, wydawca, Cold Spring Harbor, NY (1989); oraz Ausubel i inni, Current Protocols in Mołecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).
Definicje „Klonowanie” oznacza zastosowanie in vitro technik rekombinacji do wstawiania określonego genu lub innej sekwencji DNA do cząsteczki wektora.
„cDNA” oznacza komplementarny DNA lub kopia DNA, wytworzony z matrycy RNA w wyniku działania zależnej od RNA polimerazy DNA (odwrotnej transkryptazy). I tak „klon CDNA” oznacza dwuniciową sekwencję DNA komplementarną z odpowiednią cząsteczką RNA, przenoszony w wektorze klonowania.
180 066 „Biblioteka cDNA” oznacza zbiór zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających inserty cDNA, które zawierają kopie DNA z mRNA powstającego w wyniku ekspresji w komórce przy wytwarzaniu biblioteki cDNA. Takąbibliotekę cDNA wytworzyć można sposobami znanymi specjalistom, opisanymi np. przez Ausubela i innych, supra, oraz Maniatisa i innych, supra. Ogólnie, najpierw wydziela się RNA z komórek organizmu, którego genom jest pożądany do klonowania określonego genu. Według wynalazku korzystnie wykorzystuje się w tym celu linie komórek limfocytowych ssaków, zwłaszcza ludzi. Obecnie korzystnym wektorem jest szczep wirusa krowianki WR.
„Wektor” oznacza cząsteczkę DNA pochodzącą np. z plazmidu, bakteriofaga albo wirusa ssaka lub owada, w którym wykonać można insercję lub klonowanie fragmentów DNA. Wektor będzie zawierać jedno lub więcej unikatowych miejsc restrykcyjnych oraz może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym gospodarzu lub organizmie nośnym, tak że klonowana sekwencja może być reprodukowana. „Wektor ekspresji DNA” oznacza dowolny autonomiczny element zdolny do kierowania syntezą zrekombinowanego peptydu. Takie wektory ekspresji DNA obejmują bakteryjne plazmidy i fagi, a także plazmidy i wirusy ssaków i owadów.
„Zasadniczo czysty” odnosi się do związku, np. białka, polipeptydu lub przeciwciała, zasadniczo wolnego od składników, które z natury towarzyszą mu. Ogólnie związek jest zasadniczo czysty, gdy co najmniej 60%, jeszcze korzystniej co najmniej 75%, a najkorzystniej co najmniej 90% całości materiału w próbce stanowi właściwy związek. Czystość można oznaczyć odpowiednim sposobem, np. na drodze chromatografii kolumnowej, elektroforezy na żelu poliakrylamidowym albo analizy HPLC. W odniesieniu do kwasów nukleinowych „zasadniczo czysty” oznacza sekwencję, segment lub fragment kwasu nukleinowego, który bezpośrednio nie sąsiaduje (np. nie jest kowalencyjnie połączony) z obydwoma sekwencjami kodującymi, z którymi bezpośrednio sąsiaduje (np. z jedną na końcu 5', a z drugą na końcu 37) w występującym w naturze genomie organizmu, z którego pochodzi właściwy DNA według wynalazku.
Określenie „fragment” cząsteczki, taki jak dowolna z sekwencji cDNA według wynalazku, odnosi się do dowolnego z sąsiadujących podzbiorów nukleotydowych cząsteczki. „Analog” cząsteczki oznacza nienaturalną cząsteczkę zasadniczo podobną do całej cząsteczki lub jej fragmentu. Cząsteczka jest „zasadniczo podobna” do innej cząsteczki, gdy sekwencje aminokwasów w obydwu cząsteczkach są zasadniczo takie same. Zasadniczo podobne cząsteczki aminokwasów będą wykazywać podobne działanie biologiczne. W użytym znaczeniu cząsteczka stanowi „chemiczną pochodną” innej cząsteczki, gdy zawiera grupy chemiczne, nie stanowiące zazwyczaj części cząsteczki. Takie grupy mogą zwiększać rozpuszczalność, absorpcję, okres półtrwania biologicznego cząsteczki itp. Grupy te mogą także obniżać toksyczność cząsteczki, eliminować lub osłabiać jakiekolwiek niepożądane działanie uboczne cząsteczki itp. Grupy zdolne do wywierania takiego wpływu ujawniono np. w publikacji Remingtońs Pharmaceutical Sciences, 16 wyd., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).
Określenie „funkcyjna pochodna” genu chimery receptorowej według wynalazku obejmuje „fragmenty” lub „analogi” genu, „zasadniczo podobne” pod względem sekwencji nukleotydowej i kodujące cząsteczkę o podobnej aktywności jak chimera receptora z komórki T, komórki B lub Fc. Najkorzystniej pochodna wykazuje 90%, szczególnie korzystnie 70%, a korzystnie 40% aktywności chimery receptora typu dzikiego. Aktywność pochodnej funkcyjnego receptora chimerycznego obejmuje specyficzne wiązanie (z pozakomórkowączęściąCD4) z komórką zainfekowaną przez HIV oraz wynikające stąd niszczenie komórki; dodatkowo chimeryczny receptor nie nadaj e komórce przenoszącej receptor podatności na infekcję HIV. Aktywność chimerycznego receptora można zbadać, wykonując np. dowolny z testów opisanych poniżej.
Przeprowadzić można rekombinację sekwencji DNA kodującej chimerę receptora CD4 według wynalazku, albo jej funkcyjnych pochodnych, z DNA wektora, z wykorzystaniem znanych technik, z wykorzystaniem tępo zakończonych lub lepko zakończonych końców do ligowania, trawienia enzymem restrykcyjnym w celu uzyskania odpowiednich końców, wypełniania w odpowiedni sposób lepkich końców, obróbki fosfatazą alkaliczną, tak aby zapobiec niepożąda
180 066 nemu połączeniu, oraz ligowania z odpowiednimi ligazami. Techniki takich manipulacji ujawniono w pracy Maniatisa i innych, supra. Są one dobrze znane specjalistom.
Cząsteczka kwasu nukleinowego, np. DNA, jest „zdolna do ekspresji” polipeptydu, jeśli zawiera sekwencje nukleotydowe, które zawierają informację regulującą transkrypcję i translację, a sekwencje takie są „operacyjnie połączone” z sekwencjami nukleotydowymi, które kodują polipeptyd. Operacyjne połączenie stanowi połączenie, w którym regulujące sekwencje DNA oraz sekwencja DNA, która ma brać udział w ekspresji, połączone są w taki sposób, aby umożliwić ekspresję genu. Dokładny charakter regionów regulujących niezbędnych do zapewnienia ekspresji genu może być odmienny dla różnych organizmów, z tym że zazwyczaj obejmuje on region promotora, który w prokariotach zawiera zarówno promotor (który kieruje inicjowaniem transkrypcji RNA) jak i sekwencje DNA które, po transkrypcji w RNA, będą sygnalizować inicjowanie syntezy białka. Regiony takie zazwyczaj obejmują te 5'-nie kodujące sekwencje uczestniczące w inicjowaniu transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja czapeczkowa, sekwencja CAAT itp.
W razie potrzeby nie kodujący region 3' względem sekwencji kodującej gen białka otrzymać można sposobami opisanymi powyżej. Region ten można zachować z uwagi na jego sekwencje regulujące terminację transkrypcji, np. terminację i poliadenylowanie. I tak, zachowując region 3' sąsiadujący w naturze z sekwencjąDNA kodującąbiałko uzyskać można sygnały terminacji transkrypcji. Gdy sygnały terminacji transkrypcji nie działają zadowalająco w komórce gospodarza, w której zachodzi ekspresja, to można go zamienić na region funkcyjny 3' w komórce gospodarza.
Dwie sekwencje DNA (np. sekwencja regionu promotora i sekwencja kodująca chimerę receptora CD4) są operacyjnie połączone, jeśli charakter połączenia między dwiema sekwencjami (1) nie spowoduje wprowadzenia mutacji przesuwającej ramkę, (2) nie zakłóca zdolności sekwencji regionu promotora do kierowania transkrypcją sekwencji genu chimery receptora albo (3) nie zakłóca możliwości transkrypcji sekwencji genu chimery receptora przez sekwencję regionu promotora. Region promotora powinien być operacyjnie połączony z sekwencją DNA, jeśli promotor ma być zdolny do skutecznej transkrypcji sekwencji DNA. Dlatego też, aby nastąpiła ekspresja białka, niezbędne sątranskrypcyjne i translacyjne sygnały rozpoznawane przez odpowiedniego gospodarza.
Wynalazek obejmuje ekspresję białka chimery receptora CD4 (lub jego funkcyjnej pochodnej) w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych, z tym że ekspresja w eukariotach (a zwłaszcza w ludzkich limfocytach) jest korzystna.
Przeciwciała według wynalazku wytwarzać można dowolnym z szeregu sposobów. Tak np. komórki, w których zachodzi ekspresja białka chimery receptora CD4 lub jego fimkcyjnej pochodnej, można wprowadzić do zwierzęcia, w celu wywołania u niego wytwarzania surowic zawierających poliklonalne przeciwciała zdolne do wiązania się z chimerą.
Zgodnie z korzystnym sposobem, przeciwciała według wynalazku stanowią przeciwciała monoklonalne. Takie monoklonalne przeciwciała wytwarzać można techniką z hybrydomą (Kohler i inni, Naturę 256:495 (1975); Kohler i inni, Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler i inni, Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling i inni, w: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., str. 563-684 (1981)). Ogólnie procedury takie obejmują immunizację zwierzęcia antygenem chimery receptora CD4. Wydziela się limfocyty śledzionowe zwierzęcia i przeprowadza się ich fuzję z odpowiednią linią komórek szpiczaka. Według wynalazku zastosować można dowolną odpowiednią linię komórek szpiczaka. Po fuzji uzyskane komórki hybrydomy selektywnie utrzymuje się w ośrodku HAT, po czym klonuje się je metodą ograniczonego rozcieńczania, którą opisali Wand i inni (Gastroenterology 80:225-232 (1981). Komórki hybrydomy uzyskane w wyniku takiej selekcji bada się następnie w celu zidentyfikowania klonów, które wydzielają przeciwciała zdolne do wiązania chimery.
Przeciwciała według wynalazku mogą również stanowić przeciwciała poliklonalne albo, korzystnie, poliklonalne przeciwciała specyficzne względem regionu.
180 066
Przeciwciała przeciw chimerze receptora CD4 według wynalazku można zastosować do monitorowania ilości chimery receptora (lub komórek przenoszących chimerę receptora) u pacjenta. Takie przeciwciała nadają się do stosowania w standardowym teście immunodiagnostycznym, znanym specjalistom, takim jak test immunometryczny lub „sandwiczowy”, taki jak test sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny. Przeciwciała stosować można w wielu różnych kombinacjach, co mogą łatwo ustalić specjaliści bez niepotrzebnego eksperymentowania, tak aby przeprowadzić testy immunologiczne o dopuszczalnej specyficzności, czułości i dokładności.
Do standardowych prac podających ogólne zasady immunologii należą: Roitt, Essential Immunology, 6 wyd., Blackwell Scientific Publications, wydawca, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2 wyd., Macmillan Publishing Co., wydawca, New York (1986); Roitt i inni, Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., wydawca, London, (1985); Campbell, „Monoclonal Antibody Technology”, w Burdon i inni, redakcja Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Volume 13, Elsevier, wydawca, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, wydawca, New York (1982); oraz Kennett i inni, redakcja, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, wydawca, New York (1980).
Określenie „detekcja” obejmuje oznaczanie obecności lub braku substancji, albo ilościowe oznaczanie substancji. Określenie to odnosi się do zastosowania materiałów, kompozycji i sposobów według wynalazku, w oznaczeniach jakościowych i ilościowych.
Przeciwciała i zasadniczo oczyszczony antygen według wynalazku idealnie nadają się do wytwarzania zestawu. Taki zestaw może zawierać opakowanie podzielone na przedziały, w których umocowane są pojemniki, takie jak fiolki, probówki itp., z których każdy zawiera odrębne składniki do wykonywania testu.
Istnieje wiele rodzajów testów, które można wykonywać z wykorzystaniem zestawów, takie jak np. testy konkurencyjne i nie konkurencyjne. Do typowych przykładowych testów, które można przeprowadzać z wykorzystaniem przeciwciał według wynalazku, należą testy radioimmunologiczne (RIA), immunotesty enzymatyczne (EIA), enzymatyczne testy immunoadsorpcyjne (ELISA) oraz testy immunometryczne lub sandwiczowe.
Określenie „test immunometryczny” lub „immunologiczny test sandwiczowy” obejmują test sandwiczowy współbieżny, sandwiczowy przeciwbieżny lub sandwiczowy równoczesny. Określenia te są dobrze znane specjalistom. Dla specjalistów zrozumiałe jest również, że przeciwciała według wynalazku mogąbyć przydatne również w innych odmianach i formach testów, znanych obecnie lub opracowanych w przyszłości. Testy takie uważa się za objęte zakresem wynalazku.
Określenie „specyficznie rozpoznaje i wiąże” oznacza, że przeciwciało rozpoznaje i wiąże polipeptyd chimery receptora, ale zasadniczo nie rozpoznaje i nie wiąże innych niespokrewnionych cząsteczek w próbce, np. w próbce biologicznej.
„Komórka terapeutyczna” oznacza komórkę, która została transformowana chimerą receptora CD4 według wynalazku, tak że jest zdolna do rozpoznawania i niszczenia komórki zainfekowanej przez HIV; korzystnie takie komórki terapeutyczne stanowiąkomórki układu krwiotwórczego.
Określenie „pozakomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki wystaje z powierzchni komórki. Określenie wewnątrzkomórkowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki wystaje do cytoplazmy komórki terapeutycznej. Określenie „przezbłonowy” oznacza, że co najmniej część cząsteczki przechodzi przez błonę komórkową. W użytym znaczeniu określenia „część pozakomórkowa”, „część wewnątrzkomórkowa” i „część przezbłonowa” mogą obejmować flankujące sekwencje aminokwasów, które wystają do sąsiednich przedziałów komórki.
„Oligomeryzowanie” oznacza tworzenie kompleksu z innymi białkami z utworzeniem dimerów, trimerów, tetramerów i innych oligomerów wyższego rzędu. Takie oligomery mogąbyć homooligomerami lub heterooligomerami. „Część oligomeryzująca” stanowi ten region cząsteczki, który kieruje tworzeniem kompleksu (czyli oligomeru).
180 066
Określenie „cytolityczny” oznacza zdolny do niszczenia komórki (np. komórki zainfekowanej przez HIV) lub zdolny do niszczenia czynnika infekcyjnego (np. wirusa HIV).
„Wirus upośledzenia odporności” oznacza retrowirusa, który w formie dzikiej jest zdolny do infekowania komórek T4 gospodarza spośród naczelnych i wykazuje wirusowąmorfogenezę i morfologię charakterystyczną dla podrodziny wirusów wolno działających. Określenie to obejmuje bez żadnych ograniczeń wszystkie warianty HIV i SIV, w tym HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, STVsmm, SIVman, SIVmand i SIVcpz.
„Niezależny od MHC” oznacza, że cytolityczna reakcja komórkowa nie wymaga obecności antygenu MHC klasy Π na powierzchni docelowej komórki.
Określenie „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny” oznacza funkcyjnąpochodną (określoną powyżej), która jest zdolna do ukierunkowania co najmniej 40%, jeszcze korzystniej co najmniej 70%, a najkorzystniej co najmniej 90% aktywności biologicznej cząsteczki typu dzikiego. W użytym znaczeniu „funkcyjna pochodna przenosząca sygnał cytolityczny” może działać przez bezpośrednie sygnalizowanie komórce terapeutycznej, aby zniszczyła ona związany z receptorem czynnik lub komórkę (np. w przypadku wewnątrzkomórkowej części chimerycznego receptora), albo też może działać bezpośrednio, inicjując oligomeryzację z białkami przenoszącymi sygnał cytolityczny w komórce terapeutycznej (np. w przypadku domeny przezbłonowej). Skuteczność takich pochodnych można określać wykonując np. testy in vitro opisane poniżej.
Określenie „funkcyjna pochodna wiążąca kopertę HIV oznacza funkcyjną pochodną (określoną powyżej), która jest zdolna do wiązania dowolnego białka kopertowego HIV. Funkcyjne pochodne można identyfikować, wykonując np. testy in vitro opisane poniżej.
Podawanie terapeutyczne
Transformowane komórki według wynalazku można stosować do zwalczania wirusa upośledzenia odporności. Obecne sposoby podawania takich transformowanych komórek obejmują immunoterapię adoptywną lub terapię z przenoszeniem komórek. Sposoby te umożliwiają zawrócenie transformowanych komórek układu odpornościowego do prądu krwi. Rosenberg, Scientific American 62 (maj 1990); Rosenberg i inni, The New England Journal of Medicine 323 (9):570(1990).
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać dowolnemu zwierzęciu, w przypadku którego uzyskać można korzystne działanie związków według wynalazku. Do ssaków tych należą przede wszystkim ludzie, choć wynalazek nie ogranicza się do takiego rozwiązania.
Opis szczegółowy
Najpierw opisane zostaną rysunki.
Na figurze 1A pokazano sekwencję aminokwasów wokół miejsca fuzji pomiędzy CD4 (reszty 1-369) i różnymi łańcuchami receptorów. Sekwencja podkreślona oznacza pozycję aminokwasów kodowanąmiejscu BamHI stosowanym w konstrukcji fuzji. Początek domeny przezbłonowej zaznaczono pionowym słupkiem. Sekwencja η jest identyczna z sekwencjąζ na końcu aminowym, ale różni się na końcu karboksylowym (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). Na fig. IB przedstawiono wyniki przepływowej analizy cytometrycznej powierzchniowej ekspresji CD4, CD4: ζ, CD4:y i CD4: η w komórkach CV1. Komórki zainfekowano ζ wirusem, w którym zachodzi ekspresja chimery CD4 lub CD16p, inkubowano przez 9 godzin w 37°C i zabarwiono skoniugowanym z fikoerytryną anty-CD4 MAb Leu3 A.
Na figurze 2 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TM po współinfekcji samym CD16tm (gęste kropki) lub po współinfekcji wirusem, w którym zachodzi ekspresja CD4:y (kreski) lub CD4: ζ (linia ciągła). Rzadkie kropki - komórki zainfekowane samym CD4: ζ, zabarwione 3G8 (Fleit i inni, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982)) (anty-CD16 MAb).
Na figurze 3 pokazano powierzchniową ekspresję CD16TM po współinfekcji wirusami, w których zachodzi ekspresja CD 16TM i po chimerach ζ : CD4: ζ (grupa linia), CD4: ζ C11G (linia ciągła); CD4: ζ (linia przerywana); CD4: ζ Cl 1G/D15G (gęste kropki); bez współinfekcji (sam CD16tm, rzadkie kropki). Komórki inkubowano z anty-CD16 MAb 3G8 i skoniugowanymi z fi
180 066 koerytryną kozimi przeciwciałami Fab'2 względem mysiego IgG. Poziom ekspresji chimery ζ był zasadniczo identyczny dla różnych analizowanych mutantów, a współinfekcja komórek wirusami, w których zachodzi ekspresja CD 16TM i chimery ζ nie zmienia zasadniczo powierzchniowej ekspresji chimery.
Na figurach 4A-D pokazano zwiększony poziom wewnątrzkomórkowy wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu mutantowej chimery ζ w linii komórek T. Komórki Jurkata E6 (Weiss i inni, J. Immunol. 133:123-128 (1984) zainfekowano zrekombinowanymi wirusami krowianki i zanalizowano metodą cytometrii przepływowej. Wyniki przedstawiono dla wybranej populacji CD4+, tak że analizowano tylko komórki, w których zachodzi ekspresja odpowiedniego białka chimerycznego. Średni stosunek fioletowej do błękitnej fluorescencji Indo-1 odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie wolnego wapnia w populacji jako całości, a procent odpowiadających komórek odpowiada udziałowi komórek, w których nastąpiło przekroczenie ustalonego stosunku progowego (należy zaznaczyć, że 10% komórek nie poddanych obróbce daje wynik dodatni). Na fig. 4A i fig. 4B pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ (linia ciągła) lub Οϋ16:ζ (linia przerywana), eksponowane na anty-CD4 Mkb Leu3a (koniugat fikoerytryny), a następnie sieciowane kozim przeciwciałem względem mysiego IgG. Linia kropkowana pokazuje reakcję nie infekowanych komórek na anty-CD3 MAb OKT3. Na fig. 4C i 4D pokazano komórki Jurkata, w których zachodzi ekspresja CD4: ζΏ 15G (linia ciągła); CD4^C11G/D15G (kreski); lub CD4: ζϋΐΐΰ (kropki), które poddano obróbce i zanalizowano jak na fig. 4A i 4B.
