CN110272810A - 外源物质递送至真核细胞内的装置和方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置和方法及其应用,涉及生物技术领域。该外源物质递送至真核细胞内的装置含挤出模块,其中挤出模块中设置分布有规则孔道的微孔膜,并且孔道的孔径小于所述真核细胞直径;挤出模块还包括用于驱动真核细胞和外源物质同时通过孔道的压力单元。悬浮在溶液中的细胞可以在穿过孔道的过程中压缩变形,从而引起细胞膜和核膜穿孔,使得分散或溶解在细胞悬液中的外源性材料进入细胞质和细胞核。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种外源物质递送至真核细胞内的装置和方法及其应用。
背景技术
细胞质和细胞核内递送是细胞工程、细胞疗法研发和许多生物学功能研究的关键步骤。现有的常规细胞内递送技术包括电穿孔、病毒载体或非病毒载体等。然而,这些方法有许多不足。比如电穿孔常导致较高的细胞死亡率;病毒载体具有免疫原性,构建递送特定序列核酸的病毒载体耗时长,效率低;非病毒载体在悬浮细胞和原代细胞递送效率低,耗时较长,且不太适合递送除脱氧核糖核酸DNA和核糖核酸RNA外的其它生物大分子等(StewartM P,Sharei A,Ding X,et al.In vitro and ex vivo strategies for intracellulardelivery.Nature,2016,538(7624):183-192.)。此外,基于微流控的细胞内递送技术已出现,用于将各种外源性材料递送入各种细胞的细胞质(CN103987836B;Sharei,A.,et al.(2013).Cell Squeezing as a Robust,Microfluidic Intracellular DeliveryPlatform.Journal of Visualized Experiments:JoVE(81):50980.;CN201680051309.0A),但是其不能诱导核膜破裂并将水合半径大于细胞核膜核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)扩散上限(Peters,R.(1984).Nucleo-cytoplasmic fluxand intracellular mobility in single hepatocytes measured by fluorescencemicrophotolysis.The EMBO Journal 3(8):1831-1836.)的超大分子量大分子如质粒DNA递送入细胞核(Ding,X.,et al.(2017).High-throughput nuclear delivery and rapidexpression of DNA via mechanical and electrical cell-membranedisruption.Nature Biomedical Engineering 1:0039.doi:10.1038/s41551-017-0039;Haiqing Bai et al.(2017).Cytoplasmic transport and nuclear import of plasmidDNABioscience Reports,37(6):1-17),且处理通量较低。因此,一种改进的向真核细胞中递送外源物质的递送装置和方法是目前需要的。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种外源物质递送至真核细胞内的装置,该装置缓解了现有真核细胞内递送技术的不足,比如无法使细胞核膜破裂穿孔,为了递送质粒DNA进入细胞核需要联用微流控和电场,以及基于载体的细胞内递送方法仅适合递送特定分子如核酸等技术问题。
本发明的第二目的在于提供一种外源物质递送至真核细胞内的方法,该方法包括将真核细胞和外源物质的混合物经上述装置挤出。
本发明的第三目的在于提供一种上述高通量真核细胞内递送装置,或上述外源物质递送至真核细胞内的方法在调控细胞功能功能中的应用。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置,该装置包含挤出模块,所述挤出模块中设置分布有规则孔道的微孔膜,所述孔道的孔径小于所述真核细胞的直径;所述挤出模块还包括用于驱动真核细胞和外源物质同时通过孔道的压力单元。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了一种外源物质递送至真核细胞内的方法,该方法包括:将包含真核细胞和外源物质的混悬体系经上述装置挤出,以使外源物质递送至真核细胞内。
根据本发明的另一个方面,本发明还提供了上述高通量真核细胞内递送装置,或上述外源物质递送至真核细胞内的方法在调控细胞功能中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的外源物质递送至真核细胞内的装置设置有挤出模块,该挤出模块中设置分布有规则孔道的微孔膜,且孔道的孔径小于所述真核细胞直径;该挤出模块还包括用于驱动真核细胞和外源物质同时通过孔道的压力单元。
