CN109844126A - 基于多孔膜的大分子递送系统 - Google Patents
基于多孔膜的大分子递送系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109844126A CN109844126A CN201780060638.6A CN201780060638A CN109844126A CN 109844126 A CN109844126 A CN 109844126A CN 201780060638 A CN201780060638 A CN 201780060638A CN 109844126 A CN109844126 A CN 109844126A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- microns
- hole
- reagent
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
在一方面,披露了处理细胞的方法,所述方法包括使细胞穿过包括多个孔的膜的孔,同时将所述细胞暴露于试剂以引起所述细胞的变化,从而允许所述试剂进入所述细胞,其中所述孔中的每一个从输入开口延伸至输出开口,并且具有小于所述细胞的直径的至少一个截面尺寸,以及在许多实施例中最大截面尺寸。例如,所述孔的至少一个截面尺寸,以及在许多实施例中所述孔的最大截面尺寸可以小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年9月28日提交的美国临时申请号62/401,053的优先权,该申请的内容通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明总体上涉及用于处理细胞的系统和方法,并且更具体地涉及允许操纵细胞以使细胞能够从外部环境摄取试剂(例如,生物剂)的此类系统和方法。
背景技术
各种治疗和诊断应用需要使细胞摄取多种试剂(例如,生物剂)。在许多情况下,这些试剂无法透过细胞,并因此试剂向细胞中的递送带来了巨大挑战。举例来说,基因编辑技术需要将基因编辑组分递送到细胞中。一种这样的基因编辑技术,通常被称为CRISPR(规律成簇间隔短回文重复),需要将核糖核蛋白(RNP)复合物递送至细胞。然而,此类RNP复合物跨细胞膜递送是困难的。
已经开发了许多技术来促进将外来试剂递送至细胞。此类技术的一些实例包括电穿孔,光穿孔,通过纳米针的直接穿刺等。然而,这些技术可能存在许多缺点。例如,这些技术可以表现出低效率和/或低细胞活力。在一些情况下,此类技术需要使用特殊缓冲液。而且,许多这样的技术不适合于大量细胞的平行处理。
因此,存在用于将试剂递送至细胞中的经改进的系统和方法的需要。
发明内容
在一个方面,披露了用于细胞处理的方法,该方法包括使多个细胞通过包含多个孔的膜的一个或多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以引起这些细胞的变化,从而允许所述试剂进入这些细胞中的至少一个,其中所述孔中的每一个从输入开口延伸到输出开口,并且具有在约7微米至约9微米的范围内,并且优选地在约8微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。在一些实施例中,每个孔的最大截面尺寸是约7微米、或约8微米、或约9微米。在一些实施例中,至少约80%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约99%或更多的孔具有在所希望的范围内或在具体值的截面尺寸,例如,在约7微米至约9微米的范围内、或在约8微米至约9微米的范围内、或7微米、或8微米、或9微米。
在一些实施例中,细胞可以是循环细胞。适合的循环细胞的一些实例包括但不限于,干细胞、祖细胞、免疫效应细胞、造血干细胞、造血祖细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)。在一些实施例中,这些细胞可以是CD34+细胞。在其他实施例中,这些细胞可以是T细胞和/或NK细胞。在一些实施例中,这些细胞可以被工程化,或能够被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中,这些细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施例中,这些细胞可以是人细胞。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,孔可以具有在约7微米至约10微米的范围内(例如,在约8至9微米的范围内)的长度。在一些实施例中,这些孔可以具有在约18至约21微米的范围内的长度。在一些实施例中,膜可以具有在以下范围内的活性表面积:约7mm2至约80mm2的范围内,例如,在约10mm2至20mm2的范围内、或在约30mm2至约40mm2的范围内、或在约50mm2至60mm2的范围内、或在约70mm2至约80mm2的范围内。另外,在一些这样的实施例中,膜可以具有在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。在一些实施例中,膜的厚度可以基本上类似于孔的长度,尽管在其他实施例中可以采用较厚的膜。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,可以将细胞和试剂置于液体载体中,并且可以通过向该液体载体施加压力以推动所述液体载体穿过所述孔。在一些这样的实施例中,液体载体中细胞的浓度可以在约10,000至约200,000个细胞/微升的范围内。在一些实施例中,液体载体中细胞的浓度可以在以下范围内:约50,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约100,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约150,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约160,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约170,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约180,000至约200,000个细胞/微升的范围内、或在约190,000至约200,000个细胞/微升的范围内。在一些这样的实施例中,施加到液体载体上的压力可使得细胞以至少约10至约20mL(毫升)/分钟的速率穿过孔。举例来说,施加到液体载体上的压力可以在约5psi至约20psi的范围内。
在一些实施例中,液体载体可以包括但不限于,水、盐水、基础细胞培养基(例如,SFEM-II)、无血清培养基、和/或造血干细胞布鲁(HSC brew)培养基中的任一种。在一些实施例中,该液体载体可以包括聚乙二醇(PEG)和/或清洁剂中的任一种。在一些实施例中,该液体载体可以进一步包含一种或多种细胞因子、一种或多种生长因子、一种或多种活力增强剂、及其组合。举例来说,该一种或多种细胞因子可以是血小板生成素(TPO)、Flt3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素-6(IL-6)中的任一种,及其组合。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,经由细胞穿过孔在细胞中引起的变化可以是瞬时变化,例如,细胞膜渗透性中的瞬时变化。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,膜的孔可以至少部分被聚乙烯吡咯烷酮包被。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,该试剂可以包括通常不可透过细胞膜的化合物。举例来说,在一些实施例中,该试剂可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料中的任一个,及其组合。举例来说,该试剂可以是基因编辑系统。此类基因编辑系统的一些实例可以包括但不限于,CRISPR基因编辑系统、ZFN基因编辑系统、TALEN基因编辑系统、大范围核酸酶基因编辑系统或Cre重组酶基因编辑系统。例如,基因编辑系统可以是CRISPR基因编辑系统,其中该CRISPR基因编辑系统包括一种或多种RNP(例如Cas9-gRNA复合物)。举例来说,在一些实施例中,基因编辑系统可以是如在PCT公开WO2017/115268中所述的例如,CRISPR基因编辑系统,将其内容通过引用以其全文并入本文。在其他实施例中,该基因编辑系统可以是如在PCT公开WO 2017/093969中所述的基因编辑系统(例如,CRISPR基因编辑系统),将其内容通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中,递送至细胞的试剂可以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在一些实施例中,这些细胞可以包含CAR或编码CAR的核酸。将嵌合抗原受体(CAR)和表达CAR的核酸描述于以下公开的国际申请中,将每种申请的内容通过引用以其全文并入本文:WO2012/07900、WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2014/130657、WO 2015/142675、WO2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/164731、WO 2016/028896、WO 2016/014576和WO2016/014535。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,试剂可以是带电的。在其他实施例中,该试剂可以是电中性的。在一些实施例中,该试剂可以具有以下分子量:高于约2kDa、或高于约3k Da、或高于约10kDa、或高于约20kDa、或高于约30kDa、或高于约40kDa、或高于约50kDa、或高于约60kDa、或高于约70kDa、或高于约80kDa、或高于约90kDa、或高于约100kDa。
在用于处理循环细胞的以上方法中,膜可以由各种不同的材料形成。举例来说,该膜可以包括聚合材料。适合的聚合材料的一些实例包括但不限于,聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些这样的实施例中,可以通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在聚合材料中形成孔。在其他实施例中,膜可以由半导体、陶瓷、或金属中的任一种形成。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,这些孔沿着每个孔的长度可以具有基本上一致的截面面积。这些孔可以具有规则的或不规则的截面形状。这些孔可以具有各种不同的形状。例如,孔可以具有多边形截面形状,例如正方形、矩形、六边形或八边形形状。例如,在一些实施例中,这些孔可以基本上是圆柱形。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,这些孔可以具有疏水性或亲水性内表面。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,在使细胞穿过膜的步骤之前,可以从异质细胞的集合选择细胞。举例来说,这些经选择的细胞可以具有CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD34、CD90和CD49f标记物中的任一种。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%的细胞通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。在一些这样的实施例中,这些细胞可以用高于约50%、或高于约60%、或高于约70%、或高于约80%、或高于约90%的细胞活力摄取试剂。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,膜可以具有基本上等于孔的最大长度的最大厚度。举例来说,这些孔可以具有基本上一致的长度,并且膜可以具有基本上等于孔长度的厚度。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,试剂可以是脱氧核糖核酸(DNA)(例如,单链或双链DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料、不可透过膜的化合物中的任一种,及其组合。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,在携带细胞和试剂到多孔膜的液体载体中试剂的浓度可以最高达50克/升。
在用于处理循环细胞的以上方法的一些实施例中,可以将含有细胞和试剂的液体载体经输入室引入所述孔中,该输入室具有小于经所述输入室引入孔的液体载体的体积的约20%的体积。举例来说,在一些实施例中,可以将含有细胞和试剂的液体载体经输入室引入孔中,该输入室具有等于或小于约10微升的体积,例如,在约0.5至约10微升范围内的体积。
在相关的方面,披露了转染细胞(特别是循环细胞)的方法,该方法包括向含有细胞浓度在约10,000至约200,000个细胞/微升范围内的多个细胞的液体载体施加压力,以使得液体载体和其中包含的细胞穿过一个或多个多孔膜的多个孔,同时将这些细胞暴露给试剂以按高于约20亿个细胞、或高于约40亿个细胞/分钟的速率、至少约60%的细胞活力用所述试剂转染所述细胞中的至少一些,其中所述孔中的每一个具有在约7微米至约9微米的范围内,例如,在约8微米至约9微米的范围内、或约7微米、或约8微米、或约9微米的最大截面尺寸。在这样的方法的一些实施例中,这些孔可以具有在约7微米至约10微米范围内的长度。在其他实施例中,这些孔可以具有在约18微米至约21微米的范围内的长度。此外,在这样的方法的一些实施例中,转染后的细胞活力可以是至少约60%或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%。
在相关的方面,披露了用于平行细胞处理的系统,该系统包括具有多个开口用于接收含有流体载体、多个细胞和由这些细胞内化的至少一种试剂的多个样品的入口支撑元件,具有多个开口和设置在所述入口支撑元件和所述出口支撑元件之间的多个多孔膜的出口支撑元件,并且每一个出口支撑元件具有多个孔,这些孔具有最大截面尺寸小于约9微米,例如,在约7微米至约9微米的范围内,其中多孔膜中的每一个多孔膜相对于入口支撑元件中的一个开口定位,从而接收一个样品并且相对于出口支撑元件中的一个开口定位,从而允许样品的至少一部分穿其而过到达所述出口开口。
在一些实施例中,系统可以进一步包括多个网,所述多个网各自被设置成邻近所述多孔膜的其中一个多孔膜以向所述多孔膜提供机械支持。举例来说,该网可以由不锈钢形成。
在一些实施例中,可以通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在聚合材料中形成孔。
在一些实施例中,系统进一步包括至少一个压力施加器,所述压力施加器与所述输入支撑元件的所述开口中的至少一个开口相联以用于向所述样品施加压力。
在一些实施例中,系统进一步包括至少一个入口室,所述至少一个入口室设置于所述多个多孔膜上游,并且具有入口端口和出口端口,所述入口端口用于接收所述流体载体,所述流体载体通过所述出口端口被引入到所述多孔膜上。在一些这样的实施例中,输入室具有小于引入到所述多孔膜上的流体载体体积的约20%的体积。例如,输入室可以具有等于或小于约10微升,例如,在约0.5至约10微升的范围内的体积。
在又另一个方面,披露了处理细胞的方法,该方法包括使细胞穿过包括多个孔的膜的孔,同时将细胞暴露于试剂以引起细胞的变化,从而允许所述试剂进入细胞,其中所述孔中的每一个从输入开口延伸到输出开口,并且具有小于所述细胞的直径的至少一个截面尺寸,以及在许多实施例中最大截面尺寸。例如,孔的至少一个截面尺寸,并且在许多实施例中孔的最大截面尺寸可以是小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米。例如,孔的至少一个截面尺寸,并且在许多实施例中孔的最大截面尺寸可以在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约12微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内,例如,在约5微米至约8微米的范围内。
在一些实施例中,膜可以具有基本上等于孔的最大长度的最大厚度。在一些这样的实施例中,孔可以具有基本上一致的长度,并且膜具有基本上等于长度的厚度。
在一些情况下,细胞通过膜的孔的通道引起的变化可以是瞬时变化。例如,变化(或扰动)可以对应于细胞膜渗透性中的瞬时变化。
在一些实施例中,多孔膜可以具有在约1x 105至约2x 106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。在一些实施例中,多孔膜可以至少部分地被聚合材料(例如,聚乙烯吡咯烷酮)包被。
在一些实施例中,可以将细胞和试剂置于液体载体中,并且通过向该液体载体施加压力来推动该液体载体穿过膜的孔。例如,可以将至少约5psi(例如,在约5psi至约100psi的范围内)的压力施加到液体载体上以生成液体载体流,并因此细胞和其中包含的一种或多种试剂穿过多孔膜。在一些实施例中,施加到液体载体上的压力可以导致液体载体流以高于约10ml/min(毫升/分钟)例如,在约10ml/min至约20ml/min的范围内的流速穿过膜的一个或多个孔。
使用根据本教导的方法可以将各种不同的试剂引入到各种不同的细胞中。在许多实施例中,可以采用根据本教导的方法将试剂(例如,生物化合物)递送到细胞,该试剂通常不可透过该细胞。举例来说,该试剂可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料、不可透过膜的化合物中的任一种及前述的组合。
举例来说,在一些实施例中,可以采用根据本教导的方法将Cas9-gRNA RNP复合物递送至细胞。在一些实施例中,试剂可以是带电的,然而在其他实施例中该试剂是电中性的。该试剂可以具有各种不同的分子量。在一方面,可以将基因编辑系统的一个或多个组分,例如,CRISPR基因编辑系统、锌指核酸酶基因编辑系统、TALEN基因编辑系统、大范围核酸酶基因编辑系统、Cre重组酶基因编辑系统等引入到细胞中。在一些实施例中,基因编辑系统的一个或多个组分可以是例如,包含或是RNP的CRISPR基因编辑系统的一个或多个组分,该RNP包含gRNA分子和RNA指导的核酸酶(例如,Cas9蛋白质)。
在一些实施例中,该多孔膜可以包括聚合材料,例如聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。例如,通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中任一种可以在这样的聚合材料中形成孔。
在一些其他的实施例中,多孔膜可以包半导体或金属中的任一种。
可以将根据本教导的方法应用于各种不同的细胞类型。这样的细胞的一些实例可以包括祖细胞、免疫效应细胞、人胚胎干细胞(hES细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、角化细胞、和人支气管上皮细胞。例如,该细胞可以是T细胞。
膜的孔可以具有各种不同的形状。例如,孔可以具有规则的、或不规则的截面形状。规则的截面形状的一些实例可以包括但不限于,圆形、椭圆形和多边形形状(例如,正方形、矩形、六边形、或八边形形状)。在一些实施例中,膜的孔沿着其长度可以具有基本上一致的截面尺寸。在他实施例中,孔的至少一个截面尺寸可以沿着其长度是不一致的。
在一些实施例中,多孔膜可以具有亲水性表面。在其他实施例中,多孔膜可以具有疏水性表面。例如,孔的内表面可以是亲水性或疏水性的。
在一些实施例中,以上方法进一步包括在使细胞穿过多孔膜的孔之前,从异质细胞的集合中选择一个或多个细胞。可以使用各种选择标准。例如,在一些实施例中,基于CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD34、CD90、CD49f中任一种,及其组合的表达(例如,表面表达)选择细胞。
在相关的方面,披露了转染细胞的方法,该方法包括使含有多个细胞和试剂的流体载体穿过具有多个孔的多孔膜,这些孔各自具有最大截面尺寸小于所述细胞的最大直径,使得细胞通过孔导致细胞物理变形足以通过所述试剂转染细胞。在一些实施例中,每个孔可以具有接近膜的上表面的入口和接近膜的下表面的出口。在一些实施例中,膜可以具有基本上等于孔的最大长度的最大厚度。在一些实施例中,这些孔可以具有基本上一致的长度,并且膜具有基本上等于该长度的厚度。
多孔膜可以具有以上讨论的特征。例如,孔的至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸可以小于细胞的最大直径。例如,孔的至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸可以是小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米,例如,在约5微米至约8微米的范围内。此外,在一些实施例中,膜可以展现出在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。如以上所指出的,可以采用各种细胞类型和试剂(例如以上所列出的那些)。此外,如以上所指出的,在许多实施例中,有待通过细胞内化的细胞和一种或多种试剂可以夹带在液体载体中,通过施加压力(例如,高于约5psi的压力)以推动该液体载体穿过膜。
