NO319378B1

NO319378B1 - DNA som koder for en kimaer reseptor, vektor og celle omfattende nevnte DNA, samt anvendelse av cellene.

Info

Publication number: NO319378B1
Application number: NO19963379A
Authority: NO
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus; Babak Banapour
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1996-08-13
Publication date: 2005-07-25
Also published as: HUT75375A; EP0750457A4; CN1146136A; CA2182890C; FI120264B; DE69534589T2; US5851828A; US7094599B2; FI963150A0; MX9603384A; IL112390A; FI963150A; EP0750457A1; HU9602182D0; JP3832850B2; WO1995021528A1; KR970701004A; BR9506783A; NZ279123A; ES2249766T3

Description

Oppfinnelsen angår DNA som koder for en kimær reseptor, vektor og celle omfattende nevnte DNA, samt anvendelse av cellene. Det beskrives funksjonelle kimærer mellom CD4-fragmenter og immuncellereseptorer som kan styre immunceller til lysering av HIV-infiserte celler, men som ikke gjør immuncellene ømfintlige overfor HIV-infeksjon. Oppfinnelsen tilveiebringer derfor en ny anvendelse av terapeutiske celler for HIV-terapi for fremstilling av en farmasøytisk blanding.

T-celleoppfattelse av antigen via T-cellereseptoren er grunnlaget for en rekke immunologiske fenomener. T-cellene styrer det som kalles cellemediert immunitet. Dette innbefatter ødeleggelse av fremmede vev eller infiserte celler ved hjelp av celler i immunsystemet. Det finnes forskjellige T-celler, innbefattende "hjelper"- og "undertrykker"-celler, som modulerer immunresponsen, og cytotoksiske (eller "dreper"-) celler, som kan drepe unormale celler direkte.

En T-celle som oppfatter og binder et unikt antigen som finnes på overflaten av en annen celle, blir aktivert; den kan deretter formere seg, og hvis den er en cytotoksisk celle, kan den drepe den bundne celle.

HIV og imxnunpatogenese

I 1984 ble det vist at HIV var det etiologiske virkemiddel ved AIDS. Siden denne tid er definisjonen av AIDS blitt revidert en rekke ganger med hensyn til hvilke kriterier som bør inngå ved diagnosen. Til tross for svingningen når det gjelder diagnostiske parametere, er imidlertid den enkle fellesnevner for AIDS infeksjonen med HIV og etterfølgende utvikling av vedvarende konstitusjonelle symptomer og AIDS-definerende sykdommer så som sekundære infeksjoner, neoplasmer og nevrologisk sykdom. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12. utg., McGrawHill

(1991) .

HIV er et humant retrovirus i lentivirusgruppen. De fire kjente humane retrovirus hører til to atskilte grupper: de humane T-lymfotrope (eller leukemi-) retrovirus, HTLV-1 og HTLV-2, og de humane immunsviktvirus, HIV-l, og HIV-2. De førstnevnte er trans-formerende virus, mens sistnevne er cytopatiske virus.

HIV-l er blitt identifisert som den mest alminnelige årsak til AIDS i hele verden. Sekvenshomologi mellom HIV-2 og HIV-l er ca. 40%, idet HIV-2 er nærmere beslektet med en del medlemmer i en gruppe av ape-immunsviktvirus (SIV). Se J.Curran et al.. Science, 329:1357-1359 (1985); R. Weiss et al.. Nature, 324:572-575 (1986).

HIV har de vanlige retrovirus-gener ( env, gag og pol) samt seks ekstra gener som inngår ved replikasjonen og andre biologiske aktiviteter hos viruset. Som tidligere angitt, er fellesnevneren for AIDS en dyptgående immunundertrykkeIse, hovedsakelig av cellemediert immunitet. Denne immun-undertrykkelse fører til forskjel-lige opportunistiske sykdommer, spesielt visse infeksjoner og neoplasmer.

Hovedårsaken til immundefekten ved AIDS er blitt identifisert som en kvantitativ og kvalitativ mangel hos under-settet av thymusavledede (T)-lymfocytter, T4-populasjonen. Dette under-sett av celler er definert fenotypisk ved tilstedeværelse av CD4-over-flatemolekylet , som er blitt vist å være cellereseptoren for HIV. Dalgleish et al-, Nature 312:763 (1984). Skjønt T4-cellene er hoved-celletypen som infiseres med HIV, kan i det vesentlige hvilken som helst human celle som uttrykker CD4-molekylet på sin overflate, bindes til og infiseres med HIV.

Tradisjonelt er CD4<+->T-celler blitt tildelt rollen som hjelper/induktor, noe som viser deres funksjon ved tilveiebringelse av et aktiverende signal til B-celler, eller indusering av at T-lymfocyttene som bærer den resiproke CD8-markør, blir cytotoksiske/undertrykkende celler. Reinherz og Schlossman, Cell 19:821-827 (1989); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68:5-42 (1982).

HIV bindes spesifikt og med høy affinitet, via en periode av aminosyrer i viruskapselen (gpl20), til en del av VI-regionen av CD4-molekylet som befinner seg nær dens N-terminale ende. Etter binding smelter viruset sammen med målcellemembranen og interneres. Når det er internert, bruker det enzymet reversert transkriptase til transkribering av sin genom-RNA til DNA, som integreres i celle-DNA, hvor det finnes i hele cellens levetid som et "provirus".

Proviruset kan forbli latent, eller det kan aktiveres til transkribering av mRNA og genom-RNA, noe som fører til proteinsyntese, sammenkopling, dannelse av nye virioner og knoppskyting av viruset fra celleoverflaten. Skjønt den nøyaktige mekanisme ved hvilken viruset bevirker celledød ikke er blitt påvist, antas det at hovedmekanismen er massiv virus-knoppskyting fra celleoverflaten, noe som fører til oppbryting av plasmamembranen og resulterende osmotisk ulikevekt.

I løpet av infeksjonen utvikler vertsorganismen antistoffer overfor virusproteiner, innbefattende hoved-kapselglykoproteinene gpl20 og gp41. Til tross for denne humorale immunitet, skrider sykdommen frem, noe som resulterer i en dødelig immununder-trykkelse som er kjennetegnet ved multiple opportunistiske infeksjoner, parasittemi, sløvsinn og død. Svikten hos vertens antivirus-antistoffer når det gjelder stopping av utviklingen av sykdommen representerer ett av de mest ubehagelige og alarmerende aspekter ved infeksjonen, og er et dårlig varsel med hensyn til vaksineringsforsøk basert på vanlige fremgangsmåter.

To faktorer kan spille en rolle når det gjelder effektiviteten av den humorale respons overfor immunsviktvirus. I likhet med andre RNA-virus (og spesielt i likhet med retrovirus), viser immunsviktvirusene for det første en høy mutasjonshastighet som svar på vertens immunforsvar. For det annet er kapselglykoproteinene i seg selv sterkt glykosylerte molekyler som viser få epitoper som er egnet for høyaffinitets-antistoffbinding. Det svakt antigene mål som viruskapselen oppviser, gir verten liten mulighet til begrensing av virusinfeksjon ved dannelse av spesifikke antistoffer.

Celler som er infisert med HIV-viruset, uttrykker gpl20-glykoproteinet på sin overflate. Gpl20 medierer fusjoner CD4<+->celler imellom via en reaksjon som er lik den reaksjon ved hvilken viruset kommer inn i de ikke-infiserte celler, noe som fører til dannelse av kortlivede flerkjernede kjempeceller. Syncytiumdannelse er avhengig av en direkte vekselvirkning mellom gpl20-kapselglykoproteinet og CD4-proteinet. Dalgleish et al., som ovenfor; D. Klatzman et al., Nature 312:763 (1984); J.S. McDougal et al., Science 231:382 (1986); J. Sodroski et al., Nature 322:470

(1986); J.D. Lifson et al., Nature 323:725 (1986); J. Sodroski et al., Nature 321:412 (1986).

Bevis for at CD4-gpl20-binding er ansvarlig for virusinfeksjon i celler som bærer CD4-antigenet, innbefatter det funn at det dannes et spesifikt kompleks mellom gpl20 og CD4. McDougal et al., som ovenfor. Andre forskere har vist at cellelinjene som var ikke-infiserbare når det gjaldt HIV, ble omdannet til infiserbare cellelinjer etter transfeksjon og ekspresjon av det humane CD4-cDNA-gen. Maddon et al., Cell 46:333-348 (1986).

Terapeutiske programmer basert på løselig CD4 som et passivt virkemiddel til vekselvirkning med virusadsorpsjon og syncytium-mediert celletransmisjon, er blitt foreslått og vist med hell in vitro av en rekke grupper (Deen et al., Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al-, Nature 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331:78-81 (1988); Smith et al-, Science 238:1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)); og CD4-immunglobulin-fusjonsproteiner med forlengede halveringstider og beskjeden biologisk, aktivitet er deretter blitt utviklet (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al. Nature 339, 68-70

(1989); Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)). Skjønt CD4-immuntoksin-konjugater eller -fusjonsproteiner viser potent cytotoksisitet overfor infiserte celler in vitro (Chaudhary et al., Nature 335:369-372 (1988); Till et al., Science 242:1166-1168 (1988)), gjør latensen hos immunsviktsyndromet at det er usannsynlig at en enkeltbehandlings-terapi vil være effektiv når det gjelder eliminering av virusmengden, og det er sannsynlig at antigeni-siteten hos fremmede fusjonsproteiner vil begrense aksepterbar-heten for dem ved behandlinger som fordrer gjentatt dosering. Forsøk med aper som er angrepet av SIV, har vist at løselig CD4 kan redusere SIV-titeret og forbedre in vitro målene av myeloid-potensial, hvis det administreres til dyr uten markert CD4-cytopeni (Watanabe et al., Nature 337:267-270 (1989)). Det ble imidlertid observert en omgående ny tilsynekomst av virus etter at behandlingen var avsluttet, noe som tyder på at livslang administrering vil kunne være nødvendig for forhindring av progressiv svekking av immunsystemet.

T-celle- og Fc-reseptorer

Celleoverflate-ekspresjon av den mest rikelige form av T-celleantigen-reseptoren (TCR) fordrer ko-ekspresjon av minst 6 ulike polypeptidkjeder (Weiss et al-, J. Exp. Med., 160:1284-1299

(1984); Orloffhashi et al.., Nature 316:606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem., 263:8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)), de antigenbindende ct/|3-kjeder, de tre polypeptider i CD3-komplekset, og £. Hvis noen av kjedene er fraværende, fås det ikke stabil ekspresjon av de gjenværende elementer i komplekset. £ er det begrensende polypeptid når det gjelder overflate-ekspresjon av det fullstendige kompleks (Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)) og antas å mediere minst en fraksjon av celleaktiveringsprogrammene som igangsettes ved reseptor-oppfattelse av ligand (Weissman et al., EMBO J. 8:3651-3656

(1989); Frank et al., Science 249:174-177 (1990)). En 32 kDa type I integralmembran-homodimer, Z, (zeta), har et ekstracellulært 9-rests-doméne uten noen seter for N-bundet glykanaddisjon, og et intracellulært doméne med 112 rester (mus) eller 113 rester (human) (Weissman et al., Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:9709-9713 (1988)). En isoform av £ kalt n. (eta) (Baniyash et al., J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989)), som oppstår fra en vekslende mRNA-skjøtende vei (Jin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3233 (1990)), er tilstede i reduserte mengder i celler som uttrykker antigen-reseptoren. £-n,-heterodimerer antas å mediere dannelsen av inositolfosfater samt den reseptor-initierte programmerte celledød kalt apoptose (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).

I likhet med ( og r), uttrykkes den Fc-reseptor-tilknyttede y-kjede i celleoverflatekomplekser med ytterligere polypeptider, hvorav noen medierer ligandoppfattelse, og andre har udefinert funksjon, y (gamma) bærer en homodimer struktur og et totalt system som er meget likt £ og er en komponent i høyaffinitets-IgE-reseptoren, FceRI, både hos mastceller og basofile celler, som består av minst tre ulike polypeptidkjeder (Blank et al., Nature 337:187-189 (1989); Ra et al.. Nature 241:752-754 (1989)) og én av lavaffinitets-reseptorene for IgG, representert hos mus ved FcYRUa (Ra et al., J. Biol. Chem. 264:15323-15327 (1989)), og hos mennesker ved CD16-undertype-ekspresjonen ved makrofager og naturlige dreperceller, CD16n< (CD16-transmembran) (Lanier et al.. Nature 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:2274-2278 (1990)) og med et polypeptid med uidentifisert funksjon (Anderson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:2274-2278

(1990)) . Det er nylig blitt rapportert at y uttrykkes av en muse-T-cellelinje, CTL, hvor den danner homodimerer samt y-Z, °9Y~n_ heterodimerer (Orloff et al., Nature 347:189-191 (1990)).

Fc-reseptorene medierer fagocytose av immunkomplekser, transcytose, og antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC)

(Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6:251-281 (1988); og Mellman, Curr. • Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Det er i den senere tid blitt vist at én av lavaffinitets-muse-Fc-reseptor-isoformene, FcRyIIIBI, medierer internalisering av Ig-belagte målmaterialer i klatrin-belagte fordypninger, og at en annen lavaffinitets-reseptor, FcrylllA, medierer ADCC ved sammenknytning av den med ett eller flere medlemmer av en liten familie av "utløsermolekyler"

(Miettinen et al., Cell 58:317-327 (1989); og Hunziker og Mellman, J. Cell Biol. 109:3291-3302 (1989)). Disse utløsermolekyler, ■ T-cellereseptor- (TCR) -£-kjede, TCR-n.-kjede og Fc-reseptor-y-kj ede' vekselvirker med ligandoppfattelses-doméner i forskjellige immunsystem-reseptorer og kan autonomt initiere celle-effektor-programmer, innbefattende cytolyse, etter aggregering (Samelson et' al., Cell 43:223-231 (1985); Weissman et al., Science 239:1018-1020 (1988); Jin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3323

(1990); Blank et al., Nature 337:187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki og Ravetch, Nature 342:805-807

(1989); Hibbs et al., Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 87:2274-2278 (1990); og Irving og Weiss, Cell. 64 :891-901 (1991))".

Ved at det er trukket paralleller mellom lavaffinitets-Fc-reseptorfamiliene hos mus og mennesker, er det imidlertid blitt klart at de humane FcRyllA- og C-isoformer ikke har noe muse-motstykke. Delvis på grunn av dette må funksjonen av dem fremdeles defineres.

På grunn av at humorale virkemidler basert på CD4 alene kan

ha begrenset anvendelighet in vivo, har tidligere forskning utforsket muligheten for forøkning av celleimmunitet overfor HIV. Det er blitt identifisert preparater av protein-kimærer hvor det ekstracellulære doméne i CD4 er sammensmeltet med transmembran-og/eller intracellulær-doménene i signaloverføringselementer i T-

cellereeeptorer, IgG-Fc-reseptorer eller B-cellereseptorer (US-patentsøknader 07/847 566 og 07/665 961, medtatt i det foreliggende som referanse). Cytolytiske T-celler som uttrykker kimærer innbefattende et ekstracellulært CD4-doméne viser potent MHC-uavhengig

ødeleggelse av cellemål som uttrykker HIV-kapselproteiner. En meget viktig og ny komponent ved denne fremgangsmåte har vært identifisering av enkelt-T-celle-reseptor-, Fc-reseptor- og B-cellereseptor-kjeder hvis aggregering er tilstrekkelig til initiering av celle-responsen. Én spesielt egnet anvendelse av denne fremgangsmåte har vært oppfinnelsen av kimærer mellom CD4 og (,, ri eller y som styrer cytolytiske T-lymfocytter til oppfattelse og dreping av celler som uttrykker HIV gpl20 (US-patentsøknader 07/847 566 og 07/665 961, medtatt i det foreliggende som referanse).

Romeo et al., Cell, 64, s. 1037-1046, 1991, EP 0 325 262 og WO 92/10591 feiler i å beskrive ødeleggelse av reseptorbundet HIV eller HIV-infiserte målceller med terapeutiske celler, for eksempel cytotoksiske lymfocytter, som i seg selv ikke overfører HIV-infeksjon. Romeo et al. og WO 92/10591 er rettet på fremgangsmåter og kimære reseptorer som inkluderer intracellulære områder som er i stand til å signalisere vertsceller til å ødelegge reseptorbundet HIV eller HIV-infiserte celler. Imidlertid blir vertscellene omtalt i disse referansene, mottagelige for HIV-infeksjon. EP

0 325 262 beskriver løselige immunglobulin-CD4-fusjonsproteiner som ikke er tilstede på overflaten av vertsceller.

Konstruering av CD4-reseptor-kimærer

Humane £-cDNA (Weissman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:9709-9713 (1988b)) og ycDNA (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990)) ble isolert ved hjelp av polymerasekjedereaksjon fra biblioteker frembrakt fra HPB-ALL-tumorcellelinjen (Aruffo et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987b))

og fra humane naturlige dreperceller, mens n-cDNA (Jin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3323 (1990)) ble isolert fra et musethymocytt-bibliotek. £-, n- og y-cDNA ble knyttet til det ekstracellulære domene av en genteknikk-fremstilt form av CD4 som har et BamHI-sete like oppstrøms for det membran-overspennende domenet (Aruffo et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573-8577 (1987b)); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9347-353 (1990)) som

ble knyttet til BamHI-setet som er naturlig tilstede i £- og n.-cDNA-molekylene på et liknende sted noen få rester oppstrøms for det membran-overspennende doménet (SEKV\ ID NR: 1, 3, 4 og 6). For dannelse av fusjonsproteinet med y, ble et BamHI-sete innført ved genteknikk i sekvensen på det samme omtrentlige sted (fig. 1; SEKV. ID NR: 2 og 5). Gen-fusjonene ble innført i et Vaccinia-virus-ekspresjonsplasmid som bærer E. coli-gpt-genet som seleksjons-markør, og innført i genomet av Vaccinia-WR-stammen ved homolog rekombinasjon og utvelgelse med hensyn til vekst i mykofenolsyre (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988);

Boyle et al., Gene 65:123-128 (1988)). Strømningscytometri-analyse viste at de rekombinante Vaccinia-virus styrer den rikelige dannelse av CD4:£- og CD4:y-fusjonsproteiner på celleoverflaten, mens ekspresjon av CD4:n. er vesentlig svakere (fig. IB) . Sistnevnte funn er i overensstemmelse med en fersk rapport om at transfektering av et ri-cDNA-ekspresjonsplasmid i en musehybridom-cellelinje ga vesentlig mindre ekspresjon enn'transfektering av et sammenliknbart £-ekspresjonsplasmid (Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1998)). Immunutfelling av celler infisert med de rekombinante Vaccinia-virus viste at fusjonsproteinene danner kovalente dimerer, i motsetning til det naturlig forekommende CD4-antigen. Molekylmassene for de monomere CD4:<[- og CD4 ^-fusjonsproteiner og naturlig CD4 ble. funnet å være henholdsvis 63, 55 og 53 kD. De større massene av fusjonsproteinene er omtrent i overensstemmelse med den større lengde av den intracellulære del, som overstiger lengden for naturlig CD4 med 75 (CD4:() eller 5 (CD4:y) rester.

