TW202016297A - 抗藥性免疫細胞及使用其之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性之經修飾之細胞，該等細胞包括多能幹細胞、造血前體細胞及造血細胞(例如，修飾之Treg)。本發明提供了產生包括多能幹細胞、造血前體細胞及造血細胞之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性之修飾細胞之方法。本文還提供了組合物及治療方法。

Description

抗藥性免疫細胞及使用其之方法
相關申請案之交互參照
本申請案主張2018年5月17日提交之美國臨時申請案第62/672,868之優先權，該臨時申請案以引用方式併入本文，如同其全部內容得以闡述一樣。
調節性T細胞(Treg)對於維持免疫細胞穩態至關重要，此可由Treg群體之遺傳或物理消除之災難性後果證明。具體而言，Treg細胞藉由對其他免疫細胞實施顯性負調節來維持免疫系統之有序性。大致分為天然或適應性(誘導)Treg；天然Treg係CD4+ CD25+ T細胞，它們發育並從胸腺移出，在免疫穩態中發揮關鍵作用。適應性Treg係非調節性CD4+ T細胞，該等細胞在胸腺外獲得CD25(IL-2Rα)表現，並且通常由炎症及疾病過程誘導，例如自體免疫及癌症。
調節性T細胞(Treg)抑制過剩之免疫系統活化並促進免疫耐受。因為Treg調節先天免疫及適應性免疫，最近人們對使用Treg進行免疫治療非常關注。需要臨床耐受性以改善預後之病狀-自體免疫疾病、實體器官移植及造血幹細胞移植-可能受益於Treg免疫療法。臨床上可行之Treg免疫療法之障礙包括Treg穩定性、細胞外效應以及細胞製備純度及效力之證明。涉及Treg過繼轉移以治療移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之臨床試驗初步證明了Treg免疫療法在人體中之安全性及有效性。在此等試驗中，已經發現Treg在GVHD患者之血液中不會持續超過兩週。
因此，此項技術中需要開發克服諸如短持久性之障礙之免疫細胞。特別地，此項技術中需要開發在活體內具有增加之持久性之Treg。
當治療患有移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之受試者時，類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑代表護理預防之標準，並且可以抑制Treg持久性及功能。T效應(Teff)細胞之Treg抑制結合標準護理GVHD預防(例如鈣調神經磷酸酶抑制劑、類固醇)可直接抑制Treg持久性及功能。本發明基於以下發現：經遺傳修飾以對類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑具有抗性之免疫細胞(例如，Treg)具有增強之功能及活力。本發明提供了類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性免疫細胞(例如Treg)。本發明還提供了製備此等遺傳修飾之免疫細胞之方法，以及使用該等細胞治療同種異體反應及/或同種異體免疫之方法，其中使用類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑作為預防。
在第一態樣，本文提供了類固醇抗性之遺傳修飾之造血細胞或其前體細胞，該細胞在編碼NR3C1之基因座中包含遺傳修飾，其中該修飾能夠下調NR3C1之基因表現，其中該修飾係位於NR3C1之外顯子、剪接供體或剪接受體中，並且其中該修飾之細胞由於該遺傳修飾而具有類固醇抗性。遺傳修飾可以由CRISPR-Cas系統、CRISPR-Cpf1系統、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas-相關家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶介導。修飾可以係插入缺失。插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。NR3C1中之插入缺失可以由CRISPR系統介導。CRISPR系統可包含CRISPR核酸酶及指導RNA。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。修飾可以係鹼基對取代。NR3C1中之取代可以由CRISPR系統介導。CRISPR系統可包含鹼基編輯器及指導RNA。鹼基編輯器可包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係Cas9結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係變體Cas9結構域。變體Cas9結構域可以係核酸酶非活性之Cas9結構域。鹼基編輯域可以係脫胺酶域。脫胺酶結構域可以對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。脫胺酶結構域可以係胞苷或腺苷脫胺酶。該取代可在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含與靶序列充分互補之指導序列，該靶序列包含NR3C1之剪接受體或剪接供體。該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含SEQ ID NO 55或56中任一者所示之核酸序列。修飾之細胞可以對皮質類固醇具有抗性。修飾之細胞可以對糖皮質類固醇具有抗性。糖皮質類固醇可選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。糖皮質類固醇可選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。
另一態樣，本文提供了鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)抗性、遺傳修飾之造血細胞或其前體細胞，在細胞基因組中包含外源鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)抗性基因，其中CNI抗性基因係由於CRISPR介導之同源定向修復(homology directed repair; HDR)而插入，並且其中該修飾之細胞由於該抗性基因而具有CNI抗性。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以插入於編碼NR3C1之基因座處。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。可以使用外源供體DNA序列藉由同源重組將突變鈣調神經磷酸酶基因插入NR3C1基因座。外源供體DNA序列可包含SEQ ID NO：11所示之核酸序列。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。鈣調神經磷酸酶變體可包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可結合鈣調神經磷酸酶抑制劑但不結合鈣調神經磷酸酶，從而導致鈣調神經磷酸酶抑制劑之隔離及鈣調神經磷酸酶抑制之預防。修飾之細胞可以對選自由以下各者組成之群之鈣調神經磷酸酶抑制劑具有抗性：環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物。
在另一態樣，本文提供了遺傳修飾、類固醇抗性及鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)抗性造血細胞或其前體細胞，其包含(1)包含編碼NR3C1之基因座中之插入缺失之第一遺傳修飾，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，及(2)包含插入細胞基因組中之外源CNI抗性基因之第二遺傳修飾，其中CNI抗性基因位於編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點處，其中該修飾之細胞由於該等遺傳修飾而具有類固醇及CNI抗性。基因座可以對應於NR3C1之外顯子2。插入缺失可以由包含指導RNA之CRISPR系統介導，該指導RNA包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。插入缺失可以由包含指導RNA之CRISPR系統介導，該指導RNA包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。
另一態樣，本文提供了遺傳修飾、類固醇抗性及鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)抗性造血細胞或其前體細胞，該細胞包含(1)包含NR3C1基因座中之修飾之第一遺傳修飾，其中該修飾係能夠下調NR3C1之基因表現，及(2)包含插入細胞基因組中之外源CNI抗性基因之第二遺傳修飾，其中該修飾之細胞由於該等遺傳修飾而具有類固醇及CNI抗性。第一或第二修飾可以由CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1系統、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas-相關之家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶介導。修飾可以係插入缺失。插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。NR3C1中之插入缺失可以由CRISPR系統介導。CRISPR系統可包含CRISPR核酸酶及指導RNA。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。修飾可以係鹼基對取代。NR3C1中之取代可以由CRISPR系統介導。CRISPR系統可包含鹼基編輯器及指導RNA。鹼基編輯器可包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係Cas9結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係變體Cas9結構域。變體Cas9結構域可以係核酸酶非活性之Cas9結構域。鹼基編輯域可以係脫胺酶域。脫胺酶結構域可以對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。脫胺酶結構域可以係胞苷或腺苷脫胺酶。該取代可在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含與靶序列充分互補之指導序列，該靶序列包含NR3C1之剪接受體或剪接供體。該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含SEQ ID NO：55-56中任一者所示之核酸序列。修飾之細胞可以對皮質類固醇具有抗性。修飾之細胞可以對糖皮質類固醇具有抗性。糖皮質類固醇可選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。糖皮質類固醇可選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可結合鈣調神經磷酸酶抑制劑但不結合鈣調神經磷酸酶，從而導致鈣調神經磷酸酶抑制劑之隔離及鈣調神經磷酸酶抑制之預防。可以使用外源供體DNA序列藉由同源重組將突變鈣調神經磷酸酶基因插入細胞之基因組中。突變鈣調神經磷酸酶基因可以插入NR3C1基因座。修飾之細胞可以對選自由以下各者組成之群之鈣調神經磷酸酶抑制劑具有抗性：環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物。修飾之細胞可以係修飾之免疫細胞。修飾之細胞可以係修飾之調節性T細胞(Treg)。修飾之細胞可以係自體細胞。修飾之細胞可以係同種異體細胞。修飾之細胞可以從人類受試者中分離。人類受試者可以接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。人類受試者可以接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。人類受試者可能患有自體免疫性疾病。人類受試者可患有移植物抗宿主病(Graft vs. Host Disease; GVHD)。人類受試者可能患有1型糖尿病。
在另一態樣，本文提供了用於產生修飾之造血細胞或其前體細胞之方法，包括向細胞中引入CRISPR系統，該CRISPR系統在編碼NR3C1之基因座中產生修飾，其中該修飾能夠下調NR3C1之基因表現。修飾可以係NR3C1之外顯子2中之插入缺失。CRISPR系統可包含CRISPR核酸酶及指導RNA。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。修飾可以係鹼基對取代。CRISPR系統可包含鹼基編輯器及指導RNA。鹼基編輯器可包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係Cas9結構域。CRISPR失活或切口DNA結合結構域可以係變體Cas9結構域。變體Cas9結構域可以係核酸酶非活性之Cas9結構域。鹼基編輯域可以係脫胺酶域。脫胺酶結構域可以對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。脫胺酶結構域可以係胞苷或腺苷脫胺酶。該取代可在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。指導RNA可包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。指導RNA可包含與靶序列充分互補之指導序列，該靶序列包含NR3C1之剪接受體或剪接供體。該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。指導RNA可包含SEQ ID NO：55-56中任一者所示之核酸序列。CRISPR核酸酶/鹼基編輯器及指導RNA可包含核糖核蛋白(RNP)複合物。CRISPR核酸酶/鹼基編輯器及/或指導RNA可以由多核苷酸編碼。多核苷酸可包含載體及/或合成mRNA。可以藉由電穿孔引入RNP或多核苷酸。該方法可以進一步包括將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入細胞之基因組中。插入外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以藉由同源重組。插入可以在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點處發生。插入可以在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點處發生。插入可以藉由來自外源供體DNA序列之同源重組在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點處發生。外源供體DNA序列可包含SEQ ID NO：11所示之核酸序列。可以藉由病毒轉導引入外源供體DNA序列。可以藉由電穿孔引入外源供體DNA序列。外源供體DNA序列包含與編碼報道分子之核酸可操作連接之啟動子。啟動子及編碼報道分子之核酸可以藉由接頭分開。接頭可包含T2A序列。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。鈣調神經磷酸酶變體蛋白可包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。修飾之細胞可以係修飾之免疫細胞。修飾之細胞可以係修飾之調節性T細胞(Treg)。修飾之細胞可以係自體細胞。修飾之細胞可以係同種異體細胞。修飾之細胞可以從人類受試者中分離。人類受試者可以接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。人類受試者可以接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。人類受試者可能患有自體免疫性疾病。人類受試者可患有移植物抗宿主病(Graft vs. Host Disease; GVHD)。人類受試者可能患有1型糖尿病。
另一態樣，本文提供了在有此需要之受試者中實現免疫抑制作用之方法，包括向受試者投與本文提供之修飾之細胞。受試者可能患有同種異體反應及/或自體免疫反應。
在另一態樣，本文提供了用於在有此需要之受試者中實現預防性治療效果之方法，包括在發生同種異體反應及/或自體免疫反應之前向受試者投與本文提供之修飾細胞群。同種異體反應及/或自體免疫反應可以在移植生物材料之後進行。生物材料可選自細胞、組織及器官組成之群。生物材料可以係同種異體的。受試者可以係人。人類受試者可以接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。人類受試者可以接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。人類受試者可能患有自體免疫性疾病。人類受試者可患有移植物抗宿主病(Graft vs. Host Disease; GVHD)。人類受試者可能患有1型糖尿病。修飾之細胞可以與類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑組合投與。類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑可以在投與修飾細胞之前投與。類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑可以在投與修飾細胞之同時或之後投與。類固醇可以係皮質類固醇。類固醇可以係糖皮質類固醇。糖皮質類固醇可選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。糖皮質類固醇可選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。鈣調神經磷酸酶抑制劑可選自環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物組成之群。
本發明提供了修飾之造血細胞或其前體(例如，修飾之Treg)之組合物及方法，該等細胞係類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性的。在一些實施例中，對經修飾之細胞進行遺傳編輯以破壞一種或多種內源基因，該內源基因造成類固醇介導之細胞持久性及存活之減少。在一些實施例中，對經修飾之細胞進行遺傳編輯以引入鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因。在某些實施例中，本發明之經修飾之細胞在NR3C1基因座中包含一個或多個插入缺失。在某些實施例中，本發明之修飾細胞在NR3C1基因座中包含一個或多個插入缺失，並且進一步包含插入NR3C1基因座中之一個或多個插入缺失中之鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因。
在一些實施例中，所提供之細胞、組合物及方法提供增加之持久性及/或存活。例如，本發明之Treg表現出增加之持久性及/或存活。在臨床環境中，類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑之投與代表了經歷過例如同種異體細胞移植之個體之護理預防治療之標準。調節性T細胞之過繼轉移係減少同種異體細胞移植後之負面影響之方法。本文發現類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑對Treg之持久性及存活性產生負面影響。因此，在標準護理預防治療之存在下，本發明之修飾細胞更持久且長壽命。
應理解，本發明中描述之方法不限於本文揭示之特定方法及實驗條件，因為此等方法及條件可以變化。亦應理解，本文使用之術語僅係出於描述特定實施例之目的且不意欲成為限制。
此外，除非另有說明，本文所述之實驗使用此項技術之技能範圍內之常規分子及細胞生物學及免疫學技術。此等技術係技藝人士所熟知的，並且在文獻中有充分之解釋。參見，例如Ausubel等人編, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008)，包括所有附錄，MR Green之Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第四版)及J. Sambrook及Harlow等人, Antibodies: A Laboratory Manual, 第14章, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (2013, 第2版)。A. 定義
除非另外定義，否則本文使用之科學及技術術語具有普通熟習此項技術者通常理解之含義。如果存在任何潛在之歧義，本文提供之定義優先於任何字典或外在定義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。除非另有說明，否則「或」之使用意味著「及/或」。術語「包括(including)」以及諸如「包括(includes)」及「包括(included)」之其他形式之使用不係限制性的。
通常，與本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交相關使用之命名法係此項技術中公知及常用的。本文提供之方法及技術通常根據此項技術中熟知，並且如在整個本說明書中引用及討論之各種一般及更具體之參考文獻中所述之常規方法進行，除非另有說明。酶促反應及純化技術根據製造商之說明書進行，如此項技術中通常實現或如本文所述。與本文所述之分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學相關之術語及實驗室程序及技術係此項技術中公知及常用之彼等。標準技術用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製及遞送以及患者之治療。
為了可以更容易理解本發明，下面定義選擇術語。
本文使用之冠詞「一」及「一個」係指該冠詞之一個或多於一個(即至少一個)語法對象。舉例來說，「元件」表示一個元件或多於一個元件。
當提及諸如量、持續時間等之可測量值時，本文所用之「約」意味著包括從指定值±20%或±10%，更佳±5%，甚至更佳±1，並且更佳地±0.1%之變化，因為此等變化適合於執行所揭示之方法。
如本文所用，「減輕」疾病意味著降低疾病之一種或多種症狀之嚴重性。
如本文所用，術語「自體」意指來自同一個體之任何材料，該材料隨後將重新引入個體。
「疾病」係動物之健康狀態，其中動物不能維持體內平衡，並且其中如果疾病沒有改善則動物之健康繼續惡化。相反，動物中之「病症」係一種健康狀態，其中動物能夠維持體內平衡，但其中動物之健康狀態不如沒有病症時之健康狀態。如果不治療，病症不一定會導致動物之健康狀態進一步下降。
如本文所用之術語「下調」係指減少或消除一種或多種基因之基因表現。
「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，並且係指有效實現特定之生物學結果或提供治療或預防益處之如本文所述之化合物、調配物、材料或組合物之量。此等結果可包括但不限於當投與哺乳動物時，與不存在本發明組合物時檢測到之免疫反應相比，引起可檢測水準之免疫抑制或耐受之量。藉由許多此項技術中公認之方法可以容易地評估免疫反應。熟習此項技術者將理解，本文投與之組合物之量變化並且可以基於許多因素容易地確定，例如所治療之疾病或病症、所治療之哺乳動物之年齡及健康以及身體狀況、疾病之嚴重程度、所投與之特定化合物等。
「編碼」係指例如基因、cDNA或mRNA之多核苷酸中之特定核苷酸序列用作在生物過程中合成具有確定之核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或確定之胺基酸序列之其他聚合物及大分子之模板之固有特性，及由此產生之生物學特性。因此，如果對應於該基因之mRNA之轉錄及翻譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因編碼蛋白質。其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常在序列表中提供之編碼鏈，以及用作基因或cDNA轉錄之模板之非編碼鏈可以稱為編碼蛋白質或該基因或cDNA之其他產物。
如本文所用，「內源」係指來自生物體、細胞、組織或系統內部或在其內部產生之任何材料。
如本文所用，術語「外源」係指從生物體、細胞、組織或系統外引入或產生之任何材料。
如本文所用，術語「擴增」係指數量增加，如細胞(例如，Treg)之數量之增加。在一個實施例中，相對於培養物中最初存在之數量，離體擴增之細胞數量增加。在另一個實施例中，相對於培養物中之其他細胞類型，離體擴增之細胞數量增加。如本文所用，術語「離體」係指已經從活生物體(例如人)中移出並在生物體外(例如，在培養皿、試管或生物反應器中)繁殖之細胞。
如本文所用之術語「表現」定義為由其啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或翻譯。
「表現載體」係指包含重組多核苷酸之載體，該重組多核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含足夠之用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可以由宿主細胞或活體外表現系統提供。表現載體包括此項技術中已知之併入重組多核苷酸之所有彼等，例如黏粒、質粒(例如，裸露或包含在脂質體中)及病毒(例如，仙台病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用，術語「遺傳工程化」及「遺傳修飾」可互換使用，並且係指如下細胞，該細胞經修飾以包含已經由人工製造或修飾之非天然存在之核酸分子(例如，使用重組或基因編輯DNA技術)或衍生自此類分子(例如，藉由轉錄、翻譯等)。含有外源、重組、合成及/或以其他方式修飾之多核苷酸之細胞被認為係遺傳修飾之細胞，並且因此相對於任何天然存在之對應物係非天然存在的。在一些情況下，遺傳修飾之細胞含有一種或多種重組核酸。在其他情況下，遺傳修飾之細胞含有一種或多種合成或遺傳工程化之核酸(例如，相對於在其天然存在之對應物中發現之序列，含有至少一個人工產生之插入、缺失、倒位或取代之核酸)。
如本文所用，「同一性」係指兩個聚合分子之間之亞基序列同一性，尤其在兩個胺基酸分子之間，例如在兩個多肽分子之間。當兩個胺基酸序列在相同位置具有相同之殘基時；例如，如果兩個多肽分子中之每一個中之位置被精胺酸佔據，那麼它們在該位置係相同的。兩個胺基酸序列在比對中相同位置具有相同殘基之同一性或程度通常表示為百分比。兩個胺基酸序列之間之同一性與匹配或相同位置數量直接相關；例如，如果兩個序列中位置之一半(例如，長度為10個胺基酸之聚合物中之5個位置)相同，則兩個序列係50%相同的；如果90%之位置(例如，10個中之9個)匹配或相同，則兩個胺基酸序列係90%相同的。
本文所用之術語「免疫反應」定義為當淋巴細胞將抗原分子鑑定為外源並誘導抗體形成及/或活化淋巴細胞以移除抗原時發生之對抗原之細胞反應。
術語「免疫抑制(immunosuppressive)」或「免疫抑制(immune suppressive)」在本文中用於指降低總體免疫反應。
「插入/缺失」，通常縮寫為「插入缺失」，係一種遺傳多態性，其中特定核苷酸序列在基因組中存在(插入)或不存在(缺失)。
「分離」意指改變或從天然狀態中移除。例如，天然存在於活動物中之核酸或肽不係「分離的」，但是與其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽係「分離的」。分離之核酸或蛋白質可以以基本上純化之形式存在，或者可以存在於非天然環境中，例如宿主細胞。
如本文所用之術語「敲低」係指一種或多種基因之基因表現降低。
如本文所用之術語「敲除」係指消除一種或多種基因之基因表現。
本文所用之「慢病毒」係指逆轉錄病毒科之屬類。慢病毒在逆轉錄病毒中係獨特的，能夠感染非分裂細胞；它們可以將大量之遺傳資訊傳遞到宿主細胞之DNA中，因此它們係基因傳遞載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV都係慢病毒之實例。衍生自慢病毒之載體提供了在活體內實現顯著水準之基因轉移之手段。