在一些实施例中,以至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%的转染率可以实现细胞的转染。此外,在一些实施例中,可以用一种或多种试剂转染细胞,并且所得细胞具有高于约50%、或高于约60%、或高于约70%、或高于约80%、或高于约90%的细胞活力。可以例如,使用Beckman Coulter Vi-计数器测量细胞活力。
在另一方面,披露了用于细胞处理的系统,该系统包括
用于接收包含多个细胞和有待被细胞内化的至少一种生物剂的流体载体的入口端口,与入口联通用于接收流体载体的多孔膜,所述多孔膜具有多个孔(其中至少一个截面尺寸小于约40微米)使得细胞通过孔导致细胞的变化足以使试剂进入细胞的至少一部分。该系统进一步包括与所述膜联通以接收经转染的细胞的出口端口。在一些实施例中,孔的至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米,例如,在约5微米至约8微米的范围内。例如,在这样的系统中,孔的至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸可以在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内。在一些实施例中,多孔膜的孔可以具有在约5微米至约30微米的范围内的通道长度。
在一些实施例中,该系统进一步包括用于向液体载体施加压力从而导致液体载体流过多孔膜的机械装置。举例来说,该机械装置可以包括连接到针筒的活塞,该针筒中配置液体载体,将液体载体从储存器转移到多孔膜的泵、或任何其他适合的机械装置。在一些实施例中,该压力机械装置可以向液体载体施加高于约5psi的压力从而导致该液体载体例如,以高于约10mL/min(例如,在约10至约20ml/min的范围内)的流速流过多孔膜的每个孔。
多孔膜可以由各种不同的材料(例如,金属、半导体、或聚合物)形成。举例来说,在一些实施例中,该多孔膜可以由聚合材料形成,例如聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些这样的实施例中,可以通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在聚合材料中形成孔。
在一些实施例中,该系统可以进一步包括设置于邻近多孔膜的多孔支撑体以提供对膜的机械强度使得该膜可以经受与其中通过的样品流相关的压力。多孔支撑体可以由各种不同的材料制得。在一些实施例中,该多孔支撑体是由金属(例如,不锈钢)形成的网。在一些实施例中,该网具有高于约1mm尺寸(例如,直径)的开口。
在一些实施例中,系统可以进一步包括设置于多孔膜上游并且与用于接收液体载体的入口端口联通的输入室,并且包含一种或多种试剂。该输入室可以包括出口端口,液体载体通过该出口端口被引入到多孔膜上。在一些实施例中,该输入室可以具有在约50μL至约1L的范围内的体积。该系统还可以包括用于储存液体载体的储存库。该储存库可以与输入室呈液体联通用于递送其中的液体载体。此外,可以将输出室设置于多孔膜的下游用于收集经转染的细胞。
在相关的方面,披露了用于平行细胞处理的系统,该系统包括
入口支撑元件,其具有用于接收含有流体载体的多个样品的多个开口、多个细胞和由这些细胞内化的至少一种试剂。该系统可以进一步包括具有多个开口的出口支撑元件,并且多个多孔膜被设置于入口支撑元件和出口支撑元件之间,并且各自具有至少一个截面尺寸并且优选最大截面尺寸小于约40微米的多个孔。多孔膜中的每一个多孔膜可以相对于入口支撑元件中的开口中的一个开口定位以接收一个样品,并且可以相对于出口支撑元件中的开口中的一个开口定位,以允许这些样品的至少一部分穿其而过到达出口开口。可以将连接到输入支撑元件的压力施加器用于向样品施加压力(例如,高于约5psi的压力)以推动样品进入输入支撑元件的入口端口。
在一些实施例中,系统可以进一步包括多个多孔支撑体(网),其各自被设置于邻近所述多孔膜的其中一个以提供机械强度。该多孔支撑体可以由例如,金属网(如不锈钢网)形成。
在一些实施例中,这些多孔膜可以包括聚合材料,例如以上所讨论的那些。另外,如以上所指出的,在一些实施例中,可以通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在这样的聚合材料中形成孔。此外,多孔膜的孔可以展现出沿着其长度基本上一致的、或不一致的截面尺寸。多孔膜的孔可以具有基本上与膜的上表面齐平的入口端口和基本上与膜的下表面齐平的出口端口。
在相关的方面,披露了递送一个或多个基因编辑系统和/或一个或多个细胞组分的方法,该方法包括使至少一个细胞穿过具有多个孔的膜的孔,每个孔具有至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸小于细胞的直径,并且将细胞暴露于至少一个基因编辑组分和/或系统,例如,如本文所描述的,使得细胞穿过孔,其中当细胞穿过孔时该细胞经历变化足以允许细胞摄取所述至少一个基因编辑组分和/或系统。例如,至少一个截面尺寸,并且优选地空的最大截面尺寸可以是小于约40微米(例如,在约2微米至约40微米的范围内),或小于约30微米(例如,在约2微米至约30微米的范围内),或小于约20微米(例如,在约2微米至约20微米的范围内),或小于约15微米(例如,在约2微米至约15微米的范围内),或小于约10微米(例如,在约2微米至约10微米的范围内),例如,在约5微米至约8微米的范围内。在以上基因编辑方法的一些实施例中,膜具有在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。此外,在一些实施例中,膜可以至少部分地被聚合材料(例如,聚乙烯吡咯烷酮)包被。
在一些实施例中,一个或多个分子(例如,一个或多个遗传组分和/或一个或多个基因编辑系统的组分)的摄取导致将基因(例如,转基因或靶基因)表达调整了至少约15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、210%、220%、230%、240%、和250%中任一种。在一些实施例中,该调整是降低表达。在其他实施例中,该调整是增强表达。
例如,如本文所述,可以使用各种不同的基因编辑系统和组分。在许多实施例中,一种或多种基因编辑组分和/或系统通常不可透过细胞膜,将这些组分和/或系统通过以上方法递送至细胞。在一些实施例中,一种或多种基因编辑组分和/或系统可以包括蛋白质、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽、脂质、不可透过的化合物、质粒、和核糖核蛋白复合物(RNP)(例如像,如本文所述包含一种或多种RNP的CRISPR基因编辑系统)中任一种,及其组合。举例来说,RNP可以是Cas9-gRNA复合物。在一些实施例中,细胞中诱导的以促进摄取一种或多种基因编辑组分和/或系统的变化可以是物理和/或化学变化。举例来说,这样的变化可以是细胞膜渗透性中的变化。在一些实施例中,该变化可以是瞬时的。
在本文所述的基因编辑方法(包括以上基因编辑方法)的一些实施例中,可以将细胞和至少一个基因编辑组分和/或系统置于液体载体中并通过向液体载体施加压力来推动该液体载体穿过孔。在一些情况下,施加的压力可以导致液体载体流以至少约10ml/min(例如,在约10至约20ml/min的范围内)的流速穿过膜的每个孔。
可以将本文所述的基因编辑方法用于递送基因编辑组分和/或系统至各种不同的细胞中。例如,细胞可以是祖细胞、免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)、人胚胎干细胞(hES细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、角化细胞、和人支气管上皮细胞中的任一种。在一些实施例中,该细胞是T细胞。在其他实施例中,该细胞是造血干细胞和祖细胞(HSPC),例如,CD34+细胞。
在一些实施例中,包括以上基因编辑方法的本文所述的基因编辑方法可以进一步包括从异质细胞的集合中选择一个或多个细胞的步骤,随后使这些细胞穿过多孔膜,同时将细胞暴露于一种或多种基因编辑试剂中以便于引起一种或多种这些基因编辑试剂递送至细胞中。可以使用各种选择标准。例如,在一些实施例中,可以将一种或多种细胞标记物(例如,CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD34、CD90、CD49f,及其组合)用于选择细胞。在一些实施例中,可以基于细胞的尺寸选择细胞。
在相关的方面,披露了用于细胞处理的系统,该系统包括用于接收多个细胞的入口端口,和相对于彼此串联定位,用于通过所述入口连续接收所述细胞的至少一部分的多个多孔膜,其中所述多孔膜中的每一个具有小于约40微米,例如,在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内的至少一个截面尺寸。在一些实施例中,多孔膜中的每一个多孔膜具有小于约40微米的最大截面尺寸。在一些实施例中,该系统可以进一步包括多个液体递送模块,每个模块被配置将细胞暴露于试剂,当细胞穿过其中一个多孔膜时使得细胞中的至少一些摄取试剂。在一些这样的实施例中,当细胞穿过不同的其中一个多孔膜时,液体递送模块被配置以将细胞暴露于不同的试剂。
通过参考以下与以下所描述的相关附图结合的详细描述,可以获得对本发明的各个方面的进一步理解。附图不一定按比例绘制。
附图说明
图1是描绘根据本教导的实施例用于将一种或多种试剂递送到细胞中的方法步骤的流程图,
图2是描绘根据本教导的另一个实施例的方法步骤的流程图,该方法用于从异质细胞的集合中选择细胞并将一种或多种试剂递送至所选择的细胞中,
图3A是描绘根据本教导的实施例用于基因编辑的方法步骤的流程图,
图3B示意性地描绘了根据本教导基因编辑技术的示例性临床应用中循环的各个步骤的实例,
图3C示意性地描绘了根据本教导的基因编辑技术的示例性临床应用中循环的各种程序的另一个实例,
图4A示意性地描绘了根据本教导的实施例的用于处理细胞(例如,将试剂递送到细胞中)的系统,
图4B是图4A中描绘的系统的示意性局部视图,图4B示出了用于收集经处理的细胞的多个孔,
图5A示意性地描绘了图4A所示系统中采用的细胞处理组件,
图5B是图5A中描绘的细胞处理组件和用于将细胞处理组件流体连接到含有细胞样品的针筒的配件、管和针的分解图,
图5C是连接到针筒的细胞处理组件的示意性截面图,
图5D是细胞处理组件的另一个示意性截面图,
图6A是细胞处理组件的输入块的示意图,
图6B是细胞处理组件的输出块的示意图,
图7是根据本教导用于细胞处理系统的多孔膜的实施例的示意图(为了便于说明,仅描绘了几个孔),
图8是多孔膜的另一个实施例的示意图,该多孔膜具有矩形截面形状的孔,
图9示意性地描绘了沿着其长度具有不一致截面尺寸的多孔膜的孔,
图10示意性地描绘了可以被设置于邻近细胞处理系统中多孔膜的网,
图11A示意性地描绘了根据本教导的细胞处理系统的另一个实施例,
图11B是在图11A中描绘的细胞处理系统的示意性分解图,
图11C是在图11A和11B中描绘的系统的部分示意性截面图,
图12A示意性地描绘了根据实施例的系统,该系统包括细胞选择模块和与细胞选择模块联通的细胞处理模块,
图12B示意性地描绘了采用磁力分离细胞的示例性细胞分选装置,
图13A示意性地描绘了根据本教导的实施例的系统,该系统包括用于将试剂递送至细胞的微流体装置,
图13B示意性地描绘了根据本教导的另一个实施例的系统,该系统包括相对于彼此串联定位的多个多孔膜,
图14描绘了根据本教导的实施例原型装置的递送效率,通过NGS经插入/缺失(indel)%说明,通过FACS分析的B2M KD,并通过递送体积的不同细胞密度/50μL的Vi-Cell进行细胞回收,其中RNP浓度为200μg的Cas9/50μg sg RNA,
图15描绘了插入/缺失形成和B2M敲低数据,说明了根据本教导实施例的原型装置的可扩展性,其中细胞密度最高达1千万个细胞/50μL,RNP浓度为200μg的Cas9/50μgsgRNA,
图16描绘了在50μg或200μg Cas9的RNP复合物的剂量反应,其中5百万个细胞/50μL,
图17描绘了使用根据本教导实施例的原型装置,通过NGS的插入/缺失%的递送效率,通过FACS分析的B2M KD,并且通过5百万个细胞的递送体积每50μL膜的Vi-Cell进行细胞回收,并且RNP浓度为200μg的Cas9/50μg sgRNA,
图18描绘了根据本教导的实施例,指示用于将200μg的Cas9的Cas9/RNP复合物以5百万个细胞/50μL的浓度递送到人造血干细胞中编辑和细胞回收率的数据,作为使细胞穿过多孔膜而施加的压力的函数,
图19A描绘了通过TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后通过流式细胞术的HSC表面标记。还显示了通过流式细胞术染色比较CD34和CD90百分比,
图19B描绘了在TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC细胞计数。还描述了通过ViCell与流式细胞术染色的总细胞计数、CD34+、和Cd34+/CD90+细胞计数的比较,
图19C描绘了通过TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后HSC倍数扩增,
图20描绘了在WT、模拟处理、HBG编辑、和UNC0638阳性对照处理的细胞的红细胞分化方案在D7和D14,HbF细胞的百分比。通过CD235a、CD71和HbF的固定和染色分析细胞,
图21A描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后通过流式细胞术的HSC表面标记。还显示了通过流式细胞术染色比较CD34和CD90百分比,
图21B描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC细胞计数。还显示了通过ViCell与流式细胞术染色的总细胞计数、CD34+、和Cd34+/CD90+细胞计数的比较,
图21C描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC倍数扩增,
图22描绘了集落形成测定法的结果,以确定经TRIAMF处理的HSC致力于不同谱系的能力。显示了在甲基培养物上生长14天后不同血细胞系谱系的集落计数(平板成像并用StemVision分析),
图23显示了表明经TRIAMF编辑的HSPC在NSG小鼠中显示长期重建的数据。将经700k TRIAMF处理的细胞尾静脉注射到每只小鼠中(WT:N=4、模拟:N=5、HBG:N=6)。每4周收集外周血并染色抗人和抗小鼠CD45和人CD45,
图24描绘了根据本教导的实施例,在递送60μg的mRNA后在不同的时间点处HSC中GFP表达的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收,
图25描绘了根据本教导的实施例,在递送按5μg、10μg、和20μg DNA的微环DNA后,在不同的时间点处HSC中GFP表达的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收,和
图26描绘了在递送30μg的CY5标签化的肽后,在不同的时间点处HSC中Cy5信号的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收。
具体实施方式
本教导总体上涉及用于细胞处理的方法和系统,并且更具体地涉及引起细胞的变化(例如,瞬时的物理变形)的方法和系统,该变化反过来允许摄取化学化合物和/或生物化合物(包括那些(例如,由于细胞膜的不可渗透性)不能被细胞内化的化合物)。在一方面,采用多孔膜(例如,多孔聚合物膜),该多孔膜具有多个孔,这些孔具有最大截面尺寸小于正在经历处理的细胞的直径,从而引起适于介导由细胞摄取试剂的细胞中的变化。在某些实施例中,膜具有两个基本上平的相对表面。不受任何特定理论的限制,这种细胞通过这样的孔可以使细胞沿多个方向(例如,沿着至少两个正交方向)受到压缩力,这可以导致细胞的变化足以允许细胞摄取细胞同时暴露的试剂。
本文使用的各种术语与本领域普通技术人员理解的含义一致。通过进一步说明,若干术语定义如下。
本文使用的术语“细胞”与其通常含义一致是指生物体的最小结构和功能单元。尽管在许多实施例中,本发明的教导结合其对哺乳动物细胞的应用进行了讨论,但本教导广泛适用于任何原核或真核细胞。
如本文使用的,术语“细胞的直径(diameter of a cell或a cell’s diameter)”是指细胞的最大截面尺寸,例如,取决于细胞类型,细胞可以具有各种不同的形状。
术语“细胞活力”通常是指在细胞群中活细胞比例的量度。用于测量细胞活力的方法的实例包括死细胞染色,例如或台盼蓝(Trypan blue)染色。在一些实施例中,根据标准方案在Beckman Coulter 计数器上测量细胞活力。术语“细胞回收”通常是指相对于未经处理的组,处理后24-48小时如通过Vi-Cell计数的处理组的活细胞比例的量度。
术语“膜”是指在许多实施例中基本上是平面的,具有显著小于其横切面(例如,宽度)的厚度的结构。例如,在一些实施例中,膜的厚度可以是膜的直径的100倍或更小。
如本文使用的术语“基本上平面的”是指具有相对表面的结构,例如,彼此平行或在10度、或5度、或3度、或1度内彼此平行的入口表面和出口表面。
术语“转染”在本文中广泛用于指将试剂(例如,核糖核酸蛋白质复合物)引入细胞的过程。
如本文使用的,术语“转染效率”是指当暴露于根据本教导已经内化试剂的至少一种试剂时,穿过多孔膜的细胞部分。
如本文所用的术语“试剂”是指任何无机或有机分子、化合物和分子复合物、生物有机体及其组合。下文提供了试剂的非限制性实例。
当应用于本文所用的数值或数值范围时,如本文使用的,术语“约”表示数值或范围的至多10%的正或负变化。
如本文使用的,术语“基本上”表示相对于完全的条件或状态至多5%的偏差。
术语“细胞膜”或“细胞的膜”可互换地使用,是指将细胞内部与细胞的外部环境分开的半透膜。
如本文使用的,术语“蛋白质复合物”是指共同形成复合物的蛋白质和至少一种结合配偶体。举例来说,该结合配偶体可以是一种或多种蛋白质、一种或多种核酸、一种或多种蛋白质和一种或多种核酸的组合。在蛋白质复合物中蛋白质与结合配偶体的结合可以通过共价或非共价相互作用实现。例如,蛋白质复合物可以是蛋白质-核酸复合物,例如RNA/蛋白质核糖核蛋白复合物(RNP)。
本文使用的术语“循环细胞”和其复数“循环细胞”是指非黏附细胞,例如造血细胞(例如,造血干细胞和祖细胞),在骨髓、脐带血、外周血中发现的干细胞以及免疫效应细胞(例如,T细胞)。
如本文使用的,术语膜的“活性表面积”是指暴露于包含细胞和一种或多种目的试剂的液体载体的膜的表面面积。
如本文所用,术语“活力增强剂”是指相对于不存在所述化合物的相同细胞类型,导致细胞(例如HSPC、HSC和/或HPC)以更快的速率增殖(例如,数量增加)的化合物。在一个示例性方面,细胞类型是干细胞(例如,HSPC),并且活力增强剂是芳烃受体途径的抑制剂。在一些实施例中,增殖,例如数量的增加,是离体完成的。活力增强剂的另外的实例描述在例如,WO 2010/059401(例如,在WO 2010/059401的实例1中描述的分子)中,该申请的内容以其全文结合在此,并且还描述于例如,WO 2013/110198中,该申请的内容以其全文结合在此。在一些实施例中,该活力增强剂是((S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇;根据WO 2010/059401的化合物157S。在一些实施例中,该活力增强剂是4-[2-[[2-(1-苯并噻吩-3-基)-9-丙-2-基嘌呤-6-基]氨基]乙基]苯酚);根据WO 2010/059401的化合物1(还被称为StemRegenin 1或SR1)。在一些实施例中,该活力增强剂是UM171。在一些实施例中,该活力增强剂包含两种或更多种试剂的组合,例如,包含UM171和芳烃受体抑制剂(例如,SR1)的组合。
如本文使用的,与基因编辑系统联系的术语“模板核酸”是指一种或多种核酸分子,这些核酸分子包含可插入靶序列的序列(例如,由基因编辑系统切割的序列)。不受理论的束缚,据信这种插入可以通过同源定向修复(HDR)完成。在一些实施例中,该模板核酸是单链寡核苷酸(例如,单链DNA分子或单链RNA分子)。在一些实施例中,该模板核酸是双链核酸,例如双链DNA分子,例如质粒。在一些实施例中,该模板核酸存在于载体上,例如腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施例中,在从模板核酸插入核酸序列后,校正基因组中的靶突变。在一些实施例中,在从模板核酸插入核酸序列后,将异源基因或表达盒插入基因组中。
当以本文讨论的方式调整方法和/或系统的某些参数时,本发明的方法和系统对于转染循环细胞,特别是造血干细胞(HSC)特别有效。例如,如本文更详细讨论的,可以选择膜孔径中的至少一个(包括最大截面尺寸和/或孔的长度),细胞和/或一种或多种转染剂的浓度,以便于大大提高转染后的转染率和细胞活力。在一些实施例中,除了上述参数之外,以本文讨论的方式选择膜的活性表面积和/或膜的孔密度,以提高转染率和细胞活力。在一些实施例中,在本文所讨论的范围内选择多个上述参数以确保出乎意料的高转染率和细胞活力,特别是对于造血干细胞的转染。