CD4-kimærer kan knyttes til andre reseptorkjeder

Celleoverflate-ekspresjon av makrofag-/naturlig drepercelle-formen av human FcyRUI (CD16tm) på transfektanter blir gjort lettere ved ko-transfektering med muse-y (Kurosaki et al., Nature 342:805-807 (1989)) eler humant y (Hibbs et al., Science 246:1608-1611 (1989)) samt med humant £ (Lanier et al., Nature 342:803-805

(1989)).

I overensstemmelse med disse beretninger muliggjorde ekspresjon av kimærene dessuten overflate-ekspresjon av CD16TO ved overlevering til målcellen enten ved kotransfektering eller ved koinfisering med rekombinante Vaccinia-virus (fig. 2). Befordringen av CD16ra-overf late-ekspresjon med £ var mer uttalt enn befordringen med y (fig. 2) i de undersøkte cellelinjer, mens naturlig CD4 ikke øket CDie^-overflate-ekspresjonen.

Asp-(-mutanter ko-assosieres ikke med Fc-reseptor

For frembringelse av kimærer som ikke vil forbindes med eksisterende antigen- eller Fc-reseptorer, ble det laget mutante £-fusjonsproteiner som enten manglet intramembran-Asp- eller intramembran-Cys-resten eller begge. Strømningscytometri viste at intensiteten av celleoverflate-ekspresjon med de forskjellige mutant-kimærer ikke var særlig forskjellig fra den ikke-muterte forløper, og immunutfelningsforsøk viste at total ekspresjon med kimærene var like. Som ventet, ble det funnet at mutant-kimærene. som manglet transmembran-cysteinresten, ikke dannet disulfidbundne dimerer. De to mutant-kimærer som manglet Asp, var ikke i stand til å understøtte overflate-ekspresjonen av CD16™, mens de monomere kimærer som manglet Cys, men som bar Asp, muliggjorde' at CD16TO kunne ko-eksprimeres, men med lavere effektivitet enn opphavs-dimeren (fig. -3).

Mutante reseptorer bibeholder evnen til å initiere en kalsium-respons

For bestemmelse om hvorvidt kryssbinding av fusjonsproteinene vil muliggjøre opphoping av fritt intracellulært kalsium på liknende måte som det som- er kjent for å skje med T-celleantigen-reseptoren, ble celler av den humane T-celle-leukemilinje, Jurkat E6 (ATCC aksesjonsnummer TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) infisert med de rekombinante Vaccinia-virus, og den relative cytoplasma-kalsiumkonsentrasjon etter kryssbinding av det ekstracellulære doméne med antistoffer ble målt. Strømningscytometriske målinger ble utført med celler som var tilført det kalsiumfølsomme fargestoff Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem, 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Fig. 4A-D viser resultatene av kalsiumutstrømnings-forsøk med celler infisert med CD4:£.og Asp"-og Cys"-mutantene av Kryssbinding av kimærene øket intracellulært kalsium på en reproduserbar måte. CD4:r) og CD4:y muliggjorde likeledes opphoping av intracellulært kalsium i infiserte celler. Jurkat-celler uttrykker lave nivåer av CD4 på celleoverflaten, men kryssbinding av det naturlige CD4 i nærvær eller fravær av CD16:£ forandrer ikke intracellulære kalsiumnivåer (fig. 4A-B).

CD4:(-, r\- og y~kimærer medierer cytolyse av målceller som uttrykker HIV gpl20/41

For bestemmelse av om hvorvidt de kimære reseptorer vil .utløse cytolytiske éffektorprogrammer, ble det frembrakt et mønster-mål:effektor-system basert på CD4-oppfattelse av HIV-kapsel-gpl20/gp41-komplekset. HeLa-celler ble infisert med rekombinante Vaccinia-virus som uttrykte gpl20/gp41 (Chakrabarty et al.,' Nature 320:535-537. (1986) ; Earl et al., J. Vi roi. 64:2448-2451 (1990)), og merket med <51>Cr. De merkede celler ble inkubert - med celler .fra en human allospesifikk (CD8<+>, CD4") cytotoksisk T-lymfocyttlinje som var blitt infisert med rekombinante Vaccinia-virus som uttrykte CD4:£-, CD4:n- eller CD4:y-kimærene, eller dobbeltmutant-CD4:^CysllGly:Aspl5Gly-kimæren. Fig. 5A-C viser at HeLa-celler som uttrykker gpl20/4l, ble spesifikt lysert med cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som uttrykker CD4-kimærer. CTL utrustet med CD4:^-kimærer siktet ikke mot ikke-infiserte HeLa-celler, og HeLa-celler som uttrykte gpl20/41, ble ikke oppfattet av ikke-infiserte CTL. For sammenlikning av effektiviteten av de forskjellige kimærer, ble forholdet mellom effektor og målmateriale korrigert med hensyn til fraksjonen av CTL som uttrykker CD4-kimærer, og med hensyn til fraksjonen av HeLa-celler som uttrykker gpl20/41, ifølge måling ved strømningscytometri. Fig. 5C ' viser en cytometrisk analyse av CD4-ekspresjon ved CTL anvendt i cytolyseforsøket vist på fig. 5A og 5B. Skjønt middel-tettheten av overf late-CD4: £ i stor grad oversteg middel-tettheten for CD4:n./ var de cytolytiske effektiviteter av celler som uttrykker begge former, like. Under korrigering med hensyn til fraksjonen av målmateriale som uttrykker gpl20, er effektiviteten av cytolyse som medieres av CD4:£- og CD4 :r)-proteiner sammenliknbar med de beste effektiviteter som er rapportert for spesifikke par av T-cellereseptor-mål og -effektor (middelforholdet mellom effektor og målmateriale for 50% frigjøring ved T-celler som uttrykker CD4:£, var 1,9 ± 0,99, n=10). CD4:y-fusjonen var mindre aktiv, og likeledes CD4:^-fusjonen som manglet transmembran-Asp- og -Cys-restene. I begge tilfeller ble det imidlertid observert betydelig cytolyse {fig. 5B-C).

For kontrollering med hensyn til muligheten for at Vaccinia-infeksjon kan befordre artefakt-oppfattelse hos CTL, ble det utført liknende cytolyseforsøk med målceller infisert med Vaccinia-rekombinanter som uttrykte den fosfatidylinositol-bundne form av CD16 (CD16pi) og merket med <51>Cr, og med CTL infisert med kontroll-rekombinanter som uttrykker enten CD16Pi eller..CD16 :£. Fig. 6A viser at T-celler som uttrykker ikke-CD4-kimærer, ikke oppfatter naturlige HeLa-celler eller HeLa-celler som uttrykker gpl20/41, og likeledes at T-celler som uttrykker CD4-kimærer, ikke oppfatter HeLa-celler som uttrykker andre Vaccinia-kodede overflateproteiner. Dessuten lyserer ikke CTL'er som uttrykker ikke-kimært CD4, i noen betydelig grad HeLa-celler som uttrykker gpl20/41 (fig. 6A).

Kimærene sikter ikke mot celler som bærer MHC klasse II

CD4 antas å vekselvirke med en ikke-polymorf sekvens som uttrykkes av MHC-antigen klasse II (Gay et al., Nature 328:626-629

(1987); Sleckman et al., Nature 328:351-353 (1987)). Skjønt det med rensede proteiner aldri er blitt dokumentert noen spesifikk vekselvirkning mellom CD4 og antigen i klasse II, kan det under visse betingelser påvises adhesjon mellom celler som uttrykker CD4, og celler som uttrykker molekyler i klasse II (Doyle et al., Nature 330:256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245:743-746 (1989)). Det ble deretter undersøkt om hvorvidt drap kunne påvises overfor celler som bærer klasse II. Fig. 6B viser at det ikke er noen spesifikk cytolyse som styres av CD4:£ overfor cellelinjen Raji B, som uttrykker rikelige mengder antigen i klasse II. Skjønt det observeres en beskjeden (-5%) cytolyse, viser en klasse II-negativ mutant av Raji, RJ.2.5 (Accolla, J. Exp. Med. 157:1053-1058

(1983)) en liknende ømfintlighet, og likeså Raji-celler inkubert med ikke-infiserte T-celler.

Sekvens-fordringer for induksjon av cytolyse ved T-celle-antigen/Fc-reseptor-zetakjeden

Skjønt kimærer mellom CD4 og £ kan utruste cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) slik at de dreper målceller som uttrykker HIV gpl20, ble det lett etter et alternativ til CD4 for utvetydig sammenlikning av egenskapene hos zeta-kimærer innført i humane T-cellelinjer. Slike linjer kan uttrykke CD4, noe som gjør det vanskelig spesifikt å definere forholdet mellom typen eller graden av kalsium-mobilisering og det cytotoksiske potensial hos de forskjellige kimærer. For omgåelse av dette ble det dannet kimærer mellom ( og CD16 hvor det ekstracellulære doméne av CD16'er knyttet til transmembran-sekvensén og de intracellulære sekvenser av 4 (fig. 7A). Genfusjonene ble innført i et Vacciniavirus-ekspresjonsplasmid som bærer B. coli gpt-genet som utvelgbar markør, og innført i genomet hos Vaccinia-WR-stammen ved homolog rekombinasjon og utvelgelse med hensyn til vekst i mykofenolsyre (Falkner og Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle og Coupar, Gene 65:123 (1988)).

T-cellelinjer ble infisert med Vaccinia-rekombinantene, og den relative frie kalsiumione-konsentrasjon i cytoplasma ble målt etter kryssbinding av de ekstracellulære doméner med antistoffer. Både spektrofluorimetriske (hovedpopulasjonen) og strømnings-cytometriske■(enkeltcelle-) målinger ble utført med celler tilført fargestoffet Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440

(1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952 (1986)). Fig. 7B viser en analyse av data oppsamlet fra celler av den humane Jurkat-T-celle-leukemilinje infisert med Vaccinia-rekombinanter som uttrykker CD16:^-fusjonsprotein. Kryssbinding av kimærene øket intracellulært kalsium på en reproduserbar måte, mens liknende behandling av celler som uttrykker ikke-kimært CD16, hadde liten ■ ■ eller ingen effekt. Når kimærene ble uttrykt i mutante cellelinjer som manglet antigen-reseptor, så man enten REX33A- (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264:20760 (1989), eller Jurkat-mutant JRT3.T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 135:123 (1984)); eller en sterk respons overfor CD16-antistoff-kryssbinding. Liknende data er blitt oppsamlet når det gjelder REX20A-mutantcellelinjen (Breitmeyer et al., som ovenfor, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)), og en CD3 Ti-negativ mutant av Jurkat-cellelinjen opprettet i dette laboratorium. Infisering med rekombinanter som uttrykker CD16:£, gjenopprettet ikke responsen overfor anti-CD3-antistoff, noe som viste at fusjonsproteinet ikke virket ved berging av intracellulære CD3-kompiekskjeder.

For vurdering av kimærenes evne til styring av cellemediert immunitet på nytt, ble CTL'er infisert med Vaccinia-rekombinanter som uttrykker CD16-kimærer, og anvendt til spesifikk lysering av hybridomceller som uttrykker membranbundne anti-CD16-antistoffer. Denne analyse er en utvidelse av en hybridom-cytotoksisitets-analyse som opprinnelig ble utviklet for analysering av effektor-mekanismer hos celler som bærer Fc-reseptorer (Graziano og- Fanger,■ J.Immunol. 138:945, 1987; Graziano og Fanger, J.Immunol. 139:35-

36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959, 1989; Fanger et al., Immunol. Today 10:92, 1989). Fig. 8B viser at ekspresjon av CD16:£

i cytotoksiske T-lymfocytter muliggjør at de utrustede CTL kan drepe 3G8-hybridomceller (anti-CD16; Fleit et al.; Proe. Nati.

Acad. Sei. USA 79:3275, 1982), mens CTL som uttrykker den fosfatidylinositol-bundne form av CD16, er inaktive. CTL utrustet med . CD16:£ dreper heller ikke hybridomceller som uttrykker et uaktuelt antistoff.

For identifisering av de minimale ^-sekvenser som er nødven-dige for cytolyse, ble det laget en serie utelukkelses-mutanter hvor suksessivt mer av det. intracellulære (-doméne ble fjernet fra den karboksylterminale ende (fig. 8A). Størstedelen av det intracellulære zeta-doméne kunne fjernes med liten følge for cytolytisk potensial; kimært CD16:£ i full lengde var, når det gjaldt effektivitet, i det vesentlige lik kimæren utelukket til rest 65, CD16:^Asp66<*> (fig. 8B). En vesentlig reduksjon når det gjaldt cytotoksisitet ble observert ved utelukkelse til.£-rest■59 (kimært CD16:£Glu60<*>), og ytterligere utelukkelse til rest 50 resulterte i litt lavere aktivitet. Imidlertid ble det ikke observert fullstendig tap av aktivitet selv når det intracellulære doméne ble redusert til en tre-resters transmembran-forankring (fig. 8B).

På grunn av at £ er en disulfidbundet dimer, var én for-klaring av retensjonen av cytolytisk aktivitet at endogent

dannet heterodimerer med den kimære £-utelukkelse, hvorved aktiviteten ble gjenopprettet. For testing av denne oppfatning ble

^-restene 11 og 15 skiftet fra henholdsvis Asp og Cys til Gly (CysllGly/AsplSGly), og immunutfellinger .ble utført som følger. Omtrent 2 x IO<6> CV1-celler ble infisert i 1 time i serumfritt DME-medium med rekombinant Vaccinia ved en infeksjons-multiplisitet (moi) på minst 10. Fra 6 til 8 timer etter infisering'ble cellene løsgjort fra platene med PBS/lmM EDTA og overflatemerket med 0,2 mCi 125I pr. 2 x IO<6> celler under anvendelse av laktopeiroksydase og H202 ved fremgangsmåten ifølge Clark og Einfeld (Leukocyte Typing II, s. 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986) . De merkede celler ble oppsamlet ved sentrifugering og-lysert i 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 5 mM KC1, 0,2 M jodacetamid og l.mM PMSF: Kjernene ble fjernet ved sentrifugering, . og CD16-proteinene ble immunutfelt med antistoff 3G8 (Fleit et al., som ovenfor, 1982; Medarex) og anti-muse-IgG-agarose (Cappel, Durham, NC). Prøvene ble kjørt i elektroforese gjennom en 8% polyakrylamid/SDS-gel under ikke-reduserende betingelser, eller ■ gjennom en 10% gel under reduserende betingelser. Disse' immun-utf eininger bekreftet at CD16:£CysllGly/Aspl5Gly-kimæren ikke inngikk forbindelse i disulfidbundne dimerstrukturer.

Den cytolytiske aktivitet av de mutante reseptorer ble også undersøkt. Den muterte kimær som var utelukket til rest 65 (CD16:£CysllGly/Aspl5Gly/Asp66<*>), var, avhengig av analyse-betingelsene, 2-8 ganger mindre aktiv i cytolyseanalysen enn den sammenliknbare ikke-muterte kimære (CD16:<Asp66<*>), som vanligvis var innenfor en faktor på 2 i forhold til, eller kunne ikke skjel-nes, når det gjaldt aktivitet, fra CD16:-£ (fig. 9B) . Reduksjonen i aktivitet hos mutant-kimæren er sammenliknbar med reduksjonen som sees med CD4-kimærer med liknende struktur (se ovenfor), og skyldes mest sannsynlig den lavere effektivitet av ^-monomerer sammenliknet med dimerer. I motsetning til dette hadde den Asp"-, Cys"-muterte kimær som.var utelukket til rest 59, ingen cytolytisk aktivitet (fig. 9B), noe som understøtter hypotesen om at sammenknytting med andre kjeder mediert ved transmembran-Cys- og/eller Asp-restene var ansvarlig for den svake persistens når det gjaldt cytolytisk aktivitet i utelukkelser som var mer aminoterminale enn rest 65.

Strømningscytometriske undersøkelser viste at utelukkelses-mutantene som manglet transmembran-Asp-. og -Cys-rester.fremdeles kunne befordre en økning i fritt intracellulært kalsium-ion som svar på antistoff-kryssbinding i en TCR~-Jurkat-mutantcellelinje (fig. 9D). Liknende resultater ble oppnådd for kimærer uttrykt i opphavs-Jurkatlinjen. Når det gjaldt CD16:£CysllGly/Aspl5Gly/. Glu60<*>, viser disse data at evnen til formidling av kalsium-responsivitet kan skilles ved mutasjon fra evnen til under-støttelse av cytolyse.