Na figurach 5A-C pokazano, że receptory CD4: ζ, CD4: η, CD4:y umożliwiającytolitycznym limfocytom T (CTL) zabijanie celów w których zachodzi ekspresja HIV-1 gp 120/41.Fig. 5A: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:ę, inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa; pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41; puste kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami HeLa. fig. 5B: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: η, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4:y, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja podwójnego mutanta C11G/D15G chimery CD4.g, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp!20/41. fig. 5C: Przepływowa analiza cytometryczna ekspresji CD4 w CTL, pokazanej na fig. 5B. Aby skorygować stosunek celu do efektora, procent komórek, w których zachodzi ekspresja chimery CD4, oznaczono odejmując skalowaną (nie zainfekowaną) populację przez nakładania histogramów; w celach porównawczych na rysunku nie zainfekowanym komórkom przypisano arbitralnie wielkość progową, która daje w wyniku w przybliżeniu taką samą frakcję dodatnią jak w przypadku innych populacji komórek przy odejmowaniu histogramów.
Na figurach 6A-B pokazano specyficzność CD4-ukierunkowanej cytolizy. Fig. 6A: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja Οϋ4:ζ, inkubowane z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja CD 16P1; puste kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4 inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20; pełne kwadraty, CTL, w których zachodzi ekpresja CD16:ę inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41; puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD 16PI inkubowanego z komórkami HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41. Fig. 6B: pełne kółka, CTL, w których zachodzi ekspresja Οϋ4:ζ inkubowanego z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste kółka, nie zainfekowane komórki CTL inkubowane z komórkami RJ 2.2.5 (MHC klasa ΙΓ mutanta Raji); pełne kwadraty, nie zainfekowane CTL inkubowane z komórkami Raji (MHC klasa II+); puste kwadraty, CTL, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ inkubowane z RJ2.2.5 (MHC klasa Π). Oś rzędnych rozszerzono.
Na figurach 7A-B pokazano charakterystykę chimerycznego receptora CD 16: ζ. Fig. 7A przedstawia schematycznie diagram białka fiizyjnego Οϋ16:ζ. Pozakomórkową część połączo
180 066 nej z fosfatydyloinozytolem formy monomerycznego CD 16 połączono z dimerycznym ζ tuż poza przezbłonową domeną. Sekwencję białkową w połączeniu fuzyjnym pokazano na dole. Na fig. 7B pokazano przepływową analizę cytometrycznąmobilizacji białkowej po sieciowaniu chimery CD 16: ζ w TCR-dodatniej lub TCR-ujemnej linii komórek. Pokazano średni stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej (miara względnego stężenia jonów wapniowych) w populacjach komórek traktowanych przeciwciałami w czasie 0. Pełne kwadraty, reakcja komórek Jurkata na anty-CD3 MAb OKT3; pełne trójkąty, reakcja CD 16:ζ na anty-CD 16 MAb 3G8 usieciowane z mutantem REX33A TCR'; puste kwadraty, reakcja na CD 16:ζ usieciowany w linii mutantowej Jurkata TCR‘ JRT3 ,T3.5; puste trój kąty, reakcj a na CD 16 :ζ usieciowane w komórkach Jurkata; krzyże, reakcja na niechimeryczne CD 16 w komórkach Jurkata; kropki, reakcja na niechimeryczne CD 16 w linii komórek REX33A TCR'.
Na figurach 8A-B pokazano analizę delecj i cytolitycznego potencjału. Na fig. SA pokazano lokalizacje końcowych punktów delecji ζ. W tym przypadku, podobnie jak we wszystkich innych, mutacje w ζ sąprzedstawione w konwencji reszta wyjściowa-lokalizacja-reszta mutantowa, tak że np. D66* oznacza zastąpienie Asp-66 przez kodon terminacji. Na fig. 5B pokazano wyniki testu cytolizy CD 16: ζ bez delecji oraz skokowych delecji ζ. Komórki hybrydomy, w których zachodzi ekspresja powierzchniowych przeciwciał do CD 16 obciążono 51 Cr i inkubowano ze zwiększającąsię liczbą ludzkich cytolitycznych limfocytów (CTL) zainfekowanych rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimery CD16: ζ. Procent uwolnionego 51Cr wykreśla się w funkcji stosunku komórek efektorowych (CTL) do docelowych (hybrydoma) (e/t). Pełne kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja ΰΟ16:ζ (mfi 18.7); pełne kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16^ Asp66* (mfi 940.2); puste kwadraty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16^ Glu60* (mfi 16.0); puste kółka, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ Tyr51 * (mfi 17.4); pełne trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ Phe34* (mfi 17.8); oraz puste trójkąty, cytoliza z udziałem komórek, w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16 (mfi 591). Jakkolwiek w tych eksperymentach ekspresja CD 16: ζ Asp66* nie była dopasowana do ekspresji innych białek fuzyjnych, cytoliza przez komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ w równoważnych poziomach w tym samym eksperymencie dała wyniki zasadniczo identyczne do uzyskiwanych w przypadku komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ Asp66.
Na figurach 9A-D pokazano, że eliminacja potencjału dla oddziaływań przezbłonowych ujawnia krótki segment ζ zdolny do uczestniczenia w cytolizie. Fig. 9A przedstawia schematyczny diagram monomerycznych chimer dwudzielnych i trójdzielnych. Na górze znajduje się konstrukt CD 16: ζ ucięty przy reszcie 65, nie zawierający przezbłonowych reszt Cys i Asp. Poniżej znajdują się konstrukty CD 16: CD5: ζ i CD 16: CD7: ζ oraz zbliżone elementy kontrolne. Sekwencje peptydowe wewnątrzkomórkowych domen pokazano poniżej. Na fig. 9B przedstawiono cytolityczną aktywność delecyjnych mutantów monomerycznej chimery. Cytolityczną aktywność komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (pełne kółka; mfi 495) porównano z aktywnością komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16:ζ Asp66* (pełne kwadraty; mfi 527) lub mutantów CD 16:ζ CysHGly/Aspl5Gly/Asp66* (puste kwadraty; mfi 338) oraz CD16^ CysllGly/Aspl5Gly/Glu60* (pełne trójkąty; mfi 259). Na fig. 9C przedstawiono cytolityczną aktywność z udziałem trójdzielnych białek fuzyjnych. Pełne trójkąty, CDló.ę Asp66*; puste kwadraty, CD 16:5: ζ (48-65); pełne kwadraty CD16:7: ζ (48-65); puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-59); puste kółka, CD16:5; pełne kółka, CD16:7. Na fig. 9D przedstawiono mobilizację wapnia przez mutantowe i trójdzielne chimery w TCR-ujemnej mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5. Puste kółka, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja dimerycznego CD16: ζ Asp66*; pełne kwadraty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16^ CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*; puste kwadraty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16Ą CysllGly/Aspl5Gly/Glu60*; pełne trójkąty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD 16: 7: ζ (48-65); oraz puste trójkąty, reakcja komórek, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (48-59).
180 066
Na figurach 1OA-F pokazano udział poszczególnych aminokwasów w aktywności 18-resztowego motywu przenoszącego sygnał cytolityczny. Na fig. 10A i 1 OB pokazano cytolityczną aktywność, a na fig.lOC pokazano mobilizację jonów wapniowych z udziałem chimer przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny na końcu karboksylowym (Y62). Na fig. 10A i 10B przedstawiono dane zebrane dla komórek, w których zachodzi odpowiednio ekspresja małych i dużych ilości białek fuzyjnych CD16: ζ. Identyczne symbole użyto w przedstawianiu wyników mobilizacji wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je kodem jednoliterowym z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (mfi in A, 21; B, 376); pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16:7: ζ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); puste kwadraty CD 16:7: ζ (48-65) Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92), krzyże, CD 16:7: ζ (48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); pełne trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); puste kółka, CD16:7: ζ (48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Ser (mfi B, 64). Na fig. 1 OD i 10E pokazano cytolitycznąaktywność, a na fig. 10F pokazano mobilizację jonów wapniowych przez chimery przenoszących mutacje punktowe w pobliżu tyrozyny na końcu aminowym (Y51). Identyczne symbole użyto w przedstawianiu wyników mobilizacji wapnia i testów cytolizy, przedstawiając je z prawej strony. Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CDI 6: ζ (mfi w D, 21.2; w E, 672); pełne kwadraty, komórki, w których zachodzi ekspresja CD 16:7: ζ (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); pełne trójkąty, Οϋ16:7:ζ (48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); puste kwadraty, CD 16:7: ζ (48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); oraz puste trójkąty, CD16:7: ζ (48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).
Na figurach 11A-B pokazano ułożenie wewnętrznych powtórek ζ i porównano ich zdolność do podtrzymywania cytolizy. Fig. 11A przedstawia schematyczny diagram chimer utworzonych przez podział wewnątrzkomórkowej domeny ζ na 3 części oraz dołączenie ich do przezbłonowej domeny chimery CD 16:7. Sekwencje wewnątrzkomórkowych domen pokazano poniżej, ze wspólnymi resztami w ramkach, a zbliżone reszty zaznaczono gwiazdkami. Na fig. 11B pokazano zdolność cytolityczną 3 subdomenζ . Pełne kółka, komórki, w których zachodzi ekspresja CD16: ζ (mfi 476); pełne kwadraty, CD16:7: ζ (33-65) (mfi 68); puste kwadraty, CD16: 7: ζ (71-104) (mfi 114); oraz pełne trójkąty, CD16: 7: ζ (104-138) (mfi 104).
Na figurze 12 pokazano schematycznie diagram chimery CD 16: FcRyll.
Na figurach 13A-B pokazano mobilizację wapnia po sieciowaniu chimer CD4:FcRyII i CD 16: FcRyll. Na fig. 13A pokazano stosunek fluorescencji fioletowej do błękitnej emitowanej przez komórki obciążone wrażliwym na wapń fluoroforem Indo-1 w funkcji czasu po sieciowaniu pozakomórkowej domeny CD 16 przeciwciałami. Na fig,13B pokazano wyniki podobnej analizy wzrostu stosunku fluorescencji fioletowej do błękitnej dla komórek przenoszących chimery CD4:FcRyII, po sieciowaniu przeciwciałami.
Na figurach 14A-B pokazano wyniki testu cytolizy chimer CD4:FcRyII i CD 16: FcRyll. Na fig.l4A pokazano procent 5ICr uwolnionego z komórek hybrydomy anty-CD16 (cel), gdy komórki były eksponowane na zwiększającą się liczbę cytotoksycznych limfocytów T, w których zachodzi ekspresja chimer CD 16: FcRyll (komórki efektorowe). Na fig. 14B pokazano wyniki podobnej analizy cytotoksyczności z udziałem chimer CD4:FcRyU w stosunku do komórek docelowych, w których zachodzi ekspresja glikoprotein kopertowych HIV.
Na figurach 15 A-E przedstawiono identyfikację reszt w ogonie FcRyll A, istotnych dla cytolizy. Fig. 15 A przedstawia schematycznie diagram konstruktów delecyjnych. Na fig. 15B i 15C pokazano mobilizację wapnia i cytolizę karboksy-końcowe delecyjne warianty CD16: FcRyll A. Na fig. 15D i 15E pokazano mobilizację wapnia i cytolizę przez trójdzielne chimery przenoszące coraz mniejszą część końca aminowego wewnątrzkomórkowego ogona CDI 6: FcRyll A.
Na figurze 16 (SEQ ID NO: 24) pokazano sekwencję aminokwasów białka δ receptora CD3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurze 17 (SEQ ID NO: 25) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego y T3; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurze 18 (SEQ ID NO: 26) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego mbl; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
180 066
Na figurze 19 (SEQ ID NO: 27) pokazano sekwencję aminokwasów białka receptorowego B28; sekwencje w ramkach przedstawiają korzystną część przenoszącą sygnał cytolityczny.
Na figurach 20A-E pokazano schematyczny diagram chimer CD4. Cząsteczkę „A” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7; cząsteczkę „B” stanowi CD4 (Dl, D2): Ig:CD7; cząsteczkę „C” stanowi CD4 (D1-D4): Ig:CD7: ζ; cząsteczkę „D” stanowi CD4 (Dl, D2): Ig:CD7: ζ; a cząsteczkę „E” stanowi CD4: ζ. Pozakomórkową domenę ludzkiej cząsteczki CD4 odpowiadającą aminokwasom 1-394 prekursora połączono poprzez miejsce BamHI z zawiasą domeny CHI i CH2 ludzkiego IgGl, w sposób opisany uprzednio (Zettlmeissl i inni, DNA Celi Biol. 9:347 (1990)), z tym że wersję cDNA sekwencji ludzkiego Igs zastosowano, aby umożliwić ekspresję w rekombinantach wirusa krowianki. Dwu-domenową wersję chimery CD4 stworzono przez wstawienie adaptora BamHI w unikatowe miejsce Nhel (odpowiadające aminokwasowi 200) w cDNA prekursora CD4. Sekwencje łączące się z błoną zawierały 22 reszty z pierwszego egzonu ludzkiego IgG 1, związanego z błoną a następnie reszty 146-203 CD7. Aminokwasy 55-163 z ζ służyły jako motyw spustowy czterodzielnych konstruktów (C i D). W czterodzielnych konstruktach zawierających łańcuch ζ wewnątrzkomórkową ekspresję ζ udokumentowano, stosując dostępne w handlu przeciwciała przeciw wewnątrzkomórkowej domenie (Coulter).
Na figurze 21 pokazano cytolizę docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 z udziałem cytotoksycznego klonu komórek T, WH3, w których zachodzi ekspresja różnych chimer pochodzących z CD4 jako cząsteczek efektorowych. W testach cytotoksyczności ludzką ograniczoną linię komórek CD8* CD4' HLA B44, WH3, utrzymywano w IMDM uzupełnionym 10% ludzkiej surowicy, jak to opisano powyżej. Komórki pobudzano γ-napromieniowanymi (3000 rad), B44- przenoszącymi jednojądrowymi komórkami i fitohemaglutyniną(PRA) w stężeniu 1 pg/ml. Po pobudzaniu przez 1 dzień RPA rozcieńczono do 0,5 pg/ml dodając świeży ośrodek; po 3 dniach ośrodek całkowicie zmieniono. Komórki hodowano przez co najmniej 10 dni przed zastosowaniem w testach cytotoksyczności. Komórki zainfekowano odpowiednimi rekombinantami wirusów krowianki w sposób podany w opisie dla vPE16. Całość pozostawiono na 3-4 godziny w celu zajścia infekcji w pełnym ośrodku, po czym komórki zebrano przez odwirowanie ponownie zawieszono w stężeniu 1x107/ml. Próbkę 100 μΐ dodano do każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100 μΐ/studzienkę pełnego ośrodka i rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej próbki nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i całkowite wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLapodlinia S3 (HeLa-S3, ATCC) zainfekowano jak wyżej na 10 cm szalkach w vPEl 6.106 zainfekowanych komórek oddzielono w PBS i 1 mM EDTA, odwirowano i ponownie zawieszono w 100 μΐ5'CR chromianu sodowego (1 mCi/ml w PBS) na 1 godzinę w 37°C, po czym przemyto 3 razy PBS. 100 μΐ znaczonych komórek docelowych dodano do każdej studzienki. Płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji, komórki w każdej studzience ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki (100 μΐ) supematantu pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania γ. Stosunek efektor:cel skorygowano, uwzględniając procent komórek zainfekowanych, oznaczony metodą cytometrii przepływowej.
Na figurze 22 pokazano replikację HIV-1 w transfekowanych liniach komórek. Linie komórek, w których zachodzi trwała ekspresja dzikiego typu CD4 różne rekombinantowe chimery założono w podlinii ludzkiej linii komórek embrionalnych nerki 293. Przygotowano bazowy izolat HIV-1 IIIB o mianie ~106 infekcyjnych cząstek/ml oznaczonym metodą rozcieńczania do punktu końcowego z zastosowaniem ludzkiej linii komórek T C8166 jako wskaźnika. Infekcje prowadzono w przybliżonym MOI 1 przez 8-12 godzin w 37°C. Następnego dnia komórki przemyto PBS 3 razy, trypsynizowano, wysiano na nowych szalkach pobrano próbki supematantów hodowli w celu oznaczenia miana p24 (dzień 0). Następnie w odstępach 3-4 dniowych zbierano supematanty hodowli komórek i przechowywano do oznaczania p24. Hodowle komórek uzupełniono świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę B w stężeniu 100 pg/ml. Analizę su
180 066 pematantów hodowli przeprowadzono, stosując dostępny oparty na teście ELISA zestaw do oznaczania antygenu HIV-1 p24 (Coulter) zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Wyniki odnoszą się do dwóch niezależnych doświadczeń o podobnym czasie trwania.
Na figurze 23 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D1-D4 w CD4 (CD4 Bam).
Na figurze 24 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domen D1-D2 (CD4 Nhe).
Na figurze 25 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów zawiasy, CH2, domen CH3 ludzkiego IgGl (Igh23 Bam).
Na figurze 26 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny przezbłonowej CD7 (TM7 Bam Mlu).
Na figurze 27 pokazano sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów domeny wewnątrzkomórkowej ζ (Zeta Mlu Not).
Na figurze 28 pokazano sekwencję DNA i główną sekwencję aminokwasów syntetycznej helisy a.
Przykład I
Konstrukcja chimer ludzki IgGLreceptor
Ludzkie sekwencje ciężkiego łańcucha IgGl otrzymano przez połączenie sekwencji w domenie Ch3 z fragmentem cDNA pochodzącym z końca 3' przezbłonowej formy przeciwciała mRNA. Fragment końca 3' otrzymano w polimerazowej reakcji łańcuchowej, stosując bibliotekę cDNA z migdałka jako substrat, oraz oligonukleotyd zawierające sekwencje:
CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) oraz CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO:8), odpowiadające odpowiednio końcom 5' i 3' pożądanych fragmentów DNA. 5' oligo jest komplementarny z miejscem w domenie ChI ludzkiego IgGl, a 3' oligo jest komplementarny miejscem przy 5' sekwencji kodujących domenę przenikającą błonę. Produkt PCR strawiono BstXI BamHI zligowano pomiędzy miejsca BstXI i BamHI półsyntetycznego genu przeciwciała IgGl przenoszącego zmienne i stałe regiony. Po insercji fragmentu BstXI do BamHI, zamplifikowane części konstruktu wstawiono w miejsce Smal w Ch3 poprzez restrykcyjną wymianę fragmentów, tak tylko jedna część pomiędzy miejscem Smal i 3' oligo pochodzi z reakcji PCR.
W celu wytworzenia ludzkiego chimerycznego receptora IgGl: ζ, gen ciężkiego łańcucha kończący się w miejscu BamHI połączono z miejscem BamHI chimery ζ opisanej poniżej, tak że sekwencje przeciwciała utworzyły część pozakomórkową. Cytomeria przepływowa komórek COS transfekowanych plazmidem kodującym chimerę wykazała wysoki poziom ekspresj i determinantów przeciwciała przy współtransfekcji plazmidu ekspresji kodującym cDNA lekkiego łańcucha, oraz nieznaczną ekspresję determinantów przeciwciała w nieobecności plazmidu ekspresji lekkiego łańcucha.
Podobne chimery zawierający ludzki IgGl połączony z η lub γ (patrz poniżej), lub z dowolnąprzenoszącą sygnał częściąbiałka receptora komórki T lub receptora Fc można skonstruować zasadniczo w sposób opisany powyżej, wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej.
W celu utworzenia pojedynczej jednostki transkrypcyjnej, która mogłaby umożliwić ekspresję zarówno ciężkiego jak i lekkiego łańcucha z pojedynczego promotora, stworzono plazmid kodujący bi-cistronowy mRNA z ζ i kodujących ciężki i lekki łańcuch, oraz 5' nietranslatowaną częścią mRNA kodującego regulowane przez glukozę białko o 78 kD, określane jako grp78 lub BiP. Sekwencje grp78 uzyskano metodąPCR ludzkiego genomowego DNA, stosując startery zawierające sekwencje:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID NO: 9) oraz
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10) odpowiednio na końcach 5' i 3'. Polimerazowe reakcje łańcuchowe z tymi oligomerami przeprowadzono w obecności 10% dimetylosulfotlenku. Fragment uzyskany PCR strawiono Notl i Hin
180 066 cli i wstawiono pomiędzy miejsca Notl i Hpal w dół od sekwencji kodujących ludzki IgGl. Sekwencje kodujące cDNA lekkiego łańcucha ludzkiego IgGKWstawiono następnie w dół od lidera grp78 wykorzystując miejsce HincII i inne miejsce w wektorze. Plazmid ekspresji uzyskany w wyniku tych manipulacj i zawierał półsyntetyczny gen ciężkiego łańcucha, a następnie kolejno sekwencje lidera grp78, sekwencjeKcDNA lekkiego łańcucha oraz sygnały poliadenylowania pochodzące z fragmentu DNA SV40. Transfekcja komórek COS plazmidem ekspresji zapewniła znacznie zwiększoną ekspresję determinantów ciężkiego łańcucha w porównaniu z transfekcją plazmidu kodującego tylko determinanty ciężkiego łańcucha.
W celu stworzenia genu bicistronowego zawierającego chimerę ciężki łańcuch/receptor lekki łańcuch, sekwencje w górę ciężkiego łańcucha można zastąpić dowolnym opisanym chimerycznym genem ciężki łańcuch/receptor.