图1是描绘根据本教导的实施例用于将一种或多种试剂递送到细胞中的方法步骤的流程。参考图1中的流程,在根据本教导针对处理细胞的方法的一些实施例中,使至少一个细胞穿过具有小于细胞直径的至少一个截面尺寸的多孔膜的孔,同时将细胞暴露于一种或多种试剂以便于引起细胞的变化(扰动),该细胞介导一种或多种试剂进入细胞。在一些实施例中,多孔膜的每个孔可以具有至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸小于细胞的直径。如以下更详细讨论的,使用多孔膜可以允许多个细胞的同时处理,因此与常规方法相比显著增加了流通量。
由细胞通过多孔膜的孔引起的细胞变化可以是适于介导由细胞引起的一种或多种试剂的内化的任何物理和/或化学变化。例如,并且不受任何特定理论的限制,细胞通过具有小于细胞直径的最大截面尺寸的孔可以使细胞承受由孔壁施加的压缩力。这种压缩力可以引起细胞的物理变形,这可以反过来介导细胞对一种或多种试剂的摄取。例如,细胞的物理变形可以改变细胞膜对一种或多种试剂的渗透性,例如,通过在膜中产生瞬时孔,从而使细胞内化一种或多种试剂。
在一些实施例中,孔的至少一个截面尺寸(并且优选最大截面尺寸)可以在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内,例如,在约5微米至约8微米的范围内。此外,在一些实施例中,尽管还可以使用其他长度,孔的通道长度可以在约5微米至约30微米的范围内,例如,在约7微米至约21微米的范围内。在一些实施例中,多孔膜可以具有在约1x105至约1x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。在一些实施例中,该多孔膜可以由适合的聚合材料形成,例如以上所讨论的那些。
多孔膜的孔可以具有亲水性或疏水性内表面。在一些情况下,多孔膜,并且是孔的内表面可以被一种或多种化合物涂覆。可以出于各种原因进行这些表面的涂覆。例如,多孔膜可以被涂覆以增强孔内表面的光滑度和/或增强那些表面的疏水性或亲水性程度。举例来说,在一个实施例中,多孔膜可以被聚乙烯吡咯烷酮的薄膜(例如,具有厚度在约几纳米至几毫米范围内的膜)涂覆。其他适合的涂覆材料可以包括,例如,聚乙二醇(PEG)和PEG基化合物、聚乙烯醇(PVA)、羟乙基纤维素、tween 20、十八烷基硅烷、Brij35、聚(对二甲苯)、含氟聚合物、Pluronic F127。
在一些实施例中,膜的孔可以基本上是同质的。例如,在一些实施例中,膜的所有孔可以具有基本上一致的直径(即,不同的孔可以具有基本相同的直径)。此外,在一些实施例中,任何给定孔的直径沿其整个长度可以是基本上一致的,即,该孔在其整个长度上可以表现出基本上相同的直径。换句话说,至少一些孔,并且在一些实施例中,所有孔不表现任何收缩区。在一些实施例中,所有孔沿其整个长度具有一致的直径,并且不同孔的直径基本上相同。
可以将细胞处理以上方法应用于不同的细胞类型。适合的细胞类型的一些实例由其是包括但不限于,祖细胞、免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)、人胚胎干细胞(hES细胞)、诱导多能干细胞(iPS)、间充质干细胞、角化细胞和人支气管上皮细胞。在一些实施例中,该细胞可以是造血干细胞和祖细胞(HSPC),例如,CD34+细胞。在一些实施例中,该细胞可以是T细胞(例如,CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞)。
此外,使用本教导的方法可以将包括有机和无机化合物的各种不同的生物剂和非生物剂(例如,分子和/或复合物)引入细胞。在许多实施例中,试剂通常不可透过细胞膜。该试剂可以是中性的或带电的。此外,该试剂可以具有各种不同的分子量。
使用本教导可以被细胞内化的试剂的一些实例包括但不限于、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、不可透过膜的化合物、和染料。例如,该试剂例如,如本文所描述的,可以是Cas9-gRNA RNP复合物。举例来说,在一些实施例中,可以通过将基因编辑系统,例如,CRISPR基因编辑系统,例如,Cas9-gRNA RNP复合物引入细胞,将本教导的方法和装置用于修饰免疫效应细胞(例如,T细胞)以便于选择性修饰T细胞的基因组,在所述细胞和/或其子代中例如,减少或消除内源基因的表达以便于例如,减少或消除蛋白质(例如,表面蛋白质)的存在。作为进一步的实例,在一些实施例中,通过将基因编辑系统,例如,CRISPR基因编辑系统,例如,Cas9-gRNA RNP复合物引入细胞可以将本教导的方法和装置用于修饰HSPC,以便于选择性修饰HSPC的基因组,例如,在所述细胞和/或其子代中减少或消除内源基因的表达,以便于例如,减少或消除蛋白质(例如,表面蛋白质)的存在。在一些实施例中,使用本文所述的方法和装置可以将多于一个基因编辑系统,例如,CRISPR基因编辑系统,例如,Cas9-gRNA RNP复合物同时地或顺序地引入所述细胞,从而例如,选择性修饰细胞基因组中的多于一个基因、或选择性修饰单个基因中的多于一个位点。本文在下文中更详细地描述了可用于此类方法的基因编辑系统,例如CRISPR基因编辑系统。
在一些实施例中,根据本教导细胞群可以多次串联穿过系统,其中任选的步骤是在每个通道之间静置细胞。例如,可以在细胞通过系统后收集细胞,并再次引入系统以再次穿过多孔膜。可以根据需要重复该过程。在一些这样的实施方案中,细胞暴露于其中的试剂和/或培养基(载体液体)可任选地在细胞通过系统的不同通道中改变,例如,向细胞引入不同的分子/复合物。例如,可以在第一次通过系统期间将细胞样品暴露于含有分子/复合物的溶液中,以便于将该分子/复合物递送至细胞。经转染的细胞可以第二次穿过系统,同时将它们暴露于含有不同分子/复合物的不同溶液中,以便于将第二分子/复合物递送至细胞。可以根据需要重复多次该过程。
在一些实施例中,可以用试剂(例如,通常不可透过细胞膜的生物剂)将多孔膜用于转染多个细胞,其中,转染率为至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%。此外,在一些实施例中,当实现细胞活力为高于约50%、或高于约60%、或高于约70%、或高于约80%、或高于约90%时,可以进行这样的转染。
图2是描绘根据本教导的另一个实施例的方法步骤的流程图,该方法用于从异质细胞的集合中选择细胞并将一种或多种试剂递送至所选择的细胞中。参考图2的流程图,在相关方面,披露了处理细胞的方法,该方法包括从异质细胞的集合中选择多个细胞(步骤1)。可以基于各种不同标准来实现选择。例如,在一些情况下,可以选择优先表达某些表面蛋白的多个细胞用于进一步处理。例如,经选择的细胞可以具有CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD34、CD90、CD49f中的任一个,或其组合。这种选择可以例如通过采用与抗体缀合的固体支持物(例如磁珠)来完成,该抗体与标记物或目的标记物结合。在一些情况下,可以选择具有在特定范围内的直径的细胞子集用于后续处理。在一些实施例中,经选择的细胞可以是HSPC,并且可以基于例如CD34单独或与另一种或多种标记物(例如,CD90)的组合的表达进行选择。在一些实施例中,经选择的细胞可以是T细胞,并且可以基于例如,CD3、CD4和/或CD8单独或与另一种或多种标记物的组合的表达进行选择。
被细胞内化的包含经选择的细胞和一种或多种试剂的样品通常夹带在液体载体中,可以穿过具有多个孔的多孔膜,每个孔具有至少一个截面尺寸(并且优选最大截面尺寸)小于细胞的最大直径,使得这些细胞通过孔引起细胞的变化(例如,物理变形)足以用于由细胞摄取一种或多种试剂(步骤2)。多孔膜可以具有以上讨论的特性。例如以上讨论的多个细胞和多种试剂可以用于这样的方法。
参考图3A的流程图,披露了编辑细胞的基因组的方法,该方法包括制备适合于编辑细胞基因组的液体载体、多个靶细胞和至少一种生物剂的混合物(例如,溶液)(步骤1),并且是该混合物通过多孔膜的孔,每个孔具有至少一个截面尺寸小于细胞的最大直径,以便于引起细胞中的变化(例如,物理和/或化学调整),该变化允许细胞摄取一种或多种生物剂。细胞对生物剂的摄取可导致其细胞基因组的选择性编辑。例如,经内化的生物剂可以介导一个或多个DNA区段选择性插入基因组,或从基因组缺失一个或多个DNA区段(例如,一个或多个核苷酸)。在一些实施例中,以上方法可以允许以高于约20%、例如,高于约50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的效率进行这样的插入/缺失编辑。换言之,在所有穿过膜的细胞中至少20%、例如,至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的细胞将经历基因组编辑,例如,如通过靶位点或基因座的下一代测序所测量的。举例来说,在一些实施例中,可以采用根据本教导的基因编辑方法将靶基因的表达调节至少约15%、或至少约20%、或25%、或30%、或40%、或50%、或60%、或70%、或80%、或90%、或100%、或110%、或120%、或130%、或140%、或150%、或160%、或170%、或180%、或190%、或200%、或210%、或220%、或230%、或240%、或250%。在一些实施例中,该调整可以降低表达。在其他实施例中,该调整可以增强表达。
在一些实施例中,基因编辑组分可以是蛋白质-核酸复合物。举例来说,这样的蛋白质-核酸复合物可以包括Cas蛋白和指导RNA(gRNA)。例如,该蛋白质-核酸复合物可以是Cas9蛋白质和gRNA的复合物。在一些实施例中,蛋白质可以尤其是例如,锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、或Cre重组酶。
基因编辑系统
根据本发明,使用本文所述的方法和装置可以递送基因编辑系统或基因编辑系统的一个或多个组分。如本文所用,术语“基因编辑系统”是指系统,例如,一种或多种分子或分子复合物,该系统指导和影响改变或修饰的,例如,在所述系统靶向的基因组DNA位点处或在该位点附近一种或多种核酸的插入或缺失。示例性基因编辑系统在本领域中是已知的,并且在下文更全面地描述。
CRISPR基因编辑系统
在大约40%的测序的真细菌基因组和90%的测序的古细菌中发现了天然存在的CRISPR系统。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics[BMC生物信息学]8:172。此系统是赋予对外来遗传元件(如质粒和噬菌体)的抗性并提供获得性免疫的形式的原核免疫系统。Barrangou等人(2007)Science[科学]315:1709-1712;Marragini等人(2008)Science[科学]322:1843-1845。
CRISPR系统已被修饰用于真核生物(如小鼠、灵长类动物和人)的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人(2012)Nature[自然]482:331-8。这通过例如向真核细胞中引入一种或多种编码特异性工程化的指导RNA(gRNA)(例如,包含与真核基因组序列互补的序列的gRNA)的载体和一种或多种适当的RNA指导的核酸酶(例如,Cas蛋白)来实现。RNA指导的核酸酶与gRNA形成复合物,然后通过gRNA序列与真核基因组的互补序列杂交将其导向靶DNA位点,其中RNA指导的核酸酶随后诱导DNA中的双链或单链断裂。在链断裂处或附近插入或缺失核苷酸产生经修饰的基因组。
由于这些天然存在于许多不同类型的细菌中,因此CRISPR的确切排列,和Cas基因的结构、功能和数量及其产物在物种之间略有不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.[公共科学图书馆医学杂志第一版]1:e60;Kunin等人(2007)Genome Biol.[基因组生物学]8:R61;Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]60:174-182;Bolotin等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:2551-2561;Pourcel等人(2005)Microbiol.[微生物学]151:653-663;和Stern等人(2010)Trends.Genet.[遗传学趋势]28:335-340。例如,Cse(Cas亚型,大肠杆菌)蛋白质(例如,CasA)形成功能性复合物Cascade,其将CRISPR RNA转录物处理成保留Cascade的间隔子重复单元。Brouns等人(2008)Science[科学]321:960-964。在其他原核生物中,Cas6处理CRISPR转录物。基于CRISPR的噬菌体在大肠杆菌中失活需要Cascade和Cas3,但不需要Cas1或Cas2。强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白形成具有小CRISPR RNA的功能性复合物,其识别和切割互补的靶RNA。更简单的CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9,其是具有两个活性切割位点的核酸酶,各自对应用于双螺旋的每条链。将Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA组合可用于基因编辑系统。Pennisi(2013)Science[科学]341:833-836。
在一些实施例中,RNA指导的核酸酶是Cas分子,例如,Cas9分子。多种物种的Cas9分子可用于本文所述的方法和组合物中。尽管酿脓链球菌Cas9分子是本文大部分公开内容的主题,但也可以使用衍生自或基于本文列出的其他物种的Cas9蛋白的Cas9分子。换言之,其他Cas9分子(例如嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌和/或脑膜炎奈瑟氏菌Cas9分子)可用于本文所述的系统、方法和组合物中。另外的Cas9物种包括:燕麦食酸菌(Acidovoraxavenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属物种、cycliphilus denitrificans、少食氨基酸单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡样芽饱杆菌(Bacillus cereus)、史密斯氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌、拟杆菌属物种、Blastopirellula marina、慢生根瘤菌属物种、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslatemsporus)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、拉德弯曲菌(Campylobacter lad)、Candidatus Puniceispirillum、解纤维梭菌(Clostridiu cellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、Dinoroseobacter sliibae、细长真杆菌(Eubacteriumdolichum)、γ变形杆菌、固氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacler diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、生痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、多营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏金氏菌(Kingella kingae)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌科细菌、甲基孢囊菌属物种、甲基弯菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncusmulieris)、杆菌状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(Neisseriacinerea)、浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisserialactamica)、奈瑟氏菌属物种、瓦茨瓦尔西奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属物种、Parvibaculum lavamentivorans、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacterium succinatutens)、丁香罗尔斯通菌(Ralstoniasyzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属物种、穆氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属物种、维尼芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属物种、罕见小球菌属物种(Subdoligranulum sp.)、Tislrella mobilis、密螺旋体属物种、或Verminephrobacter eiseniae。
Cas9分子(当该术语在本文中使用时)是指可与gRNA分子(例如,tracr的结构域的序列)相互作用,并且与gRNA分子一起定位(例如,靶向或归巢)于包含靶序列和PAM序列的位点的分子。
在一些实施例中,活性Cas9分子与靶核酸相互作用并切割靶核酸的能力是PAM序列依赖性的。PAM序列是靶核酸中的序列。在一些实施例中,靶核酸的切割发生在PAM序列的上游。来自不同细菌物种的活性Cas9分子可以识别不同的序列基序(例如,PAM序列)。在一些实施例中,酿脓链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGG并指导靶核酸序列的在该序列上游1至10个(例如3至5个)碱基对的切割。参见例如,Mali等人,SCIENCE[科学]2013;339(6121):823-826。在一些实施例中,嗜热链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGGNG和NNAGAAW(W=A或T)并指导核心靶核酸序列的在这些序列上游1至10个(例如3至5个)碱基对的切割。参见例如,Horvath等人,SCIENCE[科学]2010;327(5962):167-170;以及Deveau等人,JBACTERIOL[细菌学杂志]2008;190(4):1390-1400。在一些实施例中,来自变形链球菌(S.mutans)的活性Cas9分子识别序列基序NGG或NAAR(R-A或G)并指导核心靶核酸序列的在该序列上游1至10个(例如3至5个)碱基对的切割。参见例如,Deveau等人,J BACTERIOL[细菌学杂志]2008;190(4):1390-1400。
在一些实施例中,金黄色葡萄球菌的活性Cas9分子识别序列基序NNGRR(R=A或G)并指导靶核酸序列的在该序列上游1至10个(例如3至5个)碱基对的切割。参见例如,Ran F.等人,NATURE[自然],第520卷,2015,第186-191页。在一些实施例中,脑膜炎奈瑟氏菌的活性Cas9分子识别序列基序NNNNGATT并指导靶核酸序列的在该序列上游1至10个(例如3至5个)碱基对的切割。参见例如,Hou等人,PNAS EARLY EDITION[美国国家科学院院刊早期版本]2013,1-6。可以例如使用Jinek等人,SCIENCE[科学]2012,337:816中描述的转化测定来确定Cas9分子识别PAM序列的能力。
示例性天然存在的Cas9分子描述于Chylinski等人,RNA Biology[RNA生物学]2013;10:5,727-737中。此类Cas9分子包括簇1细菌家族、簇2细菌家族、簇3细菌家族、簇4细菌家族、簇5细菌家族、簇6细菌家族、簇7细菌家族、簇8细菌家族、簇9细菌家族、簇10细菌家族、簇11细菌家族、簇12细菌家族、簇13细菌家族、簇14细菌家族、簇1细菌家族、簇16细菌家族、簇17细菌家族、簇18细菌家族、簇19细菌家族、簇20细菌家族、簇21细菌家族、簇22细菌家族、簇23细菌家族、簇24细菌家族、簇25细菌家族、簇26细菌家族、簇27细菌家族、簇28细菌家族、簇29细菌家族、簇30细菌家族、簇31细菌家族、簇32细菌家族、簇33细菌家族、簇34细菌家族、簇35细菌家族、簇36细菌家族、簇37细菌家族、簇38细菌家族、簇39细菌家族、簇40细菌家族、簇41细菌家族、簇42细菌家族、簇43细菌家族、簇44细菌家族、簇45细菌家族、簇46细菌家族、簇47细菌家族、簇48细菌家族、簇49细菌家族、簇50细菌家族、簇51细菌家族、簇52细菌家族、簇53细菌家族、簇54细菌家族、簇55细菌家族、簇56细菌家族、簇57细菌家族、簇58细菌家族、簇59细菌家族、簇60细菌家族、簇61细菌家族、簇62细菌家族、簇63细菌家族、簇64细菌家族、簇65细菌家族、簇66细菌家族、簇67细菌家族、簇68细菌家族、簇69细菌家族、簇70细菌家族、簇71细菌家族、簇72细菌家族、簇73细菌家族、簇74细菌家族、簇75细菌家族、簇76细菌家族、簇77细菌家族、或簇78细菌家族的Cas9分子。
