FI120264B

FI120264B - Membraaniin sitoutunut kimeerinen respetoriproteiini

Info

Publication number: FI120264B
Application number: FI963150A
Authority: FI
Inventors: Brian Seed; Babak Banapour; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1996-08-12
Publication date: 2009-08-31
Also published as: HUT75375A; EP0750457A4; CN1146136A; CA2182890C; DE69534589T2; US5851828A; US7094599B2; FI963150A0; MX9603384A; IL112390A; FI963150A; EP0750457A1; HU9602182D0; JP3832850B2; WO1995021528A1; KR970701004A; BR9506783A; NZ279123A; ES2249766T3; US20030138410A1

Description

Meiabraaniin sitoutunut kinueerinen respetoriproteiini

Keksinnön alue Tämä keksintö tehtiin hallituksen tuella sopimuksen 5 nro AI 27849 mukaan, jonka myönsi instituutti National Institutes of Health. Hallituksella on tiettyjä oikeuksia tähän keksintöön.

Keksintö koskee CD4-fragmenttien ja immuunisolu-reseptprien välisiä toiminnallisia kimeerejä, jotka kykene-10 vät ohj aamaan immuunisolujen aiheuttaman HI-viruksella infektoituneiden solujen lyysin, mutta jotka eivät tee im-muunisöluista HI-virusinfektiolle herkkiä. Näin ollen keksintö mahdollistaa uuden ja tehokkaan HI-virushoidon.

Keksinnön tausta 15 Antigeenin ?-soluturrnistus T-solureseptorin väli tyksellä on useiden immunologisten ilmiöiden perusta. T-so-lut ohjaavat niin kutsuttua soluvälitteistä immuniteettiä.

Tämä sisältää vieraan kudoksen tai infektoituneiden solujen hajottamisen immuunisysteemin solujen toimesta. On olemassa 20 useita erilaisia T-soluja sisältäen "auttajasolut" ja " suppressor is olut jotka moduloivat immuunivastetta, ja

Sytotoksiset solut (tai "tappajasolut"), jotka voivat tappaa epänormaalit solut suoraan.

T-solu, joka tunnistaa sellaisen uniikin antigeenin ! 25 ja sitoutuu siihen, joka on toisen solun pinnalla, aktivoi- \ tuu; sitten se voi jakaantua ja jos se on sytotoksinen so- ) lu, se voi tappaa sitoutuneen solun.

Hiv ja inmtunopatogeneesi

Vuonna 1984 HI‘-viruksen, osoitettiin olevan AIDS:n 30 etiologinen tekijä. Siitä lähtien. AIDS*n määritelmää on muutettu useita kertoja mitä tulee niihin kriteereihin, joita tulee sisällyttää diagnoosiin. Kuitenkin, huolimatta f diagnostisten parametrien vaihtelusta, yksinkertainen yhteinen nimittäjä AIDS:He on infektoituminen Hl-viruksella § 35 ja sen jälkeinen jatkuva yleisoireiden ja AIDS:lie tyypillisten tautien, kuten sekundaari-Infektoiden, kasvainten ja •ϊ '2' neurologisen taudin, kehittyminen. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. painos, McGraw Hill {1991) .

HIV on lentivirtisteri ryhmään kuuluva ihmisen retrovirus. Heljä tunnettua: ihmisen retrovirus ta kuuluvat kah-5 teen eri ryhmään; ihmisen T-lymf o trooppiset (tai leukemia:) retrovirukset HTLV-1 ja HTLV-2, ja ihmisen immuunipuutosvirukset HIV-1 ja HIV-2, Edelliset ovat transformoivia viruksia, kun taas jälkimmäiset ovat sytopaattisia viruksia.; HIV-1-viruksen On tunnistettu olevan yleisin AIDS;n 10 aiheuttaja maailmassa. HIV-2- ja HIV-1-virusten sekvenssi- homologia on noin 40 % niin, että HIV-2 on läheisemmin sukua joidenkin apinan immuunipuutosvirusten (SIV) ryhmän jäsenten kanssa. Katso Curran, J. et ai., Science 3291 1357 -1359 (1985); Weiss, R. et ai., Nature 324; 572 - 575 15 (1986).

Hl-virukseila on tavalliset retrovirusgeenit (env, gag ja pol) kuin myös kuusi ylimääräistä geeniä, jotka ottavat osaa viruksen replikaatioon ja muihin biologisiin aktiivisuuksiin. Kuten aiemmin on mainittu, AIDSrn yhteinen 20 nimittäjä on perusteellinen immuunisuppressio, pääasiani- ! sesti soluvälitteisen immuniteetin immuunisuppressio. Tämä s immuuni s uppr e s s i o johtaa erilaisiin opportunistisiin tau- j teihin, erikoisesti tiettyihin infektioihin ja kasvaimiin. j

Aibs-n immuunipuutoksen pääasialliseksi aiheutta- ! 25 jaksi on tunnistettu kateenkorvasta peräisin olevien {T) j lymfosyyttien alaryhmän, T4-populaation, kvantitatiivinen ja kvalitatiivinen puutos. Tämä solujen alaryhmä määritel- ] iään fenotyyppisesti niin, että sillä on CD4-pintamole- \ kyyli, jonka on osoitettu olevan solureseptori HI-viruk-30 sei le.. Dalgleish et ai., Nature 312: 763 (1984). Vaikka T4- f

solu on pääasiallinen solutyyppi, jonka HI-virus infektoi, J

oleellisesti mikä tahansa ihmisen solu, joka ekspressoi I

CD4-molekyyliä pinnalleen, kykenee sitoutumaan HI-virukseen j ja infektoitumaan sillä. s j 3

Traditionaalisesti CD4+-T-soluj en on ajateltu toimivan auttaja/indusoijasolun roolissa., joka esittää niille roolin, joka toimittaa aktivaatiosignaalin B—soluille, tai joka indusoi sellaisia T-lymfosyyttejä, joissa on resi-5 prookkinen CD;8-markkeri, muuttumaan sytotoksisiksi/suppres-soiviksi soluiksi, Reinherz ja Schlossman, Cell 19: 821 - 827 (1980); Goldstein et ai., Immunol. Rev. 68: 5 - 42 (1982).

HIV sitoutuu spesifisesti ja korkealla affinitee-10 tiliä viruksen vaipassa sijaitsevan aminohappqket jun (gpl2Ö) välityksellä osaan CD4-molekyylin Vl-aluetta, joka sijaitsee lähellä sen N-päätä. Kun on sitoutunut, virus fuusioituu kolidesolumembraanin kanssa ja se otetaan soluun sisään. Kun on otettu solun sisään, se käyttää käänteisko-15 pioijaentsyymiä sen genomisen KNA:n transktiptoimiseksi DHÄ;ksi, joka integroidaan solun DNA:hän, jossa se säilyy koko solun eliniän "proviruksena".

Provirus voi olla latenttina tai se voi aktivoitua niin, että sen mRNA ja genominen RNA transkriptoidaan, joka } 20 johtaa proteiinisynteesiin, kokoamiseen, uuden virionin i muodostumiseen ja viruksen silmukoitumiseen solun pinnalta, j

Vaikka tarkkaa mekanismia, jolla virus indusoi solukuole- j man, ei ole saatu selville uskotaan, että pääasiallinen me- ] kanismi on massiivinen viruksen silmukoituminen solun pin- j 25 naita, joka johtaa plasmamfembraanin hajoamiseen ja osmoottiseen epätasapainoon, :

Infektion aikana i s ant äo rgan ismi kehittää vasta- | aineita viruksen proteiineja vastaan, sisältäen, pääasiani- | set vaippaglykoproteiinit gpl20 ja gp41. Huolimatta tästä 30 humoraalisesta immuniteetista, tauti etenee johtaen letaa- 1 li in immunosuppressidon, j olle on ominaista useat oppor- j tunistiset infektiot, parasitemia, dementia ja kuolana. Se, j että isännän anti~virus-vasta-aineet eivät onnistu estämään ; taudin etenemistä, edustaa yhtä harmillisimmista ja hälyt- ;l 35 tävimmistä infektion puolista ja on epäedullinen merkki j 4 niille rokoteyrityksille, jotka perustuvat tavanomaisiin lähestymistapoihin^.

Kahdella tekijällä voi olla rooli immuunipuutasvi-ruksia vastaan tapahtuvan humoraalisen vasteen tehokkuudes-5 sa. Ensiksi:, kuten muut RNA-virukset (ja kuten erityisesti retrovirukset), iiMiuunipuutosvirukset sisältävät korkean mutaationopeuden vasteena isännän immuunivalvonnalle. Toi» seksi vaippaglykoproteiinit itsessään ovat erittäin gly-kosyloituja molekyylejä, joissa on ainoastaan muutamia epi-10 tooppeja, jotka sopivat korkean affiniteetin sisältävän vasta-aineen sitoutumiseen. Huonosti antigeeninen kohde, jollainen viruksen vaippa on, antaa isännälle ainoastaan vähän mahdollisuuksia rajoittaa virusinfektiota spesifisiä vasta-aineita tuottamalla.

15 Solut, jotka ovat infektoituneet HI-viruksella, ekspressoivat gpl20-glykoproteiinia pinnalleen. Gpl20-proteiini välittää fuusiotapahtumat CD4+-solujen kesken reaktiolla, joka on samaniainen kuin se, jolla virus saapuu in-fektoitumattomiin soluihin, joka johtaa lyhytikäisten moni-20 tumäisten jättisolujen muodostumiseen. Solusitkoksen muodostuminen riippuu gpl20-vaippaglykoproteiinin suorasta interaktiosta CD4-proteiinin kanssa, Dalgleish et ai., yllä; Klatzman, D. et ai. , Nature 312: 763 (1984); McDougal, J.

S. et ai.. Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et ai., 25 Nature 322: 470 (1986); Lifson, J. D. et ai,, Nature 323: 725 (1986); Sodroski, J. et ai,, Nature 321: 412 (1986).

Todiste siitä, että CD4- gpl20-sitoutuominen on vastuussa sellaisten solujen virusinfektiosta, jotka sisältävät CD4-antigeenin, sisältää sen havainnon, että gpl20- ja 3Ö GD4-proteiinien välille muodostuu spesifinen.kompleksi. Me-

Dougal et ai. , yllä. Muut tutkijat ovat osoittaneet, että solulihjat, joita HI-virus ei infektoinut, muuttuivat infektoituviksi solulinjoiksi, kun ne transfektoitiin ihmisen CD4-cDNA-geenillä ja sitä ekspressoitiin niissä. Maddon et 35 ai., Cell 46: 333 - 348 ¢1986).

5

Terapeuttisia ohjelmia, jotka perustuvat siihen, että liukoinen CD4-proteiini toimii passiivisena aineena häiriten viruksen adsorptiota ja solusitkosvälitteistä so-lutransmissiotä, on ehdotettu ja onnistuneesti osoitettu in 5 vitro useiden ryhmien toimesta {Deen et ai., Nature 331: 82 ~ 84 (1988) ; Fisher et ai ,, Nature 331: 76 - 78 (1988) ;

Hussey et ai.. Nature 331: 78 - 81 (1988); Smith et ai.,

Science 238: 1704 - 1707 (1987}; Traunecker et ai., Nature 331: 84 - 86 (1988)]; ja myöhemmin on kehitetty CD4- 10 immunoglobuliinifuusiopiOteiinit, joilla on pidentynyt puo li-ikä ja kohtuullinen biologinen aktiivisuus [Capon et ai., Nature 337: 525 - 531 (1989) ; Traunecker et ai,, Nature 339: 68 - 70 (1989) ; Bym et ai., Nature 344: 667 -670 (1990); Zettlmeissl et ai,, DNA Cell Biol. 9: 347 - 353 15 (1990)3. Vaikka CD4-immunotDksiinikonjugaatit tai -fuusio- proteiinit sisältävät vahvan sytötoksisuuden infektoituneita Soluja vastaan in vitro [Chaudhary et ai., Nature 335: 369 - 372 (1988); Till et ai. , Science 242: 1166 - 1168 (1988)], immuunipuutos syndrooman latenttlsuus tekee epäto-20 dennäköiseksi sen, että mikään yksittäisannosterapia olisi tehokas elimihoimäan viruskuormituksen, ja vieraiden fuu-sioproteiinien antigeenisyys todennäköisesti rajoittaa niiden hyväksyttävyyttä hoidoissa, joissa vaaditaan toistuvaa annostusta. SX-viruksella infektoituneiden apinoiden hoito-25 yritykset ovat osoittaneet, että liukoisen CD4-proteiinin anto eläimille, joilla ei ole merkittävää CM-sytopeniaa, voi alentaa SIV-tiitteriä ja parantaa myelöidipotentiaälin in vitro mittauksia [Watanabe et ai,, Nature 337: 267 - 270 (1989}3. Nopea viruksen uudelleen ilmestyminen havaittiin 3:0 kuitenkin sen jälkeen, kun hoito lopetettiin, joka antaa ehdottaa, että elämänpituinen anto voi olla tarpeen progressiivisen immuunisysteemin heikentymisen estämiseksi.

T-solu- ja Fc-reseptorit T-soluantigeenireseptorin (TCR) yleisimmän muodon 35 ekspressio solupinnalle vaatii ainakin kuuden erilaisen po-lypeptidiketjun [Weiss et ai., J. Exp. Med. 160: 1284 - $ 6 1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606 - 609 (1985); Sussman et al,, Cell 52; 85 - 95 (1988)], α/β- antigeeniin sitoutuvien ketjujen, kolmen CD3-kompleksin po-lypeptidin ja ζ-proteiinin, yhtäaikaisen ekspression. Jos 5 jokin ketjuista ei ole läsnä, kompleksin jäljelle jääneiden jäsenten stabiilia ekspressiota ei tapahdu, ζ on rajoittava polypeptidi täydellistä kompleksin pintaekspressiota varten [Sussman et al.. Cell 52: 85 - 95 (1988)] ja sen ajatellaan välittävän ainakin osaa niistä soluaktivaatio-ohjelmista, 10 jotka ligandin reseptoritunnistus saa aikaan [Weissman et ai.,. EMBO J. 8: 3651 - 3656 (1989); Frank et al..·, Science 249 ; 174 - 177 (1990) ] . 32 kDa kokoinen tyypin I integraali nen membraanihomodimeeri ζ (seta) sisältää yhdeksän jäännöksen pituisen solunulkoisen domeenin, jossa ei ole N-15 sidokseliisia glykaanin lisäyskohtia, ja 112 jäännöksen (hiiri) tai 113 jäännöksen (ihminen) pituisen solunsisäisen domeenin [Weissman et al., Science 238: 1018 - 1020 (1988);

Weissman et al., Proc. Natl... Acad. Sei. USA 85: 9709 - 9713 (1988)]. ζ-proteiinin isomuoto, jota kutsutaan nimellä g 20 (eta) [Baniyäsh et al,, J. Biol. Chem. 263: 9874 - 9878 (1988) ; Örloff et al., J. Biol. Chem. 264; 14812 - 14817 1 (1989) ], joka syntyy vaihtoehtoisella mRNA-silmukointi- j reitillä: [Jin et al., Proc, Natl. Acad. Sei. USA 87: 3319 - j 3233 (1990)], on läsnä alentuneina määrinä soluissa, jotka 2 5 ekspressoivat antige.eniresept.0ria. ζ-η-heterodimeerien on ajateltu välittävän inpsitolifosfaattien muodostusta kuin j myös reseptorin aloittamaa ohjattua soiukuolemaa, jota kut- 1 sutaan apoptoosiksi [Mereep et al., Science 242: 571 - 574 \ {1988); Mercep et al,;,; Science 246: 1162 - 1165 (1989)]. j 30 Kuten ζ- ja η-proteiineja, Fc-reseptoriin liittynyttä y-ketjUa ekspressoIdaan solupintakomplekseina, joissa | on mukana lisäpolypeptidejä, joista jotkin välittävät li- | gandin tunnistusta ja joista muilla on tuimistamatön toi- | mint a. γ (gamma) sisältää hpmpdimeerisen rakenteen ja koko- i| 35 nais organisaation, joka on hyvin samanlainen ζ-proteiinin ;j vastaavaan verrattuna ja joka on osa sekä mastosolu/baso- | '1 7 fiilisolun korkean affiniteetin IgE-reseptoria FcsRI, joka Sisältää ainakin kolme erilaista polypeptidiketjua [Blank et ai., Nature 337:: 187 - 189 (1989),· Ra et ai., Nature 241: 752 - 754 {1989} ], että yhtä IgG-prOteiinin matala- 5 af fiinistä reseptoria, jota hiiressä kutsutaan FcyRIIoc- proteiiniksi [Ra et ai., J. Biol. Chem. 264: 15323 - 15327 {1989}} ja ihmisissä makrofaagien ja luonnollisten tappajasolujen CDl6-alatyypin ekspressoimaksi proteiiniksi CDl6Ti.j (CDlS-transmembraarii) [Laiiier et ai., Nature 342: 10 8Q3 - 805 (1989); Anderson et ai.., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 87: 2274 - 2278 (1990)] ja yhden sellaisen polypepti- din, jonka toiminta on tuntematpn [Anderson et ai., Proc. Natl>: Acad. Sei. USA 87: 2274 - 2278 (1990)]. Äskettäin on julkaistu, että y-proteiinia ekspressoidaan hiiren T~ 15 solulinjassa CTL, jossa se muodostaa homodimeereitä kuin myös γ-ζ- ja γ-η-heterodimeereitä [Qrloff et ai., Nature 347: 189 - 191 (1990)] .

Fc-reseptorit välittävät immuunikompleksien fagosy-toosia, transsytoosia ja vasta-aineriippuvaista solusyto-20 toksisuutta (ADCC)[Ravetch ja Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457 - 492 (1991); Unkeless et ai., Annu. Rev. Immunol. 6: 251 - 281 (1988) ja Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16 -25 (1988)]. Äskettäin on osoitettu, että yksi hiiren mata-la-affUnisista Fc-reseptorimuodoista, FcRylllBl, välittää 25 Ig-päällystättyjen kohteiden internalisaatiota klatriini- päällystettyihin kuoppiin, ja että toinen matala-affiininen reseptori, FcrylliA, välittää ADCC-tapahtumaa liittymällä pienen laukaisinmolekyyliryhmän yhden tai useamman jäsenen kanssa [Miettinen et ai., Cell 58: 317 - 327 (1989) ; ja 30 Hunziker ja Mellmän, J. Cell. Biol. 109: 3291 - 3302 (1989)]. Nämä laukaisinmolekyylit, T-solureseptorin (TCR) ζ-ketju, TCR-g-ketju ja Fc-reseptorin γ-ketju interaktoivat immuunisysteemin eri reseptorien ligandia tunnistavien do-meenien kanssa ja voivat autonomisesti aloittaa solueffek-35 toriohjelmat sisältäen sytolyysin, jota seuraa aggregaatio [Samelson et ai. , Cell 43: 223 - 231 (1985); Weissman et 8 ai.. Science 239: 1018 - 1Ö2Q {1988}; Jin et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 87: 3319 - 3323 {1990); Blank, et ai., Nature 337: 187 - 189 (1989),- Banier et ai., Nature 342: 803 - 805 (1989) ; Kurosaki ja Ravetch, Nature 342: 805 - 5 807 (1989); Hibbs et ai., Science: 246.: 1608 - 1611 (1989);

Anderson et ai., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 87: 2274 - 2278 (1990); ja Irving ja Weiss, Cell 64: 891 - 901 {1991:)] .

Kuitenkin, kun on tehty vertailuja hiiren ja ihmisen matala-affiinisten Fe-reseptoriryhinien välillä, on tul-10 lut selväksi, että ihmisen FcRyllA- ja: -C-isomuodoillä ei ole vastinetta hiiressä. Johtuen osaksi tästä niiden toimintaa ei ole vielä määritetty.

Koska ainoastaan CD.4-proteiiniin perustuvilla huffio-raalisilla aineilla voi olla rajoitettu käyttökelpoisuus in 15 vivo, aiemmissa töissä on tutkittu mahdollisuutta lisätä soluimmuniteettiä Hl-virusta vastaan. On tunnistettu sellaisia proteiinikimeerivalmisteitä, joissa CD4-proteiinin solunulkoinen domeeni on fuusioitu T-solureseptorin, igG Fc -reseptorin tai B-solureseptorin signaalia kuljettavien 20 elementtien trähsmembraani- ja/tai solunsisäisten domeenien kanssa (US-hakemusjulkaisut sarjanro 07/847 566 ja 07/665 961, jotka on liitetty tähän viitteiksi). Sytolyyt-tiset T-solut, jotka ekspressoivat sellaisia kimeerejä, jotka sisältävät CD4-proteiinin sölunulkoisen domeenin, 25 osoittavat vahvan HIV-vaippaproteiineja ekspres soivien so-lukohteiden MHC-riippumattoman tuhoamisen. Erittäin tärkeä ja uusi osa tätä lähestymistapaa on ollut sen yksittäisen T-solureseptorin, Fc-reseptorin, ja niiden B-solureseptori-ketjujen tunnistus, joiden aggregoituminen riittää soluvas-30 teen aloitukseen. Tämän lähestymistavan yksi.erittäin käyttökelpoinen sovellus on ollut sellaisten CD4- ja ζ-, η- tai γ-proteiinien välisten kimeerien keksiminen, jotka ohjaavat sytolyyttisiä T-lymfosyyttejä niin, että ne tunnistavat ja tappavat soluja, jotka ekspressoivat HXV gpl20 -proteiinia 35 (US-hakemusjulkaisut sarjanrot 07/847 566 ja 07/665 961, jotka on liitetty tähän viitteiksi).

9

Keksinnön yhteenveto

Keksintö: koskee membraaniin sitoutunutta kimeeristä proteiinireseptoria, joka sisältää (a) solunulkoisen osan, joka sisältää CD4-fragmentin, joka kykenee spesifisesti 5 tunnistamaan HX-yiruksella: infektoituneen solun ja sitou-maan siihen, mutta joka ei välitä Hi-virusinfektiota, ja ib) solunsisäisen osan, joka kykenee viestittämään terapeuttiselle solulle tiedon siitä niin, että se tuhoaa reseptoriin sitoutuneen Hl-vifuksella infektoituneen solun.

10 Toisessa näkökohdassa, keksintö esittää solun, joka ekspressoi membraaniin sitoutunutta kimeeristä proteiini-reseptoria, joka sisältää (a) solunulkoisen osan., joka sisältää C334-fragment in, joka kykenee spesifisesti tunnistamaan Hl-viruksella infektoituneen solun ja sitoumaan sii-15 hen, mutta joka ei välitä HI-yirusinfektiota, ja (b) solun-sisäisen osan, joka kykenee viestittämään terapeuttiselle solulle tiedon siitä niin, että se tuhoaa reseptoriin sitoutuneen Hl-viruksella infektoituneen solun..

Molempien näkökohtien suositeltavissa suöritusta-20 voissa CD4-fragment ti on CD4-proteiinin aminohapot 1 - 394 tai 1 - 200; CD4-fragmentin erottaa solunsisäisestä osasta memhraanin läpi kulkeva GD7-domeeni, joka on esitetty kuviossa 26, tai ihmisen TgG-molekyyiin sarana-, CH2 tai CH3-domeenit, kuten on esitetty kuviossa 25; reseptori sisältää 25 membraanin läpi kulkevan Cö7-oSan; reseptori sisältää mem- 1 braanin läpi kulkevan GD5-osan; reseptori sisältää membraanin läpi kulkevan CD34-osan; CD4-fragmentin erottaa terapeuttisen soitan membraanista yksi tai useampi proteiinin alfa-heliksi; CD4-fragmentin erottaa terapeuttisen solun 30 membraanista ainakin 4,8 nm tai ainakin 7,2 nm; solunsisäi-nen osa on signaalia kuljettava T-solureseptoripröteiinin osa (esimerkiksi ζ), B-solureseptoriproteiini tai FG-resep-toriproteiini; ja terapeuttiset solut valitaan ryhmästä, j joka sisältää (a) T-lymfosyytit; (b) sytotoksiset T-lymfo-35 syytit;' (c) luonnolliset tappajasolut; (d) neutrofiilit; 10 (e) granulosyytit; (f) makrofaagit; (g) mastosolut ja (h)

HeLa-solut·

Toisissa näkökohdissa keksintö esittää DNA:n, joka koodittaa keksinnön mukaista kimeeristä reseptoria ja sen 5 kimeerisen xeseptori-DNA:n sisältävän vektorin.