悬浮在溶液中的细胞可以在穿过孔道的过程中压缩变形,从而引起细胞膜和核膜穿孔,使得分散或溶解在细胞悬液中的外源性材料进入细胞质和细胞核。本发明提供的真核细胞内递送方法克服了现有细胞内递送技术的不足,比如基于微流控的细胞内递送技术无法使细胞核膜破裂穿孔;递送装置单次处理的细胞悬液体积较小,或单次处理细胞数量或通量偏低,或为了递送质粒DNA进入细胞核需要联用微流控和电场,以及基于载体的细胞内递送方法仅适合递送特定分子如核酸等技术问题。
本发明提供的外源物质递送至真核细胞内的装置不仅能将各种分子量的外源物质递送入细胞质,还能将水合半径大于细胞核膜孔复合体(nuclear pore complex,NPC)扩散上限的外源物质递送入细胞核,从而说明本发明通过同时诱导细胞膜和核膜破裂、穿孔,实现了细胞质和细胞核内递送。其次,本发明提供的装置能将水合半径更大的质粒DNA递送入细胞核,并表达相应编码蛋白质。第三,本发明能将各种类型的外源性材料递送入细胞质及细胞核,不受材料自身理化特性的影响,比如葡聚糖和质粒DNA。第四,本发明在递送质粒DNA进入细胞核并表达相应蛋白质时无需电场辅助。第五,本发明提供的装置适合较高通量的含有细胞的体系穿过微孔膜,单次处理含有细胞的悬液至少可达0.5mL,一次挤出的细胞总数量至少可达0.6×106个。
基于该装置,本发明还提供了外源物质递送至真核细胞内的方法,该方法包括将真核细胞和外源物质的混合物经上述装置挤出,因此具有上述装置的所有有益效果,在此不再赘述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的外源物质递送至真核细胞内的装置的原理示意图;
图2A为本发明实施例1-3使用的苯二甲酸乙二醇酯(PET)核孔膜;
图2B为本发明实施例1-3使用的PET核孔膜上的孔道;
图2C为本发明实施例1提供的外源物质递送至真核细胞内的装置;
图3为本发明实施例2提供的外源物质递送至真核细胞内的装置;
图4为本发明实施例3提供的外源物质递送至真核细胞内的装置;
图5A为本发明实施例4中70kDa葡聚糖递送至CT26细胞质和细胞核的共聚焦图片;
图5B为本发明实施例4中2MDa葡聚糖递送至CT26细胞质和细胞核的共聚焦图片;
图6A为本发明实施例4中70kDa葡聚糖递送至CT26细胞质和细胞核的递送效率的流式检测数据;
图6B为本发明实施例4中2MDa葡聚糖递送至CT26细胞质和细胞核的递送效率的流式检测数据;
图7A为本发明实施例5中70kDa葡聚糖递送至K562细胞质和细胞核的递送效率的流式检测数据;
图7B为本发明实施例5中2MDa葡聚糖递送至K562细胞质和细胞核的递送效率的流式检测数据;
图8为本发明实施例6中pCMV-GFP质粒递送到K562细胞核并表达GFP蛋白的共聚焦图片;
图9为本发明实施例6中pCMV-GFP质粒递送到K562细胞核并表达GFP蛋白的流式检测数据;
图10为本发明实施例7中pCMV-GFP质粒递送到CT26细胞核并表达GFP蛋白的流式检测数据;
图11为本发明实施例8提供的2MDa葡聚糖递送到K562细胞质和细胞核的共聚焦图片;
图12为本发明实施例9提供的2MDa葡聚糖递送到CT26细胞的流式检测数据。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置,该装置包含挤出模块,所述挤出模块中设置分布有规则孔道的微孔膜,所述孔道的孔径小于所述真核细胞的直径;所述挤出模块还包括用于驱动真核细胞和外源物质同时通过孔道的压力单元。
挤出模块在压力单元的驱动下使细胞在穿过孔道的过程中变形,从而引起细胞膜和细胞核膜穿孔及通透性增加,使得分散在细胞周围的外源物质进入细胞,以及细胞核中,原理如图1所示。规则孔道指的是微孔膜上的孔道的形状均一,为圆形或近圆形。由于本发明提供的外源物质递送至细胞内的装置适合较高通量的细胞穿过,因此由于每次穿过挤出膜的细胞数量大,如果微孔膜上的孔道不规则,其截面形状存在较大的差异,则细胞死亡率会较高。本发明中所述的“细胞”也指代“真核细胞”可以理解的是,所述装置还包括在细胞和外源物质通过微孔膜前的贮存空间,和挤出后用于接收挤出物的接收空间,本发明对贮存空间和接收空间的形状、体积和材质,以及贮存空间、微孔膜和接收空间的连接方式均不作限制,只要能使细胞和外源物质由贮存空间通过挤微孔膜向接受空间之间流通即可。可以理解的是,该装置可以独立使用,也可以和其他装置配合使用以组成一个系统。
在一些可选的实施方式中,所述微孔膜的材质包括金属或非金属。在一些优选的实施方式中,所述微孔膜的材质包括非金属,所述非金属包括但不限于聚合物、陶瓷或硅,其中优选聚合物材质的微孔膜,以聚合物为基材制备得到的微孔膜,孔道分布均匀,微孔膜更轻薄。所述聚合物包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚乙烯、聚醚砜或聚四氟乙烯;更优选包括聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚酰亚胺或聚碳酸酯。
在一些可选的实施方式中,制备微孔膜上的孔道的方法包括蚀刻或打孔,蚀刻优选径迹蚀刻或光蚀刻,光蚀刻优选激光蚀刻;打孔优选使用冲压打孔。在一些优选的实施方式中,采用径迹蚀刻制备得到微孔膜,效果更佳。
在一些优选的实施方式中,所述装置向细胞和外源物质施加正压力,施加正压力驱动细胞和外源物质穿过孔道的效率更佳。其中所述压力单元优选包括活塞单元或压缩气体单元,其中活塞单元提供的正压力较压缩气体更佳。活塞单元可以由人工手动驱动,也可以由驱动单元驱动。
在一些优选的实施方式中,所述活塞单元包括活塞管体和活塞推杆。其中活塞单元优选包括用于驱动活塞推杆的驱动单元,驱动单元可选择常规的能够提供动力的单元,例如使用电机驱动活塞运动,以向细胞和外源物质施与向微孔膜方向的正压力。
在一些优选的实施方式中,活塞管体的材质包括金属材料、合金材料或非金属材料;金属材料优选包括铝或铜;合金材料优选包括不锈钢或钛镁合金;非金属材料优选包括玻璃。
在一些优选的实施方式中,活塞推杆主要由天然高分子材料或合成高分子材料制备得到,天然高分子材料优选使用橡胶,合成高分子可选地使用聚酯类,也优选地使用聚四氟乙烯和/或聚乙烯;在一些可选的实施方式中选取聚对苯二甲酸乙二醇酯材料的活塞单元。在一些可选的实施方式中,选取聚乙烯或聚四氟乙烯共同构成的活塞单元;在一些可选的实施方式中,选取聚乙烯材料的活塞单元。合成高分子材料机械强度好,耐腐蚀且表面光滑,尤其是以聚酯、聚乙烯和聚四氟乙烯性能较佳。
在一些可选的实施方式中,所述装置还包括温控模块,温控模块用于给挤出模块提供恒定的温度,使细胞和外源物质能够在指定的温度条件下挤出。所述温控模块优选与挤出模块接触,使温度更直接的传递至挤出模块中以控制挤出模块的温度;例如在挤出模块中用于贮存细胞和外源物质的空间的外壁设置发热金属丝、陶瓷加热器、半导体制冷片或流体循环控温单元等。在一些优选地实施方式中,所述流体循环控温单元设置有和挤出模块接触的腔体,所述腔体用于流体循环控温单元中的流体流通。
本发明还提供了一种外源物质递送至真核细胞内的方法,该方法包括将真核细胞和外源物质的混悬体系经上述装置挤出。本发明所述的混悬体系,指的是分散有真核细胞和外源物质的体系,该体系的分散介质可以为常规的可维持真核细胞活性的介质,包括但不限于培养基、生理盐水以及PBS缓冲液等。本发明所述的递送,指的是使外源物质进入细胞中,即外源物质进入细胞质,或外源物质进入细胞质和细胞核中。
本发明提供的外源物质递送至真核细胞内的方法可以在室温下进行,本发明所述的室温指的是未经人为干预的,细胞和外源物质在挤出时,挤出模块的温度和环境温度相近的温度。
在一些可选的实施方式中,预设温度下外源物质递送至真核细胞内具有更高的递送效率、细胞回收率和存活率,因此所述外源物质递送至真核细胞内的方法在预设的温度下进行,所述预设的温度由所述外源物质递送至真核细胞内的装置的温控模块进行调控。
在一些优选地实施方式中,包含细胞和外源物质的混悬体系一次性经所述装置挤出;其中一次性经所述装置挤出指的是施与混合物持续的压力,使混合物不间断的穿过微孔膜。
在一些优选的实施方式中,一次性经所述装置挤出的混悬体系的体积至少为0.5mL。优选地,单次穿过微孔膜的混合物中的细胞数量至少为0.6×106个。该方法能够处理较大通量的细胞,具有单次细胞悬液处理体积较高(>0.5毫升)、单次处理细胞通量较高(>0.6×106cells)的优点。
在一些优选地实施方式中,混悬体系挤出后继续孵育一段的时间,细胞经孵育后细胞膜孔和核膜孔修复,外源性材料能够保留在细胞质及细胞核中。
在一些优选的实施方式中,所述方法还包括在继续培养经过挤出的细胞前,分离混悬体系中的外源物质,可选的采用离心的方法去除外源物质,然后将细胞继续培养。
可以理解的是,本发明对外源物质的种类没有限制,本领域技术人员可以根据实际生产和研究的需要,采用本发明的方法将任意的外源物质递送进入任意的细胞。并且基于本发明提供的外源物质递送至细胞内的装置的有益效果,本发明的方法尤其适合将较大的分子递送至细胞内。
本发明所述的外源物质,可以为来源于天然物质,包括但不限于天然来源的核酸、蛋白质或糖蛋白等;也可以来源于人工合成或改造的物质,包括但不限于大分子聚合物、人工合成核酸或纳米元器件等。所述外源物质还可以经修饰物修饰,包括但不限于使用荧光标记、同位素标记或药物修饰剂;在一些可选的实施例中,所述外源物质包括荧光标记物修饰的核酸、同位素标记的蛋白质或药物修饰剂修饰的具有治疗作用的合成大分子等。
可以理解的是,所述外源物质可以为单一种类的物质,也可以包括不同种类物质的组合,其中优选包括葡聚糖、DNA、RNA、蛋白质、核糖核蛋白复合体和纳米器件中的一种,或者几种的组合;组合形式包括但不限于外源物质包括DNA和核糖核蛋白复合体的混合物;外源物质包括DNA和蛋白质的混合物;或,外源物质包括葡聚糖、DNA和纳米器件的组合物。
在一些优选的实施方式中,DNA包括生物来源的DNA或合成DNA;其中生物来源的DNA包括经生物合成扩增的DNA分子,包括但不限于从微生物中提取的质粒或从微生物或动物中直接提取的DNA分子等,合成DNA指的是不经生物作用合成的DNA分子,例如直接经化学合成的DNA分子。其中生物来源的DNA优选包括质粒,以将带有目的基因的质粒转化至细胞内,以上调或抑制目的蛋白的表达,或使细胞表达外源蛋白。在一些优选的实施方式中,RNA包括mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA,以研究RNA类分子对真核细胞的调控作用。
由于本发明提供的外源物质递送至真核细胞内的装置能将水合半径大于细胞核膜孔复合体(nuclear pore complex,NPC)扩散上限的外源物质递送入细胞核,因此所述外源物质中优选包括至少一种不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质。
在一些优选地实施方式中,所述不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质包括葡聚糖,所述葡聚糖的分子量至少为41kDa,优选为70kDa~2MDa,更优选为2MDa的葡聚糖。
在一些优选的实施方式中,所述不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质包括DNA,所述DNA的分子量至少为1k bp。
本发明不限制被递送外源物质的真核细胞的种类,可根据实际研发和生产需要向真核细胞中递送外源物质,被递送外源物质的真核细胞优选来源于哺乳动物,所述哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、猴、鼠或羊,优选包括人或鼠。所述真核细胞优选包括原代细胞或细胞株。原代细胞指的是直接从有机体中分离出的细胞,包括但不限于从血液、皮肤、骨骼、心脏或肌腱等动物的各种组织和器官中分离出的细胞,也可以包括这些原代细胞还未构成稳定细胞株的传代细胞。细胞株指的是具有稳定形状的传代细胞,这些传代细胞可以由原代细胞经稳定传代后得到,也可以来源于商品化的细胞系,包括但不限于CHO细胞、PK15细胞、Hela细胞、K562细胞或CT26细胞。
在一些优选的实施方式中,所述原代细胞的种类包括但不限于干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞、皮肤细胞或神经元,其中优选包括免疫细胞、肿瘤细胞或干细胞;免疫细胞的种类优选包括T细胞、B细胞、DC细胞、NK细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或巨噬细胞;干细胞优选包括造血干细胞、间充质干细胞或皮肤干细胞;免疫细胞、肿瘤细胞或干细胞优选来源于哺乳动物,更优选来源于人或鼠,其中免疫细胞更优选人的免疫细胞,以更适用于常规的生产和科研研究。
本发明还提供了上述装置或上述方法在调控细胞功能中的应用,本发明通过向真核细胞中递送外源物质以上调或下调真核细胞表达某些蛋白质,或使真核细胞表达外源蛋白质等本发明所述的调控可以为短暂调控,即使细胞在一段内改变生理生化特征,也可以为持续调控,即使细胞持续的改变生理生化特征。
在一些可选的实施方式中,所述调控细胞功能包括短暂调控或持续调控;其中所述调控细胞功能优选包括下调或上调细胞中特定蛋白的表达;下调细胞中特定蛋白的表达优选包括下调程序性死亡受体-1、T细胞受体或主要组织相容性复合体的表达。可选地,所述调控细胞功能包括使细胞表达外源蛋白,其中所述外源蛋白优选包括嵌合抗原受体、识别特定抗原的T细胞受体和β球蛋白。上调、下调或使真核细胞表达外源蛋白可用于生产蛋白类药物,例如生产单克隆抗体、融合蛋白或疫苗用抗原等。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置,该装置以PET核孔膜(购自中科院近代物理所(江碧透))作为微孔膜,PET核孔膜是将PET薄膜经高能重离子辐照形成直径约10nm的圆柱状管道,然后经化学蚀刻产生较大的特定直径孔道;以脂质体挤出仪LF1(加拿大AVESTIN公司)作为提供正压力的压力单元,将PET核孔膜置于脂质体挤出仪内,以组装成本实施例的外源物质递送至真核细胞内的装置。PET核孔膜如图2A和图2B所示,脂质体挤出仪LF1如图2C所示。
实施例2
本实施例提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置,如图3所示,其中图标110为微孔膜,120为活塞管体,130为活塞推杆。该装置以PET核孔膜(购自中科院近代物理所(江碧透))作为微孔膜110,该装置的挤出模块以活塞单元作为压力单元向真核细胞和外源物质施与正压力,具体的结构如下:
所述活塞单元包括活塞管体120和活塞推杆130,活塞推杆130和活塞推杆130可拆卸的滑动密封连接;在远离活塞推杆130进入一端的活塞管体120的底部设置可拆卸的PET核孔膜作为微孔膜110。使用时将真核细胞和外源物质的混悬体系置入活塞管体120内,将活塞推杆130插入活塞管体120内,推动活塞推杆130,使真核细胞和外源物质的混悬体系经分布于PET核孔膜上的孔道挤出,从PET核孔膜的另一侧流出并收集。
实施例3
本实施例提供了一种外源物质递送至真核细胞内的装置,如图4所示,其中图标110为微孔膜,120为活塞管体,130为活塞推杆,210为腔体,221为流入通路,222为流出通路。
该装置以PET核孔膜(购自中科院近代物理所(江碧透))作为微孔膜110,该装置的挤出模块以活塞单元作为压力单元向真核细胞和外源物质施与正压力,该装置以包括流体循环控温单元的温控模块控制温度,具体的结构如下:
所述活塞单元包括活塞管体120和活塞推杆130,活塞推杆130和活塞推杆130可拆卸的滑动密封连接;在远离活塞推杆130进入一端的活塞管体120的底部设置可拆卸的PET核孔膜作为微孔膜110。所述活塞管体120的管壁外层设置有腔体210,腔体210用于流体循环控温单元中的流体流通,腔体210的外壁上设置有用于流体进入和流出的通路,本实施方式以靠近微孔膜110一端的通路为流入通路221,以靠近活塞推杆130进入一端的通路为流出通路222。腔体210上的两条通路与恒温水浴槽的外循环相连,使具有恒定温度的液体持续且稳定的从腔体210中流进和流出。
使用时打开恒温水浴槽的外循环,设定恒温水浴槽的温度,使具有预设温度的液体持续的从腔体210中流过;然后将真核细胞和外源物质的混悬体系置入活塞管体120内,将活塞推杆130插入活塞管体120内,推动活塞推杆130,使真核细胞和外源物质的混悬体系经分布于PET核孔膜上的孔道挤出,从PET核孔膜的另一侧流出并收集。
实施例4
将70kDa和2MDa葡聚糖递送到CT26(小鼠结肠癌细胞株)细胞质及细胞核。本实施例使用实施例1提供的装置。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源物质向细胞质和细胞核内的递送,将70kDa或2MDa FITC标记葡聚糖(FITC-dextran,以下简称葡聚糖)与CT26混合的细胞悬液穿过具有不同孔径孔道的PET核孔膜,用共聚焦显微镜和流式细胞仪分析评价细胞核内递送结果和细胞内递送效率。试验材料如表1所示:
表1递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
70kDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
2MDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
Hoechst33342 | 美国Sigma-Aldrich公司 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
共聚焦皿 | 无锡耐思生物科技有限公司 |
CT26细胞株 | 北京协和细胞库 |
待CT26细胞生长至融合度80%左右,弃掉旧培养基,用PBS冲洗2遍,加入胰酶,待显微镜下观察到大量细胞变圆后,再加入RPMI 1640完全培养基终止消化,轻轻晃动培养皿并用移液器轻轻吹打细胞使其成为单细胞悬液(细胞浓度1.2×106cells/mL),然后室温下(25℃)加入70kDa或2MDa葡聚糖,混匀后将0.5mL细胞悬液转入实施例1提供的装置,用脂质体挤出仪推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道。
收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,然后离心弃去上清,细胞培养基重悬细胞继续培养24小时。培养结束,加入Hoechst33342溶液,孵育15分钟后弃去上清,用PBS冲洗2次,再加入20μL PBS,用共聚焦显微镜的油镜(630×)观察并拍照。并且收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,离心弃去上清,PBS重悬细胞并清洗2次,重悬于PBS中的细胞用流式细胞仪分析递送效率。
试验结果:
共聚焦扫描显微镜观察70kDa和2MDa葡聚糖在CT26细胞质和细胞核的分布,实验结果如图5A和5B显示了70kDa和2MDa葡聚糖在CT26细胞的亚细胞分布,可见2种葡聚糖不仅递送到了细胞质,而且递送到细胞核。
流式细胞仪分析葡聚糖在CT26的细胞内递送效率如图6A和图6B所示,显示了70kDa和2MDa葡聚糖的细胞内递送效率,以及递送效率与PET核孔膜孔直径的关系,在8微米孔直径条件下,70kDa和2MDa都获得了最高的细胞内递送效率。
实施例5
将70kDa和2MDa葡聚糖递送到K562细胞。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源性材料向细胞内的递送,将70kDa或2MDa FITC标记葡聚糖与K562细胞混合的悬液穿过实施例1提供的装置,用流式细胞仪分析评价细胞内递送效率。试验材料如表2所示:
表2递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
70kDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
2MDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
K562细胞株 | 北京协和细胞库 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
取K562单细胞悬液离心,加入无血清培养基重悬细胞(细胞浓度1.2×106cells/毫升),然后加入70kDa或2MDa葡聚糖;不同孔径核孔膜安装在脂质体挤出仪LF1中,室温下(25摄氏度)把K562细胞和葡聚糖混悬液1毫升转入实施例1提供的装置,然后用脂质体挤出仪推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道,收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,离心弃去上清,PBS重悬细胞并清洗2次,重悬于PBS中的细胞用流式细胞仪分析递送效率。
试验结果:
流式细胞仪分析葡聚糖在K562的细胞内递送效率,流式细胞仪分析葡聚糖在K562的细胞内递送效率如图7A和图7B所示,显示了70kDa和2MDa葡聚糖的细胞内递送效率,以及递送效率与PET核孔膜孔直径的关系,在7微米孔直径条件下,70kDa和2MDa都获得了最高的细胞内递送效率。
实施例6
将pCMV-GFP质粒递送到K562细胞核并表达GFP蛋白。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源性材料向细胞质和细胞核内的递送,使用实施例3提供的装置将pCMV-GFP质粒(Plasmid#11153)与K562细胞混合的悬液穿过微孔膜110,然后用共聚焦显微镜检测K562细胞的绿色荧光蛋白GFP表达,或用流式细胞仪分析K562的GFP表达水平。试验材料如表3所示:
表3递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
K562细胞株 | 北京协和细胞库 |
共聚焦皿 | 无锡耐思生物科技有限公司 |
取K562单细胞悬液离心,无血清培养基重悬细胞(细胞浓度1.2×106cells/毫升),然后加入pCMV-GFP质粒;使用PET核孔膜为7μm的实施例3提供的装置,在30℃条件下,把K562细胞和质粒混合物2mL转入装置中,用活塞推杆130推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道,收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,离心弃去上清,用含血清培养基重悬细胞并继续培养2小时,共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达;或继续培养48小时,用流式细胞仪分析绿色荧光蛋白GFP的表达。
试验结果:
CLSM观察pCMV-GFP质粒在K562的表达:如图8所示,在K562和pCMV-GFP质粒混合悬液经实施例3提供的装置挤出后2小时,GFP开始表达,说明pCMV-GFP质粒递送进入了K562细胞核,并转录为编码GFP的mRNA,最后在核外周核糖体表达了GFP蛋白。
流式细胞术分析pCMV-GFP质粒在K562的表达:如图9所示,在K562和pCMV-GFP质粒混合悬液经实施例3提供的装置挤出后24小时,GFP表达阳性率达49%,说明pCMV-GFP质粒递送进入了较大比例的K562细胞核,并表达出GFP蛋白。
实施例7
将pCMV-GFP质粒递送到CT26细胞核并表达GFP蛋白。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源性材料向细胞质和细胞核内的递送,将pCMV-GFP质粒与CT26单细胞悬液2mL使用实施例3提供的装置挤出,然后用流式细胞仪分析48小时CT26的GFP表达水平。试验材料如表4所示:
表4递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
CT26细胞株 | 北京协和细胞库 |
胰酶消化CT26细胞并用PBS清洗1次,离心,无血清培养基重悬细胞(细胞浓度1.2×106cells/毫升),然后加入pCMV-GFP质粒;使用PET核孔膜为8μm的实施例3提供的装置,30℃条件下把CT26细胞和质粒混合物2mL转入装置,然后用活塞推杆130推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道,收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,离心弃去上清,用含血清培养基重悬细胞并继续培养48小时,用流式细胞仪分析绿色荧光蛋白GFP的表达。
流式细胞术分析pCMV-GFP质粒在CT26的表达,实验结果如图10所示:在CT26单细胞和pCMV-GFP质粒混合悬液穿过实施例3提供的装置后24小时,GFP表达阳性率达57.7%,说明pCMV-GFP质粒递送进入了较大比例的CT26细胞核,并表达出GFP蛋白。
实施例8
2MDa葡聚糖递送入K562细胞质及细胞核。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源性材料向细胞质和细胞核内的递送,将2MDa FITC标记葡聚糖与K562细胞混合的悬液使用实施例3提供的装置挤出,用共聚焦显微镜评估葡聚糖在细胞质和细胞核的分布。试验材料如表5所示:
表5递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
2MDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
Hoechst33342 | 美国Sigma-Aldrich公司 |
K562细胞株 | 北京协和细胞库 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
取K562单细胞悬液离心,加入无血清培养基重悬细胞(细胞浓度1.2×106cells/毫升),然后加入2MDa葡聚糖;将核孔膜安装在带有温度控制附件的递送装置中,30℃下,把K562细胞和葡聚糖混悬液2mL转入装置,然后用活塞推杆130推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道,收集处理后的细胞悬液,加入Hoechst33342细胞核染料,孵育一定时间,离心弃去上清,无血清培养基重悬细胞并清洗2次,再重悬于无血清培养基中并滴加在共聚焦皿,用共聚焦显微镜观察2MDa葡聚糖在细胞质和细胞核的分布。
实验结果如图11所示,显示了2MDa葡聚糖的细胞内分布,可见经实施例3提供的装置挤出后,2MDa递送进入了K562细胞质和细胞核。
实施例9
将2MDa葡聚糖递送到CT26(小鼠结肠癌细胞株)细胞质及细胞核。本实施例使用实施例3提供的装置。为了评估包含在薄膜中的规则孔道介导的外源物质向细胞质和细胞核内的递送,将2MDa葡聚糖与CT26混合的细胞悬液在4摄氏度下穿过9微米孔径孔道的PET核孔膜,用流式细胞仪分析评价细胞内递送效率。试验材料如表6所示:
表6递送试验的主要耗材
耗材 | 来源 |
RPMI1640培养基 | 美国GE healthcare公司 |
胎牛血清FBS | 以色列Biological Industries公司 |
2MDa FITC-dextran(葡聚糖) | 美国Sigma-Aldrich公司 |
胰酶-EDTA | 美国Invitrogen公司 |
CT26细胞株 | 北京协和细胞库 |
待CT26细胞生长至融合度80%左右,弃掉旧培养基,用PBS冲洗2遍,加入1mL胰酶,待显微镜下观察到大量细胞变圆后,再加入2ml RPMI1640完全培养基终止消化,轻轻晃动培养皿并用移液器轻轻吹打细胞使其成为单细胞悬液(细胞浓度1.2×106cells/mL),然后加入2MDa葡聚糖,将装置温度预设为4摄氏度,混匀后将2mL细胞悬液转入实施例3提供的装置,用活塞推杆130推动细胞悬液穿过PET核孔膜的规则孔道。
收集处理后的细胞悬液,孵育一定时间,然后离心弃去上清,PBS重悬细胞并清洗2次,重悬于PBS中的细胞用流式细胞仪分析递送效率。
试验结果:
流式细胞仪分析葡聚糖在CT26的细胞内递送效率如图12所示,显示了2MDa葡聚糖在4摄氏度和9微米孔径核孔膜条件下细胞内递送效率为39.3%。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种外源物质递送至真核细胞内的装置,其特征在于,所述装置包含挤出模块,所述挤出模块中设置分布有规则孔道的微孔膜,所述孔道的孔径小于所述真核细胞的直径;所述挤出模块还包括用于驱动真核细胞和外源物质同时通过孔道的压力单元。
2.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述装置还包括用于控制挤出模块的环境温度的温控模块;
优选地,所述温控模块通过与挤出模块接触以控制挤出模块的温度;
优选地,所述温控模块包括流体循环控温单元或半导体制冷单元;
优选地,所述流体循环控温单元设置有和挤出模块接触的腔体,所述腔体用于流体循环控温单元中的流体流通。
3.根据权利要求1所述的装置,其特征在于,所述压力单元向细胞和外源物质施与正压力,以使细胞和外源物质通过所述孔道;
优选地,所述压力单元包括活塞单元或压缩气体单元;
优选地,所述活塞单元包括活塞管体和活塞推杆;
优选地,活塞单元包括用于驱动活塞推杆的驱动单元,所述驱动单元优选包括电机;
优选地,所述微孔膜与所述挤出模块可拆卸连接;
优选地,所述活塞管体的材质包括金属材料、合金材料或非金属材料;
优选地,所述金属材料包括铝或铜;
优选地,所述合金材料包括不锈钢或钛镁合金;
优选地,所述非金属材料包括玻璃;
优选地,所述活塞推杆的材质包括天然高分子材料或合成高分子材料;
优选地,所述天然高分子材料优选包括橡胶;
优选地,所述合成高分子材料优选包括聚酯类;
优选地,所述合成高分子材料优选包括聚四氟乙烯和/或聚乙烯。
4.根据权利要求1-3任一项所述的装置,其特征在于,所述微孔膜的材质包括金属或非金属;
优选地,所述微孔膜的材质包括非金属;
优选地,所述非金属包括聚合物、陶瓷或硅;优选包括聚合物;
优选地,所述聚合物包括聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚酰胺、醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚乙烯、聚醚砜或聚四氟乙烯;
优选地,所述聚合物包括聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺或聚碳酸酯;
优选地,所述规则的孔道采用蚀刻或打孔制备得到;
优选地,所述打孔包括冲压打孔;
优选地,所述蚀刻包括径迹蚀刻或光蚀刻;其中光蚀刻优选激光蚀刻;
优选地,所述微孔膜使用径迹蚀刻制备得到。
5.一种外源物质递送至真核细胞内的方法,其特征在于,所述方法包括:将包含真核细胞和外源物质的混悬体系经权利要求1-4任一项所述的装置挤出,以使外源物质递送至真核细胞内;
优选地,所述递送包括将外源物质递送至真核细胞质内和/或递送至真核细胞核内。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述外源物质包括葡聚糖、DNA、RNA、蛋白质、核糖核蛋白复合体和纳米器件中的至少一种;
优选地,所述外源物质包括DNA、RNA、蛋白质和核糖核蛋白复合体中的至少一种;RNA优选包括mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA;
优选地,DNA包括生物来源的DNA或合成DNA;
优选地,所述生物来源的DNA包括质粒;
优选地,RNA包括mRNA、siRNA、miRNA或lncRNA;
优选地,所述外源物质包含至少一种不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质;
优选地,所述不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质包括葡聚糖,所述葡聚糖的分子量至少为41kDa,优选为70kDa~2 MDa,更优选为2 MDa的葡聚糖;
优选地,所述不能通过自由扩散跨越细胞核膜核孔复合体的物质包括DNA,所述DNA的分子量至少为1kbp。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述真核细胞来源于哺乳动物;优选地,所述哺乳动物优选包括人或鼠;
优选地,所述真核细胞包括原代细胞或细胞株;
优选地,所述原代细胞包括免疫细胞、肿瘤细胞或干细胞;
优选地,所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、DC细胞、NK细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞或巨噬细胞;
优选地,所述干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞或皮肤干细胞;
优选地,所述细胞包括人源的免疫细胞。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法,其特征在于,包含真核细胞和外源物质的混悬体系一次性经所述装置挤出;
优选地,一次性经所述装置挤出的混悬体系的体积至少为0.5mL;
优选地,一次性经所述装置挤出的混悬体系中的真核细胞数量至少为0.6×106个。
9.根据权利要求5-7任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括孵育挤出后的细胞和外源物质;
优选地,在继续培养经过挤出的细胞前,分离混悬体系中的外源物质。
10.权利要求1-4任一项所述的装置,或权利要求5-9任一项所述的外源物质递送至真核细胞内的方法在调控细胞功能中的应用;
优选地,所述调控细胞功能包括短暂调控或持续调控;
优选地,所述调控细胞功能包括下调或上调细胞中特定蛋白的表达;
优选地,下调细胞中特定蛋白的表达包括下调程序性死亡受体-1、T细胞受体或主要组织相容性复合体的表达;
优选地,所述调控细胞功能包括使细胞表达外源蛋白;
优选地,所述外源蛋白包括嵌合抗原受体、识别特定抗原的T细胞受体和β球蛋白。
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