示例性天然存在的Cas9分子包括簇1细菌家族的Cas9分子。实例包括以下的Cas9分子:酿脓链球菌(例如,菌株SF370、MGAS 10270、MGAS 10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131和SSI-1)、嗜热链球菌(例如,菌株LMD-9)、假豕链球菌(S.pseudoporcinus)(例如菌株SPIN 20026)、变形链球菌(例如,菌株UA 159、NN2025)、猴链球菌(S.macacae)(例如,菌株NCTC1 1558)、解没食子酸链球菌(S.gallolylicus)(例如,菌株UCN34、ATCC BAA-2069)、马链球菌(S.equines)(例如,菌株ATCC 9812、MGCS 124)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)(例如,菌株GGS 124)、牛链球菌(S.bovis)(例如,菌株ATCC700338)、S.cmginosus(例如,菌株F021 1)、无乳链球菌(S.agalactia*)(例如,菌株NEM316、A909)、单核细胞增生李斯特菌(例如,菌株F6854)、无害李斯特菌(L.innocua,例如,菌株Clip 11262)、意大利肠球菌(EtUerococcus italicus)(例如,菌株DSM 15952)、或屎肠球菌(Enterococcus faecium)(例如,菌株1,23,408)。另外的示例性Cas9分子是脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9分子(Hou等人PNAS Early Edition[美国国家科学院院刊早期版本]2013,1-6)和金黄色葡萄球菌Cas9分子。
在一些实施例中,Cas9分子(例如活性Cas9分子或无活性Cas9分子)包含与本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的氨基酸序列;当与本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列相比时,相差不超过1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%或40%的氨基酸残基的氨基酸序列;与本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列相差至少1、2、5、10或20个氨基酸但相差不超过100、80、70、60、50、40或30个氨基酸的氨基酸序列;或与本文所述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列相同的氨基酸序列;所述Cas9分子序列是例如来自本文所列物种的或描述于Chylinski等人,RNA Biology[RNA生物学]2013,10:5,′I2′I-Τ,1;Hou等人PNAS Early Edition[美国国家科学院院刊早期版本]2013,1-6中的Cas9分子。
在一些实施例中,Cas9分子是Cpf1、C2c1、C2c2、或C2c3蛋白质及其修饰。参见,例如,Zetsche等人,Cell[细胞],163:1-13(2015),其内容通过引用以其全文结合在此,对于Cpf1的描述,与Cas9同源并且包含RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的文献中Cpf1序列通过引用以其全文结合在此。参见,例如,Zetsche,表S1和S3;还参见,例如,Makarova等人,NatRev Microbiol[微生物自然综述],13(11):722-36(2015);Shmakov等人,Molecular Cell[分子细胞],60:385-397(2015)。
在一些实施例中,Cas9分子包含与酿脓链球菌Cas9(UniProt Q99ZW2)具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的氨基酸序列;当与酿脓链球菌Cas9(UniProt Q99ZW2)相比时,相差不超过1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%或40%的氨基酸残基的氨基酸序列;与酿脓链球菌Cas9(UniProt Q99ZW2)相差至少1、2、5、10或20个氨基酸但相差不超过100、80、70、60、50、40或30个氨基酸的氨基酸序列;或与酿脓链球菌Cas9(UniProt Q99ZW2)相同的氨基酸序列。在一些实施例中,Cas9分子是酿脓链球菌Cas9变体,例如在以下文献中描述的变体:Slaymaker等人,Science Express[科学快讯],可于2015年12月1日通过Science DOI:10.1126/science.aad5227线上获得;Kleinstiver等人,Nature[自然],529,2016,第490-495页,可于2016年1月6日通过doi:10.1038/nature16526线上获得;或US 2016/0102324,将这些文献的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中,Cas9分子是催化无活性的,例如,dCas9。Tsai等人(2014),Nat.Biotech.[自然生物技术]32:569-577;美国专利号:8,871,445;8,865,406;8,795,965;8,771,945;和8,697,359,将其内容通过引用以其全文并入本文。可以将催化无活性的Cas9(例如,dCas9分子)与转录调制子(例如,转录抑制子或转录激活子)融合。
在一些实施例中,Cas9分子(例如,酿脓链球菌的Cas9)可以另外包含一个或多个赋予额外活性的氨基酸序列。在一些方面,Cas9分子可以包含一个或多个另外的多肽结构域,例如像另外的核酸酶结构域(例如,FokI),或转录激活或抑制结构域。另外的实例描述在例如,Komor等人,Nature[自然],533(7603):420-420;doi:10.1038/nature17946中,将该文献通过引用以其全文并入本文中。在一些方面,该Cas9分子可以包含一个或多个核定位序列(NLS)如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个NLS。通常,NLS由暴露于蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成,但其他类型的NLS是已知的。NLS的非限制性实例包括NLS序列,其包含或衍生自:SV40病毒大T抗原的NLS,其具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:1)。其他合适的NLS序列在本领域中是已知的(例如,Sorokin,Biochemistry[生物化学](莫斯科)(2007)72:13,1439-1457;Lange J Biol Chem.[生物化学杂志](2007)282:8,5101-5)。在前述任何实施例中,该Cas9分子可以另外(或可替代地)包含标签,例如His标签,例如His(6)标签或His(8)标签,例如在N末端或C末端。
因此,工程化CRISPR基因编辑系统,例如用于真核细胞中的基因编辑,通常涉及(1)包含靶向结构域(其能够与基因组DNA靶序列杂交)的指导RNA分子(gRNA),和能够结合Cas(例如Cas9酶)的序列,以及(2)Cas(例如,Cas9蛋白)。该第二结构域可以包括被称为tracr结构域的结构域。可以将靶向结构域和能够结合Cas的序列(例如,Cas9酶)设置于相同的(有时被称为单一gRNA、嵌合gRNA或sgRNA)或不同的分子(有时被称为双重gRNA或dgRNA)上。如果配置于不同的分子上,则每个分子包括允许分子例如通过杂交而结合的杂交结构域。
gRNA分子格式在本领域中是已知的。本发明的示例性gRNA分子(例如,dgRNA分子)包含例如具有序列:
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:2)的第一核酸,或由其组成,
其中“n”是指例如,如本文所描述的靶向结构域的残基,标签可以由15-25个核苷酸组成,例如,由20个核苷酸组成;
和具有示例性序列的第二核酸序列:
AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC,任选地在3’末端(SEQ ID NO:3)具有1、2、3、4、5、6、或7(例如,4或7,例如,7)个另外的U核苷酸。
第二核酸分子能可替代地由以上序列的片段组成,其中这样的片段能够与第一核酸杂交。这样的第二核酸分子的实例是:
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC,任选地在3’末端(SEQ ID NO:4)具有1、2、3、4、5、6、或7(例如,4或7,例如,7)个另外的U核苷酸。
本发明的另一个示例性gRNA分子(例如,sgRNA分子)包含例如具有序列:nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:5)的第一核酸或由其组成,其中“n”是指例如,如本文所描述的靶向结构域的残基,并且可以由15-25个核苷酸组成,例如,由20个核苷酸组成,任选地在3’末端具有1、2、3、4、5、6、或7(例如,4或7,例如,4)个另外的U核苷酸。
本领域已知的CRISPR基因编辑系统的另外的组分和/或元件,例如,在美国公开号2014/0068797、WO 2015/048577和Cong(2013)Science[科学]339:819-823中进行了描述,其内容通过引用以其全文并入本文。可以产生抑制靶基因的这样的系统,例如,通过使CRISPR基因编辑系统工程化以包括gRNA分子,该gRNA分子包含与靶基因序列杂交的靶向结构域。在一些实施例中,该gRNA包含靶向结构域,该靶向结构域与靶基因的15-25个核苷酸(例如,20个核苷酸)完全互补。在一些实施例中,将靶基因的15-25个核苷酸(例如,20个核苷酸)紧邻由CRISPR基因编辑系统的RNA指导的核酸酶,例如,Cas蛋白识别的原型间隔子邻近基序(PAM)序列(例如,其中该系统包含酿脓链球菌Cas9蛋白质,该PAM序列包含NGG,其中N可以是A、T、G或C中的任一个)的5’配置。
在一些实施例中,可以将gRNA分子和CRISPR基因编辑系统的RNA指导的核酸酶(例如,Cas蛋白)复合以形成RNP复合物。可以将这样的RNP复合物用于本文所述的方法和装置。在其他实施例中,可以将编码CRISPR基因编辑系统的一个或多个组分的核酸用于本文所述的方法和装置。
在一些实施例中,可以将外源DNA连同CRISPR基因编辑系统一起引入细胞,例如,编码所需转基因的DNA,该DNA具有或不具有在靶细胞类型中有活性的启动子的。取决于外源DNA的序列和基因组的靶序列,可以在由CRISPR基因编辑系统靶向的位点处或该位点附近处将该过程用于将外源DNA整合到基因组中。例如,转基因侧翼的3'和5'序列可以包括在外源DNA中,该外源DNA与基因编辑系统切割的基因组位点中的基因序列3'和5'(分别)同源。这样的外源DNA分子可以被称为“模板DNA”。
在一些实施例中,本发明的CRISPR基因编辑系统包含Cas9(例如,酿脓链球菌Cas9)和包含与目的基因的序列杂交的靶向结构域的gRNA。在一些实施例中,将gRNA和Cas9复合以形成RNP。在一些实施例中,CRISPR基因编辑系统包含编码gRNA的核酸和编码Cas蛋白(例如,Cas9,例如,酿脓链球菌Cas9)的核酸。在一些实施例中,CRISPR基因编辑系统包含gRNA和编码Cas蛋白(例如,Cas9,例如,酿脓链球菌Cas9)的核酸。
可以与本方法和装置使用的另外的CRISPR基因编辑系统包括在例如,国际申请公开WO 2017/115268和例如,国际申请公开WO2017/093969中描述的CRISPR基因编辑系统,这些申请中每一个的内容通过引用以其全文并入本文。
TALEN基因编辑系统
通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域进行融合来人工产生TALEN。可以工程化转录激活因子样效应物(TALE)以结合任何所希望的DNA序列(例如,靶基因)。通过将工程化的TALE与DNA切割结构域组合,可以产生对任何所希望的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异的限制酶。然后可以将它们引入细胞中,其中它们可以用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:135-6;和Boch等人(2009)Science[科学]326:1509-12;Moscou等人(2009)Science[科学]326:3501。
TALE是由黄单胞菌属细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列,但第12和第13氨基酸除外。这两个位置高度变化,显示出与特定核苷酸识别的强相关性。因此,它们可以被工程化以结合所希望的DNA序列。
为产生TALEN,将TALE蛋白质与核酸酶(N)融合,该核酸酶是例如,野生型或突变的FokI内切核酸酶。针对在TALEN中的用途已经对FokI作出若干个突变;例如,这些改善了切割特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.[核酸研究]39:E82;Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8;Hockemeyer等人(2011)NatureBiotech.[自然生物技术]29:731-734;Wood等人(2011)Science[科学]333:307;Doyon等人(2010)Nature Methods[自然方法]8:74-79;Szczepek等人(2007)Nature Biotech.[自然生物技术]25:786-793;和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]200:96。
FokI结构域作为二聚体起作用,这需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体,用于靶基因组中具有适当方向和间距的位点。TALE DNA结合结构域与FokI切割结构域之间的氨基酸残基的数量和两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数量似乎都是实现高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:143-8。
可在细胞内使用TALEN(或TALEN对)以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源末端连接不正确地修复断裂,则可以在断裂位点引入突变。例如,不正确的修复可以引入移码突变。可替代地,可以将外源DNA与TALEN一起引入细胞,例如编码转基因的DNA,并且根据外源DNA和染色体序列的序列,可以将该过程用于通过TALEN将转基因整合到靶位点处或靶位点附近处。可以使用本领域已知的任何方法构建对靶基因特异的TALEN,这些方法包括使用模块组分的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.[自然生物技术]29:149-53;Geibler等人(2011)PLoS ONE[公共科学图书馆综合]6:e19509;US 8,420,782;US 8,470,973,将其内容通过引用以其全文并入本文。
锌指核酸酶(ZFN)基因编辑系统
“ZFN”或“锌指核酸酶”是指锌指核酸酶,一种可用于修饰例如,使所希望的核酸序列的一个或多个核酸缺失的人工核酸酶。
与TALEN一样,ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下,DNA结合结构域包含一个或多个锌指。Carroll等人(2011)GeneticsSociety of America[美国遗传学学会]188:773-782;和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:1156-1160。
锌指是被一种或多种锌离子稳定的小蛋白质结构基序。锌指可包含例如Cys2His2,并且可识别大约3-bp序列。可以将已知特异性的各种锌指组合以产生识别约6、9、12、15或18-bp序列的多指多肽。各种选择和模块组装技术可用于产生识别特定序列的锌指(及其组合),包括噬菌体展示、酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统、以及哺乳动物细胞。
像TALEN一样,ZFN必须二聚化以切割DNA。因此,需要一对ZFN来靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN必须与DNA的相反链结合,其中它们的核酸酶适当地间隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95:10570-5。
也像TALEN一样,ZFN可以在DNA中产生双链断裂,如果不正确地修复则可以产生移码突变,这导致细胞中靶基因表达和量的减少。ZFN还可以与同源重组一起使用以突变靶基因或基因座,或在靶向序列处或附近的位点处引入编码所需转基因的核酸。
可以使用本领域已知的任何方法构建对靶基因中的序列特异性的ZFN。参见,例如,Provasi(2011)Nature Med.[自然医学]18:807-815;Torikai(2013)Blood[血液]122:1341-1349;Cathomen等人(2008)Mol.Ther.[分子疗法]16:1200-7;和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]400:96;美国专利公开2011/0158957;和美国专利公开2012/0060230,其内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中,ZFN基因编辑系统还可以包含编码ZFN基因编辑系统的一个或多个组分的核酸。
可以将以上基因编辑方法应用于各种不同的靶细胞。例如,靶细胞可以是哺乳动物细胞,例如,人细胞。细胞可以是所希望的类型,尤其是例如祖细胞、免疫效应细胞(例如,T细胞或NK细胞)、人胚胎干细胞(hES细胞)、诱导多能干细胞(iPS)、间充质干细胞、角化细胞或人支气管上皮细胞。在一些实施例中,细胞是人T细胞。在一些实施例中,细胞是人造血干细胞和祖细胞(HSPC)。在一些实施例中,细胞对其可以施用至的受试者是自体同源的。在其他实施例中,细胞对其可以施用至的受试者是同种异体的。
图3B示意性地描绘了根据本教导用于进行基因治疗的基因编辑技术的示例性临床应用中循环的各个步骤的实例。图3C示意性地描绘了根据本教导用于进行基因治疗的基因编辑技术的示例性临床应用中循环的各种程序的另一个实例。在图3B-3C中所示的实例中,例如,使用抗体和/或尺寸选择收集患者(供体患者)(例如,患有遗传疾病的患者)的细胞样品(例如,骨髓(如图3C所示)或外周血)并分离造血干细胞和祖细胞(HSPC),例如,CD34+细胞。采用根据本教导的方法将基因编辑复合物(例如,Cas9-gRNA复合物)递送至HSC细胞用于进行遗传校正。然后收集经修饰的细胞,例如用于质量控制,并任选地进行冷冻保存。然后制备经收集的细胞用于移植到患者(受体患者)中。在一些实施例中,患者与从中收集细胞的患者相同,例如,移植是自体的。在其他实施例中,可以从健康供体患者收集细胞并将其递送至不同的受体患者,例如患有遗传疾病的患者,例如,移植是同种异体的。通过从供体患者收集包含所需细胞群的细胞群,可以将类似方法用于其他细胞类型(例如,T细胞)的临床应用。
使用各种不同的系统可以实施用于将试剂递送到细胞中的以上方法。例如,图4A和4B示意性地描绘了根据本教导的实施例用于细胞处理的系统100,该系统包括收集块102(本文还被称为收集板),该收集块包括用于接收经处理的细胞的多个孔104。虽然在该实施例中,收集板包括24个孔,但在其他实施例中,收集板中提供的孔的数量可以是不同的。
系统100进一步包括多个细胞处理组件106,各自流体地连接到收集块102中孔104的其中一个孔(在图4A中细胞处理组件106被封盖102a遮蔽;图4B描绘了具有去除封盖102a的细胞处理组件106)。如以下更详细讨论的,每个细胞处理组件可以接收流体载体(通常是液体载体),其中夹带有多个细胞和一种或多种试剂(例如以上讨论的那些试剂)。细胞通过细胞处理组件106可以导致细胞的物理和/或化学特性的调整,例如细胞膜渗透性的变化,这可以反过来允许细胞的摄取一种或多种试剂。
在一些实施例中,系统可以包括多个注射器108,其中可以将每个注射器连接到细胞处理组件106的其中一个,用于将含有流体载体、多个靶细胞和一种或多种试剂的混合物(例如,溶液)的样品递送至对应的细胞处理组件。更具体地,可以将样品设置于注射器中,并且可以将正压接口用于对样品施加压力从而推动样品通过连接到注射器的细胞处理组件。