For definitiv eliminering av det mulige bidrag av £-transmem^ branrester, ble transmembran-restene og de første 17 cytoplasmarester av £ erstattet med sekvenser som koder for det membran-■omspennende og de første 14 eller første 17 cytoplasmarester av henholdsvis CD5- eller CD7-antigenene (fig. 9A). De resultrende tredelte fusjonsproteiner CD16 :5 : <; (48-65) og CD16:7:£(48-65) dannet ikke disulfidbundne dimerer slik som de enklere CD16:£-kimærer på grunn av at de manglet cystein-resten i ^-transmembran-doménet. Begge de tredelte kimærer var i stand til å mobilisere kalsium i Jurkat- og TCR-negative cellelinjer (fig. 9D) og å frembringe en cytolytisk respons i CTL (fig. 9C og data ikke vist). Imidlertid motvirker avskjæring av ^-delen til rest 59 i kimære CD16:7:£(48-59) evnen ved tredelt fusjon til å styre kalsium-responsiviteten i TCR-positive eller -negative Jurkat-celler, eller cytolyse i fullt utviklede CTL (fig. 9C og 9D og data ikke vist).

For undersøkelse av bidragene av individuelle rester i 18-resters-mønsteret, laget vi en rekke mutant-varianter ved hjelp av seterettet mutagenese, og vurderte deres evne til formidling av. reseptorstyrt dreping under betingelser med lav (fig. 10A og 10D) eller høy (fig. 10B og 10E) ekspresjon av kimær reseptor. Fig. 10A-F viser at skjønt en rekke forholdsvis konservative substitusjoner (d.v.s. erstatting av sure rester med deres beslektede aminder, eller tyrosin med fenylalanin) som spente over restene 59-63, ga moderat kompromiss av cytolytisk effektivitet, bibeholdt variantene generelt evnen til mobilisering av kalsium. Kollektivt omfatter imidlertid disse rester et viktig'under-mønster, for så vidt som utelukkelse av dem eliminerer cytolytisk aktivitet. Ombytting av Tyr 62 med enten Phe eller Ser eliminerer både de cytotoksiske responser og kalsium-responsene. I den aminoterminale ende av 18-resters-segmentet avskaffet erstatning av Tyr

■51 med Phe både kalsium-mobilisering og cytolytisk aktivitet,. mens erstatting av Leu med Ser i stilling 50 eliminerte kalsiumresponsen, mens cytolysen bare delvis ble svekket. Uten at man er bundet til noen spesiell hypotese, ventes det at Leu50Ser-mutantens manglende evne til mobilisering av kalsium ved kortvarige strømningscytometriske analyser ikke fullstendig gjenspeiler dens evne til formidling av en vesentlig økning i fritt intracellulært kalsium-ion i løpet av det lengre tidsrom som cytolyseanalysen strekker seg over. Imidlertid er cytolytisk aktivitet som er ufølsom overfor kalsium, blitt rapportert for en del cytolytiske T-cellelinjer, og muligheten for at et liknende . fenomen ligger under ved resultatene beskrevet i det foreliggende er ikke utelukket. Erstatting av Asn48 med Ser svekket cytotoksi-siteten delvis ved en del forsøk, mens det hadde liten virkning ved andre forsøk.

For undersøkelse av den potensielle rolle som overflødige sekvenselementer spiller, ble det intracellulære doméhe av £ delt i tre segmenter, som spente over restene 33-65, 71-104 og 104-138.' Hvert av disse segmenter ble knyttet til en CD16:CD7-kimære ved hjelp av et Mlul-sete innført like distalt for basis-membran-forankringssekvensene av det intracellulære doméne av CD7 (se nedenfor; fig. 11A). Sammenlikning av den cytolytiske effektivitet av de tre elementer viste at de var hovedsakelig ekvipotente {fig. 11B). Sekvens-sammenlikning (fig. 11A) viser at det andre mønster bærer 11 rester mellom tyrosiner, mens det første og tredje mønster bærer 10.

Skjønt det ikke er blitt ført noe nøyaktig regnskap når det gjelder T-celleaktiveringsprosessen, er det klart at aggregering av antigen-reseptoren eller av reseptorkimærer som bærer intracellulære ^-sekvenser, utløser kalsium-mobilisering, cytokin- og granul-frigjøring og tilsynekomst av celleoverflatemarkører for aktivering. Det er sannsynlig at det aktive sete av en kort lineær peptidsekvens som sannsynligvis er for liten til å ha■ iboende enzymatisk aktivitet, vekselvirker med.ett, eller høyst noen få, proteiner under formidling av celleaktivering. Det er

■også klart at mobilisering av fritt kalsium ikke i seg selv er tilstrekkelig for celleaktivering, siden evnen til formidling av cytolyse kan skilles mutasjonelt fra evnen til formidling av

ka1s iumopphoping.

Som vist i det foreliggende, muliggjør addisjon av 18 rester fra det intracellulære domene av £ til transmembran-doménet og det intracellulære doméne av to ikke-beslektede proteiner at de resulterende kimærer kan gjen-styre cytolytisk aktivitet overfor målceller som bindes til den ekstracellulære del av fusjonsproteinene. Skjønt kimærer som bærer 18-resters-mønsteret, er omtrent åtte ganger mindre aktive enn kimærer basert på £ i full lengde, kan den reduserte aktivitet tilskrives tapet av transmembran-vekselvirkninger som normalt muliggjør at villtype-< kan danne disulfidbundne dimerer. Det vil si at (-utelukkelses-konstruksjoner som har den samme karboksylterminale ende som ■ mønsteret og mangler transmembran-Cys- og -Asp-rester, typisk viser litt mindre aktivitet enn kimærer som bare bærer 18-resters-mønsteret .

Elementet med cytolytisk kompetens som vi har fokusert på, har to tyrosiner og ingen seriner eller treoniner, noe som begrenser de mulige bidrag av fosforylering til aktiviteten: Mutasjon av begge tyrosiner ødelegger imidlertid aktiviteten, og skjønt foreløpige forsøk ikke tyder på en vesentlig tyrosin-fosforylering etter kryssbinding av kimære overflateantigener"som bærer 18-resters-mønsteret, kan en mulig deltaking av slik fosforylering på et lavt nivå ikke utelukkes. I tillegg til de virkninger som er angitt ved de to tyrosin-rester, svekker en rekke aminosyre-erstatninger i den amino- og karboksyl-terminale' ende av mønsteret aktiviteten under betingelser med lav reseptor-tetthet ■.

Sekvenser som likner på det aktive (-mønster, kan finnes i cytoplasma-doménene hos flere andre transmembranproteiner, innbefattende CD3-6- og -y-molekylene, de overflate-IgM-forbundne proteiner mbl og B29, og p- og y-kjedene av høyaffinitets-IgE-reseptoren, FceRI (Reth, Nature 338:383, 1989). Skjønt funksjonen av disse sekvenser er usikker, vil hver av dem, hvis de uttrykkes effektivt, kunne være i stand til autonom T-celleaktivering, og slik aktivitet kan forklare rest-TCR-responsiviteten som sees i en zeta-negativ mutant cellelinje (Sussman et al., Cell 52:85,- 1988).

£ bærer i seg selv tre slike sekvenser, med omtrent likt mellomrom, og en grov tredeling av det■intracellulære doméne viser

at hver av dem er i stand til å initiere en cytolytisk respons, ri, en skjøt-isoform av ( (Jin et al., som ovenfor, 1990; Clayton et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:5202, 1991), mangler karboksyl-halvdelen av det tredje mønster. På grunn av at- fjerning av karboksyl-halvdelen av det første mønster avskaffer aktiviteten, ser det sannsynlig ut at hovedandelen av den biologiske effektivitet av r\ kan tilskrives de første to.mønstre. Skjønt n ved forskjellige målinger er like aktiv som ( når det gjelder befordring av antigen-mediert cytokin-frigjøring {Bauer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88:3842, 1991) eller gjenstyrt cytolyse (se ovenfor) , blir r\ ikke fosforylert som svar på reseptor-stimulering (Bauer et al., som ovenfor, 1991). Således er enten tilstedeværelse .av alle de tre mønstre nødvendig for . fosforylering, eller det tredje mønster representerer et fore-trukket substrat for en ikke-identifisert tyrosin-kinase.

Ifølge ett aspekt av foreliggende oppfinnelse, omfattes en ■ DNA-sekvens kjenntegnet ved at den koder for en proteinholdig,-membranbundet, kimær reseptor som omfatter (a)- en'ekstracellulær, del som innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan-oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-infeksjon, hvor nevnte fragment av CD4 omfatter aminosyrene 1-3 94 eller aminosyrene 1-200 avSEQ ID NR:-29, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et T-celle-reseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptor-protein som kan signalisere til en celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle.

Ifølge et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse omfattes

en .vektor som omfatter DNA ifølge oppfinnelsen.

Ved et ytterligere aspekt, omfatter oppfinnelsen en celle som kjennetegnes ved den uttrykker en en proteinholdig, membranbundet, kimær reseptor som omfatter (a) en ekstracellulær del som .. innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-infeksjon, hvor nevnte- fragment av CD4 omfatter aminosyrene 1-3 94' eller aminosyrene 1-200 av SEQ ID NR: 29, og hvor nevnte CD4-fragment er - separert fra den terapeutiske cellemembranen ved i- det minste 48 Ångstrøm, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et T-cellereseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptorprotein som kan signalisere til en celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle.

Ved foretrukkede utførelsesformer■er CD4-fragmentet aminosyrene 1-394 av CD4.eller aminosyrene 1-200 av CD4; CD4-fragmentet er skilt fra den intracellulære del ved CD7-transmembran-doménet vist på fig. 26, eller ved hengsel-, CH2- og CH3-doménene av det humane IgGl-molekyl vist på fig. 25; reseptoren innbefatter en . CD7-transmembran-del,- reseptoren innbefatter en CD5-transmembran-del; reseptoren innbefatter en CD34-transmembran-del; CD4-fragmentet er skilt fra membranen av den terapeutiske celle ved én eller flere proteinholdige alfa-helikser; CD4-fragmentet er skilt fra membranen av den terapeutiske celle med minst 48 Ångstrøm eller med minst 72 Ångstrøm; den intracellulære del er den signaloverførende del av et T-celle-reseptorprotein {for eksempel (), et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptor-protein; og de terapeutiske, celler er valgt fra gruppen som består av: {a) T-lymfocytter, (b) cytotoksiske T-lymfocytter; (c) naturlige dreperceller, (d) nøytrofile celler; (e) granulocytter,.(f) makrofager; (g) mastceller,- {h) HeLa-celler.

Skjønt den spesifikke utførelsesform av den- foreliggende oppfinnelse involverer en kimær mellom CD4 og zeta, kan hvilken som helst reseptorkjede som har liknende funksjon som disse molekyler, f.eks. i granulocytter eller B-lymfocytter, anvendes for de formål som er beskrevet her. De atskillende trekk hos et ønskelig immuncelle-utløsermolekyl omfatter evnen til å uttrykkes autonomt (d.v.s. som enkeltkjede), evnen til sammensmelting med et-ekstracellulært CD4-doméne slik at den resulterende kimære finnes på overflaten av en terapeutisk celle, og evnen til initiering av celle-effektor-programmer ved aggregering sekundært ved møte med en mål-ligand.

På det nåværende tidspunkt er den mest hensiktsmessige metode for avgivelse av kimærene til immunsystemceller, ved en viss form for genetisk terapi. Imidlertid vil gjenoppbygging av immunsystemceller med kimære reseptorer ved blanding av cellene med hensiktsmessig solublisert renset kimært protein også resultere i dannelse, ved hjelp av genteknikk, av en frembrakt cellepopulasjon som kan svare på HIV-infiserte målmaterialer. Liknende fremgangs-måter er blitt anvendt for eksempel for innføring av CD4'-molekylet i erytrocytter for terapeutiske formål. I dette tilfelle vil ikke den genteknikk-dannede cellepopulasjon være i stand til selv-fornyelse.

Den foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av terapeutiske celler for HIV-terapi, idet de terapeutiske celler uttrykker en membranbundet, proteinholdig, kimær reseptor som omfatter (a) en ekstracellulær del som innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-infeksjon, hvor nevnte fragment av-CD4 omfatter aminosyrene 1-394 ■ eller aminosyrene 1-200 av SEQ ID NR: 29, og hvor nevnte CD4-fragment er separert fra den terapeutiske cellemembranen ved i det minste 4 8 Ångstrøm, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et ^T-cellereseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptorprote-in som kan signalisere til den terapeutiske celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle for fremstilling av en farmasøytisk ■ blanding for styring av cellulær immunrespons overfor en HIV- ■ infisert celle i et pattedyr.

I den følgende detaljerte beskrivelse vil det bli henvist til forskjellige metodikker som er kjent for fagfolk på området molekylærbiologi og immunologi. Publikasjoner og andre materialer som beskriver slike kjente metodikker som det henvises til, er medtatt i det foreliggende som referanse.

Standard-referansemateriale som beskriver de generelle prinsipper ved rekombinant DNA-teknologi,' innbefatter Watson et al., Molecular Biology of the Gene, volum I og II, Benjamin/- Cummings Publishing Company, Inc., utgiver, Menlo Park, CA (1987); . Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., utgiver, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, utgivere, New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An :Introduction to Genetic Engineering, 2. utgave, University of California Press, utgiver, Berkeley, CA

(1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory,. utgiver, Cold Spring

Harbor, NY (1989); og Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

DEFINISJONER

Med "kloning" menes anvendelse av rekombinasjonBteknikker in vitro til innsetting av et spesielt gen eller annen DNA-sekvens i et vektormolekyl.

Med "cDNA" menes komplementær eller kopi-DNA dannet av en RNA-templat ved innvirkning av RNA-avhengig DNA-polymerase (reversert transkriptase)., En "cDNA-klon" angir således en dupleks DNA-sekvens som er komplementær til et aktuelt RNA-molekyl, båret

i en kloningsvektor.

Med "cDNA-bibliotek" menes en samling av.rekombinante DNA-, molekyler inneholdende .cDNA-innskudd som omfatter DNA-kopier av mRNA som ble uttrykt av cellen på samme tid som cDNA-biblioteket ble laget. Et slikt cDNA-bibliotek kan lages ved hjelp av metoder som er kjent for fagfolk, og som er beskrevet for eksempel i Ausubel et al., som ovenfor, og Maniatis et al., som ovenfor. Vanligvis isoleres RNA først fra cellene av en organisme fra hvis genom det er ønskelig å klone et spesielt gen. For den foreliggende oppfinnelses formål et det foretrukket lymfocytt--... cellelinjer av pattedyr, og spesielt av mennesker. En vektor som for tiden foretrekkes for dette formål, er Vacciniavirus-WR-stammen.

Med "vektor" menes et DNA-molekyl som f.eks. stammer fra et plasmid, en bakteriofag eller et pattedyr- eller insektvirus, i hvilket fragmenter av DNA kan innføres eller klones. En vektor vil inneholde ett eller flere unike restriksjonsseter og kan være i stand til autonom replikasjon i en definert verts- eller bærer-organisme slik at den klonede sekvens er reproduserbar.

Med "DNA-ekspresjonsvektor" menes det således hvilket som helst autonomt element som kan styre syntesen av et rekombinant peptid. Slike DNA-ekspresjonsvektorer innbefatter bakterielle plasmider og fager, og pattedyr- og insektplasmider og virus.

Med "hovedsakelig ren" menes en forbindelse, f.eks. et. protein, et polypeptid eller et antistoff, som er hovedsakelig fri for komponentene som naturlig hører til det. En forbindelse er vanligvis hovedsakelig ren når minst 60%, mer foretrukket minst 75%, og mest foretrukket minst 90% av det totale materiale i en prøve er den aktuelle forbindelse. Renhet kan måles ved hjelp av hvilken som helst hensiktsmessig metode, f.eks. kolonne-kromatografi, polyakrylamidgel-elektroforese eller HPLC-analyse. Når det gjelder en nukleinsyre, angir "hovedsakelig ren" en nukleinsyresekvens, et nukleinsyresegment eller -fragment som ikke umiddelbart grenser til (d.v.s. er kovalent bundet til) begge kodingssekvensene som den (det) umiddelbart grenser til (d.v.s. én i 5'-enden og én i 3'-enden) i det naturlig forekommende genom av organismen som DNA ifølge oppfinnelsen stammer fra.

Et "fragment" av et molekyl, så som hvilken som helst av cDNA-sekvensene, er ment å angi hvilket som helst tilgrensende nukleotid-undersett av molekylet. En "analog" til et molekyl menes å angi et ikke-naturlig molekyl som er hovedsakelig likt enten hele molekylet eller et fragment av dette. Et molekyl sies å være "hovedsakelig likt" et annet molekyl hvis sekvensen av aminosyrer i begge molekyler er hovedsakelig den samme. Hovedsakelig like ■' aminosyremolekyler vil ha lik biologisk aktivitet. Anvendt i det foreliggende sies det at et molekyl er et "kjemisk derivat" av et annet molekyl når det inneholder kjemiske deler som normalt ikke er en del av molekylet. Slike deler kan forbedre molekylets løselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid o.s.v. Delene kan alternativt redusere molekylets toksisitet, eliminere eller svekke en eventuell uønsket bivirkning av molekylet o.s.v. Deler som kan mediere slike effekter, er for eksempel beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utg., Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980) ....

Et "funksjonelt derivat" av et reseptor-kimærgen er ment å skulle innbefatte "fragmenter" eller "analoger" til genet, som er "hovedsakelig like" når det gjelder nukleotidsekvens, og som koder for et molekyl som har liknende aktivitet som for eksempel en T-celle-, B-celle- eller Fc-reseptorkimære. Mest foretrukket har derivatet. 90%, mer fore-trukket 70%, og fortrinnsvis 40% av villtypereseptor-kimærens aktivitet. Aktiviteten av et funksjonelt kimært reseptor-derivat innbefatter spesifikk binding (med dens ekstracellulære CD4-del) til en HIV-infisert celle, og resulterende ødeleggelse av denne celle; i tillegg gjør ikke den kimære reseptor den reseptor-bærende celle ømfintlig overfor HIV-inf eksjon. Kimær reseptoraktivitet kan-undersøkes under anvendelse av f.eks. hvilken som helst av analysene beskrevet i det foreliggende.