本文所用之術語「修飾」係指本發明之分子或細胞之改變之狀態或結構。可以以許多方式修飾分子，包括化學、結構及功能。可以藉由引入核酸來修飾細胞。在某些實施例中，修飾之細胞可以係「遺傳修飾的」或「遺傳編輯的」，其中細胞中之一種或多種核酸被改變。
本文所用之術語「調節」係指與不存在治療或化合物之受試者中之反應水準相比，及/或與在其他方面相同但未經治療之受試者之反應水準相比較，介導受試者中反應水準之可檢測之增加或減少。該術語包括擾亂及/或影響天然信號或反應，從而在受試者(較佳人)中介導有益之治療反應。
在本發明之上下文中，使用以下對常見核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷，並且「U」係指尿苷。
除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此簡並形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA之片語核苷酸序列也可包括內含子，只要編碼蛋白質之核苷酸序列在某些形式中可含有內含子。
免疫原性組合物之「腸胃外」投與包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射或輸注技術。
如本文所用之術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸係核苷酸之聚合物。因此，本文使用之核酸及多核苷酸係可互換的。熟習此項技術者通常知道核酸係多核苷酸，該等多核苷酸可以水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限於藉由此項技術中可利用之任何方法獲得之所有核酸序列，包括但不限於重組方法，亦即使用普通選殖技術及PCR等，從重組文庫或細胞基因組來選殖核酸序列，以及藉由合成方法。
如本文所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，並且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，並且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質，該肽或蛋白質包含藉由肽鍵彼此連接之兩個或更多個胺基酸。如本文所用，該術語係指短鏈，該等短鏈在此項技術中通常也稱為例如肽、寡肽及寡聚體，並且係指較長之鏈，該等鏈通常在此項技術中稱為蛋白質，存在有很多種蛋白質。「多肽」包括，例如，生物活性片段、基本上同源之多肽、寡肽、同型二聚體、異二聚體、多肽之變體、修飾之多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
如本文所用，「多能性」係指細胞分化成身體或體細胞之所有譜系(即胚胎本體)之能力，包括所有三個胚層(外胚層、內胚層及中胚層)之細胞。
如本文所用，術語「多能幹細胞」係指能夠持續自我更新並且能夠在適當條件下分化成所有三個胚層之細胞之細胞。多能幹細胞(pluripotent stem cell; PSC)之實例包括胚胎幹細胞(embryonic stem cell; ESC)及誘導之多能幹細胞(induced pluripotent stem cell; iPSC)。如本文所用，「胚胎幹細胞」或「ESC」係指源自胚泡內細胞團之多能細胞或多能細胞群。參見，例如Thomson等人, Science 282:1145-1147 (1998)。此等細胞表現Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81，並且在活體外表現為具有高細胞核與細胞質比率及顯著核仁之緊密集落。如本文所用，術語「iPS細胞」或「iPSC」係指多能細胞或多能細胞群，該等細胞可以相對於其分化之起源體細胞而變化，可以相對於一組特定效力決定因素而變化，並且可以根據用於分離它們之培養條件而變化，但是與它們各自之分化之起源體細胞基本上在遺傳上相同，並且顯示出與如本文所述之更高效力細胞諸如ESC相似之特徵。參見，例如Yu等人, Science 318:1917-1920 (2007)。IPSC與其各自分化之起源體細胞基本上在遺傳上相同，顯示出與更高效力細胞例如ES細胞相似之特徵，並且藉由對非多能細胞(例如，多潛能細胞、寡潛能細胞、單潛能細胞及終末分化細胞)諸如體細胞進行重新程式規劃來獲得。ESC及iPSC可從各種商業供應商處獲得。
術語「受試者」意欲包括可以引發免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。其中使用之「受試者」或「患者」可以係人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜及寵物，例如綿羊、牛、豬、犬、貓及鼠科哺乳動物。較佳地，受試者係人。
「靶位點」或「靶序列」係指基因組核酸序列，該序列定義了在足以發生結合之條件下結合分子可特異性結合之核酸之一部分。
本文所用之術語「治療性」係指治療及/或預防。藉由抑制、緩解或根除疾病狀態獲得治療效果。
「移植物」係指待移植之生物相容性格構或供體組織、器官或細胞。移植物之實例可包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓及實體器官，例如心臟、胰腺、腎、肺及肝。移植物也可以指向宿主投與之任何材料。例如，移植物可以指核酸或蛋白質。
如本文所用之術語「轉染」或「轉型」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞之過程。「轉染」或「轉型」或「轉導」細胞係已經用外源核酸轉染、轉型或轉導之細胞。細胞包括原代受試細胞及其後代。
本文使用之術語「治療」疾病係指降低受試者經歷之疾病或病症之至少一種體征或症狀之頻率或嚴重性。
「載體」係物質組合物，該組合物包含分離之核酸並且可以用於將分離之核酸遞送至細胞內部。此項技術中已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關之多核苷酸、質粒及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製之質粒或病毒。該術語還應解釋為包括促進核酸轉移到細胞中之非質粒及非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體等。病毒載體之實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、逆轉錄病毒載體、慢病毒載體等。
範圍：貫穿本發明，本發明之各個態樣可以以範圍形式呈現。應當理解，範圍形式之描述僅僅係為了方便及簡潔，並且不應該被解釋為對本發明範圍之不可改變之限制。因此，應該認為範圍之描述已經具體揭示了所有可能之子範圍以及該範圍內之各個數值。例如，應該認為諸如從1到6之範圍之描述已經具體揭示了子範圍，例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。無論範圍之廣度如何，此都適用。B. 修飾之細胞
本發明提供了一種修飾之細胞(例如，修飾之多能幹細胞、修飾之免疫細胞、修飾之調節性T細胞、來自修飾之多能幹細胞之免疫細胞)，該細胞對類固醇(例如，糖皮質激素)之作用具有抗性。本發明提供了對鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如CsA、FK506)之作用具有抗性之修飾細胞(例如免疫細胞、調節性T細胞)。在某些實施例中，本發明提供了修飾之細胞(例如免疫細胞、調節性T細胞)，該細胞對類固醇(例如，糖皮質激素)及鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如CsA、FK506)之作用具有抗性。還提供了對其他免疫抑制藥物(例如，mTOR抑制劑、黴酚酸、甲胺蝶呤、氟達拉濱、噴司他丁、環磷醯胺等)之作用具有抗性之修飾細胞。還提供了對類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑之作用敏感之經修飾之效應T細胞(Teff)。 類固醇抗性細胞
如本文所述，當治療患有移植物抗宿主病(GVHD)之受試者時，類固醇(例如，糖皮質激素)代表護理預防之標準，並且可以降低效應T細胞(Teff)功能以及直接抑制Treg持久性及功能。類固醇可能直接影響細胞之存活，例如，在類固醇地塞米松存在下Treg之存活率大大降低。
本發明提供了類固醇抗性細胞(例如，基因編輯之類固醇抗性多能幹細胞、類固醇抗性調節性T細胞(Treg)、類固醇抗性造血細胞或其前體細胞)。如本文所用，「類固醇抗性」細胞係指對類固醇(例如糖皮質激素)之作用具有抗性之細胞。如本文所用，對試劑「抗性或耐受」之細胞係指已經遺傳修飾之細胞，使得細胞在一定量之抑制或阻止沒有修飾之細胞增殖之試劑存在下增殖。當與類固醇接觸時，本發明之類固醇抗性細胞表現出極小之生理變化或沒有生理變化。有效地，類固醇抗性細胞不與類固醇相互作用(例如，結合)。評估類固醇抗性細胞是否對類固醇之作用具有抗性之各種方法係此項技術中已知的。例如，可以使用細胞計數技術或基於報道基因之技術測量在類固醇存在下細胞之存活。技藝人士將能夠使用此項技術中已知之各種方法確定類固醇對類固醇抗性細胞之作用。
在一些實施例中，藉由基因編輯一種或多種內源表現之基因來實現類固醇抗性。因此，本發明提供了基因編輯之類固醇抗性細胞(例如，基因編輯之類固醇抗性多能幹細胞、基因編輯之類固醇抗性Treg、修飾之造血細胞或其前體細胞)。在一些實施例中，對細胞進行遺傳編輯以破壞一種或多種內源表現基因之表現，其中該破壞導致一種或多種內源表現基因之表現之減少、缺失、消除、敲除或破壞，從而賦予細胞類固醇抗性。
在一些實施例中，對本發明之類固醇抗性細胞進行遺傳編輯以破壞編碼一種或多種核受體之一種或多種內源基因之表現。核受體係在細胞內發現之一類蛋白質，該等蛋白質負責感知類固醇及甲狀腺激素以及其他分子。此等受體與其他蛋白質一起調節特定基因之表現。各種核受體在此項技術中係已知的，並且大致分為亞家族，例如：亞家族1，甲狀腺激素受體樣；亞家族2，類視黃醇X受體樣；亞家族3，雌激素受體樣；亞家族4，神經生長因子IB樣；及亞家族5，類固醇生成因子樣，亞家族6，生殖細胞核因子樣。每個核受體亞家族可以進一步分為幾類。例如，屬亞家族3之核受體可以進一步分類為例如：A類，雌激素受體；B類，雌激素相關受體；及C類，3-酮類固醇受體。屬亞家族3，C類之核受體之幾個成員係已知的。例如，NR3C1基因(NCBI參考序列NG_009062.1)編碼糖皮質激素受體，NR3C2基因(NCBI參考序列NG_013350.1)編碼鹽皮質激素受體，NR3C3基因(NCBI參考序列NG_016475.1)編碼黃體酮受體，並且NR3C4基因(NCBI參考序列NG_009014.2)編碼雄激素受體。
在某些實施例中，對本發明之類固醇抗性細胞進行遺傳編輯以破壞NR3C1之表現。NR3C1編碼糖皮質激素受體(GR或GCR)。糖皮質激素係一類與糖皮質激素受體結合之皮質類固醇，傳統上已知可調節葡萄糖代謝並且在腎上腺皮質中合成。如本文所用，術語「糖皮質激素」及「糖皮質類固醇」可互換使用。糖皮質激素包括但不限於黃體酮型糖皮質激素、氫化可體松型糖皮質激素、美達松型糖皮質激素及丙酮化物型糖皮質激素。糖皮質激素包括但不限於倍他米松、布地奈德、可的松、地夫可特、脫氧皮質酮、地塞米松、氟氫可體松、氫化可體松(皮質醇)、氯替潑諾、甲基強的松龍、潑尼松龍、潑尼松及曲安西龍，及其衍生物及類似物。
因此，在一些實施例中，本發明之類固醇抗性細胞(例如，基因編輯之類固醇抗性多能幹細胞、類固醇抗性造血細胞或其前體細胞)經遺傳編輯(如藉由經由核苷酸結合試劑(例如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)、Cas9直向同源物、旁系同源物、Cas相關家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶候選物)進行之一種或多種DNA或RNA鹼基改變，插入、缺失、取代或轉化來定義，該核苷酸結合試劑靶向NR3C1基因座，導致NR3C1表現之破壞或擾動(例如，藉由將插入缺失及/或取代引入NR3C1基因座(以便包括調節區、外顯子及內含子))，其中該類固醇抗性細胞對一種或多種糖皮質激素具有抗性，該糖皮質激素選自黃體酮型糖皮質激素、氫化可體松型糖皮質激素、美達松型糖皮質激素及丙酮化物型糖皮質激素組成之群。在一些實施例中，本發明之類固醇抗性細胞經遺傳編輯以破壞NR3C1之表現，其中該類固醇抗性細胞對選自以下各者組成之群之一種或多種糖皮質激素具有抗性：倍他米松、布地奈德、可體松、地夫可特、脫氧皮質酮、地塞米松、氟氫可體松、氫化可體松(皮質醇)、氯替潑諾、甲基強的松龍、潑尼松龍、潑尼松及曲安西龍，及其衍生物及類似物。在某些實施例中，對本發明之類固醇抗性細胞進行遺傳編輯以破壞NR3C1之表現，其中類固醇抗性細胞對地塞米松具有抗性。
在一些實施例中，本發明之類固醇抗性細胞(例如，基因編輯之類固醇抗性多能幹細胞、類固醇抗性造血細胞或其前體細胞)在類固醇(例如，地塞米松)存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，經基因編輯以破壞NR3C1之表現(例如，藉由將插入缺失及/或取代引入NR3C1基因座(以便包括調節區、外顯子及內含子))之類固醇抗性細胞在類固醇存在下表現出增加之細胞存活。在某些實施例中，遺傳編輯以破壞NR3C1表現之類固醇抗性細胞在地塞米松存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，細胞存活之增加為至少105%、至少110%、至少115%、至少120%、至少125%、至少130%、至少135%、至少140%、 至少145%、至少150%、至少155%、至少160%、至少165%、至少170%、至少175%、至少180%、至少185%、至少190%、 至少195%、至少200%、至少205%、至少210%、至少215%、至少220%、至少225%、至少230%、至少235%、至少240%、 至少245%、至少250%、至少255%、至少260%、至少265%、至少270%、至少275%、至少280%、至少285%、至少290%、 至少295%、至少300%、至少350%、至少400%或更多。 鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞
如本文所述，當治療患有移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之受試者時，鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)代表護理預防之標準，並且可以降低效應T細胞(Teff)功能以及直接抑制Treg持久性及功能。鈣調神經磷酸酶抑制劑可直接影響細胞之存活，例如，在類固醇地塞米松存在下Treg之存活率大大降低。
本發明提供了CNI抗性細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、CNI抗性調節性T細胞(Treg)、CNI抗性造血細胞或其前體細胞)。如本文所用，「鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性」細胞係指對CNI(例如環孢菌素)之作用具有抗性之細胞。當與CNI接觸時，本發明之CNI抗性細胞表現出極小至無生理變化。有效地，CNI抗性細胞不與CNI相互作用(例如，結合)。評估CNI抗性細胞是否對CNI之作用具有抗性之各種方法係此項技術中已知的。例如，在CNI存在下細胞之存活可以使用細胞計數技術或基於報道基因之技術測量。技藝人士將能夠使用此項技術中已知之各種方法確定CNI對CNI抗性細胞之影響。
鈣調神經磷酸酶係異二聚體鈣及鈣調蛋白依賴性絲胺酸-蘇胺酸磷酸酶，該磷酸酶對T細胞活化係至關重要的。在T細胞受體結合後，鈣調神經磷酸酶使轉錄因子NFAT(活化T細胞之核因子)去磷酸化，使其易位至細胞核並活化關鍵靶基因，如IL-2(白細胞介素2)。與FKBP12(FK506結合蛋白)複合之FK506(他克莫司；藤黴素)或與CyPA(親環蛋白A)複合之CsA(環孢菌素A)阻斷NFAT進入鈣調神經磷酸酶之活性位點，阻止其去磷酸化，從而抑制T細胞活化。鈣調神經磷酸酶由兩個亞基形成：A係負責其磷酸酶活性之催化亞基(CnA)，及B係對細胞內鈣特別敏感並調節CnA活化之調節亞基(CnB)。
鈣調神經磷酸酶係稱為鈣調神經磷酸酶抑制劑之一類藥物之靶標，該等抑制劑包括但不限於環孢菌素、伏孢素、吡美莫司及他克莫司，及其衍生物及類似物。鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor; CNI)結合稱為親免蛋白之細胞內蛋白：在環孢菌素A(CsA；在此項技術中也稱為環孢菌素)的情況下為親環蛋白，並且在他克莫司(也稱為FK506)的情況下為FK結合蛋白。然後該複合物與鈣調神經磷酸酶結合，導致其活性受到抑制，從而抑制T細胞活化。環孢菌素係具有N-甲基化胺基酸之環狀十一胺基酸多肽，使得該分子對胃腸道之失活具有抗性，因此可用作口服免疫抑制藥物。伏孢素係環孢菌素之類似物，具有增強之針對鈣調神經磷酸酶之作用及更高之代謝穩定性。他克莫司(FK506；藤黴素)係大環內酯類抗生素。吡美莫司及他克莫司屬子囊黴素類之大環內醯胺免疫抑制劑，該等免疫抑制劑藉由鈣調神經磷酸酶途徑抑制T細胞活化及抑制許多炎性細胞因子之釋放來起作用。
在一些實施例中，如本文所述，CNI抗性可以藉由向細胞中引入鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因來實現。因此，本發明提供了對CNI具有抗性之修飾細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、修飾之CNI抗性Treg)。在一些實施例中，修飾細胞以表現鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因。當細胞被修飾以表現CNI抗性基因時，可以進一步修飾細胞以破壞內源鈣調神經磷酸酶基因之表現。
在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因包括鈣調神經磷酸酶之變體，該變體已經在關鍵胺基酸殘基處被修飾以破壞FK506-FKBP12及CsA-CyPA之一或兩者之對接以產生對FK506及/或CsA具有抗性之鈣調神經磷酸酶突變體。本發明之鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因可以係編碼對鈣調神經磷酸酶抑制劑如FK506及/或CsA具有抗性之鈣調神經磷酸酶變體之核酸序列。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體結合FK506但不結合鈣調神經磷酸酶，導致藥物之隔離及鈣調神經磷酸酶抑制之預防。
在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體可以在選自由V314、Y341、M347、T351、W352、L354及K360組成之群中之一個或多個位置處包含野生型鈣調神經磷酸酶異二聚體A之一個或多個取代。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體可包含野生型鈣調神經磷酸酶異二聚體A之雙重取代，例如，在位置T351及L354，或V314及Y341。在一些實施例中，341位之纈胺酸殘基可以用離胺酸或精胺酸殘基取代，341位之酪胺酸殘基可以用苯丙胺酸殘基取代；347位之蛋胺酸可以被麩胺酸、精胺酸或色胺酸殘基取代；351位之蘇胺酸可以用麩胺酸殘基取代；352位之色胺酸殘基可以被半胱胺酸、麩胺酸或丙胺酸殘基取代，353位之絲胺酸可以被組胺酸或天冬醯胺殘基取代，354位之白胺酸可以被丙胺酸殘基取代；360位之離胺酸可以用SEQ ID NO：1之丙胺酸或苯丙胺酸殘基取代。本文描述之胺基酸位置之對應通常以SEQ ID NO：1(GenBank：ACX34092.1)中所示之野生型人鈣調神經磷酸酶異二聚體A多肽形式之胺基酸之位置表示。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體可以在選自V120、N123、L124或K125組成之群之一個或多個位置包含野生型鈣調神經磷酸酶異二聚體B之一個或多個取代。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體可包含野生型鈣調神經磷酸酶異二聚體B之雙重取代，例如，在位置L124及K125。在一些實施例中，120位之纈胺酸可以用絲胺酸、天冬胺酸、苯丙胺酸或白胺酸殘基取代；123位之天冬醯胺可以被色胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、精胺酸、組胺酸或絲胺酸取代；124位之白胺酸可以用蘇胺酸殘基取代；125位之離胺酸可以用丙胺酸、麩胺酸、色胺酸取代，或兩個殘基如白胺酸-精胺酸或異白胺酸-麩胺酸可以在胺基酸序列SEQ ID NO：2中125位之離胺酸後添加。本文描述之胺基酸位置之對應通常以SEQ ID NO：2(GenBank：ACX34095.1)中所示之野生型人鈣調神經磷酸酶異二聚體B多肽形式之胺基酸之位置表示。鈣調神經磷酸酶變體描述於Brewin等，2009, Blood, 114(23): 47924803，該文獻以引用方式整體併入本文。
在某些實施例中，修飾本發明之CNI抗性細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、CNI抗性造血細胞或其前體細胞)以表現鈣調神經磷酸酶之變體。在某些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體選自由以下組成之群：CNa12 (SEQ ID NO:3；GenBank: GQ463594.1)、CNa22 (SEQ ID NO:4；GenBank: GQ463595.1)及CNb30 (SEQ ID NO:5；GenBank: GQ463597.1)。
鈣調神經磷酸酶及鈣調神經磷酸酶抑制劑之靶標係轉錄因子NFAT，該NFAT在CD28下游被活化並且係Treg發育所必需的。在一些實施例中，可以藉由基因編輯一種或多種內源表現之NFAT基因來實現CNI抗性。因此，本發明提供了基因編輯之CNI抗性細胞(例如，基因編輯之類固醇抗性Treg)。在一些實施例中，對細胞進行遺傳編輯以破壞一種或多種NFAT基因之表現，其中該破壞導致一種或多種內源表現基因之表現之減少、缺失、消除、敲除或破壞，從而賦予細胞CNI抗性。
在一些實施例中，對本發明之CNI抗性細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、CNI抗性造血細胞或其前體細胞)進行遺傳編輯以破壞一種或多種NFAT基因之表現。NFAT轉錄因子家族包括五個成員：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4及NFAT5。NFAT c1-c4受鈣信號傳導調節，並且被稱為NFAT家族之經典成員。活化之鈣調神經磷酸酶迅速使NFAT蛋白之富含絲胺酸之區域及胺基末端之SP重複序列去磷酸化，導致構形變化，從而暴露核定位信號，導致NFAT核輸入。在一些實施例中，對本發明之CNI抗性細胞進行遺傳編輯以破壞選自NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4及NFAT5組成之群之一種或多種內源表現之基因。在某些實施例中，對本發明之CNI抗性細胞進行遺傳編輯以破壞選自NFATc1、NFATc2及NFATc4組成之群之一種或多種內源表現之基因。
在一些實施例中，修飾本發明之CNI抗性細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、CNI抗性造血細胞或其前體細胞)以表現阻斷所有NFAT同種型活性之NFAT抑制劑。在一些實施例中，修飾CNI抗性細胞以表現包含VIVIT肽(SEQ ID NO：6)之NFAT抑制劑。此項技術中已知各種能夠抑制NFAT活性之含有VIVIT肽之試劑。在一些實施例中，例如，含有VIVIT肽之試劑係鈣調神經磷酸酶介導之NFAT活化之抑制劑，該抑制劑包含SEQ ID NO：67中所示之序列(可在全球資訊網上之tocris.com/products/nfat-inhibitor_3930獲得)。
在一些實施例中，本發明之CNI抗性細胞(例如，CNI抗性多能幹細胞、CNI抗性造血細胞或其前體細胞)在CNI(例如，CsA)存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，修飾CNI抗性細胞以表現鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因，並且CNI抗性細胞在CNI存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，本發明之CNI抗性細胞在存在選自環孢菌素、伏孢素、吡美莫司及他克莫司及其衍生物及類似物組成之群之CNI之情況下表現出增加之細胞存活。在某些實施例中，經修飾以表現鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因之CNI抗性細胞在CsA及/或他克莫司(FK506)及其衍生物及類似物存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，細胞存活之增加為至少105%、至少110%、至少115%、至少120%、至少125%、至少130%、至少135%、至少140%、 至少145%、至少150%、至少155%、至少160%、至少165%、至少170%、至少175%、至少180%、至少185%、至少190%、 至少195%、至少200%、至少205%、至少210%、至少215%、至少220%、至少225%、至少230%、至少235%、至少240%、 至少245%、至少250%、至少255%、至少260%、至少265%、至少270%、至少275%、至少280%、至少285%、至少290%、 至少295%、至少300%、至少350%、至少400%或更多。 糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞
如本文所述，糖皮質激素抗性可藉由破壞內源表現之NR3C1基因來實現。鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性可以藉由向細胞中引入鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因(例如鈣調神經磷酸酶之變體)來實現。
本發明提供糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞(例如，糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性多能幹細胞、糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性造血細胞或其前體細胞)。修飾此類細胞以破壞NR3C1之表現(例如，藉由將插入缺失及/或取代引入NR3C1基因座(以便包括調節區、外顯子及內含子)，以及表現CNI抗性基因。在一些實施例中，本發明之糖皮質激素及CNI抗性細胞係經修飾以破壞NR3C1表現，並且進一步修飾以表現CNI抗性基因(例如鈣調神經磷酸酶變體)之細胞。在一些實施例中，CNI抗性基因可以藉由靶向或隨機整合來整合到細胞之基因組中。靶向及隨機整合之各種方法在此項技術中係已知的並且在本文中描述。在某些實施例中，CNI抗性基因整合到細胞之基因組中，進入NR3C1基因座內之靶向位點。在一些實施例中，CNI抗性基因整合到NR3C1基因座外之細胞基因組中。當CNI抗性基因整合到NR3C1基因座外之細胞基因組中時，可能需要選擇不將CNI抗性基因整合到基因組之編碼區中之引入方法(例如，CNI抗性基因可能需要整合到基因組之非編碼區中)。