Przykład II
Konstrukcja chimer receptora CD4
Ludzki cDNA ζ (Weissman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 85:9709-9713 (1988b) oraz γ (Ktister i inni, J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990) wydzielono metodąpolimerazowej reakcji łańcuchowej z bibliotek uzyskanych z linii komórek nowotworowych HPB-ALL (Aruffo i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b)) oraz z ludzkich naturalnych komórek zabijaczy, podczas gdy η cDNA (Jin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990) wydzielono z biblioteki mysich tymocytów. ζ, η i γ cDNA połączono z pozakomórkową domeną skonstruowanej formy CD4 zawierającej miejsce BamHI tuż w górę od domeny przechodzącej przez błonę (Aruffo i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zettlmeissl i inni, DNA Celi Biol. 9-347-353 (1990)), która była połączona z miejscem BamHI występującym naturalnie w ζ i ηcDNA w podobnym miejscu kilka reszt w górę od domeny przechodzącej przez błonę (SEQ IN NOS: 1,3,4 i 6). W celu uzyskania białka fuzyjnego z γ miejsce BamHI wstawiono do sekwencji w przybliżeniu w tym samym miejscu (fig. 1; SEQ ID NO: 2 i 5). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcjonujący, oraz wstawiono do genomu szczepu krowianki WRna drodze homologicznej rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i inni, J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle i inni, Gene 65:123-128 (1988)). Przepływowa analiza cytometryczna wykazała, że rekombinanty krowianki kierują obfitym wytwarzaniem białek fuzyjnych CD4: ζ i nd CD4: γ na powierzchni komórki, podczas gdy ekspresja CD4: η jest znacząco słabsza (fig. IB). To ostatnie odkrycie jest zgodne z najnowszym doniesieniem, że transfekcja plazmidu ekspresji η cDNA w mysiej linii komórek hybrydomy zapewnia znacznie słabszą ekspresję niż transfekcja porównywalnego plazmidu ekspresji ζ (Clayton i inni, J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990)). Immunostrącanie komórek zainfekowanych rekombinantami krowianki potwierdziło, że białka fuzyjne tworząkowalencyjne dimery w przeciwieństwie do występującego naturalnego antygenu CD4. Stwierdzono, że masy cząsteczkowe monomerycznych białek fuzyjnych CD4: ζ i CD4: γ oraz natywnego CD4 wynoszą odpowiednio 63, 55 i 53 kD. Większe masy białek fuzyjnych w przybliżeniu odpowiadają większej długości części wewnątrzkomórkowych, przewyższających długość natywnej CD4 o 75 (CD4: ζ) lub 5 (CD4: γ) reszt.
Przykład III
Chimery CD4 mogą ulegać asocjacji z innymi łańcuchami receptora
Ekspresję na powierzchni komórek formy makrofag/naturalna komórka zabijacz ludzkiego FcyRIII (CDI 6tm) na transfektantach ułatwia się poprzez współtransfekcję z mysim (Kurosaki i inni, Naturę 342:805-807 (1989)) lub ludzkim (Hibbsiinni, Science 246:1608-1611 (1989)) γ, a także z ludzkim ζ (Lanier i inni, Naturę 342:803-805 (1989)).
Zgodnie z tymi doniesieniami ekspresja chimer również umożliwia powierzchniową ekspresję CD16TM po doprowadzeniu do komórki docelowej na drodze współtransfekcji lub współinfekcji zrekombinowanymi wirusami krowianki (fig. 2). Ułatwianie powierzchniowej ekspresji CD 16TM przez ζ było znaczniejsze niż w przypadku γ (fig. 2) w badanej linii komórek, natomiast natywny CD4 nie wzmacniał powierzchniowej ekspresji CD16TM.
180 066
Przykład IV
Mutanty Asp ζ nie współasocjują z receptorem PC
W celu stworzenia chimer, które mogłyby nie asocjować z istniejącym antygenem lub receptorami Fc, wytworzono mutantowe białka fuzyjne ζ, które nie zawierały reszt, wewnątrzbłonowej Asp i/lub wewnątrzbłonowej Cys. Cytometria przepływowa wykazała, że nie występuje znacząca różnica w intensywności ekspresj i na powierzchni komórek w przypadku różnych chimer mutantowych w porównaniu z nie mutowanym prekursorem, a eksperymenty immunoprecypitacji wykazały, że całkowita ekspresja przez chimery przebiega podobnie. Zgodnie z oczekiwaniem, chimery mutantowe nie zawierające przezbłonowej reszty cysteiny nie tworzą dimerów z połączeniem disulfidowym. Dwie mutantowe chimery pozbawione Asp nie były zdolne do podtrzymywania powierzchniowej ekspresji CD16TM, a monomeryczne chimery nie zawierające Cys, ale zawierające Asp, umożliwiająkoekspresję CD16TM, ale z niniejszą wydajnością niż dimer macierzysty (fig. 3).
Przykład V
Mutantowe receptory zachowują zdolność do inicjowania reakcji wapniowej
W celu ustalenia, czy sieciowanie białek fuzyjnych może spowodować nagromadzanie się wolnego wewnątrzkomórkowego wapnia w podobny sposób jak w przypadku receptora antygenu komórki T, komórki ludzkiej linii komórek białaczki T, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), zainfekowano rekombinantami krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wapnia po sieciowaniu pozakomórkowej domeny z przeciwciałami. Pomiary metodącytometrii przepływowej przeprowadzono dla komórek obciążonych wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986). Na fig. 4A-D pokazano wyniki eksperymentów z przepływem wapnia dla komórek zainfekowanych CD4: ζ, oraz mutantami Asp i Cys'. Sieciowanie chimer powtarzanie zwiększa wewnątrzkomórkowy poziom wapnia. CD4: η i CD4: γ również umożliwiają nagromadzanie wewnątrzkomórkowego wapnia w zainfekowanych komórkach. Komórki Jurkata wytwarzają w wyniku ekspresji mniejsze ilości CD4 na powierzchni, z tym że sieciowanie natywnego CD4 w obecności lub bez CDI6: ζ nie wpływa na wewnątrzkomórkowy poziom wapnia (fig. 4A-B).
Przykład VI
Chimery η oraz γ uczestniczą w cytolizie celów, w których zachodzi ekspresja HIV gpl20/41 '
W celu stwierdzenia, czy chimeryczne receptory mogą uruchamiać cytolityczne programy efektorowe, stworzono modelowy układ cel:efektor oparty na rozpoznawaniu przez CD4 kompleksu kopertowego HIV gp 120/gp41. Komórki HeLa zainfekowano rekombinantowymi wirusami krowianki, w których zachodzi ekspresja gp 120/gp41 (Chakrabarti i inni, Naturę 320:535-537 (1986); Earl i inni, J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) oraz wykonano znakowanie 51Cr. Znakowane komórki inkubowano z komórkami z ludzkiej allospecyficznej (CD8+, CD4) cytotoksycznej linii limfocytów T, którą zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CD4: ζ, CD4: r|lub CD4: γ, lub podwójnąmutantowąchimerąCD4: ζCysl lGly:Asp!5Gly. Na fig. 5 A-C pokazano, że komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41 zostały specyficznie zlizowane przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL), w których zachodzi ekspresja chimery CD4. Niezainfekowane komórki HeLa nie stanowiły celu dla CTL zawierającymi chimery CD4: ζ, a komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja gpl20/41 nie były rozpoznawane przez nie zainfekowane CTL. W celu porównania działania różnych chimer stosunki efektor:cel skorygowano uwzględniając frakcję CTL, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, oraz frakcję komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oznaczone metodą cytometrii przepływowej.
Na figurze 5C pokazano cytometryczną analizę ekspresji CD4 przez CTL stosowane w eksperymentach cytolizy pokazanych Na fig. 5A i 5B. Jakkolwiek średnia gęstość powierzchniowa CD4: ζ znacznie przewyższa średnią gęstość CD4: η, to cytolityczne zdolności komórek, w których zachodzi ekspresja obydwu form były podobne. Przy korygowaniu uwzględniającym
180 066 frakcję celów, w których zachodzi ekspresja gp!20, skuteczności cytolizy z udziałem białek CD4: ζ i CD4: η są porównywalne z najlepszymi podawanymi skutecznościami dla par cekefektor określonego receptora komórki T (średni stosunek efektora do celu dla 50% uwalniania przez komórki T, w których zachodzi ekspresja CD4: ζ wynosił 1,9 ± 0,99, n = 10. Fuzja CD4: γ była mniej aktywna, podobnie jak fuzja CD4: ζ nie zawierająca przezbłonowych reszt Asp i Cys. Jednakże w obydwu przypadkach zaobserwowano znaczącą cytolizę (fig. 5B-C).
Aby sprawdzić ewentualność, że infekcja krowianką może ułatwić artefaktyczne rozpoznawanie przez CTL, przeprowadzono podobne eksperymenty cytolizy z komórkami docelowymi zainfekowanymi rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja formy CD 16 połączonej z fosfatydyloinozytolem (CD16PI) i znakowanymi5'CR, oraz z CTL zainfekowanymi kontrolnymi rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD16PI lub CD 16: ζ. Na fig. 6A pokazano, komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer nie-CD4, nie rozpoznająnatywnych komórek HeLa lub komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41, oraz, podobnie, że komórki T, w których zachodzi ekspresja chimer CD4, nie rozpoznają komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja innych białek powierzchniowych kodowanych przez krowiankę. Na dodatek CTL, w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD4, nie powodująw znaczącym stopniu lizy komórek HeLa, w których zachodzi ekspresja gp 120/41 (fig. 6A).
Przykład VII
Komórki przenoszące MEC klasy II nie stanowią celu dla chimer
Uważa się, że CD4 oddziaływuje z niepolimorficzną sekwencją wytwarzaną w wyniku ekspresji przez antygen MHC klasy II (Gay i inni, Naturę 328:626-629 (1987); Sleckman i inni, Naturę 328:351-353 (1987)). Jakkolwiek specyficzne oddziaływanie między CD4 i antygenem klasy Π nigdy nie zostało udokumentowane na oczyszczonych białkach, w pewnych warunkach można było stwierdzić adhezję komórek, w których zachodzi ekspresja CD4, do komórek, w których zachodzi ekspresja cząsteczek klasy II (Doyle i inni, Naturę 330:256-259 (1987); Clayton i inni, J. Exp. Med. 177:1243-1253 (1990); Lamarre i inni,. Science 245:743-746 (1989)). Zbadano następnie, czy można wykryć zabijanie komórek przenoszących klasę II. Na fig. 6B pokazano, że nie obserwuje się specyficznej cytolizy skierowanej przez CD4: ζ przeciw linii komórek Raji B, w których zachodzi obfita ekspresja antygenu klasy U. Jakkolwiek zaobserwowano słabą (~ 5%) cytolizę, mutant klasy II-ujemny Raji, RJ2.2.5, (Accolla J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)) wykazuje podobną podatność jak komórki Raji inkubowane z nie zainfekowanymi komórkami T.
Przykład VIII
Wymagania odnośnie sekwencji do indukowania cytolizy przez łańcuch antygen komórki T/Fc receptor ζ
Jakkolwiek chimery pomiędzy CD4 i ζ mogą uzbrajać cytotoksyczne limfocyty T (CTL), tak aby zabijały one docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja HIV gpl20, poszukiwano alternatywny dla CD4, aby bezwarunkowo porównać właściwości chimer ζ wprowadzonych do ludzkich linii komórek T. Linie takie mogą wytwarzać w wyniku ekspresji CD4, co utrudnia konkretne ustalenie zależności pomiędzy typem i stopniem mobilizacji białkowej oraz potencjałem cytotoksycznym różnych chimer. Aby obejść ten problem wytworzono chimery pomiędzy ζ i CD 16, w których pozakomórkową domena CD 16 j est połączona z przezbłonowymi i wewnątrzkomórkowymi sekwencjami ζ (fig. 7A). Fuzje genowe wprowadzono do plazmidu ekspresji wirusa krowianki przenoszącego gen gpt E. coli jako marker selekcji, po czym wykonano insercję do genomu szczepu krowianki WR na drodze homologicznej rekombinacji i selekcji względem wzrostu w kwasie mikofenolowym (Falkner i Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle i Coupar, Gene 65:123(1988)).
Linie komórek T zainfekowano rekombinantami krowianki i zmierzono względne cytoplazmatyczne stężenie wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen przeciwciałami. Zarówno spektrofluorometryczne (populacja w masie) jak i przepływowe cytometryczne (pojedyncza komórka) pomiary przeprowadzono dla komórek obciążonych barwnikiem Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952 (1986)). Na fig. 7B pokazano wyniki lizy danych zebranych z komórek ludz180 066 kiej linii komórek białaczki T Jurkata, zainfekowanych rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja białka fuzyjnego CD16: ζ. Sieciujące chimery powtarzalnie zwiększają wewnątrzkomórkowy poziom wapnia, podczas gdy podobna obróbka komórek w których zachodzi ekspresja niechimerycznego CD 16, wywiera co najwyżej minimalny wpływ. Gdy chimera jest wytwarzana w wyniku ekspresji w mutantowych liniach komórek nie zawierających receptora antygenu, obserwuje się REX33A (Breitmeyer i inni, J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho i inni, J. Biol. Chem. 264:20760 (1989)), lub mutant Jurkata JRT3.T3.5 (Weiss i inni, J. Immunol. 135:123 (1984)); albo silnąreakcję na sieciowanie przeciwciała CD 16. Podobne wyniki zebrano dla mutantowej linii komórek REX20A (Breitmeyer i inni, supra, 1987; Blumberg i inni, J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) oraz dla CD3/Ti-ujemnego mutanta linii komórek Jurkata założonej w tym laboratorium. Infekcja rekombinantami, w których zachodzi ekspresja CD 16: ζ, nie odtwarza reakcji na przeciwciała anty-CD3, co wykazuje, że białko fuzyjne nie oddziaływuje poprzez uwalnianie łańcuchów wewnątrzkomórkowego kompleksu CD3.
Aby ocenić zdolność chimer do zmiany kierunku odporności z udziałem komórek CTL zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CDI 6, po czym zastosowano do przeprowadzenia specyficznej lizy komórek hybrydomy, w których zachodzi ekspresja związanych z błoną przeciwciał anty-CD16. Test ten stanowi rozszerzenie testu cytotoksyczności hybrydomy opracowanego pierwotnie do analizowania mechanizmów efektorowych komórek przenoszących receptory Fc (Graziano i Fanger, J. Immunol. 138:945, 1987; Graziano i Fanger, J. Immunol. 139:35-36,1987; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959,1989; Fanger i inni, Immunol. Today 10:92,1989). Na fig. 8B pokazano, że ekspresja CD16: ζ w cytotoksycznych limfocytach T umożliwia uzbrojenie CTL tak, że zabija on komórki hybrydomy 3G8 (anty-CD16; Fleit i inni, Proc. Natl. Acad, Sci, USA 79:3275, 1982), podczas gdy CTL, w których zachodzi ekspresja formy CD 16 połączonej z fosfatydyloinozytolem, jest nieaktywny. CTL uzbrojony w CD 16: ζ również nie zabija komórek hybrydomy, w których zachodzi ekspresja niewłaściwego przeciwciała.
Aby zidentyfikować minimalne sekwencje ζ niezbędne do zajścia cytolizy, otrzymano szereg mutantów delecyjnych, w których kolejno coraz więcej wewnątrzkomórkowej domeny ζ usunięto z końca karboksylowego (fig. 8A). Większość wewnątrzkomórkowej domeny ζ można usunąć z niewielkimi konsekwencjami w odniesieniu do potencjału cytolitycznego: pełnej długości chimera CD 16: ζ była zasadniczo równa pod względem skuteczności z chimerą w której wykonano delecję do reszty 65, CD 16: ζ Asp66* (fig. 8B). Zasadniczy spadek cytotoksyczności zaobserwowano w przypadku delecji do reszty ζ 59 (chimera CD16^ Glu60*), a dalsza delecja do reszty 50 spowodowała nieznaczny spadek aktywności. Jednakże pełnej utraty aktywności nie zaobserwowano nawet wtedy, gdy wewnątrzkomórkową domenę zredukowano do 3 reszt zakotwiczenia przezbłonowego (fig. 8B).
Z uwagi na to, że ζ jest dimerem z połączeniem disulfidowym, jedno z wyjaśnień zachowania aktywności cytolitycznej opiera się na tym, że endogenny ζ tworzy heterodimery z chimeryczną delecją ζ, co powoduje odtworzenie aktywności. W celu sprawdzenia tego założenia reszty ζ lii 15 zmieniono z Asp i Cys odpowiednio na Gly (Cys HGly/Aspl5Gly), po czym przeprowadzono immunoprecypitacje w sposób następujący. Około 2 χ 106 komórek CV1 zainfekowano przez 1 godzinę w ośrodku DME pozbawionym surowicy, ze zrekombinowanąkrowianką przy krotności infekcji (moi) co najmniej 10. 6-8 godzin po infekcji komórki oddzielono od płytek za pomocą PB S/1 mM EDTA i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,2 mCi 1251 na 2 χ 106 komórek stosując laktoperoksydazę i H2O2, metodą Clarka i Einfelda (Leukócyte Typingll, str. 155-167, Springer Verlag, NY, 1986). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0, 5mM MgCl2, 5mM KC1, 0,2M jodoacetamid i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 3G8 (Fleit i inni, supra, 1982; Medarex) oraz agaroząz anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddano elektroforezie przez 8% żel poliakrylamid/SDS w warunkach nieredukujących lub przez 10% żel w warunkach
180 066 redukujących. Takie immunoprecypitacje potwierdziły, że chimera CD16: ζ Cysl!Gly/Aspl5Gly nie tworzy asocjatów w strukturach dimerowych z połączeniem disulfidowym.
Zbadano również cytolityczną aktywność receptorów mutantowych. Zmutowana chimera z delecjądo reszty 65 (CD 16: ζ Cysl IGly/Asp 15Gly/Asp66*) była, zależnie od warunków testu, 2-8 razy mniej aktywna w teście cytolizy niż porównywalna niemutowana chimera (CD 16: ζ Asp66*), która zazwyczaj wykazywała aktywność mniej niż dwukrotnie niższą lub nierozróżnialną od aktywności CD 16: ζ (fig. 9B). Spadek aktywności mutantowej chimery jest podobny do spadku obserwowanego dla chimer CD4 o podobnej budowie (patrz powyżej) i można go najprawdopodobniej przypisać zmniejszonej skuteczności monomerów ζ w porównaniu z dimerami. Natomiast zmutowana chimera Asp’, Cys’ z delecjądo reszty 59 nie wykazuje aktywności cytolitycznej (fig. 9B), co potwierdza hipotezę, że asocjacja z innymi łańcuchami z udziałem przezbłonowych reszt Cys i/lub Asp jest odpowiedzialna za słabą stabilność aktywności cytolitycznej w delecjach wykraczających poza resztę 65 od końca aminowego.
Badania przepływu cytometrycznego wykazały, że mutanty delecyjne nie zawierające przezbłonowych reszt Asp i Cys mogą w dalszym ciągu powodować wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego wolnych jonów wapniowych w reakcji na sieciowanie przeciwciałami w TCR-mutantowej linii komórek Jurkata (fig. 9D). Podobne wyniki uzyskano dla chimer powstających w wyniku ekspresji w macierzystej linii Jurkata. W przypadku Εϋ16:ζ Cysl lGly/Aspl5Gly/Glu60* wyniki wskazują, że zdolność w uczestniczeniu w reaktywności wapniowej można mutacyjnie oddzielić od zdolności do podtrzymywania cytolizy.
Aby definitywnie wyeliminować ewentualny wpływ przezbłonowych reszt ζ, przezbłonowe i pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt ζ zastąpiono sekwencjami kodującymi przejście przez błonę oraz odpowiednio pierwszych 14 lub pierwszych 17 cytoplazmatycznych reszt antygenów CD5 lub CD7 (fig. 9A). Uzyskane trójdzielne białka fuzyjne CD 16: 5: ζ (48-65) i CD 16: 7: ζ (48-65) nie tworzą dimerów z połączeniem disulfidowym, podobnie jak prostsze chimery CDI 6: ζ, gdyż nie zawierająone cysteiny w przezbłonowej domenie ζ. Obydwie trójdzielne chimery były zdolne do mobilizowania wapnia w liniach komórek Jurkata i TCR-ujemnej (fig. 9D) oraz wywoływały reakcję cytolityczną w CTL (fig. 9C oraz dane nie pokazane). Natomiast skrócenie części ζ do reszty 59 w chimerze CD16: 7: ζ (48-59) znosi zdolność trójdzielnej fuzji do kierowania reaktywnością wapniową w TCR-dodatnich lub -ujemnych komórkach Jurkata oraz do cytolizy w dojrzałych CTL (fig. 9C i 9D oraz dane nie pokazane).