Vaikka esillä olevan keksinnön mukainen: spesifinen suoritustapa :qn kimeeri CD4- ja ξ;-proteiinien välillä, mitä tahansa reseptoriketjua, jolla on samanlainen toiminta: kuin näillä molekyyleillä, esim. granulosyyteissä tai B-lymfo-1D syyteissä, voidaan käyttää tässä kuvattuihin tarkoituksiin. Suositeltavan immuunisolun laukaisinmolekyylin erottuvat ominaisuudet sisältävät kyvyn ekspressoitua autonomisesti (nimittäin yksittäisenä ketjuna), kyvyn fuusioitua solunulkoi-seen CD4-domeeniin niin, että tuloksena syntynyt kimeeri on 15 läsnä terapeuttisen solun piimällä, ja kyvyn aloittaa solun effektoriohjelmat aggregoituessäan kohdeligandin kohtaamisen jälkeen.

Tällä hetkellä helpoin menetelmä kimeerien kuljettamiseksi immuunisysteemin soluille on jonkin geeniterapiako muodon käyttö. Kuitenkin immuunisysteemin soluj en rakentaminen kimeerisillä reseptoreilla käyttäen seosta, jossa on sopivasti liukoiseksi tehtyä puhdistettua kimeeristä proteiinia sisältäviä soluja, johtaisi myös sellaisen manipuloidun solupopulaation muodos turn i s e en, joka kykenee respon-25 doimaan Hl-viruksella: infektoituihin kohteisiin. Samanlaisia lähestymistapoja on käytetty esimerkiksi CD4-molekyylin viemiseen punasoluihin terapeuttisia tarkoituksia varten. Tässä tapauksessa manipuloitu solupopulaatio ei kykene uudistumaan i t sestään.

30 Esillä oleva keksintö koskee sellaisia toiminnalli sia ja yksinkertaistettuja kimeerejä CD4 -fragmenttien ja T-solureseptoPih, B-solureseptorin ja Fc-reseptorin alayksikköjen välillä, jotka kykenevät ohjaamaan immuunisoluja niin, että ne tunnistavat Hl-viruksella infektoituneet so-35 lut ja lyysaavat ne. Soluvasteen ohjaamiseen käytetty menetelmä nisäkkäällä sisältää vaiheen, jossa nisäkkäälle: anne- 11 taan tehokas määrä terapeuttisia soluja (.esimerkiksi syto-toksisia T-lymfosyyttejä) niin, että solut kykenevät tunnistamaan HI-viruksella Infektoituneen solun ja tuhoamaan sen, 5 Keksintö sisältää myös kimeeriset reseptoriproteii- nit, jotka ohjaavat sytolyyttisiä T-lymfosyyttejä niin, että ne ttinnistavat Hl-v-irukselia infektoituneet solut ja lyysaavat ne, isäntäs.olrt, jotka on transformoitu sellaisella vektorilla, joka sisältää kimeeriset reseptorit ja 10 vasta-aneet, jotka on suunnattu kimeerisiä reseptoreita vastaan.

Nämä ja muut: esillä olevan keksinnön ei-rajoittavat suoritustavat tulevat ilmeisiksi alan asiantuntijalle seu-raavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

15 Seuraavassa yksityiskohtaisessa kuvauksessa viita taan erilaisiin menetelmiin, jotka molekyylibiologian ja immunologian alan asiantuntijat tuntevat. Julkaisut ja muut materiaalit, jotka kuvaavat sellaiset tunnetut menetelmät, joihin tässä viitataan, on liitetty tähän viitteiksi koko-20 naisuudessaan kuin olisivat kuvattuina täydellisesti.

Standardiviitteet, jotka kuvaavat yhdis telmä-DNA- j menetelmien yleiset periaatteet, sisältävät julkaisut Wat- j son et ai,, Molecular Biology of the Gene, osat X ja XI, the Benjämin/Cummings Publishing Company, Inc,, julkaisija, 25 Menlo Park, CA (1987); Darnell et ai.. Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., julkaisija, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, julkaisijat, New York, N.Y. (1985)* Old et al., Principles of Gene j

Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. j 30 painos, University of California Press, julkaisija, Berke- | lev, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Labo- f ratory Manual, 2, painos, Cold: Spring Harbor Laboratory, | julkaisija, Cold Spring Harbor, NY (1989); ja Ausubel et ] al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, j 35 New York, NY (1989). j j 12 Määri teliaäfc Määritelmällä "kloonaus” tarkpitetaän in vitro yhdistelmä-DNA-mene telmi en käyttöä tietyn geenin tai muun DNA-s ekvens s in ins er to imi s eks i vekt orimo1ekyy 1i in.

5 Määritelmällä "cDNA" tarkoitetaan komplementaarista tai kopio-DNA:ta, joka on tuotettu RNA-templaatista RNA:sta riippuvaisen DNA polymeraasin (käänteiskopioijaentsyymi) aktiivisuuden välityksellä. Näin ollen määritelmä "cDNA-klooni'' tarkoittaa klo onausvektor i s s a olevaa kaksijuosteista DNA-sek-10 venssiä, joka on komplementaarinen halutulle RNA-molekyy-:1111 e.

Määritelmällä "cDNÄ-kirjasto" tarkoitetaan yhdistelmä-DNA-molekyylien kokoelmaa, jotka sisältävät cDNA-in-sertit, jotka sisältävät sellaisen mRNA:N DNA-kopiot, jota 15 solu ekspressoi silloin, kun cDNA-kirjasto valmistettiin.

Sellainen cDNA-kirjasto voidaan tehdä alan asiantuntijoiden tuntemin menetelmin, jotka on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa Ausubel et ai., yllä ja Maniatis et ai., yllä. Yleisesti SNA eristetään ensin sellaisen organismin soluista, 20 jonka genomista tietty geeni halutaan kloonata. Esillä olevan keksinnön tarkoituksiin suositeltavia ovat nisäkkään, ja erityisesti ihmisen, lymfosyyttisolulinjat. Tällä hetkellä suositeltava vektori tätä tarkoitusta varten on vac-cinia-viruksen WR-kanta.

25 Määritelmällä "vektori" tarkoitetaan DNA-molekyy- liä, joka on peräisin esim. plasmidista, bakteriofaagista tai nisäkkään tai hyönteisen viruksesta, johon DNA-frag-mentit. voidaan insertoida tai kloonata:. Vektori sisältää yhden tai usemamman uniikin restriktiokohdan ja se voi kye-30 tä autonomiseen replikaatioon määritellyssä, isännässä tai vehikkeliorganismissa niin, että kloonattu sekvenssi monis- j tuu.: Näin ollen määritelmällä "DNA-ekspressiovektori" tar- j koitetaan autonomista elementtiä, joka kykenee; ohjaamaan \ rekombinanttipeptidin synteesiä. Sellaiset DNA-ekspressio-35 vektorit sisältävät bakteeriplasmidit ja faagit ja nisäkkään ja hyönteisen plasmidit ja virukset.

13 Määritelmällä "oleellisesti puhdas" tarkoitetaan yhdistettä, esim. proteiinia, polypeptidiä tai vasta-ainetta, joka on oleellisesti vapaa komponenteista, jotka luonnossa seuraavat sen mukana. Yleisesti yhdiste on oleel-5 lisesti vapaa, kun ainakin 60 %, suositeltavammin ainakin 75 % ja suositeltavimmin ainakin 90 % näytteen kokonaisma-teriaalista on haluttua yhdistettä. Puhdistusaste voidaan mitata sopivalla menetelmällä, esim. pyiväskromatografiällä, polyakryyliamidigeelielektroforeesilla tai HPLC-analyy-10 sillä, Nukleiinihappojen kyseessä ollen "oleellisesti puhdas" tarkoittaa nukleiinihapposekvenssiä, -segmenttiä tai -fragmenttia, joka ei ole välittömästi: jatkuva (se tarkoittaa, ei ole liittynyt kovalenttisesti); molempien sellaisten koodattavien sekvenssien (se tarkoittaa, 5‘- ja 3'-pään 15 puoleisen sekvenssin kanssa) kanssa/ joiden kanssa se on välittömästi jatkuva siinä organismin luonnollisesti esiin·*· tyvässä genomissa, josta keksinnön DNA on peräisin.

Molekyylin "fragmentin" tarkoitetaan viittaavan mihin tahansa molekyylin, kuten mikä tahansa esillä olevan 2 0 keksinnön mukaisen cDNA-sekvens s in, jatkuvaan nukleotidien osajoukkoon. Molekyylin ”analogin" tarkpitetaan viittaavan ei-luonnolliseen molekyyliin, joka on oleellisesti saman- j

lainen joko kokonaisen molekyylin tai sen fragmentin kans- I

sa. Molekyylin sanotaan olevan "oleellisesti samanlainen" I

25 toisen molekyylin kanssa, jos molempien molekyylien amino- j happosekvenssit ovat oleellisesti samoja. Oleellisesti samanlainen aminohappomolekyyli sisältää samanlaisen biologi- | sen aktiivisuuden. Tässä käytettynä molekyylin sanotaan j olevan toisen molekyylin "kemiallinen johdannainen% kun se \ 30 sisältää sellaisia kemiallisia ryhmiä, jotka, eivät normaalisti ole molekyylin osia. Sellaiset ryhmät voivat parantaa | molekyylin liukoisuutta, absorptiota, biologista puoli-ikää | jne. Ryhmät voivat vaihtoehtoisesti alentaa molekyylin tok- | sisuutta, poistaa tai heikentää molekyylin ei-toivottavia | 35 sivuvaikutuksia jne. Ryhmät, jotka voivat saada aikaan sei- j laisia vaikutuksia, on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Re- j 14 xnington’s Pharmaceutical Sciences, 16. painos, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (198,0).

Esillä olevan keksinnön reseptorikimeerigeenin "toiminnallisen johdannaisen" tarkoitetaan sisältävän geenin 5 "fragmentit" tai "analogit", jotka ovat "oleellisesti samanlaisia" nukleotiäisekvenssiltään ja jotka koodittavat molekyyliä, joka sisältää samanlaisen aktiivisuuden esimerkiksi T-solu-, B-solu- tai Fc-reseptorikimeerille.

Suositeltavimmin johdannainen sisältää 90 %, suosi-10 teltavammin 70 % ja suositeltavasta 40 % villityypin reseptorin kimeeriaktiiyismidesta. Toiminnallisen kimeeriresep-torijohdannaisen aktiivisuus sisältää spesifisen sitoutumisen (sen solunulkoisen CD4-osan kanssa) Hi-viruksella infektoituneeseen soluun ja tuloksena sen solun tuhoutumisen; 15 lisäksi, kimeerinen reseptori ei muuta reseptoria sisältävää solua herkäksi HI-virusinfektiolle. Kimeerireseptoriak-tiivisuutta voidaan testata käyttäen esim. mitä tahansa tässä kuvattua testiä.

Esillä olevan keksinnön mukaista CD4-reseptoriki-20 meeriä koodittava DNA-sekvenssi tai sen toiminnalliset johdannaiset voidaan yhdistää vektori-DNA:n kanssa minkä tahansa tavanomaisten menetelmien mukaisesti sisältäen tasa-päisteh tai kohesiivisten päiden ligaatiot, restriktioent-syymidigestion, sopivien päiden muodostamiseksi, kohesiivis-25 ten päiden täyttämisen tarpeen mukaan, alkalifosfataasikä- j sittelyn ei-toivottavan yhdistymisen estämiseksi ja ligaa-tion sopivien ligaasien avulla. Menetelmät sellaisia mani- ! palaatioita varten on kuvattu julkaisussa Maniatis et ai., yllä, ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.

3 0 JSfukleiinihappomolekyylin, kuten DNA:n, sanotaan ole- ] van "kykenevä ekspressoimaan" polypeptidiä, jos se sisältää | sellaiset nukleotidisekvenssit, jotka sisältävät transkrip- j tion ja translaation säätelytiedot, ja sellaiset sekvenssit j ovat "toiminnallisesti liitettyjä" nukleotidisekvensseihin, \ 35 jotka koodittavat polypeptidiä. Toiminnallinen liitos on j liitos, jossa DNA-säätelysekvenssit ja ekspressoitumaan ai- 15 ottu DNA-sekvens si liitetään niin, että sallitaan geenieks-pressio. Geeniekspressioon tarvittavien säätelyalueiden tarkka luonne voi vaihdella organismista toiseen, mutta niiden tulisi yleensä sisältää promoottorialueen,, joka pro-5 karyooteissa sisältää sekä promoottorin (joka ohjaa rna-transkription aloitusta) kuin myös DNA-sekvenssit, jotka transkriptoituina RNAtksi viestittävät proteiinisynteesin aloituksen. Sellaiset alueet sisältävät normaalisti ne 5'-puoleiset ei-koodittavat sekvenssit, jotka ottavat osaa 10 transkription ja translaation aloitukseen, kuten TATA-box-alueen, capping-s ekvens s in, CAAT-sekvenssin ja niiden kaltaiset.

Jos halutaan, proteiinia koodittavan geenisekvenssin 3'-puoleinen ei-koodittava alue voidaan saada yllä ku-15 vatuilla menetelmillä. Tämä alue voidaan säilyttää sen transkription terminaation säätelysekvenssien, kuten termi-naatio- ja polyadeny1aa t i os ekvenss i en, vuoksi. Näin ollen säilyttämällä proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin luonnossa esiintyvä 3'-puoleinen alue, voidaan saada transkrip-20 tion terminaatipsignaalit. Kun transkription terminaatio- signaalit eivät toimi tyydyttävästi ekspressioisäntäsolus- ; sa, täytyy lisätä sellainen 31-puoleinen alue, joka toimii isänfcäsolussa. j

Kahden DNA-sekvenssin (kuten promoottorialuesek- ! 25 venssin ja CD4-reSeptorikimeeriä koodittavan sekvenssin) mainitaan olevan toiminnallisesti liitettynä, jos kahden DNA-sekvenssin liitoksen luonne ei (1) johda mutaatioon, joka muuttaa lukuraamin, (2) häiritse promoottorialuese-kvenssin kykyä ohjata reseptorikimeerigeenisekvenssin tran-.3,0; skriptiota tai (3) häiritse reseptorikimeerigeenisekvenssin { kykyä tulla transkriptoiduksi promoottorialuesekvenssin toimesta. Promoottorialue on toiminnallisesti liitettynä DNA- s ekvens s iin, jos promoottori kykenee saamaan aikaan sen |

DNA-sekvenssin transkription. Näin ollen proteiinin eks- I

35 pressoimiseksi ovat sellaiset transkription ja translaation ; signaalit tarpeen, jotka sopiva isäntä tunnistaa. i 16

Esillä oleva keksintö sisältää CD4-reseptörikimee-riprotelinin (täi. sen toiminnallisen j ohdanna i s en) ekspression joko prokaryoottisissa tai eukaryoottisissä soluissa, vaikkakin eukaryoottinen (ja erityisesti ihmisen lymfosyv-5 teissä) ekspressio on suositeltava.

Hakemuksen mukaisesti vasta-aiheet voidaan valmistaa millä tahansa useista erilaisista menetelmistä. Esimerkiksi soluja, jotka ekspressoivafc GD4-reseptorikimeeripro-teiinia tai sen toiminnallista johdannaista, voidaan antaa 10 eläimelle sellaisen seerumin indiisoimiseksi, joka sisältää polykionaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan kimeeriin.

Suositeltavassa menetelmässä vasta-aineet ovat mo-noklonaalisia vasta-aineita. Sellaiset monoklonaaliset vas-15 ta-aineet voidaan valmistaa käyttäen hybridoomamenetelmää [Kohler et ai., nature 256: 495 (1975); Kohler et ai., Eur.

J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et ai,, Eur. J. Immunol.

6: 292 (1976); Hammerling et ai,, teoksessa Monoclonal An- { tibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, H.Y., sivut 563 - f 20 684 (1981)], Yleisesti sellaiset menetelmät sisältävät vai- f keen, jossa eläin immunisoidaan CP4-reseptorikimeerianti-geenilla. Sellaisten eläinten pernasolut eristetään ja fuu- | sioidaan sopivan myeloomasolulinjan kanssa. Mitä tahansa j sopivaa myeloomasolulinjaa voidaan käyttää esillä olevan j 25 keksinnön yhteydessä. Fuusion jälkeen tuloksena syntyneitä ; hybridoomasoluja pidetään yllä selektiivisesti HAT-alus- f tässä ja sitten ne kloonataan rajoittavalla laimennoksella, 1 kuten ovat kuvanneet Wands et: ai. [Gastroenterology 80: 225 - 232 (.1981)1. Sellaisen selektion kautta saadut hybri-30 doomasolut testataan sitten sellaisten kloonien tunnistami- 1 seksi, jotka erittävät vasta-aineita, jotka kykenevät si- j toutumaan kimeeriin. j

Vasta-aineet voivat myös olla polykionaalisia tai | suositeltavasti: aluespesifisiä polykionaalisia vasta-ainei- j 35 ta. j | ! . \ |

J

ijiil 17

Esillä olevan keksinnön mukaista CD4-reseptoriko-meeriä vastaan olevia vasta-aineita voidaan käyttää kimee-risen reseptorin (tai kimeeristä reseptoria sisältävien solujen) määrän tarkkailemiseksi potilaassa. Sellaiset vasta-5 aineet sopivat hyvin käytettäviksi immunodiagnostisessä standardimenetelmässä, joka tunnetaan alalla, sisältäen sellaiset immunometriset testit tai "kerrostestit", kuten suoran, käänteisen ja samanaikaisen kerrostestin. Vasta-aineita voidaan käyttää minä tahansa yhdistelmänä, jonka 10 alan asiantuntija voi määritellä ilman tarpeettomia kokeita niin, että saadaan aikaan immuunitestit, joilla on hyväksyttävä spesifisyys, herkkyys ja tarkkuus.

Standardiviitetyöt, jotka kuvaavat yleiset immunologian periaatteet, sisältävät julkaisut Roitt, Essential 15 immunology, 6. painos, Blackwell Scientific Publications, julkaisija, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2. painos, Macmillan Publishing Co., julkaisija, Mew York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., julkaisija Lontoo (1985); Campbell, "Mono-20 clonal Antibody Technology" , teoksessa Burdon et al. , toimitta j at, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, osa 13, Elsevier, julkaisija, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, julkaisija, New York 25 (1982) ; ja Kennett et al:, to im., Monoclonal Antibodies,

Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, julkaisija, New York (1980).

Määritelmän "tunnistaminen" on tarkoitettu sisältävän aineen läsnä- tai poissaolon määrittämisen tai aiheen 30 määrän kvantitoimisen. Termi viittaa näin ollen esillä olevan keksinnön mukaisten materiaalien, koostumusten ja menetelmien käyttämiseksi kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia määr i tyks iä var ten.

Vasta-aineet ja oleellisesti puhdistettu antigeeni 35 sopivat ihanteellisesti käyttöpakkauksen valmistamiseen.

Sellainen käyttöpakkaus voi sisältää kantajavalineen niin, 18 että se on jaettu osastoiksi niin, että siinä on suljettuna lähekkäin yksi tai useampi säiliövaline, kuten lääkepullo, putki ja niiden kaltainen säiliö, kunkin mainitun säiliövä-lineen sisältäessä käytetyn testin erilliset elementit.

S Testityypit, jotka voidaan sisällyttää käyttöpak- kausmuotoon, ovat monenlaisia ja sisältävät esimerkiksi kompetitiiviset ja ei-kompetitiiviset testit. Tyypilliset esimerkit testeistä, joissa; voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisia vasta-aineita, ovat raöioimmuunitestit 10 (RlA), entsyymi-immuunitestit (EIA), entsyymivälitteiset immuunitestit (ELISA) ja immunometriset tai kerros immuuni-testit.

Termin " iinmunometrinen testi" tai "kerrosimmuuni- testi" tarkoitetaan sisältävän samanaikaiset, suorat ja 11 käänteiset kerrosimmuimitestit. Alan asiantuntija tuntee hyvin nämä termit. Alan asiantuntija ymmärtää myös, että esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat käyttökelpoisia muissa testien variaatioissa ja muodoissa, jotka tällä hetkellä tunnetaan tai jotka voidaan kehittää tule- 20 vaisuudessa. Häiden on tarkoitettu .sisältyvän esillä Olevan keksinnön piiriin,:

Termillä "spesifisesti tunnistaa ja sitoutuu11 tarkoitetaan, että vasta-aine tunnistaa kimeerisen reseptori-polypeptidin ja sitoutuu siihen, mutta, ei oleellisesti tun-25 riistä muita ei-sukua olevia näytteen, esim. biologisen näytteen, molekyylejä ja sitoudu niihin.

Termillä "terapeuttinen solu" tarkoitetaan solua:, joka on transformoitu keksinnön mukaisella CD4-reseptori-kimeerillä niin, että se kykenee tunnistamaan HI-viruksella 3:0 infektoituneen solun ja tuhoamaan sen,- sellaiset terapeuttiset solut ovat suositeltavasta heraatopoieettisen systeemin soluja.

Termillä "solunulkoinen" tarkoitetaan sitä, että j ainakin osa molekyylistä on solun pinnalla. Termillä "so- ] 35 lunsisäinen" tarkoitetaan sitä, että ainakin osa molekyylistä on terapeuttisen solun sytoplasmassa. Termillä "mem- j 19 braanin läpi kulkeva" tarkoitetaan sitä, että ainakin osa molekyylistä ulottuu plasmamembraaniin. "Solunulkoinen osa", "solunsisäinen osa" ja "membraanin läpi kulkeva osa” tässä käytettyinä voivat sisältää sellaiset viereiset aminohap-5 posekvenssit, jotka ulottuvat vierekkäisiin soluosastöihin.

Termillä "o1igomeri s o i tua" tarkoitetaan sitä, että muodostetaan muiden proteiinien kanssa dimeerejä, trimeere-jä, tetrameerejä tai muita korkeamman asteen oligomeerejä.

Sellaiset oiigömeerit voivat olla homo-oligomeerejä tai he-10 tero-oligomeerejä, "Oligomerisoituva osa" on se molekyylin alue, joka ohjaa kompleksin (se tarkoittaa, oligomeerin) muodostumista.

Termillä "sytolyyttinen" tarkoitetaan kykyä tuhota solu (esim. HI-viruksella infektoitunut solu) tai kykyä tu-15 hota infektiivinen aine (esim. Hl-virus).

Termillä " immuunipuutosvirus'' tarkoitetaan retrovirus ta, joka villityypin muodossa kykenee infektoimaan kädellisen isännän T4-soluja ja sisältää sellaisen viruksen morfogeneesin ja morfologian, joka on ominaista lentivi-20 rusalaryhmä!le· Termi sisältää ilman rajoitusta kaikki HI- I

ja Sl-yiruksen variantit sisältäen HIV-1-, HIV-2-, STVmac-, \ DIVagm-, SIVmnd-, SlVsmm-, SIVman-, SlVmand- ja SIVcpz- j variantit. j

Termillä "MHC-riippuinat on" tarkoitetaan, että solun 1 25 sytolyyttinen vaste ei vaadi MHC-luokan II -antigeenin läs- j näoloa kohdesolun pinnalla.

Termillä "toiminnallinen sytölyyttistä signaalia | kuljettava johdannainen" tarkoitetaan toiminnallista joh- ] dannaista (kuten yllä on määritelty), joka kykenee ohjaa-30 maan ainakin 40 %, suositeltavammin 70 % ja . suositeltaviin- 1 min ainakin 90 % villityypin molekyylin biologisesta aktii- | visuudesta. Tässä käytettynä termi "toiminnallisesti syto- | lyyttistä signaalia kuljettava johdannainen" voi toimia :j suoraan niin, että se ohjaa terapeuttisen solun tuhoamaan ϊ 35 reseptoriin sitoutuneen aineen tai solun (esim. solunsisai- | sen kimeerisen reseptoriosän tapauksessa) tai se voi toimia j j 20 epäsuoraan edistämällä oligomerisaatiota terapeuttisen solun sytolyyttistä signaalia kuljettavien proteiinien (esim. membraanin läpi kulkevan domeenin tapauksessa) kanssa, sellaiset johdannaiset voidaan testata niiden tehokkuuden suh-5 teen esim. käyttäen tässä kuvattuja in vitro testejä.

