CZ293969B6

CZ293969B6 - Buňka nesoucí chimérický CD4 receptor, která ničí HIV infikované buňky a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ293969B6
Application number: CZ19962331A
Authority: CZ
Inventors: Brian Seed; Babak Banapour; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: The General Hospital Corporation
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 2004-09-15
Also published as: PL315908A1; US7094599B2; NO319378B1; NZ279123A; ES2249766T3; JPH09512421A; IL112390A; FI963150A0; CN1146136A; UA42760C2; US20030138410A1; KR970701004A; WO1995021528A1; CA2182890A1; US6284240B1; CN1318576C; DE69534589D1; CA2182890C; FI120264B; IL112390A0

Abstract

Terapeutická buňka exprimující membránově vázaný proteinový receptor obsahující (a) extracelulární část, která obsahuje fragment z CD4, který je oddělen od membrány terapeutické buňky nejméně 48.10.sup.-10.n. m nebo nejméně 72.10.sup.-10.n. m je schopen specificky rozpoznat a vázat HIV infikované buňky, ale který nepřenáší infekci, a (b) intracelulární část, která je částí přenášející signál z receptorového proteinu T buňky, z receptorového proteinu B buňky nebo z receptorového proteinu Fc a je schopna poslat terapeutickým buňkám signál pro zničení HIV infikované buňky vázané na receptor, a farmaceutický prostředek obsahující takové buňky.ŕ

Description

Buňka nesoucí chimérický CD4 receptor, která ničí HIV infikované buňky a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká funkčních chimér mezi CD4 fragmenty a receptory buněk imunitního systému, které jsou schopny řídit buňky imunitního systému tak, aby lyžovaly HIV infikované buňky, ale které přitom nečiní buňky imunitního systému citlivými k HTV infekci. Vynález tak předkládá nové a efektivní HIV terapeutikum.

Dosavadní stav techniky

Základem imunitní odpovědi organismu je rozpoznání antigenu T buňkou pomocí jejího receptoru. T buňky řídí proces zvaný buněčná imunita. Tento proces zahrnuje zničení buněk cizí tkáně nebo infikovaných buněk buňkami imunitního systému. Existují různé druhy T buněk, mezi něž patří „pomocné“ buňky a „supresorové“ buňky, které modulují imunitní odpověď, a cytotoxické (nebo „killerové“) buňky, které mohou cizorodé buňky zabíjet přímo.

T buňka, která rozpoznává a váže unikátní antigen vystavený na povrchu jiné buňky, se aktivuje; tento proces se může násobit, a pokud jde o cytotoxickou buňku, navázaná cizorodá buňka může být zabita.

HIV a imupatogeneze

V roce 1984 bylo prokázáno, že HIV virus je etiologickým agens AIDS. Od té doby se definice AIDS několikrát změnila s přihlédnutím k tomu, jaká kritéria byl měla být zahrnuta v diagnóze. Navzdory fluktuaci v diagnostických parametrech, společným jmenovatelem AIDS je infekce HTV a následné objevení pro AIDS typických symptomů a chorob, jako jsou sekundární infekce, novotvary a neurologické choroby. (Harrison's Principls of Intemal Medicine, 12. vydání, McGrawHill, 1991)

HIV je lidský retrovirus ze skupiny lentivirů. Čtyři rozeznávané lidské retroviry se řadí do dvou oddělených skupin: lidské T lymfotické (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a HTLV-2, a viry lidské imunodefícience, HTV-1 a HIV-2. První uvedené patří mezi transformující viry, kdežto druhé jsou viry cytopatické. Virus HIV-1 byl identifikován jako světově nejrozšířenější původce AIDS. Sekvenční homologie mezi HTV-2 a HIV-1 je asi 40 procent, přičemž HTV-2 je spíše příbuzný některým členům skupiny imunodeficientních virů primátů (STV). (Viz Curran J. et al., Science 329:1357-1359, 1985; Weiss R. et al., Nátuře 324-572-575, 1986)

HTV je tvořen jednak geny typickými pro retroviry (env, gag, pol), a dále pak šesti specifickými geny účastnícími se replikace a dalších biologických aktivit viru. Jak již bylo uvedeno, společným jmenovatelem AIDS je vysoká imunosuprese, hlavně buněčné imunity. Tato imunosuprese vede k množství následných chorob, zejména nejrůznějších infekcí a novotvarů.

Hlavní příčinou imunitní nedostatečnosti při AIDS jsou kvantitativní a kvalitativní změny v sadě lymfocytů pocházejících zbrzlíku (Thymus), tzv. T4 populaci. Tato sada buněk je fenotypicky definována přítomností povrchových CD4 molekul, které byly odhaleny jako buněčné receptory HTV viru. (Dalgleish et al., Nátuře 312:763, 1984). Ačkoli T4 buňky jsou nejčastějším typem buněk, které podléhají HIV infekci, infikována může být v podstatě jakákoliv lidská buňka, která má na svém povrchu vystavenu CD4 molekulu.

Za normálního stavu jsou T lymfocyty s CD4 molekulou určeny pro funkci tzv. pomocníků/iniciátorů, které zajišťují předání signálu B buňkách nebo indukci T lymfocytů nesoucích

-1 CZ 293969 B6 reciproký CD8 markér k přeměně na cytotoxické/supresorové buňky. (Reinherz a Schlossman, Cell 19:821-827, 1980; Goldstein et al., Immunol. Rev. 68:5-42, 1982)

HIV virus se váže specificky a s vysokou afinitou, přes řetězec aminokyselin virového obalu (gpl20), na část VI regionu CD4 molekuly lokalizovanou blízko jejího N-konce. Po navázání virus splývá s membránou cílové buňky a proniká do nitra buňky. Jakmile je uvnitř, přepisuje svou genomovou RNA do DNA za pomoci enzymu reverzní transkriptázy. DNA je pak zaintegrována do buněčné DNA, kde setrvává až do konce života buňky jako tzv. provirus.

Provirus může zůstat latentní anebo být aktivován tak, že se začne tvořit a transkribovat mRNA a genomová RNA, což vede k syntéze proteinů, jejich sdružování, formování nového virionu a nakonec vypučení viru na buněčný povrch. Ačkoliv přesný mechanismus, kterým viru způsobí smrt buňky, není ještě úplně znám, předpokládá se, že hlavní příčinou je masivní pučení viru z povrchu buňky, což zřejmě přivodí porušení plazmatické membrány a vede k osmotické nestabilitě.

Během trvání infekce si hostitelský organismus vyvíjí protilátky proti virovým proteinům, včetně hlavních obalových proteinů gpl20 a gp41. Navzdory humorální imunitě nemoc postupuje a vede až k letální imunosupresi charakterizované mnohonásobnými následnými infekcemi, parasitémii, demenci a smrti. Selhání a neschopnost hostitelských antivirových protilátek zabránit postupu nemoci přestavuje jeden z nejhorších a nejvíce alarmujících aspektu infekce, který nedává příliš nadějí na léčení nemoci pomocí očkování.

Na efektivitu humorální odpovědi na imunosupresivní viry by mohly mít vliv dva faktory. Za prvé, jako ostatní RNA viry (a zejména jako retroviry), viry imunodeficience vykazují vysokou schopnost mutací jako reakci na hostitelský imunitní dohled. Za druhé, samotné obalové proteiny jsou vysoce glykosylované molekuly, které představují několik epitopů umožňujících vysoce afmitní vazbu protilátky. Takový slabě antigenní cíl, který virový obal představuje, zanechává hostiteli jen velmi malou šanci na zamezení tvorby viru produkcí specifických protilátek.

Buňky infikované HIV virem exprimují na svém povrchu glykoprotein gpl20. GP120 umožňuje fúzi mezi buňkami obsahujícími CD4 díky reakci podobné té, kterou viru proniká do neinfikované buňky, což vede k tvorbě pouze krátkodobě přežívajících polyjademých gigantických buněk. Tvorba takovéhoto syncytia je závislá na přímé interakci obalového glykoproteinu gpl20 s proteinem CD4. (Dalgleish et al., supra; Klatzman D. et al.., Nátuře 312:763, 1984; McDougal J.S. et al., Science 231-382, 1986; Sodroski J. et al., Nátuře 322:470, 1986; Lifson J. D. et al., Nátuře 323:725, 1986; Sodroski J. et al., Nátuře 321:412, 1986)

Pro potvrzení toho, že vazba mezi CD4 a gp 120 je zodpovědná za virovou infekci buněk nesoucích CD4 antigen, svědčí i fakt, že mezi CD4 a gp 120 se tvoří specifický komplex. (McDougal et al., viz výše). Jiní badatelé ukázali, že buněčné linie, které nebyly senzitivní k infekci HIV, je možné změnit na infikovatelné, pokud je do nich vnesen lidský CD4 cDNA gen a buňky ho začnou exprimovat. (Maddon et al., Cell 46:333-348, 1986).

V terapeutických programech a pokusech prováděných in vitro bylo několik skupinami úspěšně demonstrováno použití rozpustného CD4 jako pasivního agens pro interferenci s virovou adsorpcí a celulámím přesunem pomocí syncytia. (Deen et al., Nátuře 331:76-78, 1988; Husey etal., Nátuře 331-78-81, 1988; Smith et al., Science 238:1704-1707, 1987; Traunecker et al., Nátuře 331:84-86, 1988). Následně byly vyvinut CD4 imunoglobulinové fúzní proteiny s prodlouženým poločasem života a umírněnou biologickou aktivotou. (Capon et al., Nátuře 337:525-531,1989; Traunecker et al., Nátuře 339:68-70, 1989; Bym et al., Nátuře 344:667-670, 1990; Zetlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353, 1990). Ačkoliv CD4 imunotoxin konjuguje, a fúzní proteiny vykazují silné cytotoxické účinky vůči infikovaným buňkám in vitro (Chaundhary et al., Nátuře 335:356-372, 1988; Till et al., Science 242:1166—1168, 1988), díky latenci syndromu imunodeficience je velmi nepravděpodobné, že by jakákoli jednorázová terapie

-2CZ 293969 B6 mohla být pro eliminaci virové zátěže účinná, a antigenicita cizorodých fúzních proteinů pravděpodobně limituje jejich použití pro léčení vyžadující opakované dávky. Pokusy s opicemi infikovanými SIV ukázaly, že rozpustný CD4, pokud je podán zvířatům bez zjištění CD4 cytopénie, dokáže redukovat SIV titr a zlepšit in vitro měřený myeloidní potenciál (Watanabe et al., Nátuře 337:267-270, 1989). Pokud ale byla léčba přerušena, bylo pozorováno okamžité znovuobjevení viru, z čehož vyplývá, že pro prevenci progresivního oslabení imunitního systému by zřejmě bylo nezbytné celoživotní podávání.

T buňky a Fc receptory

Vystavení nejhojnější formy antigenního receptoru (TCR) na buněčném povrchu T buněk vyžaduje koexpresi nejméně 6 odlišných polypeptidových řetězců (Weiss et al., J. Exp. Med. 160, 1284-1299, 1984; Orloffhashi et al., Nátuře 316:606-609, 1985, Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263:8528-8536, 1988; Sussman et al., Cell 52:85-95, 1988), řetězců vážících α/β antigen, tří polypeptidů CD3 komplexu a ζ. Pokud některé z řetězců chybí, nedochází ke stabilní expresi zbývajících členů komplexu, ζ je limitujícím polypeptidem pro povrchové vystavení komplexního komplexu (Sussman et al., Cell 52:85-95, 1988), a předpokládá se, že zprostředkovává přinejmenším část programů aktivujících buňky spouštěných rozpoznáním ligandu receptorem (Weissman et al. EMBo J. 8:3651-3656, 1989; Frans et al., Science 249:174-177, 19990). Integrální membránový homodimér typu I o hmotnosti 32kDa, ζ (zeta), má extracelulámí doménu o délce 9 zbytků, která neobsahuje žádné místa pro navázání N-vázaného glykanu, a intracelulární doménu o délce 112 zbytků (myš) anebo 113 zbytků (člověk)(Weissman et al., Science 238:1018-1020, 1988; Wessman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:9709-9713, 1988). Izoforma ζ zvaná η (eta) (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878, 1988; Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812-14817, 1989), která vzniká alternativním sestřihem mRNA (Jim et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3333, 1990), je přítomna v redukovaném množství v buňkách exprimujících antigenní receptor. ζ-η heterodiméry jsou považovány za zprostředkovatele formování inositol fosfátů, stejně jako programové buněčné smrti zvané apoptóza iniciované receptorem (Mercep et al., Science 242:571-574, 1988; Mercep et al., Science 246:11621165, 1989).

Tak jako ζ a η, je i γ řetězec asociovaný s Fc receptorem vystaveným na buněčném povrchu v komplexu s dalšími polypeptidy, z nichž některé zprostředkovávají rozpoznávání ligandu, a jiné mají nedefinovanou funkci, γ (gama) má homodimerickou strukturu a organizaci velmi podobnou ζ, a je složkou vysoce afinitního IgE receptoru - FceRI - žímých buněk i basofílů, který se skládá nejméně ze tří různých polypeptidových řetězců (Blanc et al., Nátuře 337:187-1989, 1989; Ra et al., Nátuře 241:725-754, 1989), a jednoho z nízko afínitních receptorů Pro IgG, reprezentovaného v myších FcyRIa (Ra et al., J. Biol. Chem. 264:15323-15327, 1989) a u lidí expresí subtypu CD 16 (transmembránový CD 16 = CD16_TM) makrofágy a NK (natural killer) buňkami (Lanier et al., Nátuře 342:803-805, 1989; Anderson et al., proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:2274-2278, 1990; Anderson et al., Proč. Nati Acad. Sci. USA 87:2274-2278,1990). Nedávno bylo zjištěno, že γ je exprimován v T buněčné linii (CTTL) u myší, kde tvoří homodiméry i heterodiméry γ-ζ a γ-η Orloff et al., Nátuře 347:189-191, 1990).

Fc receptory zprostředkují fagocytózu imunitního komplexu, transcytózu a protilátkově závislou buněčnou cytotoxicutu (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Unkeles et al., Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1988; Mellan, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25, 1988). Nedávno bylo zjištěno, že jeden zhlodavčích nízko afínitních izoforem Fc receptoru, FcRylIIBl, zprostředkovává intemalizaci dílů s Ig na povrchu do klatrinem vystlaných jamek, a že jiný nízkoafínitní receptor, FcrylIIA, zprostředkovává ADCC během asociace s jedním nebo více členy malé skupiny tzv. „spouštěcích“ molekul (Miettinen et al., Cell 588:317-327, 1989; Hunziker and Mellman, J. Cell. Biol. 109: 3291-3302, 1989). Tyto spouštěcí molekuly, řetězce ζ a η receptoru T buněk (T cell receptor TCR) a řetězec y Fc receptoru interagují s rozpoznávacími doménami různých receptorů imunit ního systému a mohou autonomně iniciovat buněčné efektorové programy, včetně cytolýzy následující po agregaci (Samelson et al., Cell 43:223-231, 1985; Weissman etal., Science 239:1018-1020, 1988, Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87:3319-3323, 1990; Blank et al., Nátuře 337:187-189, 1989; Lanier et al. Nátuře 342-803-805, 1989; Kurosaki a Ravetch, Nátuře 342-805-897, 1989; Hibbs et al., Science 246: 1608-1611, 1989; Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87:2274-2278, 1990; Irving a Weiss, Cell 64:891-901, 1991). Při porovnávání lidských a hlodavčích nízko afinitních Fc receptorů se ukázalo, že lidský FcRylIA ani C izoformy nemají v hlodavcích obdobný protějšek.

Částečně také díly tomuto zjištění je třeba jejich funkci ještě přesně definovat. Jelikož humorální agens založená pouze na samotném CD4 mohou mít in vivo limitovanou využitelnost, byla zkoumána možnost doplnění buněčné imunity proti HTV. Byly připraveny proteinové chiméry, ve kteiých byla extracelulámí doména CD4 fúzována k transmembránové a/nebo intracelulámí doméně receptorů T buněk, receptorů IgG Fc, nebo k elementům přenášejících signál receptorů B buněk (U.S.S.N. 07/847, 566 a 07/665, 961, přiloženo jako reference). Cytolytické T buňky exprimující chiméry obsahující extracelulámí CD4 doménu, vykazují výraznou destrukci buněk exprimujících obalové proteiny HIV, závislou na hlavním histokompatibilním komplexu. Velmi důležitým a významným objemem byla identifikace jednotlivých řetězců receptorů T buněk, Fc receptorů a receptorů B buněk, jejichž agregace je dostačující k zahájení buněčné odpovědi. Jednou z výrazně užitečných aplikací tohoto objemu byl vynález chimér mezi CD4 a ζ, η nebo γ které řídí cytolytické T lymfocyty tak, aby rozpoznávaly a zabíjely buňky vystavující na povrchu HIV gpl20 (U.S.S.N. 07/847, 566 a 07/665,961, přiloženo jako reference).

Podstata vynálezu

Vynález charakterizuje metodu přímé buněčné imunitní odpovědi proti HIV infikovaným buňkám savců. Metoda zahrnuje podávání efektivního množství terapeutických buněk, které exprimují membránově vázaný proteinový chimérický receptor skládající se z (a) extracelulámí části obsahující fragment CD4, která je schopna rozpoznat a vázat HIV infikované buňky, ale nepřenáší HIV infekci a (b) intracelulámí části, která je schopna předat terapeutickým buňkám pokyn ke zničení HIV infikované buňky navázané na receptor. Vynález se zabývá také využitím terapeutických buněk, které exprimují membránově vázaný proteinový chimérický receptor skládající se z (a) extracelulámí části obsahující fragment CD4, která je schopna rozpoznat a vázat HIV infikované buňky, ale nepřenáší HIV infekci a (b) intracelulámí části, která je schopna předat terapeutickým buňkám pokyn ke zničení HIV infikované buňky navázané na receptor. Toto je využíváno při vývoji léčebného prostředku k léčbě nemocí spojených s HIV.

Druhou formou vynálezu jsou buňky, které exprimují membránově vázaný proteinový chimérický receptor skládající se z (a) extracelulámí části obsahující fragment CD4, která je schopna rozpoznat a vázat HTV infikované buňky, ale nepřenáší HTV infekci a (b) intracelulámí části, která je schopna předat terapeutickým buňkám pokyn ke zničení HTV infikované buňky navázané na receptor.