W celu zbadania udziałów poszczególnych reszt w motywie o 18 resztach wykonano szereg wariantów mutantowych na drodze mutagenezy ukierunkowanej, oraz oceniono ich zdolność do uczestniczenia w kierowanym przez receptor zabijaniu w warunkach niskiej (fig. 10A i 1 OD) lub wysokiej (fig. 10B i 10E) ekspresji chimerycznego receptora. Na fig. 10A-F pokazano, że jakkolwiek szereg zachowawczych podstawień (np. zastępowanie reszt kwasowych ich pokrewnymi amidami lub tyrozyny fenyloalaniną) rozdzielających reszty 59 do 63 powoduje umiarkowany spadek skuteczności cytolitycznej, to w zasadzie warianty zachowują zdolność do mobilizowania wapnia. Jednakże reszty te stanowią łącznie ważny podmotyw, gdyż ich delecja eliminuje aktywność cytolityczną. Zmiana Tyr 62 na Phe lub Ser eliminuje zarówno cytotoksyczność jak i reakcje wapniowe. Przy końcu aminowym segmentu o 18 resztach zastąpienie Tyr 51 przez Phe eliminuje zarówno mobilizację wapnia jak i aktywność cytolityczną, natomiast zastąpienie Leu przez Ser w pozycji 50 eliminuje reakcję wapniową, ale tylko nieznacznie osłabia cytolizę. Nie wiążąc się żadną hipotezą wydaje się, że niezdolność mutanta Leu50Ser do mobilizowania wapnia w krótkotrwałym teście przepływu cytometrycznego nie w pełni odzwierciedla jego zdolność do znaczącego zwiększania wewnątrzkomórkowego stężenia wolnych jonów wapniowych w dłużej trwającym teście cytolizy. Jednakże o niewrażliwej na wapń aktywności cytolitycznej doniesiono w przypadku pewnych cytolitycznych linii komórek T, tak że nie można wykluczyć, że podobne zjawisko leży u podstaw uzyskanych rezultatów. Zastąpienie Asn48 przez Ser częściowo zmniejsza cytotoksyczność w pewnych eksperymentach, a w innych wywiera nieznaczny wpływ.
180 066
W celu zbadania potencjalnej roli zbędnych elementów sekwencji wewnątrzkomórkową domenę ζ podzielono na 3 segmenty, obejmujące reszty 33 do 65,71 do 104 oraz 104 do 138. Każdy z tych segmentów przyłączono do chimery CD 16: CD7 przez miejsce Mlul wprowadzone za podstawowymi sekwencjami wewnątrzkomórkowej domeny CD7 zakotwiczenia w błonie (patrz poniżej; fig. 11 A). Porównanie działania cytolitycznego trzech elementów wykazuje, że są one zasadniczo jednakowo skuteczne (fig. 1 IB). Porównanie sekwencji (fig. 11 A) wykazało, że drugi motyw przenosi 11 reszt pomiędzy tyrozynami, podczas gdy pierwszy i trzeci motyw zawierają po 10 reszt.
Jakkolwiek nie ustalono dokładnie procesu uaktywniania komórki T, wyraźnie widać, że agregacja receptora antygenu lub chimer receptora przenoszących wewnątrzkomórkowe sekwencje ζ uaktywnia mobilizację wapnia, uwalnianie cytokiny i granulki, oraz ujawnienie się markerów aktywujących na powierzchni komórki. Aktywne miejsce w ζ, krótka liniowa sekwencja peptydowa, prawdopodobnie zbyt mała, aby wykazywać własną aktywność enzymatyczną prawdopodobnie oddziaływuje z jednym lub co najwyżej kilkoma białkami uczestnicząc w uaktywnieniu komórki. Wyraźnie również widać, że sama mobilizacja wolnego wapnia nie wystarcza do uaktywnienia komórki, gdyż zdolność do uczestniczenia w cytolizie można mutacyjnie oddzielić od zdolności do uczestniczenia w nagromadzaniu wapnia.
Jak to wykazano, dodanie 18 reszt z wewnątrzkomórkowej domeny ζ do przezbłonowej i wewnątrzkomórkowej domeny dwóch nie spokrewnionych białek powoduje, że uzyskane chimery ukierunkowują cytolityczną aktywność przeciw komórkom docelowym, które wiążąsię z pozakomórkową częścią białek fuzyjnych. Jakkolwiek chimery przenoszące motyw o 18 resztach są w przybliżeniu ośmiokrotnie mniej aktywne niż chimery oparte na pełnej długości ζ, zmniejszoną aktywność można przypisać utracie oddziaływań przezbłonowych, które normalnie umożliwiajątworzenie przez ζ dzikiego typu dimerów z połączeniem disulfidowym. Oznacza to, że konstrukty delecyjne ζ zawierające taki sam koniec karboksylowy jak motyw, oraz nie zawierające przezbłonowych reszt Cys i Asp zazwyczaj wykazują mniejszą aktywność niż chimery przenoszące tylko motyw o 18 resztach.
Cytolityczny element kompetencyjny, na który zwrócono uwagę, zawiera dwie tyrozyny oraz nie zawiera seryn ani treonin, co ogranicza ewentualny udział fosforylowania w aktywności. Mutacja którejkolwiek z tyrozyn niszczy aktywność, z tym że, mimo iż wstępne eksperymenty nie wykazały znaczącego fosforylowania tyrozyny po usieciowaniu chimerycznych antygenów powierzchniowych zawierających motyw o 18 resztach, nie można wykluczyć ewentualnego udziału takiego fosforylowania na niskim poziomie. Oprócz zaobserwowanego wpływu reszt tyrozynowych szereg podstawień na końcu aminowym i karboksylowym motywu osłabia aktywność w warunkach małej gęstości receptora.
Sekwencje podobne do aktywnego motywu ζ znaleźć można w cytoplazmatycznych domenach szeregu innych białek przezbłonowych, w tym w cząsteczkach CD3 δ i γ, w związanych z powierzchniowym IgM białkach mbi i B29, oraz w łańcuchach β i γ receptora IgE o wysokim powinowactwie, FceRI (Reth, Naturę 338:383, 1989). Jakkolwiek działanie tych sekwencji nie jest pewne, to przy wydajnej ekspresji każda może być zdolna do autonomicznego uaktywniania komórki T; taką właśnie aktywnością można wyjaśnić resztkową reaktywność TCR obserwowaną w ζ -ujemnej mutantowej linii komórek (Sussman i inni, Celi 52:85, 1988).
Sam ζ przenosi 3 takie sekwencje, w przybliżeniu równomiernie rozmieszczone, a zgrubny podział na 3 części wewnątrzkomórkowej domeny wykazuje, że każda z nich jest zdolna do inicjowania reakcji cytolitycznej. η, stykowa ϊζοίοπη3ζ (Jin i inni, supra, 1990; Clayton i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202,1991), nie zawiera karboksylowej połówki trzeciego motywu. W związku z tym, że usunięcie karboksylowej połówki pierwszego motywu eliminuje aktywność, wydaje się prawdopodobne, że większość aktywności biologicznej η można przypisać pierwszym dwóm motywom. Choć w różnych pomiarach η wykazuje taką samą aktywność jak ζ w inicjowaniu uwalniania cytokiny z udziałem antygenu (Bauer i inni, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:3842,1991) lub w ukierunkowywaniu cytolizy (patrz powyżej), η nie ulega fosforylowaniu w odpowiedzi na pobudzanie receptora (Bauer i inni, supra, 1991). W związku z tym albo obecność
180 066 wszystkich trzech motywów jest niezbędna do zajścia fosfory lo wania, albo też trzeci motyw stanowi korzystny substrat dla niezidentyfikowanej kinazy tyrozynowej.
Przykład IX
Transdukcja sygnału cytolitycznego przez ludzki receptor Fc
Aby ocenić działanie różnych podtypów ludzkiego receptora Fc stworzono chimeryczne cząsteczki, w których pozakomórkową domenę ludzkich antygenów CD4, CD 5 lub CD 16 połączono z przezbłonową i wewnątrzkomórkową domenąFcRIIyA, podtypy BI, B2 i C (nomenklatura Ravetcha i Kineta, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991). W szczególności sekwencje cDNA odpowiadające domenom przezbłonowym i cytoplazmatycznym uprzednio opisanych izoform FCRIIA BI i B2 zamplifikowano z istniejącego klonu PC23 lub z biblioteki cDNA ludzkiego migdałka (skonstruowanej znanymi sposobami) stosując następujące syntetyczne startery oligonukleotydowe:
CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID NO: 18; FCRIIA do przodu);
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO: 19; FCRII A odwrotnie);
GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO: 20; FCRII BI i FCRII B2 do przodu); oraz
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO: 21; FCRII BU i
FCRII B2 odwrotnie).
Startery te zawierały miejsca rozszczepiania odpowiednio dla enzymów BamHI i Notl, 6 reszt od końca 5'. Miejsce Notl znajdowało się bezpośrednio za kodonem terminacyjnym typu nonsens, CTA lub TTA. Wszystkie startery zawierały 18 lub więcej reszt komplementarnych z końcami 5' i 3' pożądanych fragmentów. Fragment cDNA odpowiadający cytoplazmatycznej domenie FcRUyC, różniącej się od izoformy IIA jedynie jedną resztą aminokwasu (L zamiast P w reszcie 268) wytworzono metodą ukierunkowanej mutagenezy przez nakładanie PCR, stosując startery o sekwencjach:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID NO: 22) oraz TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO: 23).
Fragmenty PCR wstawiono do wektorów ekspresji wirusa krowianki, które zawierały odpowiednio pozakomórkowe domeny CD 16 lub CD4, po czym wykonano insercję do dzikiego typu krowianki na drodze rekombinacji w locus kinazy tymidynowej, przeprowadzając selekcję względem współintegracji z gpt E. coli, aby ułatwić identyfikację pożądanych rekombinantów. Identyczność wszystkich izoform (pokazanych Na fig. 12) potwierdzono przez sekwencjonowanie didezoksy.
Wytwarzanie chimerycznych białek receptorowych potwierdzono w badaniach immunoprecypitacji. Około 107 komórek JRT3.T3.5 zainfekowano przez 1 godzinę w pozbawionym surowicy ośrodku IMDM ze zrekombinowanąkrowiankąprzy krotności infekcji co najmniej 10. W 12 godzin po infekcji komórki zebrano i przeprowadzono znakowanie powierzchniowe 0,5 mCi 125I na 107 komórek stosując metodę z laktoperoksydaząi oksydazą glukozową (Clark i Einfeld, supra). Znakowane komórki zebrano przez odwirowanie i przeprowadzono lizę w 1% NP-40,0,1 mMMgCl2,5mM KC1,0,2Mjodoacetamid i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, po czym wykonano immunoprecypitację białek CD 16 przeciwciałem 4G8 oraz agarozą z anty-mysim IgG. Próbki poddano elektroforezie w warunkach redukujących. Wszystkie cząsteczki immunostrącanego chimerycznego receptora cząsteczki wykazywały oczekiwane masy cząsteczkowe.
W celu zbadania zdolności chimerycznych receptorów do uczestniczenia w zwiększaniu cytoplazmatycznego stężenia wolnych jonów wapniowych zastosowano zrekombinowane wirusy do zainfekowania TCR-mutantowej linii komórek Jurkata JRT3.T3.5 (jak to opisano powyżej), cytoplazmatyczne stężenie wolnego wapnia oznaczano w komórkach (w sposób opisany powyżej) po sieciowaniu pozakomórkowych domen receptora monoklonalnymi przeciwciałami 3GS lub Leu-3A (w sposób opisany powyżej). Eksperymenty te potwierdziły, że wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, A i C były zdolne do uczestniczenia w zwiększaniu cytoplazmatycz
180 066 nego stężenia wolnych jonów wapniowych po sieciowaniu pozakomórkowych domen, podczas gdy wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll, BI i B2, były nieaktywne w porównywalnych warunkach (fig. 13 A i 13B). Hybrydy CD4, CD5 i CD 16 FcRyll A wykazują zasadniczo równą zdolność we wzmacnianiu reakcji wapniowej (fig. 13A-B). Inne linie komórek, zarówno z linii monocytowych jak i limfocytowych, były zdolne do odpowiadania na sygnał zainicjowany przez sieciowanie domen pozakomórkowych.
W celu wyjaśnienia roli różnych wewnątrzkomórkowych domen FcRyll w cytolizie ludzkie cytotoksyczne limfocyty T (CTL) zainfekowano rekombinantami krowianki, w których zachodzi ekspresja chimer CD 16: FcRyll A, Β1, B2 oraz C. Zainfekowane komórki współhodowano następnie z 51Cr-obciążonymi komórkami hybrydomy (np. komórkami 3GS 10-2), które wytwarzają w wyniku ekspresji powierzchniowe przeciwciała względem CD 16. W teście tym CTL przenoszące chimerę CD 16 zabijają docelowe komórki hybrydomy (co umożliwia uwolnienie wolnego 51 Cr), jeśli pozakomórkowa domena CD 16 chimery była połączona z wewnątrzkomórkowym segmentem zdolnym do uaktywnienia limfocytowego programu efektorowego; ten test cytolizy opisano szczegółowo poniżej. Na fig. 14A pokazano, że CTL uzbrojone w CD16: FcRyllA oraz C, ale nie w FcRyll BI lub B2, sązdolne do przeprowadzania lizy docelowych komórek, w których zachodzi ekspresja anty-CD16 przeciwciał powierzchni komórki.
Aby wyeliminować ewentualność, że specyficzna cytoliza może być w pewnym stopniu przypisana oddziaływaniu z grupą CD 16, przeprowadzono eksperymenty cytolizy, których wewnątrzkomórkowe domeny FcRII przyłączono do pozakomórkowych domen CD4. W takim przypadku komórkami docelowymi były komórki HeLa, w których zachodzi ekspresja białek gpl2/41 koperty HIV (w szczególności komórki HeLa zainfekowane wektorem krowianki vPEl 6 (dostępnym z National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Podobnie jak dla układu CD 16, docelowe komórki, w których zachodzi ekspresja koperty HIV, były podatne na lizę przez komórki T, w których zachodzi ekspresja chimery CD4: FcRyll A, ale nie FcRyll BI lub B2 (fig. 14B).
Wewnątrzkomórkowe domeny FcRyll A i C nie dzielą zasadniczej homologii sekwencji z jakimkolwiek innym białkiem, w tym z elementami rozszerzonej rodziny FcRy/TCR4. W celu ustalenia elementów sekwencji odpowiedzialnych za indukcję cytolizy wykonano delecje 5' i 3' sekwencji kodujących wewnątrzkomórkowe domeny (opisane poniżej i pokazane na fig. 15A) oraz oceniono ich skuteczność w testach mobilizacji wapnia cytolizy (w sposób opisany powyżej). W tych eksperymentach, w których usunięto amino-końcową część wewnątrzkomórkowej domeny, przezbłonową domenę FcRyll zastąpiono przezbłonową domeną niespokrewnionego antygenu CD7, tak aby wyeliminować ewentualny udział oddziaływań z udziałem domeny przenikającej przez błonę.
Na figurze 15B i 15C pokazano, że usunięcie 14 karboksy-końcowych reszt, obejmujących tyrozynę 298 powoduje całkowitą utratę zdolności cytolitycznej oraz zasadnicze zmniejszenie potencjału mobilizacji wapnia. Dalsza delecja do miejsca tuż przed tyrozyną 282 dała identyczny fenotyp (fig. 15B i 15C). Delecja od końca N wewnątrzkomórkowej domeny do reszty 268 nie wywierała zasadniczego wpływu ani na profil wapnia ani na zdolność cytolityczną, podczas gdy delecja do reszty 275 znacząco zaburzyła uwalnianie wapnia, ale wywarła nieznaczny wpływ na cytolizę (fig. 15D i 15E). Dalsza delecja do reszty 282 dała ogon FcRyll, który nie wykazuje zdolności do mobilizowania wapnia ani do uruchamiania cytolizy (fig. 15D i 15E). „Aktywny element” określony w tych zgrubnych pomiarach jest względnie duży (36 aminokwasów) i zawiera dwie tyrozyny rozdzielone przez 16 reszt.
Przykład X
Ukierunkowana cytoliza przez limfocyty przenoszące chimeryczne receptory CD4, które nie podtrzymują infekcji
Jak to przedstawiono powyżej, można skonstruować takie cząsteczki efektorowe, które ukierunkowują aktywność cytolityczną CTL w sposób niezależny do MHC. Tak np. chimera złożona z pozakomórkowej domeny CD4 połączonej z łańcuchem w ludzkim klonie CTL, WH3, specyficznie zabija komórki docelowe zawierające powierzchniową glikoproteinę kopertową
180 066
HIV-1, gpl20.W związku z tym, że pozakomórkowa domena cząsteczki CD4 nadaje podatność na infekcję HIV, uzbrojone CTL mogą stanowić cele dla wirusa, co osłabi ich skuteczność (Dalgleish i inni, Naturę 312:767 (1984); Klatzmann i inni, Naturę 312:767 (1984)). Aby zapobiec takim skutkom, zaprojektowano chimeryczne cząsteczki efektorowe oparte na CD4, skutecznym w specyficznym doprowadzaniu do komórek zainfekowanych przez HIV w celu doprowadzenia do ich zabicia, ale który nie nadaje podatności na infekcję HIV.
Stworzono trójdzielne białko fuzyjne przez genetyczne złożenie pozakomórkowej domeny CD4 (fig. 23) z zawiasą oraz drugą i trzecią stałą domeną ciężkiego łańcucha ludzkiego I-gGl (Zettlmeissl i inni DNA Celi Biol, 2:347 (1990)) (fig. 25), które połączono w tym przypadku z częścią pierwszego przezbłonowego egzonu ludzkiego IgGl związanego z błoną, po której następowała część ludzkiego antygenu CD7 obejmująca sekwencje pomiędzy samą Ig-podobną domeną oraz sekwencję przenoszącą terminacją, a następnie domenę przezbłonową (Aruffo i Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Główna sekwencja aminokwasów grupy pozakomórkowej segmentu CD7 zawiera obszar bogaty w prolinę przypominający łodygo-podobną strukturę, która przenika Ig-podobną domenę z dala od powierzchni komórki (Aruffo i Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Otrzymano zrekombinowane wirusy krowianki, które wytwarzają w wyniku ekspresji te i inne chimery, w sposób podany w opisie.
W szczególności zrekombinowane wirusy krowianki wygenerowano na drodze homologicznej rekombinacji w komórkach CV-1. Przeprowadzono co najmniej dwie rundy wizualizacji łysinek z OKT4 lub Leu3, po czym przeprowadzono oczyszczanie łysinek dla każdego asortymentu przed otrzymaniem asortymentów o wysokim mianie w komórkach CV-1.
Trójdzielna chimera (CD4 (Dl-D4):Ig:CD7) (fig. 20, cząsteczka „A”) wykazywała wydajną ekspresję na powierzchni komórki i została zbadana pod względem aktywności w działaniu jako receptor HIV w teście tworzenia zespólni opartym nakrowiance (Lifson i inni, Naturę 323:725 (1986)); Ashom i inni, J. Virol. 64:2149 (1990)). Komórki HeLa zainfekowane zrekombinowanym wirusem krowianki (νΡΕ 16) koduj ącym glikoproteinę kopertową HIV -1 (Earl i inni, J. Virol. 64:2448 (1990)) współhodowano z komórkami HeLa zainfekowanymi CD4, CD4: ζ lub CD4 (Dl-D4):Ig:CD7. 6-cm szalki z komórkami HeLa (ATCC, Rockville, MD) przy 50% zlania zainfekowano wolnym od surowicy ośrodku przez 1 godzinę przy przybliżonej krotności infekcji (MOI) 10. Komórki inkubowano przez dodatkowe 5-6 godzin w pełnym ośrodku, po czym oddzielono je w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 1 mM EDTA. Komórki, w których zachodzi ekspresja koperty i chimery CD4 wymieszano w stosunku 1:1 ponownie wysiano na 6-cm szalkach z pełnym ośrodkiem. Zespólnie zliczano w 6-8 godzin po współhodowaniu, po czym fotografowano je.
Współhodowla CD4 i vPE16 doprowadziła do powstania łatwo wykrywalnych wielojądrowych komórek olbrzymich. Również chimera zawierająca pozakomórkowądomenę CD4 zlaną z łańcuchem ζ z TCR (fig. 27) (CD4: ζ) była zdolna do uczestniczenia w tworzeniu zespólni, podczas gdy komórki, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7, nie wykazały oznak fuzji komórek. Zbadano także konstrukt, w których zachodzi ekspresja tylko pierwszej i drugiej domen CD4 (fig. 24), CD4(D1,D2): Ig:CD7 (fig. 20, cząsteczka „B”), Gdyż w innym kontekście wykazano, że dwie domeny z końca aminowego CD4 są niezbędne do zainfekowania przez HIV (Landau i inni, Naturę 334:159 (1988)). Okazało się, że cząsteczka ta również nie jest podatna na wywołane przez HTV tworzenie zespólni. Badania wiązania z rozpuszczalnym, 125I-znaczonym gp 120 wykazały, że zarówno CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 jak i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 wykazują nie upośledzone powinowactwo względem gpl20.