En DNA-sekvens som koder for CD4-reseptor-kimæren, eller dens funksjonelle, derivater, kan rekombineres med vektor-DNA ifølge vanlige teknikker, innbefattende stump-endede eller siksakendede termini for ligering, restriksjonsenzymnedbrytning under tilveiebringelse av hensiktsmessige termini, ifylling av kohesive ender etter som det er hensiktsmessig, behandling med alkalisk fosfatase for unngåelse av uønsket sammenknytting, og ligering med hensiktsmessige ligaser. Teknikker for slike manipuleringer er beskrevet av T. Maniatis et al., som ovenfor, og er velkjente på området.

Et nukleinsyremolekyl, så som DNA, sies å "kunne uttrykke" et polypeptid. hvis det inneholder nukleotidsekvenser som inneholder transkripsjonen og translasjonen reguleringsinformasjon, og slike sekvenser er "operabelt bundet" til nukleotidsekvenser som koder for polypeptidet. En operabel binding er en binding hvor regulerings-DNA-sekvensene og DNA-sekvensen som man prøver å uttrykke, er forbundet på en slik måte at gen-ekspresjon blir mulig. Den nøyaktige beskaffenhet av reguleringsregionene som er nødvendige for gen-ekspresjon, kan variere- fra organisme til organisme, men skal generelt innbefatte en'promoter-region som i prokaryote- celler inneholder både promoteren (som styrer igang-settingen av RNA-transkripsjon) samt DNA-sekvensene som, ved transkripsjon i RNA, vil signalisere igangsetting av proteinsyntese. Slike regioner vil normalt innbefatte de 5<1->ikke-kodende sekvenser som inngår ved igangsetting av transkripsjon og translasjon, så som TATA-boksen, tildekkingssekvensen, CAAT-sekvensen og liknende.

Hvis ønskelig, kan den ikke-kodende region som er 3' til gensekvensen som koder for proteinet, fås ved hjelp av de ovenfor beskrevne metoder. Denne region kan bibeholdes på grunn av sine transkripsjonsterminernings-reguleringssekvenser, så som terminering og polyadenylering. Ved bibeholdelse av 3'-regionen som naturlig grenser til DNA-sekvensen som koder for proteinet, kan således transkripsjons-termineringssignalene tilveiebringes. Når transkripsjons-termineringssignalene ikke er'tilfredsstillende funksjonelle i ekspresjons-vertscellen, kan en 3'-region som er funksjonell i vertscellen, substitueres.

To DNA-sekvenser (så som en promoterregion-sekvens og en CD4-reseptorkimær-kodende sekvens) sies å være operabelt bundet hvis beskaffenheten av bindingen mellom de to DNA-sekvenser ikke (1) resulterer i innføring av en rammeskift-mutasjon, (2) innvirker på evnen hos promoterregion-sekvensen til å styre transkripsjonen av reseptorkimær-gensekvensen, eller (3) innvirker på evnen hos reseptorkimær-gensekvensen til å transkriberes av promoterregion-sekvensen. En promoter-region vil være operabelt bundet til en DNA-sekvens hvis promoteren kunne bevirke transkripsjon av denne DNA-sekvens. For ekspresjon av proteinet er det således nødvendig med transkripsjonene og translasjonene signaler som oppfattes av' en hensiktsmessig vert.

Den foreliggende oppfinnelse involverer ekspresjon av et CD4-reseptorkimær-protein (eller et funksjonelt derivat av dette) enten i prokaryote eller eukaryote celler, skjønt eukaryot (og spesielt human-lymfocytt-) ekspresjon er foretrukket. .Antistoffer kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av forskjellige metoder. Celler som uttrykker CD4-resept6rkimær-proteinet, eller et funksjonelt derivat av dette, kan for eksempel administreres til et dyr for bevirking av dannelse av sera inneholdende polyklonale antistoffer som kan binde kimærene.

" Foretrukket.er .antistoffene monoklonale antistoffer. Slike' monoklonale antistoffer kan fremstilles under anvendelse av hybridom-teknologi (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292- (1976); Hammerling et al; i: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., s. 563-684 (1981)). Slike fremgangs-måter innbefatter vanligvis immunisering av et dyr med CD4-reseptorkimær-antigenet. Splenocyttene hos slike dyr ■ ekstraheres og sammensmeltes med- en egnet myelomcellelinje. Hvilken som helst egnet myelomcellelinje kan anvendes. Etter sammensmelting holdes de resulterende hybridomceller selektivt i HAT-medium og klones så ved begrensende for-tynning som beskrevet av Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981). Hybridom-cellene som fås ved slik utvelgelse, analyseres så for identifisering av kloner som utsondrer antistoffer som kan binde kimærene.

Antistoffer kan også være polyklonale, eller fortrinnsvis regionsspesifikke polyklonale antistoffer.

Antistoffer overfor CD4-reseptorkimærene kan anvendes til styring av mengden av kimær reseptor (eller celler som bærer kimær reseptor) hos en pasient. Slike antistoffer er godt egnet for anvendelse ved standard-immundiagnostisk analyse kjent på området, innbefattende slike immunometriske eller "sandwich"-analyser som forover-"sandwich"-, reversert-"sandwich"- og simultan-"sandwich"-analyser. Anti-stoffene kan anvendes i hvilket som helst antall kombinasjoner som kan bestemmes av fagfolk uten unødig eksperimentering, for bevir-king av immunanalyser med akseptabel spesifisitet, sensitivitet og nøyaktighet.

Standard-referanseforskning som beskriver generelle immunologi-prinsipper, innbefatter Roitt, Essential Immunology, 6. utg. ,■ Blackwell Scientific Publications, utgiver, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2. utg., MacMillan Publishing Co., utgiver, New York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., utgiver, London, (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", iBurdon et al., red., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol ■. 13, Elsevier, utgiver, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, utgiver, New York (1982); og Kennett et al., red., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, utgiver, New York (1980).

"Påvisning" er ment å innbefatte bestemmelse av tilstedeværelse eller fravær av en substans, eller kvantifisering av mengden av en substans. Betegnelsen angir således anvendelse av materialene, produktene og fremgangsmåtene til kvalitative og kvantitative bestemmelser.

Antistoffene og det hovedsakelig rensede antigen er ideelt egnet for fremstilling av et utstyrssett. Et slikt utstyrssett kan omfatte en bærerinnretning som er inndelt i kamre slik at det i innretningen kan settes én eller flere beholderinnretninger som passer nøyaktig i denne, så som ampuller, rør og liknende, idet hver av disse beholder-innretninger omfatter de atskilte elementer i analysen som skal anvendes.

De analysetyper som kan inkorporeres i form av utstyrssett,

er mange og innbefatter for eksempel konkurrerende og ikke-konkurrerende analyser. Typiske eksempler på analyser hvor anti-

stoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes, er radioimmunanalyser (RIA) ,. enzymimmunanalyser (EIA), analyser med enzymbundet immun-adsorpsjonsmiddel (ELISA) og immunometriske, eller "sandwich"-, immunanalyser.

Betegnelsen "immunometrisk analyse" eller "sandwich-immunanalyse" er ment-å innbefatte simultan-sandwich-, forover-sandwich- og reversert-sandwich-immunanalyser. Disse betegnelser er velkjente for fagfolk på området. Fagfolk på området vil også være klar over at antistoffer vil være egnede ved andre variasjoner og former av analyser som for tiden er kjent eller som vil kunne utvikles i fremtiden.

Med "spesifikt oppfatter og binder" menes at antistoffet oppfatter og binder kimærreseptor-polypeptidet, men at det ikke i noen vesentlig grad oppfatter og binder andre ikke-beslektede molekyler i en prøve, f.eks. en biologisk prøve.

Med "terapeutisk celle" menes en celle som er blitt trans-formert med en CD4-reseptorkimær ifølge oppfinnelsen slik at den kan oppfatte og ødelegge en HIV-infisert celle; .slike terapeutiske celler er fortrinnsvis celler i det hematopoietiske system.

Med "ekstracellulært" menes at i det minste, en del- av molekylet er eksponert på celleoverflaten. Med "intracellulært" menes at i det minste en del av molekylet er eksponert for cyto-plasmaet hos den terapeutiske celle. Med "transmembran" menes at i det minste en del av molekylet strekker seg over plasmamembranen.

En "ekstracellulær del", en "intracellulær del" og en "transmembran-del" anvendt i det foreliggende kan innbefatte flankerende aminosyresekvenser som strekker seg inn i tilstøtende cellekamre.

Med "oligomeriseres" menes å kompieksbindes med andre proteiner under dannelse av dimerer, trimerer, tetramerer eller andre høyereordens-oligomerer. Slike oligomerer kan være homo-oligomerer eller hetero-oligomerer. En "oligomeriserende del" er den region i et molekyl som styrer kompleksdannelse (d.v.s. oligomerdannelse).

Med "cytolytisk" menes å være i stand til å ødelegge en celle (f.eks. en HIV-infisert celle) eller ødelegge et infiserende virkemiddel (f.eks. et HIV-virus).

Med "immunsvikt-virus" menes et retrovirus som i-villtype-form kan infisere T4-celler i en primat-vert og som har en virus-morfogenese og morfologi-egenskaper som hos lentivirusunder-familien. Betegnelsen innbefatter, uten begrensning, alle' varianter av HIV og SIV, innbefattende HIV-l, HIV-2, SIVmac,

SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand og SIVcpz.

Med "MHC-uavhengig" menes at den cellulære cytolytiske

respons ikke fordrer tilstedeværelse av et antigen av typen MHC klasse II på overflaten av målcellen.

Med et "funksjonelt derivat som overfører cytolytiske signaler" menes et funksjonelt derivat, (som definert ovenfor) som kan styre minst 40%, mer foretrukket 70% eller mest foretrukket minst.90% av den biologiske aktivitet av vi11type-molekylet. Anvendt i det foreliggende kan et "funksjonelt derivat som overfører cytolytiske signaler" virke slik at det direkte signaliserer til den terapeutiske celle om å ødelegge et reseptorbundet virkemiddel eller celle (f.eks. når det gjelder en intracellulær kimær reseptordel), eller det kan virke indirekte ved befordring av oligomerisering med proteiner i den terapeutiske celle som ovér-fører cytolytiske signaler (f.eks. når det gjelder et transmembran-doméne). Slike derivater kan undersøkes med hensyn'til effektivitet, f.eks. under anvendelse av in vitro-analysene beskrevet i det foreliggende.

Med et "funksjonelt HIV-kapsel-bindende derivat" menes et funksjonelt derivat (som definert ovenfor) som kan binde hvilket som helst HIV-kapselprotein. Funksjonelle derivater kan identifi-seres under anvendelse av f.eks. in vitro-analysene beskrevet i det foreliggende.

TERAPEUTISK ADMINISTRERING

De transformerte celler ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes for immunsviktvirus-behandling. Gjeldende metoder for administrering av slike transformerte celler innbefatter adoptiv immunterapi eller celleoverføringsterapi. Disse metoder gjør mulig tilbakeføring av de transformerte immunsystemceller til blod-strømmen. Rosenberg, Scientific American 62 (mai 1990); Rosenborg et al., The New England Journal of Medicine 323(9):570 (1990).

De farmasøytiske preparater kan administreres til hvilket som helst dyr som kan oppnå de fordelaktige virkninger ved forbindelsene. Blant slike dyr er mennesker de viktigste, skjønt oppfinnelsen ikke er påtenkt å begrenses til disse.

Detaljert beskrivelse Tegningene vil først bli beskrevet.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. IA viser aminosyresekvensen omkring stedet for sammensmelting mellom CD4 (restene 1-369) og forskjellige reseptorkjeder. Den understrekede sekvens viser posisjonen for aminosyrene som kodes for i. BamHI-setet som anvendes for fusjonskonstruering. Begynnelsen av transmembran-doménet er markert med en vertikal strek, n-sekvensen er identisk med (-sekvensen ved den amino--terminale .ende; men avviker ved den karboksylterminale ende (Jin.

et al.-, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3319-3323 (1990)).

Fig. 1B viser strømningscytometrisk analyse av overflateekspresjon av CD4, CD4:(, CD4:y og CD4 :n. i■CV1-celler. Cellene ble- infisert med virus som uttrykte CD4-kimærer eller CD16Pi, inkubert i 9

timer ved 37°C og merket med fykoerythrin-konjugert Anti-CD4 MAb Leu 3A.

Fig. 2 viser overflate-ekspresjon av CD16th etter ko-infisering av CD16tm alene .{tette prikker) eller ko-infisert med virus som uttrykker CD4:y (stiplet linje) eller CD4: ( (heltrukket linje). Spredte prikker: celler infisert med CD4: ( alene, merket med 3G8(Fleit et, al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:3275-3279

(1982)) (anti-CD16 MAb).

Fig. 3 viser overflate-ekspresjon av CD16™ etter ko-infisering med virus som uttrykker CD16Tm, og følgende (-kimærer: CD4:( (tykk linje), CD4:( C11G (heltrukket linje); CD4:( (stiplet linje); CD4:( C11G/D15G (tette prikker); ingen ko-infisering

(CD16tm alene, spredte prikker). Cellene ble inkubert med anti-

CD16 MAb 3G8 og fykoerytrin-konjugerte Fab' 2-geite-antistoffer overfor muse-IgG. Nivået for ekspresjon-av (-kimærene var hovedsakelig identisk for de forskjellige analyserte mutanter, og ko-infisering av celler med virus som uttrykte CD16tm og (-kimærer, forandret ikke overflate-ekspresjonen av kimærene i noen vesentlig grad.

Fig. 4A-D viser at øket intracellulært fritt kalsium-ion - følger kryssbinding av mutante (-kimærer i en T-cellelinje. Jurkat■ E6-celler (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) ble infisert med rekombinante Vaccinia-virus og analysert ved hjelp av strømnings-cytometri. De viste resultater er for den oppsamlede poly-CD4<+->populasjon, slik at bare celler som uttrykker det aktuelle kimære protein, analyseres. Middelforholdet mellom fluorescens av fiolett og blått Indo-1 gjenspeiler den intracellulære konsentra-sjon av fritt kalsium i populasjonen- som helhet, og prosentandelen av responderende celler gjenspeiler den fraksjon av celler som overstiger et for-bestemt terskelforhold ■

(innstilt slik at 10% av ubehandlede celler er positive). Fig. 4A og fig. 4B viser Jurkat-celler som uttrykker CD4: ( (heltrukket linje) eller CD16:( (stiplet linje), og som ble eksponert "for'■" anti-CD4 MAb Leu3a (fykoerytrin-konjugat), fulgt av kryssbinding ■ med geite-antistoffer overfor muse-IgG. Den prikkede linje viser responsen hos ikke-inf iserte celler overfor anti-CD3 MAb OKT3.

Fig. 4C og 4D viser Jurkat-celler som uttrykker CD4:(D15G (heltrukket linje); CD4:(C11G/D15G (stiplet linje); eller CD4:(C11G

(prikker) som ble behandlet og analysert som på fig. 4A og 4B.

Fig. 5A-C viser at CD4:(-, CD4:n- og CD4:y-reseptorer mulig-.gjør at cytolytiske T-lymforcytter (CTL) kan drepe målmaterialer som uttrykker HIV-l gpl20/41. Fig. 5A: fylte sirkler: CTL som uttrykker CD4: ( inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41;

åpne sirkler: CTL som uttrykker CD4 : ( inkubert med ikke-infiserte HeLa-celler; fylte kvadrater: ikke-infisert CTL inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41; åpne kvadrater: ikke-infisert CTL inkubert med ikke-infiserte HeLa-celler. Fig. 5B: fylte sirkler: CTL som uttrykker CD4:r) inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41; åpne sirkler: CTL som uttrykker CD4:y inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41; åpne kvadrater: CTL som uttrykker CllG/D15G-dobbeltmutant-CD4:(-kimærene inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41. Fig. 5C: Strømningscytornetrisk analyse av CD4-ekspresjon ved CTL-anvendt på fig. 5B. For korrigering av forholdene mellom målmateriale og effektor, ble prosentandelen av celler som uttrykte CD4-kimærer, bestemt ved at populasjonen som var vurdert som negativ (ikke-infisert), ble trukket fra ved histogram-overlegging; for sammenlikningsformål ble de ikke-infiserte celler på denne figur gitt en vilkårlig terskelverdi som

grovt gir den samme fraksjon positiv for de andre

cellepopulasjoner som histogram-fratrekking ville gi.

