ES2620259T3 - Métodos y composiciones para tratar VIH - Google Patents

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ES2620259T3 ES11769573.4T ES11769573T ES2620259T3 ES 2620259 T3 ES2620259 T3 ES 2620259T3 ES 11769573 T ES11769573 T ES 11769573T ES 2620259 T3 ES2620259 T3 ES 2620259T3
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Roger Williams Medical Center
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Abstract

Un vector que comprende: a) una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína quimérica que comprende (i) un dominio extracelular de CD4, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento se une específicamente al gp120, (ii) un dominio de transmembrana, y (iii) un dominio citoplásmico que comprende a) el dominio citoplásmico de la cadena CD3 zeta, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento modula la activación de células T, y b) el dominio citoplásmico de CD28, o un fragmento del mismo; en el que el fragmento modula la activación de las células T, en el que dicha proteína quimérica es capaz de formar un homodímero cuando se expresa en una célula T, y b) una construcción de ácido nucleico que codifica un siARN específico para un gen de VIH, en el que el siARN es capaz de suprimir la replicación por VIH.

Description

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DESCRIPCION
Metodos y composiciones para tratar VIH Referenda cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/324,050, presentada el 14 de abril de 2010.
Declaracion relacionada con investigacion financiada federalmente.
Este trabajo esta respaldado por el numero de concesion NIH R21, 1R21AI076145-01 de los Institutos de Salud de los Estados Unidos. El Gobierno tiene determinados derechos en esta invention.
Antecedentes de la invencion
La invencion se relaciona con el campo del tratamiento del VIH con celulas T modificadas.
En 1984, se demostro que el VIH es el agente etiologico del SIDA. Desde ese momento, la definition de SIDA ha sido revisada innumerables veces con respecto a cual criterio se debe incluir en el diagnostico. Sin embargo, a pesar de la fluctuation en parametros diagnosticos, el denominador comun simple del SIDA es la infection con VIH y el posterior desarrollo de slntomas constitutivos persistentes y enfermedades que definen el SIDA, tal como infecciones secundarias, neoplasmas, y enfermedades neurologicas.
El VIH es un retrovirus humano del grupo lentivirus. Los cuatro retrovirus humanos reconocidos pertenecen a dos grupos distintos: los retrovirus linfotropicos T(o leucemia) humanos, HTLV-1 y HTLV-2, los virus de la inmunodeficiencia humana, VIH-1 y VIH-2. Los primeros son virus transformantes, mientras que los ultimos son virus citopaticos.
El VIH-1 ha sido identificado como la causa mas comun de SIDA en todo el mundo. La identidad de secuencia entre el VIH-2 y el VIH-1 es de aproximadamente el 40%, siendo el VIH-2 mas estrechamente relacionado con algunos integrantes de un grupo de virus de inmunodeficiencia en simios (SIV).
La causa principal del defecto inmunitario en SIDA ha sido identificada como una deficiencia cualitativa y cuantitativa en el subconjunto de linfocitos (T) derivados de timo, la poblacion T4. Este subconjunto de celulas se define fenotlpicamente por la presencia de la molecula de superficie CD4, que se ha demostrado es el receptor celular para el VIH. Aunque la celula T4 es el tipo de celula principal infectada con VIH, esencialmente cualquier celula humana que expresa la molecula CD4 en su superficie es capaz de unirse a y de ser infectada con VIH.
Intentos anteriores para tratar pacientes con celulas T “disenadoras” que expresan receptores inmunitarios (CIR) quimericos probaron no ser exitosos. Subsiste la necesidad en la tecnica de nuevas terapias para el VIH. La presente invencion aborda este problema y ofrece ventajas sobre terapias intentadas anteriormente.
El documento US 5,686,281 divulga protelnas receptoras coestimuladoras quimericas y secuencias de ADN que codifican estas protelnas. Los receptores quimericos comprenden por lo menos tres dominios en una unica molecula de cadena, a saber, un dominio de union de ligando extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio de serialization de funcion efectora coestimulador citoplasmico. La protelna quimerica puede comprender las porciones extracelulares y de transmembrana del CD4 y los dominios citoplasmico del CD3-zeta y CD28.
El documento US 2003/0138410 divulga un receptor quimerico unido a membrana que comprende una parte extracelular de CD4, una region de transmembrana y el dominio intracelular de la cadena CD3/zeta. Tambien se divulgan celulas que expresan el receptor quimerico y ADN y vectores que codifican el receptor quimerico.
Roberts M.R. et al., Blood 84, 2878-2889, 1994 divulga un metodo inmunoterapeutico con aplicacion potencial en el tratamiento de enfermedades malignas y vlricas. Las celulas CD8+ T primarias se modifican geneticamente para expresar receptores de celulas T quimericos especlficos para antlgenos de VIH. Una construction tiene los dominios de transmembrana y extracelular del CD4 y el dominio intracelular de la cadena CD3-zeta.
Marathe J.G y Wooley D.P, Genetic Vaccines and Therapy 5, 5, 2007 divulga en un artlculo de revision metodos terapeuticos para el VIH, que divulgan por lo tanto algunas estrategias similares a receptores quimericos con dominios extracelulares y de transmembrana de CD4 y dominio intracitoplasmico de CD3. Otras estrategias incluyen siARN para dirigir tat y rev de CCR4.
Sin embargo, ninguno de los documentos mencionados anteriormente divulga la combination de CIR con siARN especlfico para un gen VIH en el tratamiento de VIH, independiente de la combinacion de un acido nucleico que codifica el CIR y un acido nucleico que codifica el siARN en un unico vector.
Resumen de la invencion
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En un aspecto, la invencion caracteriza un vector que comprende a) una construccion de acido nucleico que codifica una protelna quimerica (i) un dominio extracelular de CD4, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento se une especlficamente a gp120, (ii) un dominio de transmembrana, y (iii) un dominio citoplasmico que comprende a) el dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento modula la activacion de celulas T, y b) el dominio citoplasmico de CD28, o un fragmento del mismo; en el que el fragmento modula la activacion de celulas T, en el que dicha protelna quimerica es capaz de formar un homodlmero cuando se expresa en una celula T, y b) una construccion de acido nucleico que codifica un siARN especlfico para un gen de VIH, en el que el siARN es capaz de suprimir la replication del VIH.