Zbadano następnie, czy cząsteczki chimeryczne, które są odporne na tworzenie zespólni, mogą być zdolne do ukierunkowywania zabijania komórek, jeśli zostaną zaopatrzone w grupę wyzwalającą, w sposób podany w opisie. Przeprowadzono fuzję wewnątrzkomórkowej domeny ζ (fig. 27) z końcem 3' CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 oraz otrzymano odpowiednie zrekombinowane wirusy krowianki. Konstrukty te, CD4 (D1-D4) :Ig:CD7: ζ i CD4 (D1 ,D2) :Ig:CD7: ζ (fig. 20, cząsteczki „C” i „D”), doprowadzono do ekspresji w ludzkim klonie CTL WH3 i zbadano ich zdolność do znajdywania i zabijania komórek HeLa, w których zachodzi ekspresj a powierzchnio
180 066 wej glikoproteiny kopertowej HIV (stosując sposoby przedstawione w opisie). Na fig. 21 pokazano, że wewnątrzkomórkowa domena ζ złączona z CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 lub CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 nadawać zdolność zabijania; konstrukty nie zawierające łańcucha ζ nie były zdolne do uczestniczenia w tej aktywności. CD4: ζ, a dodatni element kontrolny, nadawał nieznacznie zwiększoną cytotoksyczność, a CD4 (DI,D2):Ig:CD7: ζ był nieco mniej skuteczny pod względem cytotoksyczności niż CD4 (Dl-D4):Ig:CD7: ζ (fig. 21). Jednakże wyraźnie widać, że zarówno chimera CD4 (DI-D4):Ig:CD7: ζ jak i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7: ζ wykazują zdolność do uczestniczenia w specyficznym zabijaniu komórek, w których zachodzi ekspresja białek kopertowych HIV na ich powierzchni. Czterodzielne chimery były również niezdolne do uczestniczenia w powstawaniu zespólni w teście opartym na krowiance. Wykazano także, że pojedynczy motyw ζ typu przedstawionego Na fig. 11A wystarcza do nadania cytolitycznej aktywności chimerze CD4 (D1-D4).
Radioimmunoprecypitacje eksperymenty potwierdziły, że cząsteczki fuzyjne stanowią przede wszystkim, a być może wyłącznie dimery. W eksperymentach tych perełki agarozy z białkiem A zastosowano do immunowytrącenia rozpuszczonego ekstraktu metabolicznie znaczonych komórek HeLa zainfekowanych zrekombinowanąkrowianką w których zachodzi ekspresja chimer CD4 (Dl-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7: ζ. Immunowytrącony materiał rozfrakcjonowano metodą elektroforezy na żelu agarozowym w warunkach redukujących i nie redukujących. W szczególności około 5 χ 106 komórek HeLa-S3 zainfekowano w sposób opisany powyżej w odniesieniu do νΡΕ 16 odpowiednim wariantem wirusa krowianki. Komórki metabolicznie znakowano 200 gCi/ml Tran35S-Label (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) przez 6-8 godzin ośrodku zubożonym w cysteinę metioninę, po czym oddzielono w PBS zawierającym ImM EDTA. Komórki następnie oddzielono i przeprowadzono ich lizę w 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 5mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5mM EDTA, ImM PMSF. Po usunięciu jąder przez odwirowanie 1/5 każdego ekstraktu komórkowego zaadsorbowano na przemytych perełkach agarozowych skoniugowanych z białkiem A przez 2 godziny w 4°C. Perełki przemyto następnie PBS zawierającym 1% NP-40 i eluowano buforem próbki zawierającym SDS w obecności lub bez merkaptoetanolu. Wyniki tych eksperymentów wykazują że większość immunostrąconych chimer CD4 (Dl-D4):Ig:CD7: ζ i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7: ζ migruje w postaci dimerów o oczekiwanych masach cząsteczkowych w nieredukcyjnych warunkach.
Aby bezpośrednio ocenić zdolność komórek, w których zachodzi ekspresja fuzyjnych cząsteczek CD4, do podtrzymywania infekcji HIV, przeprowadzono długotrwałe badania infekcyjności na transfektantach, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7^ i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7. Trwałe transfektanty CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 oraz CD4 otrzymano w podlinii komórek 293, ulegającej łatwo transfekcji linii komórek pochodzących z ludzkiej embrionalnej nerki. Chimeryczne cząsteczki subklonowano w dwukierunkowych wektorach, w których gen higromycyny B był kierowany przez promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej. Zlane w 60-70% komórki na 10-cm szalkach transfekowano 10 pg tego plazmidowego DNA przez współstrącanie fosforanu wapnia. Przed transfekcjąplazmidy zlinearyzowano w unikatowym miejscu Sfil, i końce wyrównano polimeraząT4 DNA. W 24 godziny po transfekcji komórki podzielono na 4 części a w 48 godzin po transfekcji komórki poddano selekcji higromycynąB (Sigma, St. Louis, Mo) w ilości 400 pg/ml. Co 3-4 dni komórki dożywiano świeżym ośrodkiem zawierającym higromycynę.
Odporne kolonie wybrano, rozszerzono i ich ekspresję oceniono metodą niebezpośredniej immunofluorescencji stosując skoniugowany z fluoresceinąanty-ludzki IgG Fc (Organon Teknika, West Chester, PA) lub Q4120, przeciwciało reagujące z ludzkim CD4 (Sigma), a następnie metodą cytometrii przepływowej (Coulter, Hialeah, FL). Dwa niezależne klony każdego konstruktu z poziomami CD4 na powierzchni komórek porównywanymi z występującymi w innych klonach wybrano do lizy Na fig. 22 pokazano, że po ekspozycji na HIV, p24 wykryto w hodowlach trwałych transfektantów CD4 już w 3 dni po infekcji. W hodowlach tych zaobserwowano obecność wielojądrowych komórek olbrzymich oraz charakterystyczne pęcherzenie już w 5 dni po infekcji. Natomiast znaczących poziomów p24 lub obecności wielojądrowych komórek ol
180 066 brzymich nie wykryto w nietransfekowanej macierzystej linii komórek lub w dowolnym z dwóch niezależnie uzyskanych izolatów transfektantów CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7 po 32 dniach w hodowli (fig. 22).
Po zakończeniu badań infekcyjnych komórki zbadano pod względem ekspresji CD4 na powierzchni. Gęstość powierzchniowych epitopów CD4 znacząco zmniejszyła się w zainfekowanych hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4, co jest zgodne z wirusową modulacją do dołu, ale nie uległa zmianie w hodowlach, w których zachodzi ekspresja CD4 (Dl-D4):Ig:CD7 i CD4 (Dl,D2):Ig:CD7. Eksperymenty te potwierdziły, że można uzyskać chimeryczne cząsteczki przenoszące dwie wierzchołkowe domeny CD4, które po wykonaniu fuzji z łańcuchem ζ receptora komórki T wykazują zdolność do dochodzenia do komórek zainfekowanych przez HIV i zabijania ich, ale nie podtrzymują infekcji HIV z udziałem CD4.
Dodatkowe eksperymenty sugerują, że występuje pewna fizyczna odległość między pozakomórkową domeną cząsteczki CD4 i podwójną warstwą lipidową, która nadaje odporność na infekcję HIV. W pierwszym eksperymencie skonstruowano chimeryczną cząsteczkę z delecją rdzenia CD4 i domeny przezbłonowej; delecja ta usuwa bogaty w prolinę region części przezbłonowej CD7. Gdy wykona się fuzję tej domeny z pozakomórkowądomenąCD4, zachowa ona zdolność skutecznego kotwiczenia pozakomórkowej domeny CD4, o czym świadczy zmierzona ekspresja cząsteczki D4 na powierzchni komórki (przedstawiona w opisie). Znika natomiast zdolność do przeciwstawiania się tworzeniu zespólni wywoływanemu przez glikoproteinę kopertową HIV. Tak więc delecja regionu bogatego w prolinę w cząsteczce CD7, który prawdopodobnie tworzy strukturę zwoju α-helisowego, na tyle zmniejsza odległość między pozakomórkową domeną CD4 i podwójną warstwą lipidową, że zanika zdolność chimery do przeciwstawianiu się tworzeniu zespólni wywołanemu przez HIV.
W drugim eksperymencie wykazano, że zdolność przeciwstawiania się wywołanemu przez HIV tworzeniu zespólni może być nadana chimerze CD4/CD5, która, jak to wcześniej wykazano, służy jako przezbłonowe zakotwiczenie pozakomórkowej domeny CD4, ale która nie jest zdolna do przeciwstawiania się wywołanemu przez HIV tworzeniu zespólni. W eksperymencie tym domeny zawiasy, CH3 i CH3 ciężkiego łańcucha ludzkiego IgGl wstawiono do cząsteczki CD4/CD5; uzyskana chimera jest odporna na tworzenie zespólni, co ponownie sugeruje, że odległość zapewniana przez domeny immunoglobulinowe wystarcza do nadania odporności na wywoływane przez HIV tworzenie zespólni.
W trzecim eksperymencie domenę CD4 wydłużono zmieniając odległości od błony komórkowej za pomocą syntetycznych α-helis o różnej długości. W szczególności zaprojektowano syntetyczne oligonukleotydy reprezentujące powtarzające się α-helisowe motywy reszt glicyny i kwasu glutaminowego flankowane dwoma resztami alanylowymi (patrz fig. 28, gdzie przedstawiono główne sekwencje kwasów nukleinowych i aminokwasów). We wcześniejszych badaniach stwierdzono, że taki układ aminokwasów występuje z dużą częstotliwością w a-helisach, co sugeruje, że powtarzalne motywy powinny przyjmować konformację α-helisową, oraz że umieszczenie takichα-helis między domenąprzezbłonowąi domenami pozakomórkowymi CD4 powinno odsunąć CD4 od błony komórkowej. Zmieniając długość segmentu α-helisowego wykonano obliczenia wystającej odległości niezbędnej do przeciwstawienia się wejściu HIV, w oparciu o znane wielkości dla podnoszenia się i powrotu α-helisy. Wyniki podano w tabeli.
180 066
Tabela
Tworzenie zespólni Ekspresja Thy-1
A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+stk - -
B. CD(Dl,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk - -
C. CD4+CD7tm+stk +/-(a) +
D. CD4+CD7tm (długa wersja) + +
E. CD4+CD7tm (krótka wersja) + +
F. CD4+CD5m + +
G. CD4+CH2+CH3+CD5tm - -
H. CD4+CH3+CD5tm - NO
1. CD4+CD34tm + +
J. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24A) + CD34tm NO +
K. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (48 A) + CD34tm NO +/-(b)
L. CD4 + syntetyczna helisa białkowa (24 A) + CD34tm NO -
a Zasadnicze zmniejszenie w liczbie zespólni lub komórek, w których zachodzi ekspresja thy-1. NO - nie oznaczano
W tabeli tej „CD4” oznacza CD4 (D1-D4), o ile nie zaznaczono tego inaczej; „H”, „CH2” i „CH3” oznaczają odpowiednio zawiasę i regiony CH2 i CH3 ludzkiego ciężkiego łańcucha I-gGl; „CD7tm i stk” oznaczają region przezbłonowy łodygowy CD7; „CD7tm (długa wersja)” i „CD7tm (krótka wersja)” oznaczają odpowiednio region przezbłonowy CD7 i region przezbłonowy CD7 z delecją domeny bogatej w prolinę (jak to przedstawiono powyżej); „CD5tm” oznacza region przezbłonowy CD5; a „CD34tm” oznacza region przezbłonowy CD34. W wierszach J-L długość regionu helisowego podano w angstremach; wielkości te są oparte na tym, że na jeden obrót a-helisy przypada 3,6 reszt, co odpowiada 5,4 A (czyli 1,5 A/resztę). W związku z tym 16 reszt a-helisy będzie odsuwać pozakomórkową domenę CD4 na około 24 A. α-helisy o 48 72 A skonstruowano przez kolejne kaskadowe fragmentu BstYl do fragmentów unikatowego miejsca BamHI (patrz fig. 28), a następnie selekcję klonów o odpowiedniej orientacji.
Powstawanie zespójni zliczano w testach współhodowania z komórkami HeLa„ w których zachodzi ekspresja glikoproteiny kopertowej HIV-1 konstruktu νΡΕ-16 wirusa krowianki, (patrz wyżej).
Ekspresję Thy-1 mierzono w sposób następujący. Skonstruowano żyjący wektor retrowirusa w oparciu o klon hxb.2 HIV-1. W wektorze tym niepodstawowy gen nef zastąpiono sekwencjąkodującą thy-1 szczura, wydajnie powstającą w wyniku ekspresji cząsteczkę na powierzchni komórki, która zakotwicza się na błonie poprzez połączenie fosfatydylo-inozytolowe. Wirus pochodzący z tego klonu cząsteczkowego, oznaczony jako hxb/thy-l, jest infekcyjny, o czym świadcząjego działania cytopatologiczne oraz wytwarzanie p24 w supematantach hodowli zainfekowanych komórek C8166 (ludzka linia komórek białaczkowych T CD4+). Na dodatek przy ekspozycji na hxb/thy-1 komórki HeLa przejściowo transfekowane CD4 wykazują oznaki ekspresji thy-1 już w 18 godzin po infekcji, czego można było oczekiwać w przypadku informacji regulowanej w nef-podobny sposób. Informacje kodowane przez gen nef zazwyczaj należą do klasy wirusowych białek regulujących, które ulegająwielokrotnemu rozszczepieniu i nie zawierają elementu odpowiedzi odwrotnej. Informacje te mogą trwale nagromadzać się w cytoplazmie jako wczesne wirusowe produkty genowe. Oczekiwano, że informacje thy-1 będą regulowane podobnie, to znaczy wystąpią wcześnie w cyklu życia wirusa. W skrócie układ taki ułatwia ocenę wej ścia HIV, przy czym ekspresję thy-1 wykorzystuje się jako namiastkę wejścia wirusa. Różne chimery oparte na CD4 przejściowo transfekowano w komórkach HeLa stosując standardowe sposoby z DEAE-dekstranem. Transfekowane komórki eksponowano na wirus hxb/thy-l w 48 godzin po
180 066 transfekcji, a zliczanie ekspresji thy-1 wykonywano w 24-48 godzin po infekcji. W przypadku wyników podanych w tabeli 1 ekspresję thy-1 oznaczano w 24 godziny po infekcji stosując dostępne w handlu monoklonalne przeciwciało Thy-1 (Accurate).
Z danych przedstawionych w tabeli 1 wywnioskowano, że pozakomórkowe domeny CD4 optymalnie powinny wystawać z błony komórki na co najmniej 48 A, a korzystnie na co najmniej 72 A, aby zapewnić odporność na infekcję HIV.
Wykorzystując strategię zbliżoną do ogólnej strategii przedstawionej w opisie skonstruować można chimery oparte na anty-HIV przeciwciałach kopertowych, które kierują się do komórek zainfekowanych przez HIV. Przykłady takich przeciwciał podali Górny i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1624 (1989) oraz Marasco i inni, J. Clin. Invest. 90:1467 (1992).
Przykład XI
Dodatkowe białka wyzwalające receptor komórki T i receptor komórki B
Inne wewnątrzkomórkowe i przezbłonowe domeny przenoszące sygnał według wynalazku mogąpochodzić z białek receptora komórki T, CD3 δ i T3 γ, oraz z białek receptora komórki B, mbl i B29. Sekwencje aminokwasów w tych białkach pokazano na fig. 16 (CD3 δ; SEQ ID NO: 24), fig. 17 (T3 γ; SEQ ID NO: 25), fig. 18 (mdl; SEQ ID NO: 26) oraz fig. 19 (B29; SEQ ID NO: 27). Części sekwencji wystarczające do przenoszenia sygnału cytolitycznego (i w związku z tym korzystnie wchodzące do chimerycznego receptora według wynalazku) zaznaczono w nawiasach. Chimeryczne receptory, które zawierają takie domeny białkowe, konstruuje się i stosuje w sposobach leczenia według wynalazku, opisanych powyżej.
Przykład XII. Metody eksperymentalne
Infekcja krowianką i radioimmunoprecypitacja
Około 5 χ 106 komórek CV1 zainfekowano na 1 godzinę pozbawionym surowicy ośrodku DME ze zrekombinowanąkrowiankąprzy krotności infekcji (moi) co najmniej 10 (miano oznaczane na komórkach CV1). Komórki po infekcji umieszczono w świeżym ośrodku i przeprowadzono metaboliczne znakowanie stosując 200 pCi/ml 35S-metioniny + cysteiny (Tran35S-label, ICN; Costo Mesa, CA) w DMEM wolnym od metioniny i cysteiny (Gibco; Grand Island, NY) na 6 godzin. Znakowane komórki oddzielono w PBS zawierającym ImM EDTA, zebrano przez odwirowanie, poddano lizie w 1 % NP-40,0,1 % SDS, 0,15 M NaCl, 0,05M Tris pH 8,0,5mM EDTA i ImM PMSF. Jądra usunięto przez odwirowanie, a białka CD4 immunostrącono przeciwciałami OKT4 agarozą z anty-mysim IgG (Cappel, Durham, NC). Próbki poddawano elektroforezie przez 8% żele poliakrylamid /SDS w warunkach nieredukujących (KR) i redukujących (R). Żele zawierające 35S-znaczone próbki impregnowano En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA) przed autoradiografią. Ułatwioną ekspresję przezbłonowej form CD 16, CD16TM, oznaczano porównując jego ekspresję w komórkach CV1 zainfekowanych tylko CD16TM z ekspresjąw komórkach współzainfekowanych wirusami kodującymi CD16TM i chimery ζ lub γ. Po infekćji i inkubacji trwającej 6 godzin lub dłużej komórki oddzielano z płytek w PBS, 1 mM EDTA i ekspresję CD 1 6tm lub chimer oznaczano metodąniebezpośredniej immunofluorescencji cytometrii przepływowej.
Test przepływu wapnia
Komórki Jurkata podlinii E6 (Weiss i inni, J. Immunol.:123-128 (1984)), zainfekowano zrekombinowanymi wirusami krowianki przez 1 godzinę pozbawionym surowicy IMDM przy moi 10 i inkubowano przez 3-9 godzin w IMDM, 10% FBS. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 3 X 106 komórek/ml w pełnym ośrodku zawierającym ImM acetometoksyestru Indo-1 (Grynkiewicz i inni, J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) inkubowano w 37°C przez 45 minut. Komórki obciążone Indo-1 odwirowano i ponownie zawieszono w stężeniu 1 x 106/ml pozbawionym surowicy IMDM, po czym przechowywano w temperaturze pokojowej w ciemności. Komórki analizowano na obecność wolnych jonów wapniowych mierząc równocześnie emisję fluorescencji fioletowej i błękitnej metodącytometrii przepływowej (Rabinovitch i inni, J. Immunol. 137:952-961 (1986)). W celu zainicjowania przepływu wapnia do zawiesiny komórek dodawano Leu-3A skoniugowane z fikoerytryną (PE) (anty-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) w stężeniu 1 pg/ml, po czym
180 066 dodawano 10 pg/ml nieskoniugowanego koziego, anty-mysiego IgG w czasie 0 lub nieskoniugowane 3G8 (anty-CD16) monoklonalne przeciwciała w stężeniu 1 pg/ml, a następnie 10 pg/ml PE-skoniugowanego koziego Fab2' antymysiego IgG w czasie 0. Histogramy stosunku emisji fioletowej/niebieskiej zbierano dla PE-dodatnich (zainfekowanych) populacji komórek, które zazwyczaj stanowiły 40-80% wszystkich komórek. Reakcję receptora antygenu komórki T w nie zainfekowanych komórkach wyzwalano przeciwciałem OKT3, bez sieciowania.
W eksperymentach obejmujących chimeryczne receptory CD 16 próbki, w których następowało przemieszczanie linii podstawowej w kierunku niższego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia (bez przeciwciał) wykluczano z lizy Histogramy analizowano następnie przekształcając dane binarne na ASCII z zastosowaniem oprogramowania Write Hand Man (Cooper City, FL), po czym wykonano analizę za pomocą zbioru programów FORTRAN. Stosunek fiolet/błękit przed dodaniem drugiego przeciwciała jako reagentu wykorzystywano do ustalania znormalizowanego stosunku wyjściowego, któremu przypisywano wartość 1, oraz ustalania progu spoczynkowego, który nastawiano tak, aby 10% populacji spoczynkowej przekraczała wielkość progową.
Test cytolizy
Linię WH3 ludzkich komórek T, ograniczoną linię cytolitycznąCD8+ CD4’ HLA B44, utrzymywano w IMDM, 10% ludzkiej surowicy, ze 100 U/ml IL-2 i okresowo pobudzano niespecyficznie napromieniowanymi (3000 rad) HLA-niresparowanymi limfocytami krwi obwodowej oraz 1 pg/ml fitohemaglutyniny, albo specyficznie, napromieniowanymi jednojądrowymi komórkami przenoszącymi B44. Po 1 dniu niespecyficznego pobudzania PHA rozcieńczono do 0,5 pg/ml dodając świeży ośrodek, a po 3 dniach ośrodek zmieniano. Komórki hodowano przez co najmniej 10 dni po pobudzaniu przed użyciem w teście cytotoksyczności. Komórki infekowano zrekombinowaną krowianką przy krotności infekcji co najmniej 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy ośrodku, po czym inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki zbierano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w stężeniu 1 χ 107 komórek/ml. 100 pl hodowli dodawano do każdej studzienki płytki mikrotiter z dnem w kształcie litery U zawierającej 100 pl/studzienkę pełnego ośrodka. Komórki rozcieńczono kolejno dwukrotnie. Dwie studzienki dla każdej próbki nie zawierały limfocytów, aby umożliwić pomiar spontanicznego uwalniania chromu i całkowite wchłanianie chromu. Komórki docelowe, HeLa podlinia S3 infekowano jak wyżej na 6,0 lub 10,0-cm płytkach przy moi około 10 przez 1 godzinę w wolnym od surowicy ośrodku, po czym inkubowano w pełnym ośrodku przez 3 godziny. Komórki oddzielano z szalek w PBS, ImM EDTA i zliczano. Porcję 106 docelowych komórek (komórki HeLa, Raji lub RJ2.2.5 w przypadku eksperymentów z chimerycznym receptorem CD4 oraz komórek 3G8 10-2; Shen i inni, Mol. Immunol. 26:959 (1989) w przypadku eksperymentów z chimerycznym receptorem CD 16) odwirowano i. ponownie zawieszono w 50 pl sterylnego 51Cr-chromianu sodu (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) na 1 godzinę w 37°C z okresowym mieszaniem, po czym przemywano 3 razy PBS. 100 pl znakowanych komórek ponownie zawieszonych w ośrodku w ilości 105 komórek/ml dodawano do każdej studzienki. Docelowe komórki Raji i RJ2.2.5 znakowano w taki sam sposób jak komórki HeLa. Płytki mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Pod koniec okresu inkubacji komórki z każdej studzienki ponownie zawieszono przez łagodne pipetowanie, pobrano próbkę do oznaczenia całkowitego wprowadzonego zliczenia i płytkę mikrotiter odwirowano przy 750 x g przez 1 minutę. Próbki 100 pl supematantu pobrano i zliczono w liczniku scyntylacyjnym promieniowania γ. Procent zabicia korygowano uwzględniając udział zainfekowanych komórek docelowych (zazwyczaj 50-90%) oznaczony metodą cytometrii przepływowej. W przypadku zainfekowanych komórek efektorowych stosunek efektor:cel korygowano uwzględniając udział zainfekowanych komórek (zwykle 20-50% w eksperymentach z chimerycznym receptorem CD4 i >70% w eksperymentach z chimerycznym receptorem CD 16).