更具体地,在该实施例中,气体管线110a将气体(例如,氮气)从源(未示出)传送到调节器组件111,该调节器组件调节气体压力以经由气体管线110b施加到正压接口113。正压接口113在注射器筒上形成密封,并向注射器中的样品提供经调节的气体压力。在一些实施例中,可以将在注射器中的至少约5psi的压力(例如,在约5psi至约100psi的范围内)施加给样品从而导致样品例如,以高于约20mL/min的流速通过细胞处理组件。通常,可以调节施加到样品上的压力(例如,通过施加的气体压力),以便于改变样品通过细胞处理组件的流速。在一些实施例中,系统100允许以至少约40亿个细胞/分钟的速率处理细胞。
参考图5A、5B、5C和5D,细胞处理组件106(例如,展示性细胞处理组件106a)中的每一个可以包括具有入口端口114的输入块112,该入口端口114允许将样品递送至入口块112。如以下更详细讨论的,入口块112进一步包括从入口端口114延伸至以下输入室118的流体通道116,多孔膜120定位于输入室118之下。输入室118的体积可以例如,在约50μL至约1L的范围内,尽管还可以使用其他体积。
在该实施例中,套圈122允许通过配件124(例如,聚醚醚酮(PEEK)配件)和管道126将展示性细胞处理组件106a的入口端口114与包含样品的注射器的针128流体地偶联。更具体地,入口端口可包括内螺纹,该内螺纹可与配件的外螺纹接合。针可以延伸穿过配件和套圈的中心开口,以将注射器流体地连接到入口端口114。
细胞处理组件106a进一步包括输出块130,该输出块130具有输出室132,该输出室132流体地连接到通道134的近端,在其远端提供出口端口136。在一些实施例中,输出室132被配置成减少死体积并促进将样品转移到相应的收集孔中。例如,输出室132可以具有所选择的适合的体积,例如,基于膜120的内径,网142和以下讨论的垫圈146。例如,输出室132的体积可以是约7.99立方毫米,尽管还可以使用其他尺寸。流体通道134可以具有任何合适的长度和体积,例如约21.32mm的长度和约0.9mm的孔直径,对应于约13.56立方毫米的体积。输出块132包括多个外螺纹138(还参见图6A),该外螺纹138可以与输入块的多个内螺纹140(还参见图6B)接合以将两个块连接在一起。
如以上所指出的,细胞处理组件106a进一步包括设置在输入块和输出块之间的多孔膜120,以便于经由输入块接收包含细胞和有待被细胞内化的一种或多种试剂的样品,并且允许至少一部分细胞穿过其中以到达输出块。网142(例如本实施例中的不锈钢网),被设置于邻近多孔膜120,用于为其提供机械支持。特别地,该网可以帮助薄膜承受液体样品在压力下通过。由输入块的凹槽145(参见图6A)接收的垫圈144和由输出块的凹槽150接收的另一个垫圈146(还参见图6B)有助于在输入块和输出块之间将多孔膜120和网142固定地定位。
参考图7,在该实施例中,多孔膜120具有基本上平的结构和圆形截面,其中直径(PD)在约1mm至约142mm的范围内,尽管还可以使用其他直径。多孔膜120包括从上表面120延伸至膜的下表面120b的多个孔200。换言之,每个端口从基本上与膜120的上表面齐平的入口端口(例如,入口端口202)延伸至基本上与膜120的下表面齐平的出口端口(例如,出口端口204)。因此,在该实施例中,膜的厚度与孔的长度基本上相同,该长度可以在约5微米至约30微米的范围内。虽然在该实施例中,孔具有基本上一致的长度,但在其他实施例中,孔的长度可以是不一致的。在这样的实施例中,膜的厚度可以是不一致的,以符合孔的长度。
在该实施例中,每个孔200基本上是圆柱形的,沿着孔的长度具有基本上一致的圆形截面。通常,每个孔的截面直径D(对应于该实施例中孔的最大截面尺寸)被选择为小于要经由通过孔进行改变的细胞的直径,以便于在流体载体中摄取一种或多种试剂。在该实施例中,每个孔的截面直径D可以小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米。举例来说,截面直径D可以在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内。在一些实施例中,截面直径D可以在约5微米至约8微米的范围内。
膜的厚度(在该实施例中对应于孔的长度)可以例如,在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内。在一些实施例中,孔的表面密度可以是例如,在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内。孔的表面密度可以通过将孔的数量除以多孔膜的上表面或下表面的面积来确定。高孔密度有利地允许细胞通过它们在施加的压力下通过多孔膜而有效递送和处理。例如,在一些实施例中,可以将多孔膜用于以至少约40亿个细胞/分钟的速率用实际转染细胞。
多孔膜可以由各种材料,例如聚合物、半导体或金属形成。在许多实施例中,多孔膜由聚合材料形成。适合的聚合物的一些实例包括但不限于、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
使用各种不同的方法,可以产生多孔膜120的孔。举例来说,使用离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种可以生成孔。
在一些实施例中,可以用材料涂覆膜的暴露表面的至少一部分,和在许多实施例中膜的整个暴露表面。例如,膜的暴露表面(包括孔的内表面)可以用聚合材料,例如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(PEG)和PEG基化合物、聚乙烯醇(PVA)、羟乙基纤维素、tween 20、十八烷基硅烷、Brij-35、聚(对二甲苯)、含氟聚合物、Pluronic F127涂覆。虽然在一些情况下,孔的内表面在其他实施例中可以是亲水的,但孔的内表面可以是疏水的。在一些实施例中,可以选择涂覆膜表面的材料,以便于增强那些表面的亲水性或疏水性。
在其他实施例中,孔可以具有包括规则和不规则形状的非圆形截面形状。举例来说,图8示意性地描绘了另一个多孔膜300的顶视图,该多孔膜300具有多个具有矩形截面的孔302。在这种情况下,矩形(DD)对角线的尺寸对应于孔的最大截面尺寸,并且小于适合于当细胞穿过其中一个孔时实现细胞中所需变化的阈值。例如,对角线DD可以小于约40微米、或小于约30微米、或小于约20微米、或小于约15微米、或小于约10微米。类似于前述实施例,孔的长度可以是例如,在约5微米至约30微米的范围内,例如,在约7微米至约21微米的范围内。
在一些实施例中,一个或多个孔的截面面积沿孔的整个长度可能是不一致的。举例来说,图9示意性地描绘了从近端开口401a延伸到远端开口401b的这种孔400。孔的截面面积从近端开口逐渐减小并且在孔的中间达到最小值,并然后从孔的中间到其远端增加。在其他实施例中还可以采用孔的截面面积的其他变化。
参考图5B以及图10,支撑网142邻近膜120放置从而为膜提供机械稳定性,例如,以帮助膜承受由于液体样品通过而施加到其上的压力。在该实施例中,网142由不锈钢形成,但是在其他实施例中,它可以由其他材料形成。网142包括多个开口142a,这些开口具有比多孔膜120的孔的截面直径显著更大的截面直径。举例来说,网开口的直径可以在约1mm至约5mm的范围内。离开多孔膜的细胞穿过网的孔以到达输出块130。
如以上所指出的,在许多实施例中,多孔膜由聚合材料形成,并且网可以由适合的金属(例如,不锈钢)形成。系统的其他组分(例如,输入块和输出块)可以由任何适合的材料(例如,聚合材料)形成。
再次参考图4A、4B、5A和5B,通过一个或多个注射器108,可以将使用的各自包含流体载体(例如,缓冲溶液)、多个目的细胞和有待被细胞内化的一种或多种试剂的多个样品引入一个或多个细胞处理组件106。由活塞110施加到样品上的压力可以促进它们通过多孔膜120的孔。当细胞穿过孔200的其中一个孔时,孔的壁对细胞施加压缩压力,因为孔的截面尺寸小于细胞的直径。不受任何特定理论的限制,这种压缩压力可引起细胞的变化,例如,它可以改变细胞膜的渗透性。并且这种细胞变化可以反过来促进细胞对一种或多种试剂的摄取。在许多实施例中,本发明的系统和方法允许细胞摄取许多通常不被细胞内化的试剂(例如,因为那些试剂在正常条件下不可透过细胞膜)。
在通过多孔膜120的其中一个后,包括夹带在流体载体中的细胞的样品穿过网142的其中一个的开口以到达输出块130。然后,样品可以穿过输出块130的出口136的出口,以收集在收集块102的一个孔104中。
根据本教导的另一个实施例,图11A、11B和11C示意性地描绘了用于细胞处理的系统500。系统500包括细胞处理组件502,该细胞处理组件502包括多个并行通道504,用于同时处理多个细胞。细胞处理组件502包括具有多个入口端口508的入口支撑元件(例如,板)506,通过这些入口端口508可以将各自包含细胞和有待递送至细胞中的一种或多种试剂的多个样品引入组件。细胞通常与有待被细胞内化的一种或多种试剂一起夹带在液体载体(例如,缓冲溶液)中。虽然在该实施例中,输入板包括24个入口端口(如图11A中更清楚地显示),但在其他实施例中,例如,基于特定应用的要求,入口端口的数量可以是不同的。
图示的细胞处理组件502进一步包括出口支撑元件(例如,板)510(本文中还被称为出口块),包括多个孔512,用于接收经处理的样品。如以下更详细讨论的,每个样品-接收孔512与其中一个入口端口流体连通。
入口块和出口块可以由各种不同的材料形成。适合的材料的一些实例由其包括但不限于,316不锈钢、聚醚醚酮(PEEK)聚合物。此外,入口板和出口板可以具有各种不同的厚度,例如,在约10至约20mm的范围内的厚度。
多个多孔膜514被设置在入口板506和出口板510之间,使得每个多孔膜相对于入口块的入口端口定位,以接收经由该入口端口引入组件中的细胞,并且相对于出口块的相应的孔定位,使得穿过膜的细胞被接收在该孔中。举例来说,多孔膜514a相对于入口块的入口端口508a定位,以便于接收包含经由入口端口508a引入组件的细胞的样品,并且多孔膜514a相对于孔512a定位,使得样品在通过膜后将到达该孔。
多孔膜可以具有以上结合前述实施例所讨论的特性。例如,每个多孔膜可以具有小于细胞直径的最大截面尺寸,对于这些细胞系统500旨在提供细胞处理(例如,细胞转染)。举例来说,多孔膜514的孔的最大截面尺寸可以在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内,例如,在约5微米至约8微米的范围内。与前述实施例类似,在该实施例中,多孔膜的每个孔的入口基本上与膜的输入表面齐平,并且每个孔的出口基本上与膜的输出表面齐平。此外,多孔膜514可以由例如以上所讨论的各种不同的聚合材料形成。
参考图11B,系统500进一步包括多个网516(例如,不锈钢网),每个网被设置于邻近多孔膜514的其中一个。如以上结合前述实施例所讨论的,这些网可为多孔膜提供机械支持。这些网可以具有在约1mm至约5mm的范围内的孔,这允许细胞容易通过穿过膜514的孔。此外,如以上所讨论的,在一些实施例中,这些网516可以具有例如,在约0.15mm至约0.25mm的范围内的厚度,尽管还可以采用其他厚度。
入口密封件518和出口密封件520(例如垫圈)用于在入口块506和出口块510之间提供流体严密密封件。出口密封件容纳在设置于出口板中相应的凹槽522中,并且入口密封件容纳在设置于入口板506中相应的凹槽(未示出)中(参见图11C)。
类似于前述实施例,在该实施例中,提供多个注射器524,每个注射器524流体地连接到入口板506的其中一个入口端口,从而将含有细胞和一种或多种试剂的样品(细胞和一种或多种试剂通常夹带在液体载体中)引入细胞处理组件。更具体地,在该实施例中,每个注射器经由套圈524的其中一个、螺纹配件526的其中一个、内六角圆柱头螺钉(SHCS)528的其中一个、管530的其中一个以及配件532的其中一个连接到相应的入口端口。多个活塞534(每个活塞连接到注射器524的其中一个)允许将包含在注射器中的样品推到多孔膜514上。在其他实施例中,可以使用加压气体将包含在注射器中的样品推到多孔膜上。
因此,细胞处理系统500包括多个平行细胞处理通道(在该实施例中为24个通道),每个通道经由多孔膜从一个入口端口延伸到一个出口端口,用于多个细胞的同时处理。举例来说,在一些情况下,可以采用细胞处理系统500的每个单元以处理至少约40亿个细胞/分钟。
更具体地,在使用中的多个样品,其中每个样品包含细胞和有待被细胞内化的一种或多种试剂,这些细胞和一种或多种试剂通常夹带在液体载体中,例如通过对注射器的活塞施加压力可以将该液体载体同时引入细胞处理组件中。在该实施例中,细胞处理组件502包括24个平行细胞处理通道,但在其他实施例中,可以提供其他数量的平行细胞处理通道。类似于前述实施例,在一些情况下,施加到包含于注射器中的样品的压力可以高于约5psi。在一些情况下,样品通过每个细胞处理通道的流速可以是至少约20mL/min。样品通过细胞处理组件的总流速可以通过将经过每个细胞处理通道的流速乘以那些通道的数量来获得。
细胞通过多孔膜中的每一个可以引起那些细胞中至少一些的变化,使得这些细胞可以摄取存在于流体载体中的一种或多种试剂。举例来说并不受任何具体的理论限制,如以上所讨论的,由于孔的较小截面尺寸,细胞通过其中一个膜的其中一个孔可以使该细胞经受压缩力,该压缩力可以反过来引起变化(例如,细胞膜渗透性中的瞬时变化),允许细胞摄取存在于载体中的一种或多种试剂。
在通过多孔膜和相应的网之后,细胞(包括已经经历由通过膜的通道而转化的细胞)穿过出口板中提供的出口端口以到达设置在输出板510中的收集孔。
如以上所指出的,在一些实施例中,从异质细胞的集合中选择具有所需特征的一种或多种细胞,并然后以上述方式处理所选细胞从而用一种或多种试剂转染这些细胞。举例来说,图12A示意性地描绘了根据本发明实施例的系统600,该系统包括可以接收异质细胞集合的细胞选择(分选)装置602。装置602可以基于一个或多个所需特性对所接收的细胞进行分选。例如,装置602可以基于表面蛋白质标记(例如,标记物,如CD34、CD90、CD49f及其组合)、细胞大小、或其他细胞特征的优先存在来对细胞进行分选。根据本教导,系统600进一步包括用于与一种或多种目的试剂转染细胞的细胞处理装置602,该细胞处理装置连接到细胞分选装置602以接收其中经选择的细胞。在该实施例中,细胞处理装置602包括具有孔径为约8微米的多孔膜(未示出),在一种或多种试剂的存在下细胞通过该孔。如以上所讨论的,细胞通过多孔膜可以介导细胞摄取一种或多种试剂。收集单元606可以收集经处理的细胞。被废弃的细胞(即,未被选择用于进一步处理的细胞)可被废物收集单元608收集,作为废物被丢弃。
细胞分选装置602可以以各种不同的方式实现。例如,如图12B中示意性地显示,装置602可以包括细胞室602a和相对于细胞室可移动的磁体602b,用于将结合到磁性粒子的细胞与未结合的细胞分离。施加到与磁性粒子结合的细胞的磁力可以通过移动磁体602a到更靠近或更远离细胞室来调节。更具体地,在将细胞引入细胞室后,可以将磁体移动到紧邻细胞室的位置,以通过向其施加磁力来约束与磁性粒子结合的细胞的运动,使得其他细胞(不与磁性粒子结合的细胞)可以从细胞室中去除并收集在非磁性部分中。然后可以使磁体远离室的附近移动,从而减少或优选地消除施加到磁性粒子结合细胞的磁力,使得那些细胞还可以从细胞室去除并转移到单独的磁性部分中。此外,在一些实施例中,装置602可以包括各种磁性装置、电磁铁、活性流体控制和细胞室设计,用于在分离过程中最佳控制磁力。
在一些实施例中,用于处理细胞的系统可以包括微流体装置,该装置可以从储存器中接收包含细胞的样品并按以上讨论的方式处理这些细胞。举例来说,图13A示意性地描绘了具有微流体装置1002的这样的系统1000,该微流体装置1002流体地连接到样品储存器1004,该样品储存器1004包含多个细胞和包含在液体载体中的一种或多种试剂。泵1006促进将液体载体流与其中包含的细胞和一种或多种试剂一起递送到微流体装置1002。微流体递送装置1002可以反过来将所接收的含有细胞和一种或多种试剂的液体载体分配到多个样品中,并将那些样品(通常同时地)递送到与其流体连接的细胞处理组件的平行细胞处理通道中。
更具体地,在该实施例中,微流体装置1002包括可以从储存器1004接收样品的输入室1008。多个微流体输入通道1010与多孔膜1012平行地携带所接收的样品的不同部分。多孔膜1012可以包括具有至少一个截面尺寸(并且优选最大截面尺寸)小于细胞直径的多个孔,以便于促进细胞摄取存在于样品中的一种或多种试剂。多个输出通道1014携带处理过的细胞到输出室1016中进行收集。
参考图13B,在一些实施例中,根据本教导的用于将一种或多种试剂递送至细胞的系统2000包括多个多孔膜2002、2004、2006和2008,将这些多孔膜串联定位以便于顺序地接收多个细胞。多孔膜类似于与其他实施例所讨论的多孔膜有关,并且包括具有足够小的截面直径的孔,以便于引起通过孔的细胞摄取其暴露的一种或多种试剂。举例来说,膜的孔可以具有至少一个截面尺寸,并且优选最大截面尺寸小于约40微米,例如,在约2微米至约40微米的范围内、或在约2微米至约30微米的范围内、或在约2微米至约20微米的范围内、或在约2微米至约15微米的范围内、或在约2微米至约10微米的范围内。
该系统进一步包括多个储存器2010、2012、2014和2016(本文中还被称为液体交换模块),每个储存器包含一种或多种试剂(例如,包含在液体载体中)。将每个储存器流体地连接到其中一个多孔膜(例如,经由多个喷嘴2010a、2012a、2014a和2016a),以便于将细胞暴露于一种或多种试剂,当细胞穿过细胞膜时使得至少一些细胞摄取一种或多种试剂。在一些情况下,每个贮存器含有不同的试剂,使得当细胞顺序地通过多孔膜时,它们将暴露于不同的试剂并因此顺序地摄取不同的试剂。
提供以下实例用于说明目的以进一步阐明本发明的各个方面,并且不旨在表示实践本发明的各个方面和/或可获得的最佳结果的必然最佳方式。
实例1:将CRISPR-Cas9核糖核酸蛋白质物理递送至人CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)
Cas9蛋白质不仅对于基础研究,还对于敲除基因甚至修复基因的治疗应用具有巨大的潜力。目前存在少数将Cas9递送到目的细胞中的方法,这些方法包括Cas9和指导物的病毒递送、通过脂质纳米颗粒的质粒和mRNA递送、或电穿孔。这些方法存在将Cas9/指导RNA序列随机整合到基因组中的风险,这可能导致不希望的后果。这些方法还在细胞内产生Cas9和gRNA蛋白质的高表达,这可以使Cas9对细胞的蛋白质合成机制起作用,甚至增加脱靶和随机切割的风险。理论上,仅需要一种蛋白质达到靶基因组序列。此外,已经证明质粒DNA和mRNA非常庞大,并因此难以瞬时递送到悬浮细胞(如人造血干细胞和祖细胞(HSPC)和T细胞)中。在该实施例中,描述了与sgRNA复合的Cas9蛋白作为核糖核蛋白复合物(RNP,在本文中还被称为核糖核蛋白复合物)的递送,其中运载物较小,具有的寿命较短,并且不存在随机整合的风险。由于受限的内在胞吞作用,HSPC需要物理直接的递送方法(如电穿孔)。但电穿孔对细胞非常苛刻,导致高细胞毒性和减少增殖。
在该实例中,采用了可替代的系统,即由膜过滤辅助的跨膜内化(TRIAMF),该系统证明了RNP复合物的高递送和高编辑效率,具有低细胞毒性,同时允许可扩展性和模块化以合并到其他细胞处理系统中。
方法:
装置的设置:采用例如以上所讨论的那些系统。根据本教导定制不锈钢装置(单孔和24孔歧管)和不锈钢盘膜支撑件。所有其他的部件购自麦克马斯特-卡尔公司(McMasterCar)。跟踪蚀刻的聚碳酸酯PVP涂覆的膜购自Sterlitech(产品编号PCT8013100(8μm,薄)、PCTF8013100(8μm薄,疏水性)、PCT10013100(10μm,薄),以及具有7μm(厚)、8μm(厚)、9μm(厚)的常规膜,具有不同厚度的孔径)。内部生产Cas9蛋白质并配制于20mM HEPES、150mMKCl、1%蔗糖、1mM TCEP(在pH 7.5)或20mM TRIS-HCl(在pH 8.0)、200mM KCl、10mM MgCl2中,同时合成sgRNA分子并购自AxoLabs或TRILINK,并且包括与B2M的序列(B2M靶向结构域序列:GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG(SEQ ID NO:6))互补的靶向结构域。冷冻的骨髓CD34+HSPC购自龙沙公司(Lonza)或澳赛尔斯公司(AllCells)。StemSpan SFEM II培养基(09655),CC100(02690)均购自干细胞技术公司(Stem Cell Technologies)。FITC缀合的B2M抗体(克隆2M2)和人TruStain FcX购自Biolegend公司。
TRIAMF系统建立
放置硅o形圈、随后放置不锈钢网、接着是聚碳酸酯膜(光面朝上)、然后是Teflon垫圈、然后将顶部连接并拧紧(24孔歧管通过螺钉,单个支架通过扳手)。然后将3mL注射器连接到针上。
在转染之前,通过运行2mL无菌DI(去离子)水,然后使用1mL70%乙醇,并然后在5psi下再用另外的2mL无菌DI水校准歧管。
人造血干细胞和祖细胞培养
冷冻骨髓衍生的CD34+HSPC购自龙沙公司(Lonza)或澳赛尔斯公司(AllCells),并根据制造商的说明书解冻。在补充有CC110(干细胞技术公司(StemCell Technologies))、0.75uM StemRegenin 1(干细胞技术公司)、50nM UM171(干细胞技术公司)、50ng/mL人重组IL-6(派普泰克公司(Peprotech))和PenStrep的SFEM II中培养细胞。在实验使用细胞之前将细胞培养/扩增3至5天。
通过TRIAMF递送RNP