U obou forem vynálezu představuje CD4 fragment aminokyseliny 1-394 z CD4 anebo aminokyseliny 1-200 z CD4; CD4 fragment je oddělen od intracelulámí části transmembránovou doménou CD7, jak je ukázáno na obr. 26, nebo flexibilní části těžkého řetězce nebo doménami CH2 či CH3 lidské molekuly IgGl, jak je ukázáno na obr. 25; receptor zahrnuje transmembránovou části CD7; receptor zahrnuje transmembránovou část CD5; receptor zahrnuje transmembránovou část CD34; CD4 fragment je oddělen od membrány terapeutických buněk pomocí jednoho nebo více proteinových alfa helixů; CD4 fragment je oddělen od membrány terapeutických buněk nejméně 48.10'¹⁰m nebo nejméně 72.10^-1° m; intracelulámí část je signál transfukující částí receptorového proteinu T buněk (např. ζ), receptorového proteinu B buněk nebo Fc receptorového proteinu; terapeutické buňky jsou vybírány ze skupiny buněk skládajících se z: (a): T lymfocytů, (b) cytotoxických T lymfocytů, (c) NK buněk, (d) neutrofílů, (e)

-4CZ 293969 B6 granulocytů, (f) makrofágů, (g) žímých buněk, (h), Hela buněk, a (i) embryonálních kmenových buněk. V dalších aspektech vynálezu charakterizuje DNA kódující chimérický receptor vynálezu; a dále vektor obsahující DNA tohoto chimérického receptorů. Ačkoliv je předkládaný vynález chimérou mezi CD4 a zeta, pro zde předkládané účely může být užit jakýkoli receptorový řetězec zastávající v těchto molekulách (tj. granulocytech nebo B lymfocytech) podobnou funkci. Charakteristickými vlastnostmi požadovanými od spouštěcích molekul imunitního systému jsou: schopnost autonomní exprese (tj. jako jednotlivý řetězec), schopnost fuze s extracelulámí CD4 doménou tak, aby vzniklá chiméra byla přítomna na povrchu terapeutické buňky, a schopnost iniciovat buněčné efektorové programy při agregaci a setkání s cílovým ligandem. V současné době je nejpohodlnější metodou pro vnášení chimérických molekul do imunitního systému nějaká forma genetické terapie, přestože vytváření buněk imunitního systému s chimérickými receptory pomocí smísení buněk s dostatečně rozpuštěným purifikovaným proteinem by také vedlo k formování buněčných populací schopných reagovat na HTV infikované buňky. Podobné postupy byly použity například pro terapeutické účely a vnášení CD4 molekul do erytrocytů.

V tomto případě by však nově vytvořené buněčné populace nebyly schopny se samy obnovovat.

Předkládaný vynález se vztahuje k funkčním a zjednodušeným chimérám mezi CD4 fragmenty a podjednotkami receptorů T buňky, receptorů B buňky a Fc receptorů, které jsou schopny přímé imunitní odpovědi a rozpoznání a lyže HTV infikovaných buněk. Tato metoda řízení buněčné odpovědi u savců zahrnuje vnesení efektivního množství terapeutických buněk (například cytotoxických T lymfocytů) do savce; tyto buňky jsou schopny rozpoznávat a ničit HTV infikované buňky.

Vynález dále zahrnuje chimérické receptorové proteiny, které umožňují cytotoxickým T lymfocytům rozpoznávat a lyžovat HIV infikované buňky, hostitelské buňky transformované vektorem nesoucím chimérické receptory, a protilátky proti chimérickým receptorům.

Tyto a další nelimitované formy využití předkládaného vynálezu budou zřejmé všem známým oboru z následujícího detailního popisu vynálezu.

V následujícím podrobném popisu budou využívány odkazy na různé metodiky známé molekulárním biologům a imunologům.

Publikace a další materiály obsahující metodiky, na něž bude odkazováno, jsou součástí referencí.

Standardní odkazy jsou na práce obsahující základní principy technologií pro rekombinantní DNA jako jsou: Watson et al.., Molecular biology of the Gene, díly I a Π, vydavatel Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., Menlo Park, Ca (1987); Damel et al., Molecular Cell Biology, Sciencific Američan books, lne., New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, vydavatelé John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, druhé vydání, vydavatel University ofCarolina Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, druhé vydání, vydavatel Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

Definice „Klonování“ znamená použití rekombinantních technik in vitro ke vnesení určitého genu nebo jiné sekvence DNA do vektorové molekuly.

„cDNA“ je komplementární řetězec DNA vzniklý přepisem RNA templátu RNA-dependentní DNA polymerázovou (reverzní transkriptázou). Pak „cDNA klon“ je dvojřetězcová sekvence DNA komplementární k určité RNA molekule, která je nesena klonovacím vektorem.

-5CZ 293969 B6

Jako „cDNA knihovna“ je označována kolekce rekombinantních molekul DNA obsahující cDNA inzerty, které obsahují DNA kopie mRNA, která byla exprimována buňkou v době přípravy cDNA knihovny. Taková cDNA knihovna může být připravena známými metodami popsanými např. v Ausubel et al. - viz výše, a Maniatis et al. - viz výše. Obecně: RNA je nejprve izolována z buněk organismu, z něhož genomu je žádoucí klonovat určitý gen. Pro účely předkládaného vynálezu jsou preferovány savčí, a to zejména lidské, lymfocytické buňky linie. V současné době je vektorem používaným pro tyto účely nejčastěji WR kmen vakcinia viru.

Jako „vektor“ je označována molekula DNA pocházející např. zplazmidu, bakteriofága nebo savčího či hmyzího viru, do které mohou být vnášeny nebo klonovány fragmenty DNA. Vektor bude obsahovat jedno nebo dvě unikátní restrikční místa a může být schopna autonomní replikace v definovaném hostitelském nebo nosičovém organismu, tak, aby klonovaná sekvence byla reproducibilní. Potom je „DNA expresním vektorem“ míněn jakýkoli autonomní element schopný řízení syntézy rekombinantního peptidu. Takové expresní vektory zahrnují bakteriální plazmidy a fágové a savčí a hmyzí plazmidy a viry. „Značně čistá“ je sloučenina, např. protein, polypeptid nebo protilátka, která je do značné míiy zbavena všech složek, které jsou s ní přirozeně spojeny. Obecně, sloučenina je značně čistá, pokud vzorek z celkového materiálu obsahuje nejméně 60 %, výhodněji nejméně 75 % a nejvýhodněji 90 % dané sloučeniny. Čistota může být stanovena jakoukoliv vhodnou metodou, např. sloupcovou chromatografií, elektroforézou v polyakiylamidovém gelu nebo pomocí HPLC (vysoce afmitní chromatografie). V případě nukleové kyseliny „značně čisté“ charakterizuje sekvenci, segment nebo fragment nukleové kyseliny, který není bezprostředně přilehlý k (= kovalentně vázán k) oběma kódujícím sekvencím, ke kteiým bezprostředně přiléhá (tzn. jedné na 5' konci a druhé na 3' konci) v přirozeně se vyskytujícím genomu organismu, ze kterého pochází DNA.

Jako „fragment“ je označována molekula, např. jakákoliv cDNA předkládaného vynálezu, která je tvořena sadou sousedících nukleotidů pocházejících z dané molekuly.,Analogem“ molekuly je nazývána uměle vytvořená (tzn. ne přírodní) molekula značně podobná dané molekule nebo jejímu fragmentu. Molekula je popisována jako „značně podobná“ jiné molekule, pokud je tvořena v podstatě shodnými aminokyselinami. Molekuly se značně podobnými aminokyselinami budou vykazovat podobnou biologickou aktivitu. Zde je jako „chemický derivát“ jiné molekuly označovaná molekula obsahující chemické skupiny, které nejsou normálně její součástí. Takové skupiny mohou zlepšovat rozpustnost molekuly, absorpci, poločas života atp. Takové skupiny mohou také alternativně snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat nežádoucí vedlejší efekty, atd. Skupiny schopné způsobit takové efekty jsou popsány např. v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack Publishing Co., Easton, Penn (1980).

„Funkční derivát“ genu pro receptorovou chiméru předkládaného vynálezu zahrnuje „fragmenty“ pro „analogy“ genu, které mají „značně podobnou“ nukleotidovou sekvenci, a která kóduje molekulu vykazující podobnou aktivitu jako např. chimeraci receptorů T buňky, B buňky nebo Fc receptorů. Derivát nejvýhodněji vykazuje 90 %, velmi výhodně 70 % a výhodně 40 % aktivity divokého typu receptorové chiméry. Aktivita funkčního chirálního receptorového derivátu zahrnuje specifickou vazbu (pomocí extracelulámí CD4 části) k HIV infikované buňce a následnou destrukci této buňky; mimo toho chimérický receptor nezpůsobuje citlivost buněk nesoucích receptor k HIV infekci. Aktivita chimérického receptorů může být testována jakoukoliv z metodik popsaných výše.

DNA sekvence kódující CD4 receptorovou chiméru předkládaného vynálezu, nebo její funkční deriváty, může být rekombinováno s vektorovou DNA v souladu s konvenčními postupy, zahrnujícími využití typů konců nebo přečnívajících konců pro ligaci, digesci restrikčními enzymy pro získání vhodných konců, spojování konců žádoucím způsobem, působení alkalickou fosfatázou pro prevenci nežádoucího spojování a ligaci pomocí vhodných ligáz. Postupy pro takovéto techniky jsou popsány Maniatisem et al., viz výše, a jsou všeobecně známy.

-6CZ 293969 B6

Molekula nukleové kyseliny je označována jako „schopná exprese“ polypeptidu, pokud obsahuje nukleotidové sekvence, které obsahují informaci pro regulaci transkripce a translace a tyto sekvence jsou „operativně připojeny“ k nukleotidové sekvenci kódující polypeptid. Operativní spojení je takové spojení, při kterém jsou regulační DNA sekvence a DNA sekvence určené k expresi, spojeny způsobem, který povoluje genovou expresi. Přesná povaha regulačních oblastí potřebných pro expresi se může lišit v závislosti na typu organismu, ale obecně by tyto oblasti měly obsahovat region promotoru, který u prokaryot obsahuje promotor (který zahrnuje transkripci RNA) a dále sekvenci DNA, které budou, po přepisu do RNA, iniciovat syntézu proteinů. Takovéto oblasti budou normálně obsahovat ty 5' nekódující sekvence, které jsou zapojeny do iniciace transkripce a translace, jako je TATA box, sekvence čepičky (cap), CAAT sekvence a podobně.

Pokud je to vhodné, výše popsanými metodami je možné získat 3' nekódující oblast u genové sekvence, která kóduje protein. Tato oblast může být zachována pro své regulační sekvence terminace transkripce, jako jsou terminace a polyadenylace. Tak může být při zachování 3' oblasti přirozeně přiléhající k sekvenci DNA, která kóduje protein zajištěn signál pro terminaci transkripce. V případech, kdy v hostitelské buňce nejsou signály pro terminaci transkripce dostatečně funkční, může být tato oblast nahrazena jiným funkčním 3' úsekem. Dvě sekvence DNA (jako jsou sekvence promotorové oblasti a sekvence kódující chiméru CD4 receptoru) jsou považovány za operativně spojené, pokud toto spojení dvou sekvencí nevede k: (1) vnesení mutace čtecího rámce, (2) interferenci se schopností sekvence promotorové oblasti řídit transkripci sekvence genu receptorové chiméry, (3) interferenci se schopností sekvence genu receptorové chiméry být transkribována sekvencí promotorové oblasti. Promotorová oblast by byla operativně spojena se sekvencí DNA, pokud by promotor byl schopný zajistit transkripci dané sekvence. Pro expresi proteinu jsou tedy nezbytné transkripční a translační signály rozeznávané daným hostitelským organismem.

Předkládaný vynález obsahuje expresi CD4 receptorového chimérického proteinu (nebo jeho funkčního derivátu) jak v prokaryotických, tak i v eukaryotických buňkách, třebaže je exprese preferována v eukaryotických buňkách (a to zejména v lidských lymfocytech).

Protilátky pro předkládaný vynález mohou být připraveny jakoukoli z celé řady metod. Pro příklad: buňky exprimující CD4 receptorový chimérický protein nebo jeho funkční derivát, mohou být vneseny do zvířete s cílem indukovat produkci séra obsahujícího polyklonální protilátky schopné vázat chiméru.

Z protilátek jsou v předkládaném vynálezu preferovány monoklonální protilátky. Takové monoklonální protilátky mohou být připraveny pomocí technologie hybridomů (Kohler et al., Nátuře 256:495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511,1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-cell hydridomas, Elsevier, N.Y., str. 563-684, 1981). Tyto metody všeobecně zahrnují imunizaci zvířete antigenem CD4 receptorové chiméry. Z takového zvířete jsou pak extrahovány splenocyty a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou linií. V souvislosti s předkládaným vynálezem může být použita jakákoliv vhodná myelomová buněčná linie. Po fúzi jsou vzniklé hybridomové buňky selektivně uchovávány vHAT médiu a potom klonovány konečným ředěním popsaným Wandsem et al., (Gastroenterology 80:225-232, 1981). Hybridomové buňky získané pomocí takovéto selekce jsou dále testovány s cílem identifikovat klony sekretující protilátky schopné vázat chiméru.

V předkládaném vynálezu mohou být dále použity i polyklonální protilátky, a to zejména oblastně specifické polyklonální protilátky.

Protilátky proti CD4 receptorové chiméře podle předkládaného vynálezu mohou být použity k monitorování množství chimérického receptoru (nebo množství buněk nesoucích chimérický receptor) u pacientů. Takovéto protilátky jsou dobře využitelné pro standardní známé imunodiagnostické analýzy, zahrnující imunometrické nebo „sendvičové“ analýzy jako je sendvič,

-7CZ 293969 B6 reverzní sendvič a simultánní sendvičová analýza. Tyto protilátky mohou být použity v jakémkoliv množství kombinací a zajišťují imunoanalýzy o přijatelné specificitě, citlivosti a přesnosti.

Principy imunologie jsou popsány v standardních pracích jako je: Roitt, Essential Immunology, 5 6. vydání, Blackwell, Scientific Publicatons, Oxford, 1989; Kimball, Introduction tolmmunology, 2. vydání, Macmillan Publishing Co., New York, 1986; Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., London, 1985; Cambell, „Monoclonal Antibody technology“, v Burdon et al., Laboratory technique in Biochemistiy and Molecular Biology díl 13, Elsevier, Amsterodam, 1984; Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley and 10 Sons, New York, 1982; Kennet et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In

Biological Analyses, Plenům Press, New York, 1980.

„Detekcí“ je nazýváno stanovení přítomnosti nebo absence dané látky nebo stanovení množství látky. Tento termín se tedy vztahuje k materiálům, prostředkům a metodám předkládaného 15 vynálezu, které slouží určení kvality a kvantity.

Protilátky a značně přečištěné antigeny předkládaného vynálezu se ideálně hodí k přípravě kitu. Takový kit může být rozdělen na kompartmenty, které oddělují jednotlivé ampulky, tuby, a podobně a být tvořen více kontejnery, které obsahují oddělené elementy nezbytné pro analýzy. 20 Analýz, které mohou být začleněny v kitu, může být mnoho typů, a zahrnují např. kompetitivní a nekompetitivní analýzy. Typické příklady analýz, při nichž lze využít protilátky předkládaného vynálezu, jsou radioimunoanalýza (RIA), enzymová imunoanalýza (EIA), enzymově vázaná imunoadsorpční analýza (ELISA), a imunometrické nebo sendvičové imunoanalýzy.

Termín „imunometrická analýza“ nebo „sendvičová analýza“ označuje simultánní sendvičové analýzy - sendvič a reverzní sendvič. Tyto termíny jsou odborníkům dobře známy. Odborníci rovněž ocení, že protilátky z tohoto vynálezu budou použitelné i v jiných variantách a formách analýz, které jsou buď už v současnosti známé, nebo budou vyvinuty v budoucnu. Předkládá se, že budou zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Jako protilátka, která „specificky rozeznává a váže“, je označována taková protilátka, která rozpoznává a váže chimérický receptorový polypeptid, ale nerozpoznává ani neváže v podstatnější míře jiné nepříbuzné molekuly ve vzorku, např. biologickém.

Jako „terapeutická buňka“ je označována buňka, která byla transformována CD4 receptorovou chimérou vynálezu, tak že je schopna rozpoznat a zničit HIV infikovanou buňku; tyto terapeutické buňky jsou zejména buňky hematopoetického systému.

Jako „extracelulámí“ je označována molekula, jejíž alespoň část vyčnívá na buněčný povrch. 40 Jako „intracelulámí“ je označována molekula, jejíž alespoň Část je v cytoplazmě terapeutické buňky. Jako „transmembránové“ je označována molekula, jejíž alespoň část je součástí plazmatické membrány. Jako „extracelulámí část“, a „intracelulámí část“ a „transmembránové část“ je zde označována např. volná sekvence aminokyselin, který zasahuje do určitého kompartmentu buňky. Pod pojmem „oligomerizovat“ je míněno slučování s jinými proteiny za tvorby dimérů, 45 trimérů, tetramérů nebo jiných vyšších oligomérů. Takové oligoméry mohou být homooligomery nebo hetero-oligoméry. Jako „oligomerizující část“ je označována ta část molekuly, která řídí formování komplexu (tzn. oligomérů).

Jako „cytolytická“ je označována schopnost ničit buňky (např. HTV infikované buňky) nebo 50 schopnost ničit infekční agens (např. HIV virus). Jako „virus imunodefícience“ je označován retrovirus, který je (jako divoký typ) schopen infikovat T4 buňky hostitele a vykazovat virovou morfogenezi a morfologii charakteristickou pro podtřídu lentivirů. Toto označení zahrnuje (bez jakýchkoliv omezení) všechny varianty HIV a SIV, jež tvoří HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand a SIVczp.

-8CZ 293969 B6

Jako „nezávislý na hlavním histokompatibilním komplexu (MHC)“ je označován případ, kdy buněčná cytolytická odpověď nevyžaduje přítomnost antigenu II. třídy MHC na povrchu cílových buněk.

Jako „funkční derivát transdukující cytolytický signál“ je označován funkční derivát (byl definován výše), kteiý je schopen disponovat alespoň 40 %, s výhodou 70 %, a nejvýhodněji 90 % biologické aktivity molekuly divokého typu. „Funkční deriváty transdukující cytolytický signál“ může přímo signalizovat terapeutickým buňkám, aby zničily receptorem vázané agens nebo buňky (např. v případě intracelulámí části chimérického receptorů), anebo mohou působit nepřímo přes zahájení oligomerizace proteinů (transdukujících cytolytický signál v terapeutické buňce (jako je tomu např. v případě transmembránové domény). U takových derivátů může být testována účinnost např. s použitím některé z výše uvedených metod.

Jako „funkční derivát vážící obal HIV viru“ je označován funkční derivát (definován výše), který je schopen vázat jakýkoliv obalový protein HIV viru. Funkční deriváty mohou být identifikovány s použitím některé z in vitro analýz popsaných výše.

Terapeutické využití

Transformované buňky předkládaného vynálezu jsou používány pro terapii proti virům imunodeficience. Současné metody vnášení takovýchto transformovaných buněk zahrnují adoptivní imunoterapii nebo terapii přenosu buněk. Tyto metody umožňují návrat transformovaných buněk imunitního systému do krevního řečiště. (Rosenberg, Scientific Američan 62, May 1990; Rosenberg et al.; The New England Joumal of Medicine 323(9):570, 1990).

Farmaceutické složky vynálezu mohou být vnášeny do kteréhokoli živočicha, u kterého je pak možno pozorovat blahodárné účinky složek vynálezu. Na prvním místě mezi takovými živočichy jsou samozřejmě lidé, přestože vynález není v tomto směru limitován.

Detailní popis vynálezu

Nejprve budou popsány obrázky.

Stručný popis obrázků

Obr. IA (Fig Al) předkládá sekvenci aminokyselin (AK) okolo místa fuze mezi CD4 (AK4 zbytky 1—369) a různými receptorovými řetězci. Podtržená sekvence ukazuje pozici AK kódovaných vBamHl místě využitém pro fúzní konstrukci. Začátek transmembránové domény je označen vertikální čárou, η sekvence je identická s ζ sekvencí na N-konci, ale odlišuje se na karboxylovém konci (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3329-3323, 1990).

Obr. IB ukazuje průtokovou cytometrickou analýzu exprese CD4, Οϋ4:ζ, CD4:y a CD4:r| na povrchu CV1 buněk. Buňky byla infikovány virem exprimujícím chiméry CD4 nebo CD16_Pi, inkubovány 9 hodin ve 37 °C a obarveny fykoerytrinem konjugovaným s anti-CD4 Mab Leu3A.

Obr. 2 ukazuje povrchovou expresi CD16™ následující koinfekci samotným CD16_TM (husté tečky), nebo koinfekci s virem exprimujícím CD4:y (přerušovaná čára) nebo Οϋ4:ζ (plná čára). Řídké tečky znázorňují buňky infikované samotným Οϋ4:ζ, obarvené 3G8 (Fleit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:3275-3279, 1982) (anti-CD16 Mab).

Obr. 3 ukazuje povrchovou expresi CD16_TM po konfekci virem exprimujícím CD16tm a následujících ζ chimér: CD4: ζ (silná křivka), CD4: ζΟΙΙΰ (spojitá křivka); CD4: ζ (přerušovaná křivka): CD4: ζΟΙ 1G/D15G (husté tečky); žádná koinfekce (pouze CD16_Tm, řídké tečky). Buňky

-9CZ 293969 B6 byly inkubovány santi-CD16 Mab 3G3 a s kozími protilátkami Fab'₂ k myšímu IgG konjugovanými s fykoerytrinem. Stupeň exprese ζ chimér byl naprosto identický u všech různých analyzovaných mutant a koinfekce buněk viry exprimujícími CD16tm a ζ chiméry nijak neovlivnila povrchovou expresi chimér.

Obr. 4A-D ukazuje zvýšení množství volného intracelulámího vápníku po křížení mutantních ζ chimér u T buněčných linií. Jurkat E6 buňky (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128, 1984), byly infikovány rekombinantním virem vakcínie a analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Uvedené výsledky jsou pro vybranou CD4+ populaci, tzn. že byly analyzovány pouze buňky exprimující relevantní chimérický protein. Poměr fialové a modré Indo-1 fluorescence odráží koncentraci volného vápníku v celkové populaci a procento respondujících buněk odpovídá funkci buněk, které dosáhly předem určeného mezního poměru (určeného tak, že 10 % neošetřených buněk je pozitivních). Obr. 4A a 4B ukazují Jurkat buňky exprimující Οϋ4:ζ (plná čára) nebo Οϋ16:ζ (přerušovaná čára), které byly vystaveny působení anti-CD Mab Leu3a (konjugát s fykoerytrinem), následovaném vazbou skozí protilátkou proti myšímu IgG. Tečkovaná čára ukazuje odpověď neinfíkovaných buněk k anti-CD3 MAb OKT3. Obrázky 4C a 4D ukazují Jurkat buňky exprimující Οϋ4:ζ D15G (plná čára); Οϋ4:ζ Cl 1G/D15G (přerušovaná čára); nebo Οϋ4:ζ Cl 1G (tečky), které byly ošetřeny a analyzovány stejně jako u obr. 4A a 4B.

Obr. 5A-C ukazuje, že receptory CD4^, CD4:r], a CD4:y umožňují cytolytickým T lymfocytům (CTL) zabíjet cílové buňky exprimující HTV-1 gpl20/41. Obr. 5A: plná kolečka zobrazují CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdná kolečka znázorňují TLC exprimující Οϋ4:ζ inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami; plné čtverečky znázorňují neinfíkované CTL infikované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné čtverečky znázorňují neinfíkované CTL inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami. Obr. 5B: plná kolečka znázorňují CTL exprimující CD4:r| inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdná kolečka - CTL exprimující CD4:y inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gp 120/41; otevřené čtverečky - CTL exprimující C11G/D15G dvojitou mutantu CD4^ chiméry inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gpl20/41. Obr. 5C: Průtoková cytometrická analýza exprese CD4 cytolytickými T lymfocyty používanými pro stanovení na obr. 5B. Pro určení poměru cíl/efektor bylo stanoveno procento buněk exprimujících CD4 chiméru odečtením negativní (neinfíkované) populace pomocí superpozice histogramu; pro srovnání byla pro neinfíkované buňky určena libovolná mezní hranice, jejíž sledování ukázalo v podstatě shodnou frakci pozitivních buněk jako odečtení histogramu i pro jiné buněčné populace.

Obr. 6A-B ukazuje specifícitu buněčné lyže řízené pomocí CD4. Obr. 6A: plná kolečka zobrazují CTL exprimující CD4:^ inkubované s HeLa buňkami exprimujícími CD16_Pi; prázdná kolečka CTL exprimující CD4 inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20; plné čtverečky - CTI exprimující Οϋ16:ζ inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné čtverečky CTL exprimující CD16_Pi inkubované sHeLa buňkami exprimujícími gp 120/41. Obr. 6B: plná kolečka - CTL exprimující Οϋ4:ζ inkubované s Ráji (MHC třída II⁺) buňkami; prázdná kolečka - neinfíkované CTL buňky inkubované s RJ2.2.5 (MHC třída II’ Ráji mutanta) buňkami; plné čtverečky - neinfíkované CTL inkubované sRaji (MHC třída II⁺) buňkami; prázdné čtverečky - CTL exprimující Οϋ4:ζ (inkubované s RJ2.2.5 (MHC třída ΙΓ) buňkami. Obvyklé rozmezí je rozšířeno.

Na obr. 7A-B je charakterizován Οϋ16:ζ chimérický receptor. Obr. 7A je schematický diagram Οϋ16:ζ fuzního proteinu. Extracelulámí část fosfatidylinositol-vázané formy monomerického CD16 byla připojena k dimerickému ζ v místě vnější části transmembránové domény. Proteinová sekvence fúzního spojení je uvedena v dolní části obrázku. Obr. 7B ukazuje průtokovou cytometrickou analýzu mobilizace vápníku po vazbě Οϋ16:ζ chiméry v TCR pozitivních nebo TCR negativní buněčné linii. Je znázorněn poměr fialové a modré fluorescence (míra relativní koncentrace vápníkových iontů) mezi buněčnými populacemi v čase 0. Plné čtverečky zobrazují

-10CZ 293969 B6 odpověď Jurkat buněk na anti-CD3 Mab OKT3; plné trojúhelníčky- odpověď Οϋ16:ζ na vazbu anti-CD16 Mab 3G8 v REX33A TCR' mutantě; prázdné čtverečky - odpověď na vazbu Οϋ16:ζ v Jurkant TCR’ mutantní linii JRT3.T3.5; prázdné trojúhelníčky - odpověď na vazbu Οϋ16:ζ v Jurkat buňkách; křížky - odpověď na nechimerický CD 16 v Jurkat buňkách; tečky - odpověď na nechimerický CD 16 v buněčné linii REX33A TCR’.

Obr. 8A-B ukazuje deleční analýzu cytolytického potenciálu. Obr. 8A ukazuje umístění ζ delečních míst. Mutace jsou zde, tak jako kdekoliv jinde, reprezentovány záměnou původního aminokyselinového (AK) zbytku za jiný v téže pozici, tak, že např. D66* označuje nahrazení Asp-66 za terminační kodón. Obr. 8B ukazuje výsledky cytolytické analýzy nedeletovaného Οϋ16:ζ a hlavních ζ delecí. Hybridomové buňky exprimující povrchovou protilátku kCD16 byly označeny ⁵¹Cr a inkubovány se zvyšujícím se počtem lidských cytolytických lymfocytů (CTL) infikovaných vakcíniovými rekombinanty exprimujícími Οϋ16:ζ chiméry. Procento uvolněného ^5ICr je vyneseno jako funkce poměru efektoru (CTL) ku cílovým (target) molekulám (hybridomovým buňkám) (e/t). Plná kolečka zobrazují cytolýzu zprostředkovanou buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ (mf. 18.7); plné čtverečky - cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími Οϋ16:ζ Asp66* (mfi 940.2); prázdné čtverečky - cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími CDló^Glu 60* (mfi 16.0); prázdná kolečka — cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími CD16^Tyr51* (mfi 17.4); plné trojúhelníčky - cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími CD16^Phe34* (mfi 17.8); prázdné trojúhelníčky - cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujícími nechimerický CD 16 (mfi 591). Ačkoliv v tomto případě nesouhlasila exprese CD16^ Asp66* s expresí ostatních fúzních proteinů, cytolýza buněk exprimujících Οϋ16:ζ v ekvivalentním množství vykazovala ve stejném experimentu identické výsledky jako u buněk exprimujících Οϋ16:ζ Asp66.

Obr. 9A-D ukazuje, že eliminace potenciálu pro transmembránové interakce odhalí krátký ζ segment schopný zprostředkování cytolýzy. Na obr. 9A je schematický diagram monomerických dvousložkových a troj složkových chimér. Nahoře je konstrukce Οϋ16:ζ ukončený u AK zbytku 65 a postrádající transmembránový Cys a Asp. Dole jsou konstrukty CD16:CD5^ aCD16:CD7^ a příslušné kontroly. Peptidové sekvence intracelulámí části jsou uvedeny níže. Obr. 9B ukazuje cytolytickou aktivitu delečních mutant monomerické chiméry. Cytolytická aktivita buněk exprimujících Οϋ16:ζ (plná kolečka; mfi 495) byla srovnávána s aktivitou buněk exprimujících CD16^Asp66* (plné čtverečky; mfi 527) nebo mutant CDló^Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66* (prázdné čtverečky; mfi 338) a CDló^Cysl lGly/Aspl5Gly/Glu60* (plné trojúhelníčky; mfi 259). Obr. 9C ukazuje cytolytickou aktivitu zprostředkovanou troj složkovými fúzními proteiny. Plné trojúhelníčky - CD16^Asp66*; prázdné čtverečky - Οϋ16:5:ζ (48-65); plné čtverečky - Οϋ16:7:ζ (48-65); prázdné trojúhelníčky - Οϋ16:7:ζ (48-59); prázdná kolečka - CD16:5; plná kolečka - CD16:7. Obr. 9D ukazuje vápníkovou mobilizaci mutantními a troj složkovými chimérami v TCT negativní Jurkat JRT3.T3.R mutantní buněčné linii. Prázdná kolečka - odpověď buněk exprimujících dimerický CD16^Asp66*; plné čtverečky - odpověď buněk exprimujících CD16^CysllGly/Asp66*; prázdné čtverečky - odpověď buněk exprimujících CDló^Cysl lGly/Asp/15GlyPGlu60*; plné trojúhelníčky - odpověď buněk exprimujících CD 16:7:ζ(48—65); a prázdné trojúhelníčky - odpověď buněk exprimujících Οϋ16:ζ(48-59).

Obr. 10A-F ukazuje příspěvek jednotlivých aminokyselin k aktivitě 18AK zbytků dlouhého motivu transdukce cytolytického signálu. Obrázky 10A a 10B ukazují cytolytickou aktivitu a obr. 10C ukazuje mobilizaci vápníkových iontů zprostředkovanou chimérami nesoucími bodové mutace blízko tyrosinu (Y62) na karboxylovém konci. Obr. 10A a 10B reprezentují data získaná sledováním buněk exprimujících nízké, res. vysoké množství fúzních proteinů Οϋ16:ζ. Pro mobilizaci vápníku i pro cytolytické analýzy jsou užity shodné symboly, které jsou uvedeny napravo vpísmenném kódu. Plná kolečka - buňky exprimující Οϋ16:ζ (mfi v A, 21; B, 376); plné čtverečky - buňky exprimující Οϋ16:7:ζ (48-65) (mfi A, 31; B, 82); prázdné čtverečky CD16:7^(48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); křížky - CD16:7^(48-65)Asp63Asn (mfi A, 30;

-11 CZ 293969 B6

B, 74); plné trojúhelníčky - Οϋ16:7:ζ (48-65) Tyr62Phe (mfí A, 24; B, 88); prázdná kolečka CD16:7^(48-65)Glu61Gln (mfí A, 20; B, 62); prázdné trojúhelníčky - Οϋ16:7:ζ(48-65) Tyr62Ser (mfí B, 64). Obr. 10D a 10E ukazují mobilizaci vápníkových iontů chimérami nesoucími bodové mutace blízko tyrosinu (Y51) na amino konci. Pro mobilizaci vápníku i pro 5 cytolytické analýzy jsou užity shodné symboly; jsou uvedeny napravo. Plná kolečka - buňky exprimující Οϋ16:ζ (mfí vD, 21.2; vE, 672); plné čtverečky - buňky exprimující Οϋ16:7:ζ (48-65) (mfí D, 31.3; E, 179); plné trojúhelníčky - CD16:7^ (48-65) Asn48Ser (mfí D, 22.4; E, 229); prázdné s čtverečky - Οϋ16:7:ζ (48-65) Leu50Ser (mfí D, 25.0; E, 142), prázdné trojúhelníčky - Οϋ16:7:ζ (48-65)Tyr51Phe (mfí D, 32.3; E, 294).

io

Obr. 11A-B ukazuje řazení vnitřních opakování ζ a jejich schopnost podporovat cytolýzu. Obr. 11A je schematickým diagramem chimér tvořených rozdělením intracelulámí domény ζ na třetiny a jejich připojení k transmembránové doméně chiméry CD16:7. Sekvence intracelulámích domén jsou uvedeny ve spodní části obrázku, sdílené AK zbytky jsou orámovány, podobné AK 15 zbytky jsou označeny hvězdičkou. Obr. 11B ukazuje cytolytický potenciál tří ζ subdomén. Plná kolečka - buňky exprimují Οϋ16:ζ (mfí 476); plné čtverečky - Οϋ16:7:ζ (33-65) (mfí 68); prázdné čtverečky - Οϋ16:7:ζ (71-104) (mfí 114); plné trojúhelníčky - Οϋ16:7:ζ (104-138) (mfí 104).

Obr. 12 je schematickým diagramem chimér CD16:FcRyII.

Obr. 13A-B ukazuje vápníkovou mobilizaci po vazbě chimér CD4:FcRyII a CD16:FcRyII. Obr. 13A ukazuje poměr fialové a modré fluorescence, emitované buňkami označenými fluoroforem Indo-1 senzitivním k vápníku, jako funkci času po vazbě extracelulámí domény CD 16 25 s protilátkami. Obr. 13B ukazuje podobnou analýzu zvyšující se poměru fialové ku modré fluorescence buněk nesoucích chiméry CD4:FcRyII, po vazbě s protilátkami.

Obr. 14A-B ukazuje cytolytickou analýzu chimér CD4:FcRyII a CD16:FcRyII. Obr. 14A ukazuje procento ⁵¹Cr uvolněného zanti-CD16 hybridomových (cílových) buněk po vystavení buněk 30 zvyšujícímu se počtu cytotoxických T-lymfocytů exprimujících chiméry CD4:FcRyII (efektoové buňky). Obr. 14B ukazuje podobné analýzy cytotoxicity zprostředkované chimérami CD4:FcRyII proti cílovým buňkám exprimujícím HIV obalové glykoproteiny.

Obr. 15A-E ukazuje identifikaci AK zbytků v části A FcRylI důležitých pro cytolýzu. Na 35 obr. 15A je schematický diagram delečních konstruktů. Obr. 15B a 15C ukazují vápníkovou mobilizaci a cytolýzy způsobenou mutantami, které mají delece na karboxylovém konci CD16:FcRyII A. Obr. 15D a 15E ukazují vápníkovou mobilizaci a cytolýzu troj složkovými chiméami nesoucími zkrácený amino konec intracelulámí části CD16:FcRyII A.

Obr. 16 (sekv. č. 24) ukazuje aminokyselinovou sekvenci receptorového proteinu CD3 delta; orámované sekvence představují preferovanou část transdukující cytolytický signál.

Obr. 17 (sekv. č. 25) ukazuje aminokyselinovou sekvenci receptorového proteinu T3 gama; orámované sekvence představují preferovanou část transfukující cytolytický signál.

Obr. 18 (sekv. č. 26) ukazuje aminokyselinovou sekvenci receptorového proteinu mbl; orámované sekvence představují preferovanou část transfukující cytolytický signál.

Obr. 19 (sekv. č. 27) ukazuje aminokyselinovou sekvenci receptorového proteinu B29; orámo50 váné sekvence představují preferovanou část transdukující cytolytický signál.

Obr. 20A-E ukazuje schematický diagram CD4 chimér. Molekula „A“ je CD4(Dl-D4):Ig:CD7; molekula „B“ je CD4(D1, D2):IG:CD7; molekula „C“ je CD4(Dl-D4):Ig:CD7:C; molekula „D“

-12CZ 293969 B6 je CD4(D1, D2):IG:CD7^; a molekula „E“ je CD4^. Extracelulámí část lidské CD4 molekuly odpovídají aminokyselinám 1-394 prekurzoru byla připojena v BamHI místě k patentové oblasti, CH1 a CH2 doménám lidského IgGl tak, jak bylo popsáno dříve (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347, 1990) kromě toho, že byla použita cDNA verze sekvence lidského Ig, aby byla umožněna exprese v rekombinantách vakcinia viru. Vložením BamHI adaptoru do unikátního Nhel místa (odpovídajícímu AK200) v cDNA prekurzoru CD4 byla vytvořena dvou-doménová verze CD4 chimér. Za AK zbytky 146-203 zCD7 následují sekvence vazby k membráně skládající se z 22 zbytků z prvního exonu lidského membránově vázaného IgGl. Aminokyseliny 55 až 163 sloužily jako spouštěcí motiv čtyřsložkových konstruktů (C a D). V čtyřsložkových konstruktech, obsahujících ζ řetězec byla dokumentována intracelulámí exprese ζ pomocí komerčně dostupných protilátek proti intracelulámí doméně (Coulter).

Obr. 21 ukazuje cytolýzu cílových buněk exprimujících HTV-1 obalový glykoprotein zprostředkovanou cytolytickým klonem T buněk - WH3 - exprimujícím jako efektorové molekuly různé chiméry odvozené do CD4. Pro cytotoxické analýzy byly lidské buňky buněčné linie CD8⁺ CD4“ HLA B44 T, WH3, pěstovány v IMDM obohaceném 10% lidským sérem, jak už bylo popsáno výše. Buňky byly stimulovány gama ozářenými (3000 rad) jednojademými buňkami nesoucími B44 a fytohemaglutininem (PHA) o onc. 1 pg/ml. Po jednom dni stimulace byl PHA naředěn na 0,5 pg/ml přidáním čerstvého média. Po třech dnech pak bylo médium vyměněno úplně. Buňky byly pěstovány 10 dní a následně použity pro analýzu cytotoxicity. Buňky byly infikovány vhodným rekombinantním vakcinia virem, jak bylo popsáno výše pro vPE16. Infekce probíhala po dobu 3-4 hodin v kompletním médiu; pak byly buňky zcentrifugovány a resuspendovány do hustoty 1 x 10⁷/ml. Do každé jamky mikrotitračních destičky sU dnem obsahující 100 μΐ kompletního média, bylo vneseno 100 μΐ buněčné kultury a ředěno ve dvou následných krocích. Dvě jamky od každého vzorku neobsahovaly lymfocyty, aby bylo možno měřit spontánní uvolňování chrómu a celkový obsah chrómu. Cílové buňky, HeLa sublinie S3 (HeLa-S3, ATCC) byly infikovány vPE16 v 10 cm miskách. Pomocí PBS a lmM EDTA bylo odděleno od podkladu 10⁶ buněk, centrifugováno a resuspendováno ve 100 μΐ ⁵¹Cr chromanu sodného (sodium chromáte, 1 mCi/ml v PBS) po dobu 1 hodiny ve 37 °C a potom třikrát promyto PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ značených cílových buněk. Mikrotitrační destička byla třepána 1 min. při 750 x g a inkubována 4 hodiny ve 37 °C. Po skončení inkubace byly buňky resuspendovány jemným pipetováním, byl odebrán vzorek pro stanovení celkového inkorporovaného počtu, a destička byla stočena 1 min. při 750 x g. Ze supematantů byly odebrány vzorky (100 μΐ) supematantů a odečteny na scintilátoru s gama paprsky. Poměr mezi efektorem a cílem byl upraven podle počtu infikovaných buněk, který byl stanoven pomocí průtokové cytometrie.

Obr. 22 ukazuje replikaci HTV-1 v transfektorových buněčných liniích. Buněčné linie stabilně exprimující divoký typ CD4 a různé rekombinantní chiméry byly připraveny jako sublinie lidské embryonální ledvinové buněčné linie 293. Byl připraven zásobní virový roztok HIV-1 IIIB izolátu s titrem přibližně 10⁶ infekčních partikulí/ml (měřeno konečnou ředící řadou s použitím lidské T buněčné linie C8166 jako indikátoru. Infekce byly prováděny při přibližné vlhkosti (MOI) 1 po dobu 8 až 12 hodin ve 37 °C. Následující den byly buňky třikrát promyty PBS, trypsinizovány, převedeny na nosné misky a supematant z kultuiy byl použit pro určení p24 titru (byl označen den 0). V intervalech 3 až 4 dní pak byl odebírán supematant a používán pro analýz p24. Buňkám bylo dodáno čerstvé médium obsahující hygromycin B v koncentraci 100pg/ml. Analýzy supematantů z kultury byly prováděny s použitím komerčního kitu pro HIV-1 p24 antigenovou analýzu založenou na metodě ELISA (ELISA-based HIV1 p24 antigen assay, Coulter) podle pokynů dodaných výrobcem. Byly vyhodnoceny výsledky dvou nezávislých pokusů obdobného trvání.

Obr. 23 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci D1-D4 domén CD4 (CD4 Bam).

- 13 CZ 293969 B6

Obr. 24 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci D1-D2 domén CD4 (CD4Nhe).

Obr. 25 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci pantové domény, CH2 a CH3 domén lidského IgGl (Igh 23 Bam).

Obr. 26 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci transmembránové domény CD7 (TM7 Bam Mlu).

Obr. 27 ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a aminokyselinovou sekvenci intracelulámí domény zeta (Zeta Mlu Not).

Obr. 28 ukazuje DNA sekvenci a primární aminokyselinovou sekvenci syntetického alfa helixu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Konstrukce lidských IgGl^ receptorových chimér

Sekvence těžkého řetězce lidského IgGl byly připraveny spojením sekvencí C_H3 domény k fragmentu cDNA pocházejícímu z 3' konce transmembránové formy mRNA protilátky. Fragment 3' konce byl získán pomocí polymerázové řetězcové reakce (polymerace chain reaction=PCR) za použití cDNA knihovny pocházející ztonsil jako substrátu a oligonukleotidů následujících sekvencí:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekv. č. 7) a CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (sekv. č. 8).

odpovídajících 5' resp. 3' koncům požadovaného fragmentu DNA. Oligonukleotid (dále jen oligo) k 5' konci je komplementární k místu v C_H1 doméně lidského IgGl a 3' oligo je komplementární k místu 5' sekvence kódující intermembránovou doménu. Produkt PCR byl způsobem enzymy BstXi a BamHI a ligován mezi BstXI a BamHI místa semisentitického genu pro protilátku IgGl obsahujícího variabilní a konstantní regiony. Po inzerci fragmentu mezi BstXi BamHI byla amplifíkovaná část konstruktu nahrazena až kSmal míst vC_H3 výměnou restrikčních fragmentů, tak, že produktem PCR reakce byla jednom část mezi Smál místem a 3' oligem. Pro vytvoření lidského IgGl^ chimérického receptoru byl gen těžkého řetězce končící v BamHI místě připojen k BamHI místu ζ chiméry popsané níže, tak, že protilátková sekvence vytvořila extracelulámí část. Průtoková cytometrie COS buněk transfektovaných plazmidem nesoucím tuto chiméru prokázala vysokou hladinu exprese protilátkových determinant, pokud byly buňky současně kontransfektovány expresním plazmidem kódujícím cDNA lehkého řetězce; pokud chyběl expresní plazmid nesoucí lehký řetězec, exprese protilátkových determinant byla jen slabá. Stejným postupem lze za použití standardních metod molekulární biologie získat podobné chiméry - jako např. lidský IgG fúzovaný k η nebo γ (viz níže), nebo jakoukoli signál-přenášející část proteinů T buněčného receptoru nebo Fc receptoru. Pro vytvoření jedné transkripční jednotky, která by dovolovala expresi lehkého i těžkého řetězce pod jedním promotorem, byl ze sekvencí těžkého a lehkého řetězce a netranslatované 5' části mRNA kódující 78kDa glukózou regulovaný protein (jinak známý jako grp 78 či BiP) vytvořen plazmid kódující bicistronní mRNA. Sekvence grp78 byly získány pomocí PCR lidské genomové DNA s použitím primerů následujících sekvencí:

-14CZ 293969 B6

CGC GGG CGC CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAG (Sekvence č. 9) a

CGC GTT GAC GAGA CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (Sekvence č. 10) na 5' resp. 3' koncích. PCR s těmito oligonukleotidy byl prováděna za přítomnosti 10% dimetyl sulfoxidu. Fragment získaný pomocí PCR byl štěpen Notl a HincII a vložen mezi Notl a Hpal místa „po proudu“ (downstream) od sekvencí kódujících lidský IgGl. Sekvence kódující cDNA lehkého řetězce kappa lidského IgG byly dále vloženy „po proudu“ do vedoucí sekvence gpr78 za použití HincII místa a dalšího místa ve vektoru. Těmito manipulacemi byl vytvořen expresní plazmid skládající se z semisyntetického genu pro těžký řetězec, následovaného vedoucí sekvencí gpr78, následovanou sekvencemi cDNA pro lehlý řetězec kappa, následovanými polyadenylačním signálem pocházejícím z fragmentu DNA SV40. Po transfekci COS buněk expresním plazmidem byla zjištěna mnohem vyšší exprese determinant těžkého řetězce, ve srovnání s případem, kdy byly buňky transfektovány plazmidem kódujícím pouze determinanty těžkého řetězce.

Pro vytvoření bicistronního genu obsahujícího těžký řetězec/receptorovou chiméru a lehký řetězec je možné nahradit „upstream“ sekvence těžkého řetězce jakýmkoliv chimérickým genem kódujícím těžký řetězec/receptor.

Příklad II

Konstrukce CD4 receptorových chimér

Lidské ζ (Weissman et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:9705-9713, 1988) a y (Kunster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452, 1990b) cDNA byly izolovány polymerázovou řetězcovou reakcí z knihoven připravených z nádorové buněčné linie HPB-ALL (Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577, 1987b) a z lidských NK buněk, zatímco η cDNA (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:3319-3323, 1990) byla izolována z myší thymocytové knihovny, ζ, η a γ cDNA byly připojeny k extracelulámí doméně vytvořené formy CD4 disponující GamHl místem „upstream“ od intermembránové domény (Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:8573-8577, 1987b; Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol, 9:347-353, 1990), která byla připojena k BamHI místu, přirozeně přítomném v ζ a η cDNA, umístěném podobně „upstream“ os intermembránové domény (sekv. č. 1, 3, 4 a 6). Pro vytvoření fúzního proteinu s y bylo do sekvence vneseno BamHI místo v přibližně stejné oblasti (Obr. 1; Sekv. č. 2 a 5). Produkty genové fuze byly vneseny do expresního plazmidu vakcinia viru nesoucího jako selekční markér gpt gen z E. coli; a začleněny do genomu WR kmene vakcinie homologní rekombinancí a dále selekcí na růst v kyselině mykofenolové (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854, 1988; Boyle et al., Gene 65: 123-128, 1988). Analýzy pomocí průtokové cytometrie ukázaly, že rekombinanty vakcinie směřující nadbytečnou produkci fúzních proteinů Οϋ4:ζ a CD4:y na buněčný povrch, zatímco exprese Οϋ4:η byla podstatně nižší (Obr. 1B). Poslední výsledky souhlasí s nedávno uvedenou zprávou, v níž se uvádí, že transfekce expresního plazmidu s η cDNA do hlodavčích hybridomových buněk dávala podstatně nižší expresi než transfekce srovnatelného expresního plazmidu s ζ (Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253, 1990). Imunoprecipitace buněk infikovaných vakciniovými rekombinanty odhalila, že fúzní proteiny tvoří kovalentní diméry nepodobné přirozeně se vyskytujícímu CD4 antigenu. Molekulové hmotnosti monomerických fúzních proteinů Οϋ4:ζ a CD4:y a přirozeně se vyskytujícího CD4 byly stanoveny na 63, 55, resp. 53 kD. Vyšší hmotnosti fúzních proteinů přibližně odpovídají prodloužené délce intracelulámí části, která je u CD4^ delší o 75 molekulových zbytků a u CD4:y o 5 zbytků oproti přirozenému CD4.

-15CZ 293969 B6

Příklad III

CD4 chiméry mohou asociovat s jinými receptorovými řetězci

Exprese makrofágové/NK buněčné formy lidského FcyRIII (CD 16™) na buněčném povrchu transfektovaných buněk je usnadněna kontransfekcí hlodavčím (Kurosaki et al., Nátuře 342:805807, 1989) nebo lidským (Hibbs et al., Science 246:1608-1611, 1989) γ, stejně jako lidským ζ (Lanier at al., Nátuře 342:803-805,1989).

V souhlasu s těmito pracemi, exprese chimér také umožnila povrchovou expresi CD 16™, pokud byly do cílových buněk vneseny kontransfekcí nebo koinfekcí s rekombinantními viry vakcínie (obr. 2). Povrchová exprese CD16™ byla ve sledovaných buněčných liniích zřetelně více podporována ζ než γ (obr. 2), zatímco přirozený CD4 povrchovou expresi CD 16™ nezvýšil vůbec.

Příklad IV

Asp ζ mutanty nekoasociují s Fc receptorem

Za účelem vytvoření chimér, které by neasociovaly s existujícím antigenem nebo Fc receptory, byly zkonstruovány mutantní fúzní proteiny, které postrádají buď intramembránový Asp, nebo intramembránový Cys zbytek. Průtoková cytometrie ukázala, že intenzita povrchové exprese u odlišných mutantních chimér nebyla výrazně odlišná od exprese pozorované u nemutovaného prekurzoru, a i imunoprecipitačními analýzami bylo potvrzeno, že celkový exprese byla u všech chimér podobná. Jak bylo očekáváno, mutantní chiméry postrádají transmembránový cysteinový zbytek, netvořily disulfidicky vázané diméry. Dvě mutantní chiméry postrádající Asp nebyly schopny podporovat povrchovou expresi CD 16™, zatímco monomerické chiméry postrádající Cys, ale nesoucí Asp, umožňovaly koexpresi CD 16™, ale s nižší účinností než rodičovský dimér (obr. 3).

Příklad V

Mutantní receptory si udržují schopnost iniciovat vápníkovou odpověď

Pro zjištění, zda by vazba fúzních proteinů umožňovala akumulaci volného intracelulámího vápníku podobně jako v případě T buněčného antigenního receptoru, byly buňky lidské leukemické T buněčné linie, Jurkas E6 (ATCC Accessior Number TIB 152, Američan Type Culture collection, Rockville, MD), infikovány vakciniovými rekombinanty, a byla měřena relativní cytoplazmatická koncentrace vápníku po vazbě extracelulámí domény s protilátkami. Byla provedena měření pomocí průtokoví cytometri, při kterých bylo do buněk vneseno barvivo Indo1 citlivé k vápníku (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:33040-3450, 1985; Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961, 1986). Obrázek 4A-D ukazuje výsledky pokusů stokem vápníku u buněk infikovaných Οϋ4:ζ a Asp‘ a Cys“ mutantami ζ.

Vazba chimér opakovatelně zvyšuje hladinu intracelulámího vápníku. CD4:q a CD4:y podobně dovolují akumulaci intracelulámího vápníku v infikovaných buňkách. Jurkat cells exprimují na povrchu jen nízké hladiny CD4, ale vazba přirozeného CD4 v přítomnosti nebo absenci Οϋ16:ζ neovlivňuje intracelulámí hladiny vápníku (Obr. 4A-B).

-16CZ 293969 B6

Příklad VI

Chiméry Όϋ4:ζ, η a γ zprostředkovávají buněčnou lyži cílů exprimujících HTV gp 120/41

Pro určení toho, jestli by chimérické receptory spouštěly cytolytické efektorové programy, byl vytvořen modelový systém cílová molekula: efektor založený na rozpoznání obalového komplexu gp 120/gp41 HIV pomocí CD4. HeLa buňky byly infikovány rekombinantními vakcinami viry exprimujícími gpI20/gp41 (Chakrabarti et al., Nátuře 320:535-537, 1986, Earl et al., J. Virol. 64:2448-2451, 1990) a označeny ⁵¹Cr. Označené buňky byly inkubovány s buňkami z lidské allospecifícké (CD8⁺, CD4') cytotoxické T buněčné linie, které byly infikovány rekombinanty vakcínie exprimujícími chiméry Οϋ4:ζ, CD4:q nebo CD4:y, nebo dvojitě mutantní chiméru Οϋ4:ζ CysllGly:Aspl5Gly. Obr. 5A-C ukazují, že HeLa buňky exprimující gp!20/41 specificky lyžovány cytotoxickými T lymfocyty (CTL) exprimujícími chiméry CD4. Neinfikované HeLa buňky nebyly napadány CTL vyzbrojenými chimérami Οϋ4:ζ, HeLa buňky exprimující gp 120/41 nebyly rozpoznávány neinfikovanými CTL. Pro porovnání účinnosti různých chimér byly poměry efektor: cíl upraveny pro frakci CTL exprimujících chiméry CD4 a pro frakci HeLa buňky exprimujících gpl20/41, a měřeny průtokovou cytometrií. Obr. 5C ukazuje cytometrickou analýzu exprese CD4 CT-lymfocyty používanými v cytolytických experimentech znázorněných na obr. 5A a 5B. Ačkoliv průměrná hustota povrchových Οϋ4:ζ výrazně převyšovala průměrnou hustotu CD4:q, cytolytická účinnost buněk exprimujících jednu nebo druhou z těchto forem byla podobná. Po úpravě pro frakci cílových buněk exprimujících gpl20 bylo prokázáno, že efektivita cytolýzy zprostředkované proteiny Οϋ4:ζ a CD4:r| je srovnatelná s nejlepší účinností uváděnou pro specifické T buněčné receptorové dvojice cíl-efektor (poměr efektor:cíl pro 50% uvolnění T buňkami exprimujícími ΟΏ4:ζ byl 1,9 +- 0,99, n = 10. Fúze CD4:y byla méně účinná, stejně jako fuze Οϋ4:ζ postrádající transmembránové Asp a Cys zbytky. Přesto byla v obou případech pozorována prokazatelná cytolýza (Obr. 5B-C).

Pro vyloučení možnosti, že by infekce vakcinií mohla iniciovat arteficiální rozpoznávání CTL, byly provedeny podobné cytolytické experimenty s cílovými buňkami infikovanými vakciniovými rekombinanty exprimujícími fosfatidylinositolovou vázanou formu CD 16 (CD16_Pi) a označenými ⁵¹Cr; a s CTL infikovanými kontrolními rekombinanty exprimujícími buď CDlópj, nebo Οϋ16:ζ. Obr. 6A ukazuje, že T buňky exprimující chiméry bez CD4 nerozpoznávají přirozené HeLa buňky ani HeLa buňky exprimující gp 120/41, a podobně, že T buňky exprimující chiméry CD4 nerozpoznávají HeLa buňky exprimující jiné vakcinií kódované povrchové proteiny. Kromě toho, CT-lymfocyty exprimující nechimerický CD4, nelyžovaly nijak výrazně HeLa buňky exprimující gp 120/41 (obr. 6A).

Příklad VII

Buňky nesoucí hlavní histokompatibilní komplex (MHC) třídy II nejsou ničeny chimérami

Předpokládá se, že CD4 interaguje s nepolymerickou sekvencí exprimovanou antigenem II. třídy MHC (Gay et al., Nátuře 328:626-629, 1987; Sleckman et al., Nátuře 328:351-352, 1987). Ačkoliv nebyly nikdy zaznamenány interakce mezi CD4 a antigeny Π. třídy při použití čistých proteinů, za určitých podmínek může být dosaženo adheze mezi buňkami exprimujícími CD4 a buňkami exprimujícími molekuly II. třídy (Doyle et al., Nátuře 330:256-259, 1987; Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253, 1990; Lamarre et al., Science 245: 743-746, 1989). Dále bylo zkoumáno, zdaje možné detekovat zabíjení buněk nesoucích molekuly II. třídy. Obr. 6B ukazuje, že neexistuje žádná specifická cytolýza řízená CD4^ zaměřená proti buněčné linii Ráji B, která exprimuje vysoké množství antigenu II. třídy. Ačkoliv byla pozorována mírná cytolýza (asi 5%) mutanty Ráji buněk negativní na molekuly II. třídy, RJ2.2.5, (Accolla, J. Exp. Med. 157:10531058, 1983) vykazovaly podobnou citlivost jako Ráji buňky indukované s neinfikovanými T buňkami.

-17CZ 293969 B6

Příklad VIII

Sekvence nezbytné pro indukci cytolýzy T buněčných antigenem/zeta řetězcem FC receptoru

Ačkoliv chiméiy mezi CD4 a ζ mohou vyzbrojovat cytotoxické T lymfocyty (CTL) pro zabíjení cílových buněk exprimujících HTV gpl20, byly hledány alternativy kCD4 pro jednoznačné porovnání vlastností zeta chimér vnášených do lidských T buněčných linií. Takové linie mohou 10 exprimovat CD4 a ztěžovat tak možnost specificky definovat vztah mezi typem nebo stupněm mobilizace toku vápníku a cytotoxickým potenciálem různých chimér. Aby se tento problém dal obejít, byly vytvořeny chiméry mezi ζ a CD 16, ve kterých byla extracelulámí doména CD 16 připojena k transmembránovým a altracelulámím sekvencím ζ (Obr. 7A). Tento produkt genové fuze byl vnesen do expresního plazmidu vakcinia viru nesoucího gpt gen E. coli jako selektivní 15 markér, a vnesen do genomů WR kmene vakcinie homologní rekombinantní a selekcí na růst na kyselině mykofenolové (Falkner a Moss., J. Virol. 62:1849,1988; Boyle a Coupar, Gene 65:123, 1988).

T buněčné linie byly infikovány vakciniovými rekombinanty a byla měřena relativní koncentrace 20 volných iontů vápníků v cytoplazmě po vazbě extracelulámích domén s protilátkou. Obě měření (spektrofotometrické - celá populace, průtoková cytometrie - jednotlivé buňky) byla prováděna s buňkami označenými barvivém Indol-1 (Giynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440, 1985; Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952, 1986). Obr. 7B ukazuje analýzu dat získaných z buněk Jurkat lidské T buněčné leukemické linie infikovaných vakciniovými rekombinanty exprimu25 jícími fúzní protein Οϋ16:ζ. Vazba chimér reproducibilně zvyšovala hladinu intracelulámího vápníku, zatímco podobně ošetřené buňky exprimující nechimerický CD 16 vykazovaly malý nebo žádný efekt. Pokud byly chiméry expromovány v mutantních buněčných liniích postrádajících antigenní receptor - bud REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138:726, 1987; Sancho et al., J. Biol. Chem 264:20760, 1989), nebo v Jurkat mutantě JRT3.T3.5 (Weiss etal., J. 30 Immunol. 135:123, 1984), byla pozorována silná odpověď k vazbě protilátky CD16. Podobná data byla získána u REX20A (Breitmeyer et al., viz výše, 1987; Blunberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036, 1990) mutantní buněčné linie, a v této laboratoři byla připravena CD3/TÍ negativní mutanta Jurkat buněčné linie. Infekce rekombinantami exprimující CD16: ζ neobnovila odpověď k protilátce CD3, ukazujíc tak, že fúzní protein nepůsobí prostřednictvím obnovení řetězců 35 intracelulámího CD3 komplexu. Pro vyhodnocení schopnosti chimér přesměrovat buněčnou imunitu, byly CTL infikovány vakciniovými rekombinanty exprimujícími chiméry CD16 a použity k specifické lyži hybridomových buněk exprimujících membránově vázané protilátky proti CD16. Tato analýza je nadstavbou analýzy hybridomové toxicity vyvinuté původně a analýzám efektorových mechanismů buněk nesoucích Fc receptory (Graziano aFanger, J. 40 Immunol. 138:945, 1987; Graziano a fanger, J. Immunol. 139:35-36, 1987; Shen et al., Mol.

Immunol. 26:959, Fanger et al., Immunol. Today 10:92, 1989). Obr. 8B ukazuje, že exprese ϋϋΐό.’ζ v cytotoxických T lymfocytech umožňuje vyzbrojeným CTL zabíjet 3G8 (anti-CD16; Fleit et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79:3275, 1982) hybridomové buňky, zatímco CTL exprimující fosfatidylinositolem vázanou formu CD16 jsou inaktivní. CTL vyzbrojené Οϋ16:ζ 45 také nezabíjejí hybridomové buňky exprimující irelevantní protilátky.

Pro identifikací minimálních ζ sekvencí nezbytných pro cytolýzu, byly připraveny sady delečních mutant, ve kterých bylo postupně odstraňováno stále více z karboxylového konce ζ intracelulámí domény (obr. 8A). Většina z intracelulámí domény zety mohla být odstraněna pouze s nepatrným 50 následkem procytolytický potenciál; Chiméra Οϋ16:ζ plné délky byla po stránce účinnosti v podstatě shodná s chimérou deletovanou až ke zbytku 65-CD16^Asp66* (Obr. 8B). Podstatný pokles cytotoxicity byl zaznamenán při deleci ζ ke zbytku 59 (chiméra CD16^Glu60*), a další delece ke zbytku 50 vedla ve znatelně nižší aktivitě. Ovšem kompletní ztráta aktivity nebyla pozorována dokonce ani v případě, kdy byly intracelulámí domény zredukovány na pouhou

-18CZ 293969 B6 transmembránovou kotvu ze tří zbytků (Obr. 8B). Jelikož je ζ disulfidicky vázaný dimér, jedno vysvětlení pro udržování cytolytické aktivity by mohlo být, že endogenní ζ formovala heterodimery s deletovaným chimérickým ζ a tím pádem si obnovovala aktivitu. Pro ověření této teorie byla zaměněny zbytky 11 a 15 (Asp a Gly) v ζ za Gly (Cysl lGly/Aspl5Gly) a poté následovaly imunoprecipitace. Přibližně 2 x l(r CV1 buněk bylo infikováno po dobu jedné hodiny v bezsérovém DME médiu s rekombinantou vakcinie s multiplicitou infekce (moi) nejméně deset. Šest až osm hodin po infekci byly buňky odmyty s misek PBSúlmM EDTA a povrchově označeny 0,2 mCi ¹²⁵I na 2 x 10⁶ buněk za použití laktoperoxidázy a peroxid vodíku podle metody Clarka a Einfíelda (Leucocyte Typing II, 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Označené buňky byly zcentrifugovány a peroxid vodíku podle metody Clarka Einfíelda (Leucocyte typing II, 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Označené buňky byly zcentrifugovány a lysovány v 1% NP—40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH=8,0, 5mM MgCh, 5mM KC1, 0,2M jodoacetamidu a lmM PMSF. Jádra byla odstraněna centrifugací a proteiny CD 16 byly imunoprecipitovány s protilátkou 3G8 (Fleit et al., viz výše, 1982; Medarex) a anti-myší IgG agarózou (Cappel, Durham, NC). Vzorky byly analyzovány pomocí elektroforézy v 8% polyakrylamidovém/SDS gelu za neredukčních podmínek nebo v 10% gelu za redukčních podmínek. Tyto imunoprecipitace potvrdily, že chiméra CD16^CysllGly/Aspl5Gly neasociuje do disulfidicky vázaných dimerických struktur.

Dále byla též testována cytolytická aktivita mutantních receptorů. Mutovaná chiméra deletovaná až ke zbytku 65 (CD16^Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66*) byla při cytolytických analýzách, v závislosti na podmínkách analýzy, 2 až 8 krát méně aktivní než srovnávaná nemutovaná chiméra CD16^Asp66*, která vykazovala většinou aktivitu nerozlišitelnou od Οϋ16:ζ (Obr. 9B). Redukce aktivity mutantních chimér je srovnatelná s redukcí pozorovanou u CD4 chimér s podobnou strukturou (viz výše) a je pravděpodobně přisuzovatelná nižší efektivitě ζ monomérů ve srovnání s diméiy. Oproti tomu, mutovaná chiméra Asp’, Cys' deletovaná ke zbytku 59 nevykazovala žádnou cytolytickou aktivitu, což podporuje hypotézu, že asociace s jinými řetězci, zprostředkovaná transmembránovým Cys a/nebo Asp zbytky, byla příčinou slabého přetrvávání cytolytické aktivity při delecích více koncových aminokyselin než jen ke zbytku 65.

Průtoková cytometrie ukázala, že by deleční mutanty postrádající transmembránový Asp a Cys stále mohly iniciovat zvyšování hladiny volných intracelulárních vápníkových iontů v odpovědi na vazbu protilátky v mateřské Jurkat linii. V případě CD16^CysllGly/Asp/15Gly/Glu60* tyto data demonstrují, že schopnost zprostředkovávat vápníkovou odpověď může být mutačně oddělena od schopnosti podporovat cytolýzu.

Pro definitivní eliminaci možnosti zapojení ζ transmembránových zbytků, byly transmembránové a prvních 17 cytoplazmatických zbytků ζ nahrazeno sekvencemi kódujícím intermembránovou doménu a prvních 14 nebo prvních 17 cytoplazmatických zbytků antigenů CD5 nebo resp. CD7 (obr. 9A). Výsledné trojsložkové fuzní proteiny Οϋ16:5:ζ(48-65) a Οϋ16:7:ζ(48-65) neformují disulfidicky vázané diméry jako to dělají jednodušší diméry Οϋ16:ζ, protože postrádají v transmembránové doméně ζ cysteinový zbytek. Obě trojsložkové chiméry byly schopny mobilizovat vápníkový tok v Jurkat a TCR negativních buněčních liniích (obr. 9D) a zahájit cytolytickou odpověď v CTL (Obr. 9C a nepublikovaná data). Avšak zkrácení ζ části ke zbytku 59 v chiméře CD16:7:ζ(48—65) ruší schopnost trojsložkové fuzní molekuly zahájit vápníkovou odpověď v TCR pozitivních nebo negativních Jurkat buňkách nebo cytolýzy ve zralých CTL (obr. 9C a 9D a nepublikovaná data).

Ke zjištění příspěvku individuálních zbytků v rámci 18 zbytků dlouhého motivu byl připraven znační počet mutant cílenou mutagenezí a byla změřena jejich schopnost zprostředkovávat receptorem řízení nabízení za podmínek nízké (Obr. 10A a 10D) nebo vysoké (Obr. 10B a 10E) exprese chimérického receptorů. Na obr. 10A-F je znázorněno, že zatímco řada relativně konzervativních substitucí (Tzn. záměn kyselých zbytků za jejich příbuzné amidy, nebo tyrosinu za fenylalanin), která zahrnuje zbytky 59 až 63, vede k mírnému snížení cytolytické aktivity,

-19CZ 293969 B6 obecně mutanty ztratily schopnost mobilizovat vápník. Ale všechny tyto zbytky obsahují důležitý submotiv, neboť jejich delece eliminuje cytolytickou aktivitu. Konverze Tyr 62 buď na Phe, nebo Ser eliminuje jak cytolytickou, tak vápníkovou odpověď. Na amino konci 18ti-zbytkového segmentu ruší záměně Tyr 51 za Phe vápníkovou mobilizaci i cytolytickou aktivitu, zatímco substituce Leu za Ser v pozici 50 eliminuje vápníkovou mobilizaci, zato cytolýzu ovlivňuje jen částečně. Bez vazby na určitou hypotézu se zdá, že neschopnost Leu50Ser mutanty mobilizovat vápník v krátkodobých měřeních průtokové cytometrie neodráží plně jeho schopnost zprostředkovávat podstatný nárůst hladiny volného intracelulárního vápníku za delší čas v průběhu cytolytické analýzy. Pro určité cytolytické T buněčné linie byla zjištěna cytolytická aktivita nezávislá na vápníku, a možnost, že podobný fenomenon je v pozadí i zde podstatných výsledků, nebyla vyloučena. Záměna Asn 48 ze Ser v některých experimentech částečně snížila cytotoxicitu, zatímco v jiných měla jen nepatrný efekt.

Pro zjištění potenciální polohy nadbytečných elementů sekvence, byla intracelulámí doména ζ rozdělena na tři segmenty, zbytky 33 až 65, 71 až 104 a 104 až 138. Každý z těchto segmentů byl připojen k chiméře CD16:CD7 pomocí Mlul místa vneseného distálně od základní membránové kotvící sekvence intracelulámí domény CD7 (viz níže, obr. 11 A). Srovnání cytolytické účinnosti těchto tří elementů ukázalo, že byly esenciálně rovnocenné (Obr. 11B). Sekvenční porovnání (Obr. 1 IA) ukazuje, že druhý motiv nese mezi tyrpsiny 11 zbytků, zatímco první a třetí nesou deset.

Ačkoliv proces aktivace T buněk nebyl ještě podrobně vysvětlen, je jasné, že agregace antigenního receptoru nebo receptorových chimér nesoucích intracelulámí sekvence ζ spouští mobilizaci vápníku, uvolnění cytokininů a granulí a objevení buněčných povrchových aktivačních markérů. Aktivní místo ζ - krátká lineární peptidová sekvence, pravděpodobně příliš malá pro vlastní enzymatickou aktivitu, zřejmě interaguje s jedním nebo nanejvýše několika proteiny a zprostředkovává buněčnou aktivaci. Je také jisté, že mobilizace volných vápníkových iontů není sama o sobě dostačující pro aktivaci buňky, jelikož schopnost zprostředkovávat cytolýzu může být mutačně odstraněna od schopnosti zprostředkovávat akumulaci vápníku.

Jak už bylo ukázáno výše, přidání 18 zbytků z intracelulámí domény ζ k transmembránové a intracelulámí doméně dvou nepříbuzných proteinů umožní výsledným chimérám přesměrovat cytolytickou aktivitu proti cílovým buňkám, které se váží k extracelulámí části fůzních proteinů. Ačkoliv chiméry nesoucí 18ti-zbytkový motiv jsou přibližně osm krát méně aktivní než chiméry s plnou délkou, ζ redukovaná aktivita může být přičtena ztrátě transmembránových interakcí, které normálně umožňují divokého typu ζ tvořit disulfídicky vázané diméry. To znamená, že deleční konstrukty ζ, které mají stejný karboxylový konec jako je motiv a postrádají transmembránový Cys a Asp, typicky vykazují lehce nižší aktivitu než chiméry nesoucí pouze 18ti— zbytkový motiv.

Elementy cytolytické kompetence, na které jsme se zaměřili, mají dva tyrosiny a žádné šeřiny ani threoniny, což omezuje možný příspěvek fosforylace k aktivitě. Mutace kteréhokoli z tyrosinů však vede ke ztrátě aktivity, a ačkoliv předběžné pokusy neukázaly podstatnou fosforylaci tyrosinů po vazbě chimérických povrchových antigenů nesoucích 18ti-zbytkový motiv, možná přítomnost takové fosforylace nízké hladiny nemůže být vyloučena. Kromě ztráty dvou tyrosinových zbytků dále oslabují aktivitu - za podmínek nízké koncentrace receptorů - záměny aminokyselin na amino i karboxylovém konci.

Pro vysvětlení účasti různých intracelulámích domén FcRylI na procesu cytolýzy, byly lidské cytotoxické T lymfocyty (CTL) infikovány rekombinanty vakcinie exprimujícími chiméry CD16:FcRyII A, Bl, B2 a C. Infikované buňky byly pak pěstovány s hybridoma buňkami označenými ^5ICR (např. 3G8 10-2 buňky), které exprimují buněčnou povrchovou protilátku kCD16. Při této analýze CTL nesoucí chiméru CD16 zabíjely hybridomové cílové buňky (což vedlo k uvolnění volného ⁵¹Cr), pokud byla extracelulámí doména CD16 v chiméře připojena

-20CZ 293969 B6 k intracelulámímu segmentu schopnému aktivovat lymfocytový efektorový program; tato cytolytická analýza je od detailů popsána níže. Obr. 14A ukazuje, že CTL vyzbrojené

CD16:FcRyIIA a C, ale nikoliv CD16:FcRyII B1 nebo B2, jsou schopné lyžovat cílové buňky exprimující buněčnou povrchovou protilátku anti-CD16.

Pro vyloučení možnosti, že specifická cytolýza by byla nějakým způsobem závislá na interakci s CD 16, byly provedeny cytolytické experimenty, ve kterých byla intracelulámí doména FcRII připojena k extracelulámí doméně CD4. V tomto případě byly jako cílové buňky použity HeLa buňky exprimující obalové proteiny gp 120/41 HIV (tedy HeLa buňky infikované vakciniovým vektorem vPE16 (dostupný vdepositáři National Institute of Allergy and Infection Disease AIDS, Bethesda MD)). Tak jako tomu bylo u CD16 systému, cílové buňky exprimující HIV obalové proteiny byly přístupné k lysi T buňkami exprimujícími chiméru CD4:FcRyII A, ale nikoliv chiméry FcRylI B1 nebo B2 (obr. 14B).

Intracelulámí doména FcRylI A a C nesdílí žádnou značnější sekvenční homologii s žádnými jinými proteiny, dokonce ani se členy široké rodiny FcRy/TCl^. Aby byly definovány sekvenční elementy zodpovědné za indukci cytolýzy, byly připraveny 5' a 3' delece kódujících sekvencí intracelulámí domény (popsané níže a znázorněny na obr. 15A); a byla provedena měření účinnosti mobilizace vápníku a cytolytická měření (podle postupu používaného v této práci). V experimentech, ve kterých byla odstraněna aminokoncová část intracelulámí domény, byla transmembránové doména FcRylI nahrazena transmembránovou doménou nepříbuzného antigenu CD7 za účelem eliminovat možný příspěvek interakcí zprostředkovaných intermembránovou doménou.

Obr. 15B a 15C ukazují, že odstranění 14 aminokyselinových (AK) zbytků z karboxylového konce, včetně tyrosinu 298, má za následek kompletní ztrátu cytolytické kapacity a podstatnou redukci potenciálu pro mobilizaci vápníku. Další delece až k tyrosinu 292 vykazovaly identický fenotyp (Obr. 15B a 15C). Delece od N-konce intracelulámí domény k AK zbytku 268 neměla žádný výrazný vliv na mobilizaci vápníku ani na cytolytický potenciál, zatímco delece ke zbytku 275 značena narušila uvolňování volného vápníku, ale na cytolýzu měla jen nepatrný vliv (Obr. 15D a 15E). Další delece, až kAK zbytku 282, dala vznik fragmentům FcRylI, které postrádaly schopnost mobilizace toku vápníku i spuštění cytolýzy (obr. 15D a 15E). „Aktivní element“ definovaný těmito měřeními je relativně velký (36 aminokyselin) a obsahuje dva tyrosiny oddělené 16 AK zbytky.

Příklad X

Cílená cytolýza lymfocyty nesoucími chimérické CD4 receptory, které nepodporují infekci

Jak již bylo uvedeno výše, lze sestrojit efektorové molekuly, které způsobí, že se cytolytická aktivita stane nezávislou na MHC. Například chiméra složená z extracelulámí domény CD4 fúzovaná k ζ řetězci v lidském klonu CTL - WH3, specificky zabíjí cílové buňky vystavující povrchový obalový glykoprotein gpl20 HTV-1. Jelikož extracelulámí doména CD4 molekuly propůjčuje citlivost v infekci HIV, CTL, přestože vyzbrojené, by se mohly stát cílem pro infekci viru, což by snížilo jejich potenciál (Dalgleish et al., Nátuře 312:767, 1984; Klatzman et al., Nátuře 312:767,1984). Aby se tomuto jevu zabránilo, bylo nutné navrhnout a vytvořit efektorové molekuly založené na CD4, které jsou účinné pro specifické zabíjení HIV infikovaných buněk při buněčně zprostředkovaném zabíjení, které ale nenesou citlivost k infekci HIV.

Genetickým připojením extracelulámí domény CD4 (Obr. 23) k patentové doméně a druhé a třetí konstantní doméně těžkého řetězce lidského IgGl, byl vytvořen trojsložkový fuzní protein, (Zettlmeissl et al., DNA cell Biol. 9:347, 1990), byly by v tomto případě dále připojeny k části prvního transmembránového exonu lidského membránově vázaného IgGl; dále následovala část

-21 CZ 293969 B6 lidského antigenu CD7 skládající se ze sekvencí mezi samotnou doménou podobnou Ig a stop sekvencí následující transmembránovou doménu (Aruffo a Seed, EMBO J. 6:3313, 1987), (Obr. 26). Primární aminokyselinová sekvence extracelulámí části CD7 segmentu sestávala z oblasti bohaté na prolin tvořící stopkovou strukturu, přemísťující doménu podobnou Ig pryč od buněčného povrchu (Aruffo a Seed, viz výše, 1987) (obr. 26). Byly připraveny rekombinantní viry vakcínie exprimující tyto a podobné chiméry, které jsou zde popisovány. Rekombinantní viry byly vytvářeny homologní rekombinancí vCV-1 buňkách. Plaky byly nejméně dvakrát vizualizovány pomocí OTK4 nebo Leu3a, purifíkovány a poté byly připraveny zásobní sady o vysokém titru v CV-1 buňkách.

Trojsložková chiméra (CD4(Dl-D4):Ig:CD7) (obr. 20, molekula „A“) vykazovala schopnost efektivní exprese na povrchu buněk a bylo testováno, zdaje schopna působit jako HIV receptor v pokusech sledujících formování syncytií na vakciniové bázi (Lifson et al., Nátuře 323:725, 1986; Ashom et al., J. Virol. 64:2149, 1990). HeLa buňky infikované rekombinantním vakcinia virem (vPE16) kódujícím obalový glykoprotein HIV-1 (Earl et al., J. Virol. 64:2448, 1990) byly pěstovány ve společné kultuře sHeLa buňkami infikovanými buď CD4, nebo Οϋ4:ζ, nebo CD4(Dl-D4):Ig:CD7.

Šesticentimetrové můstky s HeLa buňkami (ATCC, Rockville, MD) s 50% nárůstem byly infikovány vbezsérovém médiu po dobu 1 hodiny při přibližné multiplicitě infekce (MOI) 10. Buňky byly inkubovány dalších 5 až 6 hodin v kompletním médiu a potom smyty slaným fosfátovým pufrem (PBS) obsahujícím lmM EDTA. Buňky exprimující Η IV obal a CD4 byly smíchány v poměru 1:1, a vysety na šesticentimetrové misky s kompletním médiem. Vznik syncytia byl vyhodnocován po 6 až 8 hodinách společné kultivace a misky byly fotografovány.

Společná kultivace CD4 a v PE16 vedla k vytvoření detekovatelných multijademích gigantických buněk. Chiméra sestávající z extracelulámí domény CD4 fúzované k ζ řetězci TCR (obr. 27) (ϋϋ4:ζ) byla schopná zprostředkovávat formování syncytia, zatímco buňky exprimující CD4(Dl-D4):Ig:CD7 nevykazovaly žádné známky buněčné fůze. Dále jsme testovali konstrukt exprimující pouze první a druhou doménu CD4 (Obr. 24), CD4(D1, D2):Ig:CD7 (obr. 20, molekula „B“), jelikož při jiném experimentu bylo prokázáno, že dvě domény na aminokonci CD4 jsou nezbytné pro citlivost k infekci HTV (Landau et al., Nátuře 334:159, 19888). Také tato molekula se ukázala být neschopnou tvorby syncytií. Vazebné studie s gpl20 značeným rozpustným ^,25I ukázaly, že jak CD4(Dl-D4):Ig:CD7, tak i CD4(Dl,D2):Ig:CD7, vykazují specifickou afinitu k pgl20.

Dále bylo testováno, zda jsou chimérické molekuly, které nepodléhaly tvorbě syncytií, schopny přesměrovat buněčné zabíjení, pokud jsou vybaveny spouštěcí skupinou, která je zde popsána. Fúzovali jsme intracelulámí doménu ζ (obr. 27) ke 3' konci CD4(Dl-D4):Ig:CD7 aCD4(Dl,D2):Ig:CD7 a připravili korespondující vakcinia viry. Tyto konstrukty, CD4(D1-D4): Ig:CD7^ a CD4(Dl,D2):Ig:CD7:^ (obr. 20, molekuly „C“, „D“), byly exprimovány v lidském klonu CTL WH3 a bylo testováno, zda jsou schopny zaměřovat a zabíjet HeLa buňky exprimující na povrchu obalový glykoprotein HIV (podle metodiky zde popsané). Obr. 21 ukazuje, že intracelulámí doména ζ fúzovaná s CD4(Dl-D4):Ig:CD7 nebo sCD4(Dl,D2): Ig:CD7, může udělovat schopnost zabíjení; konstrukty postrádající ζ řetězce tuto schopnost neměly. Pozitivní kontrola - Οϋ4:ζ - vykazovala lehce efektivnější cytotoxicitu, CD4(D1,D2): Ig:CD7^ o něco nižší cytotoxicitu než CD4(Dl-D4):Ig:CD7 (obr. 1). Je jasné, že obě chiméry - CD4(D1-D4): Ig:CD7^ i CD4(Dl,D2):Ig:CD7^ - měly kapacitu k zprostředkování specifického zabíjení buněk exprimujících na povrchu obalové proteiny HIV. Tyto čtyřsložkové chiméry byly shodně neschopné zprostředkovávat tvorbu syncytia v experimentech na bázi vakcinia. Dále jsme demonstrovali, že jednoduchý ζ motiv typu ukázaného na obr. 11A je dostatečný k udělení cytolytické aktivity chiméře CD4(D1-D4).

-22CZ 293969 B6

Pomocí radioimunoprecipitačních experimentů bylo zjištěno, že fuzní molekuly byly většinou, pokud ne stále, diméry. V těchto experimentech byly užity agarózové kuličky s proteinem A, jejichž pomocí byl imunoprecipitován rozpuštěný extrakt metabolicky značených HeLa buněk infikovaných rekombinantním vakcinia virem exprimujícím chiméry CD4(D1-D4): Ig:CD7^ a CD4(Dl,D2):Ig:CD7^. Imunoprecipitovaný materiál byl frakcinalizován pomocí elektroforézy v polyakiylamidovém gelu za redukčních a neredukčních podmínek. Podle metodiky popsané výše pro vPE16, bylo odpovídajícím zásobním vakcinia virem infikováno přibližně 5 x 10⁶ buněk HeLa-S3. Buňky byly metabolicky označeny 200 pCi/ml Tran³⁵S značením (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) po dobu 6 až 8 hodin v médiu postrádajícím cystein a methionin a pak odmyty pomocí PBS obsahujícího lmM EDTA. Poté byly buňky peletovány a lysovány 150mM NaCl, 50mM Tris pH 7,5, 5mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, lmM PMSF. Následovalo centrifugační odstranění jader, a poté byla pětina z každého buněčného extraktu adsorbována na omyté agarózové kuličky konjugované s proteinem A, a to po dobu 2 h ve 4 °C. Kuličky byly promyty PBS obsahujícím 1% NP—40 a eluovány za přítomnosti nebo absence merkaptoetanolu. Výsledky těchto experimentů ukázaly, že většina imunoprecipitovaných chimér CD4(D1-D4): Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7 migrovala ve formě dimérů předpokládané molekulové hmotnosti za neredukčních podmínek.

Pro přímé vyhodnocení schopnosti buněk, exprimujících fuzní molekuly, podporovat infekci HTV, byly prováděny dlouhodobé studie infekčnosti na transfektantech exprimujících CD4(Dl-D4):Ig:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7. Stabilní transfektanty CD4(D1-D4):IG:CD7 a CD4(Dl,D2):Ig:CD7 a CD4 byly připraveny v sublinii buněk 293, transfektovatelné lidské embryonální ledvinové buněčné linii. Chimérické molekuly byly subklonovány v dvousměmých vektorech, ve kterých byl gen hygromycinu B pod kontrolou thymidin-kinázového promotoru Herpex simplex viru. Deseti-centimetrové misky s 60 až 70% nárůstem buněk byly transfektovány 10 pg této plazmidové DNA pomocí koprecipitace s fosforečnanem vápenatým. Před transfekcí byl plazmid linearizován rozštěpením v unikátním Sfí I místě, a konce vytvořily rovnováhu s T4 DNA polymerázou. 24 hodin po transfekcí byly buňky rozděleny na čtvrtiny a 48 hodin po transfekcí byly převedeny pod selekční tlak hygromycinu B (Sigma, St. Louis, Mo) v koncentraci 400 μg/ml. Každé 3 až 4 hodiny bylo k buňkám doplňováno čerstvé médium obsahující hygromycin.

Rezistentní kolonie byly sebrány a rozetřeny, a jejich exprese byla testována nepřímou imunofluorescencí s použitím Fc anti-lidského IgG (Organon technika, West Chester, PA) nebo Q4120 - protilátky reaktivní s lidským CD4 (Sigma); obojí konjugované s fluoresceinem. Poté následovala průtoková cytometrie (Coulter, Hialeah, FL). Z každého konstruktu s hladinou CD4 na povrchu buňky srovnatelnou s hladinou dosaženou jinými buněčnými liniemi, byly pro další analýzy vybrány dva nezávislé klony. Obr. 22 ukazuje, že po vystavení HTV byla ve stabilních kulturách CD4 transfektantů detekována přítomnost p54, a to již 3 dny po infekci. Přítomnost multijademých gigantických buněk a charakteristické vzdouvání byly u těchto kultur evidentní již pět dní po infekci. V netransfektovaných rodičovských buněčných liniích ani ve dvou nezávisle získaných izolátech transfektantů CD4(Dl-D4):IgG:CD7 a CD4(Dl,D2):IgG:CD7 nebyla zaznamenána signifikantní přítomnost p54 nebo multijademých gigantických buněk ani po 32 dnech pěstování (Obr. 22).

Za účelem zkompletování studií infekčnosti byla u buněk testována exprese CD4 na buněčném povrchu. Hustota povrchového epitopu CD4 byla v infikovaných kulturách exprimujících CD4 znatelně snížena při omezení působení viru, zatímco v kulturách exprimujících CD4(D1-D4): IgG:CD7 a CD4(Dl,D2):IgG.CD7 zůstala nezměněna. Tyto experimenty prokázaly, že je možné vytvořit chimérické molekuly nesoucí dvě apikální domény CD4, které, pokud jsou fúzovány ke ζ řetězci T buněčného receptorů, mají schopnost zaměřovat a zabíjet HIV infikované buňky, ale které nepodporují HTV infekci zprostředkovanou CD4.

-23 CZ 293969 B6

Další experimenty objasnily, že nejpodstatnější pro schopnost odolávat infekci HIV je pravděpodobně vzdálenost mezi extracelulámí doménou CD4 molekuly a lipidovou dvouvrstvou.

V prvním experimentu jsme sestrojili chimérickou molekulu nesoucí deleci CD7 stonku a transmembránové domény; tato delece odstranila oblast transmembránové části CD7 bohatou na proliny. Pokud byla tato doména fúzována k extracelulámí doméně CD4 molekuly, udržovala si svou schopnost účinně kotvit extracelulámí doménu CD4 molekuly, což bylo zjištěno sledováním exprese CD4 molekuly na buněčném povrchu (bylo popsáno). Oproti tomu byla ztracena schopnost odolávat formování syncytií indukovanému obalovým glykoproteinem HTV.

V druhém experimentu bylo demonstrováno, že schopnost odolávat formování syncytií indukovanému obalovým glykoproteinem HIV by mohla být přičtena chiméře CD4/CD5, o které bylo již dříve známo, že slouží jako trasmembránová kotva pro CD4 extracelulámí doménu, ale která nebyla schopna odolávat formování syncitií indukovanému obalovým glykoproteinem HTV.

V tomto experimentu byly do molekuly CD4/CD5 vneseny domény pantové domény a domén CH2 a CH3 těžkého řetězce lidského IgGI; výsledná chiméra odolávala formování syncytia, což znovu naznačilo, že zvýšení vzdálenosti pomocí imunoglobulinových domén bylo dostačující pro rezistenci k formování syncytií indukovanému obalovým glykoproteinem HTV.

Ve třetím experimentu byla CD4 doména přemístěna pomocí syntetických alfa helixů různé délky od různých vzdáleností od buněčné membrány. Byly vytvořeny syntetické oligonukleotidy reprezentující opakovaný alfa helikální motiv zbytků lysinu a glutamové kyseliny obklopených dvěma alaninovými zbytky (viz obr. 28, kde jsou vedeny primární nukleotidové a aminokyselinové sekvence). V předchozích studiích byly nalezeny takové aminokyselinové sekvence, které se v alfa helixem objevovaly s vysokou frekvencí, naznačujíce tak, že takové opakované motivy by mohly přejímat konformaci alfa helixu a umístění takovýchto alfa helixů mezi transmembránovou doménu a extracelulámí domény CD4 by přemístilo CD4 dál od buněčné membrány. Pomocí alfa helikálních segmentů různých délek byla určena přibližně vzdálenost nutná k rezistenci ke vstupu HIV, přičemž byly použity známé hodnoty pro vzestup stoupání a otočení alfa helixu. Tyto výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

	Tvorba syncytia	Exprese Thy-1
A. CD4+H+CH2+CH3+CD7tm+glk	-	-
B. CD4(Dl,D2)+H+CH2+CH3+CD7tm+stk	-	-
C. CD4+CD7tm+stk	+/3^	+
D. CD4+CD7tm (dlouhá verze)	+	+
E. CD4+CD7tm (krátká verze)	+	+
F. CD4+CD5tm	+	+
G. CD4+CH2+CH3+CD5tm	-	-
H. CD4+CD3+CE5tm	-	ND
I. CD4+CD34tm	+	+
J. CD4+ syntetický alpha helix (24 angstoms) +CD34tm	ND	+
K. CD4+ syntetický alpha helix (48 angstroms) +CD34tm	ND	+/3-)
L. CD4+ syntetický alpha helix (72 angstroms) +CD34tm	ND	—

^a Podstatná redukce v počtu syncytií nebo buněk exprimujících thy-1 ND = nesledováno

-24CZ 293969 B6

Pokud není uvedeno jinak, tak v této tabulce „CD4“ představuje CD4(D1-D4); „H“, „CH2“ a„CH3“ představují pantovou oblast v oblasti CH2 a CH3 těžkého řetězce lidského IgGl. „CD7tm a stk“ představují transmembránovou a stonkovou oblast CD7; „CD7tm (dlouhá verze)“ a „CD7tm (krátká verze)“ reprezentující transmembránovou oblast CD7 a transmembránovou oblast CD7 zkrácenou o doménu bohatou prolinem (jak již bylo diskutováno výše); „CD5tm“ představuje transmembránovou oblast CD5; a „CD34tm“ představuje transmembránovou oblast CD34. V kolonkách J-L je délka alfa helikální oblasti uvedena v angstremech; tyto hodnoty jsou založeny na faktu, že alfa helixu připadá na jednu otočku 3,6 AK zbytků, což odpovídá 5,4 A (nebo 1,5 A na AK zbytek).

V souladu stím by alfa helix o délce 16 AK zbytků posunul extracelulární doménu Cd4 asi o 24 angstremů. Pomocí konkatemerizace BstYl fragmentu do unikátního BamHl místa tohoto fragmentu (viz obr. 28) a následnou selekcí klonů se správnou orientací fragmentu byly připraveny alfa helixy o velikosti 48 a 72 A.

Formování syncytií bylo sledováno v ko-kultivačních experimentech s HeLa buňkami exprimujícími obalový glykoprotein HTV-1 z konstruktu vPE16 pocházejícího zvakcinia viru (viz výše).

Dále byla měřena exprese Thy-1. Byl sestrojen živý vektor retroviru založený na hxb2 klonu HTV-1. V tomto vektoru byl neesenciální gen nef nahrazen kódující sekvencí molekuly krysího thy-1, která patří mezi molekuly efektivně exprimované na povrchu buňky, a je zakotvena v membráně fosfatidylinositolovou vazbou. Virus vzniklý z tohoto molekulárního klonu byl označen jak ohxb/thy-1 a byl infekční, jak bylo prokázáno sledováním jeho cytopatologických účinků a přítomností p24 v supematantech kultur infikovaných buněk C8166 (lidská leukemická T buněčná linie). Kromě toho bylo zjištěno, že při vystavení účinkům hxb/thy-1 vykazovaly HeLa buňky, které byly přechodně transfektovány CD4, známky exprese thy-1 již 18 hodin po infekci, jak by bylo očekáváno při regulaci způsobem nef. Nef gen normálně kóduje proteiny patřící do třídy virových regulačních proteinů, které jsou vícenásobně sestříhány a postrádají rev element. Tyto mediátorové proteiny se mohou v podstatné míře hromadit v cytoplazmě jako časné virové genové produkty. Bylo očekáváno, že proteiny thy-1 jsou regulovány podobně, tzn. že se objevují v časných fázích životního cyklu viru. V podstatě tento systém usnadnil analýzy vstupu HIV, jelikož exprese thy-1 fungovala jako náhrada za virovou expresi. Do HeLa buněk byly přechodně transfektovány různé chiméry založené na CD4, a to s využitím standardní DEAE-dextranové metody. Transfektované buňky byly 48 hodin po transfekci vystaveny viru hxb/thy-1 a byla zjišťována exprese thy-1 24 až 48 hodin po infekci. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty exprese thy-1 měřené 24 hodin po infekci pomocí komerčně dostupné monoklonální protilátky Thy-1 (Accurate). Ze získaných dat, která jsou shrnuta v tabulce 1, jsme usoudili, že pro rezistenci k HIV infekci by bylo optimální, kdyby byly extracelulární domény CD4 odsunuty od buněčné membrány nejméně o 48 angstremů, výhodněji nejméně o 72 angstremů.

S použitím strategie podobné strategii popsané v této práci, lze sestrojit chiméry založené na protilátkách proti HIV obalu, jenž zaměřují HIV infikované buňky. Příklady takových protilátek jsou popsány vGomy et al., proč. Nati. Acad. Sci, USA 86:1624, 1989; a vMarasco et al., J. Clin.Invest. 90:1467, 1992.

Příklad XI

Další T buněčné a B buněčné receptory proteiny přenášející signál

Další intracelulární a transmembránové domény přenášející signál mohou být získány z receptorových proteinů T buněk, CD3 delta a T3 gama, a z receptorových proteinů B buněk, mbl a B29.

Aminokyselinové sekvence těchto proteinů jsou vedeny na obr. 16 (CD3 delta; sekv. č. 24), obr.

(T3 gama; sekv. č. 25), obr. 18 (mdl; sekv. č. 26), a Obr. 19 (B29; sekv. č.27). Části sekvencí

-25CZ 293969 B6 postačující pro přenos cytolytického signálu (a proto s výhodou zahrnuty v chimérickém receptoru předkládaného vynálezu) jsou uvedeny v rámečcích. Chimérické receptory obsahující tyto proteinové domény jsou vytvořeny a užívány v terapeutických metodách vynálezu, jak již bylo zevrubně popsáno výše.

Příklad XII

Experimentální metody

Infekce vakcinií a radioimunoprecipitace

Přibližně 5 x 10⁶ buněk CV1 bylo infikováno rekombinantním vakcinia virem po dobu 1 hodiny v bezsérovém médiu DME při multiplicitě infekce (moi) nejméně 10 (titr měřen na CV1 buňkách). Po infekci byly buňky přeneseny do čerstvého média a metabolicky označeny 200 pCi/ml.

³⁵S-Mehionin+cystein (Tran³⁵S-label, ICN, Costo Mesa, CA) v DMEM médiu bez methioninu a cysteinu (Gibco; Grand Insland, NY) po dobu šesti hodin. Označené buňky byly odděleny od podkladu pomocí PBS obsahujícího lmM EDTA, zcentrifugováno a lysováno v 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris pH8, 5mM EDTA a lmM PMSF. Jádra byla odstraněna centrifugací a CD4 proteiny byly precipitovány protilátkou OKT4 a agarózou s anti-myším IgG (Cappel, Durman, NC). Vzorky byly analyzovány elektroforeticky v 8% polyakrylamidovém/SDS gelu za neredukčních (NR) a redukčních (R) podmínek. Gely obsahující vzorky značené ³⁵S byly před autoradigrafií nasyceny En³Hance (New England Nuclear, Boston, MA). Usnadněná exprese transmembránové formy CD 16 - CD 16™ - byla stanovena srovnáváním této exprese v buňkách CV1 infikovaných pouze CD 16™ s expresí v buňkách koinfikovaných virem kódujícím CD 16™ a chiméry ζ nebo γ. Po infekci a šesti nebo více hodinové inkubaci byly buňky odstraněny z misek pomocí PBS s lmM EDTA a exprese CD 16™ nebo chimér byla měřena pomocí nepřímé imunofluorescence a průtokové cytometrie.

Analýza toku vápníku

Buňky sublinie Jurkat buněk E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128, 1984) byly infikovány rekombinantami viru vakcinie po dobu jedné hodiny v bezsérovém IMDM médiu při moi 10, a inkubovány po dobu tří až devíti hodin v IMDM s 10%FBS. Buňky byly zcentrifugovány a resuspendovány v kompletním médiu obsahujícím lmM Indo-1 acetometoxyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3350, 1985) (Molekulární sondy) do koncentrace 3 x 10⁶ buněk/ml, a inkubovány 45 minut ve 37 °C. Buňky s Indo-1 byly peletovány a resuspendovány v konc. 1 x 10⁶/ml v bezsérovém IMDM médiu, a uloženy v temnu při pokojové teplotě. U buněk byla testována přítomnost volných iontů vápníku simultánním měřením fialové a modré fluorescence pomocí průtokové cytometrie (Rabinowitch et al., J. Immunol. 137:952-961, 1986). K iniciování toku vápníku byl k buněčné suspenzi přidán buď íykoerytrin (PE) konjugovaný s Leu3A (anti-CD4) (Bectok Dickinson, Lincoln Park, NJ) v koncentraci lpg/ml a pak 10 pg/ml nekonjugovaného kozího anti-myšího IgG v čase 0, anebo byla k suspenzi přidána nekonjugovaná monoklonální protilátka 3G3 (anti-D16) v koncentraci 1 pg/ml a pak 10pg/ml kozího anti-myšího IgG Fab₂‘ konjugovaného s PE v čase 0. Histogramy poměru fialové/modré emise byly vyhotoveny u PE positivních (infikovaných) buněčných populací, které typicky reprezentovaly 40 až 80 % ze všech buněk. Odpověď T buněčného antigenního receptorů byla u neinfikovaných buněk spouštěna bez vazby pomocí protilátky OKT3. Pro experimenty zahrnující chimérický receptor CD 16 byly vzorky, vykazující posun základní hladiny intracelulámího vápníku směrem k nižším hodnotám (bez protilátky), vyloučeny z analýzy. Data získaná z histogramu byla následně podrobně analyzována pomocí konverze binárních dat doAscilI za použití softwaru Write Hand Man (Cooper City, FL), následované analýzou pomocí programů FORTRAN. Poměr fialové/modré emise, měřený před přidáním druhé protilátky, byl

-26CZ 293969 B6 užit k stanovení normalizovaného iniciačního poměru, nastaveného souhlasně s jednotkou, a klidového mezního poměru, nastaveného tak, že 10% z klidové populace by zvýšilo mezní poměr.

Cytolytická analýza

Lidská buněčná linie WH3, cytolytická linie CD8’ CD4⁺ odvozená od HLA B44, byla pěstována v IMDM s 10% lidským sérem a s lOOU/ml IL-2, a byla periodicky stimulována buď nespecificky pomocí ozářených (3000 rad) periferních krevních lymfocytů a 1 pg/ml fytohemaglutininu (PHA), anebo specificky pomocí ozářených monojademých buněk nesoucích B44. Po jednom dni nespecifické stimulace byl PHA přidáním čerstvého média naředěn do koncentrace 0,5 pg/ml, a po třech dnech bylo médium vyměněno. Po stimulaci byly buňky pěstovány po dobu nejméně 10 dní, a teprve poté byla provedena analýza cytotoxicity. Buňky byly infikovány rekombinantami vakcinia viru při multiplicitě infekce nejméně 10, po dobu jedné hodiny v bezsérovém médiu. Poté následovala tří hodinová inkubace v kompletním médiu. Buňky byly zcentrifugovány a resuspendovány do koncentrace 1 x 10⁷ buněk/ml. 100 μΐ této buněčné suspenze bylo přidáno do každé jamky mikrotitrační destičky s U dnem obsahující 100 μΐ kompletního média. Buňky byly ředěny v dvoustupňových následných krocích. Dvě jamky od každého vzorku neobsahovaly lymfocyty, aby bylo umožněno spontánní uvolňování chrómu, a zároveň aby bylo možno měřit celkové vstřebávání chrómu. Cílové buňky z HeLa sublinie S3 byly infikovány na miskách o velikosti 6 a 10 cm při moi přibližně 10 po dobu jedné hodiny v bezsérovém médiu. Poté následovala inkubace v kompletním médiu po dobu třech hodin. Buňky byly odděleny ode dna pomocí PBS s lmM EDTA a spočítány. Vzorek buněk obsahující 10⁶ cílových buněk (HeLa, Ráji, nebo RJ2.2.5 buňky pro experimenty s chimérickým receptorem CD4 a buňky 3G8 10-2; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959, 1989 pro experimenty s chimérickým receptorem CD16) byl zcentrifugován a buňky byly resuspendovány v 50μ1 sterilního ⁵¹Cr-chromanu sodného (lmCi/ml, Dupont Wilmington, DE) po dobu jedné hodiny ve 37 °C za občasného míchání, a poté třikrát promyty PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ označených buněk resuspendovaných v médiu do výsledné koncentrace 10⁵ buněk/ml. Cílové buňky Ráji a RJ2.2.5 byly označeny stejně jako HeLa buňky. Mikrotitrační destička byla stočena 1 minutu při 750 x g a inkubována po dobu 4 hodin ve 37 C. Po skončení inkubace byly buňky resuspendovány jemným pipetováním, byl odebrán vzorek pro stanovení celkového a členěného množství a destička byla znovu stočena 1 minutu při 750 x g. Byly odebrány vzorky supematantu (100 μΐ) a proměřeny na scintilačním počítadle pro gama záření. Procento zabitých buněk bylo upraveno pro frakci infikovaných cílových buněk (většinou 50 až 90 %) měřenou pomocí průtokové cytometrie. Poměr efektor/cílová molekula byl pro infikované efektorové buňky upraven podle procenta infikovaných buněk (většinou 20 až 50 % pro experimenty s chimérickým receptorem CD4, a >70 % pro experimenty s chimérickým receptorem CD16).

In vitro mutageneze sekvence ζ

Pro vytvoření bodových mutací v aminokyselinových zbytcích 11 anebo 15 v sekvenci ζ byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery vycházející od BamHI místa „upstream“ od transmembránové domény ζ a pozměněná nativní sekvence ζ, kde byl na místě 11 zaměněn Cys za Gly (Cl 1G) nebo na místě 15 Asp za Gly (D15G) anebo obojí (Cl 1G/D15G), a použity pro PCR reakci za účelem vytvoření mutovaných fragmentů, které byly znovu vloženy do divokého typu konstrukce CD4^.

Pro vytvoření ζ deleci byly pomocí PCR nezmnoženy sekvence ζ cDNA. Byly použity syntetické oligonukleotidové primery, které byly navrženy tak, aby byl po AK zbytcích 50, 59 nebo 65 vytvořen stop kodón (UAG). Primeiy obsahovaly štěpné místo pro enzym Notl umístěné pět až šest AK zbytků od 5' konce, většinou v sekvenci tvaru CGC GGG CGG CCG CTA (sekv. č. 11), kde poslední tři zbytky souhlasí se stop antikodónem. Sekvence pro Notl a antikodón byly následovány 18 nebo více AK zbytky komplementárními s požadovanými 3' konce fragmentu.

-27CZ 293969 B6

Výsledné chiméry byly označeny CD16^Y51*, CD16^E60* resp. CD16^D66*. BamHI místo upstream od transmembránové domény a Notl místo byly použity pro vytvoření fragmentů, které pak byly znovu vneseny do divokého typu konstruktu CD16^. Uvolněním transmembránových a membránových proximálních intracelulámích sekvencí pomocí digesce konstruktu CD4.^ Asp' a Cys, popsaného výše, enzymy Bam H1 a Sací, byly vytvořeny monomerické chiméry ζ. Vzniklý fragment byl vložen do konstruktů CD16^E60* resp. CD16^D66*.

Konstrukce trojsložkových chimér CD16:7^(48-65) a CD16:7^(48-59)

Pro přípravu konstruktu CD16^D66* byla sekvence cDNA ζ korespondující s transmembránovou doménou a následujících 17 AK zbytků cytoplazmatické domény nahrazeny korespondující transmembránovou a cytoplazmatickou doménou získanou z cDNA CD5 a CD7. Fragmenty CD5 a CD7 byly vytvořeny pomocí PCR, při kterém byly použity oligonukleotidy zahrnující restrikční štěpné místo BamHI a korespondující s oblastí „upstream“ od transmembránové domény CD5 resp. CD7, a reverzní nukleotidy přesahující sekvence CD5 a CD7, a dále ζ sekvence, která obsahovala restrikční štěpné místo Sací.

CD5^: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CAG GCG CTG CTT CTT CTG (sekv. č. 12)

CD7^: CGC GGG GCG CTC GTT ATA GAG ATG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (sek. č. 13).

Produkty PCR CD5 a CD7 byly způsobeny BamHI a Sací a ligovány kCD16^E60* rovněž způsobenému BamHI a Sací; sekvence ζ tak byla mezi BamHI a Sací nahrazena fragmentem CD7. Pro konstrukci konstruktů CD16:CD5 a CD16:CD7 byly nejprve pomocí PCR vytvořeny fragmenty CD5 a CD7, a to za použití oligonukleotidů obsahujících restrikční štěpné místo Notl kódujících stop kodón UAA následující v případě CD5 za Gln416, a v případě CD7 za Ala 193. Fragmenty CD5 a CD7 vzniklé pomocí PCR byly pak způsobeny enzymy BamHI a Notl a vloženy do konstrukci CG16^Asp66*.

In vitro mutageneze N-koncových zbytků v rámci ζ motivu přenášejícího cytolytický signál

Byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery vycházející z místa Sací uvnitř ζ motivu, zahrnující výměnu nativního Asp48 za Ser (N48S), Leu50 za Ser (L50S) a Tyr51 za Phe (Y51F). Tyto primery byly použity v PCR reakci za účelem získání fragmentů, které byly dále vneseny do divokého typu konstruktu CD16:7.^(48-65).

In vitro mutageneze C koncových zbytků v rámci ζ motivu pro přenos cytolytického signálu

Byly připraveny syntetické oligonukleotidové primery od Notl místa na 3' ke stop kodónu, zahrnující přeměnu nativního Glu60 na Gin (E69Q), Gluól na Gin (E61Q), Tyr62 na Phe nebo Ser (Y62F nebo Y62S), a s Asp63 na Asn (D63N). Tyto primery byly použity v PCR reakci za účelem získání fragmentů, které byly subklonovány na divokého typu konstruktu CD16^D66* z BamHI místa k Notl místu.

Konstrukce chimér CD16:7^(33-65), CD16:7:ζ(71-104) a CD16:7:ζ( 104-137)

Transmembránový fragment CD7 nesoucí Mlul a Notl místa ve spojení mezi transmembránovou a intracelulámí doménou byl získán pomocí PCR za použití oligonukleotidu následující sekvence: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekv. č. 14). Výsledný PCR fragment byl způsoben BamHI a Notl a vložen do konstruktu CD16:7^(48-65). Pomocí PCR reakce s dvojicemi primerů obsahujících místa pro Mlul na 5' konci reverzních primerů, byly

-28CZ 293969 B6 připraveny fragmenty ζ kódující AK zbytky 33-65, 71-104, a 104-137. V každém z případů byla restrikční místa umístěna šest AK zbytků od 5' konce primerů, aby bylo zajištěno enzymatické štěpení.

ζ33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekv. č. 15) ζ71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (sekv. č. 16) ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (sekv. č. 17).

Konstrukce delečních mutant FcRylIA

Pomocí stejného PCR jako pro konstrukty plné délky, přeměňujícím sekvence kódující tyrosin v poloze 282 a 298 na stop kodony (TAA), byly připraveny deleční mutanty karboxylového konce FcRIIA. Delece N konce byly generovány amplifíkací fragmentů, kódujících menší část intracelulámí domény, pomocí PCR. Byly použity oligonukleotidy, které umožnily, aby výsledné fragmenty mohly být vložen mezi restrikční místa Mlul a Notl, do již dříve zkonstruovaného expresního plazmidu kódujícího extracelulámí doménu CD 16 fúzovanou sCD7 transmembránovou doménou, končící v Mlul místě, a spojení mezi transmembránovou a intracelulámí doménou.

Jiné formy vynálezu

Příklady popsané výše demonstrují, že agregace chimér ζ, η a y postačuje k iniciaci cytolytické efektorové odpovědi v T buňkách. Známý rozsah exprese ζ, η a y, který zahrnuje T lymfocyty, NK buňky, basofilní granulocyty, makrofágy a žímé buňky, naznačuje, že konzervované sekvenční motivy mohou interagovat s senzorickým aparátem známým buňkám hematopoetického původu, a že v obraně imunitního systému hostitele by mohly důležitou roli hrát agregační receptorové procesy.

Potenciál cytolytické odpovědi a absence odpovědi na cílové buňky nesoucí receptory II. třídy MHC demonstruje, že chiméry založené n ζ, η nebo y tvoří základ pro genetickou integraci proti AIDS s pomocí adoptivní imunoterapie. Rozsáhlá distribuce endogenních ζ a γ a evidence, že Fc receptory asociované s γ zprostředkovávají cytotoxicitu u různých buněčných typů (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99, 1989), umožňuje pro tyto účely využít různé buňky. Například neutrofílní granulocyty, které mají při cirkulaci velice krátký poločas života (asi 4 h) a jsou značně cytolytické, jsou atraktivními cílovými buňkami pro expresi chimér. Je nepravděpodobné, že by infekce neutrofilů virem HIV vedla k uvolnění viru, a nadbytek těchto buněk (převládající formy leukocytů) by měl usnadnit obranu hostitele. Jinou atraktivní možností pro hostitelské buňky jsou zralé T buňky, populace v současné době přístupná retrovirovému inženýrství (Rosenberg, S.A. Sci. Am. 262:62-69, 1990). S pomocí rekombinantních IL-2 může být populace T buněk v kultuře rozšířena poměrně snadno, a rozšířené populace mají typicky omezený poločas života, když jsou infuzovány (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570-578, 1990).

Za vhodných podmínek může rozpoznání HTV buňkami exprimujícími chiméry CD4 zajišťovat také stimul pro mitotické dělení, umožňující vyzbrojené buněčné populaci dynamicky odpovídat na virovou zátěž. Ačkoliv my jsme se v této práci zaměřili na chování fúzních proteinů v cytolytických T lymfocytech, exprese chimér v pomocných lymfocytech by mohla zajistit zdroj cytokinů mobilizovaný HIV, které by mohly zamezovat kolapsu pomocí pomocných buněk při AIDS. Nedávné návrhy několika systémů vnášejících rezistenci k infekci v jiném kroku než jako zamezení vstupu viru (Friedman et al., Nátuře 335:452-454, 1988; Green et alL, Cell 58:215— 223, 1989; Malim et al. Cell 58:205-214, 1989; Trono et al. Cell 59:113-120,1989; Buonocore et al. Nátuře 345:625-628, 1990), naznačují, že buňky nesoucí chiméry CD4 by mohly být

-29CZ 293969 B6 upraveny tak, aby zamezily produkci viru pomocí exprese vhodného agens s intracelulámím místem působení.

Schopnost přenášet signály T lymfocytům přes autonomní chiméry zajišťuje také schopnost regulace lymfocytů upravených retrovirovým inženýrstvím in vivo. Stimul pomocí vazby, zprostředkovaný například specifickou IgM protilátkou, které byly odejmuty domény vážící komplement, by mohlo umožnit lymfocytům zvýšit svůj počet in šitu, zatímco ošetření podobnou specifickou IgG protilátkou (např. rozpoznávající variace aminokyselin vnesené do chimérického řetězce), by mohlo selektivně vyčerpat upravenou populaci.

Kromě toho IgM protilátka proti CD4 nevyžaduje další vazbu k mobilizaci vápníku v Jurkat buňkách exprimujících chiméry Οϋ4:ζ. Schopnost regulovat mimotělní amplifikaci buněčné populace by mohla podstatně zvýšit rozsah a efektivitu současného použití navrhovaného pro geneticky upravené T buňky.

Ačkoli vynález byl popsán ve spojení se specifickými formami zde uvedenými je zřejmé, že jsou možné další modifikace, a záměrem této žádosti je pokrýt jakékoli variace, použití nebo adaptace tohoto vynálezu, a zahrnout taková odbočení od předkládaného objemu, která se mohou v dané oblasti, do které vynález patří, objevit, a která by se mohla týkat podstatných rysů uvedených na tomto místě, jenž jsou v celém rozsahu uvedeny v přiložených patentových nárocích.

Praktické využití

Vynález je využitelný jak účinné terapeutikum pro léčbu infekce virem HIV.

SEZNAM SEKVENCÍ

INFORMACE O SEKVENCI Č. 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1728 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 1:

-30CZ 293969 B6

ATGAACCCGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCI	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	SOO
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	9C0
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCGGGACA	GGTCCTGCTG	CAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCCAAACTC	1200
TGCTACTTGC	TAGATGGAAT	CCTCTTCATC	TACGGAGTCA	TCATCACAGC	1250
CCTGTACCTG	AGAGCAAAAT	TCAGCAGGAG	TGCAGAGACT	GCTGCCAACC	1300
TGCAGGACCC	CAACCAGCTC	TACAATGAGC	TCAATCTAGG	GCGAAGAGAG	1350
GAATATGACG	TCTTGGAGAA	GAAGCGGGCT	CGGGATCCAG	AGATGGGAGG	1400
CAAACAGCAG	AGGAGGAGGA	ACCCCCAGGA	AGGCGTATAC	AATGCACTGC	1450
AGAAAGACAA	GATGCCAGAA	GCCTACAGTG	AGATCGGCAC	AAAAGGCGAG	1500
AGGCGGAGAG	GCAAGGGGCA	CGATGGCCTT	TACCAGGACA	GCCACTTCCA	1550
AGCAGTGCAG	TTCGGGAACA	GAAGAGAGAG	AGAAGGTTCA	GAACTCACAA	160C
GGACCCTTGG	GTTAAGAGCC	CGCCCCAAAG	GTGAAAGCAC	CCAGCAGAGT	1650
AÓCCAATCCT	GTGCCAGCGT	CTTCAGCATC	CCCACTCTGT <	GGAGTCCATG	1700
GCCACCCAGT	AGCAGCTCCC	AGCTCTAA			1728

-31 CZ 293969 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 2:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1389 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 2:

ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	ggaccaagga	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	AGTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	gtgtctgtaa	AACGGGTTAC	800
COAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	gctcccgctc	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATGCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCCGGACA	GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	•150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCGCAGCTC	1200
TGCTATATCC	TGGATGCCAT	CCTGTTTTTG	TATGGTATTG	TCCTTACCCT	1250

-32CZ 293969 B6

GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG

GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC

ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA

AAAGGCAGAC	ATAGCCAGCC	1300
TGAACACCCG	GAACCAGGAG	1350
CCCCAATAG		1389

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1599 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 3:

ATGAACCGGG	GAGTCCCTTT	TAGGCACTTG	CTTCTGGTGC	TGCAACTGGC	50
GCTCCTCCCA	GCAGCCACTC	AGGGAAACAA	AGTGGTGCTG	GGCAAAAAAG	100
GGGATACAGT	GGAACTGACC	TGTACAGCTT	CCCAGAAGAA	GAGCATACAA	150
TTCCACTGGA	AAAACTCCAA	CCAGATAAAG	ATTCTGGGAA	ATCAGGGCTC	200
CTTCTTAACT	AAAGGTCCAT	CCAAGCTGAA	TGATCGCGCT	GACTCAAGAA	250
GAAGCCTTTG	GGACCAAGGA	AACTTCCCCC	TGATCATCAA	GAATCTTAAG	300
ATAGAAGACT	CAGATACTTA	CATCTGTGAA	GTGGAGGACC	AGAAGGAGGA	350
GGTGCAATTG	CTAGTGTTCG	GATTGACTGC	CAACTCTGAC	ACCCACCTGC	400
TTCAGGGGCA	GAGCCTGACC	CTGACCTTGG	AGAGCCCCCC	TGGTAGTAGC	450
CCCTCAGTGC	AATGTAGGAG	TCCAAGGGGT	AAAAACATAC	AGGGGGGGAA	500
GACCCTCTCC	GTGTCTCAGC	TGGAGCTCCA	GGATAGTGGC	ACCTGGACAT	550
GCACTGTCTT	GCAGAACCAG	AAGAAGGTGG	ACTTCAAAAT	AGACATCGTG	600
GTGCTAGCTT	TCCAGAAGGC	CTCCAGCATA	GTCTATAAGA	AAGAGGGGGA	650
ACAGGTGGAG	TTCTCCTTCC	CACTCGCCTT	TACAGTTGAA	AAGCTGACGG	700
GCAGTGGCGA	GCTGTGGTGG	CAGGCGGAGA	GGGCTTCCTC	CTCCAAGTCT	750
TGGATCACCT	TTGACCTGAA	GAACAAGGAA	GTGTCTGTAA	AACGGGTTAC	800
CCAGGACCCT	AAGCTCCAGA	TGGGCAAGAA	GCTCCCGCTC	CACCTCACCC	850
TGCCCCAGGC	CTTGCCTCAG	TATGCTGGCT	CTGGAAACCT	CACCCTGGCC	900
CTTGAAGCGA	AAACAGGAAA	GTTGCATCAG	GAAGTGAACC	TGGTGGTGAT	950
GAGAGCCACT	CAGCTCCAGA	AAAATTTGAC	CTGTGAGGTG	TGGGGACCCA	1000
CCTCCCCTAA	GCTGATCCTG	AGCTTGAAAC	TGGAGAACAA	GGAGGCAAAG	1050
GTCTCGAAGC	GGGAGAAGCC	GGTGTGGGTG	CTGAACCCTG	AGGCGGGGAT	1100
GTGGCAGTGT	CTGCTGAGTG	ACTCGGGACA	GGTCCTGCTG	GAATCCAACA	1150
TCAAGGTTCT	GCCCACATGG	TCCACCCCGG	TGCACGCGGA	TCCCAAACTC	1200

-33CZ 293969 B6

TGCTACCTGC	TGGATGGAAT	CCTCTTCATC	TATGGTGTCA	TTCTCACTGC	1250
CTTGTTCCTG	AGAGTGAAGT	TCAGCAGGAG	CGCAGAGCCC	CCCGCGTACC	1300
AGCAGGGCCA	GAACCAGCTC	TATAACGAGC	TCAATCTAGG	ACGAAGAGAG	1350
GAGTACGATG	TTTTGGACAA	GAGACGTGGC	CGGGACCCTG	AGATGGGGGG	1400
AAAGCCGAGA	AGGAAGAACC	CTCAGGAAGG	CCTGTACAAT	GAACTGCAGA	1450
AAGATAAGAT	GGCGGAGGCC	TACAGTGAGA	TTGGGATGAA	AGGCGAGCGC	1500
CGGAGGGGCA	AGGGGGACGA	TGGCCTTTAC	CAGGGTCTCA	GTACAGCCAC	1550
CAAGGACACC	TACGACGCCC	TTCACATGCA	GGCCCTGCCC	CCTCGCTAA	1599

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 4:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 575 párů bází (B) TYP: aminokyselina ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 4:

Met 1

Asn Arg

Gly

Val Pra 5

Phe

Arg His

Leu Leu Leu Val Leu Gin

Leu

10

15

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lya

λβη

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

Hxb

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

13S

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Αβπ

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Aep

Leu

245

250

255

Lys

Asn

Lys

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

26S

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

2S5

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lye

290

295

300

-34CZ 293969 B6

Thr

Gly

Lye

Leu

Híb

Gin

Glu

Val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lye

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lye

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lys

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cye

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lye

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cya

Tyr

Leu

Asp

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Tyr

Leu

Arg

Ala

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Thr

Ala

420

425

430

Aan

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Aan

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Arg

Ala

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly Gly

Lye

Gin

Arg

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Val

Tyr

465

470

475

480

Aan

Ala

Leu

Gin

Lye

Asp

Lys

Met

Pro

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

485

490

495

Thr

Lye

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

500

505

510

Aep

Ser

His

Phe

Gin

Ala

Val

Gin

Phe

Gly

Asn

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Ala

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gin

Ser

Gin

Ser

Cys

Ala

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

555

550

565

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

Ser

Gin

Leu

565

570

575

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 5:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 462 párů bází (B) TYP: aminokyselina ío (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 5:

Met 1

Asn Arg

Gly

Val 5

Pro Phe Arg

His Leu 10

Leu Leu Val

Leu

Gin 15

Leu

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

HiB

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lye

Leu

Asn

Αβρ

Arg

Ala

65

70

75

80

Aep

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lye

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cye

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Aap

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

val

Gin

Cys

Arg

ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

-35CZ 293969 B6

Lyb Aan Tle Gin Gly

Gly Lya

Thr

Leu

Ser Val 170

Ser Gin

Leu

Glu 175

Leu

165

Gin

Aap

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cya

Thr

Val

Leu

Gin

Aan

Gin

Lya

Lye

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lya

Ile

Aap

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lya

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lya

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lya

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lya

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Aap

Leu

245

250

255

Lya

Aan

Lya

Glu

Val

Ser

Val

Lya

Arg

Val

Thr

Gin

Aap

Pro

Lya

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lya

Leu

Pro

Leu

Hia

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Aan

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lya

290

295

300

Thr

Gly

Lya

Leu

Hie

Gin

Glu

Val

Aan

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lya

Aan

Leu

Thr

Cya

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Lya

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lya

Leu

Glu

Aan

Lya

Glu

Ala

Lya

Val

Ser

340

345

350

Lya

Arg

Glu

Lya

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Aan

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cya

Leu

Ser

Aap

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Aan

Ile

370

375

380

Lya

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

Hia

Ala

Aap

Pro

Gin

Leu

385

390

395

400

Cya

Tyr

Ile

Leu

Aap

Ala

Ile

Leu

Phe

Leu

Tyr

Gly

Ile

val

Leu

Thr

405

410

415

Leu

Tyr

Cya

Arg

Leu

Lya

Ile

Gin

Val

Arg

Lya

Ala

Aap

Ile

Ala

420

425

430

ser

Arg

Glu

Lya

Ser

Aap

Ala

Val

Tyr

Thr

Gly

Leu

Aan

Thr

Arg

Aan

435

440

445

Gin

Glu

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Lya

His

Glu

Lya

Pro

Gin

450

455

460

462

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 6:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 532 párů bází ίο (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 6:

-36CZ 293969 B6

Met Asn Arg Gly 1

Val 5

Pro

Phe

Arg

Híb Leu Leu 10

Leu Val

Leu Gin 15

Leu

Ala

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Ala

Ser

Gin

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lye

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Ckn

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lye

Leu

Asn

Aap

Arg

Ala

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Aep

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Ala

Asn

115

120

125

Ser

Asp

Thr

His

Leu

Gin

Gly

Gin

Ser

Leu

Thr

Leu

Thr

Leu

Glu

130

135

140

Ser

Pro

Gly

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Cys

Arg

Ser

Pro

Arg

Gly

145

150

155

160

Lys

Asn

Ile

Gin

Gly

Lys

Thr

Leu

Ser

Val

Ser

Gin

Leu

Glu

Leu

165

170

175

Gin

Asp

Ser

Gly

Thr

Trp

Thr

Cys

Thr

Val

Leu

Gin

Asn

Gin

Lys

180

185

190

Val

Glu

Phe

Lys

Ile

Asp

Ile

Val

Leu

Ala

Phe

Gin

Lys

Ala

Ser

195

200

205

Ser

Ile

Val

Tyr

Lys

Glu

Gly

Glu

Gin

Val

Glu

Phe

Ser

Phe

Pro

210

215

220

Leu

Ala

Phe

Thr

Val

Glu

Lys

Leu

Thr

Gly

Ser

Gly

Glu

Leu

Trp

225

230

235

240

Gin

Ala

Glu

Arg

Ala

Ser

Lye

Ser

Trp

Ile

Thr

Phe

Asp

Leu

245

250

255

Lye

Asn

LyB

Glu

Val

Ser

Val

Lys

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Pro

Lys

Leu

260

265

270

Gin

Met

Gly

Lys

Leu

Pro

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Pro

Gin

Ala

Leu

275

280

285

Pro

Gin

Tyr

Ala

Gly

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Leu

Ala

Leu

Glu

Ala

Lys

290

295

300

Thr

Gly

Lys

Leu

His

Gin

Glu

val

Asn

Leu

Val

Met

Arg

Ala

Thr

305

310

315

320

Gin

Leu

Gin

Lys

Asn

Leu

Thr

Cys

Glu

Val

Trp

Gly

Pro

Thr

Ser

Pro

325

330

335

Ly.

Leu

Met

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Lys

Glu

Ala

Lys

Val

Ser

340

345

350

Lys

Arg

Glu

Lye

Pro

Val

Trp

Val

Leu

Asn

Pro

Glu

Ala

Gly

Met

Trp

355

360

365

Gin

Cys

Leu

Ser

Asp

Ser

Gly

Gin

Val

Leu

Glu

Ser

Asn

Ile

370

375

380

Lye

Val

Leu

Pro

Thr

Trp

Ser

Thr

Pro

Val

His

Ala

Asp

Pro

Lys

Leu

385

390

395

400

Cys

Tyr

Leu

Aep

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

405

410

415

Ala

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Ala

Glu

Pro

Ala

420

425

430

Tyr

Gin

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Asp

Lys

Arg

Arg Gly

Arg Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Lys

Pro

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

465

470

475

480

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

485

490

495

Lys

Gly

Glu

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

500

505

510

Leu

Ser

Thr

Ala

Thr

Ly·

Asp

Thr

Tyr

Asp

Ala

Leu

His

Met

Gin

Ala

515

520

525

Leu

Pro

Arg

530

-37CZ 293969 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 7:

CGCGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 8:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 8:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 9:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 9:

CGCGGCGG CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAG 33

-38CZ 293969 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 10:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 10:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 11:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 15 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 11:

CGCGGGCGGC CGCTA 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 12:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 12:

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG 42 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 13:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bází (B) TYP: nukleová kyselina

-39CZ 293969 B6 (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 13:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG 48 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 14:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 14:

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 15:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 15:

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 16:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina

-40CZ 293969 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 16:

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 17:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 17:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 18:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 18:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 19:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 19:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42

-41 CZ 293969 B6 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 20:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 20:

GCGGGGGGAT CCACTGTCC AAGCTCCCAG 30 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 21:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 21:

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 22:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 22:

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 23:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bází (B) TYP: nukleová kyselina

-42CZ 293969 B6 (C) FORMA: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: nukleová kyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 23:

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 24:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 171 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: aminokyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 24:

Het Glu His Ser Thr

Phe Leu

Ser Gly

Leu Val Leu AJ.a 10

Thr

Leu 15

Leu

5

ser

Gin

val

Ser

Pro

Phe

Lys

Ile

Pro

Ile

Glu

Leu

Glu

Asp

Arg

20

25

30

Val

Phe

val

Asn

Cys

Asn

Thr

Ser

Ile

Thr

Trp

Val

Glu

Gly

Thr

Val

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Ser

Asp

Ile

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu

Gly

Lys

Arg

Ile

50

55

60

Leu

Asp

Pro

Arg

Gly

Ile

Tyr

Arg

Cys

Asn

Gly

Thr

Asp

Ile

Tyr

Lys

65

70

75

80

Asp

Lys

Glu

Ser

Thr

Val

Gin

Val

His

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Ser

Cys

85

90

95

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Ala

Thr

Val

Ala

Gly

Ile

Val

Thr

Asp

Val

100

105

110

Ala

Xle

Thr

Leu

Ala

Leu

Gly

Val

Phe

Cys

Phe

Ala

Gly

His

115

120

125

Glu

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Gly

Ala

Asp

Thr

Gin

Ala

Leu

Arg

130

135

140

Asn

Asp

Gin

Val

Tyr

Gin

Pro

Leu

Arg

Asp

Arg

Asp

Ala

Gin

Tyr

145

150

155

160

Ser

His

Leu

Gly

Asn

Trp

Ala

Arg

Asn

Lys

165 170 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 25:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 182 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: aminokyselina

-43 CZ 293969 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 25:

Met

Glu Gin

Gly

Lys 5

Gly Leu Ala Val Leu 10

Ile

Leu

Ala Ile

Ile 15

Leu

Gin

Gly

Thr

Leu

Ala

Gin

Ser

Ile

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr

Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Cys

Asp

Ala

35

40

45

Glu

Ala

Lys

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Lys

Asp

Gly

Lys

Met

Ile

Gly

Phe

50

55 ·

60

Leu

Thr

Glu

Asp

Lys

Lye

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Ala

Lys

Asp

65

70

75

80

Pro

Arg

Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys

Gly

Ser

Gin

Asn

Lys

Ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin

Val

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Aen

Cye

Ile

Glu

Leu

Asn

Ala

100

105

110

Ala

Thr

Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Ala

Glu

Ile

Val

Ser

Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Ala

Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile

Ala

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

Arg

Ala

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro

Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp

Gin

Tyr

Ser

His

Leu

Gin

Gly

165

170

175

Asn

Gin

Leu

Arg

Asn

180

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 26:

io (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 220 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: aminokyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 26:

-44CZ 293969 B6

K«t

Pro

Gly Gly

Leu 5

Glu

Ala

Leu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Leu Phe

10

15

Leu

Ser

Tyr

Ala

Cys

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gin

Ala

Leu

Arg

val

Glu

20

25

30

Cly

Gly

Pro

Ser

Leu

Thr

val

Asn

Leu

Gly

Glu

Ala

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cye

Glu

Asn

Gly

Arg

Asn

Pro

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Asn

Ile

Thr

Trp

Pro

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Gly

Gin

65

70

75

80

ciy

Thr

Gly

Gin

Leu

Phe

Pro

Glu

Val

Asn

Lys

Asn

Thr

Gly

85

90

95

Ala

Cye

Thr

Gly

Cys

Gin

Val

Ile

Glu

Asn

Ile

Leu

Lys

Arg

Ser

100

105

110

Cye

Gly

Thr

Tyr

Leu

Arg

Val

Arg

Asn

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Phe

Leu

11S

120

125

Asp

Met

Gly

Glu

Gly

Thr

Lye

Asn

Arg

Ile

Thr

Ala

Glu

Gly

Ile

130

135

140

Ile

Leu

Phe

Cys

Ala

Val

Pro

Gly

Thr

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Lye

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Lys

Phe

Gly

Val

Aap

Met

Pro

Asp

Tyr

165

170

175

Clu

Asp

Glu

Asn

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Leu

Aep

Cye

Ser

Met

180

185

190

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Arg

Gly

Leu

Gin

Gly

Thr

Tyr

Gin

Asp

val

Gly

195

200

205

ΑβΠ

Leu

His

Ile

Gly

Asp

Ala

Gin

Leu

Glu

Lye

Pro

210

215

220

(2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 27:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 228 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: aminokyselina (xi) POPIS SEKVENCE: SEKV. Č. 27:

-45CZ 293969 B6

Ket Ala Thr Leu Val 5 Leu Leu Leu Leu Phe

Leu Ser Ser Het Pro Cys His Trp Leu Leu Phe

Ser Gly

Glu

Pro 25

10 Val

15 Pro Ala Met Thr Ser Ser 30

20

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pro

Cys

Ser

Gin

Ile

Trp Gin

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Ala

Lys

Arg

Ser

Met

Val

Lys

Phe

H18

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

His

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Gly

Arg

Ile

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Gin

Asn

Ile

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

Ile

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Lys

Cys

Asp

Ser

Ala

Asn

115

120

125

His

Aan

Val

Thr

λβρ

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

Ile

145

150

155

160

Ile

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Ile

Leu

Phe

Ile

Val

Pro

Ile

165

170

175

Phe

Leu

Asp

Lys

Asp

Asp Gly

Lys

Ala

Gly

Met

Glu

Asp

180

185

190

His

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Ile

Asp

Gin

Thr

Ala

Thr

Tyr

Glu

Asp

195

200

205

Ile

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

Glu

His

210 215 220

Pro Gly Gin Glu

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Buňka, která exprimuje proteinový membránově vázaný chimérický receptor, přičemž tento receptor obsahuje:

a) extracelulámí část, která zahrnuje fragment CD4 schopný specifického rozpoznání a vazby buňky infikované HIV, ale který nepřenáší infekci HTV, a ve které je fragment CD4 oddělen od membrány terapeutické buňky nejméně 48.10¹⁰ m nebo nejméně 72.10'¹⁰ m,

b) intracelulámí část, která je schopna dát terapeutické buňce signál ke zničení buňky infikované HTV vázané na receptor, a kde intracelulámí část je částí přenášející signál z receptorového proteinu T buňky, z receptorového proteinu B buňky nebo z receptorového proteinu Fc.
2. Buňka podle nároku 1, v níž se fragment CD4 skládá z aminokyselin 1 až 394 nebo z aminokyselin 1 až 200.
3. Buňka podle nároku 1, v níž je fragment CD4 oddělen od intracelulámí části transmembránovou doménou CD7 nebo závěsnou doménou CH2 a CH3 molekuly lidského IgGl.
4. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou složku obsahuje buňky, které exprimují proteinový membránově vázaný chimérický receptor, přičemž tento receptor obsahuje

-46CZ 293969 B6

a) extracelulámí část, která zahrnuje fragment CD4 schopný specifického rozpoznávání a vazby buňky infikované HIV, ale který nepřenáší infekci HIV, a ve které je fragment CD4 oddělen od membrány terapeutické buňky nejméně 48.10'¹⁰ m nebo nejméně 72.10'¹⁰ m,

b) intracelulámí část, která je schopna dát terapeutické buňce signál ke zničení buňky infikované HIV vázané na receptor, a kde intracelulámí část je částí přenášející signál zreceptorového proteinu T buňky, z receptorového proteinu B buňky nebo z receptorového proteinu Fc.
5. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že fragment CD4 se skládá z aminokyselin 1 až 394 nebo 1 až 200.
6. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že fragment CD4 je oddělen od intracelulámí části transmembránovou doménou CD7 nebo závěsnou doménou CH2 a CH3 molekuly lidského IgGl.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že T buněčný receptorový protein je ζ.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že buňky jsou vybrány ze skupiny sestávající se z: a) T lymfocytů, b) cytotoxických T lymfocytů, c) Natural Killer buněk, d) neutrofilů, e) granulocytů, f) makrofágů, g) žímých buněk, h) HeLa buněk a i) embryonálních kmenových buněk.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že receptor zahrnuje transmembránovou část CD7, transmembránovou část CD5 nebo transmembránovou část CD34.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že fragment CD4 je oddělen od membrány terapeutické buňky jedním nebo více proteinovými alfa helixy.