Termillä "toiminnallinen HI-viruksen vaippaan sitoutuva johdannainen" tarkoitetaan toiminnallista johdannaista (kuten yllä on määritelty), joka kykenee sitoutumaan mihin tahansa HI-viruksen vaippaproteiiniin. Toiminnalliset 10 johdannaiset voidaan tunnistaa käyttäen esim. tässä kuvattuja in vitro testejä.

Yk s ifcyi skohtainen kuvaus Ensin kuvataan kuviot.

Kuvioiden, lyhyt kuvaus 15 Kuvio IA edustaa aminohapposekvenssiä, joka sijait see suurinpiirtein CD4-proteiinin (jäännökset 1 - 369) ja eri reseptoriketjujen fuusiökohdalla. Alleviivattu sekvenssi esittää fuusion rakentamisessa käytetyn BamHl-kohdan koodittamien aminohappojen kohdan. Membraanin läpi kulkevan 20 domeenin alku on merkitty vertikaalisella viivalla. H-sekvenssi on identtinen ξ-sekvenssin kanssa aminopäässä, mutta eroaa karboksipäässä [Jin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3319 - 3323 (1990) 3 . Kuvio IB esittää CD4 -, CD4: ζ -, CDi:y- ja CD4:η-proteiinien pintaekspression vir-25 tausytometrianalyysin CVl-soluissa. Solut infektoltiin viruksella, joka ekspressoi CD4-kimeerejä tai CDlön-prote-iinia, inkuboitiin 9 tuntia 37 °C:ssa ja värjättiin fy-koerytriinillä konjugoidulla monoklonaa1ise11a anti-CD4 Leu3A -vasta-aineella.

30 Kuvio 2 esittää GDI6TM-proteiinin pintaekspression sen jälkeen, kun on yhteis infekt oi tu GDl&nr-profceiinilla yksinään (tiheät pisteet) tai yhteisinfektoitu viruksella, joka ekspressoi CB4:γ-proteiinia (katkoviiva) tai CD4:ζ-proteiinia (yhtenäinen viiva). Harvassa olevat pisteet 35 osoittavat soluja, jotka on infektoitu GD4:ζ-proteiinilla yksinään, värjätty 3G8-vasta-aineella [Fleit et ai., Proc.

21

Natl. Acad, Sei . USA 79: 3275 - 3279 {1982) ] (monoklonaali-nen anti-CDl6:-vasta-aine) .

Kuvio 3 esittää ,eDl.6TM-proteiinin pintaekspression sen jälkeen, kun on yhteisinfektoitu viruksilla, jotka eks-5 pressoivat CDl6<ni“Proteiinia ja seuraavia ζ-kirneereitä: CD4:ζ (paksu viiva), CD4:ζ CllG (yhtenäinen viiva), CD4:c {katkoviiva),; CD4: ζ C11G/D15G (tiheässä olevat pisteet), ei yhteisinfektiota (CD16Tm yksinään, harvassa olevat pisteet) . Soluja inkuboitiin monoklonaalisen anti-CDl6-vasta-10 aineen 3G8 ja hiiren IgG-proteiinia vastaan olevien fy- koerytriini-konjugoitujen vuohen Fab' 2-vas ta-aineiden kanssa. ζ-kimeerien ekspressiotaso oli oleellisesti identtinen eri analysoitujen mutanttien välillä ja solujen yhteisin-fektio viruksilla, jotka ekspressoivat CD16TM-proteiinia ja 15 ζ-kimeereitä, ei oleellisesti muuttanut kimeerien pintaeks-pressiota.

Kuviot 4A - D esittävät kohonneen solunsisäisen vapaan kalsiumionin tason, joka seuraa ζ-miitanttikimeerien ristisitomista T~soluiinjassa. Jurkat E6 -solut [Weiss et 20 al.,: J. Immunol. 133: 123 - 128 (1984)3 infektoitiln vaeei- nia-rekombinänttlviruksilla ja analysoitiin virtaussytomet-rialla. Esitetyt tulokset ovat GD4+-proteiinia sisältävälle populaatiolle niin, että ainoastaan solut, jotka ekspres- | soivat asianmukaista kimeeristä. proteiinia, on analysoitu.

25 Indo-l-fluoresenssin keskimääräinen violetti-sininen-suhde heijastaa solunsisäisen vapaan kalsiumin konsentraatiota populaatiossa kokonaisuudessaan ja iespondgivien solujen prosentti heijastaa sitä solufraktiota, joka ylittää esi-määritetyn raja-arvon (asetettu niin, että 10 % käsittele-30 mättömistä soluista on positiivisia). Kuviot.4A ja 4B esittävät Jurkat-solut, jotka ekspressolvat CD4:ξ-proteiinia (yhtenäinen viiva) tai CD16:ξ-proteiinia (katkoviiva), jot- | ka altistettiin monoklonaaliselle anti-GD4~vasta-aineelle f

Leu3A (fykoerytriinillä konjugoitu), jonka jälkeen risti- ! 35 sidottiin hiiren IgG-proteiinia vastaan olevalla vuohen ] vasta-aineella. Pisteviiva esittää infektoimattornien soiu- ! 22 jen vasteen monoklonaa1ise11e anti-CD3-vasta-ainee11e 0KT3, Kuviot 4C ja 4d esittävät Jurkat-solut, jotka ekspres s o ivat CD4; ζ0150-ρΓθύθϋηΐη (yhtenäinen viiva), CP4:£C11G/B15G-proteiinia (katkoviivat), tai CD4:ζΟΙΙΘ-ρΓΟΐθΐιηΙρ (pis-5 teet), joita käsiteltiin ja analysoitiin, kuten kuvioissa 4A ja 4B.

Kuviot 5A - C esittävät , että CD4: ζ-, CD4: η-- ja CD4:γ-reseptorit sallivat sytolyyttisten T-lymfosyyttien (OTL) tappavan kohteet, jotka ekspressoivat HIV-1 gpl20/41 10 -proteiinia. Kuvio 5A: täytetyt ympyrät, CD4:ζ-proteiinia ekspressoivat CTL·-solut inkuboituina gp!20/4I proteiinia ekspressoivien HeLa-solujen kanssa; avoimet ympyrät, CD4:ζ-proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina infektoi-mattomien HeLa-solujen kanssa; täytetyt neliöt, infektoi-15 mattomat CTL-solut inkuboituina gp!20/41-proteiinia eks pressoivien HeLa-solujen kanssa; avoimet neliöt, infektoi-mattomat CTL-solut inkuboituina infektoimattomien HeLa-soluj en kanssa. Kuvio 5B: täytetyt ympyrät, CD4:η-prote iinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina gpl20/41-pro-20 teiinia ekspressoivien HeLa-solujen kanssa; avoimet ympyrät:, CD4;γ-proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina gpl2:0/41-proteiinia ekspressoivien HeLa-soluj en kanssa; avoimet neliöt, CD4:ξ-kimeerin CllG/DlSG-kaksoismutanttia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina gpi2Ö/4l-proteiinia 25 ekspressoivien: HeLa-solujen kanssa. Kuvio 5C: kuviossa 5B käytettyjen GTL-solujen CD4~ ekspression. virtaussytometri-analyysi. Kohteen ja vaikuttajasolun suhteen korjaamiseksi määritettiin se prosentti soluista, joka ekspressoi CD4-kimeeriä, vähentämällä mitoitettu negatiivinen (infektoima-30 ton) populaatio: histogrammin päällekkäinasetuksella; ver-tailutarkoituksia varten tässä kuviossa Infektoimattomilla soluille annettiin keinotekoinen raja-arvo, joka antaa suurinpiirtein saman fraktion positiivisia muille solupopulaatioille kuin histögrammivähennys.

23

Kuviot 6ä - B esittävät CD4-ohjatun sytolyysin spesifisyyden. Kuvio 6A:: täytetyt ympyrät, CD4: ζ-proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina CDlSpi-proteiinia eks-pressbivien, HeLa-solujen kanssa; avoimet ympyrät, CD4-pro-5 teiinia, ekspressoivat CTL-solut inkuboituina gpl2 Q-prote-iinia ekspressoivien HeLa-solujen kanssa; täytetyt neliöt, GDI6:ζ“proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina .gpi.2'0'/4;l-proteiinia ekspressoivien HeLa-solujen kanssa; avoimet, neliöt, CDl6pi~proteiinia ekspressoivat CTL-solut 10 inkuboituina gpl2Q/41-prQteiinia ekspressoivien HeLa-so-lu jen kanssa. Kuvio 6B: täytetyt ympyrät, CD4:ζ-proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina Raji-solujen {MHC luokka II+) kanssa; avoimet ympyrät, infektoimattomat CTL-solut inkuboituina RI2.2.5-solnjen (MHC luokka II* Raji 15 -mutantti) kanssa; täytetyt neliöt, infektoimattomat CTL-solut inkuboituina Raji-solujen (MHC luokka il+} kanssa; avoimet neliöt, CD4: :ζ-proteiinia ekspressoivat CTL-solut inkuboituina RJ2.2.5-solujen (MHC luokka II'* kanssa. Or-dinaatan mittakaava on laajennettu.

20 Kuvio 7ä - B esittää kimeerisen CD16:ζ-reseptorin j karaktefisaätion. Kuvio 7A on kaavio CD16:ζ-fuusioprote- \ iinista. Monomeerisen CD16~proteiinin fosfatidylinositoliin \ liittyneen muodon solunulkoinen osa liitettiin dimeeriseen j ζ-proteiiniin juuri membfäänin läpi kulkevan domeenin uiko- | 25 puolelle. Fuusiokohdassa oleva proteiinisekvenssi on esi- ) tetty alaosassa. Kuvio 7B esittää kalsiumin mobilisaation 1 virtaussytometrianalyys.in sen jälkeen, kun GDI6ζ-kimeeri |

on ristisidottu joko TCR-positiivisessa tai TCR-negatiivi- I

sessa. solulinjassa. Violetti-sininen--fluoresenssiri (mitta 30 suhteellisesta kalsiumionikonsentraatiosta) .keskimääräinen | suhde solupopulaatioissa, joita käsiteltiin vasta-aineilla | aikapisteessä 0, on esitetty. Täytetyt neliöt, Jurkat-solu- j jen vaste monoklonaaliselle anti-CD3-vasta-aineelle OKT3; | täytetyt kolmiot, vaste CDll: ζ-proteiinille/ joka on ris- j 35 tisidottu monoklonaalisella anti-CDl6-vasta-aiheella 3G8 j REX33A TCR" -mutantissa; avoimet neliöt, vaste CD16:ζ-pro-

J

24 teiinin ristisitomiselle Jurkat TCRT -mutanttilinjassa JRT3.T3.5:; avoimet kolmiot,· vaste CD16:ζ-proteiinin ristisitomiselle Jurkat-soluissa; ristit, vaste ei-kimeeri-selle CDl6:-prO:teiinille Jurkat-soluissa; ja pisteet, vaste 5 ei-kimeeriselle GDIS^proteiinille REX33A TGR' -solulinjas-sa.

Kuviot 8:Ä - B esittävät sytolyyttisen potentiaalin deleetioanälyysin. Kuvio 8A esittää ζ-deleetion kohtien loppupisteet, Tässä, kuten muissakin tapauksissa, ζ-proteii-10 nissa olevat mutaatiot esitetään sen sopimuksen mukaisesti, jossa esitetään alkuperäisen jäännöksen kohta ja mutantti-jäännös niin, että esimerkiksi D66* ilmaisee Asp-66-jään-nöksen korvaamisen lopetuskodonilla. Kuvio 8B esittää dele-toimattoman CD16:ζ-proteiinin ja tärkeiden ζ-proteiinin de-15 leetioiden sytolyysitestien tulokset. Hybridoomasolut, jotka ekspressöivät pinta-vasta-ainetta CD16-proteiinia vastaan, ladattiin 5lCr-leimalla ja niitä inkuboitiin kohoavien määrien kanssa ihmisen sytolyyttisiä lymfosyyttejä (CTL), jotka oli infektoitu vacciniä-rekombinanteilla, jot-20 ka ekspressoivat CD16:ζ-kimeerejä. Vapautuneen 51Cr-leiman prosenttimäärä esitetään effektorisolun (OTL) ja kohdesolun (hybridooma) suhteen (e/t) funktiona. Täytetyt ympyrät, CD16:ζ-proteiinia ekspressoivien solujen (mfi 18.7) välittämä sytolyysi; täytetyt neliöt, CD16:ζ Asp-66* -proteiinia 25 ekspressoivien solujen (mfi 940.2) välittämä sytolyysi; avoimet neliöt, CD16: ζ Glu60A' -proteiinia ekspressoivien solujen (mfi 16.0) välittämä sytolyysi; avoimet ympyrät, CD16:ζ Tyr51* -proteiinia ekspressoivien solujen (mfi 17.4) välittämä sytolyysi; täytetyt kolmiot, CD16:ζ Phe34* -pro-30 teiinia ekspressoivien solujen (mfi 17.8) välittämä sytolyysi; ja avoimet kolmiot, ei-kimeeristä CDl6-proteiinia ekspressoivien solujen (mfi 591) välittämä sytolyysi. Vaikka tässä kokeessa CDl6:ξ Asp66* -proteiinin ekspressio ei sopinut yhteen muiden fuusioproteiinien ekspression kanssa, 35 CD16:ζ-proteiinia ekspressoivien solujen välittämä sytolyy si ekvivalenteilla tasoilla samassa kokeessa antoi tulok- 25 set, jotka olivat oleellisesti identtiset niiden, kanssa, jotka ori esitetty CD16: ζ Asp66 -proteiinia ekspressoivien solujen kohdalla.

Kuviot 9A - P esittävät, että mahdollisten membraa-5 nin läpi kulkevien interaktioiden poistaminen paljastaa lyhyen ·ζ·-proteiinit! segmentin, joka kykenee välittämään syto-lyysiä. Kuvio. 9A on kaavio monomeerisestä kaksi- ja kolmiosaisesta: kimeeristä. Yläosassa on CDl6:: ζ-rakenne, joka on lyhennetty jäännöksen 65 kohdalta ja josta puuttuu itieiti-10 braanin läpi menevät Cys- ja Asp-jäännökset. Alaosassa on CDl 6 :CD5:ζ- ja CDl6: GD7:ζ-rakenteet ja liittyvät verrokit. Solunsisäisten domeenien peptidi sekvenssit on esitetty alla. Kuvio 9B esittää monomeeristen kimeerideleetiomutantti-en sytolyyttisen. aktiivisuuden. CD16:ζ-proteiinia (täytetyt 15 ympyrät; mfi 495) ekspressoivien solujen sytolyyttistä aktiivisuutta verrattiin sellaisten solujen vastaavaan, jotka ekspressoivat CD1:6:4 Asp66* -proteiinia (täytetyt neliöt, mfi 527) tai CDl6:ζ Cys1IGly/Aspl5Gly/Asp66*- (avoimet neliöt, mfi 338) ja CDl6: ζ CysllGly/Aspl5Gly/Glu60*-mutant-20 teihin (täytetyt kolmiot, mfi 259). Kuvio 9C esittää kolmiosaisten fuusioproteiinien välittämän sytolyyttisen aktiivisuuden. Täytetyt kolmiot, CDl6:ζ Asp66*; avoimet neliöt, CD16:5:C (48-65); täytetyt neliöt, CDl6:7:ζ (48-65); avoimet kolmiot, CD16:7:C (48-59); avoimet ympyrät, CD16:5; 25 täytetyt ympyrät, CDl.6;'7 ,' Kuvio 9D esittää mutanttikiraeeri- en ja kolmiosaisten kimeerien aiheuttaman kalsiumin mobili- ; säätiön TCR-negatiivisessa Jurkat jRT3,T3,5-mutanttisolu-linjassa. Avoimet ympyrät, dimeeristä 0Ρ16:ζ Asp66* -proteiinia ekspressoivien solujen vaste; täytetyt neliöt, 30 CD16: £ cysllGly/AsplSGly/Aspöö* -proteiinia , ekspressoivien solujen vaste,· avoimet neliöt, CD16;5

CysllGly/Aspl5Gly/Glu6'Ö* -proteiinia, ekspressoivien solujen vaste; täytetyt kolmiot, ΟΠΐ6:7:ζ (48-65) -proteiinia ekspressoivien solujen vaste; ja avoimet kolmiot, CD16:^ (48-35 59) -proteiinia ekspressoivien solujen vaste.

26

Kuviot lOA - F esittävät yksittäisten aminohappojen osallisuuden 18 jäännöksen pituisen sytolyyttistä signaalia kuljettavan alueen aktiivisuuteen. Kuviot 10:A ja 10B esittävät sytolyyttisen aktiivisuuden ja kuvio lOc esittää kal-5 siumionin mobilisaation, jota kimeerit, joissa on pistemu-taatiot lähellä karboksipään tyrösiinia (Y62) , välittävät.,

Kuviot 10A ja 10B .edustavat tuloksia, jotka on kerätty soluilla, jotka ekspressoivat matalia ja korkeita määriä, vastaavasti, CD16: ζ-fuusioproteiineja. Kalsiumin mobilisaa-10 tiötesteissä ja sytolyysitesteissä on käytetty identtisiä symboleita ja ne on esitetty yksikinjainkoodilla oikealla puolella. Täytetyt ympyrät, CD16:ζ-proteiinia ekspressoivat solut (mfi A, 21; B, 376)? täytetyt neliöt, CDl6:7: ζ (48— 65) -proteiinia ekspressoivat solut (mfi A, 31; B, 82); 15 avoimet neliöt, CD16:7:£ (48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); ristit , CDl.6 : 7 : ζ {48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); täytetyt kolmiot, CD16*7:( (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); avoimet ympäyrät, CDl6:7:ζ (48-65)GluSlGln (mfi A, 20? B, 62); ja avoimet kolmiot, CD16:7:ζ (48-65) Tyr62Ser (mfi 20 B, 64). Kuviot 10D ja 10E esittävät sytolyyttisen aktiivisuuden ja kuvio 10F esittää kalsiumionin mobilisaation, jo- | ta kimeerit, joissa on pistemutaatiot lähellä aminopään ty- |

rosiinia (Y51), välittävät. Kalsiumin mobilisaatiotesteissä I

] ja sytolyysitesteissä on käytetty identtisiä symboleita ja ! 25 ne on esitetty oikealla puolella. Täytetyt ympyrät, CDl6:ζ-proteiinia ekspressoivat solut (mfi D, 21,2; E, 672)? täytetyt neliöt, ΟΒ1β:7:ζ (48-65) -proteiinia ekspressoivat j solut (mfi D, 31,3; E, 179); täytetyt kolmiot, CD16:7:(: j (48^65)Asn488er (mfi D, 22,4; E, 209); avoimet neliöt,

30; -GpljS;7: ζ (48-65) LeuSOSer (mfi D, 25,0 ,· E, 142) ;: ja avoimet J

kolmiot, CDl.6: 7: ξ (48-65) TyrSlEhe (mfi D, 32,3; E, 294). |

Kuviot HA - B esittävät ζ-proteiinien sisäisten | toistoalueiden alekkain vertaillin ja niiden sytolyysiä tu- | kevan kyvyn vertailun. Kuvio 11.A on kaavio kimeereistä, j 35 jotka muodostettiin jakamalla ζ-proteiinin solunsisäinen | domeeni kolmeen osaan ja liittämällä ne CD16:7-kimeerin | j 27 membraanin läpi menevään domeeni in. Solunsisäisten domeeni-en sekvenssit on esitetty alla niin, että yhteiset jäännökset on laatikoitu ja toisilleen sukua olevat jäännökset on merkitty tähdillä. Kuvio 11B esittää ζ-proteiinin kolmen 5 aladomeenin sytolyyttisen vahvuuden. Täytetyt ympyrät, CD16:ζ-prDteiiniä fmfi 476) ekspressoivat solut; täytetyt neliöt, CD16:7:ζ (33-65) (mfi H 8); avoimet neliöt, CD16:7:ζ (71-104) (mfi 114); ja täytetyt kolmiot, CDl6:7:ζ (104-138)(mfi 104).

10 Kuvio 12 on kaavio CD16:FcRyll-kimeereistä.

Kuviot 13A - B esittävät kalsiumin mobilisaation CD4:FcRyll- ja CD16:FcRyII-kimeerien ristisitomisen jälkeen. Kuvio I3A esittää kalsiumherkällä Jndo-l-fluorofo-rilla ladattujen solujen emittoiman violetti-sininen-fluo-15 resenssin suhteen ajan funktiona sen jälkeen, kun CD16- proteiinin solunulkoinen domeeni on ristisidottu vasta-aineiden kanssa. Kuvio 13B esittää samanlaisen analyysin, jossa havaitaan violetti-sininen-fluoresenssin suhteen kohoaminen soluissa, jotka sisältävät GD4:FcRyll-kimeerit, 20 kun on ristisidottu vasta-aineiden kanssa.

Kuviot 14A - B esittävät CD4 :.FcRyI3h· ja CD16 ;FORYl:l^kimeerien sytolyysi testit. Kuvio 14A esittää sen 51Cr-leiman väpautuiriisprosentin, joka vapautuu anti-· CDl6-hybridoomasoluista (kohde), kun solut altistetaan ko-25 hoaville määrille sytotoksisia T-lymfosyyttejä, jotka eks pressoivat CD16 >FcRyll-kimeerejä (effektorisolut). Kuvio 14B esittää samanlaisen analyysin, jossa sytotoksisuutta j välittävät CD4:FcRylT-kimeerit sellaisia kohdespluja vastaan, jotka, ekspressoivat HI-v.iruksen vaippaglykoproteiine- 30 ja.

Kuviot 15A - E esittävät niiden jäännösten tunnistuksen FcRyll A -hännässä, jotka ovat tärkeitä sytolyysil-le. Kuvio 15A on kaavio deleetiorakenteista. Kuviot 15B ja 15C esittävät kalsiumin mobilisaation ja sytolyysin 35 CD16:FcRyll A -proteiinin karboksipään deleetiovarianttien toimesta. Kuviot 15D ja 15E esittävät kalsiumin mobilisaa- 28 tipu ja sytolyysin sellaisten kolmiosaisten kimeerien toimesta, jotka sisältävät progressiivisesti lyhyemmän CB16:FcRyll A -proteiinin solunsisäisen hännän aminopään.

Kuvio 16 {SEQ ID -numero 24:) esittää CD 3 -delta-re-5 septoriproteiinin aminohapposekvenssin; laatikoitu sekvenssi edustaa sytolyyttistä signaalia kuljettavaa suositeltavaa aluetta.

Kuvio 17 (SEQ ID -numero 25) esittää T3-y-resepto-riproteiinin aminohapposekvenssin; laatikoitu sekvenssi 10 edustaa sytolyyttistä signaalia kuljettavaa suositeltavaa aluetta.

Kuvio 18 (SEQ ID -numero 26) esittää mbl-reseptori-proteiinin aminohapposekvenssin; laatikoitu sekvenssi edustaa sytolyyttistä signaalia kuljettavaa suositeltavaa alu-15 että.

Kuvio 19 (SEQ id -numero 27) esittää B29-reseptori-proteiinin aminohapposekvenssin; laatikoitu sekvenssi edustaa sytolyyttistä signaalia kuljettavaa suositeltavaa aluetta .