将人造血干细胞和祖细胞(50万、1百万、2百万、4百万、5百万或1千万个细胞)旋转沉降并重悬浮于20μL的SFEMII培养基中。将200μg的Cas9与40μg靶向β-2微球蛋白(“B2M”)的sgRNA混合,并允许通过在室温下孵育5分钟使其复合。将RNP混合物与细胞混合,并允许在室温下孵育2分钟,其中最终体积为50μL。然后将该混合物用歧管转移到注射器连接器的底部。然后通过5psi的压力施力使该混合物通过注射器和膜。
允许流通物静置约2至5分钟,然后用1mL完全培养基洗涤膜。静置后,然后以1百万个细胞/mL向细胞补充新鲜SFEM II培养基,该培养基补充有CC100/AHR拮抗剂((S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇;根据WO 2010/059401的化合物157S或StemRegenin 1;4-[2-[[2-(1-苯并噻吩-3-基)-9-丙-2-基嘌呤-6-基]氨基]乙基]苯酚)。在下游分析之前,使细胞恢复并离体扩增72小时(hr)。
用于下一代测序的细胞裂解制品
通过分析插入/缺失形成,经由下一代测序确定编辑效率。将大约100k细胞旋转沉降,并且将细胞裂解物通过约40μL裂解缓冲液用蛋白酶K进行提取。然后将2μL细胞裂解提取物用于通过引物(正向:ctctcaaaccacagggatcaca;反向:ctccatcaccaagagagcctt和Platinum Taq聚合酶(Clontech公司)扩增靶序列并递交用于下一代测序。
抗体染色以检测B2M敲低
经由FITC缀合的抗-B2M(BioLegend公司)染色和FACS分析通过评估B2M敲低来确定功能编辑。将细胞旋转沉降并收集并用FITC缀合的B2M抗体与人TruStain FcX染色30分钟。将细胞洗涤两次,并然后用BD Fortessa流式细胞仪分析,与未经染色的细胞比较,以确定B2M敲低百分比。
细胞回收
通过在Beckman Coulter Vi-Cell中转染72小时后运行500μL细胞来测定细胞回收率从而对活细胞计数。通过比较经处理的样品中活细胞数目与未经处理的细胞样品大小来确定细胞回收率,其中通过以下等式将相同数量的细胞接种在相同体积中:
结果:
递送Cas9/RNP用于CD34+造血祖细胞中的B2M敲低
制造容纳50微升样品体积的单个膜支架以及可用于使样品平行穿过24个膜的24孔歧管。
使用24孔歧管,该装置针对核糖核蛋白复合物(RNP)的靶向递送进行了优化,其中单一指导RNA(sgRNA)与Cas9蛋白复合成衍生自骨髓的人CD34+造血干细胞,将该干细胞扩增6至7天。针对优化,用sgRNA 129(靶向序列:GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG)靶向β-2-微球蛋白作为靶,该靶可以通过流式细胞术染色和下一代测序(NGS)进行测定。然后通过流式细胞术和下一代测序用抗体细胞染色测量B2M敲低,并且经由Vi-Cell通过在递送后48小时经收集的细胞与未经处理的样品的比率来计算细胞回收率。
探索了各种参数用于进行优化,包括:细胞密度、施加的压力、RNP浓度、膜厚度和膜孔径。图18描绘了根据本发明的实施例,指示用于将200μg的Cas9的Cas9/RNP复合物以5百万个细胞/50μL的浓度递送到人造血干细胞中编辑和细胞回收率的数据,作为使细胞穿过多孔膜而施加的压力的函数。使用室内氮气,测试2.5、5、7.5、10和15PSI的不同空气压力。2.5psi不足以有效递送具有20.5%B2M敲低和76%细胞回收率的RNP。5PSI显示41.9%的B2M敲低和77%的细胞回收率。将施加的压力增加至7.5、10和15PSI不会增加递送效率,该递送效率保持在40%至45%,而其中细胞的回收几乎没有降低。
通过混合将200μg的Cas9(7.36mg/mL)和40μg的sgRNA(5mg/mL)预复合在一起并在室温下孵育5min。然后将RNP复合物与50万、1百万、2百万、4百万、5百万或1千万个细胞混合于终体积为50μL的SFEM II中。然后将RNP/细胞混合物加载到TRIAMF系统(其中8微米孔径和7微米厚的膜)上,并使用5psi的氮气压力,施力使样品通过系统并收集在孔平板上。72小时后,收集细胞用于下一代测序(NGS)、FACS分析和Vi-Cell计数以显示通过插入/缺失形成的成功的基因编辑和功能性B2M敲低以及细胞回收。
在图14中,NGS表明55%、50%、50%、54%、和54%的插入/缺失形成。FACS分析分别表明50万、1百万、2百万、4百万和5百万个细胞的63%、56%、52%、57%、和56%的B2M敲低、以及38%、43%、52%、60%、和65%的细胞回收率。
为确定系统的可扩展性,使用单个歧管系统,用50μL中200μg的Cas9测试5百万个细胞和1千万个细胞/50μL的细胞浓度。在图15中,将细胞数量从5百万个细胞扩大到1千万个细胞,TRIAMF分别实现了68%插入/缺失形成和70%B2M敲低,以及71%插入/缺失形成和70%B2M敲低的类似切割效率。这些实验表明,TRIAMF系统可以有效递送不同细胞数量和密度的RNP,从50万最高达1千万个细胞,其中编辑效率没有太大变化。细胞能够轻松穿过系统,没有任何堵塞迹象。
用TRIAMF系统(具有8微米孔径和7微米厚的膜)分别在50μg或200μg的Cas9与10μg或40μg的sgRNA下测试不同的RNP浓度。图16显示在50μg的Cas9处,TRIAMF实现了57%的B2M敲低、55%的插入/缺失形成和54%的细胞回收率,同时在200μg的Cas9处,实现了70%的B2M敲低、65%的插入/缺失形成和62%的细胞回收率。该实验表明溶液中的RNP浓度对于有效递送是重要的,因为存在对于经由膜变形形成孔之后使RNP被动扩散进入细胞的需要。这表明对于经由TRIAMF最有效的递送存在Cas9浓度的阈值,其中同时使用高浓度和低浓度RNP实现编辑水平,但其中较高浓度的RNP导致更有效的编辑。
如以下表1中所示,使用的许多膜具有不同孔径和膜厚度:
表1:膜特征
探索了不同的膜参数(包括厚度和孔径)。使用不同的膜,TRIAMF实现55%插入/缺失、58%B2M敲低和32%细胞回收;56%插入/缺失、61%B2M敲低、和62%细胞回收;67%插入/缺失、57%B2M敲低、和41%细胞回收;62%插入/缺失、54%B2M敲低、和66%细胞回收;56%插入/缺失、53%B2M敲低、和59%细胞回收;26%插入/缺失、19%B2M敲低、和89%细胞回收的具有7(微米孔径)/19(微米厚度)、8/7、8/18、8/7(疏水性)、9/16和10/10膜的HSPC的最佳编辑。图17描绘了通过NGS的插入/缺失%的TRIAMF递送效率,通过FACS分析的B2M KD,并且通过5百万个细胞的递送体积每50μL膜的Vi-Cell进行细胞回收,并且RNP浓度为200μg的Cas9/50μg sgRNA。在这些实验中,未观察到疏水性膜和亲水性膜之间的显著差异。这些数据还表明,给定的具体孔径对于较厚的膜细胞回收率降低。膜孔径为7、8或9微米提供了最佳效率,其中细胞可能直接流过10微米尺寸的膜。该实验证明RNP向HSPC的最佳递送是具有8微米孔径和7微米厚的膜,导致编辑和细胞回收的最佳平衡。
因此,在以上实验中,最佳参数包括50μL中的5百万个细胞和200μg的Cas9,并且在5PSI施加的压力下穿过具有8微米孔径的7微米厚的膜。
图19A描绘了通过TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后通过流式细胞术的HSC表面标记。还显示了通过流式细胞术染色比较CD34和CD90百分比。图19B描绘了在TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC细胞计数。还描述了通过Vi-Cell与流式细胞术染色的总细胞计数、CD34+、和CD34+/CD90+细胞计数的比较。图19C描绘了通过TRIAMF或氖电穿孔模拟处理后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后HSC倍数扩增。数据表明,电穿孔显著影响细胞的扩增能力,而TRIAMF处理使细胞正常扩增。
这些数据证明使用TRIAMF系统成功将Cas9RNP复合物递送到人CD34+ HSPC中,从而导致有效的基因编辑。然后,这可以进一步应用于针对各种遗传疾病的基因编辑疗法,包括例如镰状细胞性贫血,地中海贫血等。
实例2:通过HBG敲低经由递送Cas9/RNP上调HbF
镰状细胞病是一种使人衰弱的多器官系统性疾病,全球每年有超过300,000例新生儿,其中超过70%诞生在非洲撒哈拉沙漠以南地区。镰状细胞病的特征是第一分子疾病,其中患者具有从腺嘌呤到胸腺嘧啶的单核苷酸突变,该突变导致谷氨酸的氨基酸变为缬氨酸。突变的变化导致镰状成人β血红蛋白(HBB)在缺氧条件下聚合,导致红细胞(RBC)的镰状畸形。镰状RBC具有变形性质,降低其穿过血管的能力,导致中风、肾病、急性胸部综合征、感染、疼痛危象和贫血。目前的护理标准是给予羟基脲,但目前有14%-40%的患者对治疗没有反应,或需要终身治疗。羟基脲可能具有严重的副作用,包括免疫系统受到抑制。由于羟基脲的免疫抑制作用,这种治疗可以导致在医疗和卫生条件有限的国家由感染引起的高死亡率。目前针对镰状细胞病的唯一治疗是通过同种异体骨髓移植(BMT)。BMT仅限于发展中国家,因为筛选匹配捐赠者的资源和能力仅为20%左右。
结果:
使用与实例1结合的以上所讨论的类似方法和系统建立。特别地,制造容纳50微升样品体积的单个膜支架以及可用于使样品平行穿过24个膜的24孔歧管。
使用24孔歧管,该装置针对核糖核蛋白复合物(RNP)的靶向递送进行了优化,其中单一指导RNA(sgRNA)与Cas9蛋白复合成衍生自骨髓的人CD34+造血干细胞,将该干细胞扩增6至7天。针对优化,用sgRNA 129(靶向序列:GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG)靶向β-2-微球蛋白作为靶,该靶可以通过流式细胞术染色和下一代测序(NGS)进行测定。然后通过流式细胞术和下一代测序用抗体细胞染色测量B2M敲低,并且经由Vi-Cell通过在递送后48小时经收集的细胞与未经处理的样品的比率来计算细胞回收率。
将本教导(本文中还被简称为TRIAMF)用于递送由靶向HBG基因座的指导组成的RNP,以概括在许多患者中发现的遗传性持续性胎儿血红蛋白形式的基因型。使用先前报道的RNA靶向珠蛋白基因座序列(Traxler等人,Nat.Med.[自然医学],22(987-990);2016;doi:10.1038/nm.4170,通过引用将该文献以其全文并入本文中)连同优化的方案和本发明的装置,将离体扩增3天的HSC用RNP和靶向HBG的gRNA转染,并然后使用两步法将等分试样直接分化成红细胞,该方法包括首先诱导并将红细胞祖细胞扩增10天,并然后将红细胞祖细胞熟化至红细胞持续11天。在2天后收集剩余的细胞用于NGS和qPCR以确定插入/缺失频率和模式。通过下一代测序(NGS)和定量PCR(qPCR)的组合,靶位点的编辑效率被确定为63%总编辑的总平均值。
图20描绘了在WT、模拟处理、HBG编辑、和UNC0638(Blood.[血液]2015年7月30日:126(5):665-72)阳性对照处理的细胞的红细胞分化方案在D7和D14,HbF细胞的百分比。通过CD235a、CD71和HbF的固定和染色分析细胞。在第7和14天收集细胞并用CD235a,CD71染色,并且用流式细胞术分析胎儿血红蛋白。如图20所示,比较未经处理的细胞、模拟处理细胞(即,未被暴露于试剂通过膜的细胞,如Cas9/RNP)、编辑的细胞、和具有UNC0638的阳性对照中的HbF水平,分别有21%、23%、60%、和92%的细胞表达HbF。
图21A描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后通过流式细胞术的HSC表面标记。还显示了通过流式细胞术染色比较CD34和CD90百分比。图21B描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC细胞计数。还显示了通过Vi-Cell与流式细胞术染色的总细胞计数、CD34+、和CD34+/CD90+细胞计数的比较。图21C描绘了通过TRIAMF,回收WT细胞、模拟TRIAMF处理的细胞、和HBG编辑的细胞后2天,在50k/mL接种细胞扩增7天后的HSC倍数扩增。
使经转染的细胞静置2天后,对细胞进行计数,并将50k细胞扩增7天,以根据本教导确定转染后细胞的扩增能力。7天后,CD34+和CD34+/CD90+群似乎分别在70%和20%保持相同。如图21A-21C所示,观察来自接种的细胞计数和倍数扩增显示通过本教导的转染方法处理的HSC与未经处理的细胞相当,其中无显著变化。但对于用HBG靶向RNP处理的细胞,细胞扩增显著减少,可能是由于双链断裂导致的DNA损伤引起的毒性。
图22描绘了集落形成测定法的结果,以确定经TRIAMF处理的HSC致力于不同谱系的能力。显示了在甲醇培养物(methocult)上生长14天后不同的造血谱系的集落计数(对平板成像并用StemVision分析)。还在转染后2天对HSC进行集落形成测定以证实TRIAMF系统不改变细胞多能性和分化的能力。未经处理的HSC、通过TRIAMF进行模拟处理的HSC、和用TRIAMF编辑的HBG分别产生总共77、73和46个平均总集落(如图22所示)。这些集落还产生类似的红细胞(BFU-E),粒细胞和巨噬细胞(GM),巨噬细胞(M)、和粒细胞、红细胞、单核细胞、和巨核细胞(GEMM)多细胞集落的模式。具有通过TRIAMF递送的靶向HBG的sgRNA的RNP的细胞表明形成的集落大量下降,这可能是来自由Cas9介导的双链断裂的DNA损伤的毒性的结果。
图23显示了表明经TRIAMF编辑的HSPC在NSG小鼠中显示长期重建的数据。将经700k TRIAMF处理的细胞尾静脉注射到每只小鼠中(WT:N=4、模拟:N=5、HBG:N=6)。每4周收集外周血并染色抗人和抗小鼠CD45和人CD45。为充分证明经修饰的HSC是功能性的,将野生型(WT)、模拟TRIAMF和通过TRIAMF细胞编辑的HBG移植到亚致死辐照的NOD/SCIDγ(NSG)小鼠中。移植到小鼠中的所有细胞在16周在外周血中显示出人的移植,其中在WT、模拟TRIAMF、和通过TRIAMF编辑的HBG中分别显示平均为1.2%、2.5%、和2.1%hCD45+(图23中显示)。
为了探索TRIAMF对HSC的影响,比较了使用电穿孔和TRIAMF系统的模拟转染(即,在没有任何运载物如Cas9/RNP的情况下)。使用由赛默飞世尔公司(Thermofisher)销售的氖电穿孔系统和上述TRIAMF系统,使细胞通过任一系统而不使用任何试剂,并比较两种系统的细胞扩增7天的能力。尽管由两种系统处理的细胞表现出相似的65%CD34阳性细胞和约17%CD34/CD90双阳性细胞的群体模式,但经TRIAMF处理的细胞的细胞扩增数和倍数扩增保持在33万个总细胞、21万个CD34+和6万个CD34+/CD90+细胞不变。但经氖模拟处理的细胞下降至24万个总细胞、16万个CD34+、和4万个CD34+/CD90+细胞。7天后,WT细胞和经TRIAMF模拟处理的细胞的倍数扩增为6.5倍,而模拟电穿孔细胞的倍数扩增仅为5倍(如图19A-19C所示)。
方法:
材料:根据本教导定制不锈钢装置(单孔和24孔歧管)和不锈钢盘膜支撑件。所有其他的部件购自麦克马斯特-卡尔公司(McMaster Car)。跟踪蚀刻的聚碳酸酯PVP涂覆的膜购自Sterlitech(产品编号PCT8013100(8μm,薄)。内部生产Cas9蛋白质并配制于20mMHEPES、150mM KCl、1%蔗糖、1mM TCEP(在pH 7.5)或20mM TRIS-HCl(在pH 8.0)、200mMKCl、10mM MgCl2)中,同时合成sgRNA分子并购自AxoLabs,并且包括与HBG的序列(CUUGUCAAGGCUAUUGGUCA)互补的靶向结构域。冷冻的骨髓CD34+HSPC购自龙沙公司(Lonza)或澳赛尔斯公司(AllCells)。StemSpan SFEM II培养基(09655),CC100(02690)均购自干细胞技术公司。FITC缀合的B2M抗体(克隆2M2)和人TruStain FcX购自Biolegend公司。
TRIAMF系统建立
放置硅O形圈、随后放置不锈钢网、接着是聚碳酸酯膜(光面朝上)、然后是Teflon垫圈、将顶部连接并拧紧(24孔歧管通过螺钉,单个支架通过扳手)。然后将3mL注射器连接到针上。
在转染之前,通过运行2mL无菌DI水,然后使用1mL 70%乙醇,并然后在5psi下再用另外的2mL无菌DI水校准歧管。
人造血干细胞和祖细胞培养
冷冻骨髓衍生的CD34+HSPC购自龙沙公司(Lonza)或澳赛尔斯公司(AllCells),并根据制造商的说明书解冻。在补充有CC110(干细胞技术公司(StemCell Technologies))、0.75uM StemRegenin 1(干细胞技术公司)、50nM UM171(干细胞技术公司)、50ng/mL人重组IL-6(派普泰克公司(Peprotech))和PenStrep的SFEM II中培养细胞。在实验使用细胞之前将细胞培养/扩增3至5天。
通过TRIAMF递送RNP
将人造血干细胞和祖细胞(5百万个细胞)旋转沉降并重悬浮于20μL的SFEMII培养基中。将200μg的Cas9与40μg靶向HBG的sgRNA混合,并允许通过在室温下孵育5分钟使其复合。将RNP混合物与细胞混合,并允许在室温(RT)下孵育2分钟,其中最终体积为50μL。然后将该混合物用歧管转移到注射器连接器的底部。然后通过5psi的压力施力使该混合物通过注射器和膜。
允许流通物静置约2至5分钟,然后用1mL完全培养基洗涤膜。静置后,然后将细胞用新鲜培养基补充。在下游分析之前,使细胞恢复并离体扩增72小时(hr)。
用于下一代测序的细胞裂解制品
通过分析插入/缺失形成,经由下一代测序确定编辑效率。将大约100k细胞旋转沉降,并且将细胞裂解物通过约40μL裂解缓冲液用蛋白酶K进行提取。然后将2μL细胞裂解提取物用于通过引物(HBG1正向:cgctgaaactgtggctttatagaaatt;HBG1反向:ggcgtctggactaggagcttattg;HBG2正向:gcactgaaactgttgctttataggat;HBG2反向:ggcgtctggactaggagcttattg和Platinum Taq聚合酶(Clontech公司)扩增靶序列,并然后递交用于下一代测序。
qPCR检测大的HbF缺失
为检测大的缺失,设计引物和探针组以检测HBG1启动子特异性序列的扩增。HBG正向:ACGGATAAGTAGATATTGAGGTAAGC,HBG反向:GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG,和TaqMan探针(FAM):ACTGCGCTGAAACTGTGGCTTTATAG。使用Universal TaqMan Mix(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))对来自CD34+细胞的基因组DNA样品进行TaqMan qPCR。对于每个gDNA样品的拷贝数参考,通过减去HbG的平均CT值减去RPPH1的平均CT(赛默飞世尔科技公司)计算平均ΔCT值,并且通过减去编辑的样品的ΔCT值减去平均模拟ΔCT计算ΔΔCt值。通过取(2^-ΔΔCT)来计算倍数。
细胞回收
通过在Beckman Coulter Vi-Cell中转染72小时后运行500μL细胞来测定细胞回收率从而对活细胞计数。通过与未经处理的细胞样品大小来确定细胞回收率,其中通过以下等式将相同数量的细胞接种在相同体积中:
红细胞分化和HbF检测
在干细胞技术公司(StemCell Technologies)的两阶段方法后进行红细胞分化。简言之,在通过TRIAMF直接递送RNP后,在补充有红细胞扩增补充剂(02692)和Pen Strep(青霉素-链霉素)的SFEM II中使10k细胞/mL培养10天。10天后,用PBS洗涤细胞一次,并然后在补充有3%人AB血清,3U/mL重组人EPO和Pen Strep的SFEM II中培养。将0.5μM化合物UNC0638用作阳性对照以诱导高水平的HbF。将细胞再培养11天。4天和11天后,收集细胞,固定,透化,并用APC缀合的抗CD71(BioLegend公司)、FITC缀合的抗-GlyA(CD235a)(BioLegend公司)、和PE缀合的抗-HbF(英杰公司(Invitrogen),HBF-1克隆)染色。
CFU测定
根据制造商的说明书,用Methocult Optimum(干细胞技术公司)进行集落形成测定。简言之,在通过TRIAMF递送RNP后2天,将细胞计数,稀释,并以300个细胞/6个孔铺板。14天后,对集落计数并用StemVision系统(干细胞技术公司)自动评分。
体内移植
解冻后将细胞回收2天,然后由TRIAMF递送含有HBG指导的RNP。恢复1天后,用PBS洗涤细胞一次,并然后计数。准备了3组:野生型组、模拟组和编辑组。使用尾部IV注射,将来自每组的700k细胞注射到每只6-8周龄的NSG小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory))中。在第16周、第20周和第24周,通过尾部剪切或眼眶后出血收集外周血样品,用ACK缓冲液裂解RBC,并然后用抗人和小鼠CD45抗体染色以定量人细胞移植和贡献。
在移植后第24周,使小鼠安乐死,收集小鼠骨(2x股骨、2x胫骨、2x髂嵴和脊柱),并使用研钵和研杵压碎。然后用ACK缓冲液裂解RBC。针对谱系标记物,将一部分细胞染色为人CD45、小鼠CD45、CD3、CD19、CD33和CD71。针对造血干细胞标记物,另一部分细胞染色为人CD45、小鼠CD45、CD34和CD90。还对细胞进行FACS分选以分离人CD34细胞,收集用于NGS的人CD34细胞用于编辑和插入/缺失分析以及用于检测HbF上调的红细胞分化。