In vitro mutageneza sekwencji ζ
W celu wykonania mutacji punktowych w resztach aminokwasów 11 i/lub 15 sekwencje ζ, syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się do miejsca BainHI w górę od przezbłonowej domeny ζ, oraz przekształcenia w ζ natywnej reszty 11 z Cys w Gly (C11G) lub reszty 15 z
180 066
Asp w Gly (D15G) albo wykonania obydwu zmian (Cl 1G/D15G), otrzymano i zastosowano w reakcjach PCR w celu uzyskania zmutowanych fragmentów, które ponownie wstawiano do konstruktów CD4: ζ dzikiego typu.
W celu stworzenia delecji ζ, sekwencje cDNA ζ amplifikowano metodąPCR stosując syntetyczne oligonukleotydowe startery zaprojektowane tak, aby utworzyć kodon terminacji (UAG) po reszcie 50,59 lub 65. Startery miejsce rozszczepienia dla enzymuNotl wstawione 5 lub 6 reszt od końca 5', zwykle w sekwencji w postaci CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID NO: 11), w której ostatnie 3 reszty odpowiadają antykodonowi terminacji. Po sekwencjach Notl i antykodonu terminacji następowało 18 lub więcej reszt komplementarnych z pożądanym końcem 3' fragmentu. Uzyskaną chimerę oznaczano odpowiednio jako Οϋ16:ζΥ51*, CD16: ζΕ60* i CD16: ζϋ66*. Miejsce BamHI w górę domeny przezbłonowej oraz miejsce Notl stosowano do wytwarzania fragmentów, które wstawiano do dzikiego typu konstruktu CD 16: ζ. Monomeryczne chimery ζ uzyskiwano uwalniając przezbłonowe błonowe sekwencje ζ w sąsiedztwie sekwencji wewnątrzkomórkowej przez trawienie BamHI i SacI konstruktu Asp’ i Cys’ CD4: ζ opisanego powyżej i wstawiając fragment odpowiednio do konstruktu CD16^E60* i CD16^D66*.
Konstrukcja trójdzielnej chimery CD 16: 7: ^(48-65) i CD 16: 71^(48-59)
W celu wytworzenia konstruktu Οϋ16:ζϋ66* sekwencję οϋΝΑζ odpowiadającąprzezbłonowej domenie oraz 17 kolejnym resztom cytoplazmatycznej domeny zastępowano odpowiednią przezbłonową cytoplazmatyczną domeną uzyskaną CD5 i CD7 cDNA. Fragmenty CD5 i CD7 wytwarzano w reakcji PCR stosując oligonukleotydy przodujące zawierające miejsce rozszczepiania restrykcyjnego BamHI oraz odpowiednie dla regionu tuż w górę od domeny przezbłonowej odpowiednio CD5 i CD7 oraz następujące oligonukleotydy zwrotne zachodzące odpowiednio na sekwencje CD5 i CD7, a także sekwencjęζ zawierającąmiejsce rozszczepiania restrykcyjnego SacI.
CD5: ζ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ
ID NO: 12)
CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG(SEQIDNO: 13).
Produkty PCR, CD5 i CD7, trawiono BamHI i SacI, po czym ligowano ze strawionym za pomocą BamHI i SacI CD 16: ζΕ60* zastępując sekwencję ζ od BamHI do SacI fragmentem CD7. W celu wykonania konstruktów CD16: CD5 i CD16: CD7, fragmenty CD5 i CD7 otrzymano z PCR stosując oligonukleotyd zawierający miejsce rozszczepiania restrykcyjnego Notl i kodujący kodon terminacji (UAA) po reszcie Gln416 i Ala 193 odpowiednio w CD 5 i CD7. Fragmenty CD5 i CD7 z PCR trawiono BamHI i Notl, a następnie wstawiano do konstruktu CD 16: ζΑδρ66*.
In vitro mutageneza N-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca SacI wewnątrz motywu ζ i zmieniające natywnąresztę 48 z Asn na Ser (N48S), resztę 50 z Leu na Ser (L50S) oraz resztę 51 z Tyr na Phe (Y51F) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów, które wstawiono do dzikiego typu konstruktu CD16: 7: ζ (48-65).
In vitro mutageneza C-końcowych reszt w cytolitycznym motywie ζ przenoszącym sygnał Syntetyczne oligonukleotydowe startery rozciągające się od miejsca Notl 3' do kodonu terminacji oraz zmieniające natywnąresztę 60 z Glu na Gin (E60Q), resztę 61 z Glu na Gin (E61Q), resztę 62 z Tyr na Phe lub Ser (Y62F na Y62S) oraz resztę 63 z Asp na Asn (D63N) zsyntetyzowano i zastosowano w reakcji PCR w celu wygenerowania fragmentów, które w konstruktach dzikiego typu CD 16: ζ D66* od miejsca BamHI do miejsca Notl.
Konstrukcje chimer CDI 6: 7: ζ (33-65), CD16: 7: ζ(71-104) i CD16: 7:^(104-137)
Przezbłonowy fragment CD7 przenoszący miejsca Mlul i Notl w połączeniu pomiędzy domenami, przezbłonową wewnątrzkomórkową, otrzymano w PCR stosując oligonukleotyd o następującej sekwencji: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 14). Uzyskany fragment PCR strawiono BamHI i Notl, po czym wstawiono do konstruktu CD16: 7:ζ(48-65).Fragmentyζkodującereszty33do65,71 do 104oraz 104do 137uzyskanow reakcji PCR stosując pary starterów zawierających miejsca Mlul na końcu 5' starterów przo
180 066 dujących i kodony terminacji po miejscach Notl przy końcu 5' starterów zwrotnych. W każdym przypadku miejsca restrykcyjne wstawiano 6 reszt od końca 5' startera, aby zapewnić rozszczepienie enzymem restrykcyjnym.
ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO: 15);
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO: 16); oraz ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO: 17).
Konstrukcja mutantów delecyjnych FcRyllA
Mutanty delecyjne FcRyllA na końcu karboksylowym konstruowano w PCR w taki sam sposób jak w przypadku konstruktów o pełnej długości, zmieniając sekwencje kodujące tyrozynę w pozycjach 282 i 298 na kodony terminacji (TAA). N-końcowe delecje generowano przez ampłifikację fragmentów kodujących kolejno coraz mniejszą wewnątrzkomórkową domenę metodą PCR, stosując oligonukleotydy, które umożliwiają wstawienie uzyskanych fragmentów pomiędzy miejsca restrykcyjne Mlul i Notl w uprzednio skonstruowanym plazmidzie ekspresji kodującym pozakomórkową domenę CD16 złączoną z przezbłonową domeną CD7, przy czym ta ostatnia kończy się miejscem Mlul i połączeniu między przezbłonową i wewnątrzkomórkową domeną.
Inne rozwiązania
Opisane wyżej przykłady wykazują że agregacja chimer ζ, η łub γ wystarcza do zainicjowania cytolitycznej reakcji komórki efektorowej w komórkach T. Znany zakres ekspresji ζ, ηί γ, obejmujący limfocyty T, naturalne komórki zabijacze, granulocyty zasadochłonne, makrofagi i komórki tuczne, sugeruje, że motywy zachowanych sekwencji mogą oddziaływać z aparatem czuciowym wspólnym dla komórek pochodzenia hematopoetycznego, oraz że istotny składnik ochrony gospodarza w układzie odpornościowym może oddziaływać poprzez zjawiska agregacji receptorów.
Siła reakcji cytolitycznej oraz brak odpowiedzi na komórki docelowe przenoszące receptory MHC klasy II wykazują że chimery oparte naę, ηί γ tworzą podstawę do interwencji genetycznych w AIDS na drodze immunoterapii adoptywnej. Szeroki rozkład endogennych ζ i γ oraz potwierdzenie, że receptory Fc związane z γ uczestniczą z cytotoksyczności w różnych typach komórek (Fanger i inni, ImmunoL Today 10:92-99 (1989)), umożliwia rozważenie wykorzystania w tym celu różnych komórek. Tak np. obojętnochłonne granulocyty o bardzo krótkim okresie życia (~4 godzin) w krążeniu, które są silnie cytolityczne, stanowią atrakcyjne komórki docelowe dla ekspresji chimer. Jest mało prawdopodobne, aby infekcja obojętnochłonnych granulocytów przez HIV spowodowała uwolnienie wirusa, a obfitość tych komórek (przeważają wśród leukocytów) powinna ułatwić obronę organizmu. Inną atrakcyjną możliwość do wykorzystania jako komórki gospodarze stanowią dojrzałe komórki T, populacja, w przypadku której możliwe są obecnie manipulacje retrowirusowe (Rosenberg S.A. Sci. Am. 262:62-69 (1990)). Przy pomocy zrekombinowanych komórek IL-2 populacje komórek T można stosunkowo łatwo rozszerzyć w hodowli, a rozszerzone populacje wykazują zazwyczaj ograniczoną żywotność po ponownej infuzji (Rosenberg i inni, N. EngL J. Med. 323:570-578 (1990)).
W odpowiednich warunkach rozpoznawanie HIV przez komórki, w których zachodzi ekspresja chimery CD4, powinno dostarczyć mitogenicznych bodźców, co stwarza możliwość, że uzbrojona populacja komórek będzie odpowiadać dynamicznie na inwazję wirusową. Jakkolwiek w opisie skupiono się na zachowaniu białek fuzyjnych w cytolitycznych limfocytach T, to ekspresja chimer w limfocytach pomocnikach może dostarczyć HIV - mobilizowanego źródła cytokin, które mogą przeciwdziałać zanikowi pozdbioru komórek pomocników w AIDS. Ostatnie opisy szeregu schematów konstrukcji odporności na infekcję na etapach innych niż penetracja wirusów (Friedman i inni, Naturę 335:452-454 (1988); Green i inni, Celi 58:215-223 (1989); Malim i inni, Celi 58:205-214 (1989); Tronoi inni, Celi 59:113-120 (1989); Buonocore i inni, Naturę 345:625-628 (1990)) sugerują że komórki przenoszące chimery CD4 można zaprojektować tak, aby udaremniały produkcję wirusów poprzez ekspresję odpowiednich środków działających wewnątrz komórki.
180 066
Zdolność do przekazywania sygnałów do limfocytów T przez autonomiczne chimery stwarza również możliwość regulowania retrowirusowo skonstruowanych limfocytów in vivo; Sieciujące bodźce, np. z udziałem specyficznych przeciwciał IgM skonstruowanych tak, aby usunąć domeny wiążące dopełniacz, mogą zapewnić zwiększenie liczby limfocytów in situ, podczas gdy zastosowanie podobnych specyficznych przeciwciał IgG (np. rozpoznających warianty aminokwasów wprowadzone do chimerycznego) może selektywnie zubożyć skonstruowaną populację. Dodatkowo przeciwciała anty-CD4 IgM nie wymagają dodatkowego sieciowania, aby mobilizowały wapń w komórkach Jurkata, w których zachodzi ekspresja chimery CD4: ζ. Zdolność do regulowania populacji komórek bez powrotu do powtarzanej pozaustrojowej amplifikacji może zasadniczo rozszerzyć zakres i skuteczność obecnych zastosowań zaproponowanych dla genetycznie zmodyfikowanych komórek T.
Jakkolwiek wynalazek opisano w odniesieniu do konkretnych rozwiązań, zrozumiałe jest, że możliwe są dalsze modyfikacje, tak że zgłoszenie niniejsze obejmuje warianty, zastosowania lub adaptacje wynalazku, a także obejmuje takie odstępstwa od niniejszego ujawnienia, w dziedzinie, do której wynalazek należy, i które jako takie wynikająz zakresu załączonych zastrzeżeń.
Zestawienie sekwencji (1) Informacje ogólne:
(i) Zgłaszający: Brian Seed i inni (ii) Tytuł wynalazku: Ukierunkowana cytoliza komórek zainfekowanych przez HIV, przez komórki noszące chimeryczny receptor CD4 (iii) Liczba sekwencji: 27 (iv) Adres do korespondencji:
(A) Adresat: Fish & Richardson (B) Ulica: 225 Franklin Street (C) Miasto: Boston (D) Stan: MA (E) Państwo: USA (F) Kod: 02110-2804 (v) Postać odczytywana komputerowo:
(A) Nośnik: Dyskietka 3,5 cala, 1,44 MB (B) Komputer: IBM PS/2 Model 50Z lub 55SX (C) System operacyjny: IBP P.C. DOS (Version 3.30) (D) Oprogramowanie: WordPerfect (Version 5.0) (vi) Dane dotyczące zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia:
(B) Data zgłoszenia:
(C) Klasyfikacja:
(vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: 07/847 566 (B) Data zgłoszenia: 6 marca 1992 (C) Klasyfikacja:
(vii) Dane dotyczące wcześniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia: 07/665 961 (B) Data zgłoszenia: 7 marca 1991 (C) Klasyfikacja:
(viii) Informacja dotycząca pełnomocnika/rzecznika:
(A) Nazwisko: Clark, Paul T.
(B) Numer rejestracyjny: 30,162 (C) Numer rzecznika: 00786/212001 (ix) Informacja telekomunikacyjna:
(A) Telefon: (617) 542-5070 (B) Faks: (617) 542-8906 (C) Teleks: 200154 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:1:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1728 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy)
xi) Opis ATGAACCCGG sekwencji: GAGTCCCm ; SEQ ID NO:1: TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50
GCTCCTCCCA GCACCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100
GGGATACACT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200
CTTCTTAACT aaaggtccat CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTCGAGGACC AGAAGGAGGA 350
GGTGCAATTG CTAGTCTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTCC 400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTCGACAT 550
GCACTGTCTT GCAGAACCAC AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCCTC 600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGCGA 650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCCCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACCC 700
GCAGTGGCGA GCTGTCGTGC CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAACTCT 750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TCGGCAACAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900
CTTGAACCGA AAACAGGAAA GTTCCATCAC GAAGTGAACC TGGTGGTCAT 950
GAGAGCCACT CAGCTCCACA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTC ACCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCCGGGAT 1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG CAATCCAACA 1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200
TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250
CCTCTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TCCAGAGACT GCTGCCAACC 1300
TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTACG GCGAAGAGAG 1350
GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG 1400
CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA ACGCGTATAC AATGCACTGC 1450
AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAC 1500
AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACOAGGACA GCCACTTCCA 1550
AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA 1600
GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650
AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG 1700
GCCACCCAGT AGCAGCTCCC ACCTCTAA
1728 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:2:
(i) Charakterystyka sekwencji: (A) Długość: 1389 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:2:
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTCGC50
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG100
GGGATACACT GGAACTGACC TCTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA150
TTCCACTCGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAACCTGAA TCATCCCGCT GACTCAAGAA250
GAAGCCTTTG GOACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTCTCAA GTCGAGGACC MAAGGAjGCA350
GGTGCAATTG CTAGTCTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTCACCTTCG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC450
CCCTCAGTCC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC A0GGCGGCAA500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTCGACAT550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG600
CTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA CTCTATAAGA AAGAGGGGGA650
ACAGCTGCAG TTCTCCTTCC CACTCCCCTT TACAGTTGAA AAGCTCACGG700
GCAGTGGCGA GCTCTCGTGG CAGGCCGAGA GCGCTTCCTC CTCCAAGTCT750
TCGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTACB00
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTCGCT CTCGAAACCT CACCCTGGCC900
CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGCGGACCCA1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTCAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGCGTG CTGAACCCTC AGGCGGGGAT1100
GTGGCACTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTC GAATCCAACA1150
TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC1200
TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGCTATTG TCCTTACCCT12 50
GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATACCCAGCC1300
GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG1350
ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG1369 (2) Informacja dotycząca SEO ID NO:3:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1599 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (genomowy) (xi) Opis sekwencji: SEO ID NO:3:
ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC so
GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTCCTG GGCAAAAAAG 100
GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150
TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200
CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTCAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250
GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300
ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 3S0
GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400
TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TCGTAGTAGC 450
CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500
GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550
GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTCG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600
GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650
ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700
GCAG TGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750
TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800
CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850
TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900
CTTGAAGCGA AAACAGCAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950
GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000
CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050
GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100
GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTCCTG GAATCCAACA 1150
TCAAGCTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200
TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC 1250
CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300
AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350
GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTCGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG 1400
AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450
AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500
CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGCGTCTCA GTACAGCCAC 1550
CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 575 aminokwasów (P) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:4:
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg 15
Ala Leu Lou Pro Ala Ala Thr Gin 20
Lye Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr 35<0
Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser 5055
Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly 6570
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp 85
Lys Asn Leu Lyo Ile Glu Asp Ser 100
Asp Cln Lys Glu Glu Val Gin Leu 115120
Ser Asp Thr Hio Leu Leu Gin Gly 130135
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser 145150
Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr 165
Gin Asp Sor Gly Thr Trp Thr Cyo 180
Val Glu Phe Lyo Ile Asp Ile Val 195200
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly 210215
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu 225230
Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser 245
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys 2 60
Gin Met Gly Lyo Lys Leu Pro Leu 275260
Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 290295
Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val 305310
Gin Lou Cln Lys Aan Leu Thr Cys 325
Lys Leu Met Lou Ser Leu Lyo Leu 340
Lye Arg Glu Lys Pro Val Trp Val 355360
Gin Cyo Leu Leu Ser Asp Ser Gly 370375
Lyo Val Lou Pro Thr Trp Ser Thr 385390
Cys Tyr Lou Lou Asp Gly Ile Lou 405
Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lyo Phe 420
Asn Leu Gin Asp Pro Aon Cln Leu 435440
Arg Clu Glu Tyr Asp Val Leu Glu 450455
Met Cly Gly Lys Cln Cln Arg Arg 465470
Asn Ala Leu Cln Lys Asp Lyo Met 485
Thr Lys Gly clu Arg Arg Arg Cly 500
Asp Ser Hi* Phe Gin Ala Val Gin 515520
Cly Ser Clu Leu Thr Arg Thr Lou 530535