在某些實施例中，本發明之糖皮質激素及CNI抗性細胞(例如，糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性多能幹細胞、糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性造血細胞或其前體細胞)係經修飾以破壞NR3C1表現(例如，藉由將插入缺失及/或取代引入NR3C1基因座(以便包括調節區、外顯子及內含子)，並進一步修飾以在NR3C1基因座內表現CNI抗性基因(例如，鈣調神經磷酸酶變體)之細胞。使此等細胞對糖皮質激素(例如地塞米松)及鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如CsA及/或FK506)具有抗性。在一些實施例中，經修飾以破壞NR3C1之表現並表現CNI抗性基因(例如鈣調神經磷酸酶變體)之糖皮質激素及CNI抗性細胞在糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑及其衍生物及類似物存在下表現出增加之細胞存活。在一些實施例中，在糖皮質激素(例如，地塞米松)或其衍生物及類似物存在下細胞存活之增加為至少105%、至少110%、至少115%、至少120%、至少120%、至少125%、至少130%、至少135%、至少140%、至少145%、至少150%、至少155%、至少160%、至少165%、至少170%、至少170% 至少175%、至少180%、至少185%、至少190%、至少195%、至少200%、至少205%、至少210%、至少215%、至少220%、至少220% 至少225%、至少230%、至少235%、至少240%、至少245%、至少250%、至少255%、至少260%、至少265%、至少270%、至少270%、275%、至少280%、至少285%、至少290%、至少295%、至少300%、至少350%、至少400%或更多。在一些實施例中，在CNI(例如，FK506、CsA)或其衍生物及類似物存在下細胞存活之增加為至少105%、至少110%、至少115%、至少120%、 至少125%、至少130%、至少135%、至少140%、至少145%、至少150%、至少155%、至少160%、至少165%、至少170%、 至少175%、至少180%、至少185%、至少190%、至少195%、至少200%、至少205%、至少210%、至少215%、至少220%、 至少225%、至少230%、至少235%、至少240%、至少245%、至少250%、至少255%、至少260%、至少265%、至少270%、 至少275%、至少280%、至少285%、至少290%、至少295%、至少300%、至少350%、至少400%或更多。 其他免疫抑制藥物抗性細胞
在患病受試者中治療及控制GVHD期間可以使用其他免疫抑制藥物。與糖皮質激素及CNI一樣，此等免疫抑制藥物也可能降低Treg之持久性及功能。
例如，西羅莫司(雷帕黴素)、依維莫司及其類似物及衍生物(也稱為雷帕黴素類似物)屬雷帕黴素家族，並且可以在例如用於實體器官移植及造血幹細胞移植之免疫抑制治療中使用。此等雷帕黴素家族免疫抑制劑藉由與細胞內受體FKBP12結合來抑制哺乳動物雷帕黴素靶蛋白(mTOR)。FKBP12-雷帕黴素複合物直接結合至mTOR之FKBP12-雷帕黴素結合(FKBP12-Rapamycin Binding; FRB)結構域，從而抑制其活性。在一些實施例中，本發明之免疫抑制藥物抗性細胞對mTOR抑制具有抗性(例如，mTOR抑制劑抗性Treg)。本發明之mTOR抑制劑抗性細胞可包括但不限於經修飾以防止FKBP12-雷帕黴素複合物形成之細胞(例如，FKBP12中之特異性突變)，以及經修飾以防止FKBP12-雷帕黴素複合物結合至FRB結構域之細胞(例如，FRB結構域中之特異性突變)。由於mTOR途徑係充分研究之生物途徑，因此各種實現對mTOR抑制之抗性之方法係熟習此項技術者已知的。
免疫抑制藥物之另一個實例係黴酚酸(也稱為黴酚酸酯(mycophenolate))。黴酚酸係一種有效、可逆、非競爭性之肌苷-5'-單磷酸脫氫酶(Inosine-5′-monophosphate dehydrogenase; IMPDH)抑制劑，該酶係從肌苷-5'-單磷酸(inosine-5'-monophosphate; IMP)從頭合成鳥苷-5'-單磷酸(guanosine-5'-monophosphate; GMP)所必需之酶。另一種免疫抑制藥物係甲胺蝶呤(以前稱為胺甲蝶呤)。甲胺蝶呤係抗葉酸劑類型之抗代謝物，並且可以抑制二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase; DHFR)，該酶係參與四氫葉酸合成之酶。因此，在一些實施例中，本發明之免疫抑制藥物抗性細胞對黴酚酸及/或甲胺蝶呤及其類似物及衍生物具有抗性(例如，黴酚酸及/或甲氧喋呤抗性Treg)。本發明之黴酚酸及/或甲胺蝶呤抗性細胞可包括，例如，經修飾以表現含有取代L22F及F31S之人DHFR變體，及/或表現含有取代T333I及S351Y之肌苷單磷酸脫氫酶II之變體(IMPDH2)之細胞。
免疫抑制藥物之其他實例包括但不限於氟達拉濱、噴司他丁(脫氧助間型黴素)及環磷醯胺(cyclophosphamide )(環磷醯胺(cytophosphane))。氟達拉濱係嘌呤類似物，並且藉由干擾核糖核苷酸還原酶及DNA聚合酶來抑制DNA合成。噴司他丁係嘌呤類似物，並且模仿核苷腺苷並抑制腺苷脫胺酶，從而干擾細胞處理DNA之能力。環磷醯胺藉由混合功能氧化酶(例如細胞色素P450系統)轉化為活性代謝物，包括但不限於4-羥基環磷醯胺及磷醯胺氮芥。磷醯胺氮芥在DNA鏈之間以及在DNA鏈內之鳥嘌呤N-7位置處形成DNA交聯(分別稱為鏈間及鏈內交聯)。對此等藥物之抗性機制係此項技術中已知的，並且可用於產生本發明之免疫抑制藥物抗性細胞，例如對氟達拉濱、噴司他丁，及/或環磷醯胺具有抗性之經修飾之細胞(例如，經修飾之造血細胞或其前體細胞)。C. 生產修飾細胞之方法
對本發明之細胞進行遺傳編輯以破壞本文所述之任何內源基因之表現。因此，在一些實施例中，對本發明之修飾細胞(例如，包含鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因之修飾細胞)進行遺傳編輯以破壞本文所述之一種或多種內源基因之表現。
各種基因編輯技術係熟習此項技術者已知的。基因編輯技術包括但不限於歸巢內切核酸酶、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease; ZFN)、轉錄活化因子樣效應物(transcription activator-like effector; TALE)核酸酶(TALEN)、聚集之規則間隔短迴文重複序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat; CRISPR)-CRISPR相關蛋白9(Cas9)基因組編輯系統及CRISPR-Cpf1基因組編輯系統。歸巢核酸內切酶通常將其DNA受質切割為二聚體，並且不具有不同之結合及切割結構域。ZFN識別由兩個鋅指結合位點組成之靶位點，該等鋅指結合位點位於FokI切割結構域識別之5至7鹼基對(bp)間隔區序列之側翼。TALEN識別由兩個TALE DNA結合位點組成之靶位點，該等結合位點位於由FokI切割結構域識別之12至20 bp間隔區序列之側翼。Cas9核酸酶靶向與位於DNA螺旋之任一鏈上可能存在之相容前間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif; PAM)上游之單指導RNA(gRNA)內之靶向序列互補之DNA序列。因此，熟習此項技術者將能夠為本發明選擇合適之基因編輯技術。
在一些態樣，藉由使用對於被破壞之基因(例如，NR3C1)具有特異性之RNA指導之核酸酶(例如CRISPR-Cas系統，例如CRISPR-Cas9系統或CRISPR-Cpf1系統)之基因編輯來進行破壞。在一些實施例中，將包含Cas9及包含靶向遺傳基因座區域之靶向結構域之指導RNA(gRNA)之試劑引入細胞中。在一些實施例中，該試劑係或包含Cas9多肽及gRNA(Cas9/gRNA RNP)之核糖核蛋白(ribonucleoprotein; RNP)複合物。在一些實施例中，引入包括在活體外使試劑或其部分與細胞接觸，該接觸可包括培養或溫育細胞及試劑達24、36或48小時或3、4、5、6、7或8天。在一些實施例中，引入進一步可以包括實現試劑向細胞中之遞送。在各種實施例中，根據本發明之方法、組合物及細胞利用Cas9及gRNA之核糖核蛋白(RNP)複合物直接遞送至細胞，例如藉由電穿孔。在一些實施例中，RNP複合物包括已被修飾為包含3'多聚腺苷酸尾及5'抗反向帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog; ARCA)帽之gRNA。
CRISPR/Cas9系統係用於誘導靶向遺傳改變之簡便且有效之系統。Cas9蛋白之靶標識別需要在指導RNA(gRNA)內之「種子」序列及在gRNA結合區上游之含有保守二核苷酸之前間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif; PAM)序列。因此，可以藉由重新設計gRNA細胞來對CRISPR/Cas9系統進行工程改造以切割幾乎任何DNA序列。CRISPR/Cas9系統可以藉由將單個Cas9蛋白與兩個或更多個gRNA共表現來同時靶向多個基因組基因座，使得該系統適合於多基因編輯或靶基因之協同活化。
Cas9蛋白及指導RNA形成識別及切割靶序列之複合物。Cas9由六個結構域組成：REC I、REC II、橋螺旋、PAM相互作用、HNH及RuvC。REC I結構域結合指導RNA，而橋螺旋結合至靶DNA。HNH及RuvC結構域係核酸酶結構域。將指導RNA設計成具有與靶DNA序列互補之5'末端。在指導RNA與Cas9蛋白結合後，發生構形變化，從而活化蛋白質。一旦活化，Cas9藉由與匹配其前間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif; PAM)序列之序列結合來搜索靶DNA。PAM係與指導RNA互補之區域下游之一個核苷酸內之兩個或三個核苷酸鹼基序列。在一個非限制性實例中，PAM序列係5'-NGG-3'。當Cas9蛋白質用適當之PAM發現其靶序列時，它融化PAM上游之鹼基並將它們與指導RNA上之互補區域配對。然後RuvC及HNH核酸酶結構域在PAM上游之第三個核苷酸鹼基之後切割靶DNA。
用於抑制基因表現之CRISPR/Cas系統之一個非限制性實例，CRISPR干擾(CRISPRi)描述於美國專利申請公開案第US20140068797號。CRISPRi利用缺乏內切核酸酶活性之催化性失效之Cas9。當與指導RNA共表現時，產生DNA識別複合物，該複合物特異性地干擾轉錄延伸、RNA聚合酶結合或轉錄因子結合。該CRISPRi系統有效抑制靶基因之表現。
當將對於靶基因具有特異性之指導核酸序列及Cas內切核酸酶引入細胞並形成能夠使Cas內切核酸酶在靶基因處引入雙鏈斷裂之複合物時，發生CRISPR/Cas基因破壞。在某些實施例中，CRISPR/Cas系統包含表現載體，例如但不限於pAd5F35-CRISPR載體。在其他實施例中，Cas表現載體誘導Cas9內切核酸酶之表現。也可以使用其他內切核酸酶，包括但不限於Cas12a(Cpf1)、T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、此項技術中已知之其他核酸酶，及其任何組合。
在某些實施例中，CRISPR/Cas系統可包含具有改變活性之Cas9變體。示例性變體Cas9核酸酶包括但不限於Cas9切口酶 (nCas9)、催化性失效之Cas9 (dCas9)、超準確之Cas9 (HypaCas9) (Chen等人Nature 550(7676), 407-410 (2017))、高保真度 Cas9 (Cas9-HF) (Kleinstiver等人 Nature 529(7587), 490-495 (2016))、增強之特異性Cas9 (eCas9) (Slaymaker等人 Science 351(6268), 84-88 (2016))，及擴增之PAM Cas9 (xCas9) (Hu等人 Nature doi: 10.1038/nature26155 (2018))。
在某些實施例中，誘導Cas表現載體包括將細胞暴露於活化Cas表現載體中誘導型啟動子之試劑。在此類實施例中，Cas表現載體包括誘導型啟動子，例如藉由暴露於抗生素(例如，藉由四環素或四環素之衍生物，例如多西環素)可誘導之啟動子。也可以使用熟習此項技術者已知之其他誘導型啟動子。誘導劑可以係選擇性條件(例如，暴露於試劑，例如抗生素)，該選擇性條件導致誘導型啟動子之誘導。此導致Cas表現載體之表現。
如本文所用，術語「指導RNA」或「gRNA」係指促進RNA指導之核酸酶(例如Cas9)與細胞中之靶序列(例如基因組或附加型序列)特異性結合(或「靶向」)之任何核酸。熟習此項技術者將理解，可以用尿嘧啶或「U」核苷酸代替胸腺嘧啶或「T」核苷酸來列舉gRNA序列。
如本文所用，「模組化」或「雙RNA」指導包含多於一種，通常兩種獨立之RNA分子，例如CRISPR RNA(crRNA)及反式活化crRNA(tracrRNA)，該等分子通常例如藉由雙工來彼此締合。在整個文獻中描述了gRNA及其組成部分 (參見，例如Briner等人 Mol. Cell, 56(2), 333-339 (2014), 該文獻以引用方式併入本文)。
如本文所用，「單分子gRNA」、「嵌合gRNA」或「單指導RNA(sgRNA)」包含單個RNA分子。sgRNA可以係連接在一起之crRNA及tracrRNA。例如，crRNA之3'末端可以與tracrRNA之5'末端連接。可以將crRNA及tracrRNA連接成單個單分子或嵌合gRNA，例如，藉由橋接crRNA(在其3'末端)及tracrRNA(在其5'末端)之互補區域之4個核苷酸(例如，GAAA)「四環」或「接頭」序列。
如本文所用，「重複」序列或區域係crRNA之3'末端或其附近之核苷酸序列，該序列與tracrRNA之抗重複序列互補。
如本文所用，「抗重複」序列或區域係tracrRNA之5'末端或其附近之核苷酸序列，該序列與crRNA之重複序列互補。
關於指導RNA結構及功能，包括用於基因組編輯之gRNA/Cas9複合物之其他細節，至少可以在以下文獻找到：Mali等人 Science, 339(6121), 823826 (2013)；Jiang等人 Nat.Biotechnol. 31(3). 233-239 (2013)；及Jinek等人 Science, 337(6096), 816-821 (2012)；該等文獻以引用方式併入本文。
如本文所用，「指導序列」或「靶向序列」係指gRNA之核苷酸序列，無論係單分子或係模組的，該序列與需要編輯之細胞之基因組中之DNA序列內之靶結構域或靶多核苷酸完全或部分互補。指導序列之長度通常為10-30個核苷酸，較佳長度為16-24個核苷酸(例如，長度為16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸)，並且位於或接近Cas9 gRNA之5'末端。
如本文所用，「靶結構域」或「靶多核苷酸序列」或「靶序列」係與gRNA之指導序列互補之細胞基因組中之DNA序列。
在形成CRISPR複合物之情形下，「靶序列」係指指導序列被設計為與其具有一些互補性之序列，其中靶序列與指導序列之間之雜交促進CRISPR複合物之形成。如果存在足夠之互補性以引起雜交並促進CRISPR複合物之形成，則不一定需要完全互補。靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在某些實施例中，靶序列位於細胞之細胞核或細胞質中。在其他實施例中，靶序列可以在真核細胞之細胞器內，例如線粒體或細胞核。通常，在CRISPR系統之情形下，CRISPR複合物(包含與靶序列雜交並與一種或多種Cas蛋白複合之指導序列)之形成導致在靶序列中或附近(例如，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對內)之一條或兩條鏈之切割。與靶序列一樣，認為不需要完全互補，只要此互補足以起作用。
在某些實施例中，將驅動CRISPR系統之一種或多種元件之表現之一種或多種載體引入宿主細胞(例如，多能幹細胞)中，使得CRISPR系統之元件之表現引導在一個或多個靶位點處之CRISPR複合物之形成。例如，Cas核酸酶、crRNA及tracrRNA可以各自與分開之載體上之單獨調節元件可操作地連接。如本文所用，術語「可操作地連接」係指核酸序列在單個核酸片段上之締合，使得一個核酸序列之功能受另一個核酸片段之影響。例如，當啟動子能夠影響該編碼序列之表現時(即，編碼序列在啟動子之轉錄控制下)，啟動子與編碼序列可操作地連接。
或者，可以將由相同或不同調節元件表現之兩種或更多種元件組合在單個載體中，其中一種或多種另外之載體提供不包括在第一載體中之CRISPR系統之任何組分。組合在單個載體中之CRISPR系統元件可以以任何合適之定向排列，例如一個元件相對於第二元件位於5'(「上游」)或相對於第二元件位於3'(「下游」)。一個元件之編碼序列可以位於第二元件之編碼序列之相同或相反之鏈上，並且以相同或相反之方向來定向。在某些實施例中，單個啟動子驅動編碼CRISPR酶之轉錄物及嵌入一個或多個內含子序列內之指導序列、tracr配對序列(視情況地與指導序列可操作地連接)及tracr序列中之一個或多個之表現(例如，每一者在不同之內含子中、兩個或更多個在至少一個內含子中，或全部在單個內含子中)。
在某些實施例中，CRISPR酶係包含一個或多個異源蛋白結構域之融合蛋白之一部分(例如，除了CRISPR酶之外，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個結構域)。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外之蛋白質序列，並且視情況地包含任何兩個結構域之間之接頭序列。可以與CRISPR酶融合之蛋白質結構域之實例包括但不限於表位標籤、報道基因序列及具有一種或多種以下活性之蛋白質結構域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA切割活性及核酸結合活性。可以形成包含CRISPR酶之融合蛋白之一部分之其他結構域描述於美國專利申請公開案第US20110059502號，該公開案以引用方式併入本文。在某些實施例中，經標記之CRISPR酶用於鑑定靶序列之位置。
常規之基於病毒及非病毒之基因轉移方法可用於在哺乳動物及非哺乳動物細胞(例如人多能幹細胞)或靶組織中引入核酸。此類方法可用於將編碼CRISPR系統組分之核酸投與培養中之細胞或宿主生物中之細胞。非病毒載體遞送系統包括DNA質粒、RNA(例如，本文所述載體之轉錄物)、裸核酸及與遞送媒劑例如脂質體複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，該等病毒在遞送至細胞後具有附加型或整合之基因組 (Anderson, 1992, Science 256:808-813；及Yu等人, 1994, Gene Therapy 1:13-26)。
在一些實施例中，CRISPR/Cas衍生自II型CRISPR/Cas系統。在其他實施例中，CRISPR/Cas系統衍生自Cas9核酸酶。可以在本發明中使用之示例性Cas9核酸酶包括但不限於化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)、金黃色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、嗜熱鏈球菌Cas9(StCas9)、腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9(NmCas9) 、空腸彎曲桿菌Cas9(CjCas9)及地芽孢桿菌Cas9(GeoCas9)。
通常，Cas蛋白包含至少一個RNA識別及/或RNA結合結構域。RNA識別及/或RNA結合結構域與指導RNA相互作用。Cas蛋白還可以包含核酸酶結構域(即，DNA酶或RNA酶結構域)、DNA結合結構域、解旋酶結構域、RNA酶結構域、蛋白質-蛋白質相互作用結構域、二聚化結構域以及其他結構域。可以修飾Cas蛋白以增加核酸結合親和力及/或特異性、改變酶活性，及/或改變蛋白質之另一性質。在某些實施例中，融合蛋白之Cas樣蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其他實施例中，Cas可以衍生自修飾之Cas9蛋白。例如，可以修飾Cas9蛋白之胺基酸序列以改變蛋白質之一種或多種性質(例如，核酸酶活性、親和力、穩定性等)。或者，可以從蛋白質中除去不參與RNA指導之切割之Cas9蛋白質之結構域，使得修飾之Cas9蛋白質小於野生型Cas9蛋白質。通常，Cas9蛋白包含至少兩個核酸酶(即DNA酶)結構域。例如，Cas9蛋白可包含RuvC樣核酸酶結構域及HNH樣核酸酶結構域。RuvC及HNH結構域共同作用以切割單鏈以在DNA中產生雙鏈斷裂。(Jinek等人, 2012, Science, 337:816-821)。在某些實施例中，可以修飾Cas9衍生之蛋白質以僅含有一個功能性核酸酶結構域(RuvC樣或HNH樣核酸酶結構域)。例如，可以修飾Cas9衍生之蛋白質，使得一個核酸酶結構域缺失或突變，使得它不再起作用(即，不存在核酸酶活性)。在其中一個核酸酶結構域係無活性之一些實施例中，Cas9衍生之蛋白質能夠將切口引入雙鏈核酸(此蛋白質被稱為「切口酶」)，但不切割雙鏈DNA。在任何上述實施例中，任何或所有核酸酶結構域可以使用眾所周知之方法，例如定點誘變、PCR介導之誘變及總基因合成，以及此項技術中已知之其他方法藉由一種或多種缺失突變、插入突變及/或取代突變來失活。
如本文所用，「鹼基編輯器」係蛋白質或融合蛋白，其包含能夠結合指導RNA之CRISPR失活或切口DNA結合結構域，該指導RNA又藉由鏈雜交來結合靶核酸序列，並且進一步包含能夠編輯靶核酸序列鹼基之鹼基編輯結構域。在某些實施例中，CRISPR系統包含鹼基編輯器及指導RNA。
術語「鹼基編輯器」包括「下一代」鹼基編輯器，例如第三代鹼基編輯器(BE3系統)、第四代鹼基編輯器(BE4系統)及腺嘌呤鹼基編輯器。第三代鹼基編輯器(BE3系統)，其中鹼基切除修復抑制劑UGI與Cas9切口酶融合，切割未修飾之DNA鏈，以便鼓勵細胞使用編輯之鏈作為錯配修復之模板。結果，細胞使用含有U之鏈(藉由胞苷脫胺作用來引入)作為模板來修復DNA，複製鹼基編輯。第四代鹼基編輯器(BE4系統)使用兩個拷貝之鹼基切除修復抑制劑UGI。已經開發出腺嘌呤鹼基編輯器(ABE)，該等編輯器有效地將靶向之A•T鹼基對轉化為基因組DNA中之G•C(人細胞中0-100%之效率)，具有高產物純度(通常至少99.9%)及低插入缺失率(通常不超過1%)。參見，例如Gaudelli等人,Nature 551:464-471 (2017)。應當理解，其他鹼基編輯器，包括在ATG「起始」密碼子處引入無效突變以破壞靶基因表現之彼等編輯器適合根據本文所述之方法使用。
鹼基編輯器可包含可結合指導RNA之任何合適之CRISPR失活或切口DNA結合結構域。在一些實施例中，CRISPR失活或切口DNA結合結構域係Cas9核酸酶，該核酸酶使兩個DNA切割結構域中之一者失活，即Cas9係切口酶。核酸酶失活之Cas9蛋白可稱為「dCas9」蛋白(對於核酸酶-「失效」Cas9)。產生具有無活性DNA切割結構域之Cas9蛋白(或其片段)之方法係已知的(參見，例如Jinek等人, Science. 337:816-821(2012)；Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence- Specific Control of Gene Expression」 (2013) Cell. 28；152(5):1173-83，該等文獻中之每一者之全部內容以引用方式併入本文)。例如，已知Cas9之DNA切割結構域包括兩個亞結構域，即HNH核酸酶亞結構域及RuvC1亞結構域。HNH亞結構域切割與gRNA互補之鏈，而RuvC1亞結構域切割非互補鏈。此等亞結構域內之突變可以使Cas9之核酸酶活性沉默。例如，突變D10A及H840A完全使化膿性鏈球菌Cas9之核酸酶活性失活 (Jinek等人, Science. 337:816- 821(2012)；Qi等人, Cell. 28；152(5):1173-83 (2013))。合適之CRISPR失活或切口DNA結合結構域包括但不限於核酸酶非活性之變體Cas9結構域，包括如WO2015089406A1中所述之D10A、D10A/D839A/H840A及D10A/D839A/H840A/N863A突變結構域，該文獻以引用方式併入本文。
一旦引入靶細胞或基因組，CRISPR失活或切口DNA結合結構域(例如，核酸酶失活之Cas9)藉由結合與其前間隔區相鄰基序(PAM)序列匹配之序列來搜索靶DNA。在一些實施例中，CRISPR失活或切口DNA結合結構域可識別非經典PAM序列(例如，非NGG PAM序列)。此等PAM序列係此項技術中已知的，包括例如但不限於：5'-NGA-3'；5'-NGCG-3'；5'-NGAG-3'；5'-NNGRRT-3'；及5'-NNNRRT-3'。具有此項技術中知識之技藝人士將能夠確定由給定CRISPR核酸酶識別之合適之PAM序列。
術語「鹼基編輯結構域」係指包含能夠對核酸序列(例如，DNA或RNA)內之鹼基(例如，A、T、C、G或U)進行修飾(例如，鹼基取代)之多肽之試劑。在一些實施例中，鹼基編輯結構域係DNA編輯結構域。在一些實施例中，鹼基編輯結構域能夠使核酸內之鹼基脫胺基。在一些實施例中，鹼基編輯器能夠使DNA分子內之鹼基脫胺基。在一些實施例中，鹼基編輯結構域係脫胺酶結構域。
在一些實施例中，脫胺酶係腺苷脫胺酶。在一些實施例中，腺苷脫胺酶能夠使腺嘌呤脫胺基。在一些實施例中，腺苷脫胺酶能夠使DNA之脫氧腺苷殘基中之腺嘌呤脫胺基。腺苷脫胺酶可以衍生自任何合適之生物(例如，大腸桿菌)。在一些實施例中，腺嘌呤脫胺酶係天然存在之腺苷脫胺酶，該脫胺酶包括對應於本文提供之任何突變(例如，ecTadA中之突變)之一種或多種突變。在一些實施例中，腺苷脫胺酶來自原核生物。在一些實施例中，腺苷脫胺酶來自細菌。在一些實施例中，腺苷脫胺酶來自大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、腐敗伊氏瘧原蟲、流感嗜血桿菌、新月桿菌或枯草芽孢桿菌。在一些實施例中，腺苷脫胺酶來自大腸桿菌。在一些實施例中，合理地改造及/或逐步形成脫胺酶以獲得或增強活性。
在某些示例性實施例中，脫胺酶係胞苷脫胺酶。在一些實施例中，脫胺酶係載脂蛋白B mRNA編輯複合物(apolipoprotein B mRNA-editing complex; APOBEC)家族脫胺酶。在一些實施例中，脫胺酶係APOBEC1家族脫胺酶。在一些實施例中，脫胺酶係活化誘導之胞苷脫胺酶(activation-induced cytidine deaminase; AID)。在一些實施例中，脫胺酶係ACF1/ASE脫胺酶。在一些實施例中，脫胺酶係腺苷脫胺酶。在一些實施例中，脫胺酶係ADAT家族脫胺酶。在一些實施例中，鹼基編輯結構域與Cas9結構域之N末端融合。在一些實施例中，鹼基編輯結構域與Cas9結構域之C端融合。在一些實施例中，Cas9結構域及鹼基編輯結構域藉由接頭融合。
鹼基編輯蛋白之各種CRISPR失活或切口DNA結合結構域及鹼基編輯結構域描述於美國專利公開案第US20150166985A1號、第US20150166980A1號、第US20150166984A1號、第US20170121693A1號及第US20180073012A1號；及美國專利第9,068,179號及第9,840,699號中，所有此等專利以引用方式併入本文。
在一個非限制性實施例中，載體驅動CRISPR系統之表現。此項技術中充滿了適用於本發明之載體。待使用之載體適於複製及視情況地在真核細胞中整合。典型之載體含有可用於調節所需核酸序列表現之轉錄及翻譯終止子、起始序列及啟動子。本發明之載體也可用於核酸標準基因遞送方案。用於基因遞送之方法係此項技術中已知的(美國專利第5,399,346號、第5,580,859號及第5,589,466號，該等專利之全部內容以引用方式併入本文)。
此外，載體可以以病毒載體之形式提供給細胞。病毒載體技術在此項技術中係公知的並且例如描述於Sambrook等人 (第4版, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2012)，以及其他病毒學及分子生物學手冊。可用作載體之病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、辛德畢斯病毒、γ逆轉錄病毒及慢病毒。通常，合適之載體含有在至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、適宜限制性內切核酸酶位點及一種或多種選擇標誌物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