实例3:将核酸和肽物理递送至人CD34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)
由于受限的胞吞作用,HSPC需要物理直接的递送方法(如电穿孔)。但电穿孔对细胞非常苛刻,导致高细胞毒性和减少增殖。
本教导的方法和系统(在本文中还被称为由膜过滤辅助的跨膜内化(TRIAMF))可用于将不同的核苷酸和肽有效递送到细胞中,同时允许可扩展性和模块化以合并到其他细胞处理系统中。这允许将核酸或肽引入HSC用于治疗应用。
方法:
采用例如在图4B、图5A中所描述的装置。放置硅O形圈、随后放置不锈钢网、接着是聚碳酸酯膜(光面朝上)、然后是Teflon垫圈、然后将顶部连接并拧紧(24孔歧管通过螺钉,单个支架通过扳手)。然后将3mL注射器连接到针上。
在转染之前,通过运行2mL无菌DI水,然后使用1mL 70%乙醇,并然后在5psi下再用另外的2mL无菌DI水校准歧管。
将人造血干细胞和祖细胞(4百万个细胞)旋转沉降并重悬浮于20μL的SFEMII培养基中。将mRNA(60ug)、微环DNA(5、10、20μg)、或用CY5(30ug)标签化的肽与细胞混合,并允许在室温下孵育2分钟,其中终体积为50μL。然后将该混合物用歧管转移到注射器连接器的底部。然后通过5psi的压力施力使该混合物通过注射器和膜。
允许流通物静置约2至5分钟,然后用1mL完全培养基洗涤膜。静置后,然后将细胞用新鲜HSC培养基以1百万个细胞/mL补充。在下游分析之前,使细胞恢复并离体扩增。使用流式细胞术,在不同的时间点分析递送效力以检测GFP或CY5。
通过在Beckman Coulter Vi-Cell中转染24或48小时后运行500μL细胞来测定细胞回收率从而对活细胞计数。通过与未经处理的细胞样品大小来确定细胞回收率,其中通过以下等式将相同数量的细胞接种在相同体积中:细胞回收%=((样品中的活细胞数))/(平均(来自未经处理的活细胞数))。
材料:
定制单孔和24孔歧管和不锈钢盘膜支撑件。所有其他的部件购自麦克马斯特-卡尔公司(McMaster Car)。跟踪蚀刻的聚碳酸酯PVP涂覆的膜购自Sterlitech(产品编号PCT8013100(8um,薄))。冷冻骨髓CD34+HSPC购自龙沙公司(Lonza)或澳赛尔斯公司(AllCells)。内部生产mRNA和Cy-5肽(MW:2637),而编码GFP(MN601MC)的微环DNA购自系统生物科学公司(System Biosciences)。
结果:mRNA递送
图24描绘了根据本发明的实施例,在递送60μg的mRNA后在不同的时间点处HSC中GFP表达的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收。证明了使用TRIAMF将编码GFP的mRNA递送到HSC中。使用相同的8μm孔径的膜,将60μg的mRNA递送至4百万个细胞中。转染后6小时,对细胞进行FACS(图24)。用mRNA 1观察到A41%效力,用mRNA 2观察到25%的效力,其中转染后24小时细胞回收率为约10%-15%,而模拟处理的细胞具有60%的细胞回收率。尽管模拟处理细胞的细胞回收率为60%,但mRNA处理的细胞的细胞回收率显著降低,这可能是由于HSC的外源核酸反应。
微环递送
图25描绘了根据本发明的实施例,在递送按5μg、10μg、和20μg DNA的微环DNA后,在不同的时间点处HSC中GFP表达的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收。证明了使用TRIAMF将用GFP编码的递送微环DNA递送至HSC中。使用8μm孔径膜,将5、10、或20μg的质粒DNA递送至4百万个细胞中。48小时后,通过流式细胞术分析细胞(图25)。对于5、10和20μg,GFP表达分别是5.7%、8.4%、和1%,其中细胞回收百分比分别是75%、57%、和12%。尽管模拟处理细胞的细胞回收率为60%,但经微环处理的细胞的细胞回收率显著降低,这可能是由于HSC的外源核酸反应。
肽递送
图26描绘了在递送30μg的CY5标签化的肽后,在不同的时间点处HSC中Cy5信号的流式细胞术分析的结果,连同24小时后的百分比细胞回收。使用TRIAMF系统和8微米孔径的膜,将30μg Cy-5标签化的肽递送至4百万个HSC。在10分钟和几次洗涤后(图26),观察到78%的细胞内化肽,但在24小时后,观察到稳定的下降,因为肽可能被消化。在24小时时,细胞的细胞回收%是在68%,这与模拟细胞相当,该模拟细胞的细胞回收率为60%。
本领域普通技术人员将理解,在不脱离本发明的范围的情况下,可以对上述实施例进行各种改变。本文所引用的所有出版物均通过引用以其全文并入本文中。
Claims (88)
1.一种用于细胞处理的方法,所述方法包括:
使多个细胞穿过包含多个孔的膜的一个或多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以引起这些细胞的变化,从而允许所述试剂进入这些细胞中的至少一个;
其中所述孔中的每一个从输入开口延伸至输出开口,并且具有在约7微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述最大截面尺寸在约8微米至约9微米的范围内,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约7微米,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约8微米,并且其中任选地所述最大截面尺寸为约9微米。
3.如权利要求1或2中任一项所述的方法,其中所述细胞是循环细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述循环细胞选自由以下组成的组:CD34+细胞、祖细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、以及造血干细胞和祖细胞(HSPC)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述循环细胞选自由以下组成的组:免疫效应细胞、CD3+细胞、T细胞和NK细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述循环细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述循环细胞能够被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述孔具有在约7微米至约10微米的范围内的长度。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述孔具有在约18微米至约21微米的范围内的长度。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述膜具有在约7mm2至约80mm2的范围内的活性表面积。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述膜具有在约1x105至约2x106个孔/cm2的范围内的表面孔密度。
12.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中将这些细胞和所述试剂置于液体载体中,并且通过向所述液体载体施加压力来推动所述液体载体穿过所述孔。
13.如权利要求12所述的方法,其中所述液体载体中所述细胞的浓度在约10,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约50,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约100,000至约200,000个细胞/微升的范围内,并且其中任选地所述细胞的浓度在约150,000至约200,000个细胞/微升的范围内。
14.如权利要求12或13中任一项所述的方法,其中向所述液体载体施加的所述压力使得所述细胞以至少约10mL至约20mL(毫升)/分钟的速率穿过所述孔。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法,其中向所述液体载体施加的所述压力在约5psi至约20psi的范围内。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法,其中所述液体载体包含水、基础细胞培养基、无血清培养基、造血干细胞布鲁(HSC brew)培养基、一种或多种细胞因子、一种或多种生长因子、一种或多种活力增强剂、聚乙二醇(PEG)、清洁剂、膜稳定剂中的任一种及其组合,并且任选地其中所述一种或多种活力增强剂是UM171、SR1、((S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙氨基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇中的任一种,及其组合。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述一种或多种细胞因子选自由以下组成的组:血小板生成素(TPO)、Flt3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、白细胞介素-6(IL-6),及其组合。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法,其中所述变化是瞬时变化。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述变化包括细胞膜渗透性的变化。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述膜的孔至少部分地被聚乙烯吡咯烷酮包被。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述试剂包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料、不可透过膜的化合物中的任一种及其组合。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述试剂是基因编辑系统。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述基因编辑系统是CRISPR基因编辑系统、ZFN基因编辑系统、TALEN基因编辑系统、大范围核酸酶基因编辑系统或Cre重组酶基因编辑系统。
24.如权利要求22所述的方法,其中所述基因编辑系统是CRISPR基因编辑系统。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述CRISPR基因编辑系统包含一种或多种RNP。
26.如权利要求25所述的方法,其中所述RNP是Cas9-gRNA复合物。
27.如权利要求22-26中任一项所述的方法,其中所述试剂包含模板核酸。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是通常不可透过细胞膜的化合物。
29.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是带电的。
30.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述试剂是电中性的。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法,其中所述试剂具有高于约2kDa,任选地在约2kDa至约100kDa的范围内的分子量。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述膜包含聚合材料。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述聚合材料选自由以下组成的组:聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯(PP)、聚酰亚胺(PI)、环烯烃共聚物(COC)、环烯聚合物(COP)、聚酯、和聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
34.如权利要求32或33中任一项所述的方法,其中所述孔是通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在所述聚合材料中形成的。
35.如权利要求1-31中任一项所述的方法,其中所述膜包含半导体、陶瓷、或金属中的任一种。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔沿着所述孔中每一个的长度具有基本上一致的截面面积。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔基本上是圆柱形的。
38.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔具有规则的截面形状。
39.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中所述孔具有不规则的截面形状。
40.如权利要求38所述的方法,其中所述规则的截面形状是圆形、椭圆形和多边形形状中的任一种。
41.如权利要求40所述的方法,其中所述多边形形状选自由以下组成的组:正方形、矩形、六边形、和八边形形状。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法,其中所述孔具有疏水性内表面。
43.如权利要求1-42中任一项所述的方法,其中所述孔具有亲水性内表面。
44.如权利要求1-43中任一项所述的方法,所述方法进一步包括在使细胞穿过膜的步骤之前,从异质细胞的集合中选择所述细胞。
45.如权利要求44所述的方法,其中所述经选择的细胞选自由以下组成的组:CD34+细胞、造血干细胞、造血祖细胞、造血干细胞和祖细胞(HSPC)、免疫效应细胞、CD3+细胞、T细胞和NK细胞。
46.如权利要求44所述的方法,其中所述经选择的细胞被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR),并且任选地其中所述经选择的细胞是T细胞或NK细胞。
47.如权利要求44所述的方法,其中所述经选择的细胞能够被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR),并且任选地其中所述经选择的细胞是T细胞或NK细胞。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少约40%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
49.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少约50%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
50.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少约60%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
51.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少约70%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
52.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少约80%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
53.如权利要求1-47中任一项所述的方法,其中至少90%的所述细胞经由通过所述一个或多个孔的通道摄取所述试剂。
54.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述细胞用高于约50%的细胞活力摄取所述试剂。
55.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述细胞用高于约60%的细胞活力摄取所述试剂。
56.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述细胞用高于约70%的细胞活力摄取所述试剂。
57.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述细胞用高于约80%的细胞活力摄取所述试剂。
58.如权利要求1-53中任一项所述的方法,其中所述细胞用高于约90%的细胞活力摄取所述试剂。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法,其中所述膜具有基本上等于所述孔的最大长度的最大厚度。
60.如权利要求1-59中任一项所述的方法,其中所述孔具有基本上一致的长度,并且所述膜具有基本上等于所述长度的厚度。
61.如权利要求1-60中任一项所述的方法,其中所述试剂包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、质粒、核糖核蛋白复合物(RNP)、蛋白质、肽、脂质、多糖、寡糖、反义寡核苷酸、适配体、纳米颗粒、染料、不可透过膜的化合物、不可透过膜的小分子中的任一种,及其组合。
62.如权利要求12-61中任一项所述的方法,其中所述试剂具有最高达50克/升的浓度。
63.如权利要求8-62中任一项所述的方法,所述方法进一步包括将含有所述细胞和所述试剂的所述液体载体经由输入室引入所述孔中,所述输入室具有小于经由所述输入室引入所述孔的所述液体载体的体积的约20%的体积。
64.如权利要求8-63中任一项所述的方法,所述方法进一步包括将含有所述细胞和所述试剂的所述液体载体经由输入室引入所述孔中,所述输入室具有等于或小于10微升的体积。
65.如权利要求64所述的方法,其中所述输入室的所述体积在约0.5至约10微升的范围内。
66.一种转染细胞的方法,所述方法包括:
向含有细胞浓度在约10,000至约200,000个细胞/微升范围内的多个细胞的液体载体施加压力,以使得所述液体载体和所述液体载体中包含的细胞穿过一个或多个多孔膜的多个孔,同时将这些细胞暴露于试剂以按高于约40亿个细胞/分钟的速率、至少约60%的细胞活力用所述试剂转染所述细胞中的至少一些;
其中所述孔的每一个具有在约7微米至约9微米的范围内的最大截面尺寸。
67.如权利要求66所述的方法,其中所述最大截面尺寸在约8微米至约9微米的范围内。
68.如权利要求66所述的方法,其中所述最大截面尺寸是约7微米。
69.如权利要求66所述的方法,其中所述最大截面尺寸是约8微米。
70.如权利要求66所述的方法,其中所述最大截面尺寸是约9微米。
71.如权利要求66-70中任一项所述的方法,其中所述细胞活力是至少约60%,或至少约70%、或至少80%、或至少90%。
72.如权利要求66-71中任一项所述的方法,其中所述孔具有在约7微米至约10微米的范围内的长度。
73.一种用于平行细胞处理的系统,所述系统包括:
入口支撑元件,所述入口支撑元件具有用于处理含有流体载体、多个细胞和由这些细胞内化的至少一种试剂的多个样品的多个开口;
出口支撑元件,所述出口支撑元件具有多个开口;和
多个多孔膜,所述多孔膜被设置于所述入口支撑元件和所述出口支撑元件之间并且各自具有最大截面尺寸小于约15微米的多个孔;
其中所述多孔膜中的每一个多孔膜相对于所述入口支撑元件中的开口中的一个开口定位以接收所述样品中的一个样品,并且相对于所述出口支撑元件中的开口中的一个开口定位,以允许所述样品的至少一部分穿其而过到达所述出口开口。
74.如权利要求73所述的系统,其中所述最大截面尺寸在约7微米至约9微米的范围内。
75.如权利要求74所述的系统,其中所述最大截面尺寸在约8微米至约9微米的范围内。
76.如权利要求74所述的系统,其中所述最大截面尺寸是约7微米。
77.如权利要求74所述的系统,其中所述最大截面尺寸是约8微米。
78.如权利要求74所述的系统,其中所述最大截面尺寸是约9微米。
79.如权利要求73-78中任一项所述的系统,所述系统进一步包括多个网,所述多个网各自被设置成邻近所述多孔膜的中一个多孔膜以向所述多孔膜提供机械支持。
80.如权利要求79所述的系统,其中所述网由不锈钢形成。
81.如权利要求73-80中任一项所述的系统,其中所述多孔膜包含聚合材料。
82.如权利要求81所述的系统,其中所述孔是通过离子径迹蚀刻、激光钻孔、等离子体刻蚀、或光刻法中的任一种在所述聚合材料中形成的。
83.如权利要求73-82中任一项所述的系统,所述系统进一步包括至少一个压力施加器,所述压力施加器与所述入口支撑元件的所述开口中的至少一个开口相联以用于向所述样品施加压力。
84.如权利要求73-83中任一项所述的系统,所述系统进一步包括至少一个入口室,所述至少一个入口室设置于所述多个多孔膜上游,并且具有入口端口和出口端口,所述入口端口用于接收所述流体载体,所述流体载体通过所述出口端口被引入到所述多孔膜上。
85.如权利要求84所述的系统,其中所述输入室具有小于引入到所述多孔膜上的所述流体载体的体积的约20%的体积。