Glu Ser Thr Gin Cln Ser Sor Gin 555550
Pro Thr Lou Trp Ser Pro Trp Pro 565
His Lou Leu Leu Val Leu Cln Lou 1015
Cly Aon Lye Val Val Lou Gly Lye 2530
Cys Thr Ala Ser Cln Lys Lys Ser 45
Aon Cln Ile Lyo Ile Leu Gly Asn 60
Pro Ser Lys Lou Aon Asp Arg Ala 7580
Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 9095
Asp Thr Tyr Ile Cys Clu val Clu 105110
Lou Val Pho Gly Lou Thr Ala Asn 125
Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Clu 140
Val Cln Cyo Arg Ser Pro Arg Gly 155160
Lou Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 170175
Thr Val Leu Gin Asn Cln Lye Lys 185190
Val Leu Ala Phe Cln Lye Ala Ser 205
Glu Gin Val Clu Phe Ser Phe Pro 220
Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 235240
Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 250255
Arg Val Thr Cln Aep Pro Lys Leu 265270
His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 285
Leu Thr Leu ALa Leu Clu Ala Lys 300
Aon Lou Val Val Met Arg Ala Thr 315320
Glu Val Trp Gly Pro Thr Sor Pro 330335
Glu Aon Lys Clu Ala Lys Val Sor 345350
Lou Asn Pro Glu Ala Cly Mat Trp 365
Gin Val Leu Lou Clu Ser Asn Ile 380
Pro Val His Ala Aep Pro Lys Lou 395400
Pho Ile Tyr Cly Val Ile Ilo Thr 410415
Ser Arg Ser Ala Clu Thr Ala Ala 425430
Tyr Asn Glu Lou Asn Lou Gly Arg 445
Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu 460
Arg Asn Pro Gin Glu Cly Val Tyr 475480
Pro Clu Ala Tyr Ser Clu Ilo Cly 490495
Lyo Cly His Asp Cly Lou Tyr Cln 505510
Phe Cly Asn Arg Arg Clu Arg Glu 525
Gly Leu Arg Ala Arg Pro Lys Gly 540
Sor Cys Ala Ser Val Pho Ser Ilo 565 560
Pro Sor Ser Ser Ser Cln Lou 570 575 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 462 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:5:
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg 1S
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gin
Lya Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr
3540
Ile Gin Phe Hio Trp Lya Asn Ser 5055
Gin Gly ser Phe Leu Thr Lys Gly 6570
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp 85
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser 100
Aep Gin Lya Glu Glu Val Gin Leu
115120
Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly 130135
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser 145150
His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 1015
Gly Asn Lyo Val Val Leu Gly Lys 2530
Cys Thr Ala Ser Gin Lye Lyo Ser 45
Asn Gin Ile Lya Ile Leu Gly Asn 60
Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala 7580
Gin Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile 9095
Asp Thr Tyr Ile Cyn Glu Val Glu 105110
Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 125
Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 140
Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 155160
Lys Asn ile Gin Gly Gly Lys Thr 165
Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys 180
Val Glu Phe Lya Ile Asp Ile Val 195200
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly 210215
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu 225230
Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser 245
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lyo 260
Gin Met Gly Lye Lyo Leu Pro Leu 275280
Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn 290295
Thr Gly Lye Leu His Gin Glu Val 305310
Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys 325
Lye Leu Ket Leu Ser Leu Lys Leu 340
Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val 355360
Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly 370375
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr 38$390
Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu 405
Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile 420
Ser Arg Glu Lys Ser Asp Ala Val 435440
Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 450455
Leu Sar Val Sar Gin Lau Glu Leu 170175
Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 185190
Val Leu Ala Phe Gin Lyo Ala Sar 205
Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 220
Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 235240
Lya Ser Trp Ile Thr Phe Aep Leu 250255
Arg Val Thr Gin Asp Pro Lye Leu 265270
His Leu Thr Leu Pro Gin Ala Leu 285
Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys 300
Asn Leu Val Val Mat Arg Ala Thr 315320
Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 330335
Glu Asn Lys Glu Ala Lys V*1 Ser 345350
Lau Asn Pro Glu Ala Gly Mat Trp 365
Gin Val Lau Lau Glu Ser Asn Ile 380
Pro Val His Ala Asp Pro Gin Lau 395400
Pha Lau Tyr Gly Ile Val Leu Thr 410415
Gin Val Arg Lys Ala Asp Ile Ala 425430
Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn 445
His Glu Lys Pro Pro Gin 460462 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 532 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:6:
Met Ann Arg Gly Val Pro Phe Arg Hia Leu Leu Lou Val Łeu Gin Leu 15 1015
Ala Leu Łeu Pro Ala Ala Thr Gin Gly Aon Lys Val Val Leu Gly Lys 20 2530
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cyn Thr Ala Ser Gin Lye Lya Ser 35 4045
Ile Gin Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gin Ile Lys Ile Leu Gly Asn 50 5560
Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp ArgAla
70 7580
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gin Gly Asn Phe Pro Łeu IleIle
9095
Lye Aan Leu Lye Ile Glu Aep Ser Asp Thr Tyr Ile Cye Glu Val Glu 100 105110
Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn 115 120125
Ser Asp Thr Hie Leu Leu Gin Gly Gin Sar Łeu Thr Łeu Thr Łeu Glu 130 135140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cys Arg Sar Pro ArgGly
145 150 155160
Lye Asn Ile Gin Gly Gly Lya Thr Leu Ser Val Ser Gin Lou GluŁeu
165 170175
Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gin Aen Gin Łys Lyo 180 185190
Val Glu Phe Lyo Ile Asp Ile Val Val Łeu Ala Phe Gin Lya Ala Ser 195 200205
Ser Ile Val Tyr Lyo Łys Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215220
Lou Ala Phe Thr Val Glu Łyo Lou Thr Gly Ser Gly Glu Łeu TrpTrp
225 230 235240
Gin Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe AspŁeu
245 250255
Lye Asn Lys Glu Val Sar Val Lyo Arg Val Thr Gin Asp Pro Lyo Leu 260 265270
Gin Met Gly Lys Lyo Lou Pro Leu His Łeu Thr Leu Pro Gin Ala Łeu 275 280285
Pro Gin Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Łeu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lyo 290 295300
Thr Gly Łys Leu Ηχο Gin Glu Val Aon Leu Val Val Met Arg AlaThr
305 310 315320
Gin Łeu Gin Łys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr SerPro
325 330335
Łys Łeu Mat Leu Sar Lou Łys Lou Glu Asn Lyo Glu Ala Łys Val Ser 340 345350
Lys Arg Glu Łys Pro Val Trp Val Lau Asn Pro Glu Ala Gly Mat Trp 355 360365
Gin Cys Łeu Łeu Ser Asp Ser Gly Gin Val Lou Lou Glu Ser Asn Ile 370 375380
Lya Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro ŁysLou
385 390 395400
Cys Tyr Leu Lau Asp Gly Ile Lau Phe Ile Tyr Gly Val Ile lauThr
405 410415
Ala Leu Phe Leu Arg Val Łyo Phe Sar Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala 420 425430
Tyr Gin Gin Gly Gin Aan Gin Lou Tyr Asn Glu Lau Asn Lou Gly Arg 435 440445
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Łeu Asp Łys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 450 455460
Met Gly Gly Lya Pro Arg Arg Lys Aan Pro Gin Glu Gly Lou TyrAan
465 470 475480
Glu Lou Gin Łys Asp Lye Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile GlyMet
485 490495
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lya Gly His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly 500 505510
Leu Ser Thr Ala Thr Lye Aop Thr Tyr Asp Ala Lou Hie Met Gin Ala 515 520525
Leu Pro Pro Arg
530 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 Pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7:
CGCGGGCTGA CCGTCCCCTC CACCAGCTTG GGC (2) Informacja dotycząca SEQ ID ΝΟ:Θ:
(i) Charakterystyka sekwencji: Długość: 50 par zasad
B) Typ: kwas nukleinowy £ Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:
CGCGGGGATC CCTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:9:
CGCGCGCCGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC (2) Informacja dotyczącą SEQ ID NO:10:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:
CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAC 33 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 15 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:11:
CCCGGGCGGC CCCTA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:12:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (S) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:12:
CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:13:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 48 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:
CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:14:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:14:
CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:15:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 36 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencgi: SEQ ID NO:15:
CGCGGGACGC CTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:16:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:16:
CGCCGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:17:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:17:
CGCCGGACGC GTATTCGGAT GAAAGGCGAG CCC (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 26 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:18:
CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:19:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 42 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:19:
CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:20:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:20:
GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG 30 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:21:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 32 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:21:
GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:22:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:22:
TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:23:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 31 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: kwas nukleinowy (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:23:
TTGTTGGTTT CTTCACGTTG TGTCTTTCTG A (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:24:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 171 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencgi: SEQ ID NO:24:
Met Olu Hie Sar Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu 5 1015
Sar Gin Val Ser Pro Phe Lye Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Aro 20 2530
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Glv Thr Val 35 4045
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile 50 5560
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cya Aon Gly Thr Asp Ilo TyrLye
70 7580
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gin Val His Tyr Arg Met Cys Gin SerCys
9095
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val 100 105no
Ala Ile Thr Leu Leu Leu Ala Lau Gly Val Pha Cya Phe Ala Gly Hio 115 120125
Glu Thr Gly Arg Lau Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gin Ala Leu Lou Arg 130 135140
Asn Asp Gin Val Tyr Gin Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gin Tyr 145 150 155160
Sar His Lau Gly Gly Aan.Trp Ala Arg Asn Lys
165170 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:25:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 182 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:25:
Met Glu Gin Gly Lys Gly Leu Ala 5
Leu Gin Gly Thr Leu Ala Gin Ser 20
Val Tyr Asp Tyr Gin Glu Asp Gly 3540
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe 5055
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp 6570
Pro Arg Gly Met Tyr Gin Cys Lys 85
Leu Gin Val Tyr Tyr Arg Met Cys 100
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe 115120
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile 130135
Ser Arg Ala Sar Asp Lys Gin Thr 145150
Gin Pro Lou Lys Asp Arg Glu Asp 165
Asn Gin Lau Arg Arg Asn 180
Val Lau Ile Leu Ala Ile Ile Leu 10 15
Ile Lyo Gly Asn His Leu Val Lys 25 30
Ser Val Lau Leu Thr Cya Asp Ala 45
Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe 60
Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp 7580
Gly Ser Gin Asn Lys Ser Lys Pro 9095
Gin Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala 105110
Ala Glu Ile Val Sar Ile Phe Val 125
Ala Gly Gin Asp Gly Val Arg Gin 140
Lou Lou Pro Asn Asp Gin Leu Tyr 155 160
Asp Gin Tyr Ser Hio Lou Gin Gly 170 175 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:26:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 220 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:26:
Met Pro Gly Gly Leu Glu Ala Leu S
Leu Ser Tyr Ma Cys Leu Gly Pro 20
Gly Gly Pro Pro Sar Lau Thr Val 3540
Thr Cya Glu Aon Aan Gly Arg Aan 5055
Leu Gin Ser Asn Ile Thr Trp Pro 6570
Gly Thr Thr Gly Gin Leu Phe Phe 85
Ala Cys Thr Gly Cye Gin Val Ilo 100
Cye Gly Thr Tyr Leu Arg Val Arg 115120
Asp Met Gly Glu Gly Thr Lys Asn 130135
Ile Leu Leu Phe Cys Ala Val Val 145ISO
Lya Arg Trp Gin Asn Glu Lys Phe 165
Glu Asp Glu Aan Leu Tyr Clu Gly 180
Tyr Glu Asp Ile Ser Arg Gly Leu 195200
Asn Leu Hie Ile Gly Asp Ala Gin 210215
Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe 1015
Gly Cye Gin Ala Leu Arg Val Glu 2530
Asn Leu Gly Glu Glu Ala Arg Lau 45
Pro Ann Ile Thr Trp Trp Pho Ser 60
Pro Val Pro Leu Gly Pro Gly Gin 7580
Pro Glu Val Asn Lyo Asn Thr Gly 9095
Glu Asn Aan Ile Lou Lyo Arg Ser 105110
Aan Pro Val Pro Arg Pro Phe Leu 125
Arg Ile Ile Thr Ala Glu Gly Ile 140
Pro Gly Thr Leu Leu Lau Phe Arg 155160
Gly Val Aap Met Pro Aap Aep Tyr 170175
Lau Aan Leu Asp Asp Cye Sar Met 185190
Gin Gly Thr Tyr Gin Aap Val Gly 205
Leu Glu Lya Pro 220 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:27:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 228 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: aminokwas (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:27
Met Ala Thr Leu Val Leu Ser Ser Het Pro Cya Hie Trp Leu Leu Phe 5 1015
Leu Leu Leu Leu Phe Ser Cly Glu Pro Val Pro Ala Met Thr Sar Ser 20 2530
Aap Leu Pro Leu Asn Phe Gin Gly Ser Pro Cys Ser Gin Ile Trp Gin 35 4045
His Pro Arg Phe Ala Ala Lya Lya Arg Ser Ser Met Val Lys Phe His 50 5560
Cys Tyr Thr Asn His Ser Gly Ala Leu Thr Trp Phe Arg Lys ArgGly
70 7580
Ser Gin Gin Pro Gin Glu Lau Val Ser Glu Glu Gly Arg Ile ValGin
9095
Thr Gin Aan Gly Ser Val Tyr Thr Leu Thr Ile Gin Aan Ile Gin Tyr 100 105110
Glu Asp Asn Gly Ile Tyr Phe Cys Lys Gin Lys Cys Asp Ser Ala Asn 115 120125
His Asn Val Thr Asp Ser Cys Gly Thr Glu Leu Leu Val Leu Gly Phe 130 135140
Ser Thr Leu Aep Gin Leu Lya Arg Arg Asn Thr Leu Lya Aap GlyIle
145 150 155160
Ile Leu Ile Gin Thr Lou Leu Ile Ile Leu Phe Ile Ile Val ProIle
165 170175
Phe Leu Leu Leu Aap Lya Aep Aep Gly Lys Ala Gly Met Glu Glu Asp 180 185190
His Thr Tyr Glu Gly Leu Asn Ile Aep Gin Thr Ala Thr Tyr Glu Aep 195 200205
Ile Val Thr Lou Arg Thr Gly Glu Val Lys Trp Ser Val Gly Clu His 210 215220
Pro Gly Gin Clu 225
15 ζ
CD4:ę
OSFGLLDPKj LCYLLDG369 |
-PTWSTPYHADPK | LCYLLDG-
CD4:7
LGEPQ 369
-PTWSTPVHADPQ
LCY1LDALCYILDA-
liczba komórek
CD4:>7
CD4‘.7
CD4:ę
CD4
CD16PI
Intensywność fluorescencji
FIGo 2
Względna liczba komórek
101 10* 103
Intensywność fluorescencji
Względna liczba komórek
101 10* 103
Intensywność fluorescencji
HG. 4a
Czas (s)
FIG. 4b
Czas (s)
FIG. 4c
Czas (s)
FIG. 4d
Czas (s)
60.0 % zabicia
100.0
80.0
40.0
20.0
0.0
-20.0
1.0
10.0
100.0
100.0
80.0
60.0 % zabicia
40.0'
20.0
0.0
-20.0
0.1
Stosunek E/T
100.0
1-0 10.0
Stosunek E/T
FIG. 5c
Liczba komórek
Intensywność fluorescencji
25.0
20.0
15.0 %zabicia
10.0
5.0
0.0
FIG. 6a © a a Hn □ □
-5.0 L0.1
1.0
10.0
10).0
25.0
20.0
15.0 %zabicia
10.0
5.0
o.o
-5.0 U
0.1
Stosunek E/T
1.0
10.0
100.0
Stosunek E/T
189 -FSPPGADPKLCYLLOG CD16:c
FIG. 7b
Czas (s)
FIG. 8a
F34'
Y51*
OSFGLLDPKL CYLLDGILFI YGYILTALFL RYKFSRSAEP PAYQQGONQL
E6O' D66’
YNELNLGRRE EYDYLDKRRG RDPEMGGKPR RKNPOEGLYN ELOKDKMAEA
G1 22
A133’ L139*
101
YSEIGMKGER RRGKGHDGLY OGLSTATKDT YDALHMQALP PR
Stosunek E/T
CD16:5'.f(43-65)
CD16:7_____
CD16:7:r(4B-65))
FIG. 9a
CD16:c-C11G/D15G/D66°
0016:5
CD16:5::(48-65)
CD16:7;f(48-65)
RVKFSRSAEPPAYQQGCNQLYNELNLGRREEYDVL
KKLVKKFRQKKQRC NQLYNELNLGRREEYDVL
RTQIKKLCSWRDKNSAZ NQLYNELNLGRREEYDVL
—®- CDI 6::
—®-CD16::D66e —3— CD16:(-D66° C11G/D15G —^r—CD16:c E60° C11G/D15G .01 .1 1 10 100
Stosunek E/T
FIG. 9d
Średni stosunek
°CD16:< 066° a CD16:fC11G/D15G/D66‘ o CD16:fC11G/D15G/E60* *CD16:7:f (48-65) ^0016:7:^(48-59)
-100.0 θ·0 100.0 200.0 300.0 400.0
Czas (s)
Stosunek E/T
Stosunek E/T
FIG. 10c
Czas (s)
CDl6:7:ę(48-65) o E60Q + ' D63N a ·· Y62F o E6 I Q '· Y62S
FIG. 10e % uwolnionego chromu .1 1 10 100
Stosunek E/T
FIG. 10f
CD16:7:ę(48-65)
3.0
Średni 2.5 stosunek
2.0
1.5 ·· Y5IF
0.5 _____________________—J
-100.0 0-0 100.0 200.0 300.0 400.0
Czas (s)
CD16:7:ę(33-65)
CD16‘.7:f (71-104)
CD16:7:f(104-138)
FIG. 11a
RTRDEEMGGK?RRKNPQEC LY «I QKDKMAEi Y SEI
RTRIGMKGERRHGKGHDdLYP(3yST~ATKD,nYlDAŁHMOA % uwolnionego chromu
FIG. 12
FIG. 13a
3.0
2.5
Średni stosunek
2.0
1.5
1.0
0.5
Ξ CD10:IIA □ CD16:1IC
A CD16:1181
-100.0
Δ CD8:IIB2
200.0
Czas (s)
FIG. 13b
2.5
2.2
1.9 Średni stosunek 4 g
1.4
1.1 oea?Ss a*
0.8
Q*g β aB as ,
B CD4:IIA
A CD4:IIB1 □ CD4:IIB2
0.5 — -100.0
0.0
100.0
200.0
300.0
Czas (s)
AG. 14b
Stosunek E/T
FIG. 15a
236 RKKRISANST
DPVKAAQFEP PGROMIAIRK (269-311)
RGLEETNNDY (276-311) (282-311) (299-311)
276 ETADGGYMTL
NPRAPTDDDK
N1YLTLPPND
HVNSNN
Y282°
Y298*
4.0
3.3 Średni stosunek 2.6
1.9
1.2
0.5
FIG. 15b
hCD16:7:IIA δ CDl6:IIA(Y298*) δ CD16:IIA(Y2B2*)
-100.0 0.0 100.0 200.0 300.0
Czas (s)
FIG. 15d
FIG. 15e
60% zabicia
4020·
4— .01
CD16:IIA
CD16:7:IIA CD16:7:IIA(269-311) CD16:IIA (276-311)
CD16:7:IIA(283-311) CD16:7:IIA (299-311)
Stosunek E/T
FIG.16 (Seq. ID No: 24) PFKIPIEELE YRCNGTDIYK GVFCFAGHET DRVFVNCNTS DKESTVQVHY GfeLSGAADTQ ITWVEGTVGT RMCQSCVELD ALLRNDQVYQ
1 MEHSTFLSGL VLATLLSQVS GKRILDPRGI DVIATLLLAL
51 LLSDITRLDL
101 PATVAGIIVT
151 PLRDRDDAQY FIG. 17 (Seq ID 1 MEQGKGLAVL SHLGGNWARN NO: 25) ILAIILWGT K*| LAQSIKGNHL VKVYDYQEDG SYLLTCDAEA
51 KNITWFKDGK MIGFLTEDKK KWNLGSNAKD PRGMYQCKGS QNKSKPLQVY
101 YRMCQNCIEL NAATISGFLF AEIVSIFVLA VGVYFIAGQD |GVRQSRASDK
151 QTLLPNDQLY QPLKDREDDQ YSHLQGNQLR RN*|
FIG. 18 (Seq ID 1 KPGGLEALRA No: 26) LPLLLFLSYA CLGPGCQALR VEGGPPSLTV NLGEEARLTC
51 ENNGRNPNIT WWFSLQSNIT WPPVPLGPGQ GTTGQLFFPE VNKNTGACTG
101 CQVIENNILK RSCGTYLRVR NPVPRPFLiDM GEGTKNRIIT AEGIILLFCA
151 WPGTLLLFR KJRWQNEKFGV DMPDDYEDEN LYEGLNLDDC SHYEDISRGL
201 QGTYQDVGNL FIG. 19 (Seq ID 1 MATLVLSSMP HIGDAOLEKP No: 27) CHWLLFLLLL 3 FSGEPVPAMT SSDLPLNFQG SPCSQIWQHP
51 RFAAKKRSSM YKFHCYTNHS GALTWFRKRG SQQPQELVSE EGRIVQTQNG
101 SVYTLTIQNI OYEDNGIYFC KQKCDSANHN VTDSCGTELL VLGFSTLDQL
151 KRRNTLKDGI ILIQTLLIIL FIIVPIFLLL dKddgkagme EDHTYEGLNI
201 DQTATYEDIV TLRTGEYKWS VGEHPGQE*|
<η m co co
0 <
U
CM
E to co
0
C
0 <
0 $
oi 01 <1
0l □ < tu <
< iu < * < tu < id < LU < X o. Q
-1
40 % specyficznego uwolnienia ,θ.
o-
CD4Z
CD4(Dl-D4).lg.CD7.Z
CD4(Dl-D4).lg.CD7 CD4(Dl.D2).Ig.CD7Z. CD4(Dl.D2).Ig.CD7 Uninf.