20 Kuviot 20A - E esittävät kaavion CB4-kimeereistä.

Molekyyli "A" on CD4 (Dl - D.4):Ig:ep7; molekyyli "B" on CD4(Dl, D2)·Ig:CD7; molekyyli "C" on CD4(Dl - D4):Ig:CD7:ζ; molekyyli "D" on CD4(D1, D2):Ig;CD7:ζ ja molekyyli "E" on Οϋ4:ζ. Ihmisen CD4-molekyylin solunulkoinen öomeeni, joka 25 vastaa esiasteen aminohappoja 1 - 394, liitettiin BamHl- kohdasta ihmisen IgGl-proteiinin sarana-, OHI- ja CH2-do- meeneihin, kuten: on kuvattu, aiemmin [Zettlmeiss: et ai,, DNA Cell Biol. 9.: 347 (1990)] paitsi, että käytettiin ihmisen Ig-sekvenssien cDMA^muotoä niin, että sallittiin ekspressio 30 vaccinia-rekombinanttiviruksissa. CD4“kimeerien kaksidom.ee- ninen muoto muodostettiin insertoimalla BamHI-adaptor! uniikkiin .Nhei-kohtaan (vastaa aminohappoa 200) Cp4-esiasteen c:DNA::ssa. Membraaniin kiinnittyvät sekvenssit sisälsivät 22 jäännöstä ihmisen membraaniin sitoutuneen: IgGl-pro-35 teiinin ensimmäisestä eksonista, jota seurasi CD7-proteiinin jäännökset 146 - 203. Z-proteiinin aminohapot 55 - 163 29 toimivat neliosaisten rakenteiden (G ja D) laukaisija-alueena. Z-ketjun sisältävissä neliosaisissa rakenteissa ξ-proteiinin solunsisäinen ekspressio dokumentoitiin kaupallisesti saatavalla vasta-aineella, joka on valmistettu 5 soi unsi säistä· domeenia vastaan (Coulter).

Kuvio 21 esittää HIV-1 -vaippanivkoproteiinia eks-pressoivien kohdesoltijen sytolyysin, jonka välittää syto-toksinen WHB-T-solu yksinään, joka ekspressoi erilaisia CD4-prpteiinista peräisin olevia kimeereitä effektorimole-10 kyyIsinä· Sytotoksisia testejä varten ihmisen CD8+ CD4'HLA

B44 .-proteiinin suhteen rajoittunutta t-solulinjaa WH3 ylläpidettiin IMDM-alustassa, johon oli lisätty 10 % ihmisen seerumia, kuten tässä aiemmin on kuvattu. Solut stimuloitiin ysät ei lytätyillä. (3000 rad) B44-proteiinia sisältäviin 15 lä mononukleaärisiila soluilla ja fytohemagglutiniinilla (PHA), jonka konsentraatio oli 1 pg/ml. Kun oli stimuloitu yksi vuorokausi, ΡΗΆ laimennettiin konsentraatioksi 0,5 pg/ml lisäämällä tuoretta alustaa; kolmen vuorokauden kuluttua alusta vaihdettiin kokonaan. Soluja kasvatettiin ai-20 nakin 10 vuorokautta ennen käyttöä sytotoksisissa testeissä. Solut infektoitiin sopivilla vaccinia - r ekombinan t t i -viruksilla, kuten tässä on kuvattu νΡΕίβ:lie. Infektioiden annettiin jatkua 3-4 tuntia lisää täydellisessä alustassa, jonka jälkeen solut kerättiin sentrifugoimalla ja ne 25 suspensoitiin uudelleen tiheytenä 1 x 1.07 solua/ml. Kuhunkin U-pohjaisen mikrotiitterilevyn kuoppaan, joka sisälsi 100 μΐ täydellistä alustaa, lisättiin 100 μΐ ja laimennettiin kaksinkertaisilla sarjalaimennusvaiheilla. Kussakin näytteessä kaksi kuoppaa ei sisältänyt lymfosyyttejä niin, 30 että voitiin mitata spontaani kromin vapautuminen ja kromin kokonaisotto. Kohdesolut, HeLa-sölujen alalinja S3 (HeLa S3., ÄTCC), infektoitiin kuten yllä 10 cm;n maljoilla νΡΕίβ :11a, 1.06 infektoitua solua irrotettiin liuoksella, | jossa oli PBS:ää ja 1 mM EDTA:a, sentrifugoitiin ja suspea-35 soitiin uudelleen 100 μΐ :aan 51Cr-natri\ainkromaattiä (1 mCi/ml PBS:ssä) yhden tunnin ajan 37 °C:ssa ja sitten 30 pestiin kolme kertaa PBS:llä. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 μΐ leimattuja kohdesoluja. Mikrotiitterilevyä sentrifu-goitiin voimalla 750 x g yhden minuutin ajan ja inkuboitiin neljä tuntia 37 °G:ssa. Inkubaatlaajan lopussa solut kussa-5 kin kuopassa suspensoitiin uudelleen varovaisella pipetoin-nilla, otettiin näyte inkorporoituneen kokonaisradioaktii-visuuden määrittämiseksi ja mikrotiitterilevyä sentrifugöi-tiin voimalla 750 x g yhden minuutin ajan. Otettiin pienet määrät (100 μΐ) supernatanttia ja laskettiin gamma-neste-10 tuikelaskijassa. Effektori. :kohdesolusuhde korjattiin infek toituneiden solujen prosenttimäärän suhteen mitattuna vir-taussytometrilla.

Kuvio 22 esittää HIV-1-viruksen replikaation trans-fektoituneissa solulinjoissa. Villityypin CD4-proteiinia ja 15 erilaisia rekombinanttikimeereitä stabiilisti ekspressoivat solulinjat muodostettiin ihmisen sikiön munuaissolulinjan 293 alalinjassa. HIV-1 IIIB -isolaatin virusvarastoliuos valmistettiin tiitteriksi, joka oli noin 106 infektiivistä partikkelia/ml mitattuna löppupistelaimennusanalyysillä käyt-20 täen ihmisen τ-solulinjaa C8166 indikaattorina. Infektiot suoritettiin MOI-arvolla, joka oli noin 1, 8 - 12 tuntia 37 °C:Ssa, Seuraavana päivänä solut pestiin PBS:llä kolme kertaa, trypsinoitiin, maljattiin uudelleen uusille maljoille ja viljelyäupernatantista otettiin p24-tiitterinäyte 25 (merkittiin vuorokaudeksi : 0) . Kolmen - neljän vuorokauden välein sen jälkeen s o 1 uvi 1 j e liriä s upema t ant. i t kerättiin ja säilytettiin p24-analyysiä varten. Soluille lisättiin uudelleen tuoretta alustaa, joka sisälsi hygromysiini B -yhdistettä konsentraationa 100 pg/ml. Viijelmäsupernatanttien 30 analyysi suoritettiin käyttäen kaupallista ELISA-testiin perustuvaa HIV-I p24-antigeeni -tesfcikäyttöpakkausta (Coulter) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tulokset edustavat kahta toisistaan riippumatonta koetta, jotka kestivät yhtä kauan.

31

Kuvio 23 esittää GD4-molekyylin Dl - D4-domeenien (CD4 Bam) nukleiini- ja aminohapposekvenssit.

Kuvio 24 esittää GD4-molekyylin Dl - D2 - doin e en i en (CD4 Nhe) nukleiini- ja aminohapposekvenssit.

5 Kuvio 25 esittää ihmisen igGl-proteiinin (Igh23

Bam) sarana-, CH2- ja CH3-domeenien nukleiini- ja aminohappo sekvenssit .

Kuvio 26 esittää GD4-molekyylin membraanin läpi kulkevan domeenin (TM? Bam Miu) nukleiini- ja aminohappösek-10 venssit.

Kuvio 27 esittää zeta-molekyylin solunsisäisen domeenin (Zeta Miu Not) nukleiini- ja aminohapposekvenssit.

Kuvio 28 esittää synteettisen alfa-heliksin DNA- sekvenssin ja primaarisen aminohapposekvenssin.

15 Esimerkki 1

Ihmisen IgGlrreseptorikimeerien rakennus Ihmisen IgGl-proteiinin raskasketjusekvenssit valmistettiin liittämällä CH3-domeenisekvenssit cDNA-fragmenttiin, joka oli peräisin vasta-aineen mRNA-mo 1 ekyylin mem-20 braanin läpi kulkevan muodon 3'-päästä. 3’-pään fragmentti saatiin polymeraasiketjureaktiolla käyttäen tonsillan cDNA-kirjästoa substraattina ja oiigonukleotideja, joiden sekvenssit Olivat:: CGC GGG GTG ACC GTG CCG TCC ÄGC AGC TTG GGC (SEQ ID -numero 25 7) ja CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID -numero 8), jotka vastaavat haluttujen DNA-fragmenttien 5'- ja 3'-päitä, vastaavasti. 5'-oligo on komplementaarinen ihmi-30 sen IgGl·-proteiinin CHl-dömeenin kohdalle ja 3'-oligo on komplementaarinen kohdalle, joka on juuri niiden sekvenssien 5'-puolella, jotka koodittavat membraaniin ulottuvaa do-meenia,: PCR-tuote digestoitiin Bstxi- ja BamHI-entsyymeillä ja ligoitiin Bstxi- ja BamHI-kohtien väliin semisynteetti-35 seen igGl-vasta-ainegeeniin, joka sisälsi variaabeli- ja vakioalueet. Kun Bstxi-BamHI-fragmentti oli insertoitu, ra- 32 kenteen amplifioidufc osat korvattiin CH3-domeenissa olevaan Smal-kohtaan asti restriktiofragmentin vaihdolla niin, että ainoastaan osa Smal-kohdan ja 3'-oligon välissä oli peräisin PCR-reaktiosta.

5 Ihmisen kimeerisen IgGl:ζ-reseptorin luomiseksi raskasketjugeeni, joka loppui BamHI-kohtaan, liitettiin alla kuvatun ζ-kimeerin BamHI-kohtaan niin, että vasta-aine-sekvenssit muodostivat solunulkoisen osan, Kimeeriä koodit-tavalla plasmidilla transfektoitujen COS-sölujen virtaussy-10 tömetria osoitti vastä-äinedeterminanttien korkean tason ekspression, kun yhteistransfektoitiin sellainen ekspres-sioplasirtidi, joka kooditti kevytketjun cDNA:ta, ja keskinkertaisen vasta-ainedeterminanttien ekspression, kun kevytket juekspressioplasmidi oli poissa.

15 Samanlaiset kimeerit, sisältäen ihmisen IgGl-prote iinin fuusioituna η- tai γ-proteiiniin (katso alla) tai mihin tahansa signaalia kuljettavaan T-solureseptorin tai Fc-reseptoriproteiihin osaan, voidaan rakentaa yleisesti, kuten on kuvattu yllä käyttäen molekyylibiologian standardi-20 menetelmiä.

Yksittäisen transkriptioyksikön luomiseksi, joka sallisi sekä raskas- että kevytketjujen ekspressoitumisen yhdestä promoottorista, bikistronista mRNA-molekyy1iä koo-dittava plasmidi muodostettiin raskas- ja kevytketjua koo- 25 dittavista sekvensseistä ja sellaisen mRNA:n 5’-pään trans- loimattomasta alueesta, joka koodittaa glukoosin säätelemää 78 kD proteiinia, joka tunnetaan nimellä grp78 tai BiP. Proteiinin grp78 sekvenssit saatiin PCR-menetelmällä ihmisen genomisesta DNA:sta käyttäen alukkeita, joiden sekvens-30 sit olivat: CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (SEQ ID -numero 9) ja CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID -numero 10) 33: 5‘- ja 3!-päissä, vastaavasti. Polymeraasiketjureaktiot. näillä oligoilla suoritettiin niin, että läsnä oli 10 % dimetyylisulfoksidia. PCR-menetelmällä saatu fragmentti digestoitiin NotI- ja Hinall-entsyymeillä ja insertoi-5 tiin NotI- ja Hpal-kohtien väliin alavirtaan ihmisen IgGl-proteiinia koodittavista sekvensseistä. Ihmisen igG kappa -kevytketjun cDNA:ta koodattavat sekvenssit insertoitiin sitten alavirtaan grp78-proteiinin leader-sekvenssistä käyttäen Hindi-kohtaa, ja toista kohtaa vektorissa. Näiden ma-10 nipulaatioiden tuloksena syntynyt ekspressiopiasmidi sisäl si semisynteettisen raskasketjugeenin, jonka jälkeen seurasi grp78-proteiinin leader-sekvenssit, jonka jälkeen seurasi kappa-kevytketjun cDNA-sekvenssit, jonka jälkeen seurasi polyädenylaatiosignaalit, jotka olivat peräisin SV40-DNA-15 fragmentista, CQS-solujen transfektio ekspressioplasmidilla antoi merkittävästi parantuneen raskasketjudeterminanttien ekspression verrattuna sellaisen plasmidin transfektioon, joka kooditti ainoastaan raskasketjun determinatteja.

Sellaisen bikistronisen geenin muodostamiseksi, jo-20 ka sisältää raskasketju/reseptorikimeerin ja kevytketjun, raskasketjun ylävirtasekvenssit voidaan korvata millä tahansa tässä kuvatulla kimeerisellä raskasketju/reseptori-geenillä.

Esimerkki 2 25 CD4 - resept or ikimeerien rakentaminen

Ihmisen ζ-cDNA [Weissman et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 85: 9709 - 9713 { 1988b) ] ja γ-cDNA [Kiister et ai., J. Biol. Chern. 265: 6448 - 6452 {1990)] eristettiin polyme- j raasiketjnreaktiolla kirjastoista, jotka valmistettiin HPB-30 ALL-käsvainsolulinjasta [Aruffo et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 84: 8573 - 8577 (1987b)] ja ihmisen luonnollisista tappajasoluista, kun taas η-cDNA [Uin et ai., Pro.c. Natl.

Acad. Sei. USA 87: 3319 - 3323 (1990) 3 eristettiin hiiren tymösyyttikir jastosta. Z-, η- ja γ-cDNA: t liitettiin CD4-35 proteiinin manipuloidun muodon solunulkoiseen dameeniin, jossa oli BairiHI-kohta juuri ylävirtaan membraaniin aiottu- 34 vasta domeenista [Aruffo et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8573 - 8577 {1987b); Zettlmeissl et ai·.., DNA Cell Biol.

9 : 347 - 353 (1990) ] , joka liitettiin BamHI-kohtaan, joka on luonnollisesti läsnä ζ- ja u-cDNA:ssa samanlaisella koh-,5 dalla muutamia jäännöksiä ylävirtaan membraaniin ulottuvasta domeenista (sekvenssit SEQ ID -numero 1, 3, 4 ja 6),

Puusioproteiinin muodostamiseksi γ-pröteiinin kanssa, Bam-HI-kohta· manipuloitiin sekvenssiin suurinpiirtein samaan kohtaan (kuviö: 1; sekvenssit SEQ ID -numero 2 ja 5) . Geeni-1Q fuusiot vietiin sisään vaccinia-viruksen ekspressioplasmi" eli in, joka sisälsi E. coli gpt -geenin selektiomarkkerina, ja insertoitiin vaccinia WR -kannan genomiin homologisella rekömbinaatiolla ja selektoitlin kasvun suhteen, mykofenoli-hapossa [Faulkner et ai., J. Virol. 62: 1849 - 1854 (1988); 15 Boyle et ai., Gene 65: 123 - 128 {1988}]. Virtaussytometri-analyysi osoitti, että väeeiniarekombinantit ohjaavat runsasta .CD4·: ζ- ja CD4: γ-fuusioprotelinien tuottoa solun pinnalle, kun taas CD4:η-proteiinin ekspressio on oleellisesti heikompaa (kuvio IB) . Jälkimmäinen havainto on yhdenmukai-20 nen äskettäisen julkaisun kanssa, että η-oDNA-ekspressiö-pläsmidin transfektio hiiren hybridoomasolulinjaan antoi Oleellisesti pienemmän ekspression kuin verrattavan ζ-eks-pressioplasmidin transfektio [Glayton et ai., J. Exp. Med.

172: 1243 - 1253 (1990} ]. Vacciniarekombinanteilla infek- 25 toitujen solujen immuuni saostus paljasti, että fuusioprote-iinit muodostavat kovalenttisia dimeerej ä, toisin kuin luonnollisesti esiintyvä CD4-antigeeni. Monomeeristen CD4:ζ- ja CD4:y-fuusioproteiinien ja luonnollisen CD4-proteiinin mo-iekyylimässojen havaittiin olevan 63, 55 ja 53 kD, vastaa-30 vaati. Fuusiopröteiinien suuremmat massat ovat suurinpiir- j tein yhdenmukaisia solunsisäisen osan suuremman pituuden ]

.kanssa, joka ylittää luonnollisen CD4-proteiinin vastaavan I

75 (€ϋ4:ζ) tai 5 (CD4:y) jäännöksellä. \ 35

Esimerkki 3

ClM~kimeerit voivat assosioitua muiden reseptori-ketjujen kanssa ihmisen FcyR.1 II -proteiinin (CD16th) makrofaageis-5 sa/luonnollisissa tappajasoluissa olevan muodon solupinta-ekspressio transfektanteissa tehostuu, kun samalla trans-fektoidaan hiiren [Kurosaki et ai., Nature 342: 805 - 807 (1989)] tai ihmisen (Hibbs et ai,, Science 246: 1608 - 1611 (1989)] γ-sekvenssi kuin myös ihmisen ζ-sekvenssi (Lanier 10 et ai., Nature 342* 803 - 805 (1989)].

Yhdenmukaisesti näiden julkaisujen kanssa kimeerien ekspressio salli myös CDl6TM-proteiinin pintaekspression, kun se kuljetettiin kohdesoluuii joko yhteistransfektoimalla tai yhteisinfektoimalla vaccinia-rekömbinantt iviruks illa 15 (kuvio 2) . CD16TM-proteiinin pintaekspression tehostuminen ζ-proteiinin toimesta on suurempi kuin γ-proteiinin toimesta tapahtuva tehostuminen (kuvio 2) tutkituissa solulin-joissa, kun taas luonnollinen CD4-proteiini ei tehostanut CDl6TM-proteiinin pintaekspressiota.

20 Esimerkki 4

Asp ζ -mutantit eivät koassosioidu Fc-reseptorin kanssa

Sellaisten kimeerien muodostamiseksi, jotka eivät assosisgidu olemassa olevan antigeenin tai Fc-reseptorien 25 kanssa, valmistettiin ζ-mutanttifuusioproteiinit, joista puuttui joko membraanin sisäinen Asp- tai membraanin sisäinen Cys-jäännös tai molemmat. Virtaussytometria osoitti, että eri mutattikimeerien solupintaekspression intensiteetti ei Ollut oleellisesti erilainen ei-mutatoituun esiastee-30 seen verrattuna ja immuunisaostuskokeet osoittivat, että kimeerien kokonaisekspressio oli samanlainen. Kuten odotet-tiinkin, sellaiset mutanttikimeerit, joista puuttui membraanin läpi kulkeva kysteiinijäännös, eivät muodostaneet dxsulf idisidoksellisia dimeerejä. Kaksi kimeeriä,: joista 35 puuttui Asp-jäännös, eivät kyenneet pitämään yllä: CDIS’1’1*-proteiinin pintaekspressiota, kun taas monomeeriset kimee- 36 rit, joista puuttui Cys-jäännös, mutta joissa oli Asp-j äännös, sallivat CDl6TM-proteiinin yhteisekspressoitumi-sen, mutta alemmalla tehokkuudella kuin emodimeeri (kuvio 3) .

5 Esimerkki 5

Mutanttireseptoreilla säilyy kyky aloittaa kalsium- vaste

Sen määrittämiseksi, salliiko fuusioproteiinien r.isiisi torninen vapaan solunsisäisen kalsiumin kasaantumisen 10 samalla tavalla kuin tiedetään tapahtuvan T-soluantigeeni-reseptorin tapauksessa, ihmisen T-soluleukemialinjan Purkat E6 -solut (ATCC koodinumero TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) infektoitiiu vaccinia-rekombi-nanteilla ja mitattiin suhteellinen sytoplasminen kalsium-15 konsentraatio sen jälkeen, kun solunulkoinen domeeni oli ristisidottu vasta-aineiden kanssa. Virtaussytometriamitta-ukset suoritettiin soluilla, jotka ladattiin kaislumber kalla indo-l-värillä [Grynkiewicz et ai., J. Biol. Chem. 260: 3340 - 3450 (1.985) ; Habinovitch et ai., J. Immunol. 137: 20 952 - 961 (1986)]. Kuviot 4A - D esittävät kalsiumvirtako- keiden tulokset soluilla, jotka infektoitiin CD4;ζ-proteiinilla ja ζ-proteiinin Asp" ja Cys”mutänteilla. Kimeeri-en ristisitominen kohotti toistuvasti solunsisäistä kalsiumia. CD4:η- ja CB4:γ-proteiini sallivat samalla tavalla 25 solunsisäisen kalsiumin kasaantumisen Infektoituneissa soluissa. Jurkat-solut ekspressoivat matalia tasoj a CD4-proteiinia solun pinnalle, kuitenkaan luonnollisen CD4-proteiinin ristisitominen CDl6:ζ-proteiinin läsnä- tai poissa ollessa ei muuttanut solunsisäislä kalsiumtasoja (kuviot 30 4A - B) .

Esimerkki 6 : ·0ϋ4ϊζ-, CD4;η- ja CD4 jy-kimeerit välittävät sellaisten kohteiden sytolyysiä, jotka ekspressoivat HIV gpl20/41 -proteiinia 35 Sen määrittämiseksi, laukaisisivatko kimeeriset re septorit sytolyyttiset effektoriohjelmat, muodostettiin 37 CD4- protelinin HlV-vaipan gp!20/gp41-kompleksin tunnistukseen perustuva kohde:effektorisysteemimalli. HeLa-solut in-fektoitiin vaecinia-rekombinanttiviruksilla, jotka ekspres-soivat gpl20/gp41-proteiinia [Chakrabarti et al., Nature 5 320: 535 - 537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64: 2448 - 2451 (1990} ], ja leimattiin 51Cr-leimalla. Leimattuja soluja inkuboitiin sellaisten solujen kanssa, jotka olivat peräisin ihmisen allospesifisestä sytotoksisesta T-lymfosyytti! inj as ta (CD8‘, CD4"1, joka oli infektoitu vaccinia-rekom-10 binanteilla, jotka ekspressoivat CD4 : ζ-, CD4:r)- tai CD4: y-kimeerejä tai CD4: ζ CysllGly:Aspl5Gly -kaksöismutantti-kimeeriä. Kuviot 5A - G osoittavat, että HeLa-solut, jotka ekspressoivat gpl20/41-proteiinia, lyysautuivat spesifisesti sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) toimesta, jotka eks-15 pressoivat CD4-kimeereja. Infektoitumattomat HeLa-solut eivät olleet CD4:ζ-kimeerien sisältävien CTL-solujen kohteena ja HeLa-soluja, jotka ekspressoivat gpI20/41-proteiinia, ei tunnistettu infektoitumattomien CTL-solujen toimesta. Eri kimeerien tehokkuuden vertaamiseksi effektori:kohde-suhteet 20 korjattiin CD4-kimeerejä ekspressoivalle CTL-solufraktiolle ja sille HeLa-solufraktiolle, joka ekspressoi gpl20/4l-pro-teiinia mitattuna virtausytometrialla. Kuvio 5C esittää niiden CTL-solujen CD4-ekspression sytometrisen analyysin, joita käytettiin kuvioissa 5A ja 5B esitetyssä sytolyysiko-25 keessa. Vaikka pinnalla olevan CD4:ζ-proteiinin keskimääräinen tiheys ylitti suuresti CD4:η-proteiinin keskimääräisen tiheyden, kumpaa tahansa muotoa ekspressoivien solujen tehokkuudet olivat samanlaiset. Korjattaessa sen kohteen suhteen, joka ekspressoi gpl20-proteiinia, CD4:ζ- ja CD4:η-30 proteiinien välittämän sytolyysin tehokkuus on verrannollinen parhaisiin tehokkuuksiin, jotka on julkaistu spesifisille T-solureseptorin kohde:effektori-pareille (keskimääräinen ef f ektori: kohde-sxihde 50 prosenttiselle vapautukselle sellaisilla T-soluillä, jotka ekspressoivat CD4:ζ-pro-35 teiinia, oli 1,9 ± 0,99, n = 10. CD4:y-fuusio oli vähemmän aktiivinen kuin oli myös CD4:ζ-fuusio, josta puuttui mem- 38 hraanin läpi kulkevat Asp- ja Cys-jäärmökset. Kuitenkin molemmissa tapauksissa havaittiin merkittävä sytolyysi (kuvio 5B - C) ,

Sen mahdollisuuden kontrolloimiseksi, että vacci-5 nisinfaktio edistäisi keinotekoisesti tunnistusta CTL-solu jen toimesta, suoritettiin samanlaiset sytolyysikokeet koh-desoluilla, jotka infektoitiin vaccinia-rekombinanteilla, jotka ekspressoivat GDI6-proteiinin fosfatidylinositoliin liitettyä muotoa (CD16PI) ja leimattiin 51Cr-leimalla, ja 10 CTL-soluillä, jotka infektoitiin verrokkireJcoiiibinanteilla, jotka ekspressoivat joko CDlöpj- tai CD16: ζ-proteiinia. Kuvio 6Ά esittää, että T-solut, jotka ekspressoivat ei-CD4-kimeerejä, eivät tunnista luonnollisia HeLa-soluja tai He-La-soluja, jotka ekspressoivat gpl20/41-proteiinia, ja sa-15 maila tavalla sen, että T-solut, jotka ekspressoivat CD4-kimeerejä, eivät tunnista HeLa-soluja, jotka ekspressoivat muita yaecinia-viruksen koodittamia pintaproteiineja. Lisäksi CTL-splut, jotka ekspressoivat ei-kimeeristä CD4~pro~ teiinia, eivät merkittävästi lyysaa HeLa-soluja, jotka eks-20 pressoivat gpl2O741-proteiinia (kuvio 6A).

Esimerkki 7 MHC luokka il -proteiinia sisältävät solut eivät ole kimeerien kohteena CD4-proteiinin ajatellaan interaktoivan ei-polymor-25 fisen sekvenssin kanssa, jota MHC luokka II -antigeeni eks- pressoi [Gay et ai., Nature 328: 626 - 629 (1987); Sleckman et ai., Mature 328: 351 - 353 (1987)]. Vaikka spesifistä interaktiota CD4-proteiinin ja luokka II -antigeenin välillä ei ole koskaan dokumentoitu puhdistetuilla proteiineille) la, tietyissä olosuhteissa adheesio sellaisten solujen, jotka ekspressoivat CD4-proteiinia, ja sellaisten solujen, jotka ekspressoivat luokka II -molekyylejä, välillä voidaan osoittaa [Doyle et ai., Nature 330: 256 - 259 (1987);

Clayton et ai., J. Exp. Med. 172: 1243 - 1253 (199:0); La-35 marre et ai., Science 245: 743 - 746 (1989)3 , Seuraavaksi tutkittiin, voidaanko havaita tappo sellaisia soluja vas- 39 taan, jotka sisältävät luokka II -molekyylin, Kuvio 6B esittää, että CD4:ζ-proteiini ei ohjaa mitään spesifistä sytolyysiä Raji B-solulinjaa vastaan, joka ekspressoi runsaasti luokka II -antigeeniä. Vaikka vaatimaton {noin 5 %) 5 sytolyysi havaitaan, luokka II -negatiivinen Raji-mutantti RJ2.2.5 [Accolla et ai., J. Exp. Med. 157: 1053 - 1058 {1983}] osoittaa samanlaisen herkkyyden kuin Raj i-solut, joita on inkuboitu infektoimattomien T-solujen kanssa.

Esimerkki 8 10 T-soluantigeeni/Fc-reseptorin ζ-ketjun aiheuttaman sytolyysin induktioon tarvittavat sekvenssit

Vaikka kimeerit CD4- ja ζ-proteiinien välillä voivat aseistaa sytotoksiset T-lymfosyytit {CTL) niin, että ne voivat tappaa HIV gpl20 -proteiinia ekspressöivat koh-15 desolut, vaihtoehtoa CD4-proteiinille etsittiin ihmisen T-solulinjoihin vietyjen ζ-kimeerien ominaisuuksien suoraksi vertaamiseksi. Sellaiset linjat voivat ekspressoida CD4-proteiinia, joka tekee vaikeaksi sen suhteen spesifisen määrityksen, joka on eri kimeerien kalsiumin mobilisaation 20 ja sytptoksisen potentiaalin tyypin tai tason välillä. Tämän kiertämiseksi muodostettiin sellaiset, kimeerit ζ- ja GDI6-proteiinien välille, joissa GDI6-proteiinin solunul-koinen domeeni on kiinnitetty ξ-proteiinin membraanin läpi kulkevaan ja solunsisäiseen sekvenssiin (kuvio 7A) . Geeni-25 fuusiot vietiin sisään väbciniayiruksen ekspressioplasmi-diin, joka sisälsi E. coli gpt -geenin selektiomarkkerina, ja insertoitiin vaccinia WR -kannan genomiin homologisella rekombinaatiolla ja selektoitiin kasvun suhteen mykofenoli-hapossa [Falkner ja Moss, J, Virol. 62: 1849 (1988) ; Boyle 30 ja Coupar, Gene 65: 123 (1988)].

T-solulinjat infektoitiin vaccinia-rekombinanteilla ja: suhteellinen sytoplasminen vapaan kalsiumionin. konsent-raatio mitattiin sen jälkeen, kun solunulkoiset domeenit oli ristisidottu vasta-aineilla. Sekä spektrofluorimetriset 35 (koko populaatio) että virtaussytometriset (yksittäissolu) mittaukset suoritettiin soluilla, jotka oli ladattu lndo-1- 40 värillä [Grynkiewicz et ai., J. Biol. Chem. 260: 3440 (1985); Rabinovitch et ai., J. Immunol. 137; 952 (1986)]. Kuviossa 7B esitetään niiden tulosten analyysi, jotka kerättiin ihmisen T-soluleukemialinjan Jurkat soluista, jotka 5 oli infektqitu vaccinia-rekombinanteilla, jotka ekspressoi-vat CD16:ζ-fuusiöproteiinia. Kimeerien ristisitominen kohotti toistuvasti solunsisäisen kalsiumin määrää, kun taas sellaisten solujen samanlaisella käsittelyllä, jotka eks-pressoivat ei-kimeeristä CDl6-proteiinia, oli vain vähän 10 tai ei ollenkaan vaikutusta. Kun kimeeriä ekspressoitiin mutanttisolulinjoissa, joista puuttui antigeenireseptori, joko linjassa REX33Ä: [Breitmeyer et ai., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et ai. , J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989:) ] tai Jurkat-mutantissa JRT3 .T3.5 [Weiss et ai. , J. 15 Immunol. 135: 123 (1984)], havaittiin vahva vaste CB1.6- proteiinin vasta-aineen ristisitamiselle. Samanlaiset tulokset on kerätty REX2QA-mutanttisolulinjalla [Breitmeyer et ai,, yllä, 1987; Blumberg: et ai., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990)] ja CD3/Ti-negatiivisella Jurkat-solulinja- 20 mutantilla, joka on muodostettu tässä laboratoriossa. Infektio rekombinanteilla, jotka ekspressoivat CD16:ζ-proteiinia, ei muodostanut uudelleen vastetta anti-CD3-vasta-aineelle, joka osoitti, että fuusioproteiini ei toiminut pelastamalla CD3-kompleksin solunsisäisiä ketjuja.

25 Jotta voitiin arvioida kimeerien kyky uudelleen oh jata soluvälitteistä immuniteettiä, CTL-solut infektoitiin vaccinia-rekombinanteilla, jotka ekspressoivat CDl6-kimee-rejä, ja niitä käytettiin spesifisesti lyysaamaan hybridoo-masolut, jotka ekspressoivat membraaniin sitoutuneita anti-30 CDlö-vasta-aineita. Tämä testi on laajennus hybridoomasyto-toksisuustestiin, joka alunperin kehitettiin analysoimaan sellaisten solujen effektorimekanismeja, jotka sisältävät Fc-reseptoreita (Graziano ja Fanger, J, Immunol. 138: 945, 1987,- Graziano ja Fanger, J. Immunol. 139: 35 - 36, 1987; 35 Shen et ai., Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger et ai., Immunol. Today 10: 92, 1989). Kuvio 8B esittää, että 41 CD16:ζ-proteiinin ekspressio sytotoksisissa T-lymfosyyteissä sallii sen,, että aseistetut CTL-solut voivat tappaa 3G8-hybridooinasolut (anfci-GDl6; Fleit et ai., Proc. Natl. Acäd,

Sei. USA 79 : 3275 , 1982), kun taas CTL-solut, j otka eks- 5 pressoivat CD16-proteiinin fosfatidylinositöliin liittynyttä muotoa, ovat inaktiivisia. CD16:ζ-proteiinin sisältävät CTL-solut eivät myöskään tapa hybridoomasoluja, jotka eks-pressoivat asiaankuulumatonta vasta-ainetta.

Niiden ζ-proteiinin minimisekvenssien tunnistami-10 seksi, jotka tarvitaan sytolyysiin, valmistettiin ryhmä de-leetiomutantteja, joissa peräkkäin enemmän ζ-proteiinin so-lunsisäisestä domeenista poistettiin karboksipäästä (kuvio 8A) , Suurin osa ζ-proteiinin solunsisäisestä domeenista voitiin poistaa niin, että sytolyyttiselle potentiaalille 15 aiheutui ainoastaan pieniä vaikutuksia; täyspitkä CD16:ζ-kimeeri oli tehokkuudeltaan oleellisesti samanlainen verrattuna kimeeriin CD16:ζ Asp66*, joka oli deletoitu jäännökseen 65 asti (kuvio 8B) . Oleellinen vähentyminen syto-toksisuudessa havaittiin, kun ζ-proteiini deietoitiin jään-20 nökseen 59 (kimeeri CD16: ζ GluSÖ*), ja lisädeleetio jäännökseen 50 johti hiukan pienempään aktiivisuuteen. Täydellistä aktiivisuuden häviämistä ei kuitenkaan havaittu edes silloin, kun solunsisäinen domeeni pienennettiin kolmen jäännöksen pituiseksi membraanin läpi kulkevaksi ankkuriksi 25 (kuvio: 8B) .

Koska ζ on disulfidilla sidottu .dimeeri:,, yksi seli- j tys sytolyyttisen aktiivisuuden säilymiselle oli se, että endogeeninen ζ muodosti heterodimeereitä kimeerisen ζ-de-leetion kanssa näin muodostaen uudelleen aktiivisuuden. Tä-30 män idean testaamiseksi ζ-proteiinin jäännökset 11 ja 15 muutettiin Asp- ja Cys-jäännöksistä, vastaavasti, Gly-jäännöksiksi (CysllGly/AspiSGly) ja immuunisaostukset suoritettiin seuraavasti- Noin 2 x 106 CVl-solua infektoitiin yhden tunnin ajan seerumivapaassa DME-alustässä vaccinia-35 rekombinanttiviruksella niin, että infektion infektiomoni-kerta-arvo (moi) oli ainakin 10. 6-8 tuntia infektion 42

jälkeen solut irrotettiin maljoilta FBS./l mM EDTA. -liuoksella ja pintaleimattiin käyttäen 0,2 mCi 125T-leimaa/2 x. 106 solua käyttäen laktoperoksidaasia ja H202:ta menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Clark ja Einfeld (Leukocyte Typing 5 II, sivut 155 - 167, Springer- Veri a g-, NY, 1986). Leimatut solut kerättiin sentrifugoimalla ja lyysattiin liuoksessa, joka oli 1 % NP-40, 0,1 % SLS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH

8,0, 5 otM MgCl2:,: 5 mM KC1, 0,2 M: jodiasetamidi ja 1 mM PMSF. Tumat poistettiin sentrifugoimalla ja CD!6-proteiinit 10 immuunisaostettiin 3G8-västa-aineella (Flait et ai., yllä, 1982; Medarexj ja anti-laiiri-IgG-agaroosilla (Cappel, Durham, NC) . Näytteet ajettiin elektroforeesissa: 8 % polyak-ryyliamidi/SDS-geelissä ei-pelkistävissä olosuhteissa tai 1.0 % geelissä pelkistävissä olosuhteissa. Nämä immuunisaos-15 tukset varmistivat sen, että Οϋ16:ζ CysllGly/Aspl5Gly -ki meeri ei assosioitunut disulfidiliitGksellisiin dimeerira-kenteisiin.

Mutänttireseptörien syto1yy11inen aktiivisuus testattiin myös. Jäännökseen 65 asti deletoitu mutanttikimeeri 20 (CD161 ζ CysllGly/Aspl5Gly/Äsp66* ) oli testiolösuhteista riippuen 2-8 kerta vähemmän aktiivinen sytolyysitestissä kuin vastaava mutatoimaton kimeeri (CD16:ζ Asp66*), jonka aktiivisuus yleensä heitti korkeintaan kaksinkertaisesti tai oli erottumaton CD16:ζ-proteiinin aktiivisuudesta (ku-25 vio 9B) . Mutanttikimeerieh aktiivisuuden vähentyminen on verrattavissa vähenemiseen, joka havaitaan samanlaisen rakenteen sisältävien CD4-kimeerien aiheuttamaan vähenemiseen (katso yllä) ja johtuu todennäköisemmin matalammasta ζ-monomeerien tehokkuudesta verrattuna dimeereihin. Tälle 30 päinvastaisesti, Asp*' Cys" -mutatoitu kimeeri, joka on de letoitu jäännökseen 59 asti, ei sisältänyt mitään sytolyyt-tistä aktiivisuutta (kuvio: 9B), joka tukee sitä hypoteesiä, että assosiaatiota muiden ketjujen kanssa välittävät mem-braanin läpi kulkevat Gys- ja/tai Asp-jäännökset olivat 35 vastuussa heikosta sytolyyttisen aktiivisuuden säilymisestä 43 deleetiossa, joka ulottui enemmän aminopäähän kuin jäännös 65 -

Virtaussytometriatutkimukset osoittivat, että de-leetiomutaiitit, joista puuttui membraanin läpi kulkevat 5 Asp- ja Cys~jäännökset, pystyivät yhä edistämään, vapaan so-lunsisäisen kaisiumionin kohoamista vasteena vasta-aineris-tisitömiselle Jurkat TCR’-mutanttisOlulinjassa (kuvio 9D), Samanlaiset tulokset saatiin kimeereillä, joita ekspressoitiin Jurkat-emolinjassa. CD16: ζ Cysl:lGly/Äspl5Gly/Glu6Ö* 10 -proteiinin tapauksessa nämä tulokset osoittavat, että kyky välittää kalsiumin responslivisuutta voidaan: mutatoimaria erottaa kyvystä tukea sytolyysiä.

Jotta lopullisesti voitaisiin poistaa ζ-pröteiinin membraanin läpi kulkevien jäännösten mahdollinen osuus, 15 ζ-pröteiinin membraanin läpi kulkevat jäännökset ja ensimmäiset 17 sytoplasmista jäännöstä korvattiin sekvenssillä, joka kooditti CD5- tai CD7-antigeenien membr aan iin ulottuvia jäännöksiä ja ensimmäistä 14:ää tai ensimmäistä 17:ää sytoplasmista jäännöstä, vastaavasti (kuvio 9A) , Tuloksena 20 syntyneet kolmiosaiset fuusioproteiinit CD16: 5: ζ (48 - 65) ja CD16:7:ζ (48 - 65) eivät muodostaneet disulfidisidoksel-lisia dimeereitä, kuten yksinkertaisemmat CD16:ζ-kimeerit tekivät, koska niistä puuttui ζ-proteiinin membraanin läpi kulkevan domeeniri kysteiinijäännös. Molemmat kolmiosaiset 25 kimeerit kykenivät mobilisoimaan kalsiumin Jurkat- ja TCR-negatiivisissa solulinjoissa (kuvio 9D) ja saamaan aikaan sytölyyttisen vasteen CTL-soluissa (kuvio 9C ja tulokset, joita ei oie esitetty). Z-proteiinin osan lyhennys jäännökseen 59 asti kimeerissä CDl6:7:ζ (48 - 65) ehkäisee kuiten-30 kin kolmiosaisen fuusion kyvyn ohjata kalsiumin responsii-visuutta TCR-positiivisissa tai -negatiivisissa Jurkatseluissa tai sytolyysiä kypsissä CTL-soluissa (kuviot 9C ja 9D ja tulokset, joita ei ole esitetty), 18-jäännöksen pituisen alueen yksittäisten jäännös-35 ten vaikutusten tutkimiseksi valmistimme useita mutanttiva-riantteja kohdennetulla mutageneesilla ja arvioimme niiden 44 kykyä välittää reseptoriohjattua tappoa kimeerisen reseptorin matalan (kuviot 10A ja 10D) tai korkean (kuviot 1QB ja 10e) ekspression olosuhteissa. kuviot 10Ά - F osoittavat, että kun useat suhteellisen konservatiiviset Substituutiot 5 (se tarkoittaa, että korvattiin happamat jäännökset niitä muistuttavilla amiineilla tai tyrosiini feiiyylialaniinil-la}, jotka ulottuivat jäännöksiin 59 - 63, muodostivat sy-tolyyttisen aktiivisuuden keskinkertaisen kompromissin, yleensä varianteissa Säilyi kyky mobilisoida kalsiumia.

10 Kollektiivisesti nämä jäännökset kuitenkin sisältävät tärkeän osa-alueen, koska niiden deleetio poistaa sytolyytti-sen aktiivisuuden. Tyr62-jäännöksen muuttaminen joko Phe-tai Ser-jäännökseksi poisti sekä sytotoksisen että kalsium-vasteen. 18-jäännöksen pituisen alueen aininopäässä TyrSl-15 jäännöksen korvaaminen Phe-jäännöksellä poisti sekä: kalsiumin mobilisaation että sytolyyttisen aktiivisuuden:, kun taas Leu-jäännöksen subs tatuoiminen Ser-jäännöksellä kohdassa 50 poisti kalsiumvasteen, kun taas häiritsi ainoastaan osittain sytolyysiä. Ilman, että sitoudutaan mihinkään 20 tiettyyn hypoteesiin epäillään, että LeuSOSer-mutantin kyvyttömyys mobilisoida kalsiumia lyhytaikaisissa virtaussy-tometriakokeissa ei täysin heijasta sen kykyä välittää vapaan solunsisäisen kaisiumionimäärän oleellista kohoamista pidemmällä aikavälillä sytolyysitestissä. Kuitenkin jois-25 sain sytolyyttisissä T-soliilinjoissa on julkaistu sytolyyt-tinen aktiivisuus, joka ei ole kalsiumille herkkä ja sitä mahdollisuutta, että samanlainen ilmiö on tässä kuvattujen tulosten takana, ei ole laskettu pois. Asn4 8-j äännöks en korvaaminen Sen-jäännöksellä häiritsi osittain sytotoksi-30 suutta joissain kokeissa, kun taas toisissa kokeissa sillä j oli pieni vaikutus. |

Ylimääräisten. sekvenssielementtien mahdollisen roo- j

Iin tutkimiseksi ζ-proteiinin solunsisäinen domeeni jaettiin kolmeen alueeseen, jotka sisälsivät jäännökset 33 -35 65, 71 - 104 ja 104 - 138. Kukin näistä alueista kiinnitet tiin CD16:CD7-kimeeriin MluI-kohdan välityksellä, joka oli 45 lisätty juuri CD7-proteiinin solnnsisäisen domeenin emäksisten membraaniin ankkuroivien sekvenssien distaalipuolel-le {katso alla; kuvio 11A) . Kolmen elementin sy t o lyy t1is en tehokkuuden vertailu osoitti, että ne olivat oleellisesti 5 yhtä, vahvoja (kuvio 11B), Sekvenss ivertailu {kuvio 11A) osoittaa, että toinen alue sisältää 11 jäännöstä tyrosli-nien välissä, kun taas ensimmäinen ja kolmas alue sisältää 10 jäännöstä.

Vaikka tarkkaa T-soluaktivaatioprosessin selvitystä 10 ei ole tehty on selvää:, että antigeenireseptorin tai sellaisten reseptorikimeerien, jotka sisältävät ζ-proteiinin solUnsisäiset sekvenssit, aggregaatio laukaisee kalsiumin mobilisaation, sytokiini- ja jyväsvapautumisen ja aktivaation solupintamarkkereiden ilmestymisen. Z-proteiinin ak-15 tiivinen kohta, joka on lyhyt lineaarinen peptidisekvenssi, joka on .luultavasti liian lyhyt, jotta sillä olisi: luontaista entsyymiaktiivisuutta, interaktoi todennäköisesti yhden tai korkeintaan muutaman proteiinin kanssa välittäen soluaktivaation. On myös selvää,;: että vapaan kalsiumin mo-20 bilisaatio ei yksin riitä soluaktivaatiöön, koska kyky välittää sytolyysiä voidaan muta toisaalla erottaa kyvystä välittää kalsiumin kasaantuminen.

Kuten tässä on osoitettu, 18 jäännöksen lisääminen ζ-proteiinin solunslsäisestä domeenista kahden ei-sukua 25 olevan proteiinin membraahin läpi kulkevaan ja solunsisäi-seen domeeniin sallii tuloksena syntyneiden kimeerien ohjata sytolyyttinen aktiivisuus uudelleen sellaisia kohdesolu-ja vastaan, jotka sitoutuvat fuusiopröteiinien solunulkoi-seen osaan. Vaikka kimeerit., jotka, sisältävät 18-jäännöksen 30 pituisen alueen, ovat: noin 8-kertaa vähemmän aktiivisia kuin kimeerit, jotka perustuvat täyspitkään ζ-proteiiniin, alentunut aktiivisuus voi johtua sellaisten membraanin läpi kulkevien interaktioiden häviämisestä, jotka normaalisti sallivat villityypin ζ-proteiinin muodostaa disulfidilii-35 toksellisia dimeerejä. Se tarkoittaa, ζ-deleetiprakenteet, joissa on sama karboksipää kuin alueessa ja joista puuttuu 46 rfiembraanin läpi kulkevat Cys- ja Asp-jäännökset, sisältävät tyypillisesti hiukan pienemmän aktiivisuuden kuin kimeerit, joissa on ainoastaan 18-jäännöksen alue.

Sytolyysiin osaa ottavassa elementissä, johon olem-5 me keskittyneet, on kaksi tyrosiinia eikä yhtään seriiniä tai treoniinia, joka poistaa sen mahdollisuuden, että fos-forylaatio ottaa osaa aktiivisuuteen. Kumman tahansa tyro-siinin mutaatio kuitenkin tuhoaa aktiivisuuden ja vaikka preliminääriset kokeet eivät osoita oleellista tyrosiinin 10 fosforylaatiota, joka seuraisi 18-jäännöksen pituisen alueen sisältävien kimeeristen pinta-antigeenien ristisitömis-ta, sellaisen fosforylaation osan ottoa matalalla tasolla ei voida jättää pois laskuista,. Näiden kahden tyrosiini-jäännöksen kohdalla havaittujen vaikutusten lisäksi useat 15 aminohappokprvaukset alueen amino- ja karboksipäissä heikentävät aktiivisuutta matalan reseptoritiheyden olosuhteissä .

Samanlaisia sekvenssejä kuin ζ-proteiinin aktiivinen alue voidaan löytää useiden muiden membraanin läpi kul-20 kevien proteiinien sytoplasruisista domeeneista sisältäen CD3 δ ja γ-molekyylit, pinta-igM-proteiiniin assosioituneet j proteiinit mbl ja B29, ja korkea-affUnisen IgE-reseptorin FceRI β- ja γ-ketjut {Reth, Nature 338: 383, 1989). Vaikka näiden sekvenssien toiminta on epävarma, jos niitä ekspres-25 soidaan tehokkaasti, kukin voi kyetä autonomiseen T-solu-aktivaatioon ja sellainen aktiivisuus voi selittää sen jäljelle jääneen TCR~vasteen, joka havaitaan (-negatiivisessa mutanttisölulinjassa (Sussman et ai., Cell 52: 85, 1988).

Z-proteiihi itse sisältää kolme sellaista sekvens- j 30 siä, jotka ovat sijoittuneet suurinpiirtein -tasaisesti, ja i solunsisäisen domeenin jako suurinpiirtein kolmeen osaan osoittaa, että kukin kykenee aloittamaah sytölyyttisen vasteen. H-p.ro t ei inistä.,· joka on (-proteiinin silmukointi-isomuoto (Jxn et ai., yllä, 1990; Clayton et ai., Proc. ) 35 Mäti. Acad, Sei. USA: 88: 5202, 1991), puuttuu kolmannen ] alueen karboksipuöli. Koska ensimmäisen alueen karboksipuo- j 47

Ien poisto poistaa aktiivisuuden tuntuu todennäköiseltä, että suurin osa η-proteiinin biologisesta tehokkuudesta voi johtua kahdesta ensimmäisestä alueesta. Vaikka eri mittauksilla η-proteiini on yhtä aktiivinen kuin ζ-proteiini anti-5 geenivälitteisen sytokiinivapautuksen edistämisessä (Bauer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3842, 1991) tai sy-tolyysin uudelleen ohjaamisessa (katso yllä), η ei fosfory-loidu vasteena reseptorin stimulaatioon (Bauer et ai., yllä, 1991). Näin ollen joko kaikkien kolmen alueen läsnäolo 10 tarvitaan fosforylaätiota varten tai kolmas alue edustaa tunnistamattoman tyrosiinikinaasin suosimaa substraattia.

Esimerkki 9

Ihmisen Pc “reseptorin sytolyyttisen signaalin kuljetus 15 Ihmisen erilaisten Fc-resepfcorialatyyppien toimin nan arvioimiseksi muodostettiin sellaiset kimeeriset molekyylit, joissa ihmisen CD4-, CD5- tai CDl6-antigeenin so-lunulkoinen domeeni liitettiin FcRllyA-, -Bl-, -B2- ja -C-alatyyppien xnembraanin läpi kulkeviin ja .solunsisäisiin do~ 20 meeneihin (nimistö julkaisun Ravetch ja Kinet, Arm. Rev. Immunol. 9: 457, 1991, mukainen). Spesifisesti DNA-sekvens-sit, jotka vastasivat aiemmin kuvattujen FcRIIA-, -Bl- ja -B2-isomuo;tojen membraanin läpi kulkevia ja sytoplasmisia domeeneja:, amplifioitiin jo olemassa olevasta kloonista 25 PC23 tai ihmisen tonsilIän cPNA-kirjastösta (rakennettiin Standardimenetelmin:)' käyttäen; seuraavia synteettisiä oligo-nukleotidialukkeita CCC GGA “ICe CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID -numero 18;

FcRII A eteenpäin); 30 CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ÄTG GTC GTT (SEQ; ID -numero 19; FcRII A käänteinen) ; GCG: GGG GGA TCC CAQ TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ÄCC G (SEQ ID -numero 20; FcRII Bl ja FcRII B2 eteenpäin); ja GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID -numero 35 21; FcRII Bl ja FcRII B2 käänteinen).

48 Nämä alukkeet sisälsivät katkaisukohdat BamHI- ja NotI-entsyymeille, vastaavasti., sisennettynä kuuden jäännöksen päässä 5'-päästä. Notl-kohtaa seurasi välittömästi antisehse-lopetusködoni, joko CTA tai TTA., Kaikki alukkeet 5 sisälsivät 18 jäännöstä tai enemmän, jotka olivat komplementaarisia haluttujen fragmenttien 5’- ja 3'-päille. FcRllyC-proteiinin sytoplasmista domeenia vastaava cDNA-fragmentti, joka eroaa IIA-isömuodosta ainoastaan yhden aminohappojäännöksen (L on P jäännöksessä 268) verran, muo-10 dostettiin kohdennetulla mutageneesillä pääl1ekkäi s-PCR-menetelmällä käyttäen alukkeita, joiden sekvenssit olivat: TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG ÄÄÄ CCA ACA A (SEQ ID -numero 22) ja TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A {SEQ ID -numero 15 23).

PGR-fragmentit insertoitiin vaccinia-viruksen eks-pressiovektoreihin, jotka sisälsivät CD16- tai CD4-prote-iinin solunulkoiset domeenit, vastaavasti, ja sen jälkeen insertoitiin villityypin vacciniavirukseen rekombinoimalla 20 tyrnidiinikinaasilokukseen käyttäen selektiossa E. coli gpt -geenin yhteisintegraatiota haluttujen rekombinanttien tunnistuksen tehostamiseksi. Kaikkien isomuotojen (esitetty kuviossa 12) identiteetit varmistettiin dideöksisekvensoinnilla.

25 Kimeeristen reseptbriproteiinien tuotto varmistet tiin lisäksi immuunisaostustutkimuksilla. Noin 107 JRT3.T3,5-solua infektoitiin yhden tunnin ajan seerumivapaassa IMDM-alustassa rekombinanttivacciniavirusten kanssa niin, että infektiomonikerta-arvo oli ainakin 10. 12 tuntia 30 infektion jälkeen solut kerättiin ja pxntaleimattlin käyttäen 0,5 mCi 125l-leimaa/ TO7 solua käyttäen laktoperoksidaa-si/ glukoosioksidaasi^mehetelmää (Clark ja Einfeld, yllä).

Leimatut solut kerättiin sentrifugoimalla ja ne lyysattiin liuoksella, joka oli 1 % NP-40, 0,1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 35 0,2 M jodiasetamidi ja 1 mM PMSF. Tumat poistettiin sentri- | fugoimalla ja CDl6-fuusioproteiinit irnmuunisaostettiin 4G8- 49 vasta-aineella ja anti-hiiri-IgG-agaroosilla. Näytteet ajettiin elektroforeesissa pelkistävissä olosuhteissa. Kaikki immuunisaostetut kinteeriset reseptorimolekyylit olivat mo-lekyylimassaitaan odotetun kokoisia* 5 Sen, testaamiseksi, kykenivätkö kimeeriset resepto rit välittämään sytoplasmisen vapaan kalsiumionin määrän kohoamista, rekoitbinanttiviruksia käytettiin infektoimaan Jurkat JRT3.T3.5 -solulinjan TCR"-mutantti (kuten tässä on kuvattu) ja sytoplasminen vapaa kalsium mitattiin soluissa 10 {kuten tässä on kuvattu) sen jälkeen, kun reseptorin so-lunulkoiset domeenit oli ristisidottu monoklonaalisella 3G8- tai Leu~3A-västa-aineella (kuten tässä on kuvattu). Nämä kokeet paljastivat, että FcRyll A ja C -proteiinien solunsisäiset domeenit kykenivät välittämään sytoplasmisen 15 vapaan kalsiumionin määrän kohoamista sen jälkeen, kun so-lunulkoiset domeenit oli ristisidottu, kun taas FcRyll B1 ja B2 -proteiinien solunsisäiset domeenit olivat inaktiivisia verrattavissa olosuhteissa (kuviot 13A ja 13B) * FcRyll A -proteiinin CD4-, CD5- ja CDl6-hybrideillä oli oieelli-2 0 sesti samanlainen kapasiteetti edistää kalsiumyastetta (kuviot 13A - B) . Muut solulinjat, sekä monosyytti- että lym-fosyyttilinjoista, kykenivät respondoimaan signaaliin, jonka solunulkoisten domeenien ristisitominen aloitti.

FcRYlI-proteiinin eri solunsisäisten domeenien roo-25 Iin tutkimuseksi sytolyysissä ihmisen sytotoksiset T-lymfosyytit (CTL) infektoitiin vacciniarekoxnbinanteilla, jotka ekspressoivat CD16:FcRyII A, Bl, B2 ja C -kimeerejä. Sitten infektoituja soluja viljeltiin yhdessä 51Cr-leimattujen hybridoomasolujen (se on, 3G8 10-2 -solujen) kanssa, jotka 30 ekspressoivat solupinta-vasta-ainetta CDl6-proteiinia vastaan* Tässä kokeessa CTL-solut, jotka sisälsivät CD16-kimeerin, tappoivat hybridoomakohdesolut (sallien vapaan 51Cr-leiman vapautumisen) , jos kimeerin CDl6-protelinin so-lunulkoinen domeeni oli liitetty sellaiseen solunsisäiseen 35 segmenttiin, joka kykeni aktivoimaan lymfosyytin effekto-riohjelman; tämä sytolyysitesti on kuvattu alla yksityis- 50 kohtaisesti. Kuviossa 14A esitetään,: että CD16;FcRyll A ja C -proteiinin, sisältävät, mutta ei FcRyll Bl tai B2 -proteiinin sisältävät:/ CTL-solut kykenevät lyysaamaan koh-desolut, jotka ekspressoivat anti-CDl6-solupintavasta-ai-5, net ta.

Sen mahdollisuuden poistamiseksi, että spesifinen sytolyysi johtui jollain tavalla interaktiosta CQl6-osan kanssa, suoritettiin sellaiset sytqlyysikokeet, joissa FcRli-pföteiinin solunsisäiset dömeehit kiinnitettiin: CD4-10 proteiinin solunulkoiseen domeeniin. Tässä tapauksessa koh-desolut olivat HeLa-soluja, jotka ekspressoivat Hi-viruksen vaipan gpl20/41-proteiineja [spesifisesti HeLa-solujä, jotka oli infektoitui· Vaccinia*-vektorilla vPE16 (saatavissa kokoelmasta National institute of Allergy and Infections -Dll'S· sease AIDS Depository, Bethesda, MD)]. Kuten CD16-syst.ee-missä, Hi-viruksen vaippaa ekspressoivat kohdesolut olivat herkkiä sellaisten T-solujen aiheuttamalle lyysille, jotka ekspressoivat CD4iFnRyii A -kimeeriä, mutta ei FcRyll Bl tai B2 -kimeeriä (kuvio 14B).

20 FcRyll A ja C -proteiinin solunsisäiset domeenit eivät sisällä merkittävää sekvenssihomologiaa minkään muun proteiinin kanssa sisältäen laajennetun FcRy/TCR^-ryhmän jäsenet. Niiden sekvenssielementtien määrittämiseksi, jotka ovat vastuussa sytolyysin induktiosta, valmistettiin solun-25 sisäistä domeenia koodattavien sekvenssien 5'- ja 3'-deleetiot (kuvattu alla ja esitetty kuviossa 15A) ja ne arvioitiin niiden tehokkuuden suhteen mobilisoida kalsiumia ja sytolyysitesteissä (kuten tässä on kuvattu). Kokeissa, joissa solunsisäiseu domeenin aminopään osa poistettiin, 30 FcRyll-proteiinin membraanin läpi kulkeva domeeni korvat tiin ei-sukua olevalla CD7-antigeenin membraanin läpi kulkevalla domeeni 1,1 a niin,: että poistettiin membraaniin ulottuvan domeenin välittämien interaktioiden mahdollinen: osallistuminen.

51

Kuviot 15B ja 15C esittävät, että 14 karboksipään jäännöksen poisto sisältäen tyrosiini 298 -jäännöksen, johti täydelliseen sytolyyttisen kapasiteetin häviämiseen ja oleelliseen alenemiseen kalsiumin mobilisaatiovahvuudessa.

5 Lisädeleetio juuri tyrosiinin 282 eteen antoi samanlaisen fenotyypin {kuviot 15B ja 15C) . Solunsisäisen domeenin de-leetiolla N-päästä jäännökseen 268 ei ollut mitään oleellista vaikutusta kalsiumprofiiliin tai sytölyyttiseen vahvuuteen, kun taas deleetio jäännökseen 275 häiritsi merkit-10 tävästi vapaan kalsiumin vapautumista, mutta sillä oli vain vähän vaikutusta sytolyysiin (kuviot 15D ja 15E). Lisäde-leetio jäännökseen 282 antoi FcKIi-hännät, joilta puuttui kyky sekä mobilisoida kalsiumia että laukaista sytolyysi (kuviot 15D ja 15E) . Näiden raakamittausten määrittelemä 15 'aktiivinen elementti' on suhteellisen suuri (36 aminohappoa) ja se sisältää kaksi tyrosiinia, joita erottaa 16 jäännöstä.

Esimerkki 10

Kimeerisiä CD4-reseptoreita sisältävien lymfosyyt-20 tien, jotka eivät tue infektiota, kohdennettu sytolyysi

Kuten yllä on keskusteltu, voidaan rakentaa sellaiset effektQr.imolekyyl.itjotka ohjaavat uudelleen CTL— solujen sytolyyttisen aktiivisuuden MHC-molekyylistä riippumat t oma llä tavalla. Esimerkiksi kimeeri, joka sisältää 25 CD'4-proteiinin so lumiko isän domeenin .fuusioituna ζ-ket juun ihmisen CTL-kloonissa WH3, tappaa spesifisesti kohdesolut, jotka sisältävät HIV-1-viruksen pinnan vaippaglykoproteii-nin gpl20. Kuitenkin, koska CD4-molekyylin sölunulkoinen domeehi saa aikaan, herkkyyden HIV-infektiolle, sitä sisäl-30 täväfc CTL-solut voivat tulla viruksen infektion kohteeksi, joka johtaa alenemiseen niiden vahvuudessa [Palgleish et ai., Nature 312: 767 (1984); Klatzmann et ai., Nature 312: 767 (1984)], Sellaisen tapahtuman estämiseksi suunniteltiin sellaiset C.D4-p.roteii.niin perustuvat kimeeriset effektori-35 molekyylit, jotka ovat tehokkaita spesifisesti kohdentamaan HX-viruksella infektoituneet, solut soluvälitteistä tappoa 52 varten, mutta jotka eivät saa aikaan herkkyyttä HI-virusinfektio IX e,·

Muodostettiin kolmiosainen fuusioproteiini liittämällä geneettisesti CD4-proteiinin solunulkoinen domeeni & (kuvio 23) Uimisen IgGl-proteiinin raskasketjun sarana-domeeniin ja toiseen ja kolmanteen vakiodomeeniin [Zettl-meissl et ai., DNA Cell Biol., 9: 347 (1990)] (kuvio 25), jotka liitettiin tässä tapauksessa osaan ihmisen membraa-niin sitoutuneen IgGl-proteiinin ensimmäistä membraanin lä-10 pi kulkevaa eksonia, jota seurasi ihmisen CD7-antigeenin osa, joka sisältää sekvenssit ainoan Ig-kaltaisen domeenin ja siirtolopetussignaalin välissä, jotka seurasivat mem-braanin läpi kulkevaa domeenia [Aruffo ja Seed, EMBO j. 6: 3 313 (1987)](kuvio 26) . CD7-segmentin solunulkoisen osan 15 primaarinen aminohapposekvenssi sisälsi proliinirikkaan alueen, joka antoi ehdottaa sellaisen varsimaisen rakenteen olemassaolon, joka ohjaa Ig-kaltaisen domeenin poispäin solun pinnasta [Aruffo ja Seed, EMBO J. 6: 3313 (1987)](kuvio 26) . Valmistettiin vaccinia-rekomhinanttiviruksen tämän ja 20 sille sukua olevien kimeerien ekspressoimiseksi, kuten täs sä on kuvattu. Vaccinia-rekombinanttivirukset muodostettiin erityisesti homologisella rekombinaatiolla CV-l-soluissa.

Ainakin kaksi plakkitarkastuskierrosta OKT4- ja Leu3a-vasta-aineilla, joita seurasi plakkipuhdistus, suoritettiin 25 kullekin virusvarastolXe ennen korkeatiitterästen virusva- rastojen muodostamista CV-l-soluissa.

Kolmiosainen kimeeri [CD4(Dl - D4):Ig:CD7](kuvio 20, molekyyli "A") osoitti tehokkaan solupintaekspression ja se testattiin sen kyvyn suhteen toimia HIV-reseptorina 30 vaccinia-perusteisessa solusitkoksen muodostustestissä [liifsoix et ai., Nature 323: 725 (1986); Ashorn et ai., J. f

Virol. 64: 2149 (1990)]. HeLa-soluja, jotka oli infektoitu i vaccinia-rekorrb>inanttiviruksellä (VPE16), joka kooditti HIV -1 - virnks en va i ppaglykopr o tei ini a [ Ear 1 et ai,, J. Vi -35 rol. 64: 2448 (1990)], viljeltiin yhdessä sellaisten HeLa-solujen kanssa, jotka oli infektoitu joko CD4-, CD4;ζ- tai 53 CD4(D1 - D4):Ig:CD7-proteiini11a. 6 cm HeLa-solumaljat (ATCC, Rockville, MD), jotka olivat 50 % täysiä, iniektoitiin see-rumivapaassa alustassa yhden tunnin ajan niin, että infek-tiomonikerta-arvo (MOI) oli noin 10. Soluja inkuboitiin li-5 sää 5-6 tuntia täydellisessä alustassa ja sitten ne irrotettiin fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), joka sisälsi 1 mM EDTA:ta. Solut, jotka ekspressoivat vaippaa ja CD4-kiineeriä, sekoitettiin Suhteena 1:1 ja maljat-tiin uudelleen 6 cm maljoille täydellisessä alustassa. So-10 lusitkökset laskettiin 6 - 8 tuntia yhteisvlljelyn aloituksen jälkeen ja ne valokuvattiin, CD4- ja vPEl6-molekyylien yhteisviljely johti helposti tunnistettavien moni tuma i s t en .jät ti solujen muodostumiseen, Myöskin kimeeri, joka sisälsi CD4-proteiinin so-15 lunulköisen domeenin fuusioituna TCR-molekyylin ζ-ketjuun (kuvio 2;7j (CD4 : ζ ) , kykeni välittämään solusitkoksen muodos-tuksen, kun taas solut, jotka ekspressoivat CD4(D1 - D4):Ig;GD7-proteiinia, eivät antaneet mitään merkkiä solu-fuusioista . Testasimme myös. rakenteen ¢7)4(01, D2) : ig:CD7 20 (kuvio 20, molekyyli "B"), joka ekspressoi ainoastaan CD4-proteiinin ensimmäistä ja toista domeenia, (kuvio 24) , koska toisessa yhteydessä eD4-proteiinin aminopään kahden domeenin on osoitettu olevan tarpeellisia HI-virusinfektiolle [Landau et ai., Nature 334: 159: (1988)]. Tämä molekyyli 25 osoittautui Olevan epäherkkä Hl-viruksen indusoimalle solusitkoksen muodostukselle myöskin. Sitoutumiskokeet liukoisella l2^I-leimatulla gpl20-proteiinilla osoittivat, että sekä CD4 (PI - D4-) :Ig:CD7- että CD4(D1, D2) : Ig: CD7-proteiinilla oli ehdoton affiniteetti gpl20-proteiinille.

30 Seuraavaksi määritimme, kykenevätkö· ne kimeeriset molekyylit, jotka vastustivat solusitkoksen muodostusta, ohjaamaan uudelleen solutappoa, jos ne varustetaan laukaus inosal la, kuten tässä on kuvattu. Fuusioimme ζ-proteiinin solunsisäisen domeenin (kuvio 27) CD4(Dl -35 D4):Ig:CD7- ja CD4(D1, D2):Ig:CD7-proteiinin 3'-päähän ja valmistimme vastaavat vaccinia-rekomtoinanttivir-ukset. Näitä 54 rakenteita CD4 {Dl - D4):Ig:CD7:ζ ja CD4(Dl, D2):Ig:CD7^ (kuvio 20, molekyylit "G” ja "D”), ekspressoitiin ihmisen CTL-kloonissa WH3 ja ne testattiin niiden kyvyn suhteen kohdentua ja tappaa HeLa-spIut, jotka ekspressoivat HI-5 viruksen pinnan vaippaglykoproteiinia (käyttäen tässä kuvattuja menetelmiä). Kuvio 21 osoittaa, että ζ-proteiinin solunsisäinen domeeni fuusioituna joko CD4(D1 ~ D4):Ig:CD7-tai CD4(Dl, D2)tIg:CD7-proteiiniin, voi muodostaa tappoky-vyn; rakenteet, joista ζ-ketju puuttui, eivät kyenneet vä~ 10 liitämään tätä aktiivisuutta. Positiivinen verrokki CD4: ζ välitti hiu)can tehokkaamman sytotoksisuuden ja CD4(D1, D2):Ig:CD7*ζ-proteiini hiukan pienemmän sytötoksisuuden kuin CD4(Dl - D4):Ig:CD7:ζ-proteiini (kuvio 21). On kuitenkin selvää, että sekä CD4(D1 - D4):Ig:GD7:ξ- että CD4(Dl, 15 D2):Ig:GD7:ζ-kimeereillä on kapasiteetti välittää sellaisten solujen spesifinen tappo, jotka ekspressoivat Hl-virus-vaipan proteiineja pinnallaan. Neliosaiset kimeerit olivat yhtäläisesti kykenemättömiä välittämään solusihkoksen muodostusta vaccinia-perusteisessa testissä. Olemme myös osöit-20 taneet, että yksittäinen kuvion 11A mukainen ξ-alue on riittävä saamaan aikaan sytolyyttisen aktiivisuuden CD4(Dl - D4)-kimeeriä vastaan.

Radioimmuunisaöstuskpkeet osoittivat, että fuusio-molekyylit olivat pääasiassa, elleivät peräti kokonaan, di-25 meerejä. Näissä kokeissa 'käytettiin proteiini-A-agaroosi- helmiä metabolisesti leimattujen HeLa-solujen, jotka oli infekt.oi.tu yaccinia-rekombinanttiviruksilla, jotka ekspres-soivat CD4(Dl - D4) :Ig:CD7:ζ- ja CD4(Dl, D2):Ig:CD7:ζ-ki-meereitä, liukoiseksi tehdyn uutoksen immuunisaostamiseksi. 30 Immuunisaostettu materiaali fraktioitiin polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa. Erityisesti noin 5 x 106 HeLa-S3-solua infek-toitiin, kuten yllä on kuvattu vPEl6-viruksen tapauksessa, sopivalla vaccinia-virusvarastoliuoksella. Solut leimattiin 35 metabolises ti. käyttäen 200 gCi Tran3£,S-leimaa/ml (ICN Ra di ochemieals, Irvine, CA) 6-8 tuntia kysteiini- ja metio- 55 niinivapaassa alustassa ja ne irrotettiin PBS:11a, joka sisälsi 1 mM EDTA:ta. Sitten solut pelietoitiin ja ne lyysat-tiin liuoksessa, joka oli 150 mM NaCl, 50 inM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5 % NP-40, 0,1 % SOS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF.

5 Kun tumat oli poistettu sentrifugoimalla, 1/5 kustakin so-lu-uutoksesta adsorboitiin pestyihin proteiini-A-konjugoi-tuihin agaroosiheimiin kahden tunnin ajan 4 °C:ssa. Sen jälkeen helmet pestiin PBS:lla, joka sisälsi 1 % NP-40:ää, ja eluoitiin näytepuskuriin, joka sisälsi SDS:ää niin, että 10 läsnä oli merkaptoetanolia tai sitä ei ollut. Näiden kokeiden tulokset osoittivat, että suurin osa immuunisaostetuis-ta CD4(Dl - D4):Ig:CD7:ζ- ja CD4{D1, D2):Ig:CD7:ζ-kimee-reistä kulki odotetun molekyylimassan sisältävinä dimeerei-nä ei-pelkistävissä olosuhteissa.

15 Jotta voitiin suoraan arvioida sellaisten solujen, jotka ekspressoivat CD4-fuusiomolekyylejä, kyky tukea HI-virusinfaktiota, suoritimme pitkäaikaiset infektiivisyys-tutkimukset transfektanteilla, jotka ekspressoivat CD4{Dl -D4}:Ig:CD7- ja CD4(Dl, D2):Ig:CD7-proteiinia. Stabiilit 20 CD4 (Dl - D4) :Ig:CD7- ja CD4{Dl, D2) :;lg:CD7- ja CD4-trans-fektantit valmistettiin 293-solujen alalinjan soluihin, joka ovat helposti transfektoitava ihraisen sikiön munuaisista peräisin oleva solulinja. Kimeeriset molekyylit jatkokloo-nättiin kaksisuuntaisiin vektöreihin, joissa hygromysiini B 25 -geeniä ohjasi herpes simplex -viruksen tymidiinikinaas!-promoottori. 10 cm solumalja, joka oli 60 - 70 % täysi, transfektoitiin 10 μ g tätä plasmidi-DNA:ta kalsiumfosfaat-tiyhteissaostusmenetelmällä. Ennen transfektiota plasmidit linearisoitiin uniikista Sfil-köhäasta ja päiden juosteista 30 tehtiiin yhtäpitkät T4 DNA polymeraasilla. 24 tuntia trans-fektion jälkeen solut jaettiin neljään osaan ja 48 tuntia transfektion jälkeen solut laitettiin hygromysiini B -selektioon {Sigma, St. Louis, MO) niin, että sen konsentraa-tio oli 400 ug/ml. Joka 3-4 vuorokausi soluille lisättiin 35 tuoretta alustaa, joka sisälsi hygrömysiiniä.

56

Resistentit pesäkkeet poimittiin, laajennettiin ja niiden ekspressio arvioitiin epäsuoralla immunofluoresens-silla käyttäen fluoreskeiinilla konjugoitua anti-ihmis-IgG Fc -vasta-ainetta (Organon Teknika, West Chester, PA) tai 5 Q412Q-vasta-ainetta, joka on ihmisen CD4-proteiinin kanssa reagoiva vasta-aine (Sigma), jota seurasi virtaussytometria (Coulter, Hialeah, FL). Kaksi toisistaan riippumatonta kloonia kustakin rakenteesta, joiden solupinnan CD4-tasot olivat verrattavissa muiden solulinjojen vastaaviin, valittiin 10 analyysiin:. Kuvio 22 osoittaa, että kun oli altistettu HI-virukselle, p24 havaittiin stabiileissa CD4-transfektantti-viljelmissä niin pian kuin kolme vuorokautta infektion jälkeen, Monitumaisten jähtisolujen läsnäolo ja ominainen paisuminen oli näkyvissä niin pian kuin viisi vuorokautta in-15 fektion jälkeen näissä viljelmissä. Mitään merkittäviä p24-tasoja tai todistetta monitumaisista jättisoluista ei havaittu transfektoimattomassa emosolulinjassa tai kummassakaan kahdessa toisistaan riippumattomasti saadussa CD4(Dl -D4) :Ig:CD7- ja CD4(Dl, D2) :Ig:CD7-transf:ektanttien isolaa-20 tissa 32 viljelyvuorokauden jälkeen (kuvio 22).

Infektiotutkimusten lopussa solut analysoitiin CD4-proteiinin solupintaekspres s ion suhteen. CD4-proteiinin pin-taepitooppitiheys aleni merkittävästi CD4-proteiinia eks-pressoivissa infektoiduissa viljelmissä, joka vastaa viruk-25 sen aiheuttamaa säätelyä älas, mutta ei muuttunut viljel- j missä, jotka ekspressoivat CD4(Dl - D4):lg:CD7- ja CD4(Dl, D2);:Ig:.CD7-proteiinia. Nämä kokeet osoittivat, että on mahdollista muodostaa kimeeriset molekyylit, jotka sisältävät CD4-prot:eiinin kaksi apikaalista domeenia, joilla fuusioi-30 tuna T-solureseptorin ζ-ketjuun on kyky kohdentua Hl-viruk:-sellä infektoituneisiin soluihin ja tappaa ne, mutta jotka eivät tue CD4-proteiinin välittämää HI-virusinfektiota.

Lisäkokeet antavat ehdottaa, että CD4-molekyylin soinnu 1 koi s en domeenin ja lipidikaksoiskerroksen fyysinen vä-35 limatka on mukana kyvyssä vastustaa HI-virusinfektiota. Ensimmäisessä kokeessa rakensimme kimeerisen molekyylin, joka 57 sisälsi CD7-varsirakenteen ja membraanin läpi kulkevan do-meenin deleetion; tämä deleetio poisti CD7-proteiinin mem-braanin läpi kulkevan osan proliinirikkaan alueen. Kun tämä domeeni fuusioitiin CD4-proteiinin solunulkoiseen doxnee-5 niin, se piti yllä kykyä tehokkaasti ankkuroida CD4-mole-kyylin solunulkoinen domeeni, mitattuna CD4-molekyylin so-lupintaekspressiona (kuten tässä on kuvattu). Kuitenkin kyky vastustaa solusitkoksen muodostumista, jonka HI-virus-vaipan glyköproteiini indusoi, hävisi. Näin ollen CD7-mole-10 kyylin proliinirikkaan alueen, joka todennäköisesti muodostaa a-helikaalisen kierrerakenteen, deleetio alensi tehokkaasti välimatkaa CD4-proteiinin solunulkoisen dömeenin ja lipidikaksoiskerroksen välillä ja ehkäisi kimeerin kykyä vastustaa solusitkoksen muodostusta.

15 Toisessa kokeessa osoitimme, että kyky vastustaa HT- viruksen indusoimaa solusitkoksen muodostusta voi johtua CD4/CD5-kimeeristä, joiika on aiemmin dokumentoitu toimivan, membraanin läpi kulkevana ankkurina CD4-proteiinin solunul-koiseile domeenille, mutta joka ei kyennyt vastustamaan HI-20 viruksen indusoimaa solusitkoksen muodostusta. Tässä kokeessa ihmisen igGl-proteiinih raskasketjun sarana-, CH2-ja CH3-domeenit insertoitiin CD4/GD5-molekyyliin; tuloksena syntynyt kimeeri vastusti solusitkoksen muodostusta antaen jälleen ehdottaa, että välimatka, jonka immunoglobuliinido-25 meenit muodostivat, oli riittävä saamaan aikaan vastustus kyvyn Hl-viruksen indusoimaa solusitkoksen muodostumista vastaan.

Kolmannessa kokeessa CD4-domeenia siirreltiin eri pituisia välimatkoja solumembraanista käyttäen synteettisiä 30 eri pituisia a-heliksejä. Erikoisesti suunniteltiin sellaiset synteettiset oligonukleotidit, jotka edustivat toistuvia α-helIkaalisia alueita, joissa oli lysiini- ja gluta-miinihappojäännöksia, joiden vieressä oli kaksi alaniini-jäännöstä (katso primaariset nukleiinihappo- ja aminohap-35 posekvenssit kuviosta 28). Aiemmissa tutkimuksissa sellaisten aminohapposekvenssien havaittiin esiintyvän korkealla 58 frekvenssillä α-helikseissä, joka antaa ehdottaa, että sellaiset toistuvat alueet omaksuvat a-helikaalisen konformaa-tion ja että sellaisten a-heliksien sijoittaminen CD4-pro-teiinin menihraanin läpi kulkevan: domeenin ja solunulkoisten 5 domeenien väliin suuntaisi CD4-proteiinin poispäin solun memhraanista. Muuttamalla a-helikaalisen osan pituutta, määritettiin of-heliksin nousun ja käänteen tunnettuihin arvoihin perustuen se ulkonevan osan välimatka, joka tarvittiin vastustamaan HT-viruksen tunkeutumista. Nämä tulokset on 10 esitetty taulukossa 1.

_Taulukko 1_

Solusit- Thy-1- koksen ekspres- muodostu- sxo __minen__ A. CD4 +H+CH2 +CH3 +CD7 tm+s tk__-__-_ B. CD4{Dl,D2}-5-H+CH2 +CH3 +CD7tm+

Stk____ C. CD4+CD7tm+stk__+/-a__+__ D. CD4+CD7tm (pitkä muoto)__+__+_ E. CD4+CD7tm (lyhyt muoto) + + j **....... ............... ...................."" ......*............ —..... ......................... \ F . CD4+CD5tm__+__+_ G. CD4+CH2+CH3*CD5 tm . .__~__-_.

H. CD4 +CH3+CD5tm__-__ND_ I . CD4-fGD34fcm + + | -:— ----—— ] J. CP4+synteettinen α-heliksi ND + j 2 4 ängs tr omi ä) +CD34 tm__________j K. CD4+synteettinen α-heliksi ND +/-a |

(48 ängsträmiä) +CD34tm___J

L. CD4+synteettinen a-heiikäi ND

(72 ängströmiä) +CD34tm_______ aQleellinen alentuminen solusitkosten ja Thy-i-ekspressoi- ] 15 vien solujen määrässä. j 59 Tässä taulukossa "CD4" edustaa CD4{Dl-D4)“molekyyliä, jollei, toisin ole mainittu; "H", "CH2" ja ‘'CH3" edustavat ihitiisen igGl-proteiinin raskasketjun sarana-, CK2- ja CH3-alueita, vastaavasti; "CD7tm ja stk" edustavat CD7-5 proteiinin membraanin läpi kulkevaa ja varsialuetta, vastaavasti; "CD7tm (pitkä versio)" ja "CD7tm (lyhyt versio)” edustavat vastaavasti GP7-proteiinin membraanin läpi kulkevaa aluetta ja CD7-proteiinin memhraanin läpi kulkevaa aluetta, josta on del etoi tu prOliinirikas domeeni (kuten yllä 10 on keskusteltu); "CDStm" edustaa CD5-proteiinin membraanin läpi kulkevaa aluetta; ja "CD34tm" edustaa GD34-proteiinin membraanin läpi kulkevaa aluetta. Kohdissa J - L a-heli-kaalisen alueen pituus on ilmoitettu ängströmeinä; nämä arvot perustuvat siihen tosiasiaan, että a-heliksissä on 3,6 15 jäännöstä/kierros vastaten 5,4 Ä (tai 1,5 Ä/jäännös). Tämän mukaisesti 1.6 jäännöksen pituinen α-heliksi suuntaa CD4-proteiinin solunulkoiseh döxneenin noin 24 Ä päähän. 48 JL ja 72 Ä ö-heliksit rakennettiin konkatemerisoimalla peräkkäin BstYX-fragmentti fragmentin uniikkiin BamHl-kohtaan (kuvio 20 28), jota seurasi sellaisten kloonien selektio, jotka oli vat oikeassa orientaatiossa.

Solusitkoksen muodostus laskettiin yhteisviljely-testeissä HeLa-soluilla, jotka ekspressoivat Hiv-l-vaipan glykoproteiinia vaccinia-virus vPSl6-rakenteesta (katso yl-25 la). !

Thy-l-ekspressio mitattiin seuraavasti. Elävä ret-rovirusvektori rakennettiin perustuen HIV-1 hxb.2 -klpo-niin. Tässä vektorissa ei-keskeinen nef-geeni korvattiin rotan thy-T-pröteiinia koodittavälla sekvenssillä, joka on 30 tehokkaasti ekspressoitu solun pintamolekyyli, joka on ankkuroitu membraaniin fisfatidylinositoliliitoksella, Tästä molekyylikloonista peräisin oleva virus, jonka nimi oli hxb/thy-l, oli infektirvinen, jonka todisti sen sytopatolo-giset. vaikutukset ja p24-proteiinin tuotto infektoitujen 35 C8:166-solujen (ihmisen CD4+-T-leukemiasolulinja) viljely-supernatantteihin. Lisäksi, altistettaessa hjcb/tby-'l'-kloO” 60

Mile HeLa-solut, jotka oli lyhytaikaisesti transfektoitu CD4-prQteiinilla, osoittivat merkkejä thy-l-ekspressiosta niinkin pian kuin 18 tuntia infektion jälkeen, kuten oli odotettavissa lähetiltä, jota säädellään samalla tavalla 5 kuin nef-geeniä, Nef-geenin koodittamat lähetit ovat normaalisti viruksen säätelyproteiiniryhmän proteiineja, jotka on usealla eri tavalla silmukoitu ja joista puuttuu revres-ponssielementti. Nämä lähetit voivat kasaantua konstitutii-visesti sytoplasmaan aikaisina virusgeenituotteina. Thy-1-10 lähettien odotettiin olevan samalla tavalla säädeltyjä, se tarkoittaa, että ne esiintyvät viruksen elinkierron aikaisessa vaiheessa. Lyhyesti, tämä systeemi tehosti HI-viruksen tunkeutumisen testaamista niin, että thy-l-eks-pressiota käytettiin viruksen saapuminen korvikkeena. Eri 15 CD4-perusteiset kimeerit transfektoitiin lyhytaikaisesti

HeLa-soluihin käyttäen standardia DEAE-dekstraanimenetel-mää. Tränsfektöidut solut altistettiin hxb/thy-l-virukselle 48 tuntia transfektion jälkeen ja tutkittiin thy-l-eks-pression suhteen 24 - 48 tuntia infektion jälkeen. Taulu-20 kossa 1 esitetyissä tuloksissa thy-l-ekspressio mitattiin 24 tuntia infektion jälkeen käyttäen kaupallisesti saatavissa olevaa monoklonaalista Thy-1-vasta-ainetta (Accurate) .

Taulukossa 1 esitetyistä tuloksista päättelimme, 25 että CD4-proteiinin solunulkoisten domeenien tulee optimaalisesti suuntautua poispäin solun membraani s ta ainakin 48 angströmin verran ja suositeltavasti ainakin 72 ängströmin verran, jotta voitaisiin vastustaa Hiv-l-infektiota.

Käyttäen samanlaista strategiaa kuin tässä kuvattu 30 yleisstrategia, voidaan rakentaa anti-HIV-vaippa-vasta-aineisiin perustuvat kimeerit, jotka kohdentuvat HIV-infek-toituneisiin soluihin. Esimerkit sellaisista vasta-aineista on kuvattu julkaisuissa Goray et ai., Proc. Natl, Acad. Sei. USA 86: 1624 (1989) ja Marasco et ai., J. Clin. In-35 vest. 90: 1467 (1992).

61

Esimerkki 11

Muut T"solureseptori- ja B-solureseptorilaukaisin-proteiinit

Muut keksinnon mukaiset solunsisäiset ja membraanin 5 läpi kulkevat signaalia kuljettavat domeenit voidaan saada T-solureseptoriproteiineista CD3-delta ja Τ3-γ, ja B-solu-reseptpriprotelineistä mbl ja B29. Näiden proteiinien aminohapposekvenssit on esitetty kuviossa 16 {CD3-delta; SEQ ID -numero 24}, kuviossa 17 (Τ3-γ; SEQ ID -numero 25), ku li) viossa 18 (mdl; SEQ ID -numero 26) ja kuviossa 19 (B29; SEQ ID -numero 27) . Ne osat sekvensseistä, jotka riittävät sy-tolyyttisen signaalin kuljetukseen (ja sen vuoksi sisällytetään suositeltavasti keksinnön kimeeriseen reseptoriin) on esitetty suluissa. Kimeeriset reseptorit, jotka sisältä-15 vät nämä proteiinidomeenit, rakennetaan ja niitä käytetään keksinnön terapeuttisissa menetelmissä yleisesti, kuten yllä on kuvattu.

Esimerkki 12

Koemenefcelmät 20 Vaccinia-infektio ja radioinnrauunisaosfcus

Noin 5 x 106 CVl-solua infektoitiin yhden tunnin ajan seerumivapaassa DME-alustassa vaccinia-rekombinanttien läsnä ollessa niin, että infektiomonikerta-arvo (moi) oli ainakin 10 (tiitteri mitattu CVl-solu.illa) . Solut laitet- 25 tiin tuoreeseen alus taan infektion jälkeen ja leimattiin metabplisesti käyttäen 200 pCi 35S-metiöniinia plus kyste-iiniä/ml (Tran3$S-leima, ICN; Costo Mesa, CA) metioniini-ja kysteiinivapaassa DMEM-alustässä (Gibeo; Grand Island, NY) kuusi tuntia. Leimatut solut irrotettiin PBS:llä, joka 30 sisälsi 1 mM EDTA:ta, kerättiin sentrifugöimalla ja iyysat-tiin liuoksessa, joka oli 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA ja 1 mM PMSF. Tumat poistettiin sentrifugöimalla ja CD4~proteiinit immuunisaos-tettiin QKT4-vasta-a.ineella ja anti-hiiri-IgG-agaroosilla 35 (Cappel, Durham, NCj . Näytteet ajettiin elektroforeesissa 8 % polyakryyliamidi/SDS-geelien läpi ei-pelkistävissä (NR) 5 62 ja pelkistävissä (R) olosuhteissa. Geelit, jotka sisälsivät 35S-leimattuja näytteitä, upotettiin En3Hance-liuokseen (New England Nuclear, Boston, MÄ) ennen autoradiografiaa, CD16-proteiinin membraanin läpi kulkevan. CD16TM-muodon tehostu-5 nut ekspressio mitattiin vertaamalla sen ekspressiota CV1-soluissä, jotka oli infektoitu ainoastaan GDI6Tr-viruksella sellaisten solujen ekspressioon, jotka oli infektoitu yhtäaikaa viruksilla, jotka koodittivat CDl6TM-proteiinia ja ξ-tai γ-kimeerejä, Infektion ja kuuden tai useamman tunnin 10 inkubaation jälkeen solut irrotettiin maljoilta liuoksella, joka oli PBS, 1 mM EDTA, ja CDl6TM-proteiinin tai kimeerien ekspi'essio mitattiin epäsuoralla immunofluoresenssilla ja virtaus sy t oirie tr i ai la..

Kaisiumvirtatesti 15 Jurkat-alalinjan E6 [Weiss et ai,, J, Immunol, 133; 123 — 128 (1984) ] solut infektoitiin vacc ini a --- r ekombi - nanttiviruksi11a yhden tunnin ajan seerumivapaassa IMDM-alustässä niin, että moi-ärvo oli 10, ja inkuboitiin kolme - yhdeksän tuntia IMDM, 10 % FBS -alustassa. Solut ke-20 rättiin sentrifugoimalla ja suspensoitiin uudelleen tiheydeksi 3 x 10* solua/ml täydelliseen alustaan, joka sisälsi 1 mM Indo-1-asetometoksiesteriä [Grynkiewicz et ai,, J, Biol. Chem, 260: 3340 - 3450 (1985)](Molecular Probes) ja inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuuttia. Indo-1-värillä ladatut 25 solut pelletoitiin ja ne suspensoitiin uudelleen tiheydeksi 1 X 106 solua/ml seerumi vapaaseen IMDM-alus taan ja ne säilytettiin huoneenlämpötilassa pimeässä. Solut analysoitiin vapaan kalsiumionin suhteen mittaamalla samanaikaisesti violetti ja sininen fluoresenssiemissio virtaussytometrial-30 la [Rabinovitch et ai,, J, Immunol, 137: 952- 961 (1986)], Kalsiumvirran aloittamiseksi solususpensioon lisättiin joko fykoerytriinillä (PE) konjugoitua Leu-3A-vasta-ainetta (an-ti-CD4) (Beeton Dickinson, Lincoln Park, NJ) konsentraati-oksi 1 pg/rnl, jonka jälkeen lisättiin 10 μ-g/ml konjugoima-35 tonta vuohen anti-hiiri-IgG-proteiinia. aikapisteessä 0, tai konj ugoimatonta monokipnaalista iGS-vasta-ainetta (anti- 63 CD16) lisättiin solususpensioon konsentraatioksi 1 pg/ml, jonka jälkeen, lisättiin 10 pg/ml FE-kqnjugöitua Faba 1 vuohen anti-hiiri-IgG-proteiinia aikapisteessä 0. Violetti/si-ninen-emissiösuhteiäen histograrfimit kerättiin PE-positiivi-5 s es ta -(infektoitunut) solupopulaatiosta, joka tyypillisesti edusti 40 - 80 % kaikista soluista. T-soluantigeeniresep-torivasteen laukaisi infektoimattornissa soluissa vasta-aine OKT3 ilman ristisitomista. Kokeissa, joissa käytettiin ki-meerisiä GDI6-reseptoreita näytteet, joissa tapahtui perus-10 linjan muutokset matalampaan solunsisäiseen kalsiumiin päin (ilman vasta-ainetta), jätettiin pois analyysistä. Sen jälkeen hi s togrammi tulokset analysoitiin muuttamalla binaari-tulokset ASCII-muotoon käyttäen Write Hand Man -ohjelmaa (Cooper City, FL), jota seurasi analyysi ryhmällä FORTRAN-15 ohjelmia. Vio1e11i/sininen-emissiosuhde11a ennen toisen vas-ta-ainereagenssin lisäystä käytettiin muodostamaan normalisoitu alkusuhde, joka asetettiin yhtäsuureksi kuin ykkönen, ja lepotilan raja-arvosuhde., joka asetettiin.: niin, että 10 % lepotilassa olevasta populaatiosta ylitti raja-arvon.

20 syijolyysi testi

Ihmisen T-solulinjaa: WH3, joka on CB8+ CD4~ HLA B44 -proteiinin suhteen .rajoittunut sytolyyttinen linja, ylläpidettiin IMDM-alustassa, jossa oli 10 % ihmisen seerumia ja 1ÖQ yksikköä/ml IL-2-proteiinia, ja niitä stimuloitiin 25 ajoittain joko epäspesifisesti säteilytätyillä (3 000 rad) HLA-proteiinin suhteen yhteensQpimattorni11a perifeerisen veren lymfosyyteillä ja 1 pg fytohemagglutiniinia/ml, tai spesifisesti säteilytetyillä B4 4-proteiinia sisältävillä mononukleaarisilla soluilla. Yhden vuorokauden epäspesifi- j 30 sen stimulaation jälkeen PHA laimennettiin konsentraatioksi | 0,5 pg/ml lisäämällä tuoretta alustaa ja kolmen vuorokauden j kuluttua alusta vaihdettiin. Soluja kasvatettiin ainakin 10 ] vuorokautta stimulaation jälkeen ennen kuin niitä käytet- ] tiin sytotoksisuustesteissä. Solut infektoitiin vaccinia-35 rekombinantei1la niin, että infektiomonikerta-arvo oli ai nakin 10, yhden tunnin ajan seerumivapaassa alustassa, jota 64 seurasi inkubaatio täydellisessä alustassa kolmen tunnin ajan. Solut kerättiin sentrifugoimalla ja ne suspensoitiin uudelleen tiheydeksi 1 x 10? solua/ml. 100 μΐ lisättiin kuhunkin U-pohjäisen mikrotiitterilevyn kuoppaan, joka sisäl-5 si 100 μΐ täydellistä alus taa/kuoppa. Solut laimennettiin kaks inkertais ella sarjalaimennoksella. Kaksi kuoppaa kullekin näytteelle ei sisältänyt lymfosyyttejä niin, että voitiin mitata kromin spontaani vapautuminen ja kromin koko-naisotto soluihin. HeLa S3 -alalinjan kohdesolut infektoi-10 tiin 6,0 tai 10,0 cm maljoilla niin, että moi-arvo oli suurinpiirtein 10, yhden tunnin ajan seerumivapäassa alustassa, jota seurasi inkubaatio täydellisessä alustassa kolmen tunnin ajan. Sitten ne irrotettiin maljoilta liuoksella, joka oli PBS, 1 rnM EDTA, ja laskettiin. Määrä, joka oli 10® 15 köhdesqlUä [HeLa-, Raji- tai RJ2.2.5-solut kimeerisiä CD4-reseptorikokeita varten ja 3G8 10-2 -solut; Shen et ai., Mol. Immunol. 26: 959 (1989) , kimeerisiä CDl6-reseptori- kokeita varten], sentrifugoitiin ja ne suspensoitiin uudelleen 50 pl:aan steriiliä 51Cr-natriumkromaattiä (1 mCi/ml, 20 Dupont, Wilmington, DE) yhden tunnin ajaksi 37 °C:ssa sekoittaen välillä, sitten pestiin kolme kertaa PES:llä. 100 μΐ leimattuja soluja, jotka oli suspensoitu uudelleen alustaan tiheydeksi 105 sqiuä/ml, lisättiin kuhunkin kuoppaan. Raji- ja RJ2.2.5-kohdesolut leimattiin samalla tavalla kuin 25 HeLa-solut. Mikrotiitterilävyä sentrifugoitiin voimalla 750 x g yhden minuutin ajan ja inkuboitiin neljä tuntia 37 °C:ssa. xnkubaatioajan lopussa kimkin kuopan solut suspensoitiin uudelleen pipetoimalla varovasti, otettiin näyte inkorporoituneen kokonaisradioaktiivisuuden määrittämiseksi 30 ja mikrotiitterilevyä sentrifugoitiin voimalla 750 x g yhden minuutin ajan. Otettiin 100 μΐ määrät supernatanttia ja ne laskettiin gammasädetuikelaskurissa. Tappoprosentti korjattiin infektoituneiden solujen fraktion (yleensä 50 -90 %) suhteen, jotka mitattiin virtaussytometrialla. Infek-35 toituja effektorisoiuja varten effektori:kohde-suhde korjattiin infektoituneiden solujen prosenttimäärän (tavaili- 65 sesti 20 - 50 % kimeerIsissä CD4-reseptorikokeissa ja > 70 % kimeesrisissä CDl6-reseptorikokeissa) suhteen, Z-sekvenssin In vitro mutageneesi

Pistemutaatloiden muodostamiseksi (-sekvenssin ami-5 nohappojäännöksiin 11 ja/tai- 15, valmistettiin synteettiset ollgonukleotidialukkeet, jotka pidentyivät (-proteiinin meinbraanin läpi kulkevan dömeenin ylävirrassa olevasta Bam-Hl-kohdasta ja muuttivat luonnollisen ζ-jäännöksen 11 Cys-jäännöksestä Gly-jäännökseksi (CllG) tai jäännöksen 15 Asp-10 jäännöksestä Gly-jäännökseksi (D15G) tai molemmat (CllG/DlSG), ja niitä käytettiin PCR-reäktioissa sellaisten mutatoitujen fragmenttien muodostamiseksi, jotka insertoi-tiin uudelleen villityypin CD4: ζ-rakenteisiin.

(“deleetloiden muodostamiseksi (-cDNA-sekvenssit am-15 plifioitiin PCR-menetelmäliä käyttäen synteettisiä oligo-nukleotidialukkeita, joiden suunniteltiin muodostavan lope-tuskodonin (UAG) jäännöksen 50, 59 tai 65 jälkeen. Alukkeet sisälsivät katkaisukohdan Notl-entsyymille sisennettynä viisi tai kuusi jäännöstä 5’-päästä, tavallisesti sekvenssin 20 CGC GGG CGG GCG CTA muodossa (SEQ ID -numero 11), jossa kolme viimeistä jäännöstä vastaavat lopetusantikodonia. No-tl- ja lopetusantikodonisekvenssejä seurasi 18 jäännöstä tai useampi, jotka olivat komplementaarisia halutulle fragmentin 3‘-päälle. Tuloksena syntyneille kimeereille annet-25 tiin nimet CD16:(Y51*, CD16:(E60* ja CD16:(D66*, vastavaas- ti. Membraanin läpi kulkevan domeenixi ylävirrassa olevaa BaitiHI-kohtaa ja Notl-kohtaa käytettiin sellaisten fragmenttien muödostamiseeh, jotka insertoitiin uudelleen villityypin CD16:(-rakenteeseen. Monomeeriset (-kimeerit muodostet-30 tiin vapauttamalla (-proteiinin membraanin läpi kulkevat ja membraanista proksimäalisesti olevat solunsisäiset sekvenssit yllä kuvatun Asp" ja Cys" CD4:(-rakenteen BamHI- ja Sa-cl-digestiolla ja insertoimalla fragmentti CD16: (E6.0*- ja j CD16:ζ066*-rakenteeseen, vastaavasti.

66

Kolmiosaisen CD16; 7: ζ (48-65) ja 0016ί7:ζ (48-59) -kiraeerin rakentaminen

Rakenteen CD16:ζϋ66* valmistamiseksi ζ-cDNA-sekvenssi, joka vastaa membraanin läpi kulkevan domeenin jäännök-5 siä ja 17 sitä seuraavan sytoplasmisen domeenin jäännöstä, korvattiin vastaavalla membraanin läpi kulkevalla ja syto-plasmisella domeenilla, jotka saatiin CD5- ja CD7-cDNA:sta.

CD5- ja CD7-fragmentit valmistettiin RCR-reaktlolla käyttäen eteenpäin suuntautuvia oligonukleotideja, jotka sisälsi-lö vat BamHI-restriktiokatkaisukolidan ja vastasivat: aluetta, joka oli juuri ylävirtaan CD5- ja CD7-proteiinin membraanin läpi kulkevasta domeenista, vastaavasti, ja seuraavia kään-teisollgonukleotideja* jotka menivät päällekkäin CD5- ja CD7-sekvenssien kanssa* vastaavasti, ja ζ-sekvenssin kans-15 sa( joka sisälsi Sacl-restriktiokatkaisukohdan.

CD5: ίζ : CGC C-GG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID -numero 12) CD7:ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ÄTC CCG (SEQ ID -numero 13).

20 CD5- ja CD7-PCR-tuotteet digestoitiin BamHI- ja Sa~ cl-entsyymeillä ja ligoitiin BamHI- ja SacT-entsyyraeillä digestoidun GDISCE60*-sekvenssin kanssa ja korvaamalla ζ-sekvenssi BamHI-SacI-kohtien välillä CD7-fragmentilla.

CD16:CD5- ja CD16:CD7-rakenteiden valmistamiseksi CD5- ja j 25 CD7-fragmentit saatiin PdR-menetelmällä käyttäen oligonuk-leotidia, joka sisälsi Notl-restriktiokatkaisukoMan ja koo-ditti lopetuskodonia (DAA) jäännöksen Gln416 ja Alal93 jälkeen CD5- ja CD7-proteiinissa., vastaavasti. CD5- ja CD7-fragmentit digestoitiin BamHI- ja Notl-entsyymeillä ja in-30 sertoitiin CD16:ζΑ3ρβ6^-rakenteeseen, j

S

z-protexinm syfcolyyttistä signaalia kuljettavan | alueen N-pään jäännösten in vitro mutageneesi j

Syntetisoitiin synteettiset oligonukleotidialuk- 1 keet, jotka pidentyivät ζ-alueen sisäisestä Sacl-kohdasta 35 ja muuttivat luonnollisen jäännöksen: 48 Asn-jäännöksestä Ser-jäännökseksi (U48S), jäännöksen 50 Leu-jäännöksestä 67

Ser-jäännökseksi (L50S) ja jäännöksen 51 Tyr-jäännöksestä Phe-jäännökseksi (Y51F), ja niitä käytettiin PCR-reaktiossa sellaisten fragmenttien muodostamiseksi, jotka insertoitiin uudelleen villityypin 0016:7:,¾ (48-65) -rakenteeseen.

5 S-proteiinin sytolyyttistä signaalia kuljettavan alueen C-pään jäännösten in vitro mutageneesi

Syn tetisoitiin synteettiset oligonukleotidiaiuk-keet, jotka pidentyivät lopetuskodonin 3'-puoleisesta Nötl-köhdästa ja muuttivat luonnollisen: jäännöksen 60 Glu-jään-10 nöksestä G In-jäännökseksi (E160Q) > jäännöksen 61 Glu-jäännöksestä Gin-jäännökseksi (E61Q), jäännöksen 62 Tyr-jäännöksestä Pile- tai Ser-jäännökseksi (Y62F tai Y62S) , ja jäännöksen 63 Asp-jäännöksestä Asn-jäännökseksi (D63N), ja niitä käytettiin PCR-reaktiossa sellaisten fragmenttien 15 muodostamiseksi, jotka jatkokloonattiin villityypin CDl6: ζθ66*-rakenteeseen BamHI-kohdasta Notl-kolataan.

CD16 ϊ7 s ζ (33 - 65), Οϋ16ϊ7ίζ (71 - 104), CDl6:7sC (104 - 137) -kimeerien rakentaminen CD7-proteiinin merabraanin läpi kulkeva fragmentti, 20 jossa oli MluI- ja Notl-kohdat membraanin läpi kulkevien ja solunsisäisten domeenien rajakohdassa, saatiin PCR-menetel-mällä käyttäen oligonukleotidia, jolla oli seuraava sekvenssi : CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID -numero 14). Tuloksena syntynyt PCR-fragmentti digestoitiin 25 BamHI- ja No 11-entsyymei1lä ja insertoitiin uudelleen CD16:7:ζ (48 - 65) -rakenteeseen. Z-fragmentit, jotka koo-dittivat jäännöksiä 33 - 65, 71 - 104 ja 104 - 137, saatiin PCR-menetelmällä käyttäen alukepareja, jotka sisälsivät Mlul-kohdat eteenpäin suuntautuvien alukkeiden 5'-päässä ja 30 lopetuskodonit Notl-kohdan jälkeen käänteisalukkeiden 5' -päässä. Kussakin tapauksessa restriktiokohdat sisennettiin kuusi jäännöstä alukkeen 5'-päästä niin, että valmistettiin restriktioentsyymikatkaisu.

ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ 35 ID -numero 15); 68 ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID “numero 16); ja ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID -numero 17).

5 FcRyXiA-deleetiomutanfctien rakennus

FcEllA-proteiinin karboksipään deleetiomutantit rakennettiin PCR-menetelmällä samalla tavalla kuin täyspitkät rakenteet muuttaen sekvenssit, jotka koodittivat tyrosiinia kohdissa 282 ka 298 lopetuskodoneiksi (TAA). N-pään delee-10 tiot muodostettiin amplifroimalla PCR-menetelmällä fragmentit, jotka kooditfcivat peräkkäin vähemmän solunsisäistä do-meenia, käyttäen oligonukleatideja, jotka sallivat tuloksena syntyneiden fragmenttien insertoimisen MluI- ja Notl-restriktiokohtien väliin aiemmin rakennettuun ekspressio-15 plasmidiin, joka kooditti CD16-proteiinin solunulkoista do-meenia fuusioituna CD7-proteiinin inembraanin läpi kulkevaan domeeniin niin, että jälkimmäinen päättyi Mlui-kohtaan mem-braanin läpi loilkevah ja solunsisäisen domeenin rajakohdassa.

2 0 Muut suoritustavat

Yllä kuvatut esimerkit osoittavat.., että ζ-, η-tai γ-kimeerien aggregoituminen riittää aloittamaan sytolyytti-sen effektorlsoluvasteen T-soluissa. Ζ-, η-ja γ-proteiinin tunnettu ekspressiopliri, joka sisältää T-lymfosyytit, luon-25 nolliset tappajasolut, basofilliset granulosyytit, makro-faagit ja mastosolut antaa ehdottaa, että konservoituneet sekvenssialueet voivat interaktoida sellaisen aistikoneis-ton kanssa, joka on yleinen hematopoieettista alkuperää oleville soluille, ja että tärkeää osaa isännän puolustuk-30 sesta immuunisysteemissä voi välittää reseptoriaggregaa- t i o tapahtuma t.

Sytolyyttisen vasteen vahvuus: ja vasteen poissaolo sellaisia kohdesoluja vastaan, jotka sisältävät MHC-luokan II -reseptorit osoittaa, että kimeerit, jotka perustuvat 35 ζ-, η- tai γ-proteiiniin, muodostavat perustan geneettisel le interventiolle AIDS:a vastaan käyttäen adoptiivista im- 69 munoterapiaa, Endogeenisen ζ- ja γ-proteiinin laaja jakauma ja todiste,, että γ-proteiinin, kanssa assosioituneet Fc~ reseptorit välittävät sytotoksisuutta erilaisissa solutyypeissä. tFanger et ai., Immunol Today 10: 92 - .99 (1989) 3, 5 sallii erilaisten solujen harkinnan käytettäväksi tähän tarkoitukseen. Esimerkiksi neutrofiiliset granulosyytit, joilla on hyvin lyhyt elinikä (noin 4 tuntia) verenkierros-sa ja jotka ovat erittäin sytölyyttisiä, ovat höukuttelevia kohdesoluja kimeerien ekspressöimiseksi. Neutro fi i1i en in-10 fektio Hl-viruksella ei todennäköisesti johda viruksen vapautumiseen ja näiden solujen runsauden (runsain leukosyyteistä) tulisi tehostaa isännän puolustusta. Toinen houkut-televa mahdollisuus isäntäsoluiksi ovat kypsät T-solut, populaatio, jota tällä hetkellä voidaan käyttää retrovirus-15 manipuloinnissa [Rosenberg, S .A., Aei, Am. 262: 62 - 69 (1990) ] , lL-2-rekonibinanttiproteiinin avulla T-solupopulaatioita voidaan laajentaa viljelmissä suhteellisen helposti ja laajennetuilla populaatioilla on tyypillisesti rajoittunut elinikä uudelleen infusoituina [Rosenberg et ai., N. 20 Engl. J. Med. 323: 570 - 578 (1990)].

Sopivissa olosuhteissa Hl-viruksen tunnistuksen sellaisten solujen toimesta, jotka ekspressoivat CD4-kimee-rejä, tulisi myös muodostaa mitogeeniset stimulukset, jotka sallivat sen mahdollisuuden, että aseistetut solupopulaati-25 ot voisivat respondoiäa dynaamisesti viruskuormitukseen. Vaikka olemme keskittyneet tässä fuusioproteiinien käyttäytymiseen sytolyyttisissä T~lymfosyyteissä, kimeerien eks-pressio auttajalymfosyyteissä voisi muodostaa HI-viruksen mobilisoiman sytokiinien lähteen, joka voisi estää autta-30 jasolualaryhmän romahduksen AIDS:ssa. Äskettäiset useiden sellaisten kaavioiden kuvaukset, joissa manipuloidaan resistenssiä infektiota vastaan muissa vaiheissa kuin viruksen tunkeutumisvaiheessa [Friedman et ai., Nature 335: 452 - 454 (1.988) ; Green et ai., Cell 58: 215 - 223 (1989) ; 35 Halim et ai., Cell 58: 205 - 214 (1989); Trono et ai.. Cell 59: 113 - 120 (1989); Buonöcore et ai., Nature 345: 625 - 70 628 (1980)] antavat ehdottaa, että CD4~kimeereitä sisältävät solut voitaisiin suunnitella niin, että ne estävät viruksen tuoton ekspressoimaila sopivia aineita, joilla on solunsisainen toimintakohta.

5 Kyky siirtää signaaleita T-lymfosyytteihin autono misten kimeerien välityksellä muodostaa myös kyvyn säädellä retroviruksilla manipuloituja lymfosyyttejä in vivo. Ris-tisitomisstimulukset, joita välittävät esimerkiksi spesifiset IpM-vasta-aineet, joita on manipuloitu poistamaan komp-10 lementin sitojadomeenit, voivat sallia sellaisten lymfosyyttien määrän kohoamisen in situ,: kun taas käsittely samanlaisilla spesifisillä IgG-vasta-aineilla (jotka tunnistavat esimerkiksi aminohappovariaation, joka on manipuloitu kimeeriseen ketjuun) voi selektiivisesti depletoida manipu-15 loidun populaation. Lisäksi, anti-CD4-IgM-vasta-aineet eivät vaadi lisäristisitomista kalsiumin mobilisoimiseksi Jurkat-soluissa, jotka ekspressoivat CD4:ζ-kimeerejä. Kyky säädellä solupopulaatioita ilman, että turvaudutaan toistuviin kehonulkoisiin amplifikaatiöihin voi oleellisesti laa-20 jentää geneettisesti manipuloitujen 'T-solujen käyttöaluetta ja -tehokkuutta, joka niille tällä hetkellä on ehdotettu.

Samalla kun keksintö on kuvattu yhdessä spesifisten suoritustapojen kanssa on ymmärrettävä, että. siihen voidaan tehdä lisämodifikaatioitä ja tämän patenttihakemuksen on 25 tarkoitettu sisältävän kdkainnön variaatiot, käytöt tai muokkaukset ja sisältävän sellaiset poikkeamiset esillä olevasta kuvauksesta, jotka sisältyvät siihen alaan, jota keksintö koskee ja joita voidaan soveltaa tässä aiemmin kuvattuihin keskeisiin ominaisuuksiin, jotka ovat lisättyjen 30 patenttivaatimusten piirissä.

i

Claims

71 Patenttivaatimukset.

1. Membraaniin sitoutunut kimeerinen proteiinire-septori, tunnettu siitä, että se sisältää (a) solunul-5 koisen osan, joka sisältää CD4 -fragment in, joka kykenee spesifisesti tunnistamaan Hl-viruksella infektoituneen solun ja sitoutumaan siihen, mutta joka ei välitä Hl-virusinfektiota, ja (bj solunsisäisen osan, joka käsittää signaalia kuljettavan osan T-solureseptoriproteiinista, B-sölu-10 reseptoriproteiinistä tai Fc-reseptoripro tei inistä, joka kykenee viestittämään isäntäsolulle, joka sisältää mainitun reseptorin, että sen tulee tuhota reseptoriin sitoutunut, Hl-viruksella infektoitunut solu, jossa mainittu CD4-fragment ti koostuu sekvenssinumeron 29 aminohapoista 1 - 394 15 tai 1 - 200 ja jossa mainitun CD4-fragment in erottaa mainitusta isäntäsolun membraanista ainakin 4,8 nm:n välimatka sellaisen osan avulla, joka käsittää s ekvenss inumero11a 35 esitetyn CD7-proteiinin membraanin läpi kulkevan domeenin, ihmisen IgGl-molekyylin sarana-, CH2- ja CH3-domeenin, jot-20 ka on esitetty sekvenssinumerolla 33, CD7-proteiinin membraanin läpi kulkevan osan, CD5-proteiinin membraanin läpi kulkevan osan, CD3 4 - p r o t e i in in membraanin läpi kulkevan osan, tai yhden; tai useamman a-heliksin.

2. Receptor enligt patentkrav 1, kanne t ecknad I 25 av att CD4-fragmentet skiljs frän värdcellens membran med ett avständ pä ätrainstone 7,2 nm.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen reseptori,, t u n -25 nettu siitä, että CD4-fragmentin erottaa isäntäsolun membraanista ainakin 7,2 nm:n välimatka.

3. Receptor enligt patentkrav 1, kanne tecknad 1 av att T-cellreceptorproteinet är ζ. |

3, Patenttivaatimuksen 1 mukainen reseptori, tunnettu siitä, että T-solureseptoriproteiini on ζ. 4, : Patenttivaatimuksen 1 mukainen reseptori, tun~ 30 nettu siitä, että isäntäsolu valitaan ryhmästä, joka sisältää: (a) T-lymfosyytit; (b) sytotoksiset T-lymfosyytit; (c) luonnolliset tappajasolut· (d) neutrofiilit; (e) granu-losyytit; (f) makrofaagit ,· (g) syöttösolut (mast-solut) ; ja (h) HeLa-soiut. i; 72

4. Receptor enligt patentkrav 1, k anne t e c k n a d | 30 av att värdcellen väljs frän en grupp, som innehäller: (a) j T-lymfocyter; (b) eytotoxiska T-lymfocyter; (c) naturdiga j mördsrceller; (d) neutrofiler; (e) granulocyter; (f) makro- | 'i fager; (g) matarceller (mast-celder); och (hj HeLa-celler, f 74

5 HI-virusinfekterad cell och bindas vid denna, men som inte förmedlar HI-virusinfektionen, och (b) en intracellular del, som omfattar en signaltransporterande del av ett T-cellreceptorprotein, B-cellreceptorprotein eller Fc-recep-torprotein, som förmär kommunicera till cellen att den bör 10 förstöra den vid receptorn bundna, HI-virusinfekterade cellen, väri nämnda CP4- fragment bestär av aminosyrorna 1 - 394 eller 1 - 200 med sekvensnummer 29 och väri nämnda CD4-fragment skiljs frän en värdcells nämnda mernbran med ett avständ pä ätminstone 4,8 nm med hjälp av en sädan 15 del, som omfattar ett med sekvensnummer 35 presenterat. CD7-proteins domän som gär genoxn membranen, en human igGl-molekyls led-, CH2- och CH3-domän, vilka har presenterats: med sekvenshummer 33, GB7-protelnets del som gär genom membranen, CD5-proteinets del som gär genom membranen,

20 CD34-proteinets del som gär genom membranen eller en eller i flera a-helixar, \

5. Cell, kanne tecknad av att den exprimerar en vid en membran bunden kimerisk proteinreceptor, vilken receptor innehäller (a) en extracellular del, som innehal-ler ett CD4-fragment, som förmär specifikt identifiera en

5. Solu, tunnettu siitä, että se ekspressoi mem-brääniin sitoutunutta kimeeristä proteiiniressptoria reseptorin sisältäessä (a) solunulkoiseh osan, joka sisältää CM-fragmentin, joka kykenee spesifisesti tunnistamaan HI- 5 viruksella infektoituneen solun ja sitoutumaan siilien^ mutta joka ei välitä Hl-virusinfektiota, ja (b) solun-sisäisen osan, joka käsittää signaalia kuljettavan osan T-splureseptoriproteiinista, B-solureseptoriproteiinista tai Fo-reseptoriproteiinista, joka kykenee viestittämään so-10- lulle, että sen tulee tuhota reseptoriin sitoutunut, Hl-viruksella infektoitunut solu, jossa mainittu CD4-frag-men.tti koostuu sekvenssinumeron 29 aminohapoista 1 - 394 tai 1 - 200 ja jossa mainitun CM- fragment in erottaa mainitusta isäntäsolun memhraanista ainakin 4,8 nm:n välimat-15 ka sellaisen osan avulla, joka käsittää sekvenssinumerolla 35 esitetyn CD7-proteiinin membraanin läpi kulkevan domee-nin, ihmisen IgGl-molekyylin sarana-, CH2- ja CH3-domee-nin, jotka on esitetty sekvenssinumerolla 33, CD7-proteiinin membraanin läpi kulkevan osan, CD5-proteiinin mem-20 braanin läpi kulkevan osan, CD34-proteiinin membraanin läpi kulkevan osan, tai yhden tai useamman a-heliksin.

6. Cell enligt patentkrav 5, kannet e cknad av Ϊ att CD4-fragmentet skiljs frän cellens merabran med ett av- | stand pä ätminstone 7,2 nm. |

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen solu, tunnettu siitä, että CD4-fragmentin erottaa solun membraanista ainakin 7,2 nm:n välimatka.

7. Cell enligt patentkrav 5 , k ä n n e t e c kn a d av j att T-cellreceptorproteinet är ζ, | 8. ,i3NA, k ä n ne te c k n a t av att det kodar för en f kimerisk receptor enligt patentkrav 1. |

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen solu, tunnet tu siitä, että T-solureseptoriproteiini on ζ.

8. DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa patent tivaatimuksen 1 mukaista kimeeristä reseptoria.

9. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää pa-30 tenttivaatimuksen 8 mukaisen kimeerisen reseptorin DNA:n. 73 1. : Via en meniBraii bunden kimerisk proteinreceptor, kannetecknad av att den innehäller (a) en extracel- 5 lulär del, sora innehäller ett CD4-fragment, som förmär specifikt identifiera en Hl-virusinfekterad cell och bin-das vid denna, men sora inte förmedlar Hl-virusinfektionen, och (b) en intracellulär del, som omfattar en signaltrans-porterande del av ett T-cellreceptorprotein, B-cellre.cep-10 fcorprotein elder Fc-receptorprotein, som fprinar kommunice-ra till värdcellen, som innebäller näranda receptor att den bör förstöra deh vid receptorn bundna, HI-virusinfekterade eellen, väri näranda CD4-fragment bestir av aminosyrotna 1 - 394 eller 1 - 200 med sekvensnuramer 29 och väri näranda 15 CP4-fragment skiljs frän en värdcells näranda merabran med ett avstind pä Strains tone 4,8 nm med hjädp av en sädan del, som omfattar ett med sekvensnuramer 35 presenterat CD7-proteins domän som gär genom membranen, en human igGl-molekyls led-, CH2- och CH3-domän, vilka har presenterats 2 0 med sekvensnummer 33, CD7-proteinets del som gär genom membranen, CD5-proteinets del som gär genom membranen, CD34-proteinets del som gär genom membranen eiler en elder flera a-helixar.

9. Vektor, kanne tecknad av att den innehäl-30 ler DNA av en kimerisk receptor enligt patentkrav 8. :j ! !