86.如权利要求84所述的系统,其中所述输入室具有等于或小于约10微升的体积。
87.如权利要求84所述的系统,其中所述输入室具有在约0.5至约10微升的范围内的体积。
88.如权利要求84-87中任一项所述的系统,其中所述至少一个入口室包含多个入口室,这些入口室中的每一个入口室被设置于所述多个多孔膜中的一个多孔膜的上游。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662401053P | 2016-09-28 | 2016-09-28 | |
US62/401,053 | 2016-09-28 | ||
PCT/US2017/054110 WO2018064387A1 (en) | 2016-09-28 | 2017-09-28 | Porous membrane-based macromolecule delivery system |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109844126A true CN109844126A (zh) | 2019-06-04 |
Family
ID=60183103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201780060638.6A Pending CN109844126A (zh) | 2016-09-28 | 2017-09-28 | 基于多孔膜的大分子递送系统 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190203230A1 (zh) |
EP (1) | EP3519577A1 (zh) |
JP (1) | JP2019532672A (zh) |
CN (1) | CN109844126A (zh) |
WO (1) | WO2018064387A1 (zh) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9017991B2 (en) | 2009-03-13 | 2015-04-28 | Tufts University | Methods tip assemblies and kits for introducing material into cells |
JP7030522B2 (ja) | 2015-05-11 | 2022-03-07 | エディタス・メディシン、インコーポレイテッド | 幹細胞における遺伝子編集のための最適化crispr/cas9システムおよび方法 |
WO2016201047A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation |
TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
WO2019014564A1 (en) | 2017-07-14 | 2019-01-17 | Editas Medicine, Inc. | SYSTEMS AND METHODS OF TARGETED INTEGRATION AND GENOME EDITING AND DETECTION THEREOF WITH INTEGRATED PRIMING SITES |
CN110272810A (zh) * | 2019-07-01 | 2019-09-24 | 广州世赛生物科技有限公司 | 外源物质递送至真核细胞内的装置和方法及其应用 |
WO2022240846A1 (en) * | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof |
WO2024072512A1 (en) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Xellar, Inc. | Methods and systems for functionalizing surfaces for microfluidic devices or other applications |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015148842A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | The Regents Of The University Of California | Efficient delivery of large cargos into cells on a porous substrate |
WO2016070136A1 (en) * | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of biomolecules to immune cells |
WO2016115179A1 (en) * | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene editing through microfluidic delivery |
CN108138118A (zh) * | 2015-09-04 | 2018-06-08 | Sqz生物技术公司 | 由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送 |
Family Cites Families (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7687267B2 (en) * | 2006-09-30 | 2010-03-30 | Rational Biotechnology Inc. | High-throughput cell transfection device and methods of using thereof |
US20110213288A1 (en) * | 2007-04-23 | 2011-09-01 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Device And Method For Transfecting Cells For Therapeutic Uses |
PE20100362A1 (es) | 2008-10-30 | 2010-05-27 | Irm Llc | Derivados de purina que expanden las celulas madre hematopoyeticas |
US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
EP2206723A1 (en) | 2009-01-12 | 2010-07-14 | Bonas, Ulla | Modular DNA-binding domains |
WO2011050009A1 (en) * | 2009-10-19 | 2011-04-28 | Rational Biotechnology Inc. | Method, device and apparatus for inducing self-adjusting cell electroporation |
US8956828B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases |
GB2481983A (en) | 2010-07-12 | 2012-01-18 | Hart Fenton & Co Ltd | A ship including a gas tank room |
AU2011281062B2 (en) | 2010-07-21 | 2015-01-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for modification of a HLA locus |
WO2013110198A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-08-01 | Université de Montréal | Pyrimido[4,5-b]indole derivatives and use thereof in the expansion of hematopoietic stem cells |
LT3401400T (lt) | 2012-05-25 | 2019-06-10 | The Regents Of The University Of California | Būdai ir kompozicijos, skirtos rnr molekulės nukreipiamai tikslinės dnr modifikacijai ir rnr molekulės nukreipiamam transkripcijos moduliavimui |
DK2898075T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-27 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF IMPROVED SYSTEMS, PROCEDURES AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION |
EP4234696A3 (en) | 2012-12-12 | 2023-09-06 | The Broad Institute Inc. | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
UY35340A (es) | 2013-02-20 | 2014-09-30 | Novartis Ag | Marcaje efectivo de leucemia humana usando células diseñadas con un receptor quimérico de antígeno anti-cd123 |
CN111139256A (zh) | 2013-02-20 | 2020-05-12 | 诺华股份有限公司 | 使用人源化抗EGFRvIII嵌合抗原受体治疗癌症 |
UY35468A (es) | 2013-03-16 | 2014-10-31 | Novartis Ag | Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19 |
JP6670743B2 (ja) | 2013-05-29 | 2020-03-25 | セレクティスCellectis | Ii型crisprシステムにおける新規のコンパクトなcas9足場 |
US20160237455A1 (en) | 2013-09-27 | 2016-08-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr-related methods and compositions |
WO2015090230A1 (en) | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Novartis Ag | Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof |
US20170015994A1 (en) * | 2014-02-24 | 2017-01-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for in vivo genome editing |
EP3593812A3 (en) | 2014-03-15 | 2020-05-27 | Novartis AG | Treatment of cancer using chimeric antigen receptor |
CA2951707A1 (en) * | 2014-06-10 | 2015-12-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for gene editing |
US9777061B2 (en) | 2014-07-21 | 2017-10-03 | Novartis Ag | Treatment of cancer using a CD33 chimeric antigen receptor |
US10174095B2 (en) | 2014-07-21 | 2019-01-08 | Novartis Ag | Nucleic acid encoding a humanized anti-BCMA chimeric antigen receptor |
TWI718992B (zh) | 2014-07-21 | 2021-02-21 | 瑞士商諾華公司 | 使用cll-1嵌合抗原受體治療癌症 |
FR3024778B1 (fr) * | 2014-08-05 | 2021-01-22 | Screencell | Procede pour le depistage de la drepanocytose et kit pour sa mise en oeuvre |
JP7084138B2 (ja) | 2014-08-19 | 2022-06-14 | ノバルティス アーゲー | 癌処置に使用するための抗cd123キメラ抗原受容体(car) |
WO2016094880A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs) |
US20190024065A1 (en) * | 2015-02-06 | 2019-01-24 | Cellectis | Primary hematopoietic cells genetically engineered by slow release of nucleic acids using nanoparticles |
RU2021121771A (ru) | 2015-04-08 | 2022-01-12 | Новартис Аг | Cd20 терапия, cd22 терапия и комбинированная терапия клетками, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (car) к cd19 |
US20180362975A1 (en) | 2015-12-04 | 2018-12-20 | Novartis Ag | Compositions and methods for immunooncology |
JP2019500043A (ja) | 2015-12-28 | 2019-01-10 | ノバルティス アーゲー | 異常ヘモグロビン症の治療用組成物および方法 |
-
2017
- 2017-09-28 JP JP2019538110A patent/JP2019532672A/ja active Pending
- 2017-09-28 WO PCT/US2017/054110 patent/WO2018064387A1/en unknown
- 2017-09-28 EP EP17790886.0A patent/EP3519577A1/en not_active Withdrawn
- 2017-09-28 US US16/331,967 patent/US20190203230A1/en not_active Abandoned
- 2017-09-28 CN CN201780060638.6A patent/CN109844126A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015148842A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | The Regents Of The University Of California | Efficient delivery of large cargos into cells on a porous substrate |
WO2016070136A1 (en) * | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery of biomolecules to immune cells |
WO2016115179A1 (en) * | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Gene editing through microfluidic delivery |
CN108138118A (zh) * | 2015-09-04 | 2018-06-08 | Sqz生物技术公司 | 由具孔表面介导的生物分子的细胞内递送 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
A R WILLIAMS等: "Filtroporation: A simple, reliable technique for transfection and macromolecular loading of cells in suspension", 《BIOTECHNOL BIOENG》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2018064387A1 (en) | 2018-04-05 |
US20190203230A1 (en) | 2019-07-04 |
EP3519577A1 (en) | 2019-08-07 |
JP2019532672A (ja) | 2019-11-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109844126A (zh) | 基于多孔膜的大分子递送系统 | |
Lee et al. | Synthetically modified guide RNA and donor DNA are a versatile platform for CRISPR-Cas9 engineering | |
AU2016206870B2 (en) | Gene editing through microfluidic delivery | |
CN107980059B (zh) | 用于修饰基因组dna的方法和组合物 | |
CN108779462A (zh) | 用于治疗血红蛋白病的组合物和方法 | |
CA3036926C (en) | Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same | |
JP2021010366A (ja) | ゲノムdnaを改変するための方法および組成物 | |
KR20240017098A (ko) | 혈색소병증의 치료를 위한 조성물 및 방법 | |
CN111712569A (zh) | 用于基因编辑的Cpf1-相关方法和组合物 | |
JP2019520844A (ja) | ゲノムdnaを改変するための方法および組成物 | |
JP2021500058A (ja) | 胎児ヘモグロビンの発現レベルを増加させる方法 | |
CN109312308A (zh) | 通过使用核酸酶来进行人神经干细胞的基因组编辑 | |
CN106544351A (zh) | CRISPR‑Cas9体外敲除耐药基因mcr‑1的方法及其专用细胞穿透肽 | |
CN108136047A (zh) | 提高原代细胞中基于核酸内切酶的基因编辑 | |
EP3754018A1 (en) | Method for producing low-antigenic cell | |
CN116322716A (zh) | Regnase-1和/或TGFBRII被破坏的基因工程化T细胞具有改善的功能性和持久性 | |
JP2017513477A5 (zh) | ||
JP2024001075A (ja) | 操作されたcas9ヌクレアーゼ | |
US20210139935A1 (en) | Methods of manufacturing car-t cells | |
AU2020297451A1 (en) | Compositions and methods for editing beta-globin for treatment of hemaglobinopathies | |
KR20210102309A (ko) | 유전적으로-변형된 세포를 제작하는 줄어든, 그리고 최소한의 조작 | |
TW202016297A (zh) | 抗藥性免疫細胞及使用其之方法 | |
CN111004781A (zh) | 长期扩增粒细胞-巨噬细胞祖细胞的方法及其应用 | |
CN114929873A (zh) | 使用靶向核酸酶调节微生物群的组成 | |
CN101368180A (zh) | 一类能将间充质干细胞分化为造血细胞的小rna分子及其作用靶点 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190604 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |