HU225688B1 - Redirection of cellular immunity by receptor chimeras - Google Patents

Description

A találmány tárgyát funkcionális Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor-, valamint B-sejt-receptor-kimérák képezik, amelyek alkalmasak immunrendszeri funkciók célzott irányítására.

Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek („killer”-sejtek) vagy granulociták szabályozása képezi, az említett sejtekben olyan kimérák expresszálásán keresztül, amelyek a sejtekben, a kimérák által felismert célpontokkal szemben válaszreakciót váltanak ki. A találmány tárgyát képezik továbbá funkcionális Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor-, valamint B-sejt-receptor-kimérák, amelyek képesek terápiás sejteket úgy irányítani, hogy azok specifikus módon felismerjenek és elpusztítsanak adott fertőző ágenssel fertőzött sejteket, magát a fertőző ágenst, tumorsejteket vagy olyan sejteket, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg. A találmány tárgyát közelebbről olyan Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor-, valamint B-sejt-receptor-kimérák előállítása képezi, amelyek képesek citotoxikus T-limfocitákat HIV-burokproteineket expresszáló sejtek specifikus felismerésére és lizálására késztetni.

A találmány tárgyát képezik ezenfelül a fenti kimérákat expresszáló sejtek, valamint ilyen kimérákat kódoló DNS-ek. A találmány tárgyát képezik továbbá betegségek, például a HIV-vírus által okozott AIDS („Acquired Imminodeficiency Syndrome”, szerzett immunhiányos szindróma) kezelésére, valamint tumoros elváltozások kezelésére alkalmazható terápiás eljárások.

A találmány szerinti eljárások alkalmasak fertőző ágensek okozta betegségek kezelésére, például a szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) kezelésére, valamint tumoros elváltozások kezelésére.

Antigének T-sejtek által történő felismerése a T-sejt-receptoron keresztül immunológiai jelenségek széles skálájának alapját képezi. A T-sejtek irányítják az úgynevezett sejt által közvetített immunitást. Ez vonatkozik idegen szöveteknek vagy fertőzött sejteknek az immunrendszer sejtjei által történő elpusztítására. Különböző T-sejtek ismertek, ezen belül „helper- és „szupresszor”-sejtek, amelyek az immunválasz szabályozásában játszanak szerepet, valamint citotoxikus („killer”) sejtek, amelyek közvetlenül képesek rendellenes sejtek elpusztítására.

Egy másik sejt felszínén megjelenő egyedi antigén felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes T-sejt aktiválódik, majd osztódásnak indulhat, és amennyiben az citotoxikus sejt, képes a kötődött sejt elpusztítására.

Autoimmun betegségek létrejöttét gazdaszövettel reagálni képes ellenanyagok termelődése vagy autoreaktív immuneffektor T-sejtek jelenléte jellemzi. Egyes esetekben autoellenanyagok keletkezhetnek olyan idegen anyagok vagy organizmusok által aktivált, normális T-sejtes, valamint B-sejtes válaszon keresztül, amelyek a gazdaszervezet szövetében található, hasonló vegyületekkel keresztreagáló antigéneket tartalmaznak. Klinikai szempontból jelentős autoellenanyagok például myasthenia gravis esetében az acetil-kolin-receptorokkal szemben termelődő ellenanyagok; valamint a szisztémás lupus erythematosus esetében kimutatható anti-DNS, antieritrocita és antivérlemezke ellenanyagok.

HÍV és annak immunpatogenezise

1984-ben mutatták ki, hogy az AIDS kórokozója HIV-vírus. Azóta az AIDS definíciója többször változott arra vonatkozólag, hogy a diagnózisnak milyen ismérveken kell alapulnia. A diagnosztikai paraméterek változékonyságának ellenére azonban az AIDS egyszerű általános jellemzője a HIV-vírussal történő fertőződés, majd azt követően állandó szervi tünetek és az AIDS-tünetegyüttest meghatározó betegségek kifejlődése, úgymint másodlagos fertőzések, neoplazmák és idegrendszeri betegségek jelentkezése [„Harrison’s Principles of Internál Medicine”, 12. kiadás, „McGraw Hill” (1991)].

A HÍV a lenti vírusok csoportjába tartozó humán retrovírus. Az eddig ismert négy humán retrovírus két, egymástól elkülöníthető csoportra osztható: a humán T-limfotróp (vagy leukémia-) retrovírusok közé tartoznak a HTLV-1 és a HTLV-2, a humán immundeficiencia-vírusok közé tartoznak a HIV-1- és a HIV-2-vírusok. Az előbbiek transzformációt előidéző vírusok, míg az utóbbiak citopatogén vírusok.

A HIV-1-vírust a világon az AIDS leggyakoribb okozójaként azonosították. A HIV-2 és HIV-1 között kimutatható szekvenciaazonosság körülbelül 40%, és a HIV-2 közelebbi rokonságban áll a majom-immundeficienciavírusok (SIV) csoportjának egyes tagjaival [lásd, Cuman és munkatársai: Science 329, 1357 (1985); Weiss és munkatársai: Natúré 324, 572 (1986)].

A HÍV tartalmazza a szokásos retrovírusgéneket (env, gag és pol), ezenkívül tartalmaz hat olyan gént, amelyek a vírus replikációjában és egyéb biológiai aktivitásaiban játszanak szerepet. Amint azt a fentiekben megállapítottuk, az AIDS szokásos ismérve súlyos immunszuppresszió, elsősorban a sejt által közvetített immunitás szuppressziója. Ez az immunszuppresszió különböző opportunista betegségekhez vezet, közelebbről bizonyos fertőzések és neoplazmák kialakulásához vezet.

Megállapították, hogy az immunhiány fő oka AIDSben a timuszeredetű (T) limfociták alcsoportjának, a T4-populációnak mennyiségi és minőségi elégtelensége. Ezt a sejtalcsoportot fenotípusosan CD4-molekulák sejtfelszíni jelenléte jellemzi, amelyről kimutatták, hogy a HÍV sejtreceptora [Dalgleish és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984)]. Bár a T4-sejtek képviselik a HÍV által elsősorban fertőzött sejttípust, lényegében bármely, a felszínén CD4-molekulát expresszáló humán sejt képes HIV-hez történő kötődésre és azzal történő fertőződésre.

A CD4⁺-T-sejteknek hagyományosan „helper/inducer” szerepet tulajdonítanak, utalva arra, hogy funkciójuk aktiválószignál közvetítése a B-sejtek számára, vagy a reciprok, CD8-markerrel rendelkező T-limfociták indukálása citotoxikus/szupresszor sejtekké történő átalakulásra [Reinherz és Schlossman: Cell 19, 821 (1980); Goldstein és munkatársai: Immunoi. Rév. 68, 5 (1982)].

HU 225 688 Β1

A HÍV a vírusburokban található aminosavszakaszon keresztül (gp120) specifikusan és nagy affinitással kötődik a CD4-molekula N-terminális végének közelében található V1-régió részletéhez. A kötődést követően a vírus a célsejt membránjával fuzionálódik és a sejtbe jut. Miután a sejtbe került, a vírus genomi RNS-e reverz transzkriptáz enzim segítségével DNS-sé íródik át, amely beépül a sejt DNS-ébe, ahol az a sejt további élete során „provírusként” van jelen.

A provírus maradhat latens állapotban, vagy aktiválódhat, ezáltal mRNS-sé és genomi RNS-sé íródhat át, ez pedig proteinszintézishez, összeépüléshez, új virionok keletkezéséhez és a sejtfelszínen át vírusok kiszabadulásához vezethet. Bár annak a mechanizmusnak a részletei még nem ismertek, amelyen keresztül a vírus a sejt pusztulását okozza, feltehető, hogy a fő mechanizmus a sejtfelszínen át történő tömeges vírusfelszabadulás, amely a plazmamembrán károsodásához és az ozmotikus egyensúly felborulásához vezet.

A fertőzés folyamán a gazdaszervezetben ellenanyagok termelődnek a vírusproteinekkel szemben, például a gp120 és gp41 elnevezésű, fő burokglikoproteinekkel szemben. A humorális immunitás ellenére a betegség előrehalad, halálos kimenetelű immunszuppressziót eredményezve, melyet opportunista fertőzések sokasága, parazitémia, dementia és halál jellemeznek. Az a tény, hogy a gazdaszervezet vírusellenes ellenanyagai nem képesek megakadályozni a betegség előrehaladását, képezi a betegség legnyugtalanítóbb és legriasztóbb sajátságainak egyikét, és nem sok sikert jósol a szokásos eljárásokon alapuló vakcinázási próbálkozásoknak.

Az immundeficiencia-vírusokkal szemben létrejövő humorális válasz hatékonyságának meghatározásában két faktor játszhat szerepet. Először, más RNS-vírusokhoz hasonlóan (és különösen retrovírusokhoz hasonlóan), az immundeficiencia-vírusok magas mutációs aránnyal válaszolnak a gazdaszervezet immunrendszere által történő beavatkozásra. Másodszor, a burokglikoproteinek nagymértékben glikozilezett molekulák, amelyek nagy affinitású ellenanyag-kötődés számára kevés alkalmas epitópot mutatnak fel. A vírusburok által képviselt gyenge antigénhatású célpont a gazdaszervezet számára kevés lehetőséget teremt a vírusfertőzés specifikus ellenanyagok termelődésével történő visszaszorítására.

A HIV-vírussal fertőzött sejtek felszínükön expresszálják a gp120-glikoproteint. A gp120-burokprotein, hasonló reakción keresztül, mely révén a vírus a nem fertőzött sejtekbe bejut, fúzió létrejöttét közvetíti a CD4⁺-sejtek közt, rövid életű, többmagvú óriássejtek keletkezéséhez vezetve. A szincíciumképződés a gp120 elnevezésű burokglikoproteinnek a CD4-proteinnel történő közvetlen kölcsönhatásán alapul [Dalgleish és munkatársai: lásd fent; Klatzman és munkatársai: Natúré 312, 763 (1984); McDougal és munkatársai: Science 231, 382 (1986); Sodorski és munkatársai: Natúré 322, 470 (1986); Lifson és munkatársai: Natúré 323, 725 (1986); Sodorski és munkatársai: Natúré 321, 412(1986)].

A bizonyítékok között, melyek szerint a CD4-gp120kötődés felelős a CD4-antigént hordozó sejtek vírussal történő fertőződéséért, megemlítendő az a tény, hogy a gp120 és CD4 specifikus komplexet képez [McDougal és munkatársai: lásd fent]. Más kutatók kimutatták, hogy HIV-vírussal nem fertőzhető sejtvonalak fertőzhető sejtvonalakká váltak azt követően, hogy azokat humán CD4-cDNS-génnel transzfektálták, és azokban a gén expresszálódott [Maddon és munkatársai: Cell 46, 333 (1986)].

Számos kutatócsoport olyan terápiás programok kidolgozását javasolta, és azok alkalmazását in vitro sikeresen szemléltette, amelyek oldható CD4-antigén alkalmazásán alapulnak, melyet passzív ágensként, a vírusadszorpció gátlására és a szincícium által közvetített, sejtről sejtre történő vírusátvitel megakadályozására használtak [Deen és munkatársai: Natúré 3321, 82 (1988); Fisher és munkatársai: Natúré 331, 76 (1988); Hussey és munkatársai: Natúré 331, 78 (1988); Smith és munkatársai: Science 238, 1074 (1997); Traunecker és munkatársai: Natúré 331, 84 (1988)], ezt követően elnyújtott felezési idővel és mérsékelt biológiai aktivitással rendelkező CD4-immunglobulin fúziós proteinek kifejlesztésére is sor került [Capon és munkatársai: Natúré 337, 525 (1989); Traunecker és munkatársai: Natúré 339, 68 (1989); Bym és munkatársai: Natúré 344, 667 (1990); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990)]. Bár a CD4-immunotoxin konjugátumok vagy fúziós proteinek a fertőzött sejtekkel szemben in vitro jelentős citotoxikus hatást mutatnak [Chaudhary és munkatársai: Natúré 335, 369 (1988); Till és munkatársai: Science 242, 1166 (1988)], az immundeficiencia-szindróma kialakulásának latenciaideje valószerűtlenné teszi azt, hogy bármely egyszeri kezelésből álló terápia hatékony lehetne a vírusterhelés megszüntetésére, ezenfelül az idegen fúziós proteinek antigenitása valószínűleg korlátozza azok alkalmazhatóságát ismételt adagolást szükségessé tevő kezelésekben. SIV-vírussal fertőzött majmokon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy oldható CD4, olyan állatoknak beadva, melyek nem szenvednek jelentős CD4-citopéniában, képes a SIV-titer csökkentésére és a mieloid funkciók in vitro fokmérőiként használt eredmények javítására [Watanabe és munkatársai Natúré 337, 267 (1989)]. A kezelés megszakítását követően azonban megfigyelhető volt a vírus azonnali újbóli megjelenése, ami azt jelenti, hogy az immunrendszer előrehaladó legyengülésének megelőzése érdekében a kezelésre az egész élet során szükség lehet.

T-sejt-receptorok és Fc-receptorok

A T-sejt-antigén-receptorok (TCR) legelterjedtebb formájának sejtfelszíni expresszálódásához legalább hat különálló polipeptidlánc együttes expresszálódására van szükség [Weiss és munkatársai: J. Exp. Med. 160, 1284 (1984); Orloffhashi és munkatársai: Natúré 316, 606 (1985); Berkhout és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 8528 (1988); Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)], nevezetesen az α/β-antigénkötő láncokra, a CD3-komplex három polipeptidjére, vala3

HU 225 688 Β1 mint ζ-láncra. Ha bármelyik lánc hiányzik, a komplex fennmaradó tagjainak stabil expresszálódása nem valósul meg. A teljes komplex sejtfelszíni expresszálódása szempontjából a korlátozó tényező a ζ-polipeptid [Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)], amelyről felételezik, hogy a ligandum által történő receptorfelismerés által beindított sejtaktivációs programok legalább egy része ennek közvetítésével zajlik [Weissman és munkatársai: EMBO J. 8, 3651 (1989); Frank és munkatársai: Science 249, 174 (1990)]. A ζ- (zéta-) polipeptid egy 32 kDa nagyságú, I. típusú, membránba beépülő homodimer, amely kilenc aminosavból álló extracelluláris domént tartalmaz, N- kötésű glikánkapcsolódási helyek nélkül, valamint 112 (egér) vagy 113 (humán) aminosavból álló intracelluláris domént tartalmaz [Weissman és munkatársai: Science 238, 1018 (1988); Weissman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9709 (1988)]. A ζ-lánc egy izoformja, amelyet η-nak (étának) neveznek [Baniyash és munkatársai: J. Bioi. Chem. 263, 9874 (1988), Orioff és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 14 812 (1989)], és amely egy eltérő mRNS összeillesztési folyamat eredményeképp jön létre [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)], kisebb mennyiségben van jelen az antigénreceptort expresszáló sejtekben. A ζ-η-heterodimerekről feltételezik, hogy inozitol-foszfátok képződését közvetítik, valamint az apoptózisnak nevezett, receptorfüggő programozott sejthalálért felelősek [Mercep és munkatársai: Science 242, 571 (1988); Mercep és munkatársai: Science 246, 1162 (1989)].

Hasonlóképp a ζ- és η-polipeptidekhez, az Fc-receptorral kapcsolódó γ-lánc (gamma-lánc) is további polipeptideket tartalmazó sejtfelszíni komplexekben expresszálódik, melyek közül egyesek a ligandumfelismerést közvetítik, mások ismeretlen funkcióval rendelkeznek. A γ- (gamma-) polipeptid homodimer struktúrával, és a ξ-lánchoz igen hasonló általános szerveződéssel rendelkezik - alkotórésze mind a hízósejtekben és bazofilsejtekben található, FcsRI-nek nevezett, nagy affinitású IgE-receptornak, amely legalább három különböző polipeptidláncból áll [Blank és munkatársai: Natúré 337, 187 (1989); Ra és munkatársai: Natúré 241, 752 (1989)], és az alacsony affinitású IgG-receptorok egyikének, amelyet egérben az FcyRIla képvisel [Ra és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 15323 (1989)], emberben pedig a makrofágok és természetes ölősejtek által expresszált CD16-altípus, a CD16_TM (CD16transzmembrán) [Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989); Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2214 (1990)], valamint egy ismeretlen funkcióval rendelkező polipeptid képvisel [Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 (1990)]. A közelmúltban közölték, hogy a γ-lánc expresszálódik a CTL elnevezésű egér-T-sejt-eredetű sejtvonalban, amelyben az homodimereket, valamint γ-ξ- és γ-η-heterodimereket képez [Orioff és munkatársai: Natúré 347, 189(1990)].

Az Fc-receptorok immunkomplexek fagocitózisának, transzcitózis és ellenanyagfüggő celluláris citotoxicitás („antibody dependent cellular cytotoxicity”, ADCC) közvetítésében vesznek részt [Ravetch és Kínét: Annu. Rév. Immunoi. 9, 457 (1991); Unkeless és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 6, 251 (1988); és Mellman: Curr. Opin. Immunoi. 1, 16 (1988)]. Nemrégiben kimutatták, hogy az alacsony affinitású, egérFc-receptor-izoformok egyike - az FcRylIIBI - Ig-vel fedett célzott antigének felvételét közvetíti klatrinnal fedett sejtfelszíni behúzódásokba (retikulumokba), egy másik alacsony affinitású receptor - az FcryllIA - pedig jelközvetítő („trigger”) molekulák egy kis családjának egy vagy több tagjával történő kapcsolódáson keresztül vesz részt ADCC közvetítésében [Miettinen és munkatársai: Cell 58, 317 (1989); Hunziker és Mellman: J. Cell Bioi. 109, 3291 (1989)]. A fenti jelközvetítő molekulák, a T-sejt-receptor (TCR) ξ-lánc, a TCR^-lánc, valamint az Fc-receptor γ-lánc különböző immunrendszeri receptorok ligandumfelismerő doménjaival lépnek kölcsönhatásba, és autonóm módon sejteffektorprogramok beindítására, ezen belül - aggregációt követően - citolízis kiváltására képesek [Samelson és munkatársai: Cell 43, 223 (1985); Weissman és munkatársai: Science 239, 1018 (1988); Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990); Blank és munkatársai: Natúré 337, 187 (1989); Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989); Kurosaki és Ravetch: Natúré 342, 805 (1989); Hibbs és munkatársai: Science 246, 1608 (1989); Anderson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2274 (1990); valamint Irvin és Weiss: Cell 64, 891 (1991)].

Összehasonlítva az alacsony affinitású, egér és humán Fc-receptor-családokat azonban nyilvánvaló, hogy a humán FcRylIA- és -C-izoformoknak egérben nincs megfelelője. Részben a fentiek következtében ezek funkciója még meghatározásra vár.

Mivel a csupán CD4-receptoron alapuló humorális hatóanyagoknak in vivő alkalmazhatósága korlátozott lehet, a korábbiakban olyan kutatások indultak, amelyek a HIV-vel szemben a celluláris immunitás fokozásának lehetőségeit vizsgálták. Olyan protein-kimérákat állítottak elő, amelyekben a CD4 extracelluláris doménját T-sejt-receptor, IgG-Fc-receptor, vagy B-sejt-receptor szignáltranszdukciós elemeinek transzmembránés/vagy intracelluláris doménjaival fuzionáltatták (lásd a 07/847 566, valamint 07/665 961 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratokat, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik). Extracelluláris CD4-domént tartalmazó kimérákat expresszáló citolitikus T-sejtek MHC-independens módon, hatékonyan elpusztítják a HIV-burokproteineket expresszáló célsejteket. A fenti megközelítési mód különösen fontos és új összetevőjeként azonosították a különálló Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor- és B-sejt-receptor-láncokat, amelyek aggregációja elegendő a sejtek válaszreakciójának kiváltásához. Ennek a megközelítési módnak egy különösen előnyös alkalmazási módja szerint CD4, valamint ξ-, η- és γ-láncok közti kimérákat állítottak elő, amelyek citolitikus T-limfocitákat HIV-gp120-antigént expresszáló sejtek felismerésére és elpusztítására késztetnek (lásd a 07/847 566, vala4

HU 225 688 Β1 mint 07/665 961 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratokat, amelyek teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik). Extracelluláris CD4-domént tartalmazó kimérákat expresszáló citolitikus T-sejtek HIV-burokproteineket expresszáló sejtes célpontok hatékony MHC-independens elpusztítására képesek. A találmány szerinti megoldás különösen fontos és új összetevőjét különálló Τ-sejt-receptor-, Fc-receptor-, valamint B-sejt-receptor-láncok azonosítása képezi, amelyek aggregációja elegendő a celluláris immunválasz beindításához.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint CD4-antigén, valamint ξ-, η- vagy γ-láncok közti kimérákat alkalmazunk, amelyek citolitikus T-limfocitákat HIV-gp120-glikoproteineket expresszáló sejtek felismerésére és elpusztítására késztetnek (lásd a 07/847 566 és 07/665 961 számú amerikai egyesült államokbeli közzétételi iratokat).

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.

Bár natív T-sejt-, Β-sejt-, valamint Fc-receptorok igen bonyolult multimer struktúrákat képeznek vagy képezhetnek, amely nem teszi lehetővé azokkal a szokásos módszerekkel történő munkát, a leírásban bármely, a célpontfelismerés feladatának végrehajtására képes molekula intracelluláris doménjai közt létrehozott kimérák alkalmazási lehetőségeit ismertetjük. Közelebbről, T-sejt/Fc-receptor zéta-, éta- vagy gamma-láncok intracelluláris részét megfelelően kialakított ellenanyag-molekula extracelluláris részével összekapcsoltan tartalmazó kimérák előállítása lehetővé teszi immunrendszeri sejtek antigénfelismerő képességének célzott irányítását, az extracelluláris ellenanyagrészlet által felismert antigénnel szemben. Az immunrendszer kimérával felfegyverzett sejtjei, a kórokozó felszínén valamely determináns felismerésére képes ellenanyagrészlet révén, a kórokozó jelenlétére eredetüknek megfelelő effektorprogrammal válaszolnak, például „helper” T-limfociták a célzott sejttel szemben létrejövő citotoxikus aktivitással válaszolnak, B-limfociták aktiválódnak, majd ellenanyagokat termelnek. Makrofágok és granulociták saját effektorprogramjukat hajtják végre, amely citokinkibocsátást, fagocitózist és reaktív oxigén képzését foglalja magában. Hasonlóképp, tumorsejtek felismerésére képes ellenanyagrészlet esetében az immunrendszer tumorellenes válasza előnyösen fokozódik. Saját determinánsokkal szemben rendellenes reaktivitást mutató immunsejtek felismerésére képes ellenanyagok esetében az autoreaktív sejtek szelektív módon kiválaszthatók és elpusztíthatok.

Bár a fentiekben a találmány szerinti megoldást az egyszerűség kedvéért ellenanyag-kimérák alkalmazásán keresztül szemléltettük, a találmány nem korlátozódik ellenanyag-kimérák alkalmazására, és valójában specifikus, nem ellenanyag természetű extracelluláris doménok alkalmazása jelentős előnyökkel járhat. Például olyan extracelluláris részlet esetében, amely egy vírus, baktérium vagy parazita receptorát képezi, a kimérákkal felfegyverzett sejtek specifikusan a vírus-, baktérium-, vagy parazitadeterminánsokat expresszáló sejteket fogják megcélozni. Ennek a megközelítési módnak ellenanyagok alkalmazásához képest az előnye, hogy egy kórokozó natív receptora egyedülállóan magas szelektivitással vagy affinitással rendelkezhet, ami a létrejövő immunválasz sokkal pontosabb irányítását teszi lehetővé. Hasonlóképp, rendellenes módon saját antigénekkel reagáló immunrendszeri sejtek eltávolítására elegendő lehet az antigén (Β-sejtek eltávolítását célzó terápia esetében intakt proteinként; T-sejtek eltávolítását célzó terápia esetében MHC-komplexként történő) összekapcsolása intracelluláris zéta-, étavagy gamma-láncokkal, ezáltal elérhetjük a saját determinánsokra rendellenesen válaszoló sejtek specifikus, célzott elpusztítását.

A kimérák alkalmazásának másik területe sejtpopulációk in vivő szabályozása egyéb géntechnológiai módosítások létrehozását követően. Például javasolták tumort elárasztó limfociták vagy természetes ölősejtek alkalmazását abból a célból, hogy azok a tumor helyére citotoxikus anyagokat juttassanak. A találmány tárgyát képezik ilyen limfociták és sejtek számának és aktivitásának szabályozására könnyen alkalmazható eljárások, amely eljárások nem teszik szükségessé, hogy a sejteket in vitro amplifikálás céljából eltávolítsuk a beteg szervezetéből. Mivel tehát a sejtek proliferatív válaszreakcióját a kimérareceptorok intracelluláris doménjai közvetítik, az extracelluláris doménok elrendeződésének megváltoztatása különböző, az extracelluláris doménokra specifikus, aggregációt kiváltó stimulusokkal (például az extracelluláris doménra specifikus ellenanyag alkalmazásával) a kimérákat hordozó sejtek proliferációját eredményezi.