Fig. 6A-B viser spesifisitet for CD4-styrt cytolyse. Fig. 6A: fylte sirkler: CTL som uttrykker CD4: ( inkubert med HeLa-celler som uttrykker CD16Pi; åpne sirkler: CTL som uttrykker CD4 inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20; fylte kvadrater: CTL som uttrykker CD16:( inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41; åpne kvadrater: CTL som uttrykker CD16pj inkubert med HeLa-celler som uttrykker gpl20/41. Fig. 6B: fylte sirkler: CTL som uttrykker CD4: ( inkubert med Raji-celler (MHC.klasse I-I+) ; åpne' sirkler: ikke-infiserte CTL-celler inkubert med RJ2.2.5-celler (MHC klasse II" Raji mutant); fylte kvadrater: ikke-infiBert CTL inkubert med Raji-celler (MHC klasse II<+>); åpne kvadrater: CTL som uttrykker CD4:( inkubert med RJ2.2.5-celler (MHC klasse II").- Ordihat-skalaen er utvidet. Fig. 7A-B viser karakterisering av CD16:(-kimær-reseptoren. Fig. 7A er et skjematisk diagram over CD16:(-fusjonsproteinet. Den - ekstracellulære del av den fosfatidylinosityl-bundne form' av monomert CD16 ble bundet til dimer-( like utenfor transmembran-doménet. Proteinsekvensen ved fusjons-forbindelsen er vist nederst. Fig. 7B viser en strømningscytometrisk analyse av kalsium-mobilisering etter kryssbinding av CD16:(-kimærene enten i en TCR-positiv eller TCR-negativ cellelinje. Middelforholdet mellom fiolett og blå fluorescens (et mål for relativ kalsiumione-konsentrasj.on) blant cellepopulas joner behandlet med antistoffer på tidspunkt 0 er vist. Fylte kvadrater: responsen hos Jurkat-celler overfor anti-CD3 MAb 0KT3; fylte trekanter: responsen hos CD16:( overfor anti-CD16 MAb 3G8-kryssbinding i REX33A TCR'-mutanten; åpne kvadrater: responsen overfor CD16:(-kryssbinding i Jurkat-TCR"-mutantlinjen JRT3.T3.5; åpne trekanter: responsen overfor CD16:(kryssbinding i Jurkat-celler; kryss: responsen overfor ikke-kimært CD16 i■Jurkat-celler; og prikker: responsen overfor ikke-kimært CD16- i REX33A TCR"-cellelinjen. Fig. 8A-B viser utelukkelsesanalyse av cytolyse-potensial. Fig. 8A viser beliggenheten av (-utelukkeIses-endepunktene. Her som ellers er mutasjoner i ( representert ved den opprinnelige rest-lokasjons-mutant-rest-konvensjon, slik at D66<*> for eksempel' angir erstatning av Asp-66 med et terminerings-kodon. Fig. 8B

viser cytolyseanalyseresultater av ikke-utelukket CD16:( og tydelige (-utelukkelser. Hybridom-celler som uttrykker overflate-antistoff overfor CD16, ble tilført <51>Cr og inkubert med økende antall humane cytolytiske lymfocytter (CTL) infisert med Vaccinia-rekombinanter som uttrykker.CD16:(-kimærer. Prosentandelen av frigjort <51>Cr er avsatt som funksjon av forholdet mellom effektor-(CTL) og mål-(hybridom)-celler (e/t). Fylte sirkler: cytolyse mediert av celler som uttrykker CD16:( (mfi 18,7); fylte kvadrater: cytolyse mediert av celler som uttrykker CD16:( Asp66*

(mfi 940,2); åpne kvadrater: cytolyse mediert av celler som uttrykker CD16:(Glu60<*> (mfi 16,0);.åpne sirkler: cytolyse mediert av celler som uttrykker CD16:(Tyr51<*> (mfi 17,4); massive trekanter: cytolyse mediert av celler som uttrykker CD16:(Phe34<*> (mfi 17,8); og åpne trekanter: cytolyse mediert av celler som uttrykker ikke-kimært CD16 (mfi 591). Skjønt ekspresjonen-av CD16:( Asp66<*> i dette forsøk ikke svarte til ekspresjonen-av de andre fusjonsproteiner, ga cytolyse ved celler som uttrykte CD16:( ved ekvivalente nivåer i det samme forsøk, resultater som var hovedsakelig identiske med resultatene vist ved celler som uttrykker CD16:(Asp66.

Fig.- 9A-D viser at eliminering av potensialet for transmembran-vekselvirkninger åpenbarer et kort (-segment som kan mediere cytolyse. Fig. 9A er et skjematisk diagram over de monomere todelte og tredelte kimærer. På toppen er Cdl6:(-konstruksjonen avskåret ved rest 65 og mangler transmembran-Cys-og Asp-rester. Under, er CD16:CD5:(- og CD16:CD7.: (-konstruksjonene og beslektede kontroller. Peptidsekvensene i de intracellulære doméner er vist nedenfor. Fig. 9B viser den cytolytiske aktivitet av monomere kimærutelukkelsesmutanter. Den cytolytiske aktivitet av celler som uttrykte CD16:( (fylte sirkler; mfi 495), ble sammenliknet med aktiviteten hos celler som uttrykte CD16:(Asp66*

(fylte kvadrater; mfi 527) eller mutantene CD16:(CysllGly/ Aspl5Gly/Asp66<*>, (åpne kvadrater; mfi 338) og.CD16:(CysllGly/ Aspl5Gly/Glu60<*> (fylte trekanter; mfi 259). Fig. 9C viser den cytolytiske aktivitet som medieres av tredelte fusjonsproteiner. Fylte trekanter: CD16:(Asp66<*>; åpne kvadrater: CD16:5:((48-65); fylte kvadrater: CD16:7:((48-65); åpne trekanter: CD16:7:((48-59); åpne sirkler: CD16:5; fylte sirkler: CD16:7. Fig. 9D viser

kalsium-mobilisering med mutante og tredelte kimærer i den TCR-negative Jurkat JRT3.T3.5-mutantcellelinje. Åpne sirkler: respons hos celler som uttrykker dimert CD16:(Asp66<*>; fylte kvadrater: respons hos celler som uttrykker CD16:(CysllGly/Aspl5Gly/Asp66<*>; åpne kvadrater: respons hos celler som uttrykker CD16:(CysllGly/ Aspl5Gly/Glu60<*>; fylte trekanter: respons hos celler som uttrykker CD16:7:((48-65); og åpne trekanter: respons hos celler som uttrykker CD16:((48-59).

Fig. 10A-F viser bidraget av individuelle aminosyrer til aktiviteten av 18 resters-mønsteret for overføring av cytolytiske . signaler..Fig. 10A og 10B viser cytolytisk aktivitet, og fig. 10C viser kalsiumione-mobilisering mediert av kimærer som bærer punktmutasjoner nær det karboksylterminale tyrosin (Y62). Fig. 10A og 10B representerer data oppsamlet når det gjelder celler Bom uttrykker henholdsvis små og store mengder av CD16:(-fusjonsproteinene. Identiske symboler er anvendt for kalsium-mobiliserings- og cytolyse-analysene, og er vist i én bokstavkode til høyre. Fylte sirkler: celler som uttrykker CD16:( (mfi-i' A: 21;.B: 376); fylte kvadrater: celler som uttrykker CD16:7:((48-65)

(mfi A: 31, B: 82); åpne kvadrater: CD16:7:((48-65)Glu60Gln (mfi

A: 33; B: 92), kryss: CD16:7:((48-65)Asp63Asn (mfi A: 30; B: 74); fylte trekanter: CD16:7:((48-65)Tyr62Phe (mfi A: 24; B: 88); åpne sirkler: CD16:7:((48-65)Glu61Gln (mfi A: 20; B: 62); og åpne trekanter: CD16 :7 : ( (48-65)Tyr62Ser (mfi B: 64)-. Fig. 10D og 10E viser cytolytisk aktivitet, og fig. 10F viser kalsiumione-mobilisering ved kimærer som bærer punktmutasjoner nær det aminb-terminale tyrosin (Y51).. Identiske symboler er anvendt for kalsium-mobiliserings- og cytolyseanalysene, og er vist til høyre. Fylte sirkler: celler som uttrykker CD16:( (mfi i D: 21,2; i E: 672); fylte kvadrater: celler som uttrykker CD16:7:((48-65) (mfi D: 31,3; E: 179); fylte trekanter: CD16:7:((48-65)Asn48Ser (mfi D: 22,4; E: 209); åpne kvadrater: CD16:7:((48-65)Leu50Ser (mfi D: 25,0; E: 142); og åpne trekanter: CD16:7:((48-65)TyrSlPhe (mfi D: 32,3; E: 294). Fig. 11A-B viser oppstilling av interne gjentatte enheter av og sammenlikning av deres evne til understøttelse av cytolyse. Fig. 11A er et skjematisk diagram over kimærer dannet ved deling av det intracellulære (-doméne i tredjedeler og tilknytting av dem til det transmembrane doméne av en CD16:7-kimære. Sekvensene av de intracellulære doméner er vist under, med felles rester inntegnet i rammer, og beslektede rester angitt med stjerner. Fig. 11B viser den cytolytiske potens av de tre (-underdoméner. Fylte sirkler: celler som uttrykker CD16:( {mfi 476); fylte kvadrater: CD16:.7:( {33-65) (mfi 68); åpne kvadrater: CD16 : 7 :( (71-104) (mfi 114); og fylte trekanter: CD16:7:<(104-138) (mfi 104). Fig. 12 er et skjematisk diagram over CD16:FcRylI-kimærene. Fig. 13A-B viser kalsium-mobilisering etter kryssbinding av CD4:FcRyII- og CD16:FcRylI-kimærer. Fig. 13A viser forholdet mellom fiolett og blå fluorescens utstrålt av celler som er til-ført det kalsiumfølsomme fluorofor Indo-1, vist som funksjon av tiden etter kryssbinding av det ekstracellulære CD16-dbmérie med antistoffer. Fig. 13B viser en liknende analyse av økningen i forholdet mellom fiolett og blå fluorescens hos celler som bærer CD4:FcRylI-kimærer, etter kryssbinding med antistoffer. Fig. 14A-B viser cytolyseanalyser av CD4:FcRyII- og CD16:-' FcRylI-kimærer. Fig. 14A viser prosentandelen av <51>Cr frigjort fra .anti-CD16-hybridom-(mål-)celler når cellene utsettes for økende antall cytotoksiske T-lymfocytter som uttrykker CD16:FcRyII-kimærer (effektorceller). Fig. 14B viser en liknende analyse av cytotoksisitet mediert av CD4:FcRylI-kimærer overfor målceller som uttrykker HIV-kapselglykoproteiner. Fig. 15A-E viser identifisering av rester i FcRyll A-halen som er viktige for cytolyse. Fig. 15A er et skjematisk diagram over utelukkelseskonstruksjonene. Fig. 15B og 15C viser kalsium-mobilisering og cytolyse med karboksylterminale utelukkelses-varianter av CD16:FcRyII A. Fig. 15D og 15E viser kalsium-mobilisering og cytolyse med tredelte kimærer som bærer progres-sivt mindre av den aminoterminale ende av den intracellulære hale av CD16:FcRyII A. Fig. 16 (SEKV. ID NR: 24) viser aminosyresekvensen av CD3-delta-reseptorproteinet; sekvensen i ramme representerer en foretrukket del som overfører cytolytiske signaler. Fig. 17 (SEKV. ID NR: 25) viser aminosyresekvensen av T3-gammareseptorproteinet; sekvensen i ramme representerer en foretrukket del som overfører cytolytiske signaler. Fig. 18 (SEKV. ID NR: 26) viser aminosyresekvensen av mbl-reseptorproteinet; sekvensen i ramme representerer en foretrukket del som overfører cytolytiske signaler. Fig. 19 {SEKV. ID NR: 27) viser aminosyresekvensen av B29-reseptorproteinet; sekvensen i ramme representerer en foretrukket del som overfører cytolytiske signaler. Fig. 20A-E viser et skjematisk diagram over CD4-kimærene. Molekyl "A" er CD4(D1-D4):Ig:CD7; molekyl "B" er CD4(D1,D2):-Ig:CD7; molekyl "C" er CD4(D1-D4):Ig:CD7:(; molekyl "D" er CD4(Dl, D2):lg:CD7:(; og molekyl "E" er CD4:(. Det ekstracellulære doméne av det humane CD4-molekyl svarende til■aminosyrer 1-394 av forløperen ble ved hjelp av et BamHI-sete knyttet til hengsel-, CH1- og CH2-doménene av humant IgGl som beskrevet tidligere (Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347 (1990)), bortsett fira at en cDNA-versjon av de humane Ig-sekvfenser ble anvendt for å gjør mulig ekspresjon i Vacciniavirus-rékombinanter. Todoméne-versjonen • av CD4-kimærene ble frembrakt ved innføring av en BamHI-adapter i det unike Nhel-sete (svarende til aminosyre 200) i CD4-forløper-cDNA. Membrantilknyttings-sekvensene besto av 22 rester fra det første ekson av humant membranbundet' IgGl, fulgt av CD7-restene ■ 146-203. Aminosyrene 55-163 av ( tjente som utløsermønsteret for de tredelte konstruksjoner (C og D). I firdélte konstruksjoner inneholdende (-kjeden ble intracellulær ekspresjon av ( dokumentert med et kommersielt tilgjengelig antistoff overfor- det intracellulære doméne (Coulter). Fig. 21 viser cytolyse av målceller som uttrykker HIV-1-kapselglykoproteinet mediert av den cytotoksiske T-celleklon, WH3, ■ som uttrykker forskjellige CD4-avledede kimærer som effektormolekyler. Med hensyn til cytotoksisitetsanalyser ble den humane CD8<+> CD4" HLA B44-begrensede T-cellelinje, WH3, holdt i IMDM supplert med 10% humant serum som beskrevet tidligere i det foreliggende. Cellene ble stimulert med gammabestrålte (3000 rad) B44-bærende mononuklære celler og fytohemagglutinin (PHA) i en konsentrasjon på 1 ug/ml. Etter én dags stimulering, ble PHA fortynnet til 0,5 ug/ml ved tilsetting av friskt medium; etter 3 dager ble mediet fullstendig utskiftet. Cellene ble dyrket i minst 10 dager før anvendelse ved cytotoksisitets-analyser. Cellene ble'infisert med de hensiktsmessige rekombinante Vaccinia-virus som beskrevet i det foreliggende for vPE16. Infiseringene fikk foregå i-ytterligere 3-4 timer i komplett medium, hvoretter cellene ble høstet ved sentrifugering og suspendert på nytt til en tetthet på 1 x 10<7>/ml. 100 pl ble tilsatt i hver brønn i en mikrotiterplate med U-bunn inneholdende 100 yl komplett medium pr. brønn, og fortynnet i dobbeltserietrinn. To brønner for hver prøve inneholdt ikke lymfocytter, for å muliggjøre måling av spontan kromfrigjøring og totalt kromopptak. Målcellene, HéLa-sublinje S3 (HeLa-S3, ATCC) ■ble infisert som ovenfor i 10 cm skåler med vPE16. 10<6> infiserte celler ble løsgjort med PBS og 1 mM EDTA, sentrifugert og suspendert på nytt i 100 yl <51>Cr-natriumkromat {1 mCi/ml i PBS) i 1 time ved 37°C og deretter vasket tre ganger med PBS. 100 yl merkede målceller ble tilsatt i hver brønn. Mikrotiterplaten ble sentrifugert ved 750 x g i 1 minutt og inkubert i 4 timer ved 37°C. Ved slutten av inkuberingstidsrommet ble cellene i hver brønn suspendert på nytt ved forsiktig pipettering, en prøve ble uttatt for bestemmelse av de totale inkorporerte tellinger, og mikrotiterplaten ble sentrifugert ved 750 x g i 1 min. Porsjoner (100 yl) av supernatanten ble uttatt og tellet i en gammastråle-scintillasjonsteller. Forholdet mellom effektor og målmateriale ble korrigert med hensyn til prosentandelen av celler som var infisert, ifølge måling ved hjelp av strømnings-cytornetri. Fig. 22 viser replikasjon av HIV-l i transfektant-cellelinjer. Cellelinjer som stabilt uttrykte villtype-CD4 og forskjellige rekombinante kimærer, ble påvist i en under-linje av den humane embryonale nyrecellelinje 293. Et virus-forråd av HIV-1-IIIB-isolatet ble tillaget med en titer på =10<*> infeksiøse partikler pr. ml ifølge måling ved endepunktfortynnings-analyse under anvendelse av den humane T-cellelinje C8166 som indikator. Infiseringene ble utført ved en omtrentlig MOI på 1 i et tidsrom på 8-12 timer ved 37°C. Den følgende dag ble cellene vasket med PBS tre ganger, trypsinert og gjen-utplatet i nye skåler, og det ble tatt prøver av dyrkningssupernatanten for p24-titer (betegnet dag 0). Med 3-4 dagers mellomrom etter dette ble celledyrknings-supernatantene oppsamlet og holdt tilbake for p24-analyse. Cellene ble på nytt tilført friskt medium som inneholdt hygromycin B i en konsentrasjon på 100 yg/ml. Analyse av dyrkningssupernatantene ble utført under anvendelse av et kommersielt ELISA-basert HIV-l p24-antigen-analysesett (Coulter) ifølge instruksjonene levert av fabrikanten. Resultatene er representative for to uavhengige forsøk med lik varighet. Fig. 23 viser nukleinsyre- og aminosyresekvensen for D1-D4-doménene av CD4 (CD4 Barn). Fig. 24 viser nukleinsyre- og aminosyresekvensen for D1-D2-doménene av CD4 (CD4 Nhe). Fig. 25 viser nukleinsyre- og aminosyresekvensen for hengsel- , CH2- og CH3-doménene av humant IgGl (Igh23 Barn). Fig. 26 viser nukleinsyre- og aminosyresekvensen for transmembran-doménet av CD7 (TM7 Barn Mlu) . Fig. 27 viser nukleinsyre- og aminosyresekvensen fOr det intracellulære doméne av zeta (Zeta Mlu Not).. Fig. 28, viser DNA-sekvensen og den primære aminosyresekvens for en syntetisk alfa-heliks.

EKSEMPEL I

Konstruering av humane IgGl:reseptor-kimærer

Humane IgGl-tungkjedesekvenser ble laget ved tilknytting av sekvenser i CH3-doménet til et cDNA-fragment som stammet fra 3'-enden av transmembranformen av antistoff-mRNA. 3'-endefragmentet ble oppnådd ved polymerasekjedereaksjon under anvendelse av et tonsille-cDNA-bibliotek som substrat, og oligonukleotider med sekvensene:

og

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG

CCT CA (SEKV. ID NR: 8), svarende til 5'- og 3'-endene av de respektive ønskede DNA-fragmenter. 5'-oligo er komplementært til et sete i CHl-doménet av humant IgGl, og 3'-oligo er komplementært til et sete like 5' for sekvensene som koder for doménet som spenner over membranen. PCR-produktet ble nedbrutt med BstXI og BamHI og ligert mellom BstXI- og BamHI-seter i et halvsyntetisk IgGl-antistoff-gen som bærer variable og konstante regioner. Etter innføring av BstXI-BamHI-fragmentet, ble de forøkte deler av konstruksjonen erstattet opp til Smal-setet i CH3 ved restriksjons-fragment-utveksling, slik at bare delen mellom Smal-setet og 3'-oligo stammet fra PCR-reaksjonen.