En el primer aspecto, la invencion caracteriza el vector, en el que las protelnas quimericas dimerizadas son capaces de formar por lo menos un enlace disulfuro.
En el primer aspecto, la invencion caracteriza el vector, en el que dicho dominio de transmembrana comprende un polipeptido seleccionado del grupo que consiste del dominio de transmembrana de la cadena CD3 zeta y el dominio de transmembrana de CD28.
En la anterior realization, la invencion caracteriza el vector en donde dicho dominio de transmembrana comprende 730 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3.
En el primer aspecto, la invencion caracteriza el vector, en el que dicha protelna quimerica comprende adicionalmente una etiqueta c-myc.
En el primer aspecto, la invencion caracteriza el vector, en el que dicho dominio extracelular de CD4 comprende 1372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1; dicho dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta comprende 31-142 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3; dicho dominio citoplasmico del CD28 comprende 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; y/o dichos dominios citoplasmicos comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10.
En el primer aspecto y realizaciones anteriores, la invencion caracteriza el vector, en el que dicho siARN esta contra CCR5 o Tat/Rev.
En un segundo aspecto, la invencion caracteriza una celula anfitriona que comprende el vector del primer aspecto de las realizaciones anteriores.
En el segundo aspecto, la invencion caracteriza la celula anfitriona, en la que dicha celula anfitriona es una celula T.
En la anterior realizacion, la invencion caracteriza la celula anfitriona, en la que dicha celula anfitriona es una celula T CD8+.
En el segundo aspecto de la realizacion anterior, la invencion caracteriza una celula anfitriona, en la que dicha celula T se alsla de un paciente infectado con VIH.
En el segundo aspecto y en las realizaciones anteriores, la invencion caracteriza la celula anfitriona para uso en un metodo para el tratamiento de un paciente infectado con VIH.
En la anterior realizacion, la invencion caracteriza la celula anfitriona en el que dicha celula anfitriona es una celula T aislada de dicho paciente.
La invencion divulga una construccion de acido nucleico que codifica una protelna quimerica que incluye (i) un dominio extracelular de CD4 (por ejemplo, 1-372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1) o un fragmento de estos, (ii) un dominio de transmembrana, y (iii) un dominio citoplasmico que incluye el dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta (por ejemplo, un polipeptido que tiene los 31-142 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3), o un fragmento del mismo, y el dominio citoplasmico de CD28 (por ejemplo, un polipeptido que tiene los 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2), o un fragmento del mismo. En una realizacion, el dominio citoplasmico tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10.
La invencion divulga una construccion de acido nucleico que codifica una protelna quimerica que incluye (i) un dominio extracelular de CD4 (por ejemplo, un polipeptido que tiene 1-372 aminoacidos de SEQ ID NO: 1) o un fragmento del mismo, (ii) un dominio de transmembrana, y (iii) un dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta (por ejemplo, un polipeptido que tiene 31-142 aminoacidos de SEQ ID NO: 3), o un fragmento de los mismos.
En cualquiera de las anteriores divulgaciones, la protelna quimerica puede ser capaz de formar un homodlmero cuando se expresa en una celula T, por ejemplo, a traves de la formation de un enlace de disulfuro.
Tambien en cualquiera de las divulgaciones anteriores, los dominios de transmembrana pueden ser dominios de transmembrana de la cadena CD3 zeta (por ejemplo, un polipeptido que tiene 7-30 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3) o el dominio de la membrana/extracelular parcial de CD28.
Tambien en cualquiera de las divulgaciones anteriores, la protelna quimerica puede incluir una etiqueta c-myc (por ejemplo, en el terminal N).
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La invencion tambien divulga un vector que incluye cualquiera de las construcciones de acido nucleico descritas anteriormente. Este vector tambien puede incluir una construccion de acido nucleico que codifica un siARN (por ejemplo, contra CCR5 o contra Tat/Rev).
La invencion tambien divulga una celula anfitriona (por ejemplo, una celula T derivada de un paciente no infectado o celula T derivada de un paciente infectado con VIH) que contiene cualquiera de los vectores o construcciones de acidos nucleicos anteriores. Esta celula anfitriona tambien puede incluir una construccion de acido nucleico que codifica un siARN (por ejemplo, contra CCR5 o contra Tat/Rev).
La invencion tambien divulga un metodo para tratar un paciente infectado con VIH (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) al administrar una composicion que incluye cualquiera de las anteriores celulas anfitriones. En este aspecto, la celula anfitriona se puede aislar del paciente que se va a tratar o de otro paciente.
“Se une especlficamente” significa un dominio extracelular que reconoce y enlaza una protelna del VIH, pero que no se reconoce sustancialmente y une otras moleculas en una muestra, por ejemplo, una muestra de sangre humana.
“Tratar” significa aliviar una afeccion o slntoma de la afeccion (por ejemplo, los slntomas de la infeccion por VIH). Para “tratar el VIH” o referirse a administrar un tratamiento a un sujeto infectado con VIH para mejorar la afeccion del sujeto. Cuando se compara con un control no tratado equivalente, tal como el alivio o grado de tratamiento es de por lo menos el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 99%, o 100%, segun se mide por la carga vlrica de VIH del sujeto.
“Vector” significa una molecula de ADN, derivada usualmente de un plasmido o bacteriofago, en el que los fragmentos de ADN se pueden insertar o clonar. Un vector recombinante contendra uno o mas sitios de restriccion unicos, y pueden ser capaces de replicacion autonoma en un anfitrion definido u organismo vehlculo de tal manera que la secuencia clonada se pueda reproducir. Un vector contiene un promotor ligado funcionalmente a un gen o region de codificacion de tal manera, que luego de transfeccion en una celula receptora, se expresa un ARN o una protelna codificada.
“Celula T anfitriona” significa una celula (por ejemplo, una celula T humana aislada de un sujeto) en el que se introduce una o mas construcciones de acido nucleico.
“Receptor de celula T inmunitaria quimerica” o “CIR” significa una protelna de fusion que, cuando se expresa en una celula T, contiene un dominio extracelular que se une especlficamente a una protelna objetivo y un dominio citoplasmico que modula la activacion de las celulas T.
“Dominio extracelular CD4” significa un polipeptido que tiene la region de terminal-N del CD4 que se ubica por fuera de la membrana celular cuando se expresa en una celula T, por ejemplo, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de 1-372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. El termino “dominio extracelular de CD4” tambien significa que incluye cualquier fragmento de polipeptido que se une especlficamente al gp120 y es sustancialmente identico a los 1-372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 sobre la longitud del fragmento polipeptido.
Secuencia de Aminoacido CD4 Humano SEQ ID NO: 1
LOCUS NP 000607 458 aa PRI lineal 18 MAR 2010
DEFINICION
ACCESO
VERSION
DBSOURCE
precursor CD4 de glucoprotelna de superficie de celulas T [Homo sapiens]. NP_000607
NP_000607.1 GI:10835167 REFSEQ: acceso NM 000616.3
1 MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT
61 ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK
121 LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG
181 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE
241 QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL
301 LEAKTGKLHQ EVNLVVMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML
CTASQKKSIQ
IEDSDTYICE
KNIQGGKTLS
FSFPLAFTVE
HLTLPQALPQ
SLKLENKEAK
FHWKNSNQIK
VEDQKEEVQL
VSQLELQDSG
KLTGSGELWW
YAGSGNLTLA
VSKREKAVWV
361 LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW 421 RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR
STPVQPMALI
FQKTCSPI
VLGGVAGLLL
FIGLGIFFCV
“Dominio citoplasmico de CD28” significa un polipeptido que tiene la region C-terminal de CD28 que se ubica en el citoplasma cuando se expresa en una celula T, por ejemplo, un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos del 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2. El termino “dominio citoplasmico CD28” tambien significa que incluye cualquier fragmento de polipeptldico que mantiene la capacidad de modular la activacion de celulas T (por ejemplo, segun se determina utilizando el metodo titulado “muerte de celulas infectadas con VIH mediante celulas T
modificadas”) y es sustancialmente identico a los 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 sobre la longitud completa del fragmento polipeptldico.
Secuencia de Aminoacido CD28 Humano SEQ ID NO: 2:
LOCUS
NP 006130 220 aa lineal PRI 11-ABRIL-2010
5 DEFINICION Precursor CD28 de glucoprotelnas de superficie especifica de celulas T [Homo sapiens].
ACCESO
NP 006130
VERSION
NP 006130.1 GI:5453611
DBSOURCE REFSEQ: acceso NM_006139.2
1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD
61 SAVEVCWYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP
21 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVWG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR
181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS
10 “CD3 zeta” significa un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3. El termino “CD3 zeta” tambien significa que incluye cualquier fragmento de polipeptldico que conserva la capacidad de modular la activacion de celulas T (por ejemplo, como se determina utilizando el metodo titulado “muerte de celulas infectadas por VIH mediante celulas T modificadas”) y es sustancialmente identico a la SEQ ID NO: 3 sobre la longitud completa del fragmento de protelna.
15 Secuencia de Aminoacidos CD3 zeta humana de la SEQ ID NO: 3 LOCUS NP_000725 163 aa PRI lineal 11ABRIL2010
DEFINICION precursor de isoforma 2 de cadena zeta de receptor de celulas-T [Homo sapiens].
20 DBSOURCE REFSEQ: acceso NM_000734.3
1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD 61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP RRKNPQEGLY NELQKDKMAE 121 AYSEIGMKGE RRRGKGHDGL YQGLSTATKD TYDALHMQAL PPR
“ARN de interferencia pequena” o “siARN” significa una molecula de ARN aislada, de cadena sencilla o cadena doble que tiene por lo menos 15 nucleotidos, preferiblemente, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 nucleotidos de longitud e incluso hasta 50 o 100 nucleotidos de longitud (incluso de todos los enteros entre 25 ellos). Preferiblemente, el siARN es capaz de mediar el ARNi. Como se utiliza aqul, la expresion “media ARNi” se refiere a (indica) la capacidad de distinguir que ARN se van a degradar por los procesos o maquinaria del ARNi. El siARN se procesa a partir de dsARN largos y usualmente son de doble cadena (por ejemplo, siARN endogeno). El siARN tambien puede incluir ARN de horquilla corta en el que ambas cadenas de un siARN duplex se incluyen dentro de una molecula de ARN sencilla. Estos terminos incluyen ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla, ARN 30 aislado, as! como ARN alterado que difiere del ARN que se presenta en forma natural por la adicion, elimination, sustitucion y/o alteration de uno o mas nucleotidos.
“Sustancialmente identico” significa una secuencia de aminoacidos o acidos nucleicos que, cuando se alinean optimamente, utilizando por ejemplo los metodos descritos adelante, comparten por lo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con una segunda secuencia de 35 aminoacidos o acidos nucleicos. “Identidad sustancial” se puede utilizar para referirse a varios tipos de longitudes de
secuencia, tal como secuencia de longitud completa, epltopos o peptidos inmunogenicos, dominios funcionales, secuencias reguladoras y/o de codification, exones, intrones, promotores, y secuencias genomicas. El porcentaje de identidad entre dos polipeptidos o secuencias de acidos nucleicos se determina en diversas formas que estan dentro de la materia, por ejemplo, utilizando el software del ordenador publicamente disponible tal como Smith Waterman 40 Alignment (Smith andWaterman (1981) J Mol Biol 147:195-7); "BestFit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, (1981) 482-489) como se incorpora en GeneMatcher Plus™, Schwarz and Dayhof, Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhof, M.O., Ed (1979) 353-358; BLAST program (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul et al. (1990) J MolBiol 215: 403-10), software BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, o Megalign (DNASTAR). Adicionalmente, aquellos expertos en la tecnica pueden 45 determinar los parametros adecuados para medir la alineacion, que incluyen cualquier algoritmo necesario para
alcanzar la alineacion maxima sobre la longitud completa de las secuencias que se van a comparan. En general para protelnas o acidos nucleicos, la longitud de la comparacion puede ser cualquier longitud, hasta y que incluye longitud
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completa (por ejemplo, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90% 95% o 100%). Las sustituciones conservadoras normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; acido aspartico, acido glutamico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.
Otras caracterlsticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama que muestra la estructura de los receptores de celulas T inmunitarias quimericas (CIR) indicadas.
La figura 2 es un diagrama que muestra la organizacion de una construccion de acido nucleico de ejemplo que codifica un CIR de segunda generacion y la construccion siARN.
La figura 3 es una serie de graficas que muestran la expresion de superficie celular del CIR indicado. El PBMC se transduce con retrovirus y se tine con anticuerpos anti-CD4-FITC y anti-CD8-APC despues de cuatro dlas y se analizan mediante citometrla de flujo. El % de celulas CD8+ que expresan Hege CIR es 52%, primera generacion CIR es 44% y segunda generacion CIR es 39%. Se muestra un ejemplo representativo de cuatro.
La figura 4A es un par de graficas que muestran la supervivencia de los tipos de celulas indicados cuando se incuban con celulas CEM-SS infectadas con VIH en la relacion indicada.
Se cocultiva PBMC transducido con celulas CEM-SS infectadas con VIH o celulas CEM-SS no infectadas en una relacion de Efector a Objetivo (E:T) de 1:1 o 1:10. Allcuotas de las celulas se toman de los cultivos al dla tres y se tinen con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 como se describio anteriormente. Los datos mostrados son el % de celulas modificadas (CD8+CIR+) en cada punto de tiempo. Se muestra un representante de dos experimentos.
La figura 4B es un par de graficas que muestran el analisis de citometrla de flujo desde el dla tres para celulas Hege CIR. Las celulas T Hege CIR desaparecen (Hege+VIH, cuadrante superior derecho) cuando se cultivan en una relacion E:T de 1:10. % de celulas modificadas = (Q2/Q2+Q4) se muestran en cada grafica. (Q2 es el cuadrante superior derecho y Q4 es el cuadrante inferior derecho.)
La figura 5 es una grafica que muestra la supervivencia de celulas Hege CIR cuando se incuban con celulas CEM-SS infectadas con VIH en la relacion indicada en la presencia y ausencia de AZT. Se cocultiva PBMC transducido con celulas CEM-SS infectadas con VIH o celulas CEM-SS no infectadas en una relacion Efector a Objetivo (E:T) de 1:1 o 1:10. Las allcuotas de las celulas se tomaron de diferentes cultivos en el dla tres y se tineron con anticuerpos anti- CD4 y anti-CD8 como se describio para la figura 3. Los datos mostrados son el % de celulas modificadas (celulas CD8+CIR+) de un experimento.
La figura 6 es una serie de graficas que muestran la expresion de los marcadores indicados en las celulas indicadas cuando se exponen a VIH. Se cocultivan celulas T transducidas con CIR de primera y segunda region o no transducidas con celulas CEM-SS infectadas con VIH durante dos dlas y se tineron con anticuerpos anti-p24gag y anti-CD8. Se lavo una allcuota de celulas no tenidas y separa cultivo por otros nueve dlas y se tino con anticuerpos anti-CD8 y anti-p24gag. Se muestra un representante de dos experimentos. En el dla dos, celulas CD8+ infectadas mostraron una poblacion distinta (mostrada en el clrculo) en las celulas T de primera y segunda generacion en comparacion con celulas no transducidas. No hay poblacion de celulas vistas en celulas CD8+ no Td (dla dos, cuadrante superior derecho). El % de celulas modificado para este experimento es: primera generacion = 67% y segunda generacion = 68%.
La figura 7 es una grafica que muestra el porcentaje de muerte especlfica como una funcion de la relacion de las celulas efectoras a objetivo. Se cultivan celulas T de primer y segunda generacion Hege CIR, con celulas CEM-SS VIH-1 IIIB infectadas cronicamente o no infectadas etiquetadas 51Cr. Se determina la citotoxicidad de la liberation de 51Cr al medio de cultivo despues de 18 h de cocultivo en las relaciones indicadas de Efector a Objetivo, y se calcula el porcentaje de muerte especlfica como sigue: (experimento-control)/(control maximo) x 100. El % de celulas modificadas para Hege es 47%, para primera generacion es 25%, y para segunda generacion es 47%. Los datos mostrados son representativos de dos experimentos. Esto se calcula al tomar el valor medio del control CEM-SS como liberacion espontanea = (Expt-control)/(Max-control).
La figura 8 es un par de graficas que muestran la cantidad de secretion de la citoquina indicada en los tipos de celulas indicados. Se ensayan celulas T de primera y segunda generacion para detection de secrecion de interferon gamma (IFNy) o IL2 al cultivar durante 24 horas en placas recubiertas con anti-CD4 (5 pg/ml). Los datos se representan como el cambio de veces sobre primera generacion. Los datos de IL2 se muestran en promedio ±EEM de tres experimentos. Los datos de IFN-y se muestran en promedio ±EEM de dos experimentos. El % de celulas modificadas son similares para las celulas T de primera y segunda generacion.
Descripcion detallada de la invencion
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La invencion caracteriza
un vector que comprende construcciones de acido nucleico que codifican receptores de celulas T inmunitarias (CIR) quimericas que se utilizan para tratar VIH en pacientes. En general, el CIR contiene un dominio extracelular que se dirige a celulas VIH o infectadas con VIH (por ejemplo, el dominio extracelular de CD4), un dominio de transmembrana, y un dominio citoplasmico para mediar la activacion de celulas T (por ejemplo, CD3 zeta y/o el dominio extracelular parcial de CD28). La invencion tambien caracteriza celulas anfitrionas que expresan CIR para uso en el tratamiento del VIH. Cuando se expresan en celulas anfitriones, el CIR se disena con ingenierla para homodimerizar, aumentando por lo tanto su potencia. Estas celulas anfitrionas tambien contienen construcciones de acido nucleico que codifican siARN contra genes del VIH con el fin de, por ejemplo, interrumpir la infeccion por VIH de las celulas T anfitrionas. La estructura de un CIR de la tecnica anterior y las estructuras de los CIR que contienen el dominio de transmembrana de CD3 zeta y el dominio extracelular parcial del CD28 se describen en la figura 1.
Dominios Extracelulares
El CIR de la invencion caracteriza un dominio extracelular capaz de unir especlficamente VIH y celulas infectadas con VIH. La protelna de VIH gp 120 une el CD4 humano. Por lo tanto, el dominio extracelular del CIR de la invencion incluye el dominio extracelular de CD4 (por ejemplo, CD4 humano o fragmentos del mismo). El dominio extracelular, como se divulga aqul, puede incluir cualquier grupo funcional de union especlfico para VIH y celulas infectadas con VIH, que incluyen, anticuerpos especlficos para VIH (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla que son especlficos para gp120 o gp41).
El dominio extracelular puede incluir opcionalmente una etiqueta de protelna adicional, por ejemplo, una etiqueta c- myc (EQKLISEEDL (SEQ ID NO: 4) de origen humano, en el terminal N. La etiqueta c-myc no obstruye la union CD4 al gyp120. La inclusion de c-myc en el diseno de sFv basado en CIR no parece afectar la funcion CIR, pero puede facilitar estudios futuros de la construccion.
Dominios citoplasmicos
El CIR de la invencion tambien caracteriza un dominio citoplasmico para senalar la activacion de modulation de las celulas T anfitrionas cuando se unen a celulas VIH o infectadas con VIH. Los dominios citoplasmicos utiles para uso en el CIR de la invencion incluyen CD3 zeta, o fragmentos del mismo, y el dominio citoplasmico del CD28, o fragmentos del mismo. La invencion tambien caracteriza la fusion de protelnas derivadas de multiples dominios extracelulares para potenciar la activacion de celulas T cuando se unen a celulas de VIH o infectadas con VIH (por ejemplo, un dominio citoplasmico que incluye fragmentos activos de CD3 zeta y CD28).
Dominios de transmembrana
Los CIR de la invencion caracterizan dominios de transmembrana derivados de CD4, CD28, CD3 zeta, u otra protelna. Adicionalmente, el dominio de transmembrana (o los dominios extracelulares parciales, “pEC”) se pueden disenar para facilitar la homodimerizacion del CIR cuando se expresan en celulas T anfitriones. Esto se puede lograr, por ejemplo, con la adicion o sustitucion de residuos de cistelna capaces de formar enlaces de disulfuro con una molecula pareada.
La inclusion de la region de transmembrana de la cadena zeta o la transmembrana y dominio extracelular parcial de CD28 proporciona la capacidad de enlaces de disulfuro intermolecular. El CIR contienen estos dominios de transmembrana/extracelular parcial que se predicen para formar dlmeros ligados a disulfuro a traves de un residuo cistelna ubicado en la transmembrana de zeta o en el residuo cistelna proximo en el dominio extracelular parcial de CD28 (position 123 de CD28) que imita la configuration de dlmero de CD28 y zeta natural.
Construcciones de SiARN
Las construcciones de ADN y las celulas anfitrionas de la invencion tambien caracterizan componentes que suprimen la infeccion del VIH de celulas T anfitrionas. Dichos componentes incluyen construcciones de siARN para supresion de replication del VIH. Estas construcciones de siARN pueden ser especlficos para diversos objetivos de VIH (revisado en Morris (2006) Gene Ther 13:553-558; Rossi (2006) Biotechniques Suppl:25-29; Nekhai (2006) Curr Opin Mol Ther 8:52-61; and Cullen (2005) AIDS Rev 7:22-25). Un ejemplo es un siARN que se dirige a una secuencia altamente conservada en un exon comun para tat y rev, que se ha mostrado es efectivo para evitar la expresion y replicacion del virus (vease, por ejemplo, SEQ ID No. 1). Con el fin de evitar la infeccion por VIH de las celulas T anfitrionas, la invencion tambien caracteriza componentes para reducir la expresion de los correctores de celulas T (por ejemplo, CCR5 y CCR4). Dicha supresion se esperarla impida la infeccion de las celulas T cuando las personas con mutation CCR5A32 sean resistentes a infeccion por VIH. La invencion tambien caracteriza la inclusion de multiples construcciones de siARN (por ejemplo construcciones contra genes de VIH y receptores de celulas T utilizadas para infeccion por VIH). Aqul, una construccion siARN puede bloquear la infeccion y mientras tanto una segunda construccion de siARN evita la progresion de la infeccion.
Los metodos para disenar y expresar las construcciones de siARN son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, las construcciones de siARN de la invencion pueden utilizar ARN de horquilla larga (lhARN) para expresar el CCR5 y el Tat/Rev siARN. El uso de un lhARN es un metodo disponible para controlar la replicacion del VIH-1 en razon a que
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una unica transcripcion larga puede en teorla ser procesada en multiples siARN. Se puede alcanzar multiple objetivo a partir de un unico precursor de horquilla larga, lo que sugiere que multiples siARN se pueden procesar desde las horquillas largas in vivo. La construccion siARN de la invencion tambien puede incluir un promotor que dirige la expresion en celulas T. Ejemplos de dichos promotores son promotores U6 y tARN. Expresar shARN de los promotores tARN tiene diversas ventajas, en comparacion con los promotores U6 y H1 mas comunmente utilizados: promotores tARN son mas pequenos, proporcionan una variedad de opciones, y normalmente se expresan en niveles inferiores. Los promotores mas pequenos pueden ser deseables en las construcciones de acido nucleico de la invencion para facilitar la inclusion en un vector que incluye una construccion de expresion CIR. Un ejemplo de una construccion de acido nucleico que contiene CIR y siARN se establece en la figura 2.
Secuencias shARN
tat/rev shARN-cadena sentido SEQ ID NO:5 5' -GCGGAGACAGCGACGAAGAGC- 3'
Ref: Scherer, L. J., R. Frank, and J. J. Rossi. 2007. Nucleic Acids Res 35:2620-2628.
ccr5 shARN-cadena sentido SEQ ID NO:6 5' - GCCUGGGAGAGCUGGGGAA - 3'
Ref: Ehsani, Mol Ther Epub ahead of print. shARN dentro de CIR (SEQ ID NO: 7)
-Myc-CD4-CD28-zeta- tcaaggtggtggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg
Ligador Generico (G4S)3
GCCCGGATAGCTCAGTcGGTAGAGCACAGACTTTAATCTGAGGGTCCAGGGTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCA
Promotor tARN
GCCTGGGAGAGCTGGGGAATTTGTACGTAGTTCCCCAGCTCTCCCAGGC ccr5 sentido shARN Bucle shARN ccr5 shARN antisentido
ggtggcagtggctccggaggttcaggaagcggcggtagtgggagc Ligador generico (GGSGS)3
GCGGAGACAGCGACGAAGAGCCTTCCTGTCAGAGCGGAGACAGCCACGAAGAGCTTTTTGAA tat/reivindicacion sentido shARN shARN antisentido bucle tat/reivindicacion shARN secuencia terminadora Construcciones de acidos nucleicos
Las construcciones de acidos nucleicos comprendidas por el vector de la invencion son utiles para expresar las construcciones CIR y siARN en celulas T anfitriones. Las construcciones CIR y ARNsi se pueden incluir en una unica construccion de acido nucleico o multiples construcciones de acido nucleico. Con el fin de facilitar la transfeccion de celulas anfitriones, se puede incluir la construccion de acido nucleico en un vector vlrico (por ejemplo, un vector retrovlrico o vector adenovlrico) o se disenada para ser transfectada en una celula anfitriona a traves de medios electroporacion o medios qulmicos (por ejemplo, utilizando un reactivo de transfeccion de llpidos).
Ejemplos de construcciones de acidos nucleicos
Myc-CD4-zeta (primera generacion (dlmero)) SEQ ID NO: 8
AT GAACCGGGGAGTCCCTTTT AGGCACTT GCTTCTGGTGCT GCAACT GGC myc (subrayado)
CD4
GCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGGAGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGG ACCTGAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC TGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAA CCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCAT CCAAGCTGAATGATCGCGCTGACXCAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGA AAC TTTCCCCIGAT CAT CAAGAAT CT TAAGATAGAAGACTCAGATAC T TA CATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACC CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAG TCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGC TGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAG AAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGC CTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCC CACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGG CAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAA GAACAAGGAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCIAAGCTCCAGA TGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAG
TATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAA
GTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAGA
AAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTG
AGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGC
GGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTG
ACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGG
TCCACCCCGGTGCCTAGGCTGGATCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGG AATCCTCTTCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGAGTGA AGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAG C T C TATAAC GAGCTCAATC TAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGA CAAGAGAC GTGGCCGG GAC C C T GAGAT G G G G G GAAAG C C GAGAAG GAAGA AC C C T CAG GAAG G C C T G TACAAT GAAC T G CAGAAAGAT AAGAT G G C G GAG GCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCA CGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACG CC
—— zeta (subrayado)
5 Myc-CD4-CD28-zeta (segunda generation) SEQ ID NO: 9
AT GAACCGGGGAGTCCCTTTT AGGCACTT GCTTCTGGTGCT GCAACT GGC
mvc (subrayado) CD4
GCTCCTCCCAGCAGCCAC TCAGGGAGAGCAGAAGC TGATC TCCGAGGAGG
ACCTGAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC
TGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAA
CCAGATAAAGATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCAT
CCAAGC T GAAT GAT C GCGC T GAC T CAAGAAGAAGC C T T T GGGAC CAAGGA
AAC TTTCCCCTGATCATCAAGAATC T TAAGATAGAAGAC TCAGATAC T TA
CATCTGTGAAGTGGAGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTGCTAGTGTTCG
GATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACC
CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAG
TCCAAGGGGTAAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGC
T GGAGC T C CAGGATAG T GGCAC C T GGACAT GCAC T GT C T T GCAG AAC CAG
AAGAAGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGC
CTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAGTTCTCCTTCC
CACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGG
CAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAA
GAACAAG GAAG T G T C T G TAAAACGGGT TACCCAGGACCC TAAGC TCCAGA
TGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAG
TATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCCCTTGAAGCGAAAACAGGAAA
GTTGCATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAGAGCCACTCAGCTCCAG
AAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGC
TGAGCT TGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTC TCGAAGCGGGAGAAG
GCGGTGTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAG
TGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACAT
CD28 (subrayado)
zeta
GGTCCACCCCGGTGCCTAGGAAAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTAC C T AGAC AAT GAGAAG AGC AAT GG AAC C AT T ATCC AT G T G AAAGGG AAAC A CCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGC TGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTG GCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAG TGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATT ACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTG AAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCA GCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGG AC AAGAGAC GTGGCCGG GAC C C T GAGA T G G G G G GAAAG C C GAGAAG G AAG AAC C C T C AGG AAGG C C T G T AC AAT G AAC T G C AG AAAG AT AAG AT G G C GG A GGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC AC GAT G G C C T T T AC CAGGG T C T CAG TACAG C CAC CAAG GACAC C TAC GAC GCC
5 La secuencia de aminoacidos para las porciones CD28 y CD3 zeta para la construccion de segunda generation es
KIEV Met YPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDY Met
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SEQ ID NO: 10 Celulas T anfitrionas
Las celulas T anfitrionas de la invention se pueden aislar de, por ejemplo, un paciente infectado con VIH. Las celulas T anfitrionas se trasfectan o infectan con construcciones de acido nucleico comprendidas por el vector de la invencion (por ejemplo, construcciones de acidos nucleicos que codifican un CIR y una o mas construcciones de siARN). Antes de la administration a un paciente, las celulas T se pueden expandir en el cultivo celular. En una realization, las celulas T modificadas se administran al paciente desde el cual se aislaron originalmente.
En una realizacion, los PBMC se alslan mediante tecnicas estandar y se transducen con un CIR. Las celulas se administran al paciente en una dosis comprendida de entre 109 y 1010 celulas (por ejemplo, 109, 5 x 109, o 1010 celulas). Las celulas se pueden aislar una vez y expandir para multiples administraciones y/o se puede realizar una transduction y aislamiento separado con cada ronda de tratamiento.
El tratamiento puede ser, por ejemplo, un unico tratamiento, tratamiento mensual, tratamiento semianual o un tratamiento anual.
Etapas Adicionales
Antivlricos adicionales pueden ser, por ejemplo, un inhibidor de proteasa, un inhibidor de transcriptasa inversa, un inhibidor de integrasa, un antagonista CCR5, un inhibidor de fusion, o un inhibidor de segunda maduracion. El agente antivirico adicional puede ser, sin limitation, azidovudina (AZT), didanosina (dideoxiinosina, ddl), d4T, zalcitabina (dideoxicitosina, ddC), nevirapina, lamivudina (epivir, 3TC), saquinavir (Invirasa), ritonavir (Norvir) Indinavir (Crixivan) y delavirdina (Rescriptor).
Terapias adicionales
Los metodos de la invencion se pueden combinar con, por ejemplo, linfodeplecion de antes de la administracion de celulas T anfitrionas. Adicionalmente, el tratamiento tambien puede incluir la administracion de una o mas citoquinas, por ejemplo IL-2, IL-7, e IL-15.
Resultados experimentales
Construction de vectores retrovlricos
El receptor de celulas T inmunitarias (CIR) quimerico de los ensayos de celulas T disenadoras anti-VIH anteriores tienen la estructura de dominio extracelular de CD4 (un polipeptido que corresponde a los 1-327 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1), el dominio de transmembrana CD4 (un polipeptido que corresponde a los 373-395 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1) y dominio citoplasmico de zeta (un polipeptido que corresponde a los 31-142 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3) (Deeks et al. (2002) Mol Ther 5:788-797, Mitsuyasuet al. (2000) Blood 96:785-793) (aqul “Hege CIR”, Figura 1). Tambien designamos un CIR de una sola senal que es similar al Hege CIR, excepto que el dominio de transmembrana de zeta (un polipeptido que corresponde a los 7-30 residuos de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3) se sustituye (primera generation CIR, Figura 1). Finalmente, creamos una construccion que integra el CD28, as! como serialization zeta en un formato de dos senales (segunda generacion CIR, Figura 1). Esto emplea el mismo dominio extracelular de CD4 (un polipeptido que corresponde a los 1-372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1) con un dominio extracelular parcial/dominio de transmembrana/dominio citoplasmico de CD28 (un polipeptido que corresponde a los 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2) y se expresa como dlmero.
Adicionalmente, tambien se incluye una etiqueta c-myc (EQKLISEEDL) de origen humano en nuestras construcciones en el terminal N del CD4.
Se construyen CIR de primera y segunda generacion en el vector retrovirus MFG. Se crean retrovirus mediante “ping pong’’ entre estirpes de celulas anfotericas PG13 y ecotropicas E+86. La PG13 es una estirpe de celulas auxiliares derivadas de fibroblastos de murino que se utiliza para crear celulas productoras de vectores (VPC) para production retrovlrica. Las VPC se almacenan para mayor expresion transgenica y los sobrenadantes vlricos se cosechan como describe Beaudoin et al. ((2008) J Virol Methods 148:253-259).
Expresion de CIR
Se utilizan sobrenadantes vlricos de PG13 VPC para transducir PBMC humano. El PBMC de individuos normales saludables se purifica y activa con anticuerpo anti-CD3 (OKT3) y 100 U/ml IL2 durante dos dlas y se transduce con
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retrovirus mediante espinoculacion sobre una placa recubierta con retronectina. Se determina la expresion de superficie de CIR en celulas T CD8+ mediante tincion doble para CD8 y CD4 y se determina el Indice de transduccion (como % de celulas modificadas, Figura 3). La transduccion de celulas T humanas activadas rutinariamente produjo 40 a 70% de Indices de transduccion con estos CIR anti-VIH.
Cocultivamos celulas T transducidas o no transducidas con CEM-SS VIH+ (cronicamente infectados con VIH-1 IIIB) o celulas VIH (en una relacion E:T de 1:1 o 1:10). Determinamos la presencia de celulas transducidas en el cultivo mediante tincion con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD4. El cocultivo de celulas T Hege CIR con celulas CEM-SS VIH+ en una relacion E:T de 1:10 indujo muerte celular y todas las celulas Hege CIR desaparecieron del cultivo en el dla 3 (Figura 4). En una relacion E:T de 1:1, las celulas T Hege CIR aun estuvieron presentes en el cultivo en el dla 13, con muerte en todas las celulas objetivo en el cultivo (observado mediante analisis de citometrla de flujo). Se observo muerte celular en las celulas T disenadoras Hege CIR que se puede deber a la mayor sensibilidad a muerte de celulas inducidas por activacion (AICD) o a infeccion por VIH. Para probar esto, se trataron celulas Hege CIR con farmaco anti- retro vlrico AZT y se cocultivan con celulas CEM-SS infectadas con VIH. Las celulas Hege CIR tratadas AZT no murieron cuando se cocultivaron con una mayor relacion objetivo (1:10, Figura 5). Estos datos de farmacos sugieren que las celulas Hege CIR se infectaron con VIH y murieron por apoptosis inducida por VIH, o murieron por otras celulas T que contenlan CIR (fratricidas). Estos datos sugieren y planteamos la hipotesis de que una de las razones para la falla del Hege CIR en los ensayos cllnicos esto se puede deber a la mayor susceptibilidad de los pacientes a eliminacion e infeccion por VIH.
Susceptibilidad de celulas T disenadoras para infeccion por VIH
Celulas T CD4+ infectadas con VIH al unirse al receptor CD4 y un correceptor (CXCR4 o CCR5). En razon a que el CIR tiene un dominio CD4 extracelular, postulamos que esto puede ser utilizado por el VIH para infectar todas las celulas T CIR+, que incluyen celulas T CD8+. La infeccion por VIH de las celulas CIR+ CD8+ se determina mediante cocultivo de celulas T que contiene CIR con celulas VIH+ CEM-SS y tincion para antlgeno p24-gag, un indicador de infeccion productiva. Despues de dos dlas de cultivo, se tinen las celulas con anticuerpos anti-CD8 y anti-p24gag. En contraste a cultivos no transducidos, se infectan celulas CD8+ con VIH en cultivos transducidos (primera y segunda generacion) (Figura 6). En el dla 11 no detectamos ninguna celula CD8+ infectada con VIH, en ninguna de las celulas T que contienen CIR de primera y segunda generacion (Figura 6).
Muerte de celulas infectadas con VIH por celulas T modificadas.
Con el fin de comparar las potencias de Hege CIR, anti-VIH CIR de primera y segunda generacion, en muerte de celulas objetivo, se transducen celulas T activadas como se describio anteriormente. Se marcan celulas objetivo (celulas CEM-SS infectadas con VIH o no infectadas) con 51Cr durante 5 horas (50 pCi para 1 x 106 celulas) y se cocultivan con celulas T transducidas en relaciones E:T indicadas durante 18 horas. Las celulas T Hege CIR y nuestras celulas T disenadoras de primera y segunda generacion tenlan todas igual potencia en la muerte de las celulas objetivo VIH+ (Figura 7)
Secrecion de citoquinas por celulas T modificadas.
Se ensayaron celulas T humanas transducidas con CIR de primera y segunda generacion que contienen celulas T por su capacidad para secretar citoquinas luego de estimulacion a traves del CIR. Celulas T transducidas o no transducidas se cultivan en placas recubiertas con anticuerpo anti-CD4 durante 24 horas. Se mide la secrecion IL2 con un kit ELISA. Celulas T de segunda generacion producen mas IL2 que las celulas T de primera generacion cuando se estimulan con anticuerpo anti-CD4 (Figura 8). En contraste, la secrecion de IFNy es similar con estimulacion anti-CD4 de celulas T disenadoras de primera y segunda generacion, como es tlpico para la senalizacion de celulas T.
Conferir resistencia de celulas T de disenador a infeccion por VIH
El VIH infecta celulas T CD4+ al unirse al receptor CD4 y al correceptor (CXCR4 o CCR5). Como se mostro anteriormente, las celulas CD8+CIR+ (primera y segunda generacion) son susceptibles a infeccion por VIH (dla dos, figura 6). En el dla 11 no detectamos ninguna celula CD8+ infectada por VIH, en las celulas T de primera o segunda generacion (Figura 6). Estos datos sugieren que las celulas T modificadas pueden matar a otras celulas T modificadas infectadas con VIH. No obstante, esto es una fuente potencial de perdida de celulas efectoras para combatir el VIH y proporcionar un nuevo deposito para aumentar la carga de VIH del paciente. Por lo tanto es importante eliminar o reducir el potencial del VIH para infectar celulas T modificadas.

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un vector que comprende:
    a) una construccion de acido nucleico que codifica una protelna quimerica que comprende
    (i) un dominio extracelular de CD4, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento se une especlficamente al gp120,
    (ii) un dominio de transmembrana, y
    (iii) un dominio citoplasmico que comprende
    a) el dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta, o un fragmento del mismo, en el que el fragmento modula la activacion de celulas T, y
    b) el dominio citoplasmico de CD28, o un fragmento del mismo; en el que el fragmento modula la activacion de las celulas T,
    en el que dicha protelna quimerica es capaz de formar un homodlmero cuando se expresa en una celula T, y
    b) una construccion de acido nucleico que codifica un siARN especlfico para un gen de VIH, en el que el siARN es capaz de suprimir la replicacion por VIH.
  2. 2. El vector de la reivindicacion 1, en el que las protelnas quimericas dimerizadas son capaces de formar por lo menos un enlace disulfuro.
  3. 3. El vector de la reivindicacion 1, en el que dicho dominio de transmembrana comprende un polipeptido seleccionado del grupo que consiste del dominio de transmembrana de la cadena CD3 zeta y el dominio de transmembrana de CD28.
  4. 4. El vector de la reivindicacion 3, en el que dicho dominio de transmembrana comprende 7-30 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3.
  5. 5. El vector de la reivindicacion 1, en el que dicha protelna quimerica comprende adicionalmente un marcador c-myc.
  6. 6. El vector de la reivindicacion 1, en el que dicho dominio extracelular de CD4 comprende 1-372 aminoacidos de la SEQ ID NO: 1; dicho dominio citoplasmico de la cadena CD3 zeta comprende 31-142 aminoacidos de la SEQ ID NO: 3; dicho dominio citoplasmico de CD28 comprende 127-234 aminoacidos de la SEQ ID NO: 2; y/o dicho dominio citoplasmico comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 10.
  7. 7. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho siARN esta contra CCR5 o Tat/Rev.
  8. 8. Una celula anfitriona que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
  9. 9. La celula anfitriona de la reivindicacion 8, en el que dicha celula anfitriona es una celula T.
  10. 10. La celula anfitriona de la reivindicacion 9, en el que dicha celula anfitriona es una celula T CD8+.
  11. 11. La celula anfitriona de la reivindicacion 9 o 10, en el que dicha celula T se alsla de un paciente infectado con VIH.
  12. 12. La celula anfitriona de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para uso en un metodo para el tratamiento de un paciente infectado con VIH.
  13. 13. La celula anfitriona para uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde dicha celula anfitriona es una celula T aislada de dicho paciente.
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