Bár a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint zéta-, éta- vagy gamma-láncok vagy azok aktív fragmensei (például az alábbiakban ismertetett fragmensek) közti kimérákat alkalmazunk, a találmány szerinti célra bármely, például granulocitákban vagy B-limfocitákban található, a fenti molekulákhoz hasonló funkcióval rendelkező receptorlánc alkalmazható. Előnyös immunsejt-indukáló molekuláknak az alábbi megkülönböztető tulajdonságokkal kell rendelkezniük: legyenek képesek autonóm expresszálódásra (például külön láncként); legyenek egy extracelluláris doménnal fuzionáltathatók úgy, hogy a kiméra jelen legyen a terápiás sejt felszínén; valamint célzott ligandummal történő találkozást követően, aggregáció révén képesek legyenek sejteffektorprogramok beindítására.

Jelenleg kiméráknak az immunrendszer sejtjeibe történő juttatására legelőnyösebben alkalmazható eljárások a génterápia valamilyen formáján alapulnak. Az immunrendszer sejtjeinek kimérareceptorokkal történő ellátása oly módon, hogy a sejteket megfelelőképp szolubilizált, tisztított kiméraproteinekkel elegyítjük, szintén módosított sejtpopulációt eredményez, amely képes reagálni a kimérák extracelluláris doménja által felismert célsejtekre. Hasonló eljárást alkalmaztak például az intakt CD4 HIV-receptomak terápiás célból, eritrocitákba történő bejuttatására. Ebben az esetben a módosított sejtpopuláció nem képes önmaga megújítására.

HU 225 688 Β1

A találmány tárgyát képezik funkcionális, egyszerűsített T-sejt-receptor-, Β-sejt-receptor-, valamint Fc-sejt-receptor-kimérák, melyek képesek immunrendszeri funkciók célzott irányítására. Közelebbről, a találmány tárgyát limfociták, makrofágok, természetes ölősejtek vagy granulociták működésének szabályozása képezi, az említett sejtekben kimérák expresszálásán keresztül, melyek a sejtekben a kimérák által felismert célponttal szemben válaszreakciót váltanak ki. A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások célzott sejtszintű válaszreakciók kiváltására, fertőző kórokozóval, tumorsejtekkel vagy rákos sejtekkel vagy olyan sejtekkel szemben, melyekben autoimmun folyamatok indultak meg. Célzott sejtszlntű válaszreakciók emlősben történő kiváltására szolgáló eljárások szerint emlősnek terápiás sejtek hatékony mennyiségét adjuk be, amely sejtek képesek felismerni és elpusztítani a fenti fertőző kórokozókat, tumorsejteket, rákos sejteket vagy autoimmun sejteket. A sejtszintű válaszreakció létrejöhet egyetlen receptorkiméra közvetítésével, vagy lehet több kiméra együttműködésének eredménye (például két vagy több kimérából álló kombináció tagjai közti együttműködés eredménye, amely kimérák egyike CD28 intracelluláris domént tartalmaz). A találmány tárgyához tartozik tehát a fenti kimérareceptor-expresszáló sejtek alkalmazása betegségek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására (amint azt a leírásban ismertettük).

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint egy fertőző kórokozóval szemben létrejövő célzott sejtszintű válaszreakció kiváltására szolgáló eljárásban terápiás sejteknek az említett kórokozó felismerésére és elpusztítására képes hatékony mennyiségét adjuk be, ahol a kórokozó meghatározott vírus, baktérium, protozoon vagy gomba. Még közelebbről az eljárás olyan kórokozókkal szemben irányul, mint a HIV-vírus és Pneumocystis carinii.

Közelebbről, a találmány tárgyát sejtszintű válaszreakciók HIV-fertőzött sejtekkel szemben történő célzott irányítására alkalmazható eljárások képezik. A fenti eljárások szerint betegeknek kimérareceptort expresszáló citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be; a limfociták képesek specifikus módon felismerni és lizálni a HIV-vírussal fertőzött sejteket, valamint a keringésben található vírusokat.

Egyrészt a találmány tárgyát képezik eljárások, HIV-vírussal fertőzött sejtekkel szemben célzott sejtszintű válaszreakció kiváltására, amely eljárások szerint betegnek citotoxikus T-limfociták hatékony mennyiségét adjuk be, amelyek képesek specifikus módon felismerni és lizálni a HIV-vírussal fertőzött sejteket.

Másrészt a találmány tárgyát képezik kiméra-receptorproteinek, amelyek citotoxikus T-limfocitákat HIV-fertőzött sejtek felismerésére és lizálására késztetnek. A találmány tárgyát képezik ezenfelül a kimérareceptorokat tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtek.

A találmány tárgyához tartoznak ezenfelül a találmány szerinti kimérareceptorokkal szemben irányuló ellenanyagok.

Abból a célból, hogy HIV-fertőzött sejtekhez történő specifikus kötődésre és azok elpusztítására képes citotoxikus T-limfocitákat nyerjünk, receptorkimérákat állítottunk elő és alkalmaztunk. Ezek a receptorkimérák funkcionálisan aktívak, és azzal a különleges képességgel rendelkeznek, hogy gp120-expresszáló sejtekhez specifikus módon kötődnek, és azokat elpusztítják.

A találmány célkitűzését képezi HIV-fertőzött egyének kezelésére alkalmas eljárások kifejlesztése. A találmány szerinti megoldás jelentős előrelépést jelent tehát az AIDS kezelése szempontjából.

Ezek és a találmány további bemutatott, nem korlátozó jellegű megvalósítási módjai szakember számára világosak lesznek a találmány alábbi, részletes leírása alapján.

Az alábbi részletes leírás során utalunk molekuláris biológiában és immunológiában jártas szakember számára jól ismert eljárásokra. Az említett ismert eljárásokat ismertető közlemények és egyéb szakirodalmi helyek, melyekre utalás történt, teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik, mintha azokat teljes egészükben közöltük volna.

Rekombináns DNS technológia általános elveit ismertetik például a felsorolt ismert szakirodalmi helyek: Watson és munkatársai: „Molecular Biology of the Gene”, 1. és 2. kötet, „Benjamin/Cummings Publishing Company” Inc., Menlo Park, CA (1987); Darnell és munkatársai: „Molecular Cell Biology”, „Scientific American Books, Inc., New York, N. Y. (1986); Lewin: „Genes II”, „John Wiley & Sons” New York, N. Y. (1985); Old és munkatársai: „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. kiadás, „University of California Press, Berkeley, CA (1981); Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor Laboratory”, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989); valamint Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology” „Wiley Press”, New York, NY (1989).

Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok egyértelműen értelmezhetőek legyenek, az alábbi definíciókat adjuk meg.

„Klónozás” alatt in vitro rekombinációs technikák alkalmazását értjük adott génnek vagy egyéb DNS-szekvenciának egy vektormolekulába történő inszertálására. Egy meghatározott gén sikeres klónozásához szükség van DNS-fragmensek előállítására, a fragmensek vektormolekulákhoz történő kapcsolására, az összeállított DNS-molekulának olyan gazdasejtbe történő bejuttatására, amelyben az képes replikálódni, valamint a recipiens gazdasejtek közül a célzott gént tartalmazó kiónok szelektálására szolgáló eljárások alkalmazására.

A leírásban „cDNS alatt olyan komplementer vagy másolat-DNS-t értünk, mely RNS-templát alapján készült RNS-függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzim közreműködésével. „cDNS-klón alatt tehát klónozóvektor által hordozott, egy adott RNS-molekulával komplementer, kettős szálú DNS-szekvenciát értünk.

A „cDNS-génkönyvtár kifejezés cDNS-inszerteket tartalmazó rekombináns DNS-molekulák gyűjteményére vonatkozik, mely DNS-molekulák olyan mRNS-ről

HU 225 688 Β1 készült DNS-másolatokat tartalmaznak, amelyek a sejtekben a cDNS-génkönyvtár előállításának idejében expresszálódtak. Ilyen cDNS-génkönyvtárat előállíthatunk szakember számára ismert eljárásokkal, ilyen eljárásokat ismertetnek például Maniatis és munkatársai [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, lásd fent]. Általánosságban, először RNS-t izolálunk az organizmus sejtjeiből, amelynek genomjából egy meghatározott gént klónozni kívánunk. A találmány céljára előnyös emlős-, és különösen humán limfocita-sejtvonalak alkalmazása. A találmány szerinti célra előnyös vektor a vacciniavírus WR-törzs.

„Vektor” kifejezés alatt például plazmid, bakteriofág, vagy emlős- vagy rovarvírus-eredetű DNS-molekulát értünk, melybe DNS-fragmens inszertálható vagy klónozható. Egy vektor egy vagy több egyedi restrikciós hasítási helyet tartalmaz, és meghatározott gazdaszervezetben vagy hordozószervezetben autonóm replikációra képes úgy, hogy a klónozott szekvencia reprodukálható legyen. „DNS-expressziós vektornak” tehát bármely olyan autonóm elemet nevezünk, amely egy rekombináns peptidszintézisét irányítani képes. Ilyen DNS-expressziós vektorok lehetnek bakteriális eredetű plazmidok és fágok, valamint emlős- és rovareredetű plazmidok és vírusok.

„Lényegében tiszta” kifejezés alatt olyan vegyületet, például proteint, polipeptidet vagy ellenanyagot értünk, amelyik a természetben azzal együtt előforduló összetevőktől lényegében mentes. Általánosságban egy vegyületről akkor mondjuk, hogy az lényegében tiszta, ha a mintában az adott vegyület aránya legalább 60%, előnyösen 75% és legelőnyösebben 90%. A tisztasági fok bármely alkalmas eljárással meghatározható, például oszlopkromatográfiával, poliakrialamid-gélelektroforézissel vagy HPLC-analízissel. Nukleinsavak vonatkozásában a „lényegében tiszta kifejezés olyan nukleinsavszekvenciát, -szegmenst vagy -fragmenst jelöl, amelyik nem csatlakozik közvetlenül (azaz nem kapcsolódik kovalensen) azokhoz a kódolószekvenciákhoz (azaz az 5’-végen, valamint a 3’-végen található szekvenciákhoz), melyekhez közvetlenül kapcsolódik az organizmus természetben előforduló genomjában, amelyből a találmány szerinti DNS származik.

„Funkcionális származéknak nevezzük egy molekula „fragmenseit”, „variánsait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait. Egy molekula „fragmense” kifejezés, például a találmány szerinti cDNS-szekvenciák bármelyike, a molekula valamely nukleotid-alcsoportjára vonatkozik. Egy ilyen molekula „variánsa” természetben előforduló molekulát jelent, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekula „analógjának” természetben elő nem forduló molekulát nevezünk, amely lényegében hasonló a teljes molekulához vagy annak fragmenséhez. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy az „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha a két molekula aminosavszekvenciája lényegében megegyezik. Közelebbről, „lényegében hasonló” aminosavszekvenciák legalább 50%-os, előnyösen 85%-os és legelőnyösebben 95%-os aminosavszekvencia-azonosságot mutatnak a természetben előforduló szekvenciával vagy a referenciaszekvenciával és/vagy egy olyan szekvenciával, amely a természetben előforduló szekvenciától vagy referenciaszekvenciától csak konzervatív aminosavszubsztitúciók tekintetében tér el. A lényegében hasonló aminosavszekvenciák lényegében hasonló biológiai aktivitással rendelkeznek. Feltéve tehát, hogy két molekula hasonló aktivitással rendelkezik, azokat a leírásban használt definíció szerint variánsoknak tekintjük, még abban az esetben Is, ha a molekulák egyike a másikban nem található, további aminosavakat tartalmaz vagy annál kevesebb aminosavat tartalmaz, vagy azokban az aminosavak sorrendje nem azonos. A leírásban egy molekula „kémiai származékán olyan molekulát értünk, amelyik a molekula részét normálisan nem képező, további kémiai csoportokat tartalmaz. Ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, felszívódását, biológiai felezési idejét stb. A csoportok csökkenthetik továbbá a molekula toxicitását, megszüntethetik vagy csökkenthetik a molekula valamely nem kívánt mellékhatását stb. Ilyen hatások közvetítésére képes csoportokat írnak le például az alábbi szakirodalmi helyen: „Remington Pharmaceutical Science”, 16. kiadás, „Mack Publishing Co.”, Easton, PA (1980).

Hasonlóképp, a találmány szerinti receptor-kiméragén „funkcionális származéka” kifejezés vonatkozik a gén „fragmenseire”, „variánsaira” vagy „analógjaira, melyek nukleinsavszekvenciája „lényegében hasonló lehet, és amelyek Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptorvagy Fc-receptor-kimérákhoz hasonló aktivitással rendelkező molekulát kódolnak. „Lényegében hasonló” nukleinsavak lényegében hasonló aminosavszekvenciákat kódolnak, és azok lehetnek bármilyen, megfelelő hibridizációs körülmények alkalmazása mellett a vad típusú nukleinsavszekvenciával hibridizálódni képes nukleotidszekvenciák [„megfelelően sztringens” hibridizációs körülmények leírását lásd például a következő szakirodalmi helyen: Ausubel és munkatársai: „Current Protocols in Molecular Biology” „Wiley Press”, New York, NY (1989)].

Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra-proteineknek nevezünk minden olyan funkcionális származékot, fragmenst, variánst, analógot vagy kémiai származékot, amely lényegében hasonló a „vad típusú” kimérához, és amely ahhoz hasonló aktivitással rendelkezik (azaz a vad típusú receptorkimérák aktivitásának legelőnyösebben 90%-ával, előnyösebben 70%-ával, előnyösen 40%-ával és legalább 10%-ával rendelkezik). Egy funkcionális, kimérareceptor-származék aktivitása vonatkozik (annak extracelluláris részén keresztül) egy célzott ágenshez vagy sejthez történő specifikus kötődésre, és a kötődés következményeképp (a kimérareceptor intracelluláris része által) az adott ágens vagy sejt elpusztítására; úgy, hogy az aktivitás tesztelhető például bármely, a leírásban ismertetett vizsgálati eljárással.

A találmány szerinti Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kimérát vagy annak funkcionális származékát kódoló DNS-szekvenciát rekombináns

HU 225 688 Β1 úton vektor-DNS-sel kapcsolhatjuk össze szokásos technikák alkalmazásával, például ligálás céljából tompa végek vagy lépcsőzetes végek létrehozásával, megfelelő végek kialakítása céljából restrikciós enzimekkel végzett emésztésekkel, szükség esetén a ragadós végek feltöltésével, a nem kívánt összekapcsolódás megelőzése céljából alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel, valamint megfelelő ligázokkal történő ligálással. Ilyen technikákat írnak le például Maniatis és munkatársai (lásd fent), és azok a technika állása szerint jól ismertek.

Egy nukleinsavmolekuláról, például DNS-ről akkor mondjuk, hogy „képes egy polipeptid expresszálására, ha transzkripciós és transzlációs szabályozó információkat hordozó nukleotidszekvenciákat tartalmaz, és az említett szekvenciák a polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciákkal „funkcionálisan kapcsoltak”. Funkcionális kapcsolódásnak olyan kapcsolódást nevezünk, amelyben a szabályozó DNS-szekvenciák és az expresszálandó DNS-szekvenciák oly módon kapcsolódnak, hogy génexpresszió jöhessen létre. A gén expresszálódásához szükséges szabályozórégiók közelebbi természete organizmusról organizmusra változhat, de általánosságban tartalmazniuk kell egy promoterrégiót, amely prokarióták esetében tartalmazza a promotert (amely az RNS-transzkripció megindítását szolgálja), valamint olyan DNS-szekvenciákat, melyek RNS-sé átíródva jelzést szolgáltatnak a proteinszintézis megindulása számára. Ezek a régiók általában tartalmazzák azokat az 5’-végi nem kódoló szekvenciákat, amelyek a traszkripció és a transzláció megindításában játszanak szerepet, például a „TATA-box” régiót, a „capping”-szekvenciát, CAAT-szekvenciát és hasonlókat.

Kívánt esetben a proteint kódoló génszekvenciától 3-irányban található nem kódoló régiót megkaphatjuk a fent leírt módszerek alkalmazásával. Ezt a régiót megtarthatjuk az abban található, transzkripciós terminációszabályozó szekvenciák, ezen belül a terminációt és poliadenilezést szabályozó szekvenciák kedvéért. Megtartva tehát a proteint kódoló DNS-szekvenciával természetben kapcsolódó 3’-régiót, a rendelkezésre állnak a transzkripció végét jelző szignálok. Amennyiben a transzkripció végét jelző szignálok nem működnek kielégítően az expresszálásra felhasznált gazdasejtben, azt a gazdasejtben működőképes 3'-régióval helyettesíthetjük.

Két DNS-szekvenciáról (például promoterrégió-szekvenciáról és Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptorvagy Fc-receptor-kimérát kódoló szekvenciáról) akkor mondjuk, hogy azok „funkcionálisan kapcsoltak”, ha a két DNS-szekvencia közti kötődés természete (1) nem eredményez fáziseltolódással járó („frame shift”) mutációt, (2) nem gátolja a promoterrégiót alkotó szekvencia azon képességét, hogy irányítsa a receptorkiméra-génszekvencia transzkripcióját, vagy (3) nem gátolja a receptorkiméra-génszekvencia azon képességét, hogy az a promoterrégió-szekvencia által átíródjon. Egy promoterrégió funkcionálisan kapcsolt egy DNS-szekvenciával, ha a promoter képes létrehozni az adott DNS-szekvencia transzkripcióját. A protein expresszálódásához tehát szükség van megfelelő gazdasejt által felismert transzkripciós és transzlációs szignálokra.

A találmány tárgyát képezi továbbá T-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra-proteinek (vagy funkcionális származékaik) expresszálása prokarióta vagy eukarióta sejtekben; bár eukarióta sejtekben (különösen humán limfocitákban) történő expresszálás előnyösebb.

A találmány szerinti ellenanyagok számos különböző eljárással előállíthatók. Például eljárhatunk úgy, hogy állatnak a receptorkiméra-proteineket vagy azok funkcionális származékait expresszáló sejteket adunk be, abból a célból, hogy a kimérához kötődni képes poliklonális ellenanyagokat tartalmazó szérum termelődését váltsuk ki.

Egy előnyös eljárás szerint a találmány szerinti ellenanyagok monoklonális ellenanyagok. Ilyen monoklonális ellenanyagokat előállíthatunk hibridómatechnológiával [Kohler és munkatársai: Natúré 256, 495 (1975); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 511 (1976); Kohler és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 292 (1976); Hameriing és munkatársai: „Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, „Elsevier Ν. Y., 563-684. oldal (1981)]. A fenti eljárások szerint állatot immunizálunk a Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra-antigénekkel. Az ilyen állat lépsejtjeit extraháljuk és megfelelő mielóma-sejtvonallal fuzionáltatjuk. A találmány szerinti megvalósítási módokban bármely alkalmas mielóma-sejtvonal alkalmazható. A fúziót követően az így kapott hibridómasejteket szelektív módon, HAT-tápfolyadékban tartjuk fönn, majd Wands és munkatársai módszere szerint [Gastroenterology 80, 225 (1981)], határhígításos eljárással klónozzuk. A fenti szelekcióval kapott hibridómasejteket ezután vizsgáljuk, hogy a kimérához kötődni képes ellenanyagokat szekretáló kiónokat azonosítsunk.

A találmány szerinti ellenanyagok lehetnek poliklonális ellenanyagok is, vagy előnyösebben régióspecifikus poliklonális ellenanyagok.

A találmány szerinti Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kimérák ellen irányuló ellenanyagok alkalmazhatók betegben a kimérareceptor (vagy kimérareceptort hordozó sejtek) mennyiségének meghatározására. Ilyen ellenanyagok alkalmasak a technika állása szerint ismert, standard immundiagnosztikai vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásra, például immunometriás vagy „szendvics” vizsgálati eljárásokban, mint például „forward-szendvics, „reverz-szendvics” és „szimultán-szendvics” vizsgálati ejárásokban. Amint azt további kísérletezés nélkül szakember képes megállapítani, az ellenanyagokat alkalmazhatjuk bármilyen kombinációban, hogy megfelelő specifitással, érzékenységgel és pontossággal rendelkező immunvizsgálati eljáráshoz jussunk.

Az immunológia általános elveit ismertető szokásos szakirodalmi helyek például az alábbiak: Roitt: „Essential Immunology, 6. kiadás, „Blackwell Scientific Publications”, Oxford (1988); Kimball: „Introduction to Immu8

HU 225 688 Β1 nology”, 2. kiadás, „Macmillan Publishing Co. New York (1986); Roitt és munkatársai: „Immunology”, „Gower Medical Publishing Ltd.” London (1985); szerk.: Burdon R. és munkatársai: „Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, 13. kötet, Campbell A.: „Monoclonal Antibody Technology, „Elsevier”, Amszterdam (1984); Klein: „Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination”, „John Wiley & Sons, New York, (1982); valamint szerk.: Kennett és munkatársai: „Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses”, „Plenum Press” New York (1980).

„Kimutatás” kifejezésen egy anyag jelenlétének vagy hiányának kimutatását, vagy egy anyag mennyiségének meghatározását értjük. A kifejezés vonatkozik tehát a találmány szerinti anyagok, készítmények és eljárások alkalmazásával történő kvalitatív vagy kvantitatív meghatározásokra.

A leírásban feltártakkal megegyező specifitással rendelkező monoklonális ellenanyagokat szekretáló egyéb hibridómák izolálhatok antiidiotípus-szűréses technika alkalmazásával [Potocmjak és munkatársai: Science 215, 1637 (1982)]. Röviden, antiidiotípus-ellenanyagnak olyan ellenanyagot nevezünk, amelyik a kérdéses klón által termelt ellenanyagon jelen levő egyedi determinánsokat ismer fel. Antiidiotlpus-ellenanyagot úgy állíthatunk elő, hogy a monoklonális ellenanyag forrásául szolgáló fajhoz tartozó állatot a kérdéses monoklonális ellenanyaggal immunizálunk. Az immunizált állat az immunizálásra felhasznált ellenanyag idiotípusdeterminánsait felismeri, és azokra a fenti idiotlpusdeterminánsokkal szembeni ellenanyagok (antiidiotípus-ellenanyagok) termelődésével válaszol.

Replikáció céljából a hibridsejtek in vitro vagy ín vivő tenyészthetők. A magas in vivő termelődés miatt előnyösen ez utóbbi eljárást alkalmazzuk. Röviden, az egyes hibridtörzsekből származó sejteket intraperitoneálisan (hasüregbe), lökésszerűen pristane-nal kezelt Balb/c-egerekbe injektáltuk, hogy a kívánt monoklonális ellenanyagot magas koncentrációban tartalmazó aszciteszfolyadékot nyerjünk. IgM- vagy IgG-izotípusba tartozó monoklonális ellenanyagokat a tenyészet felülúszójából szakember számára jól ismert oszlopkromatográfiás eljárásokkal tisztíthatunk.

A találmány szerinti ellenanyagok különösen megfelelnek immunvizsgálati eljárásokban történő alkalmazás céljára, amelyekben azokat folyékony fázisban használjuk, vagy szilárd fázisú hordozóhoz kötjük. Az említett immunvizsgálati eljárásokban használt ellenanyagokat ezenkívül különböző módon jelölhetjük, hogy azok kimutathatóak legyenek.

A technika állása szerint számos különböző jelölőanyag és eljárás alkalmazható jelölésre. A találmány szerinti megvalósítási módokban alkalmazható jelölőanyag-típusok, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, például a felsoroltak: enzimek, radioizotópok, fluoreszcens vegyületek, kemilumineszcens vegyületek, biolumineszcens vegyületek és fémkelátok. Szakember számára ellenanyaghoz köthető más alkalmas jelölőanyagok is ismertek, vagy rutinszerű kísérletekkel képes ilyent kifejleszteni. Továbbá ezeknek a jelölőanyagoknak ellenanyagokhoz történő kötését szakember számára jól ismert standardtechnikák alkalmazásával végezhetjük.