Ί---r-r-rrrm,---r-nrTrm,
100 1000
Efektor/Cel
FIG. 21
Dni po zainfekowaniu
FIG. 22
D1-D4zCD4
Sekwencja kwasów nukleinowych
GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC51
CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGGιοί
CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC151
TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG201
GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCIT CCCAGAAGAA251
GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA301
ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT351
GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA401
GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC451
AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATtGACTGC CAACTCTGAC501
ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC551
TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC601
AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC651
ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT701
AGACATCGTG GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA751
AAGAGGGGGA ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA801
AAGCTGACGG GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC851
CTCCAAGTCT TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA901
AACGGGTTAC CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC951
CACCTCACCC TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT1001
CACCCTGGCC CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC1051
TGGTGGTGAT GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG1101
TGGGGACCCA CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA1151
GGAGGCAAAG GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG1201
AGGCGGGGAT GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG1251
GAATCCAACA TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA1301
TCCC (SEQ ID NO: 28)
Sekwencja aminokwasów
MNRGYPFRHL LLVLQ1ALU> AATQGNKWL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ51
FHWKHSNQIK XLGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDOG MFPLIIKNLK101
IEDSDTYICE VEDQKEEVQL L7FGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS151
PSVQCRSPRG KNI0GGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV201
VLATQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW QAERASSSKS251
WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA301
LEAKTGKLHQ ZTNLWMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK351
VSKREKPVWV UiPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKYLPTW STPYHADP (SEO ID NO: 29)
FIG. 23
D1-D2zCD4
Sekwencja kwasów nukleinowych
GCCTGTTTGA GAAGCAGCGG GCAAGAAAGA CGCAAGCCCA GAGGCCCTGC51
CATTTCTGTG GGCTCAGGTC CCTACTGGCT CAGGCCCCTG CCTCCCTCGG101
CAAGGCCACA ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC151
TGCAACTGGC GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG201
GGCAAAAAAG GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA251
GAGCATACAA TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA301
ATCAGGGCTC CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT351
GACTCAAGAA GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA401
GAATCTTAAG ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC451
AGAAGGAGGA GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC501
ACCCACCTGC TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC551
TGGTAGTAGC CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC601
AGGGGGGGAA GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC651
ACCTGGACAT GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT701
AGACATCGTG GTGCTAGCT (SEO 10 NO; 30)
Sekwencja aminokwasów
MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATOGNKWL GKKGDTWELT CTASQKKSIQ51
FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWQQG NFPLIIKNLK101
IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS151
PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV201
VLA (SEO 10 NO: 31)
FIG. 24
Zawiasa, domeny CH2 i CH3 ludzkiego lgG1
Sekwencja kwasów nukleinowych
GCTAGCAGAG CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC51
CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA101
CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CATGCGTGGT151
GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC TGGTACGTGG201
ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCGCGGGA GGAGCAGTAC251
AACAGCACGT ACCGGGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC ACCAGGACTG301
GCTGAATGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GCCCTCCCAG351
CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA401
CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAT GAGCTGACCA AGAACCAGGT451
CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC ATCGCCGTGG501
AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACGCCTCCC551
GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA601
CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG651
AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGG701
CTGCAACTGG ACGAGACCTG TGCTGAGGCC CAGGACGGGG AGCTGGACGG751
GCTCTGGACG ACGGATCC (SEQ ID NO: 32)
Sekwencja aminokwasów
EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSYFLFPP KPKDTUilSR TPEVTCWVD51
VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEO YNSTYRWSV LTVLHQDWLN101
GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGOPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL151
TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTYDKS201
RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GLQLDETCAE AODGELDGLW251
TTDP (SEO ID NO: 33)
FIG. 25
Domena przezbłonowa CD7
Sekwencja kwasów nukleinowych
CCAAGGGCCT GTGCCCTCCC TGCCCCACCG ACAGGCTCCG CCCTCCCTGA CCCGCAGACA GCCTCTGCCC TCCCTGACCC GCCAGCAGCC TCTGCCCTCC CTGCGGCCCT GGCGGTGATC TCCTTCCTCC TCGGGCTGGG CCTGGGGGTG GCGTGTGTGC TGGCGAGGAC GCGT (SEO ID NO: 34)
SI
101
151
Sekwencja aminokwasów
PRASALPAPP TGSALPDPOT ASALPDPPAA SALPAALAYI SFLLGLGŁGY 51
ACYLARTR (SEO ID NO: 35)
FIG. 26
Domena wewnątrzkomórkowa ς
Sekwencja kwasów nukleinowych
ACGCGTTTCA GCAGGAGCGC AGAGCCCCCC GCGTACCAGC AGGGCCAGAA51
CCAGCTCTAT AACGAGCTCA ATCTAGGACG AAGAGAGGAG TACGATGTTT101
TGGACAAGAG ACGTGGCCGG GACCCTGAGA TGGGGGGAAA GCCGACAAGG151
AAGAACCCTC AGGAAGGCCT GTACAATGAA CTGCAGAAAG ATAAGATGGC201
GGAGGCCTAC AGTGAGATTG GGATGAAAGG CGAGCGCCGG AGGGGCAAGG251
GGCACGATGG CCTTTACCAG GGTCTCAGTA CAGCCACCAA GGAGACCTAC301
GACGCCCTTC ACATGCAGGC CCTGCCCCCT CGCTAAAGCGGCCGC (SEQ ID NO: 36)
Sekwencja aminokwasów
TRFSRSAEPP AYQQG<2NQLY NELNŁGRREE YDYLDKRRGR DPEMGGKPRR51
KNPQEGLYNE LQKDKMAEAY SEIGMKGESR RGKGHDGLYQ GLSTATKOTY101
DALHMOALPP R (SEO ID NO: 3η
FIG. 27
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Białkowy chimeryczny receptor błonowy, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: fragment CD7 posiadającą SEQ ID NO: 35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonowąCD7, część przezbłonowąCD5, część przezbłonową CD34, białkową a-helisę.
  2. 2. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera fragment CD4 posiadający SEQ ID NO: 31.
  3. 3. Chimeryczny receptor według zastrz. 1, znamienny tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ.
  4. 4. Zmodyfikowana komórka pochodząca z grupy obejmującej (a) limfocyty T; (b) cytotoksyczne limfocyty T; (c) naturalne komórki zabijacze; (d) neutrofile; (e) granulocyty; (f) makrofagi; (g) komórki tuczne; (h) komórki HeLa; oraz (i) embrionalne komórki macierzyste, wytwarzająca w wyniku ekspresji związany z błoną białkowy chimeryczny receptor, zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych a-helis.
  5. 5. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że fragment CD4 jest oddzielony od błony komórki o co najmniej 48 A lub o co najmniej 72 A.
  6. 6. Komórka według zastrz. 4, znamienna tym, że białko receptora komórki T stanowi ζ.
  7. 7. DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domenąprzezbłonową zawierającąsekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającąSEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych ct-helis.
  8. 8. DNA według zastrz. 7, znamienny tym, że zawiera SEQ ID NO:30.
  9. 9. Wektor zawierający DNA kodujący białkowy chimeryczny receptor błonowy zawierający (a) pozakomórkową część zawierającą fragment CD4 obejmujący aminokwasy 1-394 lub aminokwasy 1-200, oraz (b) część wewnątrzkomórkową którą stanowi przenosząca sygnał część białka receptora komórki T, białka receptora komórki B lub białka receptora Fc, przy czym fragment CD4 jest oddzielony od wewnątrzkomórkowej części domeną przezbłonową zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej: CD7 posiadającą SEQ ID NO:35, zawiasę domen CH2 i CH3 ludzkiej cząsteczki IgG posiadającą SEQ ID NO:33, część
    180 066 przezbłonową CD7, część przezbłonową CD5, część przezbłonową CD34, jedną lub więcej białkowych a-helis.
  10. 10. Wektor według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera SEQ ID NO:30.
    * * *
PL95315908A 1994-02-14 1995-01-12 Bialkowy chimeryczny receptor blonowy, zmodyfikowana komórka,DNA kodujacy bialkowy chimeryczny receptor blonowy i wektor zawierajacy taki DNA PL PL PL PL PL PL PL PL180066B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19539594A 1994-02-14 1994-02-14
US08/284,391 US5851828A (en) 1991-03-07 1994-08-02 Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
PCT/US1995/000454 WO1995021528A1 (en) 1994-02-14 1995-01-12 Targeted cytolysis of hiv-infected cells by chimeric cd4 receptor-bearing cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL315908A1 PL315908A1 (en) 1996-12-09
PL180066B1 true PL180066B1 (pl) 2000-12-29

Family

ID=26890956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL95315908A PL180066B1 (pl) 1994-02-14 1995-01-12 Bialkowy chimeryczny receptor blonowy, zmodyfikowana komórka,DNA kodujacy bialkowy chimeryczny receptor blonowy i wektor zawierajacy taki DNA PL PL PL PL PL PL PL

Country Status (21)

Country Link
US (3) US5851828A (pl)
EP (1) EP0750457B1 (pl)
JP (1) JP3832850B2 (pl)
KR (1) KR100289253B1 (pl)
CN (1) CN1318576C (pl)
AT (1) ATE308888T1 (pl)
AU (1) AU690204B2 (pl)
BR (1) BR9506783A (pl)
CA (1) CA2182890C (pl)
CZ (1) CZ293969B6 (pl)
DE (1) DE69534589T2 (pl)
DK (1) DK0750457T3 (pl)
ES (1) ES2249766T3 (pl)
FI (1) FI120264B (pl)
HU (1) HU220100B (pl)
IL (1) IL112390A (pl)
NO (1) NO319378B1 (pl)
NZ (1) NZ279123A (pl)
PL (1) PL180066B1 (pl)
UA (1) UA42760C2 (pl)
WO (1) WO1995021528A1 (pl)

Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6319494B1 (en) 1990-12-14 2001-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US6407221B1 (en) 1990-12-14 2002-06-18 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5851828A (en) * 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US6753162B1 (en) 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
CZ291754B6 (cs) * 1993-07-16 2003-05-14 The General Hospital Corporation Proteinový chimerní receptor, terapeutická buňka, DNA kódující chimerní receptor a vektor
DK0781095T3 (da) * 1994-08-02 2003-06-23 Gen Hospital Corp Celler der bærer CD4 lokkeduereceptorer og beslægtede molekyler og fremgangsmåder
GB9520641D0 (en) * 1995-10-10 1995-12-13 Medical Res Council Improvements in or relating to protection against intracellular infection
AUPN980796A0 (en) 1996-05-13 1996-06-06 Australian Membrane And Biotechnology Research Institute Improved reservoir components
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
EP0893507A1 (en) * 1997-07-25 1999-01-27 Institut Gustave Roussy Use of MHC class II ligands (CD4 and LAG-3) as adjuvant for vaccination and of LAG-3 in cancer treatment
US6610043B1 (en) 1999-08-23 2003-08-26 Bistech, Inc. Tissue volume reduction
GB9925853D0 (en) * 1999-11-01 1999-12-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
DE19957838C2 (de) 1999-11-25 2002-11-21 Pette Heinrich Inst Gentherapie von HIV-Infizierten durch Expression von Membran-verankerten gp41-Peptiden
US7994298B2 (en) 2004-09-24 2011-08-09 Trustees Of Dartmouth College Chimeric NK receptor and methods for treating cancer
IN2014DN06624A (pl) 2005-10-18 2015-07-10 Univ Colorado
EP2031646A4 (en) * 2006-06-22 2012-05-30 River Bell Co TREATMENT DEVICE, TREATMENT METHOD AND PLASMA SOURCE
AU2009246876B2 (en) 2008-05-16 2015-04-02 Taiga Biotechnologies, Inc. Antibodies and processes for preparing the same
DK2966084T3 (en) 2008-08-28 2018-08-06 Taiga Biotechnologies Inc MODULATORS OF MYC, PROCEDURES FOR USING SAME AND PROCEDURES FOR IDENTIFYING SUBSTANCES MODULATING MYC
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
WO2011059836A2 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient t cell compositions
EP3725319A1 (en) * 2010-04-14 2020-10-21 Roger Williams Medical Center Methods and compositions for treating hiv
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
EP2847223B1 (en) 2012-05-07 2019-03-27 Trustees of Dartmouth College Anti-b7-h6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same
SG11201500429QA (en) 2012-07-20 2015-03-30 Taiga Biotechnologies Inc Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment
PT2884999T (pt) 2012-08-20 2021-01-05 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapêutica celular
US10272115B2 (en) 2013-03-11 2019-04-30 Taiga Biotechnologies, Inc. Production and use of red blood cells
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
WO2015095811A2 (en) 2013-12-20 2015-06-25 The Board Institute Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
WO2016100975A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Massachsetts Institute Ot Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3757211A1 (en) 2014-12-19 2020-12-30 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire
EP3261651B1 (en) * 2015-02-27 2022-05-04 iCell Gene Therapeutics LLC Chimeric antigen receptors (cars) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof
KR20180010229A (ko) 2015-05-20 2018-01-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 공유 신생항원
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
EA201890782A1 (ru) * 2015-09-22 2018-09-28 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Способ перенацеливания t-клеток для лечения инфекции hiv
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
EP3368689B1 (en) 2015-10-28 2020-06-17 The Broad Institute, Inc. Composition for modulating immune responses by use of immune cell gene signature
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017087708A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
AU2017254477A1 (en) 2016-04-18 2018-11-01 Jennifer G. ABELIN Improved HLA epitope prediction
CN106267409B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病生物治疗反应器
CN106178163B (zh) * 2016-07-01 2019-02-01 翁炳焕 艾滋病生物细胞免疫治疗仪
US11630103B2 (en) 2016-08-17 2023-04-18 The Broad Institute, Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
WO2018067991A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
KR20190092472A (ko) 2016-12-02 2019-08-07 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 나노입자 제제
EP3574116A1 (en) 2017-01-24 2019-12-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
CN110612119A (zh) 2017-02-07 2019-12-24 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 磷脂醚(ple)car t细胞肿瘤靶向(ctct)剂
US11965892B2 (en) 2017-02-12 2024-04-23 Biontech Us Inc. HLA-based methods and compositions and uses thereof
EP3589295A4 (en) 2017-02-28 2020-11-04 Endocyte, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF T CAR LYMPHOCYTE THERAPY
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
EP3606518A4 (en) 2017-04-01 2021-04-07 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION AND MODULATION OF IMMUNOTHERAPY RESISTANCE GENE SIGNATURE IN CANCER
EP3610266A4 (en) 2017-04-12 2021-04-21 Massachusetts Eye and Ear Infirmary TUMOR SIGNATURE OF METASTASIS, COMPOSITIONS OF SUBSTANCES AND USES THEREOF
CA3059643A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cellectis New sequence specific reagents targeting ccr5 in primary hematopoietic cells
WO2018195019A1 (en) 2017-04-18 2018-10-25 The Broad Institute Inc. Compositions for detecting secretion and methods of use
KR20240059648A (ko) 2017-04-19 2024-05-07 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포
CN107014658B (zh) * 2017-05-27 2023-08-25 四川省肿瘤医院 提取游离细胞的方法及试剂盒
EP3638218A4 (en) 2017-06-14 2021-06-09 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH
US10149898B2 (en) 2017-08-03 2018-12-11 Taiga Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for the treatment of melanoma
CN115028739A (zh) 2017-08-03 2022-09-09 泰加生物工艺学公司 用于治疗黑素瘤的方法和组合物
KR20200066616A (ko) 2017-09-21 2020-06-10 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
WO2019084055A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Massachusetts Institute Of Technology CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS
WO2019094983A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway
JP2021511293A (ja) * 2018-01-12 2021-05-06 ビラクタ セラピューティクス，インク． 細胞免疫療法で使用されるエピジェネティック修飾因子
AU2019209428A1 (en) 2018-01-22 2020-07-30 Endocyte, Inc. Methods of use for CAR T cells
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
US20210371932A1 (en) 2018-06-01 2021-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US20210246503A1 (en) 2018-06-11 2021-08-12 The Broad Institute, Inc. Lineage tracing using mitochondrial genome mutations and single cell genomics
WO2020041384A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. 3-phenyl-2-cyano-azetidine derivatives, inhibitors of rna-guided nuclease activity
WO2020041387A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
US20210177832A1 (en) 2018-08-20 2021-06-17 The Broad Institute, Inc. Inhibitors of rna-guided nuclease target binding and uses thereof
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
US20220170097A1 (en) 2018-10-29 2022-06-02 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
US20210388389A1 (en) 2018-10-30 2021-12-16 Yale University Compositions and methods for rapid and modular generation of chimeric antigen receptor t cells
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
BR112021012278A2 (pt) 2018-12-21 2021-12-14 Biontech Us Inc Método e sistema para a preparação de células hla de classe ii-específica de epitopes e de síntese de cd4 + t
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
EP3942023A1 (en) 2019-03-18 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
US20220226464A1 (en) 2019-05-28 2022-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating immune responses
WO2021030627A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
JP2023538303A (ja) 2020-08-13 2023-09-07 イェール ユニバーシティー 所望の表現型を有するｃａｒ ｔ細胞の操作および選択のための組成物および方法
WO2023173137A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Yale University Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells
WO2023220644A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Yale University Compositions and methods of synthetic ctla-4 tails for reprogramming of car-t cells and enhancement of anti-tumor efficacy
WO2024077256A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery ofpeptide-mhc targeting binding proteins

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL224379A (pl) 1957-01-30
US4873190A (en) * 1984-06-13 1989-10-10 Massachusetts Institute Of Technology Heterodimeric T lymphocyte receptor
GB8422238D0 (en) * 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4690915A (en) * 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US5030576A (en) * 1986-04-30 1991-07-09 Genentech, Inc. Receptors for efficient determination of ligands and their antagonists or agonists
WO1988001649A1 (en) * 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4808151A (en) * 1987-04-27 1989-02-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Simplified method for the preparation of human lymphokine activated killer cells
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
JPS6463394A (en) * 1987-09-04 1989-03-09 Kyowa Hakko Kogyo Kk Novel chimera polypeptide
US5336603A (en) * 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
NZ226414A (en) * 1987-10-02 1992-07-28 Genentech Inc Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use
PT89484B (pt) * 1988-01-22 1994-03-31 Gen Hospital Corp Genes clonados codificadores de proteinas de fusao ig-cd4 e sua utilizacao
IL86278A (en) * 1988-05-04 2003-06-24 Yeda Res & Dev Endowing cells with antibody specificity using chimeric t cell receptor
CA2000878C (en) * 1988-10-18 1999-06-29 Jean-Pierre Kinet Cdnas coding for the subunit of the high-affinity receptor for immunoglobulin e
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
FR2644463A1 (pl) * 1989-03-17 1990-09-21 Pasteur Institut
EP0394827A1 (en) * 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
WO1991010736A2 (en) * 1990-01-19 1991-07-25 Dana Farber Cancer Institute CLONING AND CHARACTERIZATION OF THE CD3θ SUBUNIT
KR100246529B1 (ko) * 1990-12-14 2000-04-01 스티븐 에이. 서윈. 엠.디. 수용체 관련된 신호 변환 경로를 위한 키메라 사슬
US5843728A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) * 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US6753162B1 (en) * 1991-03-07 2004-06-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
NZ241855A (en) * 1991-03-07 1994-04-27 Gen Hospital Corp Use of therapeutic cells to obtain cellular response to infection, tumours or autoimmune-generated cells, cells with chimaeric receptors (with binding component and destruction signal), dna encoding the receptor, vectors and antibodies to receptor
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
WO1993019163A1 (en) * 1992-03-18 1993-09-30 Yeda Research And Development Co, Ltd. Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
CZ291754B6 (cs) 1993-07-16 2003-05-14 The General Hospital Corporation Proteinový chimerní receptor, terapeutická buňka, DNA kódující chimerní receptor a vektor
US5439819A (en) * 1993-08-27 1995-08-08 The Regents Of The University Of California Chimeric protein tyrosine kinases
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
JP3782521B2 (ja) 1996-08-23 2006-06-07 富士通コンポーネント株式会社 押釦構造およびキーボード

Also Published As

Publication number Publication date
HUT75375A (en) 1997-05-28
EP0750457A4 (en) 1999-03-03
CN1146136A (zh) 1997-03-26
CA2182890C (en) 2008-11-04
FI120264B (fi) 2009-08-31
DE69534589T2 (de) 2006-07-13
US5851828A (en) 1998-12-22
US7094599B2 (en) 2006-08-22
FI963150A0 (fi) 1996-08-12
MX9603384A (es) 1997-12-31
IL112390A (en) 2006-08-20
FI963150A (fi) 1996-10-10
EP0750457A1 (en) 1997-01-02
HU9602182D0 (en) 1996-10-28
JP3832850B2 (ja) 2006-10-11
WO1995021528A1 (en) 1995-08-17
KR970701004A (ko) 1997-03-17
BR9506783A (pt) 1997-10-14
NZ279123A (en) 1998-03-25
ES2249766T3 (es) 2006-04-01
US20030138410A1 (en) 2003-07-24
KR100289253B1 (ko) 2001-11-30
NO963379L (no) 1996-10-11
CZ293969B6 (cs) 2004-09-15
EP0750457B1 (en) 2005-11-09
JPH09512421A (ja) 1997-12-16
UA42760C2 (uk) 2001-11-15
NO963379D0 (no) 1996-08-13
US6284240B1 (en) 2001-09-04
PL315908A1 (en) 1996-12-09
IL112390A0 (en) 1995-03-30
CZ233196A3 (en) 1997-07-16
DK0750457T3 (da) 2006-03-27
CA2182890A1 (en) 1995-08-17
CN1318576C (zh) 2007-05-30
ATE308888T1 (de) 2005-11-15
DE69534589D1 (de) 2005-12-15
AU1565395A (en) 1995-08-29
NO319378B1 (no) 2005-07-25
HU220100B (hu) 2001-10-28
AU690204B2 (en) 1998-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6284240B1 (en) Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US6753162B1 (en) Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
AU662136B2 (en) Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
AU708339B2 (en) Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US20040005334A1 (en) Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
AU697489B2 (en) Cells bearing cd4 decoy receptors and related molecules and methods
AU724652B2 (en) Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
RU2173167C2 (ru) Способ направления клеточного иммунного ответа против вич-инфицированной клетки млекопитающего, белковый мембранносвязанный химерный рецептор, днк
MXPA96003384A (es) Citolisis objetivada de celulas infectadas por hiv mediante celulas portadoras receptoras cd4 quimericas