For frembringelse av en human kimær IgGl:(-reseptor ble genet for tunge kjeder som sluttet i et BamHI-sete, sammenknyttet med BamHI-setet av (-kimæren beskrevet nedenfor, slik at antistoff-sekvensene dannet den ekstracellulære del. Strømningscytometri av COS-celler transfektert med et plasmid som koder for kimæren, viste høynivå-ekspresjon av antistoff-determinanter når et ekspresjonsplasmid som koder for en lettkjede-cDNA ble ko-transfektert, og beskjeden ekspresjon av antistoff-determinanter når plasmidet som uttrykker lette kjeder, var fraværende.

Liknende kimærer som innbefatter humant IgGl sammensmeltet med n eller y {se nedenfor), eller hvilken som helst signal-overførende del av et T-cellereseptor- eller Fc-reseptor-protein kan konstrueres generelt som beskrevet ovenfor under anvendelse av standardteknikker for molekylærbiologi.

For frembringelse av en enkelt transkripsjons-enhet som vil gjøre mulig at både tunge og lette kjeder kan uttrykkes fra en enkelt promoter, ble et plasmid som koder for en bicistron-mRNA, frembrakt ut fra tung- og lettkjede-kodende sekvenser, og den'5 1 - ikketranslaterte del av mRNA som koder for det' glukoseregulerte protein på 78 kD, ellers kjent som grp7.8, eller BiP. grp78-sekvenser ble oppnådd ved hjelp av PCR av human genom-DNA under anvendelse av primere med sekvensene: og

i henholdsvis 5'- og 3<*->endene. Polymerasekjedereaksjoner med disse oligo-forbindelser ble utført i nærvær av 10% dimetyl-sulfoksyd. Fragmentet.oppnådd ved PCR ble nedbrutt med Noti og Hindi og innført mellom Noti- og Hpal-seter nedstrøms for sekvenser som koder for humant IgGl. Sekvenser som koder for en human IgG-kappa-lettkjede-cDNA, ble så innført nedstrøms for grp78-ledersekvensen under anvendelse av HindI-setet og et annet sete i vektoren. Ekspresjonsplasmidet som fremkom ved disse manipula-sjoner, besto av det .halvsyntetiske tungkjede-gen, fulgt av grp78-ledersekvensene, fulgt av kappa-lettkjede-cDNA-sekvensene, fulgt av polyadenyleringssignaler som stammer fra et SV40-DNA-fragment. Transfektering av COS-celler med ekspresjonsplasmidet ga markert forbedret ekspresjon av tungkjede-determinanter sammenliknet med

transfeksjon av plasmid som koder for tungkjede-determinanter

.alene...

For frembringelse av et bicistronisk gen som omfatter'én tungkjede/reseptor-kimære og en lett kjede, kan oppstrøms-tungkjedesekvensene erstattes med hvilket' som helst kimært tungkjede/reseptor-gen beskrevet i det foreliggende.

EKSEMPEL II

Cytolytisk signaloverføring ved hjelp av human Fc-reseptor

For vurdering av virkningene av forskjellige humane Fc-reseptor-undertyper, ble det dannet kimære molekyler hvor det ekstracellulære doméne av de humane CD4-, CD5- eller CD16-' antigener ble knyttet til transmembran- og intracellulær-doménene av FcRIIyA-, Bl-, B2- og C-undertypene (nomenklatur ifølge Ravetch og Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9:457, 1991)-. Spesifikt ble cDNA-sekvenser svarende til transmembran- og. cytoplasma-doménene av de-tidligere beskrevne FcRIIA-, Bl- og B2- isoformer forøket fra det tidligere eksisterende klon PC23 eller fra et'humant tonsill-cDNA-. bibliotek (konstruert ved hjelp av standardteknikker) under anvendelse av følgende syntetiske oligonukleotid-primere: CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEKV. ID NR: 18; FcRII A

og .forover);

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT

(SEKV. ID NR: 19; FcRII A reversert);

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEKV..

ID NR: 20; FcRII Bl og FcRII B2 forover); og

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEKV. ID NR: 21;

FcRII Bl og FcRII B2 reversert).

. Disse primere inneholdt spaltningsseter for henholdsvis enzy-mene BamHI og Noti, innrykket 6 rester fra 5'-enden. Notl-setet ble umiddelbart fulgt av et antisanse-stoppkodon, enten CTA eller TTA. Alle primere inneholdt 18 rester eller flere som var komplementære til 5'- og 3<1->endene av de ønskede fragmenter. cDNA-fragmentet som svarer til FcRIIyC-cytoplasma-dbménet, som er forskjellig fra IIA-isoformen bare ved én aminosyrerest (L for P ved rest 268), ble dannet ved seterettet mutagenese ved overlappings-PCR under anvendelse av primere med sekvens: og

PCR-fragmentene ble innført i Vacciniåvirus-ekspresjonsvektorer

som inneholdt henholdsvis de ekstracellulære CD16- eller CD4- . doméner, og deretter innført i villtype-Vaccinia ved rekombinasjon i tymidinkinase-stedet, under anvendelse av utvelgelse med hensyn til ko-integrering av E. coli gpt for å gjøre identifiseringen av de ønskede rekombinanter lettere. Identitetene til alle isoformer (vist på fig. 12) ble bekreftet ved dideoksy-sekvensering.

Dannelse av de kimære reseptorproteiner ble ytterligere bekreftet ved immunutfelningsundersøkelser. Omtrent IO<7 >JRT3.T3.5-celler ble-infisert i 1 time i serumfritt IMDM-medium med rekombinante Vaccinia med en inf iseringsmultiplisitet.på minst- 10.- . Tolv timer etter infisering ble cellene høstet og overflatemerket med 0,5 mCi 12<5>I pr-. 10<7> celler under anvendelse av lakto- ■ peroksydase/glukoseoksydase-metoden (Clark og Einfeld,, som ovenfor) . De merkede celler ble oppsamlet ved sentrifugering og lysert i 1%. NP-40, 0,1 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0,2 M jodacetamid og 1 mM PMSF. ' Kjernene ble fjernet ved sentrifugering, og CD16-fusjonsproteinene ble immunutfelt med antistoff 4G8 og antimus-IgG-agarose. Prøvene, ble kjørt i elektroforese under reduserende betingelser. Alle immunutfelte kimære reseptormolekyler hadde de ventede molekyl-masser.

For undersøkelse av de kimære reseptorers evne til mediering av en økning i cytoplasmafri kalsiumion. ble de rekombinante virus anvendt til infisering av TCR"-mutant-Jurkatcellelinjen JRT3.T3.5-(som beskrevet i det foreliggende), og cytoplasma-fritt kalsium

ble målt i cellene (som beskrevet i det foreliggende) etter kryssbinding av de ekstracellulære reseptordoméner med monoklonalt antistoff 3G8 eller Leu-3A (som beskrevet i det foreliggende). Disse forsøk viste at de intracellulære doméner av FcRyll A og C var i stand til å mediere en økning i cytoplasma-fri kalsium-ion etter kryssbinding av de ekstracellulære doméner, mens de intracellulære doméner av FcRylI Bl og B2 var inaktive under sammenliknbare betingelser (fig. 13 A og 13 B). CD4-, CD5- og CD16-hybridene av FcRyll A hadde felles en hovedsakelig lik evne til å befordre kalsiumresponsen (fig. 13A-B). Andre cellelinjerm

både fra monocytt- og lymfocyttlinjer, var i stand til å svare på signalet som ble initiert ved kryssbinding av de ekstracellulære doméner.

For undersøkelse av de forskjellige intracellulære FcRylI-doméners engasjement ved cytolysen, ble humane cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) infisert med Vaccinia-rekombinanter som uttrykte CD16:FcRyll A-, Bl-., B2- og C-kimærer. De infiserte celler ble så dyrket sammen med <51>Cr-tilførte hybridomceller (d.v.s. 3G8 10-2-celler) som uttrykte celleoverflate-antistoff overfor CD16. Ved denne analyse drepte CTL'er som bar CD16-kimærene, hybridom- ■ ■■ målcellene (noe som muliggjorde frigjøring av fritt-<51>Cr) hvis det ekstracellulære CD16-doméne av kimærene er blitt knyttet til et intracellulært segment som kan aktivere lymfocytt-effektor-programmet; denne cytolyseanalyse er beskrevet detaljert nedenfor. Fig. 14A viser at CTL som er utrustet med CD16:FcRyII A og C, men ikke FcRyll Bl eller B2, er i stand til å lysere målceller som uttrykker celleoverflate-anti-CDl6-antistoff.

For eliminering av muligheten for at den spesifikke cytolyse på en eller annen måte skyldtes vekselvirkning med CD16-delen, ble det utført cytolyseforsøk hvor de intracellulære FcRII-doméner ble knyttet til et ekstracellulært CD4-doméne. I dette tilfelle var målcellene HeLa-celler som uttrykte HIV-kapsel-gpl20/41-proteiner (særlig HeLa-celler infisert med Vaccinia-vektoren vPE16■(som leveres fra National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD)). Som i CD16-systemet, var målceller som uttrykte HIV-kapselen, utsatt for lysering ved. T-celler som uttrykte CD4:FcRyII A-kimærene, men ikke FcRyll Bl eller B2 (fig. 14B).

De intracellulære doméner av FcRyll A og C har ingen betydelig sekvenshomologi med noe annet protein, innbefattende medlemmene i den utvidede FcRy/TCR(-familie. For definering av sekvenselementene som er ansvarlige for induksjon av cytolyse, ble 5<*-> og 3'-utelukkelser av sekvensene som koder for det intracellulære doméne (beskrevet nedenfor- og vist på fig. 15A) tillaget og vurdert med hensyn til effektivitet når det gjaldt kalsium-mobiliserings- og cytolyseanalyser (som beskrevet i det foreliggende) . I forsøkene hvor den aminoterminale del av det intracellulære doméne ble fjernet, ble transmembran-doménet av FcRyll erstattet med transmembran-doménet i det ikke-beslektede CD7-antigen under eliminering av mulig bidrag av vekselvirkninger mediert ved doménet som spenner over membranen.

Fig. 15B og 15C viser at fjerning av de 14 karboksylterminale rester, innbefattende tyrosin 298, resulterte i fullstendig tap av cytolytisk evne og en vesentlig reduksjon i kalsium-mobiliserings-potensial. Ytterligere utelukkelse til like før tyrosin 282 ga en identisk fenotype (fig. 15B og 15C). Utelukkelse fra den N-terminale ende av det intracellulære doméne til rest 268 hadde, ingen vesentlig effekt verken på kalsiumprofil eller cytolytisk potens, mens utelukkelse til rest 275 markert svekket frigjøringen av fritt kalsium, men hadde liten effekt på cytolysen (fig. 15D og 15E). Ytterligere utelukkelse, til rest 282, ga FcRyll-haler som manglet evnen til enten å mobilisere kalsium eller utløse cytolysen (fig. 15D og 15E). Det "aktive element" definert ved disse grov-målinger er forholdsvis stort (36 aminosyrer) og inne-- ■ holder to tyrosiner atskilt med 16 rester.

EKSEMPEL III

Målgitt cytolyse ved hjelp av lymfocytter som bærer kimære CD4-reseptorer som ikke understøtter infisering

Som omtalt ovenfor, kan det ved hjelp av genteknikk lages effektormplekyler som omdirigerer den cytolytiske aktivitet hos CTL'er på en MHC-uavhengig måte. For eksempel vil en kimær som består av det ekstracellulære doméne av CD4 sammensmeltet med kjeden i en human CTL-klon, WH3, spesifikt■drepe målceller som oppviser overflate-kapselglykoproteinet hos HIV-l, gpl20. Siden det ekstracellulære doméne av CD4-molekylet gir ømfintlighet overfor HIV-infeksjon, vil imidlertid de utrustede CTL'er kunne bli mål for viruset, noe som resulterer i en nedsettelse i deres potens (Dalgleish et al., Nature 312:767 (1984); Klatzmann et al., Nature 312:767 (1984)). For forhindring av et slikt utfall, ble det konstruert kimære effektormolekyler basert på CD4 som er effektive med hensyn til spesifikk sikting mot HIV-infiserte celler ved cellemediert dreping, men som ikke gir ømfintlighet overfor infisering med HIV.

Det ble frembrakt et tredelt fusjonsprotein ved genetisk apposisjon av det ekstracellulære doméne av CD4 {fig. 23) til de konstante hengsel-, andre og tredje doméner av human IgGl-tungkjede (Zettlmeissl et al. DNA Cell Biol. 9:347 (1990)) (fig. 25), som i dette tilfelle ble knyttet til en del av det første transmembran-ekson av humant membranbundet IgGl, fulgt av en del av det humane CD7-antigen bestående av sekvensene mellom det eneste lg-liknende doméne og stopp-transfersekvensen etter transmembran-doménet (Aruffo og Seed, EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Den primære aminosyresekvens for den ekstracellulære del av CD7-segmentet besto av en prolin-rik region som tydet på en stilk-liknende struktur som projiserer det Ig-liknende doméne-bort fra celleoverflaten (Aruffo og Seed EMBO J. 6:3313 (1987)) (fig. 26). Det ble laget rekombinante Vaccinia-virus for ekspresjon av denne og beslektede kimærer som beskrevet i det foreliggende..Spesielt" ble det dannet rekombinante Vaccinia-virus ved homolog rekombinasjon i CV-1-celler. Minst to runder plakk-visualisering med OKT4 eller Leu3a fulgt av plakk-rensing ble utført for hvert forråd før tillaging av høytiter-forråd i CV-l-celler.

Den tredelte kimære (CD4(D1-D4):lg:CD7) (fig. 20, molekyl "A") viste effektiv celleoverflate-ekspresjon og ble undersøkt med hensyn til evne til å virke som HIV-reseptor i en Vaccinia-basert syncytiumdannelses-analyse (Lifson et al., Nature 323:725 {1986)); Ashorn et al., J. Virol. 64:2149 (1990)). HeLa-celler infisert med et rekombinant Vaccinia-virus (vPE16) som koder for kapsel-glykoproteinet hos HIV-l (Earl et al., J. Virol. 64:2448 (1990)) ble dyrket sammen med HeLa-celler infisert med enten CD4, CD4 : ( eller CD4(D1-D4):Ig:CD7. Skåler på 6 cm med HeLa-celler .(ATCC, Rockville, MD) med sammenflyting på 50% ble infisert i serumfritt medium i 1 time ved en omtrentlig infiserihgs-multiplisitet '(MOI.) på 10. Cellene ble inkubert i ytterligere 5-6 timer i komplett medium og deretter løsgjort med fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 1 mM EDTA. Celler som uttrykte kapsel- og CD4-kimær, ble blandet i et forhold på 1:1 og utplatet på nytt i 6 cm skåler med komplett medium. Syncytia ble bedømt 6-8 timer ettér ko-dyrking, og fotografert.

Ko-kulturer av CD4 og vPE16 førte til dannelse av lett påvisbare flerkjernede kjempeceller. En kimære som besto av det ekstracellulære doméne av CD4 sammensmeltet med (-kjeden av TCR

(fig. 27) (CD4:(), var dessuten i stand til å mediere syncytiumdannelse, mens celler som uttrykte CD4(D1-D4):lg:CD7, ikke ga noe tegn til cellefusjon. Vi undersøkte også en konstruksjon som bare uttrykte det første og andre doméne av CD4 (fig. 24), CD4(D1,D2):Ig:CD7 (fig. 20, molekyl "B"), siden de aminoterminale to doméner av CD4 i eri annen sammenheng er blitt vist å være nødvendige for infiseringsevne hos HIV (Landau et al., Nature 334:159 (1988)). Dette molekyl viste seg dessuten ikke å være utsatt for HIV-bevirket syncytiumdannelse. Bindingsundersøkelser med løselig 12<5>I-merket gpl20 viste at både . CD4 (D1-D4).: Ig: CD7 og CD4(D1,D2):Ig:CD7 hadde uangripelig affinitet for gpl20. . Deretter bestemte vi hvorvidt kimære molekyler som-var motstandsdyktige overfor syncytiumdannelse, ville være i stand til å gjen-styre celledreping hvis de ble utstyrt med en utløserdel som beskrevet i det foreliggende. Vi smeltet det intracellulære^ doméne av ( (fig. 27) sammen med 3'-enden av CD4(D1-D4):Ig:CD7 og CD4(D1,D2):Ig:CD7 og laget de tilsvarende rekombinante Vaccinia-virus. Disse konstruksjoner, CD4(D1-D4):Ig:CD7:( og CD4(D1,D2): Ig:CD7:( (fig. 20, molekylene "C" og "D"), ble uttrykt i den-humane CTL-klon WH3 og undersøkt med hensyn til sin evne til ' sikting mot, og dreping av, HeLa-celler som uttrykte overflate-kapselglykoproteinet av HIV- -(under anvendelse av metodene beskrevet i det foreliggende). Fig. 21 viser at det intracellulære doméne av (, sammensmeltet med enten CD4(D1-D4):Ig:CD7 eller CD4(D1,D2):Ig:CD7, kan gi dreperevne; konstruksjoner som manglet (-kjeden, var ikke i stand til å mediere denne aktivitet. CD4:(, en positiv kontroll, medierte en litt mer effektiv cytotoksisitet, og CD4(D1,D2):Ig:CD7:( en noe mindre effektiv cytotoksisitet enn CD4(Dl-D4):Ig:CD7:( (fig. 21). Det er imidlertid klart at både CD4(Dl-D4):Ig:CD7:(- og CD4(Dl,D2):Ig:CD7:(-kimærer har evne til mediering av spesifikk dreping av celler som uttrykker HIV-kapselproteiner på overflaten. De tredelte kimærer var tilsvarende ikke i stand til å mediere syncytiumdannelse ved den.Vaccinia-baserte analyse. Vi har også vist at et enkelt (-mønster av den type som er vist på fig. 11A, er tilstrekkelig til å gi cytolytisk aktivitet til en CD4(Dl-D4)-kimære.

Radioimmunutfellingsforsøk viste at fusjonsmolekylene var hovedsakelig, hvis ikke fullstendig, dimerer. I disse forsøk ble det anvendt protein-A-agaroseperler for immunutfelling av det solubiliserte ekstrakt av metabolsk merkede HeLa-celler infisert med rekombinant Vaccinia som uttrykker CD4(D1-D4):Ig:CD7:(- og CD4(Dl,D2):Ig:CD7:(-kimærer. Det immunutfelte materiale ble fraksjonert ved hjelp av polyakrylamidgel-elektroforese under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Spesielt ble ca. 5 x IO<6>HeLa-S3-celler infisert som beskrevet ovenfor for vPE16 med den hensiktsmessige Vacciniavirus-stamme. Cellene ble metabolsk merket med 200 uCi Tran<35>S-merkemateriale pr. ml (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) i 6-8 timer i cystein- og met.ionin-manglende medium, og iøsgjort med PBS som inneholdt 1 mM EDTA. Cellene ble deretter pelletert og lysert i 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,1% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF. Etter fjerning av kjernene ved sentrifugering, ble én femtedel av hvert celle-ekstrakt adsorbert på vaskede protein-A-konjugerte agaroseperler i 2 timer ved 4°C. Perlene ble deretter vasket med PBS som inneholdt 1% NP-40 og eluert i prøvebuffer som inneholdt SDS, i nærvær eller fravær av merkaptoetanol. Resultatene av disse forsøk viste at hovedmengden av de immunutfelte CD4(D1-D4):Ig: CD7:(- og CD4(D1,D2):Ig:CD7:(-kimærer vandret som dimerer med den ventede molekylmasse under ikke-reduserende betingelser.

For direkte vurdering av evnen hos celler som uttrykker CD4-fusjonsmolekylene, til understøttelse av HIV-infisering, utførte vi langvarige infiseringsevne-undersøkelser for transfektanter som uttrykte CD4(D1-D4):Ig:CD7 og CD4(Dl,D2):Ig:CD7. Stabile transfektanter av CD4(D1-D4):Ig:CD7 og CD4(Dl,D2):Ig:CD7 og CD4 ble fremstilt i en underlinje.av 293-celler, en lett transfekterbar cellelinje av human embryonyre-opprinnelse. De kimære molekyler ble subklonet i toretnings-vektorer hvor hygromycin B-genet ble styrt av thymidinkinase-promoteren av viruset herpes Bimplex. En 10 cm skål med celler med 60-70% sammenflytning ble transfektert med 10 ug av denne plasmid-DNA ved kalsiumfosfat-koutfelling. Før transfektering ble plasmidene linearisert i det unike Sfi.I-sete, og endene ble gjort jevne med T4-DNA-polymerase. 24 timer etter transfektering ble cellene oppsplittet fire ganger, og 48 timer etter transfektering ble cellene satt under utvelging med hygromycin B (Signa, St. Louis, Mo) i en konsentrasjon på 400 ug/ml. Hver 3-4 dag ble cellene tilført friskt medium som inneholdt

hygromycin.

Bestandige kolonier ble utplukket og ekspandert, og ekspresjonen av den ble vurdert ved indirekte immunfluorescens under anvendelse av fluorescein-konjugert anti-humant IgG Fc (Organon Teknika, West Che.ster, PA) eller Q4120, et antistoff som reagerer med humant CD4 (Sigma) fulgt av strømningscytometri (Coulter, Hialeah, FL). To uavhengige kloner fra hver konstruksjon med nivåer av celleoverflate-CD4 som var sammenliknbare med det som ble oppvist av de andre cellelinjer, ble valgt for analyse. Fig. 22 viser at etter utsettelse for HIV ble p24 påvist i de stabile CD4-transfektantkulturer så tidlig som 3 dager etter infisering. Tilstedeværelse av flerkjernede kjempeceller og karakteristisk oppblåsthet var tydelig så tidlig som 5 dager etter infisering i disse kulturer. Ingen betydelige p24-nivåer eller tegn til flerkjernede kjempeceller var påvisbare i den ikke-transfekterte opphavs-cellelinje eller i noen.av to uavhengig avledede isolater av CD4(Dl-D4):Ig:CD7- og CD4(Dl,D2):Ig:CD7-transfektanter etter 32 dager i kultur (fig. 22).

Etter fullføring av undersøkelsene av infeksjonsevnen, ble cellene analysert med hensyn til celleoverflate-CD4-ekspresjon. CD4-overflateepitop-tettheten var betydelig redusert i infiserte kulturer som uttrykte CD4, i overensstemmelse med virus-ned-modulering, men den var upåvirket i kulturer som uttrykte CD4(D1-D4):Ig:CD7 og CD4(Dl,D2):Ig:CD7. Disse forsøk viser at det er mulig å frembringe kimære molekyler som bærer de to apikal-doméner av CD4 som ved sammensmelting med T-cellereseptor-(-kjede har evne til å sikte mot og drepe HIV-infiserte celler, men som ikke under-støtter CD4-mediert HIV-infisering.

Ytterligere forsøk tyder på at det er den fysiske avstand mellom det ekstracellulære doméne av CD4-molekylet og lipid-dobbeltlaget som gir evnen til å motstå HIV-infeksjon. Ved et første forsøk konstruerte vi et kimært molekyl som bar en utelukkelse av CD7-stilk- og -transmembran-doménet; denne utelukkelse fjernet den prolinrike region av CD7-transmembrandelen. Når dette doméne ble sammensmeltet med det ekstracellulære doméne av CD4, beholdt det sin evne til effektiv forankring av det ekstracellulære doméne av CD4-molekylet, ifølge måling ved celleoverflate-ekspresjon av CD4-molekylet {som beskrevet i det foreliggende) . Imidlertid ble potensialet til å motstå syncytiumdannelse bevirket ved HIV-kapsel-glykoproteinet, tapt. Utelukkelse av den prolinrike region av CD7-molekylet, en region som med sannsynlighet vil danne en a-helisk spiralstruktur, reduserte således effektivt avstanden mellom det ekstracellulære doméne av CD4 og lipid-dobbeltlaget og opphevet kimærens evne til å motstå syncytiumdannelse.

Ved et andre forsøk påviste vi at en CD4/CD5-kimære som på forhånd er blitt dokumentert å tjene som transmembran-forankring for et ekstracellulært CD4-doméne, men som ikke var i stand til å motstå HIV-bevirket syncytiumdannelse, kan gis evne til å motstå HIV-bevirket syncytiumdannelse. Ved dette forsøk ble hengsel-, CH2- og CH3-doménene av den humane IgGl-tungkjede innført i CD4/CD5-molekylet; den resulterende kimære motsto syncytiumdannelse, noe som igjen tyder på at avstanden som frembringes ved immunglobulin-doménene, er tilstrekkelig til å gi resistens overfor HIV-bevirket syncytiumdannelse.

Ved et tredje forsøk ble et CD4-doméne forlenget til varierende avstander fra cellemembranen under anvendelse av syntetiske alfa-helikser med varierende lengde. Særlig ble det konstruert syntetiske oligonukleotider som representerte gjentatte alfa-heliske mønstre av lysin- og glutaminsyre-rester flankert av to alaninrester {se fig. 28 med hensyn til de primære nukleinsyre- og aminosyresekvenser). Ved tidligere undersøkelser er slike aminosyresekvenser blitt funnet å forekomme med høy frekvens i alfa-helikser, noe som tyder på at slike gjentatte mønstre vil anta en alfa-helisk form og at plassering av slike alfa-helikser mellom transmembran-doménet og de ekstracellulære doméner av CD4 vil projisere CD4 bort fra cellemembranen. Ved variering av lengden av det alfa-heliske segment ble det utført en beregning av projeksjonsavstanden som er nødvendig for å motstå HIV-inntrenging, basert på kjente verdier for alfa-helisk stigning og dreining. Disse resultater er vist i tabell 1.

I denne tabell representerer "CD4" CD4(D1-D4) dersom ikke annet er angitt; "H", "CH2" og "CH3" representerer henholdsvis hengsel-, CH2- og CH3-regionene av den humane IgGl-tungkjede; "CD7tm" og stk" representerer CD7-transmembran- og stilkregionene; "CD7tm (lang versjon)" og "CD7tm (kort versjon)" representerer henholdsvis CD7-transmembranregionen og CD7-transmembranregionen utelukket med hensyn til det prolinrike doméne (som omtalt ovenfor) ; "CD5tm" representerer CD5-transmembranregionen; og "CD34tm" representerer CD34-transmembranregionen. Under punktene J-L er lengden av den alfa-heliske region angitt i Ångstrøm; disse verdier er basert på det faktum at det er 3,6 rester pr. dreining av en alfa-heliks, noe som svarer til 5,4 Å (eller 1,5 Å pr.

rest). En 16-resters alfa-heliks vil følgelig projisere det ekstracellulære doméne av CD4 ca. 24 Ångstrøm. Alfa-heliksene på 4 8 og 72 Ångstrøm ble konstruert ved sekvensiell sammenknytting "concatemerization" av BstYl-fragmentet i fragmentets unike BamHI-sete (se fig. 28), fulgt av utvelging av kloner med den riktige orientering.

Syncytiumdannelse ble bedømt i samdyrkningsanalyser med HeLa-celler som uttrykte HIV-l-kapselglykoproteinet fra Vaccinia-virus-vPE-16-konstruksjonen (se ovenfor).

Thy-l-ekspresjonen ble målt som følger. Det ble konstruert en levende retrovirus-vektor basert på hxb.2-klonen av HIV-l. I denne vektor ble det ikke-essensielle nef-gen erstattet med kodings-sekvensen av rotte-thy-l, et effektivt uttrykt celleoverflate-molekyl som er forankret til membranen ved en fosfatidyl-inositol-binding. Viruset som stammet fra denne molekylklon, betegnet hxb/thy-1, var infeksiøst, noe som ble påvist ved dets cytopatolo-giske virkninger og ved dannelse av p24 i dyrkningssupernatanter av infiserte C8166-celler (en human CD4<+->leukemi-T-cellelinje).

Ved eksponering for hxb/thy-1 viste dessuten HeLa-celler som forbigående ble transfektert med CD4, tegn på thy-1-ekspresjon så tidlig som 18 timer etter infisering, noe som ville ventes for et signal regulert på en nef-liknende måte. Signaler kodet ved nef-genet faller normalt i en klasse av virusreguleringsproteiner som er mangedobbelt skjøtet og mangler rev-responselementet. Disse signaler kan opphopes konstitutivt i cytoplasma som tidlige virus-genprodukter. Det var ventet at thy-1-signalene' var regulert på liknende måte, d.v.s. at de forekom tidlig i virusets livssyklus. Kort angitt gjør dette system analysen av HIV-inntrenging lettere, idet thy-1-ekspresjon anvendes som et Burrogat for virusinntreng-ning. Forskjellige CD4-baserte kimærer ble forbigående transfektert i HeLa-celler under anvendelse av standard-DEAE-deks-tranmetoder. De transfekterte celler ble eksponert for hxb/thy-1-virus 48 timer etter transfeksjon og bedømt med hensyn til thy-1-ekspresjon 24-48 timer etter infisering. I resultatene vist i tabell 1 ble thy-1-ekspresjonen målt 24 timer etter infisering under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig monoklonalt Thy-l-antistoff (Accurate).

Ut fra dataene vist i tabell 1 trakk vi den konklusjon at de ekstracellulære doméner av CD4 optimalt skulle projiseres'bort fra cellemembranen med minst 48 Ångstrøm, og fortrinnsvis med minst 72 Ångstrøm, for å motstå HIV-l-infisering.

Ved anvendelse.av en strategi i likhet med den generelle strategi beskrevet i det foreliggende, kan det konstrueres kimærer basert på antirHIV-kapselantistoffer, som har HIV-infiserte celler som mål. Eksempler på slike antistoffer er beskrevet i Gorny et ■ al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:1624 (1989) og Marasco et al., J. Clin. Invest. 90:1467 (1992).

EKSEMPEL IV

Ytterligere T-cellereseptor- og B-cellereseptor-utløserproteiner

■Andre intracellulære og transmembran-signaloverførings-doméner ifølge oppfinnelsen kan avledes fra T-cellereseptorproteinene, CD3 delta og T3 gamma, og B-cellereseptorproteinene, mbl og B29. Aminosyresekvensene for disse proteiner er vist i fig.

16 (CD3 delta; SEKV. ID NR: 24), fig. 17 (T3 gamma; SEKV. ID NR: 25), fig. 18 (mdl; SEKV. ID NR: 26) og fig. 19 (B29; SEKV. ID NR: 27). Delene av sekvensene som var tilstrekkelige for cyto-lytisk signaloverføring (og som derfor fortrinnsvis inngår i en kimær reseptor ifølge oppfinnelsen) er vist i klammer. Kimære reseptorer som innbefatter disse proteindoméner, konstrueres og anvendes ifølge oppfinnelsen generelt som beskrevet ovenfor.

EKSEMPEL V

Eksperimentelle metoder

Vaccinia-infisering og radioimmunutfelling

Ca. 5 x IO<6> CVl-celler ble infisert i 1 time i serumfritt DME-medium med rekombinant Vaccinia med en infiseringsmultiplisitet (moi) på minst 10 (titer målt for CVl-celler). Cellene ble anbrakt i friskt medium etter infisering og merket metabolsk med 200 uCi/ml <35>S-metionin pluss cystein (Trans<35>S-merkemateriale, ICN; Costo Mesa, CA)

i metionin- og cysteinfritt DMEM (Gibco; Grand Island, NY) i 6 timer. De merkede celler ble løsgjort med PBS som inneholdt 1 mM EDTA, oppsamlet ved sentrifugering og lysert i 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 M Tris pH 8,0, 5 mM EDTA og 1 mM PMSF. Kjernene ble fjernet ved sentrifugering og CD4-proteinene ble immunutfelt med OKT4-antistoff og anti-muse-IgG-agarose (Cappel, Durham, NC). Prøvene ble kjørt i elektroforese gjennom 8% polyakrylamid/SDS-geler under ikke-reduserende (NR) og reduserende (R) betingelser. Geler som inneholdt <35>S-merkede prøver, ble impregnert med En3Hance (New England Nuclear, Boston, MA) før autoradiografering. Lettet ekspresjon av transmembran-formen av CD16, CD16TMf ble målt ved sammenlikning av ekspresjonen av den i CVl-celler som enkeltvis var blitt infisert med CDie™, med ekspresjon i celler som var ko-infisert med virus som koder for CD16ra og (- eller y-kimærer. Etter infisering og inkubering i 6 timer eller mer, ble cellene løsgjort fra platene med PBS, 1 mM EDTA, og ekspresjonen av CD16TM eller kimærene ble målt ved indirekte immunfluorescens og strømningscytometri.

Kalsiumutstrømningsanalyse

Jurkat-underlinje E6-celler (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) ble infisert med rekombinante Vaccinia-virus i 1 time i serumfritt IMDM med en moi på 10, og inkubert i 3-9 timer i IMDM, 10% FBS. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering og suspendert på nytt til en konsentrasjon på 3 x 10<6> celler pr. ml i komplett medium som inneholdt 1 mM Indo-l-acetometoksyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem.

260:3340-3450 (1985)) (molekyl-prober) og inkubert ved 37°C i 45 minutter. De Indo-l-tilsatte celler ble pelletert og suspendert på nytt til en konsentrasjon på 1 x IO<6> pr. ml i serumfritt IMDM og oppbevart ved romtemperatur i mørke. Cellene ble analysert med hensyn til fritt

kalsium-ion ved samtidig måling av den fiolette og blå fluorescensemisjon ved hjelp av strømningscytometri (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). For starting av kalsium-utstrømming, ble det til cellesuspensjonen tilsatt enten fykoerytrin (PE)-konjugert Leu-3A (anti-CD4)

(Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) i en konsentrasjon på l pmg/ml, fulgt av 10 ug/ml ikke-konjugert geit-antimus-IgG ved tid 0, eller ikke-konjugert monoklonalt 3G8-(anti-CDl6)-antistoff ble tilsatt til cellesuspensjonen i en konsentrasjon på 1 ug/ml, fulgt av 10 pg/ml av PE-konjugert Fab2' geit-antimus-IgG ved tid 0. Det ble oppsamlet histogrammer av fiolett/blå-emisjonsforholdet fra den PE-positive (infiserte) cellepopulasjon, som typisk representerte 40-80% av alle celler. T-celle-antigenreseptor-responsen hos ikke-infiserte celler ble utløst av antistoffet OKT3, uten kryssbinding. Når-det gjaldt forsøk som innbefattet kimære CD16-reseptorer, ble prøver som Viste basislinjedrift mot lavere intracellulært kalsium (uten antistoff) , utelukket fra analysen. Histogram-rdataene ble deretter analysert ved omgjøring av de dobbelte data til ASCII under anvendelse av dataprogramvare av typen Write Hand Man (Cooper City, FL), fulgt av analysering med en samling av FORTRAN-programmer. Forholdet mellom fiolett og blå emisjon før tilsetting av de andre antistoff-reagenser ble anvendt til påvisning av det normaliserte begynnelsesforhold, fastsatt til én, og hvile-terskelforholdet, fastsatt slik at 10% av den hvilende populasjon ville overskride terskelverdien.