A találmány szerinti ellenanyagok kimutatható módon jelölhetők például oly módon, hogy az ellenanyagokat enzimhez kötjük. Ez az enzim viszont, amikor azt később szubsztrátjával érintkeztetjük, reagálni fog a szubsztráttal úgy, hogy olyan kémiai csoport keletkezzen, amelyik például spektrofotometriás vagy fluorometriás eljárással kimutatható. Ellenanyagok kimutatható módon történő jelölésére alkalmazható enzimek például a felsoroltak: malát dehidrogenáz, staphylococcus nukleáz, delta-V-szteroid izomeráz, élesztő alkohol-dehidrogenáz, alfa-glicerofoszfát dehidrogenáz, trióz-foszfát izomeráz, biotin-avidin peroxidáz, torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz, aszparagináz, glükóz oxidáz, β-galaktozidáz, ribonukleáz, ureáz, kataláz, glükóz-6-foszfát dehidrogenáz, glükoamiláz, valamint acetil-kolin észteráz.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk úgy is, hogy az ellenanyagokat radioaktív izotóppal jelöljük, melyet azután gamma-számláló vagy szcintillációs számláló alkalmazásával határozunk meg. A találmány szerinti célra különösen alkalmas izotópok a felsoroltak: ³H, ¹²⁵l, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶CI, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe és ⁷⁵Se.

Kimutatható módon jelölt ellenanyagok jelenlétét kimutathatjuk továbbá úgy is, hogy az ellenanyagokat fluoreszcens vegyülettel jelöljük. Amikor a fluoreszcens anyaggal jelölt ellenanyagot megfelelő hullámhosszú fénynek tesszük ki, az ellenanyag jelenlétét a festék fluoreszcenciája alapján mutathatjuk ki. A leggyakrabban használt fluoreszcens jelölőanyagok a felsoroltak: fluoreszcein izotiocianát, rodamid, fikoeritrin, fikocianin, allofikocianin, o-ftaldehid és fluoreszkamin.

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá fluoreszcenciát kibocsátó fémekkel, mint például ¹⁵²Eu-val vagy a lantánsorozat egyéb tagjaival. Ezek a fémek az ellenanyag-molekulához olyan fémkelátorcsoportok alkalmazásával kapcsolhatók hozzá, mint például dietil-enteriamin-pentaecetsav (DTPA) vagy etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA).

A találmány szerinti ellenanyagokat kimutatható módon jelölhetjük továbbá úgy, hogy azokat kemilumineszcens vegyülethez kapcsoljuk. A kemilumineszcens vegyülettel ellátott ellenanyag jelenlétét ezután lumineszcencia kimutatásával határozhatjuk meg, amely a kémiai reakció során keletkezik. A találmány szerinti célra különösen alkalmas kemilumineszcens jelölőanyagok a felsoroltak: luminal, izoluminol, theromatik akridinium-észter, imidazol, akridiniumsók, oxalát-észter és dioxetán.

Hasonlóképp, a találmány szerinti ellenanyagokat jelölhetjük biolumineszcens vegyülettel. A biolumineszcencia a kemilumineszcenciának biológiai rendszerekben található típusa, melyben egy katalitikus protein fokozza a kemilumineszcens reakció hatékonyságát. A biolumineszcens ellenanyag jelenlétét lumineszcen9

HU 225 688 Β1 cia kimutatásával határozzuk meg. Jelölésre felhasználható jelentősebb biolumineszcens vegyületek az alábbiak: luciferin és luciferáz-aequorin.

A találmány szerinti ellenanyagok és lényegében tisztított antigének ideálisan megfelelnek vizsgálati reagenskészlet előállítására. Ilyen vizsgálati reagenskészlet tartalmazhat rekeszekre osztott hordozóeszközt, hogy azokba szorosan egy vagy több tartályt, például üvegcséket, csöveket és hasonlókat lehessen helyezni, és az említett tartályok mindegyike a vizsgálati eljárásban alkalmazandó egyes elemeket tartalmaz.

Vizsgálati reagenskészlet formájában számos típusú vizsgálati eljárás kivitelezhető, azok lehetnek például kompetitív és nem kompetitív vizsgálati eljárások. A találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók például az alábbi tipikus vizsgálati eljárásokban: radioimmunvizsgálati eljárások (RIA), enzim-immunvizsgálati eljárások (EIA), enzimhez kötött immunszorbens vizsgálati eljárások (ELISA), valamint immunometriás vagy szendvics-immunvizsgálati eljárások.

Az „immunometriás vizsgálati eljárás” vagy „szendvics-immunvizsgálati eljárás kifejezés vonatkozik szimultán-szendvics, „forward’-szendvics és reverzszendvics immunvizsgálati eljárásokra. Ezek a kifejezések szakember számára jól ismertek. Szakember számára nyilvánvaló az is, hogy a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazhatók jelenleg ismert vagy a jövőben kifejlesztendő vizsgálati eljárások egyéb variációiban és formáiban is. Az utóbbiak szintén a találmány tárgyát képezik.

A találmány szerinti vizsgálati eljárások kivitelezésének egy előnyös módja szerint lényeges, hogy az inkubációs közegben bizonyos „blokkolóanyagok” legyenek jelen (melyeket rendszerint a jelölt, oldható ellenanyaggal együtt adunk a vizsgálati mintához): A „blokkolóanyagokat” abból a célból adjuk a mintához, hogy a nemspecifikus proteinek, proteázok vagy a kísérleti mintában található, egér-immunglobulinellenes humán ellenanyagok ne létesítsenek keresztkötéseket a szilárd fázisú hordozón található ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák, vagy ne létesítsenek keresztkötéseket a radioaktívan jelölt indikátor-ellenanyagokkal, és azokat ne károsítsák: ellenkező esetben tévesen pozitív vagy tévesen negatív eredményeket kaphatnánk. „Blokkolóanyagok” választása tehát jelentősen hozzájárul a találmány szerinti vizsgálati eljárások specifitásához.

Azt találtuk, hogy számos, a vizsgálati eljárásokban felhasználtakkal megegyező osztályba vagy alosztályba (izotlpusba) tartozó, oda nem tartozó (azaz más specifitással rendelkező) ellenanyag (azaz lgG_1t lgG_2a, IgM stb.) alkalmazható „blokkolóanyagként”. Lényeges a „blokkolóanyagok” koncentrációja (általában 1-100 pg/pl), hogy a megfelelő érzékenység fenntartása mellett megakadályozzunk minden nem kívánt gátlást, melyet a humán szérumban egyidejűleg előforduló, keresztreagáló proteinek okozhatnak. Továbbá a „blokkolóanyagokat” tartalmazó pufferrendszert optimalizálnunk kell. Előnyös pufferek gyenge szerves savak fiziológiás tartományban történő alkalmazásán alapulnak, ilyenek például a következők: imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS és hasonlók. Valamivel kevésbé előnyösen alkalmazható pufferek szervetlen pufferek, például foszfát-, borát- vagy karbonátpufferek. Végül a „blokkolóanyagokat” tartalmazó pufferhez előnyösen ismert proteázinhibitorokat adunk (általában 0,01-10 pg/ml koncentrációban).

Számos szilárd fázisú immunadszorbens létezik, melyet alkalmaztak, és amely a találmány szerinti megvalósítási módokban alkalmazható. Jól ismert immunadszorbensek például a felsoroltak: üveg, polisztirén, polipropilén, dextrán, nejlon és egyéb anyagok, melyek alkalmazhatók ilyen anyagból álló vagy ilyen anyagokkal bevont csövek, gyöngyök, mikrotitrálólemezek és hasonlók formájában. Az immobilizált ellenanyagokat kovalensen vagy fizikai módon a szilárd fázisú immunadszorbenshez köthetjük, például egy amid- vagy észterkötésen keresztül létrejövő kovalens kötés létrehozásával, vagy abszorbcióval. Szakember számára számos egyéb alkalmas szilárd fázisú immunadszorbens és ellenanyagoknak azokon történő immobilizálására szolgáló eljárás ismert, vagy csupán rutinkísérletek során képes ilyenek kifejlesztésére.

In vitro, in vivő vagy in situ diagnózis céljára jelölőanyagokat, például radionuklidokat közvetlenül vagy egy közti funkcionális csoporton keresztül köthetünk a találmány szerinti ellenanyagokhoz. Fémkationokként létező radioizotópok ellenanyagokhoz történő kötésére gyakran használt közticsoport például a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA). Ily módon kötést létesítő tipikus fémkationok például a felsoroltak: ^99mTc, ¹²³l, ¹¹¹IN, ¹³¹l, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, valamint ⁶⁸Ga. A találmány szerinti ellenanyagokat diagnosztikai célból jelölhetjük nem radioaktív izotópokkal is. Ily módon különösen előnyösen alkalmazható elemek a felsoroltak: ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Crés ⁵⁶Fe.

A találmány szerinti antigének lényegében tiszta formában izolálhatok a találmány szerinti ellenanyagok alkalmazásával. A találmány tárgyát képezi tehát lényegében tiszta Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra; az említett antigéneket az jellemzi, hogy azokat a találmány szerinti ellenanyagok felismerik és azokhoz kötődnek. A találmány tárgyát képezik továbbá a receptorkiméra-antigén izolálására vagy tisztítására szolgáló eljárások, amely eljárások szerint az említett antigén egy vagy több, a receptorkiméra ellen termelődött ellenanyaggal komplexet képez.

A találmány szerinti, lényegében tiszta T-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra-antigének viszont alkalmazhatók mintában, például szérumban vagy vizeletben a kiméra ellen irányuló ellenanyagok kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására. A találmány tárgyát képezik tehát mintában, Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-kiméra-antigénnel szemben irányuló ellenanyagok jelenlétének kimutatására vagy azok mennyiségének meghatározására szolgáló eljárások, mely eljárások szerint a kiméraantigénnel szemben ellenanyagot tartalmazó mintát kimutatható módon jelölt receptorkimé10

HU 225 688 Β1 rával érintkeztetjük, és a jelölőanyagot kimutatjuk. Világos, hogy alkalmazhatók a kiméra immunreaktív frakciói vagy immunreaktív analógjai is. „Immunreaktív frakciónak nevezzük a kiméraantigén minden olyan részét, amely a receptorkiméra ellen irányuló ellenanyaggal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt ad. „Immunreaktív analógoknak” olyan proteineket nevezünk, amelyek a receptorkiméra-proteintől egy vagy több aminosav vonatkozásában eltérnek, de amelyek a találmány szerinti ellenanyagokkal a receptorkimérával megegyező mértékű immunválaszt adnak.

„Specifikus módon felismer és kötődik” kifejezés alatt azt értjük, hogy az ellenanyag felismeri a kímérareceptor-polipeptidet, és ahhoz kötődik, de lényegében nem ismer fel a mintában, például biológiai mintában található egyéb, az adott ellenanyagokkal kapcsolatban nem levő molekulákat, és azokhoz nem kötődik.

„Autoimmun sejtnek” olyan sejteket nevezünk, amelyek a gazdaszervezet szöveteivel szemben ellenanyagokat termelnek, vagy autoreaktív immuneffektor T-sejteket termelnek; ilyen sejtek termelhetnek például acetil-kolin-receptorral szembeni ellenanyagokat (amely például myasthenia gravis kialakulásához vezet), vagy anti-DNS, antieritrocita, antivérlemezke ellenanyagokat (amely például lupus erythematosus kialakulásához vezet).

„Terápiás sejteknek” olyan sejteket nevezünk, amelyeket a találmány szerinti kimérával transzformáltunk úgy, hogy azok képesek meghatározott fertőző ágens, meghatározott fertőző ágenssel fertőzött sejt, tumoros sejt vagy rákos sejt, vagy autoimmun sejt felismerésére és elpusztítására; a fenti terápiás sejtek előnyösen vérképzőrendszeri sejtek.

„Célzott fertőző ágensnek nevezünk minden olyan fertőző ágenst (például vírust, baktériumot, protozoont vagy gombát), amelyet kimérareceptor-hordozó terápiás sejtek képesek felismerni. „Célzott sejtnek nevezünk minden olyan gazdasejtet, amelyet kimérareceptort hordozó terápiás sejtek képesek felismerni; célzott sejtek lehetnek - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vírussal, baktériummal, protozoonnal vagy gombával fertőzött gazdasejtek, valamint tumoros vagy rákos sejtek és autoimmun sejtek.

„Extracelluláris” kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a sejtfelszínen található. „Intracelluláris kifejezésen azt értjük, hogy a molekula legalább egy része a terápiás sejt citoplazmájával érintkezik. A „transzmembrán kifejezés arra vonatkozik, hogy a molekula legalább egy része átszeli a plazmamembránt. A leírás szerint egy „extracelluláris rész, „intracelluláris rész” vagy „transzmembránrész tartalmazhat olyan határoló aminosavszekvenciákat, melyek szomszédos sejtterekbe nyúlnak át.

„Oligomerképzés” kifejezés alatt más proteinekkel történő komplexképzést értünk úgy, hogy dimerek, trimerek, tetramerek keletkezzenek vagy egyéb, több elemből álló oligomer jöjjön létre. Ilyen oligomerek lehetnek homooligomerek, vagy heterooligomerek. „Oligomerképző résznek nevezzük egy molekula azon részét, amely a komplexképződést (azaz az oligomerképződést) irányítja.

„Citolitikusnak” nevezünk valamit, ha az képes sejtek (például kórokozóval fertőzött sejt, tumoros vagy rákos sejt vagy autoimmun sejt) elpusztítására, vagy képes egy fertőző ágens (például vírus) elpusztítására.

„Immundeficiencia-vírusnak” olyan retrovírust nevezünk, amely vad típusú formában képes főemlős gazdaszervezet T4-sejtjeinek fertőzésére, és amelyet a lentivírusok alcsaládjának vírusmorfogenezise jellemez, és annak morfológiai sajátságaival rendelkezik. A kifejezés - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - vonatkozik a HÍV- és SIV-vírusok valamennyi variánsára, ezen belül a HIV-1-, HIV-2-, SIVmac-, SIVagm-, SlVmnd-, SlVsmm-, SlVman-, SIVmand- és SlVcpz-vírusokra.

„MHC-independens” kifejezésen azt értjük, hogy a celluláris citolitikus válasz létrejöttéhez nincs szükség a célzott sejt felszínén II. osztályba tartozó MHC-antigén jelenlétére.

„Funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származéknak” olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékokat nevezünk, amelyek a vad típusú molekula biológiai aktivitásának legalább 10%-ával, előnyösen 40%-ával, még előnyösebben 70%-ával és legelőnyösebben legalább 90%-ával rendelkeznek. Egy „funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származék” a leírásban használt értelemben kifejtheti hatását közvetlenül, jelezve a terápiás sejtnek, hogy a receptorhoz kötődött ágenst vagy sejtet el kell pusztítania (például egy intracelluláris kimérareceptor-részlet esetében), vagy kifejtheti hatását közvetve, oly módon, hogy elősegíti a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukciós proteinjeivel történő oligomerizálódást (például egy transzmembrándomén esetében). Ilyen származékok hatékonyságát például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal tesztelhetjük.

„HIV-burokhoz kötődő funkcionális származéknak” nevezünk minden olyan (fentiekben definiált) funkcionális származékot, amelyik képes valamely HlV-burokproteinhez kötődni. Funkcionális származékokat például a leírásban ismertetett in vitro vizsgálati eljárásokkal azonosíthatunk.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti transzformált sejtek terápiás alkalmazásának lehetőségét.

A találmány szerinti transzformált sejtek számos betegség terápiájában alkalmazhatók. Ilyen transzformált sejtek beadására jelenleg ismert eljárások például az adoptív immunterápiás eljárás vagy a sejttranszfer-terápia. Ezek az eljárások lehetővé teszik transzformált immunrendszeri sejtek visszajuttatását a vérkeringésbe [Rosenberg.: Sci. Am. 62, (1990. május); Rosenberg és munkatársai: New Engl. J. Med. 323, 570 (1990)].

A találmány szerinti gyógyászati készítmények bármely olyan állatnak beadhatók, amelyekben a találmány szerinti vegyületek előnyös hatást fejtenek ki. Az említettek közül - anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk - azok elsősorban embernek adhatók be.

HU 225 688 Β1

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

Először a csatolt ábrákat ismertetjük.

Az 1. ábra a CD4-fragmens (1-369. aminosavak) és különböző receptorláncok közti fúzió helyének aminosavszekvenciáját mutatja (28-31. azonosító számú szekvenciák). Az aláhúzott szekvencia a fúzió létrehozására felhasznált BamHI-hely által kódolt aminosavak pozícióját jelöli. A transzmembrándomén kezdetét függőleges oszloppal jelöltük. Az η-szekvencia az aminoterminális végen megegyezik a ξ-lánc szekvenciájával, de a karboxiterminális végen attól eltér [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319(1990)].

Az 1b. ábra CD4, Οϋ4:ξ CD4:y és Οϋ4:η sejtfelszíni expresszálódásának áramlásos citometriás („flow-citometriás) analízisét szemlélteti CV1-sejtekben. A sejteket CD4-kimérákat vagy CD16_Prt expresszáló vírusokkal fertőztük, 9 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd fikoeritirinnel konjugált, Leu3A jelű, anti-CD4 Mab-bal (monoklonális ellenanyaggal) festettük.

A 2. ábra CD16_TM sejtfelszíni expresszálódását ábrázolja, csak CD16_TM-mel (sűrű pontozás), vagy ezenfelül CD4:y-t (szaggatott vonal) vagy CD4^-t (folyamatos vonal) expresszáló vírussal történő fertőzést követően. A ritka pontozás csak CD4:£-val fertőzött sejteket jelöl, amelyeket 3G8-ellenanyaggal festettünk [Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982)] (anti-CD16-Mab).

A 3. ábra CD16_TM sejtfelszíni expresszálódását ábrázolja CD16_TM-et és a következő ξ-kimérákat expresszáló vírusokkal történő együttes fertőzést követően: Οϋ4:ξ (vastag vonal), CD4:%-C11G (folyamatos vonal), Οϋ4:ξ (szaggatott vonal), CD4^-C11G/D15G (sűrű pontozás); társfertőzés nélkül (csak CD16_tm; ritka pontozás). A sejteket 3G8 jelű anti-CD16 monoklonális ellenanyaggal, majd egér-lgG-vel szemben kecskében termelt, fikoeritrinnel konjugált F(ab’)₂-ellenanyaggal inkubáltuk. A ξ-kimérák expresszálódásának szintje a különböző vizsgált mutánsok esetében lényegében megegyezett, a sejtek CD16_TM-et és ξ-kimérákat expresszáló vírusokkal történő együttes fertőzése nem változtatta meg észrevehető mértékben a kimérák sejtfelszíni expresszálódását.

A 4a-d. ábrák az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráció emelkedését ábrázolják T-sejtekben, mutáns ξ-kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. Jurkat-féle E6-sejteket [Weiss és munkatársai: J. Immunoi. 133, 123 (1984)] rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, és áramlásos citometriával analizáltunk. A bemutatott eredmények a kapuzott („gated”) CD4⁺-populációt képviselik úgy, hogy csak a kérdéses kiméraproteint expresszáló sejteket analizáltuk. Az lndo-1-fluoreszcencia violából kékké történő változásának átlagos aránya az intracelluláris szabad kalciumion-koncentráclót tükrözi a teljes populációban, a válaszreakciót adó sejtek százalékos aránya pedig a sejtek azon frakciójának felel meg, amelyek egy előre meghatározott küszöbértéknek megfelelő arányt túlléptek (az utóbbit úgy állapítottuk meg, hogy e szerint a kezeletlen sejtek 10%-a volt pozitívnak tekinthető). A 4a. és 4b. ábrán ΟΟ4:ξ- (folyamatos vonal) vagy CD16^-kimérákat (szaggatott vonal) expresszáló Jurkat-sejtek vizsgálatával kapott eredményeket ábrázoltunk; a sejteket Leu3A jelű (fikoeritrinnel konjugált) anti-CD4 monoklonális ellenanyaggal érintkeztettük, majd az utóbbiak között kecskében, egér-lgG-vel szemben termelt ellenanyaggal keresztkötéseket hoztunk létre. A pontozott vonal nem fertőzött sejtek válaszreakcióját mutatja OKT3 jelű anti-CD3-MAb hozzáadására. A 4c. és 4d. ábra a 4a. és 4b. ábránál ismertetettekkel azonos módon kezelt és analizált, CD4^D15G- (folyamatos vonal), CD4^C11G/D15G- (szaggatott vonal) vagy CD4:£C11G- (pontozott vonal) kimérákat expresszáló Jurkat-sejtek eredményeit ábrázolják.

Az 5a-c. ábrák azt szemléltetik, hogy a Οϋ4:ξ-, Οϋ4:η- és CD4:y-receptorok képessé teszik a citolitikus T-limfocitákat (CTL-eket) HIV1-gp120/41-antigént expresszáló célsejtek elölésére. 5a. ábra: sötét karikák: gp120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4^-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: nem fertőzött HeLa-sejtekkel inkubált, CD4:£-t expresszáló CTL-ek; sötét négyzetek: gp 120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek; üres négyzetek: nem fertőzött HeLa-sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek. 5b. ábra: sötét karikák: gp120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4^-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: gp 120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4:y-t expresszáló CTL-ek; üres négyzetek: gp120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4:£-C11G/D15G kettős mutáns CD4^-kimérát expresszáló CTL-ek. 5c. ábra: az 5b. ábra szerinti CTL-ek CD4-expressziójának áramláscitometriás analízise. A célsejt/effektorsejt arány korrekciója céljából a CD4-kimérákat

HU 225 688 Β1 expresszáló sejtek százalékos arányát úgy határoztuk meg, hogy hisztogram szuperpozícióval kivontuk a negatívnak minősített (nem fertőzött) populációt; ezen az ábrán az összehasonlíthatóság céljából a nem fertőzött sejteknek egy önkényes küszöbértéket adtunk, melynek alkalmazásával az egyéb sejtpopulációk esetében a sejtek körülbelül ugyanolyan arányban bizonyulnak pozitívnak, mint a hisztogram szuperpozíciós módszer szerint.

A 6a-b. ábrák a CD4 irányította citolízis specifitását mutatják. 6a. ábra: sötét karikák: CD16p|-t expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4'4-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: gp120-t expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD4-t expresszáló CTL-ek; sötét négyzetek: gp120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD16^-t expresszáló -CTL-ek; üres négyzetek: gp120/41-antigént expresszáló HeLa-sejtekkel inkubált, CD16_P|-t expresszáló CTL-ek. 6b. ábra: sötét karikák: Raji- (MHC-ll⁺-osztályú) sejtekkel inkubált, CD4^-t expresszáló CTL-ek; üres karikák: RJ2.2.5- (MHC-II^- Raji mutáns) sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-sejtek; sötét négyzetek: Raji(MHC-H⁺-osztályú) sejtekkel inkubált, nem fertőzött CTL-ek; üres négyzetek: RJ2.2.5(MHC-II^- Raji mutáns) sejtekkel inkubált, CD4^-t expresszáló CTL-ek. Az ordináta beosztását elnyújtottuk.

A 7a-b. ábrák a CD16^-kiméra-receptor jellemzését mutatják. A 7a. ábrán a CD16^ fúziós protein vázlatos ábrázolása látható. A monomer CD16 foszfatidil-inozitol-kötött formájának extracelluláris részét dimer ξ-lánchoz kapcsoltuk, a transzmembrándoméntól közvetlenül externálisan. Az ábra alján jelöltük a fúzió helyén létrejött proteinszekvenciát (32. és 33. azonosító számú szekvenciák). A 7b. ábra a kalciummobilizáció áramlásos citometriás meghatározásának eredményeit mutatja TCR-pozitív, valamint TCR-negatív sejtvonalakban, a CD16^-kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. Az ábrán „0” időpontban ellenanyagokkal kezelt sejtpopulációk esetében a kibocsátott fluoreszcencia violából kékké történő változásának átlagos arányát ábrázoltuk (amely a relatív kalciumion-koncentrációt tükrözi). Sötét négyzetek: Jurkat-sejtek válaszreakciója OKT3 jelű anti-CD3MAb-ra; sötét háromszögek: CD16^-kimérák által kiváltott válaszreakció a 3G8 jelű anti-CD16-MAb-bal történő keresztkötések létrehozására REX33A jelű TCR^- mutáns sejtvonalban; üres négyzetek: CD16^-kimérák közti keresztkötések létrehozására adott válaszreakció JRT3.T3.5 jelű, Jurkat-féle TCR^- mutáns sejtvonalban; üres háromszögek: CD16^-keresztkötések létrehozására adott válaszreakció Jurkat-sejtekben; keresztek: nem kiméra CD16-ra adott válaszreakció Jurkat-sejtekben; pontok: nem kiméra CD16-ra adott válaszreakció a REX33A jelű, TCR^- mutáns sejtvonalban.

A 8a-b. ábrák a citolitikus képesség analízisének eredményeit ábrázolják deléciók létrehozását követően. A 8a. ábra a ξ-deléció végpontjainak helyét mutatja. Amint azt máshol is, a ξ-láncban létrehozott mutációkat a következőképp jelöltük: eredeti aminosav egyezményes jele - pozíció - mutáns aminosav egyezményes jele; a D16* például azt jelenti, hogy a 66. pozícióban található Asp-aminosavat terminációs kodon helyettesíti. A 8b. ábra deléciót nem hordozó CD16^-kiméra, valamint „csendes (kimutatható következménnyel nem járó) ξ-deléciók citolitikus vizsgálata során kapott eredményeket mutat. CD16-antigénnel szemben felületi ellenanyagokat expresszáló hibridómasejteket ⁵¹Cr-mal telítettünk, és azokat CD16^-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött, humán citolitikus limfociták (CTL-ek) növekvő mennyiségével inkubáltuk. A ⁵¹Cr-felszabadulás százalékos arányát az effektorsejt (CTL)/célsejt (hibridómasejt) arány („effector/target”, e/t) függvényében ábrázoltuk. Sötét karikák: CD16^-kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis („mean fluorescence intensity”, átlagos fluoreszcenciaintenzitás; mfi: 18,7); sötét négyzetek: ΰϋ16:ξAsp66*-kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 940,2); üres négyzetek: CD16^-Glu60*-kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 16,0); üres karikák: CD16^-Tyr51*-kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 17,4); sötét háromszögek: ϋϋ16:ξPhe34*-kimérákat expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 17,8); üres háromszögek: nem kiméra CD 16-ot expresszáló sejtek által közvetített citolízis (mfi: 591). Bár ebben a kísérletben a CD16.^Asp66*-kiméra expressziójának mértékét nem hasonlítottuk össze a többi fúziós protein expressziójának mértékével, ugyanebben a kísérletben a CD16:£-t azonos szinten expresszáló sejtek által közvetített citolízis eredménye lényegében megegyezett a CD16^-Asp66-kimérát expresszáló sejtek eredményével.

A 9a-d. ábrák azt szemléltetik, hogy a transzmembrán-kölcsönhatások létrehozására való képesség megszüntetésével egy olyan rövid ξ-szegmenst sikerült azonosítani,

HU 225 688 Β1 amely képes citolízis közvetítésére.

A 9a. ábrán monomer, két részből álló és három részből álló kimérák vázlatos ábrázolása látható. Az ábra felső részén azt a CD16^-konstrukciót látjuk, amely a 65. 5 aminosavpozíciótól kezdve csonka, és amelyből a transzmembrán Cys- és Asp-aminosavak hiányoznak. Ez alatt a CD16:CD5^-, CD16:CD7^-konstrukciókat és a megfelelő kontrollokat ábrázoltuk. Az 10 intracelluláris doménok peptidszekvenciája az ábra alján található (35-37. azonosító számú szekvenciák). A 9b. ábra monomer, kiméra deléciós mutánsok citolitikus aktivitását szemlélteti. A CD16^-konstrukciót 15 expresszáló sejtek citolitikus aktivitását (sötét karikák, mfi: 495) összehasonlítottuk CD16^-Asp66*-kimérát expresszáló sejtek citolitikus aktivitásával (sötét négyzetek, mfi: 527), vagy a CD16CDCys11Gly/Asp15- 20 Gly/Asp66*- (üres négyzetek, mfi: 338) és a CD 16CDCys11 Gly/Asp15Gly/Glu60*- (sötét háromszögek, mfi: 259) mutánsokat expresszáló sejtek aktivitásával. A 9c. ábra három részből álló fúziós proteinek által 25 közvetített citolitikus aktivitást ábrázol. Sötét háromszögek: CD16n>Asp66*; üres négyzetek: CD16:5üO (48-65); sötét négyzetek: CD16:7CD (48-65); üres háromszögek: CD16:7QO(48-59); üres karikák: 30 CD16:5; sötét karikák: CD16:7. A 9d. ábra mutáns és három részből álló kimérák által JRT.3T3.5 jelű, TCR-negatív Jurkat-sejtvonalban létrehozott kalciummobilizációt ábrázol. Üres karikák: dimer CD16Ü0- 35 Asp66*-t expresszáló sejtek válaszreakciója; sötét négyzetek: CD16m-Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*-kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója; üres négyzetek: CD16mCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*-kirné- 40 rát expresszáló sejtek válaszreakciója; sötét háromszögek: CD16:7ün- (48-65) kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója; üres háromszögek: CD16üü- (48-59) kimérát expresszáló sejtek válaszreakciója. 45 A 10a-f. ábrák azt mutatják, hogy az egyes aminosavak mennyiben járulnak hozzá a 18 aminosavból álló, citolitikus szignáltranszdukciós elem aktivitásához. A 10a. és 10b. ábra citolitikus aktivitást ábrázolnak, a 50 10c. és 10d. ábra pedig a karboxiterminális tirozin (Y62) közelében pontmutációkat hordozó kimérák által közvetített kalciumion-mobilizációt szemléltetik. A 10a. és 10b. ábra a CD16üü fúziós proteineket kis 55 és nagy mennyiségben expresszáló sejtek vizsgálatával kapott adatokat mutatják.

A kalciummobilizációs és a citolitikus vizsgálati eljárás esetében azonos szimbólumokat alkalmaztunk, azokat egybetűs kó- 60 dokkal, a jobb oldalon jelöltük. Sötét karikák: CD16-ot expresszáló sejtek (mfi az

a. ábrán: 21; a b. ábrán: 376); sötét négyzetek: CD16:7Cn-(48-65)-kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 31; a b. ábrán: 82); üres négyzetek: CD16:7CD-(48-65)Glu60Gln-kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 33; a b. ábrán: 92); keresztek: CD16:7on-(48-65)-Asp63Asn-kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 30; a

b. ábrán: 74); sötét háromszögek: CD16:7nn-(48-65)-Tyr62Phe-kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 24; a b. ábrán: 88); üres karikák: CD16:7Cü(48-65)-Glu61Gln-kimérát expresszáló sejtek (mfi az a. ábrán: 20; a b. ábrán: 62); üres háromszögek: CD16:7üü-(48-65)Tyr62Ser-kimérát expresszáló sejtek (mfi a b. ábrán: 64). A 10d. és 10e. ábra citolitikus aktivitást ábrázolnak, a 10f. ábra pedig az aminoterminális tirozin (Y51) közelében pontmutációkat hordozó kimérák által közvetített kalciumion-mobilizációt szemléltetik. A kalciummobilizációs és a citolitikus vizsgálati eljárások esetében azonos szimbólumokat alkalmaztunk, azokat a jobb oldalon jelöltük. Sötét karikák: CD16-ot expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 21,2; az E. ábrán: 672); sötét négyzetek: CD16:7üQ(48-65)-kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 31,3; az E. ábrán: 179); sötét háromszögek: CD16:7an-(48-65)-Asn48Ser-kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 22,4; az E. ábrán: 209); üres négyzetek: CD16:7CD-(48-65)-Leu50Ser-kimérát expresszáló (mfi a d. ábrán: 25,0; az E. ábrán: 142); üres háromszögek: CD 16:700(48-65)-Tyr51Phe-kimérát expresszáló sejtek (mfi a d. ábrán: 32,3; az E. ábrán: 294).

A 11a-b. ábrák a ξ-lánc belső ismétlődő egységeinek összevetését, valamint azok azon képességének összehasonlítását mutatják, hogy mennyiben képesek citolízis létrejöttének elősegítésére. A 11a. ábrán olyan kimérák vázlatos ábrázolása látható, amelyeket úgy állítottunk elő, hogy a ξ-lánc intracelluláris doménját három részre osztottuk, majd azokat CD16:7-kiméra transzmembrándoménjához kapcsoltuk. Az intracelluláris doménok szekvenciáját az ábra alján jelöltük (38-40. azonosító számú szekvenciák); a közös aminosavakat bekereteztük, az egymással rokonságban álló aminosavakat pedig csillaggal jelöltük. A 11b. ábra a három ξ-szubdomén citolitikus képességét mutatja. Sötét karikák: CD16OO-t expresszáló sejtek (mfi: 476); sötét négyzetek: CD16:700(33-65) (mfi: 68); üres négyzetek: CD16:700-(71-104) (mfi: 114); sötét háromszögek: CD16:700-(104-138) (mfi: 104).

HU 225 688 Β1

A 12. ábrán CD16:FcRyll-kimérák vázlatos ábrázolása látható.

A 13a-b. ábrák kalciummobilizációs vizsgálat eredményeit mutatják CD4:FcRyll-kimérák és CD16:FcRyll-kimérák közti keresztkötések létrehozását követően. A 13a. ábrán a kalciumszenzitív indo-1-fluorofórral feltöltött sejtek által kibocsátott fluoreszcencia violából kékké történő változásának arányát ábrázoltuk az idő függvényében, miután a CD 16 extracelluláris doménjai közt ellenanyagokkal keresztkötéseket hoztunk létre. A 13b. ábrán az előzőhöz hasonló analízis során, CD4:FcRyll-kimérákat hordozó sejtek által kibocsátott fluoreszcencia violából kékké történő átmenete arányának növekedését ábrázoltuk, ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően.

A 14a-b. ábrákon CD4:FcRgll-kimérákat és CD16:FcRgll-kimérákat expresszáló sejtekkel végzett citolízisvizsgálat eredményeit ábrázoltuk. A 14a. ábra anti-CD16-hibridóma sejtekből (célsejtekből) felszabaduló ⁵¹Cr százalékos arányát mutatja, miután a sejteket növekvő mennyiségű, CD16:FcRgll-kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfocitával (effektorsejtekkel) érintkeztettük. A 14b. ábra CD4:FcRgll-kimérák által közvetített citotoxicitás analízisét ábrázolja HIV-burokglikoproteineket expresszáló célsejtekkel szemben, a vizsgálatot az előzőhöz hasonló módon végeztük.

A 15a-e. ábrákon az FcRyll-A-végződésen belül a citolízis szempontjából lényeges aminosavak azonosításának eredményét ábrázoltuk. A 15a. ábrán a deléciós konstrukciók vázlatos ábrázolása látható. A 15b. és 15c. ábrán CD16:FcRYll-A-kimérák karboxiterminális deléciós variánsaival végzett kalciummobilizációs vizsgálat és citolízis vizsgálat eredményeit mutatjuk be. A 15d. és 15e. ábrán a CD16:FcRyII-A intracelluláris részének aminoterminális végéből fokozatosan kevesebbet tartalmazó, három részből álló kimérákkal végzett kalciummobilizációs vizsgálat és citolízisvizsgálat eredményeit ábrázoltuk,

A 16. ábra (24. azonosító számú szekvencia) a CD3 delta-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 17. ábra (25. azonosító számú szekvencia) a T3-gamma-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 18. ábra (26. azonosító számú szekvencia) az mb1 -receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

A 19. ábra (27. azonosító számú szekvencia) a B29-receptorprotein aminosavszekvenciáját ábrázolja; a bekeretezett szekvencia előnyös citolitikus szignáltranszdukciós részt jelöl.

1. példa

Humán lgG1:receptorkimérák előállítása Humán IgG 1 nehéz lánc szekvenciákat úgy állítottunk elő, hogy a C_H3-doménban található szekvenciákat az ellenanyag-mRNS transzmembrán formájának 3'-végóből származó cDNS-fragmenshez kapcsoltuk. A 3’-végi fragmenst polimeráz-láncreakciós eljárással, szubsztrátként tonsilla cDNS-génkönyvtár felhasználásával, a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotidok alkalmazásával kaptuk meg:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (7. azonosító számú szekvencia), valamint

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (8. azonosító számú szekvencia), amelyek megfeleltek a kívánt DNS-fragmens 5’- és 3’-végének. Az 5’-végi oligonukleotid komplementer a humán lgG1 Cn1-doménjában található hellyel, a 3'-végi oligonukleotid pedig komplementer a membránt átszelő domént kódoló szekvenciától közvetlenül 5'irányban található hellyel. A PCR-terméket BstXI- és BamHI-enzimekkel emésztettük, majd egy variábilis és konstans régiókat hordozó, félszintetikus IgG 1-ellenanyag-gén BstXI és BamHI hasítási helyei közé ligáltuk. A BstXI-BamHI-fragmens inszertálását követően a konstrukció amplifikált részeit a C_H3-doménban található Smal hasítási helyig bezárólag restrikciós fragmens cserével helyettesítettük úgy, hogy csak a Smal-hely és a 3’-oligonukleotid közti rész származott a PCR reakcióból.

Humán IgGI^-kimérareceptor előállítása céljából, a BamHI-hellyel végződő nehéz lánc gént az alábbiakban ismertetett ξ-kiméra BamHI hasítási helyével kapcsoltuk össze úgy, hogy az ellenanyag-szekvenciák képezzék az extracelluláris részt. A kimérát kódoló plazmiddal transzferált COS-sejtek áramlási citométeres analízisével - amennyiben a sejteket egyidejűleg könnyű lánc cDNS-t kódoló expressziós plazmiddal transzferáltuk - ellenanyag-determinánsok nagy mennyiségű expresszálódását sikerült kimutatni, és mérsékelt szintű expresszálódást tudtunk kimutatni abban az esetben, ha a könnyű lánc expressziós plazmid nem volt jelen.

Hasonló kimérákat, például η- vagy γ-láncokkal (lásd az alábbiakban) vagy egy T-sejt-receptor-protein vagy Fc-receptor-protein bármely szignáltranszdukciós részével fuzionáltatott humán lgG1-et, általánosságban a fentiekben ismertetettek szerint a molekuláris biológiában ismert technikák alkalmazásával állíthatunk elő.

Olyan különálló transzkripciós egység előállítása céljából, amely egyetlen promoterről mind nehéz, mind

HU 225 688 Β1 könnyű láncok expresszálódását lehetővé teszi, nehéz és könnyű lánc kódolószekvenciákból és a másképp grp78-proteinként vagy BiP-ként ismert, 78 kD molekulatömegű, glükózszabályozás alatt álló proteint kódoló mRNS 5’-végi nem transzlálódó részéből bicisztronos mRNS-t kódoló plazmidot állítottunk elő. A grp78-szekvenciákat humán genomi DNS-ről, PCR reakcióval kaptuk, az 5és 3’-végen a következő oligonukleotidok felhasználásával:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (9. azonosító számú szekvencia), valamint

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (10. azonosító számú szekvencia). A fenti oligonukleotidok alkalmazásával végzett polimerázláncreakciót 10% dimetil-szulfoxid jelenlétében végeztük. A PCR reakcióval kapott fragmenst Notl- és Hincll-enzimekkel emésztettük, és humán lgG1 kódolószekvenciáktól 3'-irányban található Notl- és Hpalhelyek közé inszertáltuk. Ezt követően a grp78 vezetőszekvenciától 3'-irányban humán IgG kappa könnyű lánc cDNS-t kódoló szekvenciákat inszertáltunk, a Hincl l-hely és egy, a vektorban található másik hasítási hely felhasználásával. A fenti manipulációk eredményeképp létrejött expressziós plazmid a következőket tartalmazta: a félszintetikus nehéz lánc gént, ezt követően a grp78-gén-eredetű vezetőszekvenciákat, majd kappa könnyű lánc cDNS-szekvenciákat, végül SV40 DNS-fragmens-eredetű poliadenilezési szignálokat. COS-sejtek transzfektálása a fenti expressziós plazmiddal nehéz lánc determinánsok lényegesen magasabb szintű expresszálódását eredményezte, mint a csak nehéz lánc determinánsokat kódoló plazmiddal történő transzfektálás.

Olyan bicisztronos gének előállítása céljából, amelyek nehéz lánc/receptorkimérát és könnyű láncot tartalmaznak, az 5’-végi nehéz lánc szekvenciákat bármely, a leírásban ismertetett kiméra, nehéz lánc/receptor génnel helyettesíthetjük.

2. példa

CD4-receptorkimérák előállítása

Humán ξ- [Weissman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9709 (1988)] és γ- [Küster és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 6448 (1990)] cDNS-eket polimeráz-láncreakcióval állítottunk elő, a HPB-ALL jelű tumorsejtvonalból [Aruffo és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987)], valamint humán természetes ölősejtekből készített génkönyvtárak alapján, míg η-cDNS-t [Jin és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3319 (1990)] egér thymocita génkönyvtárból izoláltunk. A ξ-, η- és γ-cDNS-eket a CD4 egy olyan módosított formájának extracelluláris doménjához kapcsoltuk, amely a membránt átszelő doméntól közvetlenül 5’-irányban egy BamHI hasítási helyet tartalmazott [Aruffo és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987); Zettlmeissl és munkatársai: DNA Cell Bioi. 9, 347 (1990)]; ezt a hasítási helyet a ξ- és η-cDNS-ekben hasonló pozícióban, a membránt átszelő doméntól 5'-irányban, attól néhány nukleotid távolságra található, természetben előforduló BamHI hasítási hellyel kapcsoltuk össze (1., 3., 4. és 6. azonosító számú szekvenciák). A γ-lánccal alkotott fúziós protein előállítása céljából a szekvenciában az előzővel körülbelül azonos pozícióban, géntechnikai eljárással egy BamHI-helyet hoztunk létre (1. ábra, 2. és 5. azonosító számú szekvenciák). A génfúziókat, szelekciós markerként az E. coli gpf-génjét hordozó vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk, és homológ rekombinációs technikával, valamint mikofenolsav jelenlétében történő növekedésre történő szelekcióval [Falkner és munkatársai: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és munkatársai: Gene 65, 123 (1988)] a vaccinia-WR-törzs genomjába inszertáltuk. Áramlásos citométerrel végzett analízis szerint a vacciniarekombinánsok a sejtfelszínen Οϋ4:ξ és CD4:y fúziós proteinek nagy mennyiségű termelődését eredményezték, míg a CD4:q lényegesen gyengébben expresszálódott (1b. ábra). Az utóbbi jelenség összhangban van egy nemrégiben megjelent közleménnyel, mely szerint egér-hibridómasejtvonal η-cDNS expressziós plazmiddal történő transzfekciója lényegesen kisebb mértékű expressziót eredményezett, mint a megfelelő ξ-cDNS expressziós plazmiddal történő transzfekció [Clayton és munkatársai: J. Exp. Med. 172, 1243 (1990)]. A vacciniarekombinánsokkal fertőzött sejtek immunprecipitációja azt mutatta, hogy a fúziós proteinek a természetben előforduló CD4-antigéntöl eltérően, kovalens dimereket képeznek. A Ωϋ4:ξ és CD4:y fúziós proteinek monomer formáinak, valamint a natív CD4-antigénnek a molekulatömege 63, 55 és 53 kD-nak bizonyult. A fúziós proteinek nagyobb molekulatömege körülbelül megfelel az intracelluláris rész nagyobb méretének, amely 75 (Ωϋ4:ξ) vagy 5 (CD4:y) aminosawal hosszabb, mint a natív CD4-ben található megfelelő rész.

3. példa

A CD4-kimérák képesek más receptorláncokkal történő összekapcsolódásra Transzfektánsokban a humán FcyRIII (CD16_TM) makrofágokban és természetes ölősejtekben előforduló formájának sejtfelszíni expresszálódását egér [Kurosaki és munkatársai: Natúré 342, 805 (1989)] vagy humán [Hibbs és munkatársai: Science 246, 1608 (1989)] γ-lánccal vagy humán ξ-lánccal történő egyidejű transzfekció elősegíti [Lanier és munkatársai: Natúré 342, 803 (1989)].

A fenti közleményekkel összhangban a kimérák expresszálódása akkor is lehetővé tette CD16_TM sejtfelszíni expresszióját, ha kimérákat kotranszfekcióval vagy rekombináns vacciniavírusokkal történő fertőzéssel juttattuk a célsejtekbe (2. ábra). A CD16_TM sejtfelszíni expresszálódását a vizsgált sejtvonalakban a ξ-kiméra sokkal nagyobb mértékben segítette elő, mint a γ-kiméra (2. ábra), míg a natív CD4 nem fokozta a CD16_TM sejtfelszíni expresszálódását.

4. példa

Az Asp-c,-mutánsok nem kapcsolódnak Fc-receptorokkal

Létező antigénnel vagy Fc-receptorokkal nem kapcsolódó kimérák előállítása céljából olyan mutáns

HU 225 688 Β1 ξ-lánc fúziós proteineket állítottunk elő, amelyekben a membrán belsejében található Asp-aminosav vagy a membrán belsejében található Cys-aminosav vagy mindkettő hiányzott. Áramlásos citométerrel végzett analízis szerint a különböző mutáns kimérák sejtfelszíni expresszálódásának intenzitása nem tért el lényegesen a mutációt nem tartalmazó prekurzorokétól, immunprecipitációs kísérletek pedig azt mutatták, hogy a kimérák által létrehozott expresszié összességében hasonló mértékű volt. A várakozásnak megfelelően a transzmembrán cisztein-aminosavat nem tartalmazó mutáns kimérák nem képeztek dlszulfidhidak által összekapcsolt kimérákat. Az Asp-aminosavakat nem tartalmazó mutáns kimérák nem voltak képesek CD16jm sejtfelszíni expressziójának elősegítésére, míg a Cys-aminosavat nem, de Asp-aminosavat tartalmazó monomer kimérák lehetővé tették CD16_tm expresszálódását, bár az eredeti dinieméi kisebb hatékonysággal (3. ábra).

5. példa

A mutáns receptorok megtartják kalcium-válaszreakciót kiváltó képességüket Annak meghatározása céljából, hogy a fúziós proteinek közti keresztkötések létrehozása - ismereteink szerint a T-sejtes antigénreceptorok esetében történtekhez hasonló módon - lehetővé teszi-e szabad intracelluláris kalcium felhalmozódását, a Jurkat-E6 jelű, humán T-sejtes leukémia-sejtvonal (ATCC nyilvántartási szám: TIB 152, „American Type Culture Collection”, Rockville, MD) sejtjeit a vacciniarekombinánsokkal fertőztük, és az extracelluláris doménok között ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően meghatároztuk a relatív citoplazmáris kalciumkoncentrációt. Áramlásos citométeres meghatározásokat végeztünk, a kalciumszenzitiv lndo-1-festékkel feltöltött sejtek alkalmazásával [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3340 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A4a-d. ábrák a kalciumáramlási kísérletek eredményeit ábrázolják, CD4:£-kimérával, valamint az Asp^- és Cys^-mutánsokkal fertőzött sejtek esetében. A kimérák közti keresztkötések létrehozása reprodukálható módon fokozta az intracelluláris kalciumkoncentrációt. A CD4:r|- és CD4:y-kimérák hasonlóképp lehetővé tették az intracelluláris kalcium felhalmozódását a fertőzött sejtekben. A Jurkat-sejtek esetében alacsony szintű, sejtfelszíni CD4-expresszió mutatható ki, a natív CD4-ek közti keresztkötések létrehozása azonban, sem CD16^ jelenlétében, sem hiányában nem változtatta meg az intracelluláris kalciumszintet (4a-b. ábrák).

6. példa

CD4:í-, η- és γ-kimérák HIV-gp120/41-antigéneket expresszáló célsejtek citolízisét közvetítik Annak megállapítása céljából, hogy a kimérareceptorok képesek-e citolitikus effektorprogramok kiváltására, a gp120/gp41 jelű HIV-burokprotein-komplex CD4 által történő felismerésén alapuló célsejt:effektorsejt rendszerből álló modellt dolgoztunk ki. HeLa-sejteket gp120/gp41-komplexeket expresszáló rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk [Chakrabarti és munkatársai: Natúré 320, 535 (1986); Earl és munkatársai: J. Virol. 64, 2448 (1990)], és ⁵¹Cr-mal jelöltünk. Ajelölt sejteket olyan humán, allospecifikus, citotoxikus T-limfocita-sejtvonalból (CD8⁺, CD4^-) származó sejtekkel inkubáltuk, amelyeket ΰϋ4:ξ-, h- vagy γ-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal, vagy a CD4m-Cys11Gly:Asp15Gly kettős mutáns kimérával fertőztünk. Az 5a-c. ábrák azt mutatják, hogy a gp120/gp41-komplexeket expresszáló HeLa-sejteket a CD4-kimérákat expresszáló citotoxikus T-limfociták (CTL-ek) specifikus módon lizálják. A nem fertőzött HeLa-sejteket a CD4CD-kimérákkal felfegyverzett CTL-ek nem támadták meg célzottan, és a gp120/gp41-komplexeket expresszáló HeLa-sejteket nem fertőzött T-limfociták nem ismerték fel. A különböző kimérák hatékonyságának összehasonlítása céljából az effektorsejt:célsejt arányt a CD4-kimérákat expresszáló CTL-ek, valamint a gp120/gp41-komplexeket expresszáló HeLa-sejtek részarányának megfelelően korrigáltuk, mely arányokat áramlásos citométeres analízissel határoztunk meg. Az 5c. ábra az 5a. és 5b. ábrán látható citolízises kísérletekben felhasznált CTL-ek által történő CD4-expresszió citometriás analízisét ábrázolja. Bár a CD4CE átlagos sejtfelszíni denzitása nagymértékben meghaladta a CD4^ denzitásának átlagos mértékét, bármely formát expresszáló sejtek hasonló citolitikus képességgel rendelkeztek. A gp120-antigént expresszáló célsejtek részarányára történő korrekciót követően a CD4LD- és CD4:r|-proteinek által közvetített citolízis hatékonysága összehasonlítható mértékű volt specifikus T-sejt-receptor-célsejt:effektorsejt párok esetében közölt legjobb hatékonysági mutatókkal (CD4m-kimérákat expresszáló T-sejtek esetében az 50%-os felszabadulást eredményező, átlagos effektorsejt:célsejt arány 1,9±0,99 volt, n=10). A CD4:Y-fúzió, valamint a transzmembrán Aspés Cys-aminosavakat nem tartalmazó CD4dü-fúziók kevésbé bizonyultak aktívnak. Mindkét esetben azonban szignifikáns mértékű citolízis volt megfigyelhető (5b-c. ábrák).

Annak a lehetőségnek a kizárása céljából, hogy a vacciniafertőzés esetleg a komplexek CTL-ek által történő mesterségesen előidézett felismerését hozza létre, az előzőhöz hasonló citolíziskísérleteket végeztünk a CD16 foszfatidil-inozitol-kötött formáját (CD16p_rt) expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött és ⁵¹Cr-mal jelölt célsejtek, valamint CD16_P|-t vagy CD16nc-t expresszáló kontrollrekombinánsokkal fertőzött CTL-ek alkalmazásával. A 6a. ábra azt mutatja, hogy nem CD4-kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a natív HeLa-sejteket vagy a gp120/gp41komplexeket expresszáló HeLa-sejteket, hasonlóképp, a CD4-kimérákat expresszáló T-sejtek nem ismerik fel a vacciniavírus által kódolt egyéb felszíni proteineket expresszáló HeLa-sejteket. Ezenfelül nem kiméra CD4-et expresszáló CTL-ek nem eredményezik a gp120/gp41-komplexeket expresszáló HeLa-sejtek szignifikáns mértékű citolízisét (6a. ábra).

HU 225 688 Β1

7. példa

Az MHC-ll-antigént hordozó sejteket nem ismerik fel célzottan a kimérák

A CD4-ről leírták, hogy kölcsönhatásba lép egy, a ll-osztályú MHC-antigén által expresszált, nem polimorf szekvenciával [Gay és munkatársai: Natúré 328, 626 (1987); Sleckman és munkatársai: Natúré 328, 351 (1987)]. Bár a CD4 és a ll-osztályú MHC-antigén közti specifikus kölcsönhatás létrejöttét tisztított proteinek alkalmazásával soha sem mutatták ki, CD4-et expresszáló sejtek és ll-osztályú MHC-molekulákat expresszáló sejtek között bizonyos körülmények között adhézió mutatható ki [Doyie és munkatársai: Natúré 330, 256 (1987); Clayton és munkatársai: J. Exp. Med. 172, 1243 (1990); Lamarre és munkatársai: Science 245, 743 (1989)]. Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a sejtlízis kimutatható-e a ll-osztályú antigéneket hordozó sejtekkel szemben. A 6b. ábra azt mutatja, hogy a CD4nn-kiméra nem eredményezi a nagy mennyiségű ll-osztályú antigént expresszáló Raji-féle, B-sejt-eredetű sejtvonal specifikus citolízisét. Bár mérsékelt (körülbelül 5%) citolízis megfigyelhető volt, a Raji-féle sejtvonal RJ2.2.5 jelű, ll-osztályú antigénre nézve negatív mutánsai [Accolla: J. Exp. Med. 157, 1053 (1983)], valamint nem fertőzött T-sejtekkel inkubált Raji-sejtek hasonló érzékenységet mutattak.

8. példa

A T-sejt-antigén/Fc-receptor zéta-lánc által kiváltott citolízis kiváltásához szükséges szekvenciák azonosítása

Bár a CD4 és a ξ-lánc közti kimérák citotoxikus T-limfocitákat (CTL-eket) képessé tesznek HIVgp120-antigéneket expresszáló célsejtek elpusztítására, a humán T-sejtes sejtvonalakba bejuttatott zéta-kimérák sajátságainak egyértelmű összehasonlíthatósága céljából a CD4 alkalmazásán kívül egyéb lehetőségeket is megvizsgáltunk. Az ilyen sejtvonalak képesek CD4 expresszálására, ami megnehezíti a kalciummobilizáció típusa vagy foka, valamint a különböző kimérák citotoxikus képessége közti viszony pontos meghatározását. Ennek áthidalására olyan ξ-lánc és CD 16 alkotta kimérákat állítottunk elő, amelyekben a CD16 extracelluláris doménját a ξ-lánc transzmembrán- és intracelluláris szekvenciáival kapcsoltuk össze (7a. ábra). A génfúziót, szelekciós markerként az E. coli gpf-génjét hordozó, vacciniavírus expressziós plazmidba juttattuk, majd homológ rekombinációs eljárással, valamint mikofenolsav jelenlétében történő szaporodásra végzett szelekcióval vaccinia-WR-törzs genomjába inszertáltuk [Falkner és Moss.: J. Virol. 62, 1849 (1988); Boyle és Coupar: Gene 65, 123 (1988)].

A vacciniarekombinánsokkal T-sejteket fertőztünk, és az extracelluláris doménok közt ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően meghatároztuk a citoplazmában a relatív szabad kalciumion-koncentrációt. lndo-1-festékkel telített sejtek alkalmazásával spektrofluorometriás (a sejtpopuláció egészére vonatkozó), valamint áramlásos citométeres (az egyes sejtekre vonatkozó) analízist végeztünk [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3340 (1985); Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A 7b. ábra CD16OC fúziós proteineket expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőzött Jurkat-féle, humán T-sejtes leukémia-sejtvonal esetében kapott adatok analízisét ábrázolja. A kimérák közti keresztkötések létrehozása reprodukálható módon fokozta az intracelluláris kalciumkoncentrációt, míg nem kiméra CD16-ot expresszáló sejtek hasonló kezelésének kismértékű hatása volt, vagy a kezelés hatástalan volt. Amennyiben a kimérákat antigénreceptort nem tartalmazó, REX33A jelű [Breitmeyer és munkatársai: J. Immunoi. 138, 726 (1987); Sancho és munkatársai: J. Bioi. Chem. 264, 20760 (1989)] vagy Jurkat-féle sejtvonalból származó JRT3.T3.5 jelű mutáns sejtvonalakban expresszáltattuk [Weiss és munkatársai: J. Immunoi. 135, 123 (1984)], a CD16-keresztkötések létrehozását követően erős válaszreakció volt megfigyelhető. Hasonló eredményeket kaptunk a REX20A jelű mutáns sejtvonal [Breitmeyer és munkatársai: lásd fent (1987); Blumberg és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 14036 (1990)], valamint laboratóriumunkban kifejlesztett, a Jurkat-féle sejtvonalból származó CD3/Ti-negatív mutánsok alkalmazásával. A CD16üü-t expresszáló rekombinánsokkal történő fertőzés nem állította helyre az anti-CD3-ellenanyagra adott válaszreakciót, ami azt jelenti, hogy a fúziós protein nem az intracelluláris CD3-komplex-láncok kimentésén („rescueing”) keresztül fejti ki hatását.

A kimérák célzott, sejt által közvetített immunitást létrehozó képességének értékelésére CTL-eket CD16-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk, és a sejtekkel membránhoz kötött anti-CD16-ellenanyagokat expresszáló hibridómasejteket specifikusan lizáltattunk. Ez a vizsgálati eljárás a hibridóma citotoxicitási vizsgálati eljárás kiterjesztett változata, amelyet eredetileg Fc-receptorokat hordozó sejtek effektormechanizmusainak analízisére fejlesztettek ki [Graziano és Fanger: J. Immunoi. 138, 945 (1987); Graziano és Fanger: J. Immunoi. 139, 35 (1987); Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1989); Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989)]. A 8b. ábra azt mutatja, hogy CD16cn-kimérák citotoxikus T-iimfocitákban történő expresszálódása képessé teszi a felfegyverzett CTL-eket 3G8 jelű [anti-CD16; Fleit és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3275 (1982)] hibridómasejtek elpusztítására, míg a CD16 foszfatidil-inozitol-kötött formáját expresszáló CTL-ek inaktívak. A CD16nn-kimérákkal felfegyverzett CTL-ek egyéb ellenanyagot expresszáló hibridómasejtek elpusztítására nem képesek.

A citolízis létrehozásához szükséges minimális ξ-szekvenciák meghatározására olyan deléciós mutánsokból álló sorozatot állítottunk elő, amelyekben a ξ-lánc intracelluláris doménja karboxiterminális végéről fokozatosan egyre többet távolítottunk el (8a. ábra). A ξ-lánc intracelluláris doménjának nagyobb része eltávolítható anélkül, hogy az a citolitikus képességet nagyobb mértékben befolyásolná; a teljes hosszúságú CD16n:-kiméra hatékonysága lényegében megegyezett a 65. ami18

HU 225 688 Β1 nosavig bezárólag deletált, CD16üüAsp66*-kiméráéval (8b. ábra). A citotoxicitás jelentős mértékű csökkenése volt megfigyelhető az 59. ξ-aminosavig terjedő deletálást követően (CD16roGlu60*-kiméra), az 50. aminosavig terjedő további deléció pedig az aktivitás további kismértékű csökkenését eredményezte. Az aktivitás teljes mértékű elvesztése azonban még abban az esetben sem volt megfigyelhető, ha az intracelluláris domént három aminosavból álló transzmembránhorgony-szekvenciára csökkentettük (8b. ábra).

Mivel a ξ-lánc egy diszulfidhidakkal összekapcsolt dimer, a citolitikus képesség megmaradásának egy lehetséges magyarázata szerint a deléciót hordozó kiméra^-lánccal endogén ξ-lánc képez heterodimert, ezáltal helyreállítva annak aktivitását. Ennek a lehetőségnek a vizsgálatára a ξ-lánc 11. és 15. pozícióiban található Asp- és Cys-aminosavakat Gly-aminosavakkal helyettesítettük (Cys11Gly/Asp15Gly), és az alábbiak szerint immunprecipitációt végeztünk. Körülbelül 2*10® CV1-sejtet egy órán át, szérummentes DME-tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett. A fertőzést követően 68 órával a sejteket 1 mmol/l EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk, majd laktoperoxidáz és H₂O₂ alkalmazásával, Clark és Einfeld eljárása szerint [„Leukocyte Typing ΙΓ, 155. oldal, „Springer-Verlag”, NY, 1986), 2*10⁶ sejtre számítva 0,2 mCi ¹²⁵l-dal jelöltük. Ajelölt sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/l NaCI, 0,05 mol/l Tris (pH=8,0), 5 mmol/l MgCI₂, 5 mmol/l KCI, 0,2 mol/l jódacetamid és 1 mmol/l PMSF. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD16-proteineket 3G8-ellenanyaggal [Fleit és munkatársai: lásd fent, (1982); Medarex] és antiegér IgG-agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáltuk. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS-gélen nem redukáló körülmények mellett, vagy 10%-os gélen redukáló körülmények mellett elektroforetizáltuk. A fenti immunprecipitációs kísérletek igazolták, hogy a CD160üCys11Gly/Asp15Gly-kiméra nem képez diszulfidhidakkal összekapcsolt dimer struktúrákat.

Teszteltük a mutáns receptorok citolitikus aktivitását is. A 65. aminosavig deletált mutáns kiméra (CD16üCCys11Gly/Asp15Gly/Asp66‘) - a vizsgálati eljárásban alkalmazott körülményektől függően - a citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásban kétszer-nyolcszor bizonyult kevésbé aktívnak, mint a mutációt nem tartalmazó megfelelő kiméra (CD160üAsp66‘), amelynek a CD16cin-kiméra aktivitásához viszonyított aktivitása rendszerint a kétszeres faktoron belül maradt, vagy attól megkülönböztethetetlen mértékű volt (9b. ábra). A mutáns kimérák aktivitásának csökkenése összehasonlítható mértékű volt a hasonló struktúrával rendelkező CD4-kimérák esetében tapasztalt csökkenéssel (lásd fent), és az legvalószínűbben a ξ-monomerek dimerekhez viszonyított alacsonyabb hatékonyságának tudható be. Ezzel szemben az 59. aminosavpozícióig deletált Asp^-, Cys^- mutáns kiméra nem rendelkezett citolitikus aktivitással (9b. ábra), ami azt a feltevést támasztja alá, hogy a 65. aminosavpozíciónál aminoterminális irányban tovább terjedő deléciót tartalmazó kimérák citolitikus aktivitásának alacsony szintű fennmaradásáért a transzmembrán Cys- és/vagy Asp-aminosavak által közvetített, más láncokkal létrejövő kapcsolódás felelős.

Áramlásos citométeres vizsgálatok szerint a transzmembrán Cys- és Asp-aminosavakat nem tartalmazó deléciós mutánsok TCR^- mutáns Jurkat-féle sejtvonalban még képesek elősegíteni az ellenanyagokkal történő keresztkötések hatására bekövetkező szabad intracelluláris kalciumionkoncentráció-növekedést (9d. ábra). Hasonló eredményeket kaptunk az eredeti Jurkat-féle sejtvonalban expresszáltatott kimérákkal is. A CD16DCCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*-kiméra esetében ezek az adatok azt mutatják, hogy a kalcium-válaszreakciót közvetítő képesség mutációk létrehozásával elkülöníthető a citolízist előidéző képességtől.

Abból a célból, hogy a ξ-lánc transzmembránaminosavainak esetleges szerepét egyértelműen kizárjuk, a ξ-láncban található transzmembránaminosavakat és az első 17 citoplazmáris aminosavat olyan szekvenciával helyettesítettük, amely a CD5- vagy CD7-antigénekben a membránt átszelő aminosavakat, valamint az első 14 vagy első 17 citoplazmáris aminosavat kódolta (9a. ábra). Az így kapott, három részből álló fúziós proteinek - a CD16:5üü(48-65) és a CD16:7DD(48-65) az egyszerűbb CD16^-kimérákkal szemben nem képeznek diszulfidhidakkal összekapcsolt dimereket, mivel azokból hiányzik a ξ-transzmembrándoménban található Cys-aminosav. Mindkét, három részből álló kiméra képes volt Jurkat-sejtekben és TCR^- negatív sejtvonalakban kalciummobilizáció kiváltására (9d. ábra), és CTL-ekben citolitikus válaszreakció előidézésére (a 9c. ábra, valamint az ábrán fel nem tüntetett adatok szerint). A CD16:7CD(48-59)-kimérában a ξ-résznek az 59. aminosavpozícióig terjedő megcsonkítása azonban megszünteti a három részből álló fúziós protein TCR-pozitív vagy -negatív Jurkat-sejtekben kalciumválaszreakciót közvetítő képességét, valamint érett CTL-ek esetében citolízist létrehozó képességét (a 9c. és 9d. ábra, valamint az ábrán fel nem tüntetett adatok szerint).

A 18 aminosavból álló szekvencián belül az egyes aminosavak szerepének vizsgálata céljából helyspecifikus mutagenezissel számos mutáns variánst állítottunk elő, és meghatároztuk, hogy azok mennyiben képesek a kimérareceptor alacsony (10a. és 10d. ábra) és magas szintű (10b. és 10e. ábra) expressziója mellett receptor által közvetített sejtlízist létrehozni. A 10a-f. ábrák azt mutatják, hogy míg számos, az 59-63. aminosavak közé eső, viszonylag konzervatív szubsztitúció (azaz savas aminosavaknak rokon amidokkal, vagy tirozinnak fenil-alaninnal történő helyettesítése) mérsékelt fokban csökkentette a citolízis hatékonyságát, általánosságban a variánsok kalciummobillzációt kiváltó képességüket megtartották. Ezek az aminosavak azonban együttesen egy fontos almotívumot képeznek, amennyiben deléciójuk megszünteti a citoli19

HU 225 688 Β1 tikus aktivitást. A 62. pozícióban található Tyr helyettesítése Phe- vagy Ser-aminosavakkal mind a citotoxikus, mind a kalciumválaszt megszüntette. A 18 aminosavból álló szegmens aminoterminális végén az 51. pozícióban található Tyr helyettesítése Phe-aminosavval mind a kalciummobilizációt, mind a citotolitikus aktivitást megszüntette, míg az 50. pozícióban található Leu helyettesítése Ser-aminosawal megszüntette a kalciumválaszt, de csak kismértékben csökkentette a citolízist. Anélkül, hogy igényünket egy adott feltevésre korlátoznánk, úgy gondoljuk, hogy a Leu50Ser-mutáns kalciummobilizációs képességének a rövid távú áramlásos citométeres vizsgálatokban megfigyelhető elvesztése nem tükrözi teljes mértékben annak szabad intracelluláris kalciumion-koncentrációt jelentősen fokozó képességét a hosszabb időtartamot átölelő citolitikus vizsgálati eljárás során. Egyes citolitikus T-sejtvonalak esetében azonban kalciuminszenzitív citolitikus aktivitás létét írták le, és nem zárható ki az a lehetőség sem, hogy eredményeinknek hasonló jelenség képezi az alapját. Az Asn48 helyettesítése Ser-aminosawal egyes kísérletekben részben csökkentette a citotoxicitást, míg más kísérletek során kismértékű hatást fejtett ki.

A redundáns szekvenciaelemek esetleges szerepének vizsgálata céljából a ξ-lánc intracelluláris doménját három szegmensre osztottuk, amelyek a 33-65., a 71-104. és a 104-138. aminosavakat fedték át. Valamennyi fenti szegmenst CD16:CD7-kimérával kapcsoltuk össze oly módon, hogy a CD7 intracelluláris doménjának membránkötő alapszekvenciájától közvetlenül disztális irányban egy Miül hasítási helyet iktattunk be (lásd az alábbiakban, 11a. ábra). A három elem citolitikus hatékonyságának összehasonlítása azt mutatta, hogy azok hatékonysága lényegében megegyezik (11b. ábra). A szekvencia-összehasonlítás szerint (11a. ábra) a második szegmens tizenegy tirozin-aminosavak közé eső aminosavat tartalmaz, míg az első és harmadik szegmens tízet.

Bár a T-sejt-aktiválás folyamata pontosan nem ismert, nyilvánvaló, hogy az antigénreceptor vagy intracelluláris ξ-szekvenciákat hordozó receptorkimérák aggregációja kalciummobilizációt idéz elő, valamint citokinek és granulák tartalmának felszabadulását és az aktivációs állapotra jellemző sejtfelszíni markerek megjelenését váltja ki. A ξ-lánc aktív helye - egy rövid lineáris peptidszekvencia, amely feltehetően túl kis méretű ahhoz, hogy belső enzimaktivitással rendelkezzék - valószínűleg egy, vagy legfeljebb néhány proteinnel lép kölcsönhatásba a sejtaktiváció létrehozásához. Világos az is, hogy a szabad kalcium mobilizációja önmagában nem elegendő a sejtaktiváció kiváltásához, amint az is, hogy a citolízist közvetítő képesség mutációk létrehozásával elkülöníthető a kalciumfelhalmozódást kiváltó képességtől.

Amint azt a fentiekben leírtuk, a ξ-lánc intracelluláris doménjából származó, 18 aminosavból álló szegmens hozzákapcsolása két, azzal rokonságban nem álló protein transzmembrán- és intracelluláris doménjához, képessé teszi a kapott kimérákat a fúziós proteinek extracelluláris részéhez kötődő célsejtekkel szemben citolitikus aktivitás létrehozására. A 18 aminosavból álló szegmenst hordozó kimérák azonban körülbelül nyolcszor kevésbé aktívak, mint a teljes ξ-láncon alapuló kimérák; a csökkent aktivitás transzmembrán-kölcsönhatások elvesztésének tudható be, amelyek normális körülmények között lehetővé teszik, hogy a vad típusú ξ-láncok diszulfidhidakkal összekapcsolt dimereket képezzenek. A szekvenciaelemmel azonos karboxiterminális véggel rendelkező, de transzmembrán Cys- és Asp-aminosavakat nem tartalmazó ξ-lánc deléciós konstrukciók tehát tipikusan kissé alacsonyabb aktivitással rendelkeznek, mint a csak a 18 aminosavból álló szekvenciaelemet hordozó kimérák.

A citolitikus képességért felelős elem, amelyre a leírásban összpontosítottunk, két tirozint tartalmaz, és nem tartalmaz szerin vagy treonin aminosavakat, ami csökkenti annak lehetőségét, hogy az aktivitáshoz foszforilezésre van szükség. Bármelyik tirozin mutációja megszünteti azonban az aktivitást, és bár előzetes kísérletek nem mutatnak arra, hogy a 18 aminosavból álló szekvenciaelemet tartalmazó kiméra felületi antigének közti keresztkötések létrejöttét követően jelentős mértékű tirozinfoszforilezés következne be, nem zárható ki az a lehetőség, hogy ilyen foszforilezés alacsony szinten szerepet játszik az aktivitás létrehozásában. A két tirozin aminosav esetében említett hatásokon felül, alacsony receptordenzitás mellett, a szekvenciaelem amino- és karboxiterminális végén számos aminosav helyettesítése gyengíti az aktivitást.

A ξ-lánc aktivitásáért felelős szekvenciaelemhez hasonló szekvenciák megtalálhatók több más transzmembránprotein citoplazmáris doménjában, például a CD3-8- és -γ-molekulákban, a felszíni IgM-mel kapcsolt mb1- és B29-proteinekben, valamint az FceRI jelű, nagy affinitású IgE-receptor β- és γ-láncában [Reth és munkatársai: Natúré, 338, 383 (1989)]. Bár ezen szekvenciák funkciója még nem ismert, hatékony expresszálódás esetén valamennyi képes autonóm T-sejt-aktiválás létrehozására, és az ilyen aktivitás magyarázatul szolgálhat a zéta-negativ mutáns sejtvonalakban megfigyelhető, fennmaradó TCR-válaszkészségre [Sussman és munkatársai: Cell 52, 85 (1988)].

Maga a ξ-lánc három, egymástól körülbelül egyforma távolságban elhelyezkedő ilyen szekvenciát tartalmaz; és az intracelluláris dómén három részre történő hozzávetőleges felosztása azt mutatja, hogy mindegyik képes citolitikus válaszreakció kiváltására. Az η-láncból, amely a ξ-lánc eltérő összeillesztési folyamat eredményeképp létrejövő („splice) izoformja [Jin és munkatársai: lásd fent (1990); Clayton és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991)], hiányzik a harmadik szekvenciaelem karboxiterminális fele. Mivel az első szekvenciaelem karboxiterminális felének eltávolítása az aktivitás elvesztésével jár, valószínűnek látszik, hogy az η-lánc biológiai hatékonyságának nagyobb részéért az első két szekvenciaelem felelős. Az η-lánc az antigén által közvetített citokinfelszabadulás [Bauer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3842 (1991)] vagy a célzott citolízis kiváltását tekintve

HU 225 688 Β1 (lásd fent) a ξ-lánc aktivitásával azonos - bár eltérő mértékű - aktivitással rendelkezik, az η-lánc receptorstimulálás hatására nem foszforileződik [Bauer és munkatársai: lásd fent (1991)]. A foszforileződés létrejöttéhez tehát vagy mindhárom szekvenciaelem jelenlétére szükség van, vagy a harmadik szekvenciaelem egy meg nem határozott tirozinkináz számára képez előnyös szubsztrátot.

9. példa

Humán Fc-receptor által közvetített citolitikus szignáltranszdukció

Különböző humán Fc-receptor-altípusok hatásainak vizsgálata céljából olyan kiméramolekulákat állítottunk elő, amelyekben a humán CD4-, CD5- vagy CD16-antigének extracelluláris doménját az FcRlly-A-, B1-, B2- és C-altípusok transzmembrán- és intracelluláris doménjaival kapcsoltuk össze [Ravetch és Kínét nevezéktana szerint: Ann Rév. Immunoi. 9, 457 (1991)]. Közelebbről, az előzőekben említett FcRII- A-, B1- és B2-izoformok transzmembrán- és citoplazmáris doménjainak megfelelő cDNS-szekvenciákat a korábbiakban már létező, PC23 jelű klón vagy humán tonsillából származó (ismert technikákkal előállított) cDNS-génkönyvtár alkalmazásával amplifikáltuk, az alábbi mesterséges úton előállított láncindító oligonukleotidok felhasználásával:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT [18. azonosító számú szekvencia; előreirányuló („forward”) FcRII-A];

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT [19. azonosító számú szekvencia; ellenirányú („reverse”) FcRII-A];

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (20. azonosító számú szekvencia; előreirányuló FcRll-B1 és FcRII-B2); valamint

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (21. azonosító számú szekvencia; ellenirányú FcRII-B1 és FcRII-B2).

Ezek a láncindító oligonukleotidok az 5’-végtől 6 nukleotid távolságra hasítási helyeket tartalmaztak a BamHI- vagy Notl- enzimek számára. A Notl-helyet közvetlenül egy antiszensz stopkodon - CTA vagy TTA - követte. Valamennyi láncindító oligonukleotid a kívánt fragmens 5’- vagy 3’-végével komplementer, 18 vagy több nukleotidot tartalmazott. Az FcRyll-C citoplazmáris doménjának megfelelő cDNS-fragmenst, amely csak egy aminosav vonatkozásában tér el a IIA-izoformtól (a 268. pozícióban P helyett L található), helyspecifikus mutagenezissel, átfedő PCR reakcióval állítottuk elő a következő szekvenciákkal rendelkező láncindító oligonukleotidok alkalmazásával:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (22. azonosító számú szekvencia); valamint

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (23. azonosító számú szekvencia).

A PCR-fragmensekat a CD16 vagy CD4 extracelluláris doménjait tartalmazó vacciniavírus expressziós vektorokba inszertáltuk, majd ezeket a timidinkináz-lokusznál történő rekombinációval, és a kívánt rekombinánsok azonosításának megkönnyítésére az E. coli gpt-gén együttes beépülésére történő szelekcióval vad típusú vacciniavírusba inszertáltuk. Valamennyi izoform azonosságát (lásd 12. ábra) didezoxiszekvenálással ellenőriztük.

A kiméra-receptorproteinek termelődését immunprecipitációs vizsgálatokkal is igazoltuk. Körülbelül 10⁷ JRT3.T35-sejtet egy órán át, szérummentes IMDM-tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal fertőztünk, legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett. A sejteket a fertőzést követően tizenkét órával összegyűjtöttük, és a laktoperoxidáz/glükóz oxidáz módszer alkalmazásával (Clark és Einfeld, lásd fent) felszínüket 10⁷ sejtre számítva 0,5 mCi ¹²⁵l-dal jelöltük. A jelölt sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1 mmol/l MgCI₂, 5 mmol/l KCI, 0,2 mol/l jódacetamid és 1 mmol/l PMSF. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD16 fúziós proteineket 4G8-ellenanyaggal és antiegér IgG-agarózzal immunprecipitáltuk. A mintákat redukáló körülmények mellett elektroforetizáltuk. Valamennyi immunprecipitált kimérareceptor a várakozásnak megfelelő molekulatömeggel rendelkezett.

Annak tesztelésére, hogy a kimérareceptorok mennyiben képesek a citoplazmáris szabad kalciumion-koncentráció fokozására, a rekombináns vírusokkal JRT3.T3.5 jelű, TCR^- -mutáns Jurkat-sejtvonalat fertőztünk (a leírtak szerint), majd a receptorok extracelluláris doménjai közt 3G8- vagy Leu-3A jelű monoklonális ellenanyagokkal történő keresztkötések létrehozását követően, a sejtekben meghatároztuk a citoplazmáris szabad kalciumkoncentrációt (a fent leírtak szerint). A fenti kísérletek azt mutatták, hogy az FcRyll-A és -C intracelluláris doménjai az extracelluláris doménok közti keresztkötések létrehozását követően képesek voltak közvetíteni a citoplazmáris szabad kalciumkoncentráció fokozását, míg a FcRylIBI és -B2 intracelluláris doménjai hasonló körülmények mellett inaktívak voltak (13a. és 13b. ábra). Az FcRyll-A CD4-, CD5- és CD16hibridjei lényegében azonos mértékben voltak képesek a kalcium-válaszreakció létrejöttének elősegítésére (13a-b. ábrák). Más sejtvonalak - mind monocita, mind limfocita eredetű sejtvonalak - képesnek bizonyultak az extracelluláris doménok közti keresztkötések által közvetített szignálra adott válaszreakcióra.

Az FcRylI különböző intracelluláris doménjai citolízisben játszott szerepének vizsgálatára, humán citotoxikus T-limfocitákat (CTL-eket) CD16:FcRyll-A-, -B1-, -B2- és -C-kimérákat expresszáló vacciniarekombinánsokkal fertőztünk. A fertőzött sejteket olyan, ⁵¹Cr-mal feltöltött hibridómasejtekkel (azaz 3G8-10-2-sejtekkel) tenyésztettük együtt, amelyek CD16-antigénnel szemben sejtfelszíni ellenanyagokat expresszáltak. A fenti vizsgálatban a CD16-kimérákat hordozó CTL-ek amennyiben a kiméra CD16-antigén-eredetű extracelluláris doménját a limfocita effektorprogram aktiválására képes intracelluláris szegmenshez kapcsoltuk - elpusztították a hibridómacélsejteket (szabad ⁵¹Cr felszabadulását eredményezve); a citolízis meghatározá21

HU 225 688 Β1 sara szolgáló fenti vizsgálati eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük. A 14a. ábra azt szemlélteti, hogy CD16:FcRyll-A és -C-kimérákkal felfegyverzett CTL-ek képesek voltak sejtfelszíni anti-CD16-ellenanyagokat expresszáló célsejtek lizálására, míg a CD16:FcRyll-B1- vagy -B2-kimérákkal felfegyverzettek nem.

Annak a lehetőségnek a kizárására, hogy a specifikus citolízis valamiképp a CD16-csoporttal történő kölcsönhatás eredménye lenne, olyan citolíziskísérleteket végeztünk, amelyben FcRII intracelluláris doménjait a CD4 extracelluláris doménjával kapcsoltuk össze. Ebben az esetben célsejtekként gp120/41 jelű HlV-burokproteineket expresszáló HeLa-sejteket (közelebbről a vPE16 jelű vacciniavektorral fertőzött HeLa-sejteket; „National Institution of Allergy and Infectious Disease AIDS Depository, Bethesda, MD) alkalmaztunk. Hasonlóképp a CD16-rendszerhez, a HlV-burokproteineket expresszáló célsejtek érzékenyek voltak a CD4:FcRyll-A-kimérákat expresszáló T-sejtek lizálóhatásával szemben, de nem voltak érzékenyek a CD4:FcRyll-B1- vagy -B2-kimérákat expresszáló sejtekkel szemben (14b. ábra).

Az FcRyll-A és -C nem mutat értékelhető szekvenciahomológiát semmilyen más proteinnel, beleértve a tágan értelmezett ΡοΡγ/ΤΟΡξ-οδθΙόό tagjait. A citolízis kiváltásáért felelős szekvenciaelemek meghatározása céljából olyan deléciós mutánsokat állítottunk elő, amelyek az intracelluláris domént kódoló szekvencia 5’vagy 3'-végén deléciót hordoznak (lásd az alábbiakban és a 15a. ábrán), és kalciummobilizációs, valamint citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárásokban (a leírtak szerint) vizsgáltuk azok hatékonyságát. Azokban a kísérletekben, amelyekben az intracelluláris dómén aminoterminális vége került eltávolításra, az FcRylI transzmembrándoménját az azzal rokonságot nem mutató CD7-antigén transzmembrándoménjával helyettesítettük, hogy a membránt átszelő dómén által közvetített kölcsönhatások esetleges szerepét kizárjuk.

A 15b. és 15c. ábra azt mutatják, hogy a 14 karboxiterminális aminosav - ezen belül a 298. pozícióban található tirozin - eltávolítása a citolitikus képesség teljes mértékű elvesztését és a kalciummobilizációs képesség jelentős mértékű csökkenését eredményezte. Közvetlenül a 282. pozícióban található tirozinig terjedő további deléció a fentivel megegyező fenotípust hozott létre (15b. és 15c. ábra). Az intracelluláris dómén N-terminális végétől a 268. aminosavig terjedő deléciónak sem a kalciummobilizációs profilra, sem a citolitikus képességre nem volt jelentős hatása, míg a 275. aminosavig terjedő deléció jelentősen csökkentette a szabad kalciumfelszabadulást, de alig volt hatása a citolízisre (15d. és 15e. ábra). A 282. pozícióban található aminosavig terjedő további deléció olyan FcRyll-végeket eredményezett, amelyek sem kalciummobilizációs képességgel, sem citolízist kiváltó képességgel nem rendelkeztek (15d. és 15e. ábra). A fenti hozzávetőleges mérések szerint az „aktív elem” viszonylag nagy méretű (36 aminosavból áll), és 16 aminosawal elválasztott két tirozint tartalmaz.

10. példa

További T-sejt-receptor- és B-sejt-receptor-eredetű jelközvetítő proteinek („trigger-proteinek)

A találmány szerinti további intracelluláris és transzmembrán szignáltranszdukciós doménok származhatnak CD3-delta és T3-gamma T-sejt-receptor-proteinekből, valamint mb1 és B29 jelű B-sejt-receptor-proteinekből. A fenti proteinek aminosavszekvenciáját a 16. ábra (CD3-delta; 24. azonosító számú szekvencia), a 17. ábra (T3-gamma; 25. azonosító számú szekvencia), a 18. ábra (mb1; 26. azonosító számú szekvencia), valamint a 19. ábra (B29; 27. azonosító számú szekvencia) tartalmazza. A szekvenciáknak azt a részét, amely elegendő a citolitikus szignáltranszdukció kiváltásához (amelyeket tehát a találmány szerinti kimérareceptornak előnyösen tartalmaznia kell), zárójelbe tettük. A fenti proteindoménokat tartalmazó kimérareceptorokat általánosságban a fent leírtak szerint állítjuk elő és alkalmazzuk a találmány szerinti terápiás eljárásokban.

11. példa

CD28-kimérareceptorok

Mivel kimutattuk, hogy a T-sejt-aktiváció CD28-antigének alkalmazásával fokozható, találmány tárgyát képezik kimérareceptor-párokat képező terápiás sejtek is: az első kiméra tartalmazza a CD28 intracelluláris doménját, a második kiméra valamely említett intracelluláris vagy transzmembrán jelközvetítő domént tartalmaz. Adott receptorpár esetében az extracelluláris doménok azonosak lehetnek (például mindkettő lehet CD4-protein-eredetű, ezáltal mindkettő HIV-vírust vagy HIV-fertőzött sejteket ismer fel), vagy azokat megtervezhetjük úgy, hogy adott sejt vagy kórokozó felszínén különböző célmolekukákat ismerjenek fel.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint két különböző extracelluláris domént tartalmazó kimérapárokat alkalmazunk, amelyek mindegyike a célzott tumorra jellemző, eltérő antigéneket ismer fel. Tumorantigének - anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk - például a következők: valamely szénhidrát (például Le^Y, szialil-Le^Y, Le^x és szialil-Le^x), karcinoembrionális antigén, CD40, módosított CD44, a-fötoprotein, a T- és Tn-antigének, tenascin és növekedési faktor receptorok (például HER2/neu). Növelve azon felszíni tumormarkerek számát, amelyek felismerésére szükség van ahhoz, hogy hatékony, sejtpusztulást eredményező válaszreakció váltódjon ki, a fenti megközelítési móddal fokozható a terápia specifitása, mivel csökken annak valószínűsége és gyakorisága, hogy a kezelés nem tumoros sejtek pusztulását eredményezi.

A kombinációs szabályozás fenti módja kiterjeszthető bármely együttműködő kimérareceptor-kombinációra, és az alkalmazható bármely, találmány szerinti terápiás eljárás szabályozására.

CD28-kimérákat a leírásban ismertetett módon állítottunk elő és expresszáltattunk. A CD28-szekvenciát Aruffo és Seed írták le [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8573 (1987)]. A fenti szakirodalmi hivatkozásban ismertették továbbá a CD28 intracelluláris és transz22

HU 225 688 Β1 membrándoménjait. Intracelluláris CD28-domént hordozó kimérát írtak le a következő szakirodalmi helyen:

Romeo és munkatársai: „Cold Spring Harbor Symp. on

Quant. Bioi. LVII” 117-125 (1992).

12. példa

Kísérleti módszerek

Vacciniafertőzés és radioimmunprecipitáció Körülbelül 5*10® CV1-sejtet fertőztünk 1 órán át, szérummentes DME-tápfolyadékban rekombináns vacciniavírusokkal, legalább 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett (a titert CV1-sejteken határoztuk meg). A sejteket a fertőzést követően friss tápfolyadékba helyeztük, és metabolikus úton, hat órán át, metionin- és ciszteinmentes DMEM-tápfolyadékban (Gibco; Grand Island, NY), 200 pCi/ml ³⁵S-metioninnal, valamint ciszteinnel (Tran³⁵S-jelölőanyag, ICN; Costo Mesa, CA) jelöltük. A jelölt sejteket 1 mmol/l EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és az alábbi összetételű pufferben lizáltattuk: 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 mol/l NaCI, 0,05 mol/l Tris (pH=8,0), 5 mmol/l EDTA és 1 mmol/l PMSF. A sejtmagokat centrifugálással eltávolítottuk, és a CD4-proteineket OKT4-ellenanyaggal és antiegér IgG-agarózzal (Cappel, Durham, NC) immunprecipitáltuk. A mintákat 8%-os poliakrilamid/SDS géleken, nem redukáló körülmények mellett (NR), valamint redukáló körülmények (R) mellett elektroforetizáltuk. A ³⁵S-jelölt mintákat tartalmazó géleket az autoradiográfiát megelőzően „En³Hance’’-szal (New England Nuclear, Boston, MA) impregnáltuk. A CD16 transzmembránformájának - a CD16jM-nek facilitált expresszióját úgy határoztuk meg, hogy annak csak CD16jM-mel fertőzött CV1-sejtekben történő expresszióját összehasonlítottuk CD16_TM-mel, valamint ξ- és γ-kimérákat kódoló vírusokkal fertőzött sejtekben történő expresszálódás mértékével. A fertőzést, és hat óráig vagy annál hosszabb ideig tartó inkubálást követően, a sejteket 1 mmol/l EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk, és a CD16_tm vagy a kimérák expresszióját indirekt immunfluoreszcencia és áramlásos citométeres eljárás alkalmazásával meghatároztuk.

Kalciumáramlási („calcium fíux”) vizsgálati eljárás Az E6 jelű Jurkat-alvonalhoz tartozó sejteket [Weiss és munkatársai: J. Immunoi. 133, 123 (1984)] fertőztünk rekombináns vacciniavirusokkal, egy órán át, szérummentes IMDM-tápfolyadékban, 10-es fertőzési multiplicitási (moi) érték mellett, majd a sejteket 3-9 órán át, 10% FBS-t (fötális borjúszérumot) tartalmazó IMDM-tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és 3*10® sejt/ml sűrűségben, 1 mmol/l lndo-1-aceto-metoxi-észtert [Grynkiewicz és munkatársai: J. Bioi. Chem. 260, 3340 (1985)] (Molecular Probes) tartalmazó komplett tápfolyadékban szuszpendáltuk, majd 45 percig, 37 °C-on inkubáltuk. Az lndo-1-festékkel feltöltött sejteket ülepítettük, 1*10® sejt/ml sűrűségben szérummentes IMDM-tápfolyadékban szuszpendáltuk, majd szobahőmérsékleten, sötétben tároltuk. A sejteket szabad kalciumion-koncentrációra nézve analizáltuk, a viola és kék fluoreszcenciakibocsátás áramlásos citométerrel történő egyidejű meghatározása alapján [Rabinovitch és munkatársai: J. Immunoi. 137, 952 (1986)]. A kalciumáramlás megindítása céljából a sejtszuszpenzióhoz 0 időpontban, vagy 1 pg/ml koncentrációban, fikoeritrinnel (PE) konjugált Leu3A jelű (anti-CD4) ellenanyagot (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ), majd 10 pg/ml nem konjugált, kecskében termelt antiegér IgG-t adtunk; vagy 0 időpontban, 1 pg/ml koncentrációban, nem konjugált 3G8 jelű (anti-CD16) monoklonális ellenanyagot, majd 10 pg/ml PE-konjugált, kecskében termelt antiegér lgG-Fab₂’-t adtunk. Viola/kék kibocsátást ábrázoló hisztogramokat gyűjtöttünk a PE-pozitív (fertőzött) sejtpopulációra vonatkozólag, amelyek tipikusan az összes sejt 40-80%-át képviselték. A T-sejtes antigénreceptor-választ nem fertőzött sejtekben OKT3-ellenanyaggal váltottuk ki, keresztkötések létrehozása nélkül. A CD16-kimérareceptorokra vonatkozó kísérletekben, azokat a mintákat, amelyeknél az alapvonal alacsonyabb intracelluláris kalciumkoncentráció felé történő elmozdulását figyeltük meg (ellenanyag hozzáadása nélkül), az analízisből kizártuk. A hisztogrameredményeket ezt követően a kétváltozós adatoknak ASCII-adatokká történő átalakításával, „Write Hand Man”-programcsomag (Cooper City, FL) alkalmazásával, majd FORTRAN-programok gyűjteményével analizáltuk. A második ellenanyag-reagens hozzáadását megelőzően mért viola/kék kibocsátás aránya alapján határoztuk meg az egységnek tekintett, normalizált kiindulási arányt, és a nyugalmi küszöbértéknek megfelelő arányt, amelyet úgy állapítottunk meg, hogy nyugalmi helyzetben a populáció 10%-a haladja meg a küszöbértéket.

Citolízis meghatározására szolgáló vizsgálati eljárás

Egy WH3 jelű, CD8⁺-, CD4^-, HLA-B44-antigénekre korlátozódó citolitikus, humán T-sejtes sejtvonalat 10% humán szérumot tartalmazó, 100 egység/ml IL-2-vel kiegészített IMDM-tápfolyadékban tartottunk fenn, és szabályos időszakonként, besugárzott (3000 rád), eltérő HLA-típussal rendelkező, perifériásvér-eredetű limfocitákkal és 1 pg/ml fitohemagglutininnal (PHA) nemspecifikusán, vagy besugárzott, HLA-B44 haplotípussal rendelkező mononukleáris sejtekkel specifikusan stimuláltunk. Egy napig tartó, nemspecifikus stimulációt követően a PHA-t friss tápfolyadék hozzáadásával 0,5 pg/ml koncentrációig hígítottuk, és három nap múlva a tápfolyadékot lecseréltük. A stimulációt követően a sejteket legalább 10 napig tenyésztettük, citotoxikus vizsgálati eljárásokban történő alkalmazásukat megelőzően. A sejteket egy órán át, szérummentes tápfolyadékban, legalább 10-es fertőzési multiplicitási érték (MOI) mellett rekombináns vacciniavirusokkal fertőztük, majd három óráig komplett tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, és milliliterenként 1*10⁷ sejt sűrűségben szuszpendáltuk. U alakú fenékkel rendelkező mikrotitrálólemezek egyes mélyületeihez, amelyek 100 pl komplett tápfolyadékot tartalmaztak, 100 pl sejtszuszpenziót adtunk. A sejte23

HU 225 688 Β1 két felező tovafutó hígítással hígítottuk. Mindegyik minta vizsgálata esetében két-két mélyület nem tartalmazott limfocitákat, hogy a spontán krómfelszabadulás és összkrómfelvétel meghatározható legyen. Az S3 jelű HeLa-alvonalból származó célsejteket 6,0 vagy 10,0 cm átmérőjű lemezeken, egy órán át, szérummentes tápfolyadékban, körülbelül 10-es mo/'-érték mellett rekombináns vacciniavírusokkal fertőztük, majd három órán át, komplett tápfolyadékban inkubáltuk. A sejteket ezt követően 1 mmol/l EDTA-t tartalmazó PBS-pufferrel a lemezekről leválasztottuk és megszámoltuk. 10⁶ célsejtet [a CD4-kimérareceptor-k(sérletek esetében HeLa-Raji vagy RJ2.2.5-sejteket, a CD16-kimérareceptor-kísérletek esetében pedig 3G8-10-2-sejteket; Shen és munkatársai: Mól. Immunoi. 26, 959 (1989)] tartalmazó mintákat centrifugáltunk, és 1 órán át, 37 °C-on, időközönként megkeverve, 50 pl steril ⁵¹Crnátrium-kromát-oldatban szuszpendáltunk (1 mCi/ml, Dupont Wilmington, DE), majd háromszor PBS-ben mostunk. Valamennyi mélyülethez 100 pl térfogatú, 10⁵/ml sűrűségben tápfolyadékban szuszpendált, jelölt sejtet adtunk. A Raji és RJ.2.2.5-célsejteket a HeLa-sejtekkel azonos módon jelöltük. A mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk, és 4 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő végén a sejteket valamennyi mélyületben óvatos pipettázással felszuszpendáltuk, a beépült összbeütésszám meghatározása céljából azokból mintát vettünk, és a mikrotitrálólemezeket 1 percig, 750 g mellett centrifugáltuk. A felülúszóból 100 μΙ térfogatú mintát eltávolítottunk, és gamma-szcintillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Az elölt sejtek százalékos arányát az áramlásos citométeres analízissel meghatározott, fertőzött célsejtek aránya (rendszerint a sejtek 50-90%-a) alapján korrigáltuk. A fertőzött effektorsejtek esetében az effektorsejt/célsejt arányt a fertőzött sejtek százalékos aránya (a CD4-kimérareceptor-kísérletek esetében általában 20-50%, a CD16-kimérareceptor-kísérletek esetében általában >70%) alapján korrigáltuk.

A ξ-szekvencia ín vitro mutagenezise

Abból a célból, hogy a ξ-szekvencia 11. és/vagy 15. pozíciójában található aminosavak helyén pontmutációkat hozzunk létre, a ξ-transzmembrándoméntól 5'-irányban található BamHI hasítási helytől kiinduló, és a 11. pozícióban található natív ξ-aminosavat Cys-ről Gly-re (C11G), vagy a 15. pozícióban található aminosavat Asp-ról Gly-re (D15G) változtató, vagy mindkét pozícióban mutációt létrehozó (C11G/D15G) szintetikus oligonukleotidokat állítottunk elő, és azokat PCR reakcióban használtuk fel mutációt hordozó fragmensek előállítására, amelyeket aztán a vad típusú CD4^-konstrukciókba inszertáltunk.

ξ-Láncdeléciók létrehozása céljából ξ-lánc cDNSszekvenciákat amplifikáltunk PCR reakcióval, szintetikus láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, melyeket úgy terveztünk, hogy azok az 50., 59. vagy 65. aminosavakat követően stopkodont (UAG) hozzanak létre. A láncindító oligonukleotidok az 5’-végtől 5-6 nukleotid távolságra Notl hasítási helyet tartalmaztak - rendszerint a „CGC GGG CGG CCG CTA-szekvencia formájában (11. azonosító számú szekvencia) - ahol az utolsó három nukleotid felel meg a stopantikodonnak. A Notl- és stopantikodon-szekvenciákat a fragmens kívánt 3’-végével komplementer, 18 vagy több nukleotid követte. Az így nyert kimérák a következő elnevezéseket kapták: Οϋ16:ξΥ51*, a CD16^E60* és CD16^D66*. A transzmembrándoméntól 5'-irányban található BamHI hasítási helyet, valamint a Notl hasítási helyet használtuk fel olyan fragmensek előállítására, amelyeket aztán a vad típusú CD16^-konstrukcióba juttattunk vissza. Monomer ξ-kimérákat úgy állítottunk elő, hogy a fent ismertetett, Asp^- és Cys^-CD4-^-konstrukciók BamHI- és Sacl-enzimekkel történő emésztésével a ξ-lánc transzmembrán- és membránhoz közel eső intracelluláris szekvenciáit szabaddá tettük, és a fragmenst a CD16^E60‘- vagy CD16^D66*-konstrukciókba inszertáltuk.

Οΰ16:7:ξ(48-65) és CD16:7^(48-59) jelű, három részből álló kimérák előállítása A CD16^D66‘-konstrukció előállítása céljából a ξ-lánc transzmembrándoménjának és az azt követő, a citoplazmáris dómén részét képező 17 aminosavnak megfelelő cDNS-szekvenciát a CD5- és CD7-cDNSekből származó, megfelelő transzmembrán- és citoplazmáris doménokkal helyettesítettük. A CD5- és CD7-fragmensekat PCR reakcióval kaptuk, egy BamHI restrikciós hasítási helyet tartalmazó, a CD5-, valamint CD7-antigének transzmembrándoménjától közvetlenül 5'-irányban található régiónak megfelelő, előreirányuló („forward) oligonukleotid, valamint a CD5- és CD7-szekvenciákat, valamint a ξ-szekvenciát átfedő, a Sacl restrikciós hasítási helyet tartalmazó, az alábbi szekvenciával rendelkező ellenirányú oligonukleotidok felhasználásával:

Οϋ5:ξ: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (12. azonosító számú szekvencia); valamint

Οϋ7:ξ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (13. azonosító számú szekvencia).

A CD5- és CD7-eredetű PCR-termékeket BamHIés Sacl- enzimekkel emésztettük, és BamHI-, valamint Sacl- enzimekkel emésztett CD16^E60*-konstrukcióval ligáltuk, ezáltal a BamHI-SacI z-szekvenciát a CD7-fragmenssel helyettesítettük. A CD16:CD5- és CD16:CD7- konstrukciók előállítása céljából, PCR reakcióval CD5- és CD7-fragmensekat állítottunk elő, egy Notl restrikciós hasítási helyet, valamint a CD5-antigén esetében a Gln416.-, a CD7-antigén esetében az Ala193.-aminosavakat követően stopkódont (UAA) kódolóoligonukleotid felhasználásával. A CD5- és CD7-antigén eredetű PCR-fragmenseket BamHI- és Notl-enzimekkel emésztettük, és a CD16^Asp66*konstrukcióba inszertáltuk.

A ξ-lánc citolitikus szignáltranszdukciós szekvencia-elemében található N-terminális aminosavak in vitro mutagenezise

Olyan szintetikus láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő, amelyek a ξ-szekvenciaelemen belül található Sacl-helytől indultak ki, és alkalmazásuk azt ered24

HU 225 688 Β1 ményezte, hogy a 48. natív aminosav Asn-ról Ser-re (N48S), az 50. aminosav Leu-ról Ser-re (L50S), az 51. aminosav pedig Tyr-ról Phe-re (Y51F) változott; a fenti oligonukleotidok PCR reakcióban történő alkalmazásával nyert fragmensekat a vad típusú ΰΟ16:7:ξ(48-65)konstrukcióba juttattuk vissza.

A ζ-lánc citolitikus szignáltranszdukciós szekvencia-elemében található C-terminális aminosavak in vitro mutagenezise

Olyan szintetikus láncindító oligonukleotidokat állítottunk elő, amelyek a stopkodontól 3’-irányban található Notl hasítási helynél kezdődtek, és a natív 60. aminosavat Glu-ról Gln-re (E60Q), a 61. aminosavat Glu-ról Gln-re (E61Q), a 62. aminosavat Tyr-ról Phe-re vagy Ser-re (Y62F vagy Y62S), valamint a 63. aminosavat Asp-ról Asn-re (D63N) változtatták; a fenti oligonukleotidokat PCR reakcióban alkalmaztuk, és az így nyert fragmensekat a BamHI-helytől a Notl-helyig terjedően, a vad típusú CD16^D66*-konstrukcióba szubklónoztuk.

A CD 16:7:^(33-65)-, a CD16:7:^(71-104)- és a

CD16:7:^(104—137)-kimórakonstrukciók

A transzmembrán- és intracelluláris doménok határánál Miül- és Notl- helyeket tartalmazó CD7-transzmembrán-fragmenst PCR reakcióval állítottunk elő, a következő szekvenciával rendelkező oligonukleotid alkalmazásával: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (14. azonosító számú szekvencia). Az így kapott PCR-fragmenst BamHI- és Notl-enzimekkel emésztettük, és a CD16:7^(48-65)-konstrukcióba inszertáltuk. A 33-65., 71-104. és 104-137. aminosavakat kódoló z-fragmenseket PCR reakcióval kaptuk, az előreirányuló láncindító oligonukleotid 5’-végén Mlul-helyet, az ellenirányú láncindító oligonukleotid 5'-végén pedig stopkodont és azt követő Notl-helyet tartalmazó láncindító oligonukleotidpár alkalmazásával. Valamennyi esetben a restrikciós helyeket a láncindító oligonukleotid 5’-végétől hat nukleotid távolságra Iktattuk be, hogy az restrikciós enzimmel hasítható legyen.

ξ-33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (15. azonosító számú szekvencia):

ξ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (16. azonosító számú szekvencia); és ξ-104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA

GGC GAG CGC (17. azonosító számú szekvencia).

FcRylIA-receptor-eredetű deléciós mutánsok előállítása

FcRylIA-receptor-eredetű, a karboxiterminális végen deléciót tartalmazó mutánsokat PCR reakcióval állítottunk elő, a teljes hosszúságú konstrukcióval azonos módon eljárva, de a 282. és 298. pozíciókban található tirozint kódoló szekvenciákat stopkodonná (TAA) alakítva. Az N-terminális deléciókat úgy hoztuk létre, hogy PCR reakcióval az intracelluláris dómén egyre kisebb részét amplifikáltuk, olyan oligonukleotidok alkalmazásával, amelyek lehetővé tették a kapott fragmens inszertálását az előzőek szerint előállított expressziós plazmid Miül és Notl hasítási helyei közé, amely expressziós plazmid a CD16 extracelluláris doménját a

CD7 transzmembrándoménjával fuzionáltatva kódolta, és a fúzióban az utóbbi a transzmembrán- és az intracelluláris dómén határán Miül hasítási helyben és „junction”-ben végződött.

A találmány további megvalósítási módjai

A fenti példákkal példákkal azt szemléltettük, hogy a ξ-, η- vagy γ-kimérák aggregációja elegendő T-sejtekben a sejtszintű citolitikus effektorválasz kiváltásához. A ξ-, η- vagy γ-láncok expressziójának ismert köre

- amely T-limfocitákra, természetes ölősejtekre, bazofil granulocitákra, makrofágokra és hízósejtekre terjed ki

- arra utal, hogy a hematopoetikus (vérképzőrendszeri) eredetű sejtekben közös szenzoros apparátussal konzervált szekvenciaelemek reagálhatnak, és az immunrendszeren belül a gazdaszervezet védekezőkészségének lényeges összetevőjét receptoraggregációs események közvetíthetik.

A citolitikus válaszreakcióra való képesség, és annak MHC-ll-receptort hordozó célsejtekkel szemben mutatott hiánya azt mutatja, hogy ξ-, η- vagy γ-láncokon alapuló kimérák adoptív immunterápián keresztül, az AIDS-szel szemben történő genetikai beavatkozás alapját képezhetik. Az endogén ξ- és γ-láncok széles körű elterjedtsége, valamint az a tény, hogy a γ-láncokkal kapcsolódó Fc-receptorok különböző sejttípusokban képesek citotoxicitás közvetítésére [Fanger és munkatársai: Immunoi. Today 10, 92 (1989)], számos különböző sejt alkalmazhatóságát felveti a fenti célra. Például neutrofil granulociták - amelyek a keringésben igen rövid (körülbelül 4 órás) élettartammal rendelkeznek, és erős citolitikus hatást fejtenek ki - a kimérák expresszálása számára előnyös célsejteket képezhetnek. Neutrofil sejtek HIV-vírussal történő fertőződése nem valószínű, hogy vírusok kiszabadulásához vezetne, és a fenti sejtek bősége (a leukociták között a legelterjedtebb típus) elősegítheti a gazdaszervezet védekezését. Egy további előnyös lehetőség szerint gazdasejtekként érett T-sejteket alkalmazunk, amely napjainkban vált hozzáférhető sejtpopulációvá retrovírussal történő genetikai beavatkozás céljára [Rosenberg: Sci. Am. 262, 62 (1990)]. Rekombináns IL—2 segítségével T-sejt-populációk tenyészetben viszonylag könnyen felszaporíthatók, és a felszaporított sejtpopulációk a visszainfundálást követően tipikusan korlátozott élettartammal rendelkeznek [Rosenberg és munkatársai: N. Engl. J. Med. 323, 570 (1990)].

Megfelelő körülmények mellett CD4-kimérákat expresszáló sejtek által történő HIV-felismerés szintén mitogén stimulust képezhet, lehetőséget teremtve arra, hogy a felfegyverzett sejtpopuláció gyorsan reagáljon a vírusterhelésre. Bár a leírásban a fúziós proteinek citotoxikus T-limfocitákban való viselkedésére összpontosítottunk, a kimérák „helper” T-limfocitákban történő expresszálása citokinek HIV-vírus által mobilizálható forrását képezheti, amely AIDS-betegségben a „helper”-sejtek alosztályának csökkenésével szemben fejthet ki hatást. Napjainkban több olyan eljárást írtak le, melyek alkalmazásával géntechnológiai úton, a vírus behatolásának megakadályozásától eltérő fázisban

HU 225 688 Β1 történő beavatkozással fertőzéssel szembeni rezisztenciát hoztak létre [Friedman és munkatársai: Natúré 335, 452 (1988); Green és munkatársai: Cell 58, 215 (1989); Malim és munkatársai: Cell 58, 205 (1989); Trono és munkatársai: Cell 59, 113 (1989); Buonocore és munkatársai: Natúré 345, 625 (1990)], melyek arra utalnak, hogy megtervezhetők olyan CD4-kimérákat hordozó sejtek, amelyek a vírustermelődést megfelelő, hatásukat intracellulárisan kifejtő doménokkal rendelkező molekulák expresszálásán keresztül akadályozzák meg.

Az, hogy autonóm kimérák alkalmazásával T-limfociták számára jelzéseket tudunk közvetíteni, retrovlrus alkalmazásával géntechnológiai úton módosított limfociták in vivő szabályozását is lehetővé teszi. Keresztkötéseket létrehozó stimulusok - például komplementkötő doménok eltávolítása céljából géntechnológiai eljárással módosított, specifikus IgM-ellenanyagok által közvetített stimulusok - lehetővé tehetik az említett limfociták számának in situ növelését, míg hasonló, specifikus IgG-ellenanyagokkal (például a kiméraláncban génsebészeti úton létrehozott aminosaveltérést felismerő ellenanyagokkal) történő kezelés szelektív módon képes lehet a géntechnológiai eljárással módosított populációhoz tartozó sejtek számának csökkentésére. Kimutattuk továbbá, hogy anti-CD4 IgM-ellenanyagok alkalmazása esetében CD4^-kimérákat expresszáló Jurkat-féle sejtekben nem szükséges keresztkötések további létrehozása a kalciummobilizáció kiváltásához. Ha a sejtek szervezeten kívül végzett, ismételt felszaporítása nélkül képesek lennénk sejtpopulációk szabályozására, az jelentősen kiterjeszthetné a géntechnológiai eljárással módosított T-sejtek jelenlegi alkalmazási körét és hatékonyságát.

ξ, η vagy γ intracelluláris szekvenciákat tartalmazó további kimérákat előállíthatunk úgy, hogy a receptor extracelluláris dohménját kódoló cDNS-szekvenciákat vagy genomi eredetű szekvenciákat, a választott transzmembrándomént közvetlenül megelőzően restrikciós hasítási hellyel látunk el. A restrikciós hasítási hellyel végződő extracelluláris dómén fragmenst ezután ξ-, η- vagy γ-szekvenciákhoz kapcsolhatjuk. Tipikus extracelluláris doménokat nyerhetünk komplementet, szénhidrátokat, vírusproteineket, baktériumokat, protozoon- vagy metazoonparazitákat, vagy azok által indukált proteineket felismerő receptorokból. Hasonlóképp, kórokozók vagy tumorsejtek által expresszált ligandumokat vagy receptorokat is ξ-, η- vagy γ-szekvenciákhoz kapcsolhatunk, hogy az immunválaszt célzottan, a fenti ligandumokat felismerő receptorokat hor20 dozó sejtekkel szemben irányítsuk.

Bár a találmányt a fentiekben bizonyos konkrét megvalósítási módokon keresztül szemléltettük, nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás tovább módosítható, és az igényelt oltalmi kör kiterjed annak variációira, eltérő alkalmazásaira vagy adaptációira, amennyiben az alkalmazott változtatások a találmány szerinti megoldásra vonatkozó technika állásához tartoznak, és amennyiben rájuk olvashatók a találmány szerinti megoldás előzőekben bemutatott - és a csatolt igénypontokban megfogalmazott - lényegi sajátosságai.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1728 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: genomi DNS

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950

HU 225 688 Β1

GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200 TGCTACTTGC TAGATGGAAT CCTCTTCATC TACGGAGTCA TCATCACAGC 1250 CCTGTACCTG AGAGCAAAAT TCAGCAGGAG TGCAGAGACT GCTGCCAACC 1300 TGCAGGACCC CAACCAGCTC TACAATGAGC TCAATCTAGG GCGAAGAGAG 1350 GAATATGACG TCTTGGAGAA GAAGCGGGCT CGGGATCCAG AGATGGGAGG 1400 CAAACAGCAG AGGAGGAGGA ACCCCCAGGA AGGCGTATAC AATGCACTGC 1450 AGAAAGACAA GATGCCAGAA GCCTACAGTG AGATCGGCAC AAAAGGCGAG 1500 AGGCGGAGAG GCAAGGGGCA CGATGGCCTT TACCAGGACA GCCACTTCCA 1550 AGCAGTGCAG TTCGGGAACA GAAGAGAGAG AGAAGGTTCA GAACTCACAA 1600 GGACCCTTGG GTTAAGAGCC CGCCCCAAAG GTGAAAGCAC CCAGCAGAGT 1650 AGCCAATCCT GTGCCAGCGT CTTCAGCATC CCCACTCTGT GGAGTCCATG 1700 GCCACCCAGT AGCAGCTCCC AGCTCTAA 1728

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1389 bázispár

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: genomi DNS

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50 GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100 GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150 TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200 CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250 GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300 ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350 GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400 TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450 CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500 GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550 GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600 GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650 ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700 GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750 TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800 CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850 TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900 CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950 GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000 CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050 GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100 GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150 TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCGCAGCTC 1200 TGCTATATCC TGGATGCCAT CCTGTTTTTG TATGGTATTG TCCTTACCCT 1250 GCTCTACTGT CGACTCAAGA TCCAGGTCCG AAAGGCAGAC ATAGCCAGCC 1300 GTGAGAAATC AGATGCTGTC TACACGGGCC TGAACACCCG GAACCAGGAG 1350 ACATATGAGA CTCTGAAACA TGAGAAACCA CCCCAATAG 1389

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1599 bázispár TlPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris

HU 225 688 Β1

MOLEKULATlPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAACCGGG GAGTCCCTTT TAGGCACTTG CTTCTGGTGC TGCAACTGGC 50

GCTCCTCCCA GCAGCCACTC AGGGAAACAA AGTGGTGCTG GGCAAAAAAG 100

GGGATACAGT GGAACTGACC TGTACAGCTT CCCAGAAGAA GAGCATACAA 150

TTCCACTGGA AAAACTCCAA CCAGATAAAG ATTCTGGGAA ATCAGGGCTC 200

CTTCTTAACT AAAGGTCCAT CCAAGCTGAA TGATCGCGCT GACTCAAGAA 250

GAAGCCTTTG GGACCAAGGA AACTTCCCCC TGATCATCAA GAATCTTAAG 300

ATAGAAGACT CAGATACTTA CATCTGTGAA GTGGAGGACC AGAAGGAGGA 350

GGTGCAATTG CTAGTGTTCG GATTGACTGC CAACTCTGAC ACCCACCTGC 400

TTCAGGGGCA GAGCCTGACC CTGACCTTGG AGAGCCCCCC TGGTAGTAGC 450

CCCTCAGTGC AATGTAGGAG TCCAAGGGGT AAAAACATAC AGGGGGGGAA 500

GACCCTCTCC GTGTCTCAGC TGGAGCTCCA GGATAGTGGC ACCTGGACAT 550

GCACTGTCTT GCAGAACCAG AAGAAGGTGG AGTTCAAAAT AGACATCGTG 600

GTGCTAGCTT TCCAGAAGGC CTCCAGCATA GTCTATAAGA AAGAGGGGGA 650

ACAGGTGGAG TTCTCCTTCC CACTCGCCTT TACAGTTGAA AAGCTGACGG 700

GCAGTGGCGA GCTGTGGTGG CAGGCGGAGA GGGCTTCCTC CTCCAAGTCT 750

TGGATCACCT TTGACCTGAA GAACAAGGAA GTGTCTGTAA AACGGGTTAC 800

CCAGGACCCT AAGCTCCAGA TGGGCAAGAA GCTCCCGCTC CACCTCACCC 850

TGCCCCAGGC CTTGCCTCAG TATGCTGGCT CTGGAAACCT CACCCTGGCC 900

CTTGAAGCGA AAACAGGAAA GTTGCATCAG GAAGTGAACC TGGTGGTGAT 950

GAGAGCCACT CAGCTCCAGA AAAATTTGAC CTGTGAGGTG TGGGGACCCA 1000

CCTCCCCTAA GCTGATGCTG AGCTTGAAAC TGGAGAACAA GGAGGCAAAG 1050

GTCTCGAAGC GGGAGAAGCC GGTGTGGGTG CTGAACCCTG AGGCGGGGAT 1100

GTGGCAGTGT CTGCTGAGTG ACTCGGGACA GGTCCTGCTG GAATCCAACA 1150

TCAAGGTTCT GCCCACATGG TCCACCCCGG TGCACGCGGA TCCCAAACTC 1200

TGCTACCTGC TGGATGGAAT CCTCTTCATC TATGGTGTCA TTCTCACTGC 1250

CTTGTTCCTG AGAGTGAAGT TCAGCAGGAG CGCAGAGCCC CCCGCGTACC 1300

AGCAGGGCCA GAACCAGCTC TATAACGAGC TCAATCTAGG ACGAAGAGAG 1350

GAGTACGATG TTTTGGACAA GAGACGTGGC CGGGACCCTG AGATGGGGGG 1400

AAAGCCGAGA AGGAAGAACC CTCAGGAAGG CCTGTACAAT GAACTGCAGA 1450

AAGATAAGAT GGCGGAGGCC TACAGTGAGA TTGGGATGAA AGGCGAGCGC 1500

CGGAGGGGCA AGGGGCACGA TGGCCTTTAC CAGGGTCTCA GTACAGCCAC 1550

CAAGGACACC TACGACGCCC TTCACATGCA GGCCCTGCCC CCTCGCTAA 1599

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 575 aminosav

TlPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: fehérje

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Asn

Arg

Gly

Val 5

Pro

Phe Arg

His

Leu 10

Leu

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

Alá

Leu

Leu

Pro

Alá

Alá

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Alá

Ser

Gin

Lys

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Alá

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

Ile

90 95

HU 225 688 Β1

Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser 100

Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu 115 120

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly 130 135

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser 145 150

Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr 165

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys 180

Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val 195 200

Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly 210 215

Leu Alá Phe Thr Val Glu Lys Leu 225 230

Gin Alá Glu Arg Alá Ser Ser Ser 245

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys 260

Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu 275 280

Pro Gin Tyr Alá Gly Ser Gly Asn 290 295

Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val 305 310

Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys 325

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu 340

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val 355 360

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly 370 375

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr 385 390

Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu 405

Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu 105 110

Leu Val Phe Gly Leu Thr Alá Asn 125

Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 140

Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 155 160

Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 170 175

Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 185 190

Val Leu Alá Phe Gin Lys Alá Ser 205

Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 220

Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 235 240

Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu 250 255

Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 265 270

His Leu Thr Leu Pro Gin Alá Leu 285

Leu Thr Leu Alá Leu Glu Alá Lys 300

Asn Leu Val Val Met Arg Alá Thr 315 320

Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro 330 335

Glu Asn Lys Glu Alá Lys Val Ser 345 350

Leu Asn Pro Glu Alá Gly Met Trp 365

Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 380

Pro Val His Alá Asp Pro Lys Leu 395 400

Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr 410 415

HU 225 688 Β1

Alá

Leu

Tyr

Leu 420

Arg

Alá

Lys

Phe

Ser 425

Arg

Ser

Alá

Glu

Thr 430

Alá

Alá

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

435

440

445

Arg

Glu

Glu

Tyr

Asp

Val

Leu

Glu

Lys

Lys

Arg

Alá

Arg

Asp

Pro

Glu

450

455

460

Met

Gly

Gly

Lys

Gin

Gin

Arg

Arg

Arg

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Val

Tyr

465

470

475

480

Asn

Alá

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Pro

Glu

Alá

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

485

490

495

Thr

Lys

Gly

Glu

Arg

Arg

Arg

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

500

505

510

Asp

Ser

His

Phe

Gin

Alá

Val

Gin

Phe

Gly

Asn

Arg

Arg

Glu

Arg

Glu

515

520

525

Gly

Ser

Glu

Leu

Thr

Arg

Thr

Leu

Gly

Leu

Arg

Alá

Arg

Pro

Lys

Gly

530

535

540

Glu

Ser

Thr

Gin

Gin

Ser

Ser

Gin

Ser

Cys

Alá

Ser

Val

Phe

Ser

Ile

555

550

565

560

Pro

Thr

Leu

Trp

Ser

Pro

Trp

Pro

Pro

Ser

Ser

Ser

Ser

Gin

Leu

565 570 575

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 442 aminosav TlPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

Met Asn Arg 1

Gly

Val 5

Pro

Phe

Arg

His

Leu 10

Leu

Leu

Val

Leu

Gin 15

Leu

Alá

Leu

Leu

Pro

Alá

Alá

Thr

Gin

Gly

Asn

Lys

Val

Val

Leu

Gly

Lys

20

25

30

Lys

Gly

Asp

Thr

Val

Glu

Leu

Thr

Cys

Thr

Alá

Ser

Gin

Lys

Lys

Ser

35

40

45

Ile

Gin

Phe

His

Trp

Lys

Asn

Ser

Asn

Gin

Ile

Lys

Ile

Leu

Gly

Asn

50

55

60

Gin

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Lys

Leu

Asn

Asp

Arg

Alá

65

70

75

80

Asp

Ser

Arg

Arg

Ser

Leu

Trp

Asp

Gin

Gly

Asn

Phe

Pro

Leu

Ile

Ile

85

90

95

Lys

Asn

Leu

Lys

Ile

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

Tyr

Ile

Cys

Glu

Val

Glu

100

105

110

Asp

Gin

Lys

Glu

Glu

Val

Gin

Leu

Leu

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Alá

Asn

115

120

125

HU 225 688 Β1

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 130 135 140

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly

145 150 155 160

Lys Asn Ile Gin Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu

165 170 175

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 180 185 190

Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Alá Phe Gin Lys Alá Ser 195 200 205

Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 210 215 220

Leu Alá Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp

225 230 235 240

Gin Alá Glu Arg Alá Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu

245 250 255

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 260 265 270

Gin Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gin Alá Leu 275 280 285

Pro Gin Tyr Alá Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Alá Leu Glu Alá Lys 290 295 300

Thr Gly Lys Leu His Gin Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Alá Thr

305 310 315 320

Gin Leu Gin Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro

325 330 335

Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Alá Lys Val Ser 340 345 350

Lys Arg Glu Lys Pro Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Alá Gly Met Trp 355 360 365

Gin Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gin Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile 370 375 380

Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Alá Asp Pro Gin Leu

385 390 395 400

Cys Tyr Ile Leu Asp Alá Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr

405 410 415

Leu Leu Tyr Cys Arg Leu Lys Ile Gin Val Arg Lys Alá Asp Ile Alá 420 425 430

Ser Arg Glu Lys Ser Asp Alá Val Tyr Thr Gly Leu Asn Thr Arg Asn 435 440 445

HU 225 688 Β1

Gin Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gin 450 455 460 462

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 532 aminosav

TlPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: fehérje

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg 1 5

Alá Leu Leu Pro Alá Alá Thr Gin 20

Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr 35 40 lle Gin Phe His Trp Lys Asn Ser 50 55

Gin Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly 65 70

Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp 85

Lys Asn Leu Lys lle Glu Asp Ser 100

Asp Gin Lys Glu Glu Val Gin Leu 115 120

Ser Asp Thr His Leu Leu Gin Gly 130 135

Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser 145 150

Lys Asn lle Gin Gly Gly Lys Thr 165

Gin Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys 180

Val Glu Phe Lys lle Asp He Val 195 200

Ser lle Val Tyr Lys Lys Glu Gly 210 215

Leu Alá Phe Thr Val Glu Lys Leu 225 230

Gin Alá Glu Arg Alá Ser Ser Ser 245

Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys 260

His Leu Leu Leu Val Leu Gin Leu 10 15

Gly Asn Lys Val Val Leu Gly Lys 25 30

Cys Thr Alá Ser Gin Lys Lys Ser 45

Asn Gin lle Lys lle Leu Gly Asn 60

Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Alá 75 80

Gin Gly Asn Phe Pro Leu lle lle 90 95

Asp Thr Tyr lle Cys Glu Val Glu 105 110

Leu Val Phe Gly Leu Thr Alá Asn 125

Gin Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu 140

Val Gin Cys Arg Ser Pro Arg Gly 155 160

Leu Ser Val Ser Gin Leu Glu Leu 170 175

Thr Val Leu Gin Asn Gin Lys Lys 185 190

Val Leu Alá Phe Gin Lys Alá Ser 205

Glu Gin Val Glu Phe Ser Phe Pro 220

Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp 235 240

Lys Ser Trp lle Thr Phe Asp Leu 250 255

Arg Val Thr Gin Asp Pro Lys Leu 265 270

HU 225 688 Β1

Gin	Met	Gly 275	Lys	Lys	Leu	Pro	Leu 280	His	Leu	Thr
Pro	Gin 290	Tyr	Alá	Gly	Ser	Gly 295	Asn	Leu	Thr	Leu
Thr 305	Gly	Lys	Leu	His	Gin 310	Glu	Val	Asn	Leu	Val 315
Gin	Leu	Gin	Lys	Asn 325	Leu	Thr	Cys	Glu	Val 330	Trp
Lys	Leu	Met	Leu 340	Ser	Leu	Lys	Leu	Glu 345	Asn	Lys
Lys	Arg	Glu 355	Lys	Pro	Val	Trp	Val 360	Leu	Asn	Pro
Gin	Cys 370	Leu	Leu	Ser	Asp	Ser 375	Gly	Gin	Val	Leu
Lys 385	Val	Leu	Pro	Thr	Trp 390	Ser	Thr	Pro	Val	His 395
Cys	Tyr	Leu	Leu	Asp 405	Gly	Ile	Leu	Phe	Ile 410	Tyr
Alá	Leu	Phe	Leu 420	Arg	Val	Lys	Phe	Ser 425	Arg	Ser
Tyr	Gin	Gin 435	Gly	Gin	Asn	Gin	Leu 440	Tyr	Asn	Glu
Arg	Glu 450	Glu	Tyr	Asp	Val	Leu 455	Asp	Lys	Arg	Arg
Met 465	Gly	Gly	Lys	Pro	Arg 470	Arg	Lys	Asn	Pro	Gin 475
Glu	Leu	Gin	Lys	Asp 485	Lys	Met	Alá	Glu	Alá 490	Tyr
Lys	Gly	Glu	Arg 500	Arg	Arg	Gly	Lys	Gly 505	His	Asp
Leu	Ser	Thr 515	Alá	Thr	Lys	Asp	Thr 520	Tyr	Asp	Alá

Leu Pro Gin Alá Leu

285

Alá Leu Glu Alá Lys 300

Val Met Arg Alá Thr 320

Gly Pro Thr Ser Pro 335

Glu Alá Lys Val Ser 350

Glu Alá Gly Met Trp 365

Leu Glu Ser Asn Ile 380

Alá Asp Pro Lys Leu 400

Gly Val Ile Leu Thr 415

Alá Glu Pro Pro Alá 430

Leu Asn Leu Gly Arg 445

Gly Arg Asp Pro Glu 460

Glu Gly Leu Tyr Asn 480

Ser Glu Ile Gly Met 495

Gly Leu Tyr Gin Gly 510

Leu His Met Gin Alá 525

Leu Pro Pro Arg 530

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATiPUS: nukleinsav

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

HU 225 688 Β1

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 50 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 15 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCGGC CGCTA

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 48 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 13. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TAATCCCG

HU 225 688 Β1

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 14. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA 33

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 15. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA 36

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 16. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG 33

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 17. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC 33

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 26 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 18. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT 26

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 42 bázis

TlPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: nukleinsav

A 19. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT 42

HU 225 688 Β1

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 40 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 20. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG 40

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 21. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC 32

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATIPUS: nukleinsav

A 22. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A 31

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 31 bázis

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: nukleinsav

A 23. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A 31

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 171 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATIPUS: aminosav

A 24. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Glu

His

Ser

Thr 5

Phe

Leu

Ser

Gly

Leu 10

Val

Leu

Alá

Thr

Leu 15

Leu

Ser

Gin

Val

Ser 20

Pro

Phe

Lys

He

Pro 25

He

Glu

Glu

Leu

Glu 30

Asp

Arg

Val

Phe

Val 35

Asn

Cys

Asn

Thr

Ser 40

lle

Thr

Trp

Val

Glu 45

Gly

Thr

Val

Gly

Thr 50

Leu

Leu

Ser

Asp

He 55

Thr

Arg

Leu

Asp

Leu 60

Gly

Lys

Arg

lle

HU 225 688 Β1

Leu Asp 65

Pro Arg

Gly

Ile 70

Tyr

Arg

Cys Asn Gly Thr Asp 75

Ile

Tyr

Lys 80

Asp

Lys

Glu

Ser

Thr

Val

Gin

Val

His

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Ser

cys

85

90

95

Val

Glu

Leu

Asp

Pro

Alá

Thr

Val

Alá

Gly

Ile

Ile

Val

Thr

Asp

Val

100

105

110

Alá

Ile

Thr

Leu

Leu

Leu

Alá

Leu

Gly

Val

Phe

Cys

Phe

Alá

Gly

His

115

120

125

Glu

Thr

Gly

Arg

Leu

Ser

Gly

Alá

Alá

Asp

Thr

Gin

Alá

Leu

Leu

Arg

130

135

140

Asn

Asp

Gin

Val

Tyr

Gin

Pro

Leu

Arg

Asp

Arg

Asp

Asp

Alá

Gin

Tyr

145

150

155

160

Ser

His

Leu

Gly

Gly

Asn

Trp

Alá

Arg

Asn

Lys

165 170

A 25. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 182 aminosav TlPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 25. Met

AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

Alá

Ile

Ile 15

Leu

Glu Gin

Gly

Lys 5

Gly

Leu

Alá

Val

Leu 10

Ile

Leu

Leu

Gin Gly

Thr

Leu

Alá

Gin

Ser

Ile

Lys

Gly

Asn

His

Leu

Val

Lys

20

25

30

Val

Tyr Asp

Tyr

Gin

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Leu

Leu

Thr

Cys

Asp

Alá

35

40

45

Glu

Alá Lys

Asn

Ile

Thr

Trp

Phe

Lys

Asp

Gly

Lys

Met

Ile

Gly

Phe

50

55

60

Leu

Thr Glu

Asp

Lys

Lys

Lys

Trp

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Alá

Lys

Asp

65

70

75

80

Pro

Arg Gly

Met

Tyr

Gin

Cys

Lys

Gly

Ser

Gin

Asn

Lys

Ser

Lys

Pro

85

90

95

Leu

Gin Val

Tyr

Tyr

Arg

Met

Cys

Gin

Asn

Cys

Ile

Glu

Leu

Asn

Alá

100

105

110

Alá

Thr Ile

Ser

Gly

Phe

Leu

Phe

Alá

Glu

Ile

Val

Ser

Ile

Phe

Val

115

120

125

Leu

Alá Val

Gly

Val

Tyr

Phe

Ile

Alá

Gly

Gin

Asp

Gly

Val

Arg

Gin

130

135

140

Ser

Arg Alá

Ser

Asp

Lys

Gin

Thr

Leu

Leu

Pro

Asn

Asp

Gin

Leu

Tyr

145

150

155

160

Gin

Pro Leu

Lys

Asp

Arg

Glu

Asp

Asp

Gin

Tyr

Ser

His

Leu

Gin

Gly

165

170

175

HU 225 688 Β1

Asn Gin Leu Arg Arg Asn 180

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 220 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: aminosav

A 26. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Pro

Gly Gly

Leu 5

Glu

Alá

Leu

Arg

Alá 10

Leu

Pro

Leu

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Ser

Tyr

Alá

Cys

Leu

Gly

Pro

Gly

Cys

Gin

Alá

Leu

Arg

Val

Glu

20

25

30

Gly

Gly

Pro

Pro

Ser

Leu

Thr

Val

Asn

Leu

Gly

Glu

Glu

Alá

Arg

Leu

35

40

45

Thr

Cys

Glu

Asn

Asn

Gly

Arg

Asn

Pro

Asn

Ile

Thr

Trp

Trp

Phe

Ser

50

55

60

Leu

Gin

Ser

Asn

Ile

Thr

Trp

Pro

Pro

Val

Pro

Leu

Gly

Pro

Gly

Gin

65

70

75

80

Gly

Thr

Thr

Gly

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Glu

Val

Asn

Lys

Asn

Thr

Gly

85

90

95

Alá

Cys

Thr

Gly

Cys

Gin

Val

Ile

Glu

Asn

Asn

Ile

Leu

Lys

Arg

Ser

100

105

110

Cys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Arg

Val

Arg

Asn

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Phe

Leu

115

120

125

Asp

Met

Gly

Glu

Gly

Thr

Lys

Asn

Arg

Ile

Ile

Thr

Alá

Glu

Gly

Ile

130

135

140

Ile

Leu

Leu

Phe

Cys

Alá

Val

Val

Pro

Gly

Thr

Leu

Leu

Leu

Phe

Arg

145

150

155

160

Lys

Arg

Trp

Gin

Asn

Glu

Lys

Phe

Gly

Val

Asp

Met

Pro

Asp

Asp

Tyr

165

170

175

Glu

Asp

Glu

Asn

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

Leu

Asp

Asp

Cys

Ser

Met

180

185

190

Tyr

Glu

Asp

Ile

Ser

Arg

Gly

Leu

Gin

Gly

Thr

Tyr

Gin

Asp

Val

Gly

195

200

205

Asn

Leu

His

Ile

Gly

Asp

Alá

Gin

Leu

Glu

Lys

Pro

210

215

220

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 228 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: aminosav

HU 225 688 Β1

A 27. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Alá

Thr

Leu

Val 5

Leu

Ser

Ser

Met

Pro 10

Cys

His

Trp

Leu

Leu 15

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Phe

Ser

Gly

Glu

Pro

Val

Pro

Alá

Met

Thr

Ser

Ser

20

25

30

Asp

Leu

Pro

Leu

Asn

Phe

Gin

Gly

Ser

Pro

Cys

Ser

Gin

lle

Trp

Gin

35

40

45

His

Pro

Arg

Phe

Alá

Alá

Lys

Lys

Arg

Ser

Ser

Met

Val

Lys

Phe

His

50

55

60

Cys

Tyr

Thr

Asn

His

Ser

Gly

Alá

Leu

Thr

Trp

Phe

Arg

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ser

Gin

Gin

Pro

Gin

Glu

Leu

Val

Ser

Glu

Glu

Gly

Arg

He

Val

Gin

85

90

95

Thr

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Tyr

Thr

Leu

Thr

He

Gin

Asn

He

Gin

Tyr

100

105

110

Glu

Asp

Asn

Gly

lle

Tyr

Phe

Cys

Lys

Gin

Lys

Cys

Asp

Ser

Alá

Asn

115

120

125

His

Asn

Val

Thr

Asp

Ser

Cys

Gly

Thr

Glu

Leu

Leu

Val

Leu

Gly

Phe

130

135

140

Ser

Thr

Leu

Asp

Gin

Leu

Lys

Arg

Arg

Asn

Thr

Leu

Lys

Asp

Gly

He

145

150

155

160

lle

Leu

He

Gin

Thr

Leu

Leu

He

He

Leu

Phe

He

He

Val

Pro

He

165

170

175

Phe

Leu

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Asp

Gly

Lys

Alá

Gly

Met

Glu

Glu

Asp

180

185

190

His

Thr

Tyr

Glu

Gly

Leu

Asn

lle

Asp

Gin

Thr

Alá

Thr

Tyr

Glu

Asp

195

200

205

He

Val

Thr

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Val

Lys

Trp

Ser

Val

Gly

Glu

His

210

215

220

Pro Gly Gin Glu

225

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: fehérje

A 28. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly 15 10 15

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 aminosav

HU 225 688 Β1

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 29. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Alá Asp Pro Lys Leu Cys Tyr 15 10 15

Leu Leu Asp Gly

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 12 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 30. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Leu Gly Glu Pro Gin Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Alá 15 10

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 19 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 31. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Alá Asp Pro Gin Leu Cys Tyr 15 10 15

Ile Leu Asp Alá

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 32. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp 15 10 15

Gly

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 16 aminosav

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 33. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Ser Pro Pro Gly Alá Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp 15 10 15

Gly

HU 225 688 Β1

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 142 aminosav TlPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

A 34. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gin 1

Ser

Phe

Gly Leu 5

Leu Asp

Pro

Lys

Leu Cys 10

Tyr Leu

Leu

Asp 15

Gly

Ile

Leu

Phe

Ile

Tyr

Gly

Val

Ile

Leu

Thr

Alá

Leu

Phe

Leu

Arg

Val

20

25

30

Lys

Phe

Ser

Arg

Ser

Alá

Glu

Pro

Pro

Alá

Tyr

Gin

Gin

Gly

Gin

Asn

35

40

45

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Arg

Glu

Glu

Tyr

Asp

Val

50

55

60

Leu

Asp

Lys

Arg

Arg

Gly

Arg

Asp

Pro

Glu

Met

Gly

Gly

Lys

Pro

Arg

65

70

75

80

Arg

Lys

Asn

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

85

90

95

Met

Alá

Glu

Alá

Tyr

Ser

Glu

Ile

Gly

Met

Lys

Gly

Glu

Arg

Arg

Arg

100

105

110

Gly

Lys

Gly

His

Asp

Gly

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Ser

Thr

Alá

Thr

Lys

115

120

125

Asp

Thr

Tyr

Asp

Alá

Leu

His

Met

Gin

Alá

Leu

Pro

Pro

Arg

130 135 140

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATlPUS: fehérje

A 35. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg 1

Val

Lys

Phe

Ser 5

Arg Ser

Alá Glu

Pro 10

Pro

Alá Tyr Gin Gin 15

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Arg

Glu

Glu

Tyr

20

25

30

Asp Val Leu 35

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 32 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

HU 225 688 Β1

A 36. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys 1

Lys

Leu

Val

Lys 5

Lys

Phe Arg Gin

Lys 10

Lys

Gin

Arg

Gin

Asn 15

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Arg

Lgu

Glu

Tyr

Asp

20

25

30

Val Leu

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav TlPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

A 37. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg 1

Thr

Gin

Ile

Lys 5

Lys

Leu

Cys

Ser

Trp 10

Arg

Asp

Lys

Asn

Ser 15

Alá

Alá

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Arg

Glu

20

25

30

Glu Tyr Asp Val Leu 35

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 aminosav TlPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

A 38. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg 1

Thr

Arg

Phe

Ser 5

Arg

Ser

Alá

Glu

Pro 10

Pro

Alá

Tyr

Gin

Gin 15

Gly

Gin

Asn

Gin

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Asn

Leu

Gly

Arg

Arg

Glu

20

25

30

Glu Tyr Asp Val Leu 35

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 36 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: nem releváns TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATlPUS: fehérje

A 39. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Thr Arg Asp 1

Pro Glu 5

Met Gly Gly Lys 10

Pro

Arg

Arg

Lys

Asn 15

Pro

Gin

Glu

Gly

Leu

Tyr

Asn

Glu

Leu

Gin

Lys

Asp

Lys

Met

Alá

20

25

30

Glu

Alá

Tyr

Ser

Glu

Ile

HU 225 688 Β1

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 38 aminosav

TlPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 40. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Thr Arg Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly 15 10 15

His Asp Gly Leu Tyr Gin Gly Leu Ser Thr Alá Thr Lys Asp Thr 20 25 30

Tyr Asp Alá Leu His Met Gin Alá

Claims (28)

1. Legalább két, membránhoz kötött proteintermészetű kimérareceptort expresszáló terápiás sejtek alkalmazása emlősben fertőzés, tumoros megbetegedés vagy autoimmun megbetegedés elleni celluláris immunválasz célzott irányítására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására, amely terápiás sejtek a következő részeket tartalmazó receptorokat expresszálják:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy T-sejt-receptor ξ-, η-, CD3-delta- vagy T3-gamma-protein, egy B-sejt-receptor mb1- vagy B29-protein vagy egy Fc-receptor γ-protein egy intracelluláris vagy transzmembrán részletét tartalmazza, amely utóbbi képes a sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt a receptorhoz kötődött sejt vagy receptorhoz kötődött fertőző ágens elpusztítására készteti; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint fertőző ágenssel fertőzött gazdasejt, tumoros vagy karcinómás sejt vagy autoimmun sejt elpusztítására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint MHC-independens celluláris immunválasz kiváltására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

4. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint olyan készítményt állítunk elő, mely az extracelluláris rész célzott fertőző ágenshez vagy célzott sejthez történő kötődését követően a transzmembrán résznek a terápiás sejt citolitikus szignáltranszdukciós proteinjével történő oligomerizálódását idézi elő, miáltal a receptorhoz kötődött sejt vagy fertőző ágens elpusztul.

5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint az alábbi aminosavszekvenciák valamelyikét tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk:

(a) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti 421-532. aminosavakat; vagy annak funkcionális citoli25 tikus szignáltranszdukciós származékát;

(b) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti (i) 423-455. aminosavakat; (ii) 438-455. aminosavakat; (iii) 461-494. aminosavakat; vagy (ív) 494-528. aminosavakat;

30 (c) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti

400-420. aminosavakat;

(d) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti 421-575. aminosavakat vagy annak funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékát;

35 (e) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti (i)

423-455. aminosavakat; (ii) 438-455. aminosavakat; (iii) 461-494. aminosavakat; vagy (iv) 494-528. aminosavakat;

(f) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti

40 400-420. aminosavakat;

(g) az 5. azonosító számú szekvencia szerinti 421-462. aminosavakat vagy annak funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékát;

(h) az 5. azonosító számú szekvencia szerinti 45 402-419. aminosavakat;

(i) a 15a. ábra szerinti Tyr282-Tyr298 aminosavakat;

(j) a 16. ábra (24. azonosító számú szekvencia) szerinti 132-171. aminosavakat;

50 (k) a 17. ábra (25. azonosító számú szekvencia) szerinti 140-182. aminosavakat;

(l) a 18. ábra (26. azonosító számú szekvencia) szerinti 162-220. aminosavakat;

(m) a 19. ábra (27. azonosító számú szekvencia) 55 szerinti 183-228. aminosavakat.

6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint Fc-receptor-proteinként humán FcyRIII-, humán FcRIlyA- vagy humán FcRIlyC-receptor-proteint tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket al60 kalmazunk.

HU 225 688 Β1

7. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint terápiás sejtként a következők valamelyikét alkalmazzuk:

(a) T-limfocitát;

(b) citotoxikus T-limfocitát;

(c) természetes ölősejtet;

(d) neutrofil sejtet;

(e) granulocitát;

(f) makrofágot;

(g) hízósejtet;

(h) Hela-sejtet.

8. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint immundeficiencia-vlrus elpusztítására alkalmas gyógyászati készítményt állítunk elő.

9. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint extracelluláris részként CD4-antigén HIV-burokhoz kötődő részét vagy annak funkcionális, HIV-burokhoz kötődő származékát tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk.

10. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a CD4-antigén HIV-burokhoz kötődő részeként 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1-369. nukleotidok által kódolt peptidet tartalmazó kimérareceptort expresszáló terápiás sejteket alkalmazunk.

11. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amely szerint a terápiás sejt alkalmazásával a receptorhoz kötődött célsejt vagy célzott fertőző ágens citolízis révén történő elpusztítására alkalmas készítményt állítunk elő.

12. Sejt, amely legalább két, proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptort expresszál, amely receptorok az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy T-sejt-receptor, B-sejt-receptor vagy Fc-receptor egy intracelluláris vagy transzmembránrészletét tartalmazza, amely utóbbi képes a sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt a receptorhoz kötődött sejt vagy receptorhoz kötődött fertőző ágens elpusztítására készteti; és a második receptor (í) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.

13. A 12. igénypont szerinti sejt, amely célzott sejtként fertőző ágenssel fertőzött gazdasejtet, tumorsejtet, karcinómás sejtet vagy autoimmun sejtet ismer fel.

14. A 12. igénypont szerinti sejt, amely célzott sejthez MHC-independens módon kötődik.

15. A 12. igénypont szerinti sejt, amelyben az intracelluláris vagy transzmembrándomén T-sejt-receptor ξ-, η-, CD3-delta- vagy T3-gamma-proteinből; Fc-receptor γ-proteinből; vagy B-sejt-receptor mb1- vagy B29-proteinből származik.

16. A 15. igénypont szerinti sejt, amely a következő aminosavszekvenciák valamelyikét tartalmazó kimérareceptort expresszál:

(a) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti 421-532. aminosavakat; vagy annak funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékát;

(b) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti (i) 423-455. aminosavakat; (ii) 438-455. aminosavakat; (iii) 461-494. aminosavakat; vagy (iv) 494-528. aminosavakat;

(c) a 6. azonosító számú szekvencia szerinti 400-420. aminosavakat;

(d) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti 421-575. aminosavakat vagy annak funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékát;

(e) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti (i) 423-455. aminosavakat; (ii) 438-455. aminosavakat; (iii) 461-494. aminosavakat; vagy (iv) 494-528. aminosavakat;

(f) a 4. azonosító számú szekvencia szerinti 400-420. aminosavakat;

(g) az 5. azonosító számú szekvencia szerinti 421-462, aminosavakat vagy annak funkcionális citolitikus szignáltranszdukciós származékát;

(h) az 5. azonosító számú szekvencia szerinti 402-419. aminosavakat;

(i) a 15a. ábra szerinti Tyr282-Tyr298 aminosavakat;

0) a 16. ábra (24. azonosító számú szekvencia) szerinti 132-171. aminosavakat;

(k) a 17. ábra (25, azonosító számú szekvencia) szerinti 140-182. aminosavakat;

(l) a 18. ábra (26. azonosító számú szekvencia) szerinti 162-220. aminosavakat;

(m) a 19. ábra (27. azonosító számú szekvencia) szerinti 183-228. aminosavakat.

17. A 12. igénypont szerinti sejt, amely Fc-receptor-proteinként humán FcyRIII-, humán FcRIlyA- vagy humán FcRIlyC-receptor-proteint tartalmaz.

18. A 12. igénypont szerinti sejt, amely extracelluláris részként egy receptor ligandumkötő doménját; egy ligandum receptorkötő doménját; egy ellenanyag antigénkötő részét; vagy azok funkcionális származékát tartalmazza.

19. A 18. igénypont szerinti sejt, amely célzott fertőző ágensként immundeficiencia-vírust vagy célzott sejtként immundeficiencia-vírussal fertőzött gazdasejtet ismer fel.

20. A 19. igénypont szerinti sejt, amely CD4-antigén HIV-burokhoz kötődő részét vagy annak funkcionális, HIV-burokhoz kötődő származékát tartalmazó kimérát expresszál.

21. A 20. igénypont szerinti sejt, amely HlV-burokhoz kötődő részként 1. azonosító számú szekvencia szerinti 1-369. nukleotidok által kódolt peptidet tartalmaz.

22. A 12. igénypont szerinti sejt, amely a receptorhoz kötődött célsejtet vagy célzott fertőző ágenst citolízis révén pusztítja el.

23. Sejt, amely legalább két, proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptort expresszál, amely receptorok az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy T-sejt-receptor CD3-, zéta- vagy éta-polipeptidje; egy

HU 225 688 Β1

B-sejt-receptor; vagy egy Fc-receptor egy intracelluláris vagy transzmembránrészletét tartalmazza; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.

24. A 12. vagy 23. igénypont szerinti sejt, amely a következők valamelyikét tartalmazó kimérareceptort expresszál:

(a) CD 16-, CD7- vagy CD5-antigén extracelluláris részét;

(b) CD5- vagy CD7-antigén transzmembránrészét;

(c) CD5-antigén intracelluláris részét.

25. Proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptor-pár, amelynek egyes tagjai az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-protein intracelluláris vagy transzmembránrészét tartalmazza, amely utóbbi képes a sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt a receptorhoz kötődött sejt vagy receptorhoz kötődött fertőző ágens elpusztítására készteti; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.

26. Proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptor-pár, amelynek egyes tagjai az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy T-sejt-receptor CD3-, zéta- vagy éta-polipeptidje; egy B-sejt-receptor; vagy egy Fc-receptor egy intracelluláris vagy transzmembránrészletét tartalmazza; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.

27. DNS-molekula-pár, amelynek egyes tagjai proteintermészetű, membránhoz kötött kimérareceptorokat kódolnak, amely receptorok az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy Τ-sejt-receptor-, B-sejt-receptor- vagy Fc-receptor-protein intracelluláris vagy transzmembránrészletét tartalmazza, amely utóbbi képes a sejt számára olyan jelzést közvetíteni, amely azt a receptorhoz kötődött sejt vagy receptorhoz kötődött fertőző ágens elpusztítására készteti; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részt tartalmaz.

28. DNS-molekula-pár, amelynek egyes tagjai proteintermészetü, membránhoz kötött kimérareceptorokat kódolnak, amely receptorok az alábbi részeket tartalmazzák:

az egyik receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) egy Τ-sejt-receptor CD3-, zéta- vagy éta-polipeptidje; egy B-sejt-receptor; vagy egy Fc-receptor intracelluláris vagy transzmembránrészletét tartalmazza; és a második receptor (i) célzott sejt vagy célzott fertőző ágens specifikus felismerésére és ahhoz történő kötődésre képes extracelluláris részt; valamint (ii) a CD28 egy intracelluláris részletét tartalmazza.