Cytolyseanalyse

Human T-cellelinje WH3, en begrenset cytolytisk CD8<+>

CD4" HLA B44-cellelinje, ble opprettholdt i IMDM, 10% humant serum med 100 E/ml av IL-2, og ble stimulert i perioder enten ikke-spesifikt med bestrålte (3000 rad) HLA-umake lymfocytter fra perifært blod, og 1 ug fytohemagglutinin pr. ml, eller spesifikt med bestrålte B44-bærende mononukleære celler. Etter 1 dags ikke-spesifikk stimulering, ble PHA fortynnet til 0,5 pg/ml ved tilsetting av friskt medium, og etter 3 dager ble mediet skiftet. Cellene ble dyrket i minst 10 dager etter stimulering før anvendelse ved cytotoksisitetsanalyser. Cellene ble infisert med rekombinant Vaccinia med en infiserings-multiplisitet på minst 10, il time i serumfritt medium, fulgt av inkubering i komplett medium i 3 timer. Cellene ble høstet ved hjelp av sentrifugering og suspendert på nytt til en tetthet på l x IO<7> celler pr. ml. 100 pl ble tilsatt i hver brønn i en mikrotiterplate med .U-bunn som inneholdt 100 pl komplett medium pr. brønn. Cellene ble fortynnet i dobbeltserietrinn. To brønner for hver prøve inneholdt ikke lymfocytter, for å gjøre mulig måling av spontan kromfrigjøring og totalt kromopptak. Målcellene, fra HeLa-sublinje S3, ble infisert i 6,0 eller 10,0 cm plater med en omtrentlig moi på 10, il time i serumfritt medium, fulgt av inkubering i komplett medium i 3 timer. De ble så løsgjort fra skålene med PBS, lmM EDTA, og tellet. En porsjon på 10<6 >målceller .{HeLa-, Raj i- eller RJ2 .2 . 5-celler når det- gjaldt CD4-kimærreseptor-forsøkene og 3G8 10-2-celler; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959 (1989) når det gjaldt CD16-kimærreseptor-forsøkene) ble sentrifugert og suspendert på nytt i 50 pl sterilt <51>Cr-natriumkromat (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE) i 1 time ved 37°C med blanding med mellomrom, og deretter vasket tre ganger med PBS. 100 pl merkede celler som var.suspendert på nytt i medium til en konsentrasjon på IO<5> celler pr. ml, ble tilsatt i hver brønn. Raji- og RJ2.2.5-målceller ble merket på samme måte som HeLarcellene. Mikrotiterplaten ble sentrifugert ved 750 x g i 1 minutt og inkubert i 4 timer ved 37°C. Ved slutten av inkuberingstidsrommet ble cellene i hver brønn suspendert på nytt ved hjelp av forsiktig pipettering, en prøve ble uttatt for bestemmelse av de totale inkorporerte tellinger, og mikrotiter-platen ble sentrifugert ved 750 x g i 1 minutt. Porsjoner på 100 pl supernatant ble uttatt og tellet i en gammastråle scintillasjonsteller. Prosentandelen av drepte celler ble korrigert med hensyn til fraksjonen av infiserte målceller

(vanligvis 50-90%) som ble målt ved strømningscytometri. Når det gjaldt infiserte effektorceller, ble forholdet mellom effektor og målceller korrigert med hensyn til prosentandelen av infiserte celler (vanligvis 20-50% når det gjaldt CD4-kimærreseptor-forsøkene og >70% når det gjaldt CD16-kimærreseptor-forsøkene).

Hutagenese in vitro av (-sekvensen

For frembringelse av punktmutasjoner i aminosyrerestene 11 og/eller 15 av (-sekvensen, ble syntetiske oligonukleotid-primere som hadde en utstrekning fra BamHI-setet oppstrøms for (-trans-membrandoménet, og som omdannet naturlig (-rest 11 fra Cys til Gly (C11G) eller rest 15 fra Asp til Gly

(D15G) eller begge (C11G/D15G), fremstilt og anvendt ved PCR-reaksjoner under frem-bringelse av muterte fragmenter som ble innsatt på nytt i vill-type-CD4:(-konstruksjonene.

For frembringelse av (-utelukkelser ble (-cDNA-sekvenser for-øket ved hjelp av PCR under anvendelse av syntetiske oligo-nukleotid-primere som var konstruert for frembringelse av et stopp-kodon (UAG) etter restene 50, 59 eller 65. Primerne inne-holdt spaltningssetet for enzymet Noti som var innrykket 5 eller 6 rester fra 5'-enden, vanligvis i en sekvens med formen CGC GGG CGG CCG CTA (SEKV. ID NR: 11),

hvor de siste tre rester svarer til stopp-antikodonet. Notl-og stopp-antikodon-sekvensene ble fulgt av 18 rester eller flere som var komplementære til den ønskede 3'-ende av fragmentet. De resulterende kimærer ble betegnet henholds-vis CD16:(Y51<*>, CD16:(E60<*> og CD16:(D66<*.> BamHI-setet oppstrøms for transmembran-doménet og Noti-setet ble anvendt til frem-bringelse av fragmenter som ble gjen-innført i villtype-CD16:(-konstruksjonen. Monomere (-kimærer ble frembrakt ved frigjøring av de intracellulære membran-proksimale og transmembran-(-sekvenser ved BamHI- og SacI-nedbrytning av Asp'- og Cys"-CD4:(-konstruk-sjonen beskrevet ovenfor, og innføring av fragmentet i henholdsvis CD16:(E60<*-> og CD16:(D66<*->konstruksjonen.

Tredelt CD16:7:((48-65)- og CD16:7:((48-59)-kimærkonstruksjon

For dannelse av konstruksjonen CD16:(D66<*> ble (-cDNA-sekvensen som svarte til transmembran-doménet, og de 17 følgende rester i cytoplasma-doménet erstattet med tilsvarende transmembran- og cytoplasma-doméne oppnådd fra CD5- og CD7-CDNA. CD5- og CD7-fragmentene ble dannet ved hjelp av en PCR-reaksjon under anvendelse av forover-oligonukleotider innbefattende et BamHI-restriksjons-spaltningssete og svarende til regionen like oppstrøms for transmembran-doménet av henholdsvis CD5 og CD7 og de følgende reverserte oligonukleotider som overlappet henholdsvis CD5-og CD7-sekvensene, og (-sekvensen som inneholdt SacI-restriksjons-spaltningssetet.

CD5- og CD7-PCR-produktene ble nedbrutt med BamHI og SacI og ligert til BamHI- og Sacl-nedbrutt CD16:(E60<*>, idet (-sekvensen fra BamHI til SacI ble erstattet med CD7-fragmentet. Por å lage konstruk-sjonene CD16:CD5 og CD16:CD7, ble CD5- og CD7-fragmenter oppnådd ved PCR under anvendelse av et oligonukleotid som inneholdt et Notl-restriksjonsspaltnings-sete, og kodet for et stoppkodon (UAA) etter restene Gln416 og Alal93 av henholdsvis CD5 og CD7. CD5- og CD7-PCR-fragmentet ble nedbrutt med BamHI og Noti og innført i CD16:(Asp66<*->konstruksj onen.

Xn vitro mutagenese av de N-terminale rester i det cytolytiske (-signaloverføringsmønster

Syntetiske oligonukleotid-primere som hadde en utstrekning fra SacI-setet inne i (-motivet og omdannet naturlig rest 48 fra Asn til Ser (N48S), rest 50 fra Leu til Ser (L50S) og rest 51 fra Tyr til Phe (Y51F), ble syntetisert og anvendt ved en PCR-reaksjon under frembringelse av fragmenter som ble gjen-innført i villtype-CD16:7:((48-65)-konstruksjonen.

Ju vitro mutagenese av C-terminale rester i det cytolytiske (-signaloverføringsmønster

Syntetiske oligonukleotid-primere med en utstrekning fra Notl-setet 3' til stoppkodonet, som omdannet naturlig rest 60 fra Glu til Gin (E60Q), rest 61 fra Glu til Gin (E61Q), rest 62 fra Tyr til Phe eller Ser (Y62F eller Y62S) og rest 63 fra Asp til Asn (D63N), ble syntetisert og anvendt ved PCR til frembringelse av fragmenter som ble subklonet i villtype-CD16:(D66<*->konstruksjonen fra BamHI-setet til Notl-setet.

CD16:7:((33-65)-, CD16 :7 :( (71-104) - , CD16 :7 :< (104-137)-kimasr-konstruksj oner

Et CD7-transmembranfragment som bærer Mlul- og Notl-seter i forbindelsesstedet mellom transmembran- og intracellulær-doménene, ble oppnådd ved hjelp av PCR under anvendelse av et oligonukleotid med følgende sekvens: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEKV. ID NR: 14). Det resulterende PCR-fragment ble nedbrutt med BamHI og Noti og gjen-innført i . CD16:7:((48-65)-konstruksjonen. (-fragmenter som kodet for restene 33-65, 71.-104 og 104-137, ble oppnådd ved PCR-reaksjon under anvendelse av par av primere som inneholdt Mlul-seter i 5'-enden av forover-primerne, og stopp-kodoner, fulgt av Notl-seter i 5'-enden av de reverserte primere. I hvert tilfelle ble restriksjonssetene innrykket 6 rester fra den 5'-terminale ende av primeren for å sikre restriksjonsenzym-spaltning.

Konstruéring av FcRyllA-utelukkelsesmutanter

Karboksylterminale FcRIIA-utelukkelsesmutanter ble konstruert ved hjelp av PCR på samme måte som for konstruksjonene med hel lengde, idet sekvensene som kodet for tyrosin i posi-sjoner 282 og 298 ble ombyttet til stoppkodoner (TAA). De N-terminale uteluk-kelser ble frembrakt ved forøkning av fragmenter som kodet for suksessivt mindre av det intracellulære doméne, ved hjelp av PCR, under anvendelse av oligonukleotider som muliggjorde at de resulterende fragmenter kunne innføres mellom Mlul- og Notl-restriksjonsseter i et tidligere konstruert ekspresjonsplasmid som kodet for det ekstracellulære CD16-doméne sammensmeltet med CD7-transmembran-doménet, idet sistnevnte endte i et Mlul-sete før forbindelsesstedet mellom transmembran- og det intracellulære doméne.

ANDRE UTPØRELSESFORMER

Eksemplene som er beskrevet ovenfor, viser at aggregering av £-, n.- eller y-kimærer er tilstrekkelig til starting av den cyto-lytiske effektorcelle-respons i T-celler. Det kjente område for ekspresjon av (, n. og y, som.. innbefatter T-lymfocytter, naturlige dreperceller, basofile granulocytter, makrofager og mastceller, tyder på at konserverte sekvensmønstre kan vekselvirke med et sensorisk apparat som er felles for celler av hematopoietisk opprinnelse, og at en viktig komponent når det gjelder verts-forsvar i immunsystemet kan medieres ved reseptor-aggregeringsforhold.

Potensen av den cytolytiske respons og fraværet av en respons overfor målceller som bærer MHC-reseptorer klasse II, viser at kimærer basert på (, n eller y danner grunnlaget for en genetisk inngripen med hensyn til AIDS ved adoptiv immunterapi. Den vide fordeling av endogent ( og y, og sannsynlig-heten for at Fc-reseptorer som er forbundet med y, medierer cytotoksisitet i forskjel-lige celletyper (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989)), gir mulighet for at forskjellige celler kan overveies for dette formål. For eksempel er nøytrofile granulocytter, som har meget kort levetid (= 4 t) i sirkulasjonen og er intenst cytolytiske, attraktive målceller for ekspresjon av kimærene. Infisering av nøytrofile celler med HIV vil sannsynligvis ikke resultere i virus-frigjøring, og rikeligheten av disse celler (den mest dominerende av leukocyttene) skulle gjøre vertens forsvar lettere. En annen attraktiv mulighet for vertsceller er fullt utviklede T-celler, en populasjon som for tiden er tilgjengelig for retro-virus-genteknikk (S.A. Rosenberg, Sei. Am. 262:62-69 (1990)). Ved hjelp av rekombinant IL-2 kan T-cellepopulasjoner relativt lett ekspanderes i kultur, og de ekspanderte populasjoner har typisk en begrenset levetid når de innsprøytes på nytt (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323:570-578 (1990)).

Under hensiktsmessige betingelser skulle HIV-oppfattelse hos celler som uttrykker CD4-kimærer, også tilveiebringe mitogene stimuli, noe som gir mulighet for at den utrustede cellepopulasjon kan svare dynamisk på virusbelastningen. Skjønt vi her har fokusert på fusjonsproteiners oppførsel i cytolytiske T-lymfocytter, vil ekspresjon av kimærene i hjelper-lymfocytter kunne tilveiebringe en HIV-mobilisert . kilde til cytokiner som kan motvirke sammenbrudd av hjelper-celleundersettet ved AIDS. Nylig beskrivelse av flere systemer for genteknikk-frembringelse av resistens overfor infeksjon ved andre trinn enn virus-inntrengning (Friedman et al., Nature 335:452-454 (1988); Green et al., Cell 58:215-223

(1989) ; Malin et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al., Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al., Nature 345:625-628

(1990) ) tyder på at celler som bærer CD4-kimærer, kan konstrueres til kryss-virus-dannelse ved ekspresjon av hensiktsmessige virkemidler med et intracellulært virknings-sete.

Evnen til overføring av signaler til T-lymfocytter via autonome kimærer tilveiebringer også evnen til regulering av retroviralt-genteknikk-dannede lymfocytter in vivo. Kryssbin-dingsstimuli, mediert for eksempel ved spesifikke IgM-antistoffer som er dannet ved genteknikk under fjerning av komplementbindindende doméner, kan muliggjøre at slike lymfocytter øker i antall in situ, mens behandling med liknende spesifikke IgG-antistoffer (som for eksempel oppfatter en aminosyrevariasjon som er dannet ved genteknikk inn i kimærkjeden) selektivt kan uttømme den genteknikk-dannede populasjon. Dessuten fordrer ikke anti-CD4 IgM-antistoffer ytterligere kryssbinding for mobilisering av kalsium i Jurkat-celler som uttrykker CD4:(-kimærer. Evnen til regulering av celle-populasjoner uten å ty til gjentatt forckning utenfor organismen kan i vesentlig grad utvide området og effektiviteten ved någjeldende anvendelser som er foreslått for T-celler frembrakt ved hjelp av genteknikk.

Claims

1. DNA, karakterisert ved at den koder for en proteinholdig, membranbundet, kimær reseptor som omfatter (a) en ekstracellulær del som innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-infeksjon, hvor nevnte fragment av CD4 omfatter aminosyrene 1-394 eller aminosyrene 1-200 av SEQ ID NR: 29, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et T-cellereseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptorprotein som kan signalisere til en celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle.

2. Vektor, karakterisert ved at den omfatter DNA for den kimære reseptor, ifølge krav 1.

3. Celle, karakterisert ved at den uttrykker en proteinholdig, membranbundet, kimær reseptor som omfatter (a) en ekstracellulær del som innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-infeksjon, hvor nevnte fragment av CD4 omfatter aminosyrene 1-394 eller aminosyrene 1-200 av SEQ ID NR: 29, og hvor nevnte CD4-fragment er separert fra den terapeutiske cellemembranen ved i det minste 4 8 Ångstrøm, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et T-cellereseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptorprotein som kan signalisere til den terapeutiske celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle.

4. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at CD4-fragmentet er skilt fra den intracellulære del ved CD7-transmembrandoménet bestående av aminosyresekvensen i SEQ ID NR: 35, eller ved hengsel-, CH2- og CH3-doménene av det humane IgGl-molekyl bestående av aminosyresekvensen i SEQ ID NR: 33.

5. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at CD4-fragmentet er skilt fra membranen hos den terapeutiske celle med minst 72 Ångstrøm.

6. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at T-cellereseptorproteinet er

7. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at reseptoren innbefatter en CD7-transmembrandel, en CD5-transmembrandel eller en CD34-trans-membrandel.

8. Celle ifølge krav 3, karakterisert ved at CD4- fragmentet er skilt fra membranen hos den terapeutiske celle ved én eller flere proteinholdige alfahelikser.

9. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av terapeutiske celler for HIV-terapi, idet de terapeutiske celler uttrykker en membranbundet, proteinholdig kimær reseptor som omfatter, (a) en ekstracellulær del som innbefatter et fragment av CD4 som spesifikt kan oppfatte og binde den HIV-infiserte celle, men som ikke medierer HIV-inf eks jon, hvor nevnte fragment av CD4 omfatter aminosyrene 1-394 eller aminosyrene 1-200 av SEQ ID NR: 29, og hvor nevnte CD4-fragment er separert fra den terapeutiske cellemembranen ved i det minste 4 8 Ångstrøm, og (b) en intracellulær del som omfatter en signal-transduserende del av et T-cellereseptorprotein, et B-cellereseptorprotein eller et Fc-reseptorprotein som kan signalisere til den terapeutiske celle om å ødelegge den reseptorbundne HIV-infiserte celle for fremstilling av en farmasøytisk blanding for styring av cellulær immunrespons overfor en HIV-infisert celle i et pattedyr.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor CD4-fragmentet skilles fra den intracellulære del ved CD7-transmembrandoménet bestående av aminosyresekvensen i SEQ ID NR: 35, eller ved hengsel-, CH2- og CH3-doménene av det humane IgGl-molekyl bestående av aminosyresekvensen av SEQ ID NR: 33.

11. Anvendelse ifølge krav 9, hvor CD4-fragmentet er skilt fra membranen hos den terapeutiske celle med minst 72 Ångstrøm.

12. Anvendelse ifølge krav 9, hvor T-cellereseptorproteinet er (.

13. Anvendelse ifølge krav 9, hvor de terapeutiske celler er valgt fra gruppen som består av (a) T-lymfocytter, (b) cytotoksiske T-lymfocytter, (c) naturlige dreperceller, (d) nøytrofile celler, (e) granulocytter, (f) makrofager, (g) mastceller og (h) HeLa-celler.

14. Anvendelse ifølge krav 9, hvor reseptoren innbefatter en CD7-transmembrandel, en CD5-transmembrandel eller en CD34-transmembrandel.

15. Anvendelse ifølge krav 9, hvor CD4-fragmentet er skilt fra membranen hos den terapeutiske celle ved én eller flere proteinholdige alfahelikser.