在一些實施例中，可以將指導RNA及Cas9或鹼基編輯器作為核糖核蛋白(RNP)複合物(例如Cas9/RNA-蛋白質複合物)遞送至細胞。RNP由與gRNA複合之純化之Cas9蛋白或純化鹼基編輯器組成，並且在此項技術中係眾所周知的，可有效遞送至多種類型之細胞，包括但不限於幹細胞及免疫細胞(Addgene, Cambridge, MA, Mirus Bio LLC, Madison, WI)。在一些實施例中，藉由電穿孔將Cas9或鹼基編輯器/RNA-蛋白質複合物遞送到細胞中。
在一些實施例中，使用CRISPR/Cas9編輯本發明之基因編輯細胞以破壞細胞(例如Treg)中之一種或多種內源基因。在一些實施例中，CRISPR/Cas9用於破壞內源NR3C1，從而導致NR3C1表現之下調。在一些實施例中，使用鹼基編輯器來鹼基編輯本發明之基因編輯細胞(例如，將取代引入細胞中)以破壞細胞(例如Treg)中之一種或多種內源基因。在一些實施例中，鹼基編輯器用於破壞內源NR3C1，從而導致NR3C1表現之下調。
如本文所述，NR3C1之下調導致對類固醇(例如糖皮質激素)之抗性。因此，在一些實施例中，本發明提供了類固醇抗性細胞(例如，糖皮質激素抗性Treg)，其中CRISPR/Cas9用於破壞內源性NR3C1，從而導致NR3C1表現之下調。因此，本發明之類固醇抗性CRISPR修飾細胞在編碼NR3C1之基因座中包含CRISPR介導之插入及/或缺失(插入缺失)，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現。因此，本發明之類固醇抗性CRISPR修飾之細胞在編碼NR3C1之基因座中包含鹼基編輯(例如，靶向鹼基取代)，其中鹼基編輯能夠消除/下調NR3C1之基因表現。
根據NCBI參考序列：NM_001018074.1，NR3C1基因座包含9個外顯子。在一些實施例中，編碼NR3C1之基因座中之CRISPR介導之插入缺失位於NR3C1之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8或外顯子9中。因此，在一些實施例中，gRNA包含與NR3C1之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8或外顯子9內之靶序列充分互補之指導序列。在某些實施例中，編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。在某些實施例中，指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。用於破壞內源性NR3C1之合適之gRNA列於表1中。在某些實施例中，指導序列與NR3C1基因中之靶序列充分互補，並且包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。 表1:
Figure 108117205-A0304-0001
在一些實施例中，化膿性鏈球菌CRISPR/Cas9鹼基編輯器介導之編碼NR3C1之基因座中之取代引入了過早終止密碼子。因此，在一些實施例中，gRNA包含與靶序列充分互補之指導序列，其中一個或多個鹼基對取代將正常野生型密碼子轉化為終止密碼子。在某些實施例中，編碼NR3C1之基因座中之取代位於NR3C1之外顯子中。在某些實施例中，指導RNA包含與NR3C1外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。用於介導導致在內源性NR3C1中引入過早終止密碼子之取代之合適之gRNA列於表2中。在某些實施例中，指導序列與NR3C1基因中之靶序列充分互補，並且包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。 表2:
Figure 108117205-A0304-0002
 *小寫字母殘基表示脫胺基位點(取代)。
在一些實施例中，編碼NR3C1之基因座中之CRISPR介導之取代位於NR3C1之剪接受體或剪接供體中。因此，在一些實施例中，gRNA包含與包含NR3C1之剪接受體或剪接供體之靶序列充分互補之指導序列。在某些實施例中，編碼NR3C1之基因座中之取代位於NR3C1之剪接受體或剪接供體處或其附近，其中該取代能夠破壞NR3C1之正常剪接，從而下調/消除NR3C1之表現。在某些實施例中，指導RNA包含與包含NR3C1之剪接受體之靶序列充分互補之指導序列。在某些實施例中，指導RNA包含與包含NR3C1之剪接供體之靶序列充分互補之指導序列。用於介導NR3C1之剪接受體或剪接供體處或附近之取代之合適之gRNA列於表3中。在某些實施例中，指導序列與NR3C1基因中之靶序列充分互補，並且包含SEQ ID NO：55-56中任一者所示之核酸序列。 表3:
Figure 108117205-A0304-0003
 *小寫字母殘基表示脫胺基位點(取代)。
因此，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，修飾之多能幹細胞、修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1基因表現在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中該插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：7所示核酸序列之指導RNA。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中該插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中該插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：9所示核酸序列之指導RNA。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中該插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：10所示之核酸序列。
因此，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1基因表現。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入產生NR3C1外顯子之取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：20或21所示之核酸序列。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：20所示之核酸序列。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO：21所示之核酸序列。
因此，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，修飾之多能幹細胞，修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之剪接受體或剪接供體中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠破壞NR3C1之正常剪接，從而下調NR3C1之基因表現。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，經修飾之多能幹細胞、經修飾之Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之剪接受體或剪接供體中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠破壞NR3C1之正常剪接，從而下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO 55或56所示之核酸序列。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入CRISPR系統，該CRISPR系統在NR3C1之剪接受體或剪接供體中產生取代，其中該取代能夠破壞NR3C1之正常剪接，從而下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：55所示核酸序列之指導RNA。在一些實施例中，用於產生本發明之類固醇抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入CRISPR系統，該CRISPR系統在NR3C1之剪接受體或剪接供體中產生取代，其中該取代能夠破壞NR3C1之正常剪接，從而下調NR3C1之基因表現，其中CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：56所示核酸序列之指導RNA。
在一些實施例中，產生本發明之類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，並且進一步包括將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入細胞之基因組中。在一些實施例中，CNI抗性基因之插入發生在NR3C1中之插入缺失之位點。在一些實施例中，NR3C1中之插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。在一些實施例中，CNI抗性基因編碼鈣調神經磷酸酶變體，其中鈣調神經磷酸酶變體係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc(催化亞基之三種同種型)組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式，或選自PPP3R1及PPP3R2(調節亞基之兩種同種型)組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體選自CNa12(SEQ ID NO：3)、CNa22(SEQ ID NO：4)及CNb30(SEQ ID NO：5)組成之群。
在一些實施例中，產生本發明之類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1中產生取代之CRISPR系統，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，並且進一步包括將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入細胞之基因組中。在一些實施例中，NR3C1中之取代在NR3C1之外顯子中。在一些實施例中，NR3C1中之取代在NR3C1之外顯子2中。在一些實施例中，NR3C1中之取代在NR3C1之剪接受體中。在一些實施例中，NR3C1中之取代在NR3C1之剪接供體中。在一些實施例中，CNI抗性基因之插入發生在NR3C1中之取代位點處、附近或下游(例如，在NR3C1基因座內)。在一些實施例中，CNI抗性基因之插入發生在NR3C1基因座之外)。在一些實施例中，CNI抗性基因編碼鈣調神經磷酸酶變體，其中鈣調神經磷酸酶變體係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式，或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶變體選自CNa12(SEQ ID NO：3)、CNa22(SEQ ID NO：4)及CNb30(SEQ ID NO：5)組成之群。
因此，產生類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，並且進一步包括將外源CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失之位點，其中外源CNI抗性基因編碼包含SEQ ID NO：3所示胺基酸序列之鈣調神經磷酸酶變體。因此，產生類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，並且進一步包括將外源CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失之位點，其中外源CNI抗性基因編碼包含SEQ ID NO：4所示胺基酸序列之鈣調神經磷酸酶變體。因此，產生類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如，Treg)之方法包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，並且進一步包括將外源CNI抗性基因插入NR3C1中插入缺失之位點，其中外源CNI抗性基因編碼包含SEQ ID NO：5所示胺基酸序列之鈣調神經磷酸酶變體。
在一些情況下，修飾之細胞係修飾之多能幹細胞，胚胎或誘導的。在此等情況下，本文提供之方法進一步包括在促進修飾之多能幹細胞分化成造血前體細胞或造血細胞之條件下分化修飾之多能幹細胞。在一些情況下，該方法包括在必需及足以獲得修飾之造血前體及分化之造血細胞類型之分化因子存在下培養修飾之多能幹細胞。然後可以根據任何合適之分化方法分化修飾之多能幹細胞，例如在美國專利第9574179號、第8093049中描述之彼等，從而產生修飾之多能幹細胞衍生之造血細胞或其前體。
因此，在一些情況下，產生類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如Treg)之方法包括向多能幹細胞中引入CRISPR系統，該系統如本文所述在編碼NR3C1之基因座中產生取代，其中該取代能夠下調NR3C1之基因表現，並且在一些情況下，進一步包括將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入多能細胞之基因組中。
在一些態樣，所提供之組合物及方法包括其中細胞組合物中之至少或大於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞含有所需遺傳修飾之彼等。例如，引入用於內源基因(例如，NR3C1)之敲除或遺傳破壞(例如，插入缺失及/或取代)之試劑(例如，gRNA/Cas核酸酶)之細胞組合物中之約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞包含遺傳破壞；不表現靶向內源多肽，不含有靶基因之連續及/或功能性拷貝。在一些實施例中，根據本發明之方法、組合物及細胞包括其中引入用於靶基因之敲除或遺傳破壞(例如，插入缺失及/或取代)之試劑(例如，gRNA/Cas核酸酶)之細胞組合物中之至少或大於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞不表現靶多肽之彼等。在一些實施例中，引入用於靶基因之敲除或遺傳破壞(例如，插入缺失及/或取代)之試劑(例如，gRNA/Cas9)之細胞組合物中之至少或大於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞在此百分比之細胞中在兩個等位基因中被敲除，即包含雙等位基因缺失。
在一些實施例中，提供了組合物及方法，其中Cas9介導之靶基因中或附近(例如在切割位點上游或下游之100個鹼基對內或大約100個鹼基對內，在50個鹼基對內或大約50個鹼基對內，或者在25個鹼基對內或大約25個鹼基對內或10個鹼基對內或大約10個鹼基對內)之切割效率(例如，插入%、取代%)係引入用於靶基因之敲除或遺傳破壞之試劑(例如，gRNA/Cas9)之細胞組合物中之至少或大於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞。
在一些實施例中，所提供之細胞、組合物及方法導致在引入用於靶基因之敲除或遺傳破壞之試劑(例如，gRNA/Cas核酸酶)之細胞組合物中之至少或大於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%之細胞中之藉由內源遞送之信號之減少或破壞。
在一些實施例中，當在相同條件下評估時，組合物中之細胞與相應或參考組合物中之細胞表型相比保留細胞表型。在一些實施例中，當在相同條件下評估時，組合物中之細胞與相應或參考組合物中之細胞表型相比保留細胞表型，除了對細胞具有破壞靶基因之作用以外。
在一些實施例中，組合物中之細胞包括但不限於幼稚細胞、效應記憶細胞、中樞記憶細胞、幹中樞記憶細胞、效應記憶細胞及長壽命效應記憶細胞。在一些實施例中，細胞包括但不限於免疫抑制細胞，例如調節性T細胞(Treg)、被修飾為直接免疫抑制之非Treg(例如，藉由分泌IL-10或TGF-β)，及被修飾為間接免疫抑制之非Treg(例如，殺死抗原呈遞細胞(APC)之細胞毒性T淋巴細胞(CTL))。在一些實施例中，細胞包括但不限於樹突細胞、骨髓衍生之抑制細胞、免疫調節巨噬細胞、間充質幹細胞、多潛能成體祖細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、胸腺祖細胞、免疫調節NK細胞、免疫調節NK細胞、免疫調節單核細胞、反抑細胞、先天淋巴細胞、不變之自然殺傷(NK)T細胞。在一些實施例中，細胞包括造血細胞及其前體細胞。在一些實施例中，細胞包括如本文所述修飾之效應T細胞。在一些實施例中，細胞係任何上述細胞類型之活體外衍生之多能幹細胞衍生細胞。
在一些實施例中，一定百分比之包含靶基因(例如，NR3C1)之遺傳破壞之細胞表現出與不含遺傳破壞之對應或參考細胞群體或組合物相同或基本相同之非活化、長壽命之記憶或中樞記憶表型。在一些實施例中，可以在活體外測定中測量此性質、活性或表型，例如藉由測定細胞之免疫抑制活性。在一些實施例中，可以在電穿孔或其他試劑引入後之不同天數評估所評估之活性、性質或表型中之任一者，例如在3、4、5、6、7天之後或至多3、4、5、6、7天。在一些實施例中，在相同條件下評估時，與包含不包含靶基因之遺傳破壞之細胞之相應組合物之活性相比，組合物中至少80%、85%、90%、95%或100%之細胞保留此活性、性質或表型。
如本文所用，提及「相應之組合物」或「相應之細胞群」(也稱為「參考組合物」或「參考細胞群」)係指在相同或基本相同之條件下獲得、分離、生成、產生及/或溫育之細胞(例如，Treg、Teff)，除了細胞或細胞群未引入該試劑以外。在一些態樣，除了不含有試劑之引入之外，此等細胞與已經引入試劑之細胞相同或基本相同地處理，使得除了引入試劑之外，任何一種或多種可影響細胞活性或性質之條件，包括抑制性分子之上調或表現在細胞之間不變化或基本不變。
用於評估細胞標誌物(例如Treg標誌物)之表現及/或水準之方法及技術係此項技術中已知的。用於檢測此類標誌物之抗體及試劑係此項技術中熟知的，並且容易獲得。用於檢測此類標誌物之測定法及方法包括但不限於流式細胞術，包括細胞內流式細胞術、ELISA、ELISPOT、細胞計數珠陣列或其他多重方法、蛋白質印跡及其他基於免疫親和性之方法。在一些實施例中，可以針對此等細胞特有之標誌物之表現、藉由流式細胞術或其他基於免疫親和性之方法來檢測修飾之細胞，然後可以將此等細胞與另一種標誌物共染色。
在一些實施例中，細胞、組合物及方法提供在待過繼轉移之造血細胞或其前體細胞(例如，Treg、Teff)中之靶基因之表現之缺失、敲除、破壞或減少。在一些實施例中，該等方法在來自受試者之原代細胞上離體進行，例如原代造血細胞或其前體細胞(例如，Treg、Teff)。在一些態樣，產生或生成此類細胞之方法包括向細胞中引入能夠破壞編碼待靶向之內源基因(例如，NR3C1)之基因之一種或多種試劑，並將鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因引入細胞中。如本文所用，術語「引入」包括在活體外或活體內將DNA引入細胞之各種方法，此等方法包括轉型、轉導、轉染(例如電穿孔)及感染。在引入涉及電穿孔之情況下，可以電穿孔多核苷酸(例如，質粒、單鏈DNA、小環DNA)。載體可用於將編碼分子之DNA引入細胞中。可能之載體包括質粒載體及病毒載體。病毒載體包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體或其他載體，例如腺病毒載體或腺相關載體。
細胞群可以係從受試者獲得之細胞，例如從外周血單核細胞(PBMC)樣品、臍帶血樣品、未分級之T細胞樣品、淋巴細胞樣品、白細胞樣品、單采血液成分產物或白細胞去除術產物獲得之細胞。
在一些實施例中，引入編碼鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因之核酸之步驟及引入試劑(例如，Cas/gRNA RNP)之步驟可以同時或以任何順序相繼發生。在一些實施例中，在引入鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因及一種或多種基因編輯劑(例如Cas/gRNA RNP)之後，在一定條件下培養或溫育細胞以刺激細胞之擴增及/或增殖。
因此，提供了在過繼細胞療法中增強細胞(例如Treg)功能之細胞、組合物及方法，包括具有如下作用之細胞、組合物及方法，例如藉由增加所投與之修飾細胞之活性及效力來提供改善之功效，同時保持持久性或隨時間推移暴露於轉移之細胞，或者例如藉由增加所投與之修飾細胞之持久性及/或存活。在一些實施例中，與某些可用方法相比，當在活體內向受試者投與時，經修飾之細胞表現出增加之擴增及/或持久性。在一些實施例中，當在活體內向受試者投與時，所提供之細胞表現出增加之持久性。在一些實施例中，與藉由替代方法實現之持久性相比，在投與後受試者中之修飾細胞之持久性更大，例如涉及投與藉由其中未向細胞引入減少編碼內源基因(例如，NR3C1)之基因之表現或破壞該基因之試劑之方法進行遺傳工程改造之細胞之彼等方法。在一些實施例中，持久性增加至少或約至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
在一些實施例中，投與細胞持久性之程度或範圍可在投與於受試者後檢測或定量。例如，在一些實施例中，定量PCR(qPCR)用於評估受試者之血液或血清或器官或組織(例如，疾病部位)中之修飾細胞之量。在一些實施例中，持久性被定量為每微克DNA之編碼例如鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因之DNA或質粒之拷貝，或每微升例如血液或血清樣品之CNI抗性基因表現細胞之數量，或每個微升樣品之外周血單核細胞(PBMC)或白細胞或Treg之總數。在一些實施例中，還可以進行通常使用對例如鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因編碼之蛋白質特異之抗體檢測細胞之流式細胞術測定法。基於細胞之測定也可用於檢測功能細胞之數量或百分比。
本發明提供了產生或生成本發明之鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性修飾細胞(例如Treg)之方法。通常藉由引入一種或多種編碼外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因產物之遺傳工程核酸來改造細胞。在一些實施例中，還將編碼外源CNI抗性基因產物之核酸與能夠破壞靶基因(例如NR3C1)之試劑(例如Cas9/gRNA RNP)同時或依次引入細胞。
在一些實施例中，藉由同源定向修復(HDR)將鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因(例如，編碼鈣調神經磷酸酶變體)插入基因組中。如本文所用，「同源定向修復」或「HDR」係修復細胞中雙鏈DNA斷裂之機制。HDR通常依賴於同源重組之過程，其中核酸序列同源性之片段用於修復雙鏈DNA斷裂。在HDR期間，核酸供體之同源序列之鏈侵入或與切割之DNA之切除部分雜交。使用切除之DNA作為引子之DNA聚合酶使用侵入之供體序列作為模板來延長切割之DNA。在延伸及斷裂修復後，切割位點處之新序列具有在修復過程中使用之核酸供體中存在之任何序列。HDR之過程進一步描述於Jasin等人 (Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013 Nov；5(11): a012740)，該文獻以引用方式併入本文。
在一些實施例中，核酸供體模板(例如，用於插入CNI抗性基因)可以與基因編輯複合物(例如，CRISPR/Cas系統)一起使用，以使得能夠在宿主細胞之同源靶核酸中之特定核苷酸位置進行基因組工程(例如，在特定等位基因上係複合雜合之同源染色體)。在一些態樣，本發明提供了用於靶向基因編輯之方法，該方法包括在一定條件下將核酸供體模板與重組基因編輯複合物之至少一種組分遞送至細胞(例如，疾病受試者之細胞)，使得重組基因編輯複合物誘導染色體中靶位點之遺傳損傷(例如，缺口或雙鏈斷裂)，並且本發明之供體模板介導修復機制(例如，HDR)，從而修復損傷。
在某些實施例中，核酸供體模板(在本文中也稱為外源供體DNA序列)藉由同源重組促進鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因(例如，突變體/變體鈣調神經磷酸酶基因)插入NR3C1基因座。因此，在某些實施例中，使用包含SEQ ID NO：11所示核酸序列之外源供體DNA序列，藉由同源重組將突變鈣調神經磷酸酶基因插入NR3C1基因座。本文在第15中圖提供了外源供體DNA序列之示意圖。
在一些實施例中，供體DNA序列可包含轉錄控制元件，例如但不限於MND啟動子、CMB啟動子、EF-1α啟動子、PGK啟動子。在一些實施例中，供體DNA序列可包含報道分子，例如但不限於螢光標誌物(例如GFP)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor; EGFR)、神經生長因子受體(nerve growth factor receptor; NGFR)、誘導型半胱天冬酶。當供體DNA序列包含主要插入元件(例如，CNI抗性基因)及次要元件(例如報道分子)時，可能需要協調表現。此項技術中已知多種協調表現一種或多種基因之方法。在一些實施例中，主要插入元件(例如，CNI抗性基因)及次要插入元件(例如，GFP)藉由接頭分開。用於本發明之接頭允許多個蛋白質由相同之核酸序列(例如，多順反子或雙順反子序列)編碼，該等蛋白質被翻譯為多蛋白，該多蛋白被解離成單獨之蛋白質組分。例如，用於包含CNI抗性基因及報道基因之本發明之供體核酸之接頭允許CNI抗性基因產物及報道基因產物翻譯為多蛋白，該多蛋白被解離成單獨之CNI抗性基因產物及報道基因產物組分。
在一些實施例中，接頭包含編碼內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site; IRES)之核酸序列。如本文所用，「內部核糖體進入位點」或「IRES」係指促進直接內部核糖體進入蛋白質編碼區之起始密碼子(例如ATG)之元件，從而導致基因之帽不依賴性翻譯。各種內部核糖體進入位點係熟習此項技術者已知的，包括但不限於，可從病毒或細胞mRNA來源獲得之IRES，例如免疫球蛋白重鏈結合蛋白或結合免疫球蛋白(binding immunoglobulin protein; BiP)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor; VEGF)；纖維母細胞生長因子2；胰島素樣生長因子；翻譯起始因子eIF4G；酵母轉錄因子TFIID及HAP4；及可從例如心臟病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、Friend鼠白血病病毒(Friend murine leukemia virus; FrMLV)及Moloney鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus; MoMLV)獲得之IRES。熟習此項技術者將能夠選擇適合之IRES用於本發明。
在一些實施例中，接頭包含編碼自切割肽之核酸序列。如本文所用，「自切割肽」或「2A肽」係指允許多種蛋白質編碼為多蛋白之寡肽，該等多蛋白在翻譯時解離成組分蛋白。使用術語「自切割」並不意味著暗示蛋白水解切割反應。各種自切割或2A肽係熟習此項技術者已知的，包括但不限於在小核糖核酸病毒科之成員中發現之彼等，例如口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus; FMDV)、馬鼻炎A病毒(equine rhinitis A virus; ERAV、Thosea asigna病毒(TaV)及豬捷申病毒-1(porcine tescho virus-1; PTV-1)；及心臟病毒如泰勒病毒及腦心肌炎病毒。衍生自FMDV、ERAV、PTV-1及TaV之2A肽分別在本文中稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」及「T2A」。熟習此項技術者將能夠選擇適合用於本發明之自切割肽。
在一些實施例中，接頭進一步包含編碼弗林蛋白酶切割位點之核酸序列。弗林蛋白酶係一種普遍表現之蛋白酶，其存在於反式高爾基體中並在分泌之前處理蛋白質前體。弗林蛋白酶在其共有識別序列之COOH-末端切割。各種弗林蛋白酶共有識別序列(或「弗林蛋白酶切割位點」)係熟習此項技術者已知的，包括但不限於Arg-X-Lys-Arg (SEQ ID NO:12)或Arg-X-Arg-Arg (SEQ ID NO:13)、X1-Arg-X-X1 -Arg (SEQ ID NO:14)及Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO:15)，諸如Arg-Gln-Lys-Arg (SEQ ID NO:16)，其中X係任何天然存在之胺基酸，X1係Arg或Lys。熟習此項技術者能夠選擇合適之弗林蛋白酶切割位點用於本發明。
如本文所用，術語「核酸供體」或「核酸供體模板」或「供體模板」或「供體序列」或「供體」或「核酸插入物」或「插入物」係指可用作修復機制(例如，同源定向修復(HDR))中之修復模板之任何核酸序列，例如，脫氧核糖核酸。核酸供體可以係雙鏈或單鏈的，例如雙鏈DNA(dsDNA)或單鏈DNA(ssDNA)。本發明之核酸供體可包含不同之多核苷酸長度。在某些實施例中，核酸供體之長度可小於約100個核苷酸、長度為約100個核苷酸、長度為約200個核苷酸、長度為約300個核苷酸、長度為約400個核苷酸、長度為約500個核苷酸、長度為約600個核苷酸、長度約700個核苷酸、長度約800個核苷酸、長度約900個核苷酸、長度約1000個核苷酸，或長度大於約1000個核苷酸。長度小於或等於200個核苷酸之核酸供體也可稱為「短」核酸供體。在某些實施例中，核酸供體係單鏈供體寡核苷酸(ssODN)。插入細胞基因組之核酸供體可以係技藝人士所需之任何核苷酸長度。例如，但決不係限制性的，核苷酸部分可以與單個核苷酸一樣短或大於10千鹼基。
在一些實施例中，本發明之核酸供體包含待插入細胞基因組之核苷酸序列，例如，待插入細胞基因組之外源序列。外源序列可包含基因(例如鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因)。該基因可編碼蛋白質，例如治療性蛋白質或選擇標誌物蛋白質(例如鈣調神經磷酸酶變體)。在某些實施例中，選擇標誌物可以編碼選擇標誌物蛋白，該蛋白賦予對減少細胞生長或導致細胞死亡之試劑之抗性。此等試劑之實例包括但不限於胺苄青黴素、殺稻瘟素、博來黴素、氯黴素、慶大黴素、潮黴素、卡那黴素、林可黴素、甲胺蝶呤、新黴素、草丁膦、嘌呤黴素、四環素及吉歐黴素。在其他實施例中，選擇標誌物可以編碼螢光或發光蛋白(例如螢光素酶或GFP)。該基因可以來源於插入基因之細胞之相同物種生物。該基因可以來源於插入基因之細胞之不同物種生物。該基因可以係包含多種物種序列之嵌合序列。核酸供體可包含編碼非編碼RNA之序列。非編碼RNA之實例包括但不限於轉移RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)、小RNA如siRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、snRNA、外來體RNA(exRNA)。核酸供體可包含未表現之序列。核酸供體可包含減少或消除細胞中內源基因表現之序列。
在HDR介導之基因編輯之情況下，本發明之核酸供體進一步在5'末端及3'末端包含同源臂，例如，第一及第二同源臂。同源臂係與細胞基因組中之靶位點具有足夠同源性以介導HDR之核酸序列。每個同源臂可包含不同之多核苷酸長度。熟習此項技術者將理解，同源臂核酸序列係如上所述之現有核酸供體序列之延伸。
在某些實施例中，第一同源臂之長度可為約20個核苷酸至約1000個核苷酸。在某些實施例中，第一同源臂之長度可小於約20個核苷酸、長度為約20個核苷酸、長度為約30個核苷酸、長度為約40個核苷酸、長度為約50個核苷酸、長度為約60個核苷酸、長度為約70個核苷酸、長度為約80個核苷酸、長度約90個核苷酸、長度約100個核苷酸、長度約200個核苷酸、長度約300個核苷酸、長度約400個核苷酸、長度約500個核苷酸、長度約600個核苷酸、長度約700個核苷酸、長度約800個核苷酸、長度約900個核苷酸、長度約1000個核苷酸，或長度大於約1000個核苷酸。
在某些實施例中，第二同源臂之長度可為約20個核苷酸至約1000個核苷酸。在某些實施例中，第二同源臂之長度可小於約20個核苷酸、長度為約20個核苷酸、長度為約30個核苷酸、長度為約40個核苷酸、長度為約50個核苷酸、長度為約60個核苷酸、長度約70個核苷酸、長度約80個核苷酸、長度約90個核苷酸、長度約100個核苷酸、長度約200個核苷酸、長度約300個核苷酸、長度約400個核苷酸、長度約500個核苷酸、長度約600個核苷酸、長度約700個核苷酸、長度約800個核苷酸、長度約900個核苷酸、長度約1000個核苷酸，或長度大於約1000個核苷酸。
在某些實施例中，核酸供體之第一及第二同源臂可包含不同之核苷酸長度。作為用於說明目的之實例，但決不係限制性的，核酸供體之5'末端之同源臂(第一同源臂)可以係100個核苷酸長度，並且核酸供體之3'末端之同源臂(第二同源臂)可以係150個核苷酸長度。
在一些實施例中，藉由表現載體將鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因(例如，編碼鈣調神經磷酸酶變體)引入細胞中。本文提供了包含編碼本發明鈣調神經磷酸酶變體之核酸序列之表現載體。合適之表現載體包括慢病毒載體、γ逆轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(adeno associated virus; AAV)載體、腺病毒載體、工程化雜合病毒、裸DNA，包括但不限於轉座子介導之載體，例如Sleeping Beauty、Piggybac及諸如Phi31之整合酶。一些其他合適之表現載體包括單純皰疹病毒(Herpes simplex virus; HSV)及逆轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體基於腺病毒，該等腺病毒具有整合到基因組DNA中之能力較低，但轉染宿主細胞之效率較高。腺病毒表現載體含有足以實現功能之腺病毒序列：(a)支持表現載體之包裝及(b)最終在宿主細胞中表現鈣調神經磷酸酶變體。在一些實施例中，腺病毒基因組係36 kb之線性雙鏈DNA，其中可插入外源DNA序列(例如，編碼鈣調神經磷酸酶變體之核酸)以替代大片腺病毒DNA以製造本發明之表現載體 (參見，例如Danthinne及Imperiale, Gene Therapy (2000) 7(20): 1707-1714)。
另一種表現載體基於腺相關病毒，該病毒利用腺病毒偶聯系統。該AAV表現載體具有整合到宿主基因組中之高頻率。它可以感染非分裂細胞，從而使其可用於將基因遞送到哺乳動物細胞中，例如，在組織培養物中或活體內。AAV載體具有用於感染之廣泛宿主範圍。各種AAV載體係此項技術中已知的，包括但不限於衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10之載體。關於AAV載體之產生及使用之細節描述於美國專利第5,139,941及4,797,368號中。
逆轉錄病毒表現載體能夠整合到宿主基因組中、遞送大量外來遺傳物質、感染廣譜物種及細胞類型並包裝在特殊細胞株中。藉由在某些位置將核酸(例如，編碼鈣調神經磷酸酶變體之核酸)插入病毒基因組中以產生複製缺陷之病毒來構建逆轉錄病毒載體。儘管逆轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但鈣調神經磷酸酶變體之整合及穩定表現需要宿主細胞之分裂。
慢病毒載體衍生自慢病毒，慢病毒係複合逆轉錄病毒，除了常見之逆轉錄病毒基因gag、pol及env之外，還含有具有調節或結構功能之其他基因(參見，例如，美國專利第6,013,516及5,994,136號)。慢病毒之一些實例包括人免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus; SIV)。藉由多次減毒HIV毒力基因來產生慢病毒載體，例如，使基因env、vif、vpr、vpu及nef缺失，從而使載體在生物學上安全。慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，並且可以用於例如編碼鈣調神經磷酸酶變體之核酸之活體內及離體基因轉移及表現(參見例如美國專利第5,994,136號)。
可以藉由熟習此項技術者已知之任何方法將包括本發明之核酸之表現載體引入宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染之病毒序列。或者，可以藉由融合、電穿孔、生物射彈、轉染、脂質轉染等引入表現載體。宿主細胞可以在引入表現載體之前在培養物中生長及擴增，然後進行適當之處理以引入及整合載體。然後擴增宿主細胞，並可藉助載體中存在之標誌物進行篩選。可以使用之各種標誌物係此項技術中已知的，並且可以包括hprt、新黴素抗性、胸苷激酶、潮黴素抗性等。如本文所用，術語「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用。在一些實施例中，宿主細胞係造血細胞或其前體，例如Treg、T細胞、NK細胞或NKT細胞。
本發明還提供遺傳工程細胞，該等細胞包括並穩定表現本發明之鈣調神經磷酸酶變體。在一些實施例中，遺傳工程細胞係能夠產生治療相關後代之遺傳工程調節性T細胞(Treg)、T-淋巴細胞(T細胞)、幼稚T細胞(TN)、記憶T細胞(例如、中樞記憶T細胞(TCM)、效應記憶細胞(TEM))、天然殺傷細胞(NK細胞)及巨噬細胞。在一個實施例中，遺傳工程細胞係自體細胞。
修飾之細胞(例如，包含鈣調神經磷酸酶變體)可以藉由用包含本發明之核酸之表現載體穩定轉染宿主細胞來產生。產生本發明之經修飾細胞之其他方法包括但不限於化學轉化方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀大分子、脂質體及/或陽離子聚合物)、非化學轉化方法(例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移及/或流體動力學遞送)及/或基於顆粒之方法(例如，使用基因槍及/或磁力轉染之刺型轉染)。表現本發明之鈣調神經磷酸酶變體之轉染細胞可以離體擴增。
用於將表現載體引入宿主細胞之物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。產生包括載體及/或外源核酸之細胞之方法係此項技術中熟知的。參見，例如Sambrook等人 (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。用於將表現載體引入宿主細胞之化學方法包括膠體分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠子及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。
適合使用之脂質可以從商業來源獲得。例如，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(dimyristyl phosphatidylcholine; 「DMPC」)可以從Sigma，St.Louis，MO獲得；磷酸二十六烷基酯(dicetyl phosphate; 「DCP」)可以從K＆K Laboratories(Plainview，NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可以從Calbiochem-Behring獲得；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(dimyristyl phosphatidylglycerol; 「DMPG」)及其他脂質可以從Avanti Polar Lipids，Inc. (Birmingham，AL)獲得。脂質在氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿可以用作唯一之溶劑，因為它比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係通用術語，包括藉由產生封閉之脂質雙層或聚集體形成之各種單層及多層脂質載體。脂質體可以表徵為具有囊泡結構，該等結構具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分離之多個脂質層。當磷脂懸浮在過量之水溶液中時，它們自發形成。脂質組分在形成封閉結構之前經歷自重排，並在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶質 (Ghosh等人, 1991 Glycobiology 5: 505-10)。還包括在溶液中具有與正常囊泡結構不同之結構之組合物。例如，脂質可呈現膠束結構或僅作為脂質分子之不均勻聚集體存在。還涵蓋了脂質轉染胺-核酸複合物。
無論用於將外源核酸引入宿主細胞中或以其他方式將細胞暴露於本發明之抑制劑之方法為何，為了證實核酸在宿主細胞中之存在，可以進行多種測定。此類測定包括，例如，熟習此項技術者熟知之分子生物學測定，例如Southern及Northern印跡、RT-PCR及PCR；生物化學測定，例如檢測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫學手段(ELISA及蛋白質印跡)或藉由本文所述之測定法鑑定落入本發明範圍內之試劑。
在一個實施例中，引入宿主細胞之核酸係RNA。在另一個實施例中，RNA係包含活體外轉錄之RNA或合成RNA之mRNA。RNA可以藉由使用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction; PCR)產生之模板之活體外轉錄產生。可以使用適當之引子及RNA聚合酶將來自任何來源之所關注DNA直接藉由PCR轉化為用於活體外mRNA合成之模板。DNA之來源可以係例如基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合適之DNA來源。
PCR可用於產生mRNA之活體外轉錄模板，然後將mRNA導入細胞。進行PCR之方法係此項技術中熟知的。用於PCR之引子被設計成具有與用作PCR之模板之DNA區域基本上互補之區域。如本文所用，「基本上互補」係指核苷酸序列，其中引子序列中之大部分或全部鹼基係互補的。基本上互補之序列能夠在用於PCR之退火條件下與預期之DNA靶退火或雜交。可以將引子設計為與DNA模板之任何部分基本上互補。例如，可以設計引子以擴增通常在細胞中轉錄之基因部分(開放閱讀框)，包括5'及3'UTR。還可以設計引子以擴增編碼所關注之特定目標結構域之基因之一部分。在一個實施例中，設計引子以擴增人cDNA之編碼區，包括5'及3'UTR之全部或部分。用於PCR之引子藉由此項技術中熟知之合成方法產生。「正向引子」係含有核苷酸之區域之引子，該等核苷酸與DNA模板上之位於待擴增之DNA序列上游之核苷酸基本上互補。「上游」在本文中用於指相對於編碼鏈待擴增之DNA序列之5'位置。「反向引子」係含有核苷酸之區域之引子，該等核苷酸與待擴增之DNA序列下游之雙鏈DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指相對於編碼鏈待擴增之DNA序列之3'位置。
還可以使用具有促進RNA之穩定性及/或翻譯效率之能力之化學結構。RNA較佳具有5'及3'UTR。在一個實施例中，5'UTR之長度為0至3000個核苷酸。待添加到編碼區之5'及3'UTR序列之長度可以藉由不同之方法改變，包括但不限於設計用於與UTR之不同區域退火之PCR之引子。使用該方法，普通熟習此項技術者可以在轉染經轉錄之RNA後修改實現最佳翻譯效率所需之5'及3'UTR長度。
5'及3'UTR可以係所關注之基因之天然存在之內源5'及3'UTR。或者，可以藉由將UTR序列併入正向及反向引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加對於所關注之基因不為內源之UTR序列。使用對於所關注之基因而言不為內源之UTR序列可用於修飾RNA之穩定性及/或翻譯效率。例如，已知3'UTR序列中之富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，可以選擇或設計3'UTR，以基於此項技術中熟知之UTR之性質來增加轉錄之RNA之穩定性。
在一個實施例中，5'UTR可含有內源基因之Kozak序列。或者，當如上所述藉由PCR添加對於所關注之基因不為內源之5'UTR時，可以藉由添加5'UTR序列來重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA轉錄物之翻譯效率，但似乎並不為所有RNA實現有效之翻譯所需要。對許多mRNA之Kozak序列之要求係此項技術中已知的。在其他實施例中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，該病毒之RNA基因組在細胞中係穩定的。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5'UTR中以阻止mRNA之核酸外切酶降解。
為了能夠從DNA模板合成RNA而無需基因選殖，轉錄啟動子應連接到待轉錄序列上游之DNA模板上。當將作為RNA聚合酶啟動子之序列添加到正向引子之5'末端時，RNA聚合酶啟動子被併入待轉錄之開放閱讀框上游之PCR產物中。在一個實施例中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文其他地方所述。其他有用之啟動子包括但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之共有核苷酸序列係此項技術中已知的。
在一個實施例中，mRNA在5'末端具有帽及3'聚(A)尾，該帽及尾確定核糖體結合、翻譯起始及細胞中mRNA穩定性。在環狀DNA模板，例如，質粒DNA上，RNA聚合酶產生長的多聯產物，該產物不適於在真核細胞中表現。在3'UTR末端線性化之質粒DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，該mRNA在真核轉染中無效，即使它在轉錄後經多腺苷酸化亦如此。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可以將轉錄物之3'末端延伸超過模板之最後一個鹼基 (Schenborn及Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
轉錄DNA模板之聚A/T片段可以在PCR期間藉由使用含有聚T尾(例如100T尾(大小可以係50-5000 T))之反向引子或在PCR之後藉由任何其他方法產生，包括但是不限於DNA連接或活體外重組。聚(A)尾也為RNA提供穩定性並降低其降解。通常，聚(A)尾之長度與轉錄之RNA之穩定性正相關。在一個實施例中，聚(A)尾為100至5000個腺苷。
在使用聚(A)聚合酶(例如大腸桿菌polyA聚合酶(E-PAP))進行活體外轉錄後，可以進一步延長RNA之聚(A)尾。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度從100個核苷酸增加至300至400個核苷酸導致RNA之翻譯效率增加約2倍。另外，不同化學基團與3'末端之連接可以增加mRNA穩定性。此連接可含有修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。例如，可以使用聚(A)聚合酶將ATP類似物併入聚(A)尾。ATP類似物可以進一步增加RNA之穩定性。
5'帽也為RNA分子提供穩定性。在較佳之實施例中，藉由本文揭示之方法產生之RNA包括5'帽。使用此項技術中已知及本文描述之技術提供5'帽 (Cougot等人, Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski等人, RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人, Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
在一些實施例中，將RNA電穿孔到細胞中，例如活體外轉錄之RNA。可以包括適用於細胞電穿孔之任何溶質，該等溶質可以包含促進細胞滲透性及活力之因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。
在一些實施例中，編碼本發明之鈣調神經磷酸酶變體之核酸將係RNA，例如活體外合成之RNA。用於活體外合成RNA之方法係此項技術中已知的；任何已知之方法可用於合成包含編碼鈣調神經磷酸酶變體之序列之RNA。將RNA引入宿主細胞之方法係此項技術中已知的。參見，例如Zhao等人 Cancer Res. (2010) 15: 9053。將包含編碼鈣調神經磷酸酶變體之核苷酸序列之RNA引入宿主細胞可以在活體外或離體或活體內進行。例如，宿主細胞(例如，Treg、NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)可以在活體外或離體用包含編碼鈣調神經磷酸酶變體之核苷酸序列之RNA電穿孔。
所揭示之方法可以應用於癌症、幹細胞、急性及慢性感染、自體免疫疾病、細胞療法及基因療法領域之基礎研究及治療中T細胞活性之調節，包括評估遺傳修飾之T細胞殺死靶癌細胞之能力。
該方法還提供了藉由改變例如啟動子或輸入RNA之量來控制寬範圍表現水準之能力，使得可以單獨調節表現水準。此外，基於PCR之mRNA產生技術極大地促進了具有不同結構及其結構域組合之mRNA之設計。
本發明之RNA轉染方法之一個優點係RNA轉染基本上係瞬時的並且係無載體的。RNA轉基因可以作為不需要任何額外之病毒序列之最小表現盒在短暫之活體外細胞活化後遞送至淋巴細胞並在其中表現。在此等條件下，轉基因整合到宿主細胞基因組中之可能性不大。由於RNA之轉染效率及其均勻修飾整個淋巴細胞群之能力，不需要選殖細胞。
用活體外轉錄之RNA(IVT-RNA)對細胞進行遺傳修飾利用了兩種不同之策略，此等兩種策略已經在各種動物模型中連續測試。藉由脂質轉染或電穿孔用活體外轉錄之RNA轉染細胞。期望使用各種修飾來穩定IVT-RNA，以實現轉移之IVT-RNA之延長表現。
一些IVT載體在文獻中係已知的，該等載體以標準化方式用作活體外轉錄之模板，並且已經以產生穩定之RNA轉錄物之方式進行遺傳修飾。目前，此項技術中使用之方案基於具有以下結構之質粒載體：5'RNA聚合酶啟動子，該啟動子能夠進行RNA轉錄，然後係所關注之基因，該基因位於非翻譯區(untranslated region; UTR)之3'及/或5'側翼，及含有50-70個A核苷酸之3'多腺苷酸盒。在活體外轉錄之前，藉由II型限制酶將環狀質粒在多腺苷酸盒之下游線性化(識別序列對應於切割位點)。因此，多腺苷酸盒對應於轉錄物中晚期聚(A)序列。作為該程序之結果，一些核苷酸在線性化後保持作為酶切位點之一部分，並在3'末端延伸或掩蔽聚(A)序列。目前尚不清楚此非生理性突出物是否會影響此構建體在細胞內產生之蛋白質之量。
在另一態樣，藉由電穿孔將RNA構建體遞送到細胞中。參見，例如，如在以下文獻中所教導之將核酸構建體電穿孔到哺乳動物細胞中之調配物及方法：US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1。包括任何已知細胞類型之電穿孔所需之電場強度之各種參數通常在相關研究文獻以及此項技術中之許多專利及申請案中係已知的。參見例如美國專利第6,678,556號、美國專利第7,171,264號及美國專利第7,173,116號。用於電穿孔之治療應用之裝置可商購獲得，例如MedPulser™ DNA Electroporation Therapy System (Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)，並且在諸如以下之專利中描述：美國專利第6,567,694號；美國專利第6,516,223號、美國專利第5,993,434號、美國專利第6,181,964號、美國專利第6,241,701號及美國專利第6,233,482號；電穿孔也可用於活體外轉染細胞，如例如在US20070128708A1中所述。電穿孔也可用於在活體外將核酸遞送到細胞中。因此，利用熟習此項技術者已知之許多可用裝置及電穿孔系統中之任一種進行電穿孔介導之向核酸細胞投與包括表現構建體之細胞，提供了用於將所關注之RNA遞送至靶細胞之令人興奮之新方法。
在一些實施例中，可以在引入編碼外源鈣調神經磷酸酶變體之核酸分子及基因編輯劑(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期間及/或之後溫育或培養細胞(例如，多能幹細胞、Treg)。在一些實施例中，細胞(例如，多能幹細胞、Treg)可以在引入編碼外源受體之核酸分子之前、期間或之後溫育或培養，例如在用編碼外源受體之病毒載體(例如，慢病毒載體)轉導細胞之前、期間或之後。在一些實施例中，可以在引入基因編輯劑(例如Cas9/gRNA RNP)之前、期間或之後溫育或培養細胞(例如，T細胞)，例如在使細胞與試劑接觸之前、期間或之後，或在例如藉由電穿孔將試劑遞送到細胞中之前、期間或之後。在一些實施例中，溫育可以在引入編碼外源受體之核酸分子及引入基因編輯劑例如Cas9/gRNA RNP之背景下進行。
在一些實施例中，引入基因編輯劑，例如，Cas9/gRNA RNP在引入編碼鈣調神經磷酸酶變體之核酸分子後。在一些實施例中，在引入試劑之前，將細胞靜置，例如藉由移除任何刺激或活化劑。在一些實施例中，在引入試劑之前，不移除刺激劑或活化劑及/或細胞因子。熟習此項技術者將能夠確定將一種或多種核酸序列中之每一種引入宿主細胞之順序。
因此，提供了用於產生修飾之造血細胞或其前體細胞之方法，包括向細胞中引入在NR3C1之外顯子2中產生插入缺失之CRISPR系統，其中插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現。在一個示例性實施例中，該方法進一步包括將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入細胞基因組中，其中插入發生在插入缺失NR3C1之位點。D. 核酸及表現載體
本發明提供了編碼外源鈣調神經磷酸酶變體之核酸。在一些實施例中，本發明之核酸可以與轉錄控制元件，例如啟動子及增強子等可操作地連接。合適之啟動子及增強子元件係熟習此項技術者已知的。
為了在細菌細胞中表現，合適之啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為了在真核細胞中表現，合適之啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及增強子元件；巨細胞病毒立即早期啟動子；單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子；早期及晚期SV40啟動子；存在於逆轉錄病毒之長末端重複序列中之啟動子；小鼠金屬硫蛋白-I啟動子；及各種此項技術中已知之組織特異性啟動子。合適之可逆啟動子，包括可逆誘導型啟動子，係此項技術中已知的。此等可逆啟動子可以分離並衍生自許多生物，例如真核生物及原核生物。來自第一生物用於在第二生物中使用之可逆啟動子之修飾，例如第一生物為原核生物，並且第二生物為真核生物，第一生物為真核生物並且第二生物為真核生物等，係此項技術中熟知的。此類可逆啟動子及基於此類可逆啟動子但也包含其他調控蛋白之系統包括但不限於醇調節啟動子(例如，醇脫氫酶I(alcA)基因啟動子，對醇反式活化蛋白(A1cR)有響應之啟動子等)、四環素調節之啟動子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節之啟動子(例如，大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視黃醇啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮啟動子系統等)、金屬調節啟動子(如金屬硫蛋白啟動子系統等)、發病機制相關之調節啟動子(如水楊酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等)、溫度調節啟動子(例如，熱休克誘導型啟動子(如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等)、光調節啟動子、合成誘導型啟動子等。
在一些實施例中，啟動子係CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子或NK特異性啟動子。例如，可以使用CD4基因啟動子；參見，例如Salmon等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:7739；及Marodon等人 (2003) Blood 101:3416。作為另一個實例，可以使用CD8基因啟動子。藉由使用NcrI(p46)啟動子可以實現NK細胞特異性表現；參見，例如Eckelhart等人 Blood (2011) 117:1565。
為了在酵母細胞中表現，合適之啟動子係組成型啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調節之啟動子，如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1(例如，用於畢赤酵母)。選擇合適之載體及啟動子完全在普通熟習此項技術者之水準之內。適用於原核宿主細胞之啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子，例如lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子；trc啟動子；tac啟動子等；araBAD啟動子；活體內調節之啟動子，例如ssaG啟動子或相關之啟動子(參見，例如，美國專利公開案第20040131637號)、pagC啟動子 (Pulkkinen及Miller, J. Bacteriol. (1991) 173(1): 86-93；Alpuche-Aranda等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(21): 10079-83)、nirB啟動子(Harborne等人 Mol. Micro. (1992) 6:2805-2813)及其類似啟動子(參見，例如Dunstan等人, Infect. Immun. (1999) 67:5133-5141；McKelvie等人, Vaccine (2004) 22:3243-3255；及Chatfield等人, Biotechnol. (1992) 10:888892)；sigma70啟動子，例如共有sigma70啟動子 (參見，例如GenBank登錄號AX798980、AX798961及AX798183)；固定相啟動子，例如dps啟動子、spv啟動子等；來自致病島SPI-2之啟動子 (參見，例如WO96/17951)；actA啟動子(參見，例如Shetron-Rama等人, Infect. Immun. (2002) 70:1087-1096)；rpsM啟動子(參見，例如Valdivia及Falkow Mol. Microbiol. (1996). 22:367)；tet啟動子 (參見，例如Hillen, W.及Wissmann, A. (1989) In Saenger, W. 及Heinemann, U. (編), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, 第10卷，第143-162頁)；SP6 啟動子 (參見，例如Melton等人, Nucl. Acids Res. (1984) 12:7035)；及其類似啟動子。適用於原核生物如大腸桿菌之強啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7及PLambda。用於細菌宿主細胞之操縱基因之非限制性實例包括乳糖啟動子操縱子(當與乳糖接觸時LacI阻遏蛋白改變構形，從而阻止Lad阻遏蛋白與操縱子結合)，色胺酸啟動子操縱子(當與色胺酸複合時，TrpR阻遏蛋白具有結合操縱子之構形；在沒有色胺酸之情況下，TrpR阻遏蛋白具有不與操縱子結合之構形)及tac啟動子操縱子 (參見，例如deBoer等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:21-25)。
合適啟動子之其他實例包括立即早期巨細胞病毒(cytomegalovirus; CMV)啟動子序列。該啟動子序列係強組成型啟動子序列，能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高水準表現。也可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus; MMTV)或人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus; HIV)長末端重複序列(long terminal repeat; LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、Epstein-Barr病毒立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、EF-1α啟動子，以及人基因啟動子，例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明不應限於組成型啟動子之使用。誘導型啟動子也被認為係本發明之一部分。誘導型啟動子之使用提供了一種分子開關，該分子開關能夠當需要此表現時啟動它可操作地連接之多核苷酸序列之表現，或者當不需要表現時，關閉表現。誘導型啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、黃體酮啟動子及四環素啟動子。
在一些實施例中，含有合適啟動子之基因座或構建體或轉基因藉由可誘導系統之誘導來不可逆轉換。用於誘導不可逆開關之合適系統係此項技術中公知的，例如，不可逆開關之誘導可利用Cre-lox介導之重組 (參見，例如Fuhrmann-Benzakein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 28:e99，其揭示內容以引用方式併入本文)。此項技術中已知之任何合適之重組酶、內切核酸酶、連接酶、重組位點等組合可用於產生不可逆轉換之啟動子。本文其他地方描述之用於進行位點特異性重組之方法、機制及要求可用於產生不可逆轉換之啟動子，並且係此項技術中熟知的，參見，例如Grindley等人 Annual Review of Biochemistry (2006) 567-605；及Tropp, Molecular Biology (2012) (Jones & Bartlett Publishers, Sudbury, Mass.)，其揭示內容以引用方式併入本文。
本發明之核酸可以存在於表現載體及/或選殖載體中。表現載體可包括選擇標誌物、複製起點及提供載體複製及/或維持之其他特徵。合適之表現載體包括例如質粒、病毒載體等。大量合適之載體及啟動子係熟習此項技術者已知的；許多可商購獲得以用於產生主題重組構建體。以下載體係作為實例提供的，並且不應以任何方式解釋為限制性：細菌：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG (Stratagene) pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL (Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近之適宜限制性位點，以提供編碼異源蛋白質之核酸序列之插入。可以存在在表現宿主中有效之選擇標誌物。合適之表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於痘苗病毒之病毒載體；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見，例如Li等人, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2543-2549；Borras等人, Gene Ther. (1999) 6: 515-524；Li及Davidson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 7700-7704；Sakamoto等人, H. Gene Ther. (1999) 5: 1088-1097；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)；腺相關病毒 (參見，例如Ali等人, Hum. Gene Ther. (1998) 9: 81-86, Flannery等人, Proc. Natl. Acad.Sci. USA (1997) 94: 6916-6921；Bennett等人, Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1997) 38: 28572863；Jomary等人, Gene Ther. (1997) 4:683 690, Rolling等人, Hum. Gene Ther. (1999) 10: 641-648；Ali等人, Hum. Mol. Genet. (1996) 5: 591-594；Srivastava之WO 93/09239, Samulski等人, J. Vir. (1989) 63: 3822-3828；Mendelson等人, Virol. (1988) 166: 154-165；及Flotte等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 10613-10617)；SV40；單純皰疹病毒；人類免疫缺陷病毒 (參見，例如Miyoshi等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1031923；Takahashi等人, J. Virol. (1999) 73: 7812-7816)；逆轉錄病毒載體(例如，鼠白血病病毒、脾壞死病毒及衍生自逆轉錄病毒之載體，例如勞斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒)；及其類似載體。
適合使用之其他表現載體係例如但不限於慢病毒載體、γ逆轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、工程化雜合病毒載體、轉座子介導之載體等。病毒載體技術在此項技術中係公知的，並且例如在其中描述於Sambrook等人, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)，以及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括但不限於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。
通常，合適之載體含有在至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、適宜限制性內切核酸酶位點及一種或多種選擇標誌物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
本發明之載體可以係自失活載體。如本文所用，術語「自失活載體」係指其中3'LTR增強子啟動子區(U3區)已被修飾(例如，藉由缺失或取代)之載體。自失活載體可以阻止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。因此，自失活載體可以僅感染，然後整合到宿主基因組(例如哺乳動物基因組)中一次，並且不能進一步傳代。因此，自失活載體可以大大降低產生具有複製能力之病毒之風險。
在一些實施例中，本發明之核酸可以係RNA，例如活體外合成之RNA。用於活體外合成RNA之方法係熟習此項技術者已知的；任何已知之方法可用於合成包含編碼本發明之鈣調神經磷酸酶變體之序列之RNA。將RNA引入宿主細胞之方法係此項技術中已知的。參見，例如Zhao等人 Cancer Res. (2010) 15: 9053。將包含編碼本發明之鈣調神經磷酸酶變體之核苷酸序列之RNA引入宿主細胞可以在活體外或離體或活體內進行。例如，宿主細胞(例如，Treg、NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)可以在活體外或離體用包含編碼本發明之鈣調神經磷酸酶變體之核苷酸序列之RNA電穿孔。
為了評估多肽或其部分之表現，待引入細胞之表現載體還可含有選擇標誌物基因或報道基因或兩者，以便於從試圖藉由病毒載體來轉染或感染之細胞群中鑑定及選擇表現細胞。在一些實施例中，選擇標誌物可以在單獨之DNA片段上攜帶並用於共轉染程序。選擇標誌物及報道基因都可以側接適當之調節序列以使其能夠在宿主細胞中表現。有用之選擇標誌物包括但不限於抗生素抗性基因。
報道基因用於鑑定潛在轉染之細胞及用於評估調節序列之功能。通常，報道基因係不存在於受體生物體或組織中或由其表現之基因，並且編碼多肽，該多肽之表現藉由一些易於檢測之特性(例如酶活性)表現出來。在將DNA引入受體細胞後之適當時間評估報道基因之表現。合適之報道基因可包括但不限於編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌之鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。E. 細胞來源
適用於本發明之細胞包括但不限於幼稚細胞、效應記憶細胞、中樞記憶細胞、幹中樞記憶細胞、效應記憶細胞及長壽命效應記憶細胞。在一些實施例中，細胞包括但不限於免疫抑制細胞，例如調節性T細胞(Treg)，被修飾為直接免疫抑制之非Treg(例如，藉由分泌IL-10或TGF-β)，及被修飾為間接免疫抑制之非Treg(例如，殺死抗原呈遞細胞(APC)之細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte; CTL))。在一些實施例中，細胞包括但不限於樹突細胞、骨髓衍生之抑制細胞、免疫調節巨噬細胞、間充質幹細胞、多潛能成體祖細胞、胚胎幹細胞、誘導多能幹細胞、先天淋巴細胞、不變之自然殺傷(natural killer; NK)T細胞。在一些實施例中，細胞包括造血細胞及其前體細胞。
在擴增之前，從受試者獲得免疫細胞來源用於離體操作。用於離體操作之靶細胞之來源還可以包括例如自體或異源供體血液、臍帶血或骨髓。例如，免疫細胞之來源可以來自待用本發明之經修飾之免疫細胞治療之受試者，例如受試者之血液、受試者之臍帶血或受試者之骨髓。受試者之非限制性實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。較佳地，受試者係人。
免疫細胞可以從許多來源獲得，包括血液、外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞係免疫系統之細胞，例如先天性或適應性免疫之細胞，例如骨髓或淋巴樣細胞，包括淋巴細胞，通常係T細胞及/或NK細胞。其他示例性細胞包括幹細胞，例如多潛能幹細胞及多能幹細胞，包括胚胎幹細胞(embryonic stem cell; ESC)及誘導多能幹細胞(induced pluripotent stem cell; iPSC)。在一些態樣，細胞係人細胞。關於待治療之受試者，細胞可以係同種異體及/或自體的。細胞通常係原代細胞，例如直接從受試者分離及/或從受試者分離並冷凍之細胞。
在某些實施例中，免疫細胞係T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+幼稚T細胞、中樞記憶T細胞或效應記憶T細胞)、CD4+ T細胞、天然殺傷T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞、造血幹細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)或樹突細胞。在一些實施例中，細胞係單核細胞或粒細胞，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞及/或嗜鹼性粒細胞。在一個實施例中，靶細胞係誘導之多能幹(iPS)細胞或源自iPS細胞之細胞，例如，從受試者產生之iPS細胞，該細胞被操縱以改變(例如，誘導突變)或操縱一個或多個靶基因之表現，並分化成例如T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+幼稚T細胞、中樞記憶T細胞或效應記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴祖細胞或造血幹細胞。
在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一個或多個亞組，例如整個T細胞群，CD4+細胞，CD8+細胞及其亞群，例如按照功能，活化狀態，成熟度，用於分化、擴增、再循環、定位及/或持久性能力之潛力，抗原特異性，抗原受體類型，在特定器官或區室中之存在，標誌物或細胞因子分泌譜，及/或分化程度來定義之彼等亞群。在T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細胞之亞型及亞群中，有幼稚T(TN)細胞、效應T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，諸如幹細胞記憶T(TSCM)、中樞記憶T(TCM)、效應記憶T(TEM)或終末分化效應記憶T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte; TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T(mucosa-associated invariant T; MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T(Treg)細胞、輔助T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助細胞T細胞、α/βT細胞及δ/γT細胞。在某些實施例中，可以使用此項技術中可獲得之任何數量之T細胞株。
在一些實施例中，該等方法包括從受試者中分離免疫細胞，對它們進行製備、處理、培養及/或改造。在一些實施例中，工程細胞之製備包括一個或多個培養及/或製備步驟。如上所述之用於工程化之細胞可以從樣品中分離，例如生物樣品，例如從受試者獲得或衍生自受試者之樣品。在一些實施例中，分離細胞之受試者係患有疾病或病症或需要細胞療法或將投與細胞療法之受試者。在一些實施例中，受試者係需要特定治療干預之人，例如過繼細胞療法，其中細胞被分離、處理及/或工程化。因此，在一些實施例中，細胞係原代細胞，例如原代人細胞。樣品包括直接取自受試者之組織、液體及其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟之樣品，例如分離、離心、基因工程(例如用病毒載體轉導)、洗滌及/或溫育。生物樣品可以係直接從生物來源獲得之樣品或被處理之樣品。生物樣品包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液及汗液、組織及器官樣品，包括由其衍生之經處理樣品。
在一些態樣，衍生或分離細胞之樣品係血液或血液衍生之樣品，或者係單采血液成分術或白細胞去除術產物或來自單采血液成分術或白細胞去除術產物。示例性樣品包括全血、外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)、白細胞、骨髓、胸腺、組織活檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或由其衍生之細胞。在細胞療法例如過繼細胞療法之背景下，樣品包括來自自體及同種異體來源之樣品。
在一些實施例中，細胞衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞獲自異種來源，例如，來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物及豬。在一些實施例中，細胞之分離包括一個或多個製備及/或基於非親和力之細胞分離步驟。在一些實例中，細胞在一種或多種試劑之存在下洗滌、離心及/或溫育，例如，以移除不需要之組分、富集所需組分、裂解或移除對特定試劑敏感之細胞。在一些實例中，基於一種或多種性質來分離細胞，例如密度、黏附性質、大小、對特定組分之敏感性及/或抗性。
在一些實例中，來自受試者之循環血液之細胞例如藉由單采血液成分術或白細胞去除術獲得。在一些態樣，樣品含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞及/或血小板，並且在一些態樣包含除紅細胞及血小板之外之細胞。在一些實施例中，洗滌從受試者收集之血細胞，例如以移除血漿部分並將細胞置於合適之緩衝液或培養基中用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline; PBS)洗滌細胞。在一些態樣，根據製造商之說明藉由切向流過濾(tangential flow filtration; TFF)完成洗滌步驟。在一些實施例中，洗滌後將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施例中，移除血細胞樣品之組分並將細胞直接重懸於培養基中。在一些實施例中，該方法包括基於密度之細胞分離方法，例如藉由裂解紅細胞從外周血製備白細胞並藉由Percoll或Ficoll梯度離心。
在一個實施例中，藉由單采血液成分術或白細胞分離術獲得從個體之循環血液中獲得之免疫細胞。單采血液成分產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞及血小板。可以洗滌藉由單采血液成分術收集之細胞以移除血漿部分並將細胞置於適當之緩衝液或培養基中，例如磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline; PBS)或洗滌溶液缺乏鈣並且可能缺乏鎂或者可能缺少許多(即使不是全部)二價陽離子，用於後續處理步驟。洗滌後，可將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液中，例如不含Ca、不含Mg PBS。或者，可以移除單采血液成分樣品之不希望之組分，並將細胞直接重懸於培養基中。
在一些實施例中，分離方法包括基於細胞中一種或多種特定分子(例如表面標誌物，例如表面蛋白/細胞內標誌物或核酸)之表現或存在來分離不同細胞類型。在一些實施例中，可以使用任何已知之基於此類標誌物之分離方法。在一些實施例中，分離係基於親和力或免疫親和力之分離。例如，在一些態樣中，分離包括基於細胞之一種或多種標誌物(通常係細胞表面標誌物)之表現或表現水準來分離細胞及細胞群，例如藉由與特異性結合至此等標誌物之抗體或結合配偶體一起溫育，通常然後進行洗滌步驟及從未與抗體或結合配偶體結合之細胞中分離已經結合抗體或結合配偶體之細胞。
此等分離步驟可以基於陽性選擇，其中保留了結合試劑之細胞用於進一步使用及/或陰性選擇，其中保留了未與抗體或結合配偶體結合之細胞。在一些實例中，保留兩種級分以供進一步使用。在一些態樣，當沒有可用於特異性鑑定異質群體中之細胞類型之抗體時，陰性選擇可能特別有用，使得最好基於由除所需群體之外之細胞表現之標誌物進行分離。分離不需要導致100%富集或移除特定細胞群或表現特定標誌物之細胞。例如，特定類型細胞，例如表現標誌物之細胞之陽性選擇或富集，係指增加此類細胞之數量或百分比，但不需要導致完全不存在不表現標誌物之細胞。同樣，特定類型細胞，例如表現標誌物之細胞之陰性選擇、移除或消耗，係指減少此類細胞之數量或百分比，但不需要導致所有此類細胞之完全移除。
在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中來自一個步驟之陽性或陰性選擇之級分經歷另一個分離步驟，例如隨後之陽性或陰性選擇。在一些實例中，單個分離步驟可以同時消耗表現多個標誌物之細胞，例如藉由將細胞與多個抗體或結合配偶體一起溫育，每個抗體或結合配偶體對於靶向陰性選擇之標誌物具有特異性。同樣地，藉由將細胞與在各種細胞類型上表現之多個抗體或結合配偶體一起溫育，可以同時陽性選擇多種細胞類型。
在一些實施例中，一種或多種T細胞群針對對於一種或多種特定標誌物(例如表面標誌物)呈陽性(標誌物+)或高水準表現(標誌物高 )，或者對於一種或多種標誌物呈陰性(標誌物-)或相對低水準表現(標誌物低 )之細胞進行富集或耗盡。例如，在一些態樣，T細胞之特定亞群，例如陽性或表現高水準之一種或多種表面標誌物之細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+ T細胞藉由陽性或陰性選擇技術分離。在某些情況下，此類標誌物物係在某些T細胞群(例如非記憶細胞)上不存在或表現水準相對較低，但在某些其他T細胞群(如記憶細胞)上存在或表現水準相對較高之標誌物。在一個實施例中，細胞(例如CD8+細胞或T細胞，例如CD3+細胞)針對對於CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L呈陽性或表現高表面水準之細胞進行富集(即，陽性選擇)及/或針對對於CD45RA呈陽性或表現高表面水準之細胞進行耗盡(例如，陰性選擇)。在一些實施例中，細胞對於陽性或表現高表面水準之CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra(CD127)之細胞進行富集或耗盡。在一些實例中，CD8+ T細胞對於CD45RO陽性細胞(或CD45RA陰性)及CD62L陽性細胞進行富集。例如，可以使用CD3/CD28偶合之磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)來陽性選擇CD3+、CD28+ T細胞。
在一些實施例中，藉由陰性選擇在非T細胞(例如B細胞、單核細胞或其他白細胞上表現之標誌物(例如CD14)，將T細胞與PBMC樣品分離。在一些態樣，CD4+或CD8+選擇步驟用於分離CD4+輔助細胞及CD8+細胞毒性T細胞。藉由對一種或多種幼稚、記憶及/或效應T細胞亞群上表現或表現相對較高程度之標誌物之陽性或陰性選擇，可以將此等CD4+及CD8+群體進一步分類成亞群。在一些實施例中，CD8+細胞進一步富集或耗盡幼稚、中樞記憶、效應記憶及/或中樞記憶幹細胞，例如藉由基於與相應亞群相關之表面抗原之陽性或陰性選擇。在一些實施例中，進行中樞記憶T(TCM)細胞之富集以增加功效，例如改善投與後之長期存活、擴增及/或植入，在一些態樣中，此功效在此類亞群中特別穩健。在一些實施例中，組合富含TCM之CD8+ T細胞及CD4+ T細胞進一步增強功效。
在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+外周血淋巴細胞之CD62L+及CD62L-亞組中。PBMC可以富集或耗盡CD62L-CD8+及/或CD62L+ CD8+級分，例如使用抗CD8及抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群及CD8+ T細胞亞群，例如富集中樞記憶(TCM)細胞之亞群。在一些實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞之富集基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD127之陽性或高表面表現；在某些態樣，它基於對表現或高度表現CD45RA及/或顆粒酶B之細胞之陰性選擇。在一些態樣，藉由耗盡表現CD4、CD14、CD45RA之細胞及對表現CD62L之細胞之陽性選擇或富集來進行富含TCM細胞之CD8+群體之分離。在一個態樣，中心記憶T(TCM)細胞之富集以基於CD4表現來選擇之陰性細胞部分開始來進行，該細胞部分經歷基於CD14及CD45RA之表現來進行之陰性選擇，及基於CD62L之陽性選擇。在一些態樣中，此等選擇係同時進行的，並且在其他態樣中，以任何順序依次進行。在一些態樣，用於製備CD8+細胞群或亞群之相同基於CD4表現之選擇步驟也用於產生CD4+細胞群或亞群，使得來自基於CD4之分離之陽性及陰性部分得以保留並用於方法之後續步驟中，視情況地在一個或多個其他陽性或陰性選擇步驟之後。
藉由鑑定具有細胞表面抗原之細胞群，將CD4+ T輔助細胞分類為幼稚、中樞記憶及效應細胞。CD4+淋巴細胞可藉由標準方法獲得。在一些實施例中，幼稚CD4+ T淋巴細胞係CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4+細胞係CD62L+及CD45RO+。在一些實施例中，效應CD4+細胞係CD62L-及CD45RO。在一個實例中，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，抗體或結合配偶體與固體支持物或基質(例如磁珠或順磁珠)結合，以允許細胞分離用於陽性及/或陰性選擇。
在一些實施例中，在基因工程之前或與基因工程相關地溫育及/或培養細胞。溫育步驟可包括培養、培植、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，組合物或細胞在刺激條件或刺激劑之存在下溫育。此等條件包括被設計用於誘導群體中細胞之增殖、擴增、活化及/或存活，模擬抗原暴露及/或預處理細胞用於基因工程化，例如用於引入重組抗原受體之彼等條件。該等條件可包括以下一種或多種：特定培養基、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑例如營養物、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，例如細胞因子、趨化因子、抗原、結合配偶體、融合蛋白、重組可溶性受體及任何其他意欲活化細胞之試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一種或多種試劑，例如配體，該一種或多種試劑能夠活化TCR複合物之細胞內信號傳導結構域。在一些態樣，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內信號級聯。此類試劑可包括抗體，例如對於TCR組分及/或例如與固體支持物如珠子結合之共刺激受體，例如抗CD3、抗CD28，及/或一種或多種細胞因子具有特異性之抗體。視情況地，擴增方法可以進一步包括向培養基中添加抗CD3及/或抗CD28抗體之步驟(例如，濃度至少約0.5 ng/ml)。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如，IL-2濃度為至少約10單位/mL。
在另一個實施例中，藉由裂解紅細胞及耗盡單核細胞從外周血分離T細胞，例如，藉由PERCOLLTM梯度離心。或者，可以從臍帶中分離T細胞。無論如何，可以藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離T細胞之特定亞群。
如此分離之臍帶血單核細胞可以耗盡表現某些抗原之細胞，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19及CD56。使用分離之抗體、包含抗體之生物樣品例如腹水、與物理支持物結合之抗體及細胞結合之抗體，可以實現此等細胞之消耗。
藉由陰性選擇來富集T細胞群可以使用針對陰性選擇之細胞特有之表面標誌物之抗體組合來完成。較佳之方法係藉由負磁免疫黏附或流式細胞術進行細胞分選及/或選擇，該技術使用針對陰性選擇細胞上存在之細胞表面標誌物之單株抗體混合物。例如，為了藉由陰性選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
為了藉由陽性或陰性選擇來分離所需之細胞群，可以改變細胞及表面(例如顆粒，諸如珠子)之濃度。在某些實施例中，可能需要顯著降低珠子及細胞混合在一起之體積(即，增加細胞濃度)，以確保細胞及珠子之最大接觸。例如，在一個實施例中，使用20億個細胞/ml之濃度。在一個實施例中，使用10億個細胞/ml之濃度。在另一個實施例中，使用大於1億個細胞/ml。在另一個實施例中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在另一個實施例中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在進一步之實施例中，可以使用1.25或1.5億個細胞/ml之濃度。使用高濃度可導致細胞產量、細胞活化及細胞擴增增加。
在洗滌步驟後也可以冷凍T細胞，此不需要單核細胞移除步驟。雖然不希望受理論束縛，但冷凍及隨後之解凍步驟藉由去除細胞群中之粒細胞及一定程度之單核細胞提供了更均勻之產物。在去除血漿及血小板之洗滌步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液及參數在此項技術中係已知的並且在此情況下係有用的，但在一個非限制性實例中，一種方法涉及使用含有20%DMSO及8%人血清白蛋白之PBS，或其他合適之細胞冷凍介質。然後將細胞以1℃/分鐘之速率冷凍至-80℃並儲存在液氮儲罐之氣相中。可以使用其他控制冷凍方法，也可以在-20℃或液氮中立即進行不受控制之冷凍。
在一個實施例中，T細胞群包含在細胞內，例如外周血單核細胞、臍帶血細胞、純化之T細胞群及T細胞株。在另一個實施例中，外周血單核細胞包含T細胞群。在另一個實施例中，純化之T細胞包含T細胞群。
在某些實施例中，可以從樣品中分離T調節細胞(Treg)。樣品可包括但不限於臍帶血或外周血。在某些實施例中，藉由流式細胞術分選來分離Treg。在藉由此項技術中已知之任何方法分離之前，樣品可以富集Treg。分離之Treg可以在使用前冷凍保存及/或擴增。分離Treg之方法描述於美國專利第7,754,482號、第8,722,400號及第9,555,105號，以及美國專利申請案第13/639,927號中，其內容以其整體併入本文。F. 細胞之擴增
無論在細胞修飾之前或之後，可以使用如以下專利中所述之方法活化及擴增細胞，例如免疫細胞，例如，美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國公開案第20060121005號。
用於擴增Treg細胞之方法之實例係熟習此項技術者公知的，並且包括但不限於：使用吸附在磁珠或奈米顆粒上之刺激性抗體，通常係抗CD3及抗CD28，以及使用刺激性細胞因子(通常來自IL-2、IL-15及IL-4)；使用刺激性抗體，通常係抗CD3及抗CD28，以及使用對吸附在磁珠或奈米粒子上之刺激性抗體具有特異性之配體及使用刺激性細胞因子(通常來自IL-2、IL-15及IL-4之群)；使用塗覆在細胞培養容器之表面上之刺激性抗體，通常係抗CD3及抗CD28，及使用刺激性細胞因子(通常來自IL-2、IL-15及IL-4)；如以引用方式併入本文之WO2006/108882中所述，使用飼養細胞。用於將T細胞分化成調節性T細胞之方法之實例係此項技術中熟知的，並且包括但不限於暴露於雷帕黴素、地塞米松、IL-10、IFN-α、致耐受性抗原呈遞細胞如樹突細胞等。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由 Wakkach等人 (Immunity 2003 May；18(5):605-17)所述，並且包括以下步驟之方法獲得：a)從受試者中分離祖細胞群；b)藉由在IL-10(培養基中之濃度範圍為50-250 U/mL，較佳100 U/mL)存在下培養祖細胞群獲得樹突細胞群；c)使步驟b)之細胞與在特定抗原存在下從受試者分離之CD4+ T淋巴細胞群接觸，以使針對抗原之CD4+ T細胞分化成調節性T細胞群；d)從步驟c)中回收調節性T細胞群。該方法也可以使用地塞米松及維生素D3，或耐受化或未成熟之DC代替步驟b)之DC進行。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由專利US6746670中描述，並且包括以下步驟之方法獲得：a)在具有適當量之IFN-α之培養基(較佳5 ng/ml培養基)中培養從受試者分離之針對特定抗原之CD4+ T細胞群；及b)回收調節性T細胞群。在步驟a)中，培養基可進一步包含適量之IL-10，較佳100 U/mL。在步驟b)中，可以在包含IL-15之培養基中培養調節性T細胞群以允許增殖，IL-15在培養基中較佳為5 ng/ml。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由專利申請案WO02/092793中描述，並且包括以下步驟之方法獲得：a)在由人工抗原呈遞細胞呈遞之特定抗原存在下活體外活化CD4+ T細胞群；b)回收包含至少10%調節性T細胞之活化之CD4+ T細胞。在一些實施例中，人工抗原呈遞細胞表現HLA II系統分子及人LFA-3分子，並且不表現共刺激分子B7-1、B7-2、B7-H1、CD40、CD23及ICAM-l。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由Groux等人(Nature 1997, 389(6652):737-42)描述，並且包括以下步驟之方法獲得：a)在特定抗原及適當量之IL-10(較佳100 U/ml培養基)下活體外活化CD4+ T細胞群；及b)回收調節性T細胞群。較佳地，IL-10存在於培養基中。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由專利申請案WO2007/010406中描述，包括以下步驟之方法獲得：a)用特異性抗原刺激白細胞群或外周血單核細胞(PBMC)群；b)從受刺激之群體中回收抗原特異性Treg細胞群；c)視情況地擴增抗原特異性Treg細胞群。
獲得調節性T細胞之其他方法係此項技術中已知的，包括例如如美國專利第9,228,172號及美國公開案第US201601571471A1號中所述誘導從非Treg群體產生Treg。
在一些實施例中，離體培養擴增之調節性T細胞可藉由美國專利第7,651,855號、第8,129,185號及第9,181,526號中描述之方法獲得。在一些實施例中，調節性T細胞可以從獲自臍帶血之細胞群中分離，如美國專利第9,273,282號及第9,187,727號中所述。擴增調節性T細胞之方法也描述於美國公開案第20130101567號中。在一些實施例中，可以藉由根據美國專利第9,228,172號及美國公開案第20160151471號中描述之方法將非Treg轉化為Treg來獲得Treg。在一些實施例中，根據美國專利第9,644,179號及美國公開案第20170211042號中描述之方法，可以藉由將T細胞轉化為Treg來獲得調節性T細胞。
白細胞包括幾種類型之細胞，該等細胞之特徵在於它們之重要性、分佈、數量、壽命及潛力。此等類型如下：多核或顆粒狀白細胞，其中包括嗜酸性粒細胞、嗜中性白細胞及嗜鹼性白細胞，以及單核細胞，或外周血單核細胞(PBMC)，該等細胞係大的白細胞，並且包括免疫系統之主要細胞類型(淋巴細胞及單核細胞)。可以藉由熟習此項技術者已知之任何方法將白細胞或PBMC與外周血分離。有利地，為了分離PBMC，可以使用離心，較佳密度梯度離心，較佳不連續密度梯度離心。另一種方法係使用特異性單株抗體。在某些實施例中，通常使用標準方法藉由Ficoll-Hypaque從全血產物中分離PBMC。在其他實施例中，藉由白細胞分離術回收PBMC。
在一些實施例中，調節性T細胞可以藉由以下方法獲得：a)在特定抗原存在下用間充質幹細胞培養白細胞群或外周血單核細胞(PBMC)群；及b)回收Treg細胞群。此方法也可以用幼稚或記憶T細胞代替PBMC或白細胞進行。
在一些實施例中，可以藉由在IL-2及TGF-β存在下培養T細胞來獲得Treg細胞(Davidson等人，The Journal of Immunology, 2007, 178:4022-4026)。在另一個實施例中，可以藉由在TGF-β存在下培養T細胞來獲得Treg細胞。
藉由本文揭示之方法擴增細胞可以倍增約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍 、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大，以及它們之間之任何及所有整體或部分整數。
培養後，可以將細胞在培養裝置中之細胞培養基中培養一段時間，或者直到細胞達到匯合或高細胞密度，以便在將細胞傳遞至另一個培養裝置之前進行最佳傳代。培養裝置可以係通常用於活體外培養細胞之任何培養裝置。較佳地，在將細胞傳遞至另一個培養裝置之前，匯合水準為70%或更高。更佳地，匯合水準為90%或更高。一段時間可以係適合於活體外培養細胞之任何時間。可以在細胞培養期間隨時更換細胞培養基。較佳地，每2至3天更換一次細胞培養基。然後從培養裝置中收穫細胞，隨後可立即使用細胞或冷凍保存以備後用。在一個實施例中，本發明包括冷凍保存擴增之細胞。在將核酸引入細胞之前解凍冷凍保存之細胞。
在一些實施例中，該方法包括分離細胞及擴增細胞。在另一個實施例中，本發明進一步包括在擴增前冷凍保存細胞。在另一個實施例中，將冷凍保存之細胞解凍以使用編碼嵌合膜蛋白之RNA進行電穿孔。
如本文所述之培養步驟(與本文所述之試劑接觸或在電穿孔後接觸)可以非常短，例如小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述之培養步驟(與本文所述之試劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
各種術語用於描述培養中之細胞。細胞培養物通常係指取自活生物體並在受控條件下生長之細胞。原代細胞培養物係直接取自生物體並在第一次傳代培養之前之細胞、組織或器官之培養物。當細胞在促進細胞生長及/或分裂之條件下置於生長培養基中時，細胞在培養中擴增，導致更大之細胞群。當細胞在培養中擴增時，細胞增殖速率通常藉由細胞數量加倍所需之時間量來測量，也稱為倍增時間。
每輪傳代培養稱為傳代。當細胞進行傳代培養時，它們被稱為已經傳代。特定之細胞群或細胞株有時藉由其傳代之次數來提及或表徵。例如，已傳代十次之培養細胞群可稱為P10培養物。原代培養物，即從組織中分離細胞後之第一培養物，命名為P0。在第一次傳代培養後，將細胞描述為二級培養物(P1或第1代)。在第二次傳代培養後，細胞變成三級培養物(P2或第2代)，依此類推。熟習此項技術者將理解，在傳代期間可能存在許多群體倍增；因此，培養物之群體倍增數量大於傳代數。在傳代期間細胞之擴增(即群體倍增之數量)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、受質、培養基及傳代之間之時間。
在一個實施例中，細胞可以培養數小時(約3小時)至約14天或其間之任何小時整數值。適合於Treg細胞培養之條件包括適當培養基，該培養基可以包含增殖及活力所必需之因子，及/或熟習此項技術者已知之用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括但不限於表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑，例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer，添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適當量之血清(或血漿)或一組確定之激素，及/或足以使Treg生長及擴增之量之細胞因子。抗生素，例如青黴素及鏈黴素，僅包括在實驗培養物中，而不包括在要輸注至受試者體內之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如適當之溫度(例如37℃)及大氣(例如空氣加5%CO2 )。
藉由本文揭示之方法分離之細胞可以擴增大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更高。在一個實施例中，Treg在約20倍至約50倍或更多之範圍內擴增。在一個實施例中，藉由抗CD3抗體塗覆之KT64.86人工抗原呈遞細胞(aAPC)擴增人T調節細胞。本文描述了用於擴增及活化Treg之方法。
在一個實施例中，擴增Treg之方法可以進一步包括分離擴增之Treg用於進一步之應用。在另一個實施例中，擴增方法可以進一步包括隨後對擴增之Treg進行電穿孔，然後進行培養。隨後之電穿孔可以包括將編碼試劑之核酸引入至擴增之Treg群中，例如轉導擴增之Treg、轉染擴增之Treg，或用核酸將擴增之Treg電穿孔，其中該試劑進一步刺激Treg。該試劑可以刺激Treg，例如藉由刺激進一步之擴增或功能。G. 治療方法
本文所述之經修飾之細胞(例如，Treg)可包含在用於免疫療法，尤其抑制性免疫療法之組合物中。該組合物可包括醫藥組合物，並且進一步包括醫藥學上可接受之載體。可以投與治療有效量之包含修飾細胞之醫藥組合物。
在一個態樣，本發明包括用於過繼性細胞轉移療法之方法，其包括向有需要之受試者投與本發明之經修飾之T細胞。另一態樣，本發明包括治療受試者之疾病或病症之方法，包括向有需要之受試者投與修飾之T細胞群。
還包括治療有此需要之受試者之疾病或病症之方法，包括向受試者投與遺傳編輯之修飾細胞(例如，遺傳編輯之修飾之Treg、遺傳編輯之修飾之Teff)。在一個實施例中，治療有此需要之受試者之疾病或病症之方法包括向受試者投與本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑及/或免疫抑制藥物抗性細胞。
用於過繼細胞療法之免疫細胞之投與方法係已知的，並且可以與所提供之方法及組合物一起使用。例如，過繼T細胞治療方法描述於例如Gruenberg等人之美國專利申請公開案第2003/0170238號；Rosenberg之美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)。參見，例如Themeli等人 (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928933；Tsukahara等人 (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila等人 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338。在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法藉由自體轉移進行，其中從接受細胞療法之受試者或者從衍生自該受試者之樣品中分離及/或以其他方式製備細胞。因此，在一些態樣，細胞來自需要治療之受試者，例如患者，並且在分離及處理後將細胞投與於相同之受試者。
在一些實施例中，細胞療法，例如過繼性T細胞療法，藉由同種異體轉移進行，其中從接受或最終接受細胞療法之受試者，例如，第一受試者以外之受試者分離及/或以其他方式製備細胞。在此類實施例中，然後將細胞投與於相同物種之不同受試者，例如第二受試者。在一些實施例中，第一及第二受試者在遺傳上係相同的。在一些實施例中，第一及第二受試者在遺傳上係相似的。在一些實施例中，第二受試者表現與第一受試者相同之HLA類或超型。
在一些實施例中，在投與細胞或含有細胞之組合物之前，用靶向疾病或病症(例如GVHD)之治療劑治療受試者。在一些實施例中，受試者對其他治療劑係難治的或無反應的。在一些實施例中，受試者患有持續性或復發性疾病，例如在用另一種治療性干預，包括化療、放射及/或造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation; HSCT)，例如同種異體HSCT治療後。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但投與有效地治療了受試者。在一些實施例中，受試者已經用GVHD之標準護理預防治療，例如類固醇(例如，糖皮質激素)及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑(例如，FK506、CsA)。
在一些情況下，細胞係如本文所述之遺傳編輯之Teff。在一些實施例中，該方法包括向受試者投與遺傳編輯之Teff至受糖皮質激素或CaNI治療之造血幹細胞移植患者。不受任何特定理論或作用方式之束縛，投與修飾之Teff，其中糖皮質激素受體基因座已被修飾以增加對類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑之敏感性，據信增加或維持此類患者之Teff存活。在一些情況下，修飾之Teff係腫瘤特異性的或對於特定腫瘤類型富集的。在一些情況下，修飾之Teff係病原體特異性的(例如，對巨細胞病毒或BK病毒特異)。
在一些實施例中，受試者對其他治療劑有反應，並且用治療劑治療減輕了疾病負擔。在一些態樣，受試者最初對治療劑有反應，但隨著時間之推移表現出疾病或病症之復發。在一些實施例中，受試者未復發。在一些此類實施例中，確定受試者處於復發之風險中，例如復發之高風險，因此預防性投與細胞，例如以降低復發之可能性或防止復發。在一些態樣，受試者未接受過另一種治療劑之預先治療。
在一些實施例中，受試者患有持續性或復發性疾病，例如在用另一種治療性干預，包括化療、放射及/或造血幹細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation; HSCT)，例如同種異體HSCT治療後。在一些實施例中，儘管受試者已經對另一種療法產生抗性，但投與有效地治療了受試者。
在一些實施例中，受試者已經接受幹細胞移植，或者係幹細胞移植之候選者。在一些實施例中，受試者已接受實體器官移植，或者係實體器官移植之候選者。在一些實施例中，受試者患有自體免疫疾病。在一些實施例中，受試者患有移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)。在一些實施例中，受試者患有1型糖尿病。
在一個實施例中，治療有此需要之受試者之疾病或病症之方法包括向受試者投與治療有效量之本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞。在一個實施例中，治療有此需要之受試者之疾病或病症之方法包括向受試者投與治療有效量之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性Treg。
本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞能夠在免疫療法之常規標準護理條件下植入、存活、持續及/或增殖，例如投與糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑，用於抑制及/或誘導淋巴造血系統細胞之衰老及/或細胞毒性。因此，本發明之細胞能夠在更長及持續之時間內發揮其治療效果。
當投與本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞時，保護移植之組織免於排斥。在一個實施例中，類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞可介導持久性免疫抑制。在一個實施例中，類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞可以抑制響應於同種異體抗原之T細胞增殖。在一些實施例中，在細胞、組織及/或器官移植後，同種異體抗原可以在移植之細胞、組織及/或器官上普遍表現。在此等情況下，可能發生大量免疫細胞浸潤到移植之細胞、組織及/或器官中，導致移植之細胞、組織及/或器官之破壞。因此，在一些實施例中，本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞能夠減少免疫細胞之浸潤，從而保護移植之細胞、組織及/或器官免於破壞。在一些情況下，移植之細胞、組織及/或器官可介導毒性。因此，在一些實施例中，本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞能夠減少移植之細胞、組織及/或器官介導之毒性。
因此，本發明提供了在有此需要之受試者中實現預防性治療效果之方法，及/或在有此需要之受試者中實現免疫抑制作用之方法，例如，正在經歷同種異體反應或自體免疫反應之受試者。在一些實施例中，用於在有此需要之受試者中實現預防性治療效果之方法，及/或在具有同種異體反應或自體免疫反應之有此需要之受試者中實現免疫抑制作用之方法，包括向受試者投與本發明之類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞。
本發明之方法應被解釋為包括防止任何類型之移植器官、組織或細胞之排斥，包括但不限於肺、心臟(例如，心肌細胞)、心臟瓣膜、皮膚(例如，纖維母細胞)、肝臟(如肝細胞)、手、腎、胰腺、腸、胃、胸腺、骨骼、肌腱、角膜、睾丸、神經、靜脈、血液(如全血、白細胞、紅細胞、血小板、血漿、血清)、骨髓(如單核細胞、巨噬細胞、間充質幹細胞)、幹細胞(如間充質幹細胞(mesenchymal stem cell; MSC)、造血幹細胞(hematopoietic stem cell; HSC))、朗格漢斯胰島細胞、神經細胞(如神經元、大膠質細胞、小膠質細胞)、免疫細胞(例如，T細胞、自然殺傷(NK)細胞或NKT(自然殺傷T)細胞)，及造血細胞及其組分。該方法可以提供排斥防護之其他組織及細胞類型包括但不限於上皮細胞、纖維母細胞、神經細胞、角質細胞、造血細胞、黑素細胞、軟骨細胞、淋巴細胞(B及T)、巨噬細胞、單核球、單核細胞、心肌細胞、其他肌肉細胞、顆粒細胞、卵丘細胞、表皮細胞、內皮細胞、朗格漢斯胰島細胞、胰腺胰島素分泌細胞、胰腺α-2細胞、胰腺β細胞、胰腺α-1細胞、骨細胞、骨前體細胞、神經幹細胞、原始幹細胞、肝細胞、主動脈內皮細胞、微血管內皮細胞、臍靜脈內皮細胞、纖維母細胞、肝星狀細胞、主動脈平滑肌細胞、心肌細胞、神經元、庫普弗細胞、平滑肌細胞、施萬細胞、紅細胞、血小板、中性粒細胞、淋巴細胞、單核球、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、胰島細胞、甲狀腺細胞、甲狀旁腺細胞、腮腺細胞、神經膠質細胞、星形膠質細胞、紅細胞、白細胞、巨噬細胞、體細胞、垂體細胞、腎上腺細胞、毛細胞、膀胱細胞、腎細胞、視網膜細胞、視桿細胞、錐細胞、心臟細胞、肝細胞、起搏細胞、脾細胞、抗原呈遞細胞、記憶細胞、T細胞、B細胞、漿細胞、肌細胞、卵巢細胞、子宮細胞、前列腺細胞、陰道上皮細胞、精子細胞、睾丸細胞、生殖細胞、卵細胞、睾丸間質細胞、管周細胞、支持細胞、黃體素細胞、宮頸細胞、子宮內膜細胞、乳腺細胞、卵泡細胞、黏液細胞、纖毛細胞、非角化上皮細胞、角化上皮細胞、肺細胞、杯狀細胞、柱狀上皮細胞、多巴胺能細胞、鱗狀上皮細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、胚胎幹細胞、纖維母細胞及纖維母細胞。本發明之方法還包括針對移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之保護。
在某些實施例中，除了類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性細胞外，還可以給受試者投與二級治療，例如免疫抑制藥物。免疫抑制藥物之實例包括但不限於潑尼松、硫唑嘌呤、他克莫司及環孢菌素A。在一些實施例中，二級治療係類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑。在一些實施例中，類固醇係皮質類固醇。在一些實施例中，類固醇係糖皮質激素，該糖皮質激素選自黃體酮型糖皮質激素、氫化可體松型糖皮質激素、美達松型糖皮質激素及丙酮化物型糖皮質激素組成之群。在一些實施例中，糖皮質激素選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮，及其衍生物及類似物組成之群。在一些實施例中，鈣調神經磷酸酶抑制劑選自環孢菌素、伏孢素、吡美莫司及他克莫司，及其衍生物及類似物組成之群。
在一些實施例中，向受試者提供二級治療。二級治療包括但不限於化療、放射、手術及藥物治療。
本發明之細胞可以以在適當之臨床前及臨床實驗及試驗中確定之劑量及途徑及時間投與。細胞組合物可以在此等範圍內之劑量下多次投與。如熟習此項技術者所確定的，本發明細胞之投與可以與用於治療所需疾病或病症之其他方法組合。
就接受治療之受試者而言，待投與之本發明之細胞可以係自體的。
本發明細胞之投與可以以熟習此項技術者已知之任何適宜之方式進行。可以藉由氣溶膠吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植將本發明之細胞投與於受試者。本文所述之組合物可經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結內、髓內、肌肉內、藉由靜脈內(i.v.)注射或腹膜內投與患者。在其他情況下，將本發明之細胞直接注射到受試者之炎症部位、受試者之局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
在一些實施例中，細胞以期望之劑量投與，在一些態樣中包括所需劑量或數量之細胞或細胞類型及/或所需比率之細胞類型。因此，在一些實施例中，細胞之劑量基於細胞總數(或每千克體重之數量)及個別群體或亞型之所需比率。在一些實施例中，細胞劑量基於個別群體或個別細胞類型中所需之細胞總數(或每千克體重之數量)。在一些實施例中，劑量基於此等特徵之組合，例如所需數量之總細胞、所需比率及各個群體中所需之細胞總數。
在一些實施例中，細胞群或亞型在所需劑量之總細胞，例如所需劑量之T細胞之容許差異下或在該容許差異內投與。在一些態樣，所需劑量係所需數目的細胞或投與細胞之受試者每單位體重之所需數目的細胞，例如細胞/kg。在一些態樣，所需劑量等於或高於最小細胞數或每單位體重最小細胞數。在一些態樣，在以所需劑量投與之總細胞中，各個群體或亞型以期望之輸出比率或接近期望之輸出比率存在，例如，在此比率之某個容許差異或誤差內。
在一些實施例中，在一種或多種個別細胞群體或亞型之所需劑量之容許差異下或在該容許差異內投與細胞。在一些態樣，所需劑量係亞型或群體之細胞之所需數量，或投與細胞之受試者每單位體重之此類細胞之所需數量，例如細胞/kg。在一些態樣，所需劑量等於或高於群體或亞型之最小細胞數，或每單位體重之群體或亞型之最小細胞數。因此，在一些實施例中，劑量基於期望之總細胞之固定劑量及期望之比率，及/或基於各個亞型或亞群之一個或多個(例如每個)之所需固定劑量。
在某些實施例中，細胞或細胞亞型之個別群體以約一百萬至約一千億個細胞之範圍投與於受試者，例如，一百萬至約500億個細胞(例如，大約500萬個細胞、大約2500萬個細胞、大約5億個細胞、大約10億個細胞、大約50億個細胞、大約200億個細胞、大約300億個細胞、大約400億個細胞，或者由上述任何兩個值定義之範圍)，例如，大約1000萬到大約1000億個細胞(例如，大約2000萬個細胞、大約3000萬個細胞、大約4000萬個細胞、大約6000萬個細胞、大約7000萬個細胞、大約8000萬個細胞、大約9000萬個細胞、大約100億個細胞、大約250億個細胞、大約500億個細胞、大約750億個細胞、大約900億個細胞，或由上述任何兩個值定義之範圍)，以及在某些情況下大約1億個細胞到大約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或此等範圍之間之任何值。
在一些實施例中，總細胞劑量及/或個別細胞亞群之劑量在以下範圍內：等於或大約1x105 細胞/kg至約1x1011 細胞/kg 104 與等於或大約1011 細胞/千克(kg)體重，諸如105 至106 細胞/kg體重，例如等於或大約1 x 105 細胞/kg、1.5 x 105 細胞/kg、2 x 105 細胞/kg，或1 x 106 細胞/kg體重。例如，在一些實施例中，細胞以以下劑量或在一定誤差範圍內以以下劑量之間之劑量投與：等於或大約104至等於或大約109 T細胞/千克(kg)體重，諸如105 至106 T細胞/kg體重，例如等於或大約1 x 105 T細胞/kg、1.5 x 105 T細胞/kg、2 x 105 T細胞/kg，或1 x 106 T細胞/kg體重。在其他示例性實施例中，用於本發明之方法之修飾細胞之合適劑量範圍包括但不限於約1x105 細胞/kg至約1x106 細胞/kg、約1x106 細胞/kg至約1x107 細胞/kg、約1x107 細胞/kg約1x108 細胞/kg、約1x108 細胞/kg約1x109 細胞/kg、約1x109 細胞/kg約1x1010 細胞/kg、約1x1010 細胞/kg約1x1011 細胞/kg。在一個示例性實施例中，用於本發明之方法之合適劑量為約1 x 108 個細胞/kg。在一個示例性實施例中，用於本發明之方法之合適劑量為約1 x 107 個細胞/kg。在其他實施例中，合適之劑量為約1 x 107 個總細胞至約5 x 107 個總細胞。在一些實施例中，合適之劑量為約1 x 108 個總細胞至約5 x 108 個總細胞。在一些實施例中，合適之劑量為約1.4 x 107 個總細胞至約1.1 x 109 個總細胞。在一個示例性實施例中，用於本發明之方法之合適劑量係約7 x 109 個總細胞。
在一些實施例中，細胞以以下劑量或在一定誤差範圍內以以下劑量之間之劑量投與：等於或大約104 至等於或大約109 細胞/千克(kg)體重，諸如105 至106 細胞/kg體重，例如等於或大約1 x 105 細胞/kg、1.5 x 105 細胞/kg、2 x 105 細胞/kg，或1 x 106 細胞/kg體重。在一些實施例中，細胞以以下劑量或在一定誤差範圍內以大於及/或至少以下劑量投與：約1 x 106 、約2.5 x 106 、約5 x 106 、約7.5 x 106 ，或約9 x 106 個細胞。在一些實施例中，細胞以以下劑量或在一定誤差範圍內以以下劑量之間之劑量投與：約108 至1012 或約1010 至1011 T細胞，約10s至1012 或約1010 至1011 細胞。
在一些實施例中，細胞在多種細胞群或亞型之所需輸出比率下或在該比率之容許範圍內投與。在一些態樣，期望比率可以係特定比率或可以係比率範圍，例如，在一些實施例中，期望比率在等於或大約5: 1至等於或大約5: 1之間(或大於約5: 1且小於約5: 1)，或等於或大約1: 3至等於或大約3: 1之間(或大於大約1: 3且小於大約3: 1)，例如等於或大約2: 1至等於或大約1: 5之間(或大於大約1: 5且小於大約2: 1，例如等於或大約5: 1、4.5: 1、4: 1、3.5: 1、3: 1、2.5: 1、2: 1、1.9: 1、1.8: 1、1.7: 1、1.6: 1、1.5: 1、1.4: 1、1.3: 1、1.2: 1、1.1: 1、1: 1、1: 1.1、1: 1.2、1: 1.3、1:1.4、1: 1.5、1: 1.6、1: 1.7、1: 1.8、1: 1.9: 1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5，或1:5。在一些態樣，容許差異在所需比率之約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之內，包括此等範圍之間之任何值。
在一些實施例中，將一定劑量之經修飾之細胞以單劑量或多劑量投與於有此需要之受試者。在一些實施例中，一定劑量之經修飾細胞以多劑量投與，例如，每週一次或每7天一次、每兩週一次或每14天一次、每三週一次或每21天一次、每四週一次或每28天一次。在一個示例性實施例中，將單劑量之經修飾細胞投與於需要其之受試者。在一個示例性實施例中，藉由快速靜脈內輸注將單劑量之經修飾之細胞投與於需要其之受試者。
對於預防或治療疾病，適當之劑量可取決於待治療之疾病類型、細胞或重組受體之類型、疾病之嚴重程度及病程、細胞是否用於預防或治療目的而投與、先前治療、受試者之臨床病史及對細胞之反應，以及主治醫師之自由裁量權。在一些實施例中，組合物及細胞適合一次或在一系列治療中投與於受試者。
在一些實施例中，細胞作為組合治療之一部分投與，例如與另一種治療性干預，例如抗體或工程細胞或受體或試劑例如細胞毒性劑或治療劑同時或以任何順序依次投與。在一些實施例中，細胞與一種或多種另外之治療劑或與另一種治療干預，同時或以任何順序依次來共同投與。在一些情況下，細胞與另一種療法在時間上足夠接近地共同投與，使得細胞群增強一種或多種另外之治療劑之作用，或反之亦然。在一些實施例中，在一種或多種另外之治療劑之前投與細胞。在一些實施例中，在一種或多種另外之治療劑之後投與細胞。在一些實施例中，一種或多種另外之試劑包括細胞因子，例如，以增強持久性。在一些實施例中，該方法包括投與化學治療劑。
在投與細胞後，在一些實施例中，例如藉由許多已知方法中之任何一種測量工程細胞群之生物活性。在活體內，例如藉由成像，或離體，例如藉由ELISA或流式細胞術，要評估之參數包括工程化或天然T細胞或其他免疫細胞與抗原之特異性結合。在某些實施例中，工程細胞破壞靶細胞之能力可以使用此項技術中已知之任何合適之方法測量，例如在例如Kochenderfer等人, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)，及Herman等人 J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)中描述之細胞毒性測定。在某些實施例中，藉由測定一種或多種細胞因子之表現及/或分泌來測量細胞之生物活性。在一些態樣，藉由評估臨床結果(例如腫瘤負擔或負荷之減少)來測量生物活性。H. 醫藥組合物及調配物
還提供了本發明之造血細胞或其前體細胞之群體，含有此等細胞及/或富含此等細胞之組合物，例如其中表現重組受體之細胞構成組合物中之總細胞，或某些類型之細胞如T細胞或CD8+或CD4+細胞之至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，99%或更多。在此等組合物中有用於投與，例如過繼細胞療法之醫藥組合物及調配物。還提供了將細胞及組合物投與受試者例如患者之治療方法。
還提供了用於投與之包含細胞之組合物，包括醫藥組合物及調配物，例如以給定劑量或其部分投與之包括一定數量之細胞之單位劑型組合物。醫藥組合物及調配物通常包括一種或多種視情況之醫藥學上可接受之載體或賦形劑。在一些實施例中，組合物包含至少一種另外之治療劑。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑，該製劑之形式使得其中所含活性成分之生物活性有效，並且不含對調配物所投與之受試者具有不可接受之毒性之其它成分。「醫藥學上可接受之載體」係指醫藥調配物中除活性成分外之成分，該成分對受試者無毒。醫藥學上可接受之載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些態樣，載體之選擇部分地由特定細胞及/或藉由投與方法確定。因此，存在多種合適之調配物。例如，醫藥組合物可含有防腐劑。合適之防腐劑可包括，例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及苯紮氯銨。在一些態樣，使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物重量之約0.0001%至約2%之量存在。載體例如藉由Remington's Pharmaceutical Sciences 第16卷, Osol, A. 編(1980)描述。醫藥學上可接受之載體在所用之劑量及濃度下通常對接受者無毒，並且包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及蛋胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁基或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子如鈉；金屬複合物(例如，鋅-蛋白質複合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些態樣中，緩衝劑包括在組合物中。合適之緩衝劑包括，例如，檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀及各種其他酸及鹽。在一些態樣，使用兩種或更多種緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物通常以總組合物重量之約0.001%至約4%之量存在。製備可投與之醫藥組合物之方法係已知的。示例性方法更詳細地描述於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins；第21版 (2005年5月1日)中。
調配物可包括水溶液。調配物或組合物還可含有一種以上可用於用細胞治療之特定適應症、疾病或病症之活性成分，較佳彼等活性成分具有與細胞互補之活性，其中各活性不會相互產生不利影響。此等活性成分適合以對預期目的有效之量組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲胺蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼及/或長春新鹼。在一些實施例中，醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病症之量之細胞，例如治療有效量或預防有效量。在一些實施例中，藉由定期評估所治療之受試者來監測治療或預防功效。所需劑量可以藉由單次推注投與細胞，藉由多次推注投與細胞，或藉由連續輸注投與細胞來遞送。
調配物包括口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺、透皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與之調配物。在一些實施例中，腸胃外投與細胞群。本文所用之術語「腸胃外」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道及腹膜內投與。在一些實施例中，使用藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射之外周全身遞送將細胞投與於受試者。在一些實施例中，組合物作為無菌液體製劑提供，例如等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏性組合物，該等製劑在一些態樣可以緩衝至選定之pH。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物及固體組合物更容易製備。另外，液體組合物稍微更方便投與，尤其藉由注射。另一方面，黏性組合物可以配製在適當之黏度範圍內，以提供與特定組織之更長之接觸時間。液體或黏性組合物可包含載體，該等載體可以係溶劑或分散介質，該溶劑或分散介質含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適之混合物。
無菌可注射溶液可以藉由將細胞併入溶劑中來製備，例如與合適之載體、稀釋劑或賦形劑如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖等混合。該等組合物可含有輔助物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/或顏料，此取決於投與途徑及所需製劑。在某些態樣，可以參考標準文獻來製備合適之製劑。
可以添加各種增強組合物穩定性及無菌性之添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚及山梨酸，可以確保防止微生物之作用。藉由使用延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠，可以實現可注射藥物形式之延長吸收。
用於活體內投與之調配物通常係無菌的。例如，藉由無菌過濾膜過濾可以容易地實現無菌。J. 動物模型
本發明提供(例如細胞或組織)移植後疾病或病症之活體內動物模型。在一些實施例中，動物模型係(例如細胞或組織)同種異體移植後之疾病或病症。在一些實施例中，動物模型係異種移植後(例如細胞或組織)之疾病或病症。在某些實施例中，本發明提供了(例如細胞或組織)同種異體移植後移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之活體內動物模型。在某些實施例中，本發明提供了(例如細胞或組織)異種移植後移植物抗宿主病(graft versus host disease; GVHD)之活體內動物模型。本發明還提供了製備此等動物模型之方法。
在一些實施例中，在同種異體或異種移植後之GVHD之活體內動物模型包含含有同種異體細胞群之動物。如本文所用，術語「同種異體」係指遺傳上不相似但是為相同物種之材料，該材料可以係免疫學上不相容的。例如，同種異體細胞或組織係源自來自相同物種之遺傳上不相似之來源之細胞或組織。如本文所用，術語「異種」係指屬不同物種之材料。例如，異種細胞或組織係源自不同物種之細胞或組織。
如本文所提供的，GVHD之活體內動物模型係GVHD之鼠模型。在一些實施例中，同種異體細胞係同種異體血漿血液單核細胞(plasma blood mononuclear cell; PBMC)。在一些實施例中，異種細胞係異種PBMC。在一些實施例中，鼠GVHD模型包含免疫缺陷小鼠，該小鼠包含同種異體(即，衍生自遺傳上不相似之小鼠)或異種(即，衍生自不同物種)PBMC之群體。
各種免疫缺陷小鼠品系係此項技術中已知的，包括但不限於「裸」、「scid」、「rag缺陷」及「高階、多基因」品種之免疫缺陷小鼠品系。裸鼠係Foxn1nu 突變之純合子。Foxn1編碼毛囊及胸腺發育所需之轉錄因子。在它缺乏之情況下，小鼠無毛及無胸腺。由於胸腺不能形成，CD4+及CD8+ T細胞無法分化及成熟，使裸純合子T細胞缺陷。Scid小鼠係Prkdcscid 突變之純合子。基因Prkdc編碼DNA依賴性蛋白激酶之催化亞基，該激酶係DNA修復及密封在T細胞受體(T cell receptor; TCR)及免疫球蛋白(Ig)基因之體細胞重組過程中發生之雙鏈DNA斷裂所必需的。在沒有Prkdc蛋白之情況下，TCR及Ig基因不能重排，導致T及B細胞缺陷之小鼠。Rag缺陷小鼠係不能表現功能性Rag1或Rag2蛋白之小鼠。與Prkdc基因一樣，Rag1及Rag2都係TCR及Ig基因之體細胞重組所必需的，並且任一基因之缺失都會導致T細胞及B細胞缺乏。攜帶Rag1tm1Mom 或Rag2tm1.1Cgn 突變之小鼠具有非常相似之(即使不相同之)表型。高階、多基因免疫缺陷小鼠由Prkdcscid 或Rag缺陷小鼠構建，並攜帶額外之免疫缺陷增強突變。在此等小鼠中，我們的NSG及NRG小鼠攜帶白細胞介素2受體γ亞基基因(Il2rgtm1Wj1 )中之特異性突變，以及相應之Prkdcscid 及Rag1tm1Mom 。此等小鼠係B、T及NK細胞缺陷的。另外，因為它們都具有NOD/ShiLtJ遺傳背景，它們係溶血性補體缺陷的並攜帶對巨噬細胞及樹突細胞功能有不利影響之等位基因。在某些實施例中，免疫缺陷小鼠係BALB/c小鼠。在某些實施例中，免疫缺陷小鼠係NOD/Scid/IL-2Rg -/-(NSG)小鼠。
在一些實施例中，同種異體PBMC群可以源自遺傳上不相似之供體小鼠。在某些實施例中，供體小鼠係C57BL/6小鼠。在某些實施例中，同種異體PBMC群源自C57BL/6小鼠之骨髓。因此，本發明之同種異體GVHD鼠模型包含免疫缺陷之BALB/c小鼠，該小鼠包含源自供體C57BL/6小鼠骨髓之同種異體PBMC群。
在一些實施例中，異種PBMC群可以源自人。因此，本發明之異種GVHD鼠模型包含免疫缺陷之NSG小鼠，該小鼠包含衍生自人之異種PBMC群。
在一些實施例中，製備本發明之GVHD動物模型之方法包括將同種異體或異種PBMC群體注射/投與到宿主動物(例如小鼠)中。在一些實施例中，製備本發明之GVHD鼠模型之方法包括將同種異體或異種PBMC群注射/投與到免疫缺陷小鼠中。在一些實施例中，製備本發明之同種異體GVHD鼠模型之方法包括將同種異體PBMC群注射/投與到免疫缺陷小鼠中。在一些實施例中，製備本發明之異種GVHD鼠模型之方法包括將異種PBMC群注射/投與到免疫缺陷小鼠中。
在一些實施例中，在注射同種異體或異種PBMC之前，免疫缺陷小鼠係經非致死性照射的。在某些實施例中，非致死性地照射免疫缺陷小鼠包括使小鼠經受約50拉德至約200拉德之輻射劑量。在一些實施例中，非致死性地照射免疫缺陷小鼠包括使小鼠經受約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約80、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約175、約180、約185、約190、約195、約200、約205、約210、約215、約220、約225拉德之輻射劑量，或其間之任何值。熟習此項技術者將能夠確定投與小鼠之輻射之適當之非致死劑量。
在某些實施例中，免疫缺陷小鼠注射/投與約1 x 106 至約20 x 106 個同種異體或異種PBMC。在一些實施例中，向免疫缺陷小鼠注射/投與約0.5 x 106 、0.6 x 106 、0.7 x 106 、0.8 x 106 、0.9 x 106 、1 x 106 、1.1 x 106 、1.2 x 106 、1.3 x 106 、1.4 x 106 、1.5 x 106 、2 x 106 、3 x 106 、4 x 106 、5 x 106 、10 x 106 、15 x 106 、16 x 106 、17 x 106 、18 x 106 、19 x 106 、19.5 x 106 、19.6 x 106 、19.7 x 106 、19.8 x 106 、19.9 x 106 、20 x 106 、20.1 x 106 、20.2 x 106 、20.3 x 106 、20.4 x 106 、20.5 x 106 、21 x 106 、22 x 106 、23 x 106 、24 x 106 、25 x 106 個同種異體或異種PBMC，或其間之任何值。熟習此項技術者將能夠確定注射到免疫缺陷小鼠中之適當數量之PBMC。
在一些實施例中，與野生型動物相比，當用類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑治療時，本發明之GVHD動物模型之存活率降低。在某些實施例中，與野生型小鼠相比，當用類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑治療時，本發明之GVHD鼠模型之存活率降低。
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雖然已經參考本發明之特定實施例描述了本發明，但是熟習此項技術者應該理解，在不脫離本發明之真實精神及範圍之情況下，可以進行各種改變並且可以替換等同物。對於熟習此項技術者來說顯而易見地，在不脫離本文揭示之實施例之範圍之情況下，可以使用合適之等同物進行本文所述方法之其他合適之修改及改編。另外，可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、過程、過程步驟或步驟適應本發明之目的、精神及範圍。所有此等修改都意欲在所附權利要求之範圍內。現在已經詳細描述了某些實施例，藉由參考以下實例將更清楚地理解此等實施例，該等實例僅出於說明之目的而包括在內，而不係限制性的。實例
以下實驗性實例不係限制性的，並且涉及用於產生類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性免疫細胞之組合物及方法。材料及方法： 符合 GMP 標準之 Treg
藉由兩步程序從人單采血液成分產物中純化Treg，其中使用GMP級mAb偶合之磁珠來陽性選擇CD25+細胞(包括Treg)，然後分選幼稚及記憶Treg PB(分別為CD4+25++127-45RA+及CD4+25++127-45RA-(第 1 圖 )。用GMP品質之人工抗原呈遞細胞(aAPC)刺激純化之細胞，並在高劑量IL-2(300 U/mL)中培養14天。擴增之Treg在第14天庫存(凍結)。對於本文所述之實驗，將Treg解凍並用符合GMP之抗CD3/28珠子再刺激7-10天。在培養結束時評估Treg純度及活體外抑制功能。幼稚及記憶Treg之培養物顯示相似數量之FOXP3+細胞，並且所有培養物在活體外都係抑制性的。實例 1 ：地塞米松對 Treg 存活及擴增之影響
為了確定Treg是否對糖皮質激素受體活化之免疫抑制作用敏感，產生了庫存Treg之來源。庫存之Treg由磁珠富集之外周血細胞(4+25++127lo及分別用於幼稚及效應記憶細胞之CD45RA+及CD45RA-之變體)產生。使用裝載有抗CD3 mAb之IL-2、K562-CD64/86細胞在14天培養物中擴增純化之Treg，以在重複實驗中提供更大之一致性。將庫存之tTreg解凍，使用抗CD3/28 mAb珠子再刺激，然後如所示進一步擴增4±1天或更長時間。然後將Treg分成培養物±地塞米松(Dex：10、30、100 μg/ml)，並在2-3天後使用活力染料及計數珠子藉由流式細胞術來評估相對存活。
Dex以劑量依賴之方式降低培養物中之Treg數量(第 2B 圖 )。不受任何理論束縛，Treg擴增培養物含有10-35%Foxp3-細胞，此歸因於在不存在雷帕黴素之情況下延長培養並使用磁珠而非流式分選。為了排除細胞數量減少係歸因於Treg優先損失之可能性，上述培養物也用CD127及Foxp3染色，並確定Treg(CD4+CD127-FOXP3+)及非Treg對於Dex之相對易感性(第 2C 圖 )。Dex處理沒有顯著影響Treg培養物之純度，表明Treg活力/存活受到Dex之不利影響。測試了±30 μg/ml Dex生長之Treg之抑制功能(第 2D 圖 )。在再擴增培養物中Trex暴露於Dex增加了抑制功能。實例 2 ：基因靶向策略
核受體亞家族3，C組，成員1(NR3C1)基因編碼糖皮質激素受體(GR，也稱為NR3C1)，該受體係皮質醇及其他糖皮質激素結合之受體。靶向策略係藉由易出錯之非同源末端連接(nonhomologous end-joining; NHEJ)途徑藉由可程式規劃核酸酶基因破壞及誘變DNA修復來破壞外顯子2。為了明確定義Treg中基因靶向應用之條件，採用了NR3C1之直接基因破壞以及新穎同源定向修復方法之綜合方法。
開發了一種藉由以破壞糖皮質激素受體基因座之方式靶向插入鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因來產生雙重藥物(類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑)抗性的策略。為了實現此舉，設計了四種來自聚集之規則間隔迴文重複序列(clustered regularly interspaced palindromic repeat; CRISPR)/Cas9系統之試劑用於測試。在Jurkat細胞中進行研究以優化遞送及藥物給藥參數。測試具有指導RNA(gRNA)之Cas9 mRNA，該指導RNA用核酸酶抗性硫代磷酸酯鍵特異性修飾以防止細胞內降解。同時，測試了作為核糖核蛋白(ribonucleoprotein; RNP)產物之與gRNA複合之Cas9蛋白。對於基因破壞及基於同源定向修復(homology directed repair; HDR)之基因編輯，比較了兩種遞送方法。在詳盡之給藥、定時及電穿孔條件優化後，Cas9 RNP被鑑定為Jurkat細胞中之最佳基因破壞及修復平台。該策略不需要化學修飾之gRNA，並且在某些條件下可以代表用於研究及臨床級基因組工程及細胞製造之更簡化之工程、合成及遞送方法。
使用此等參數，使用如第 3A 圖 所示之實驗方案來進行T細胞之CRISPR/Cas9工程之使用。人原代T細胞在IL-2存在下生長並用CD3/CD28珠子活化48-72小時。CRISPR/Cas9試劑使用指導RNA轉錄物(Synthego)及重組Cas9肽(Aldevron)，該轉錄物及肽使用氖電穿孔裝置(ThermoFisher)遞送。各個候選物位於NR3C1之外顯子2中，並藉由MIT CRISPR設計工具鑑定(第 3B 圖 )。使用Surveyor核酸酶測定來評估核酸酶活性(第 3C 圖 )，觀察到所有四個候選物都具有活性，如Surveyor DNA片段化產物所證明的(第 3D 圖 )。鑑定之兩個候選物，稱為GR1及GR2，表現出最高之活性水準(第 3D 圖 )。實例 3 ： Treg 中之 CRISPR/Cas9 介導之 NR3C1 敲除
為了確定GR1及GR2指導是否也能夠在臨床相關之Treg培養物中敲除NR3C1基因座，將庫存之Treg解凍並在高劑量IL-2(300 U/mL)中、用抗CD3/28珠子再刺激。在第3天，如上所述在不存在或存在GR1或GR2 GRISPR/Cas9 RNP之情況下對Treg進行電穿孔，並在最佳擴增條件下回收培養。2天後，收穫Treg培養物並再次培養±地塞米松(30 μg/ml)另外48小時(總共7天)，此時收穫培養物，並使用活力染料及計數珠子藉由流式細胞術評估相對存活率。藉由在經歷CRISPR/Cas9基因修飾及0-100 ug/mL之地塞米松給藥之Jurkat及原代T細胞中進行β測試來鑑定30 ug/mL之劑量。如第 4B 圖 所示，用GR2 CRISPR/Cas9電穿孔之Treg在地塞米松存在下顯著增加存活。藉由非同源末端連接修復CRISPR/Cas9基因導致接近gRNA結合位點之插入及缺失(插入缺失)。因此，評估了使用稱為TIDE(藉由分解跟蹤插入缺失)之序列跟蹤分解算法之插入缺失模式。分析地塞米松前後暴露樣品(分別為第 4C 及 4D 圖 )。預計在添加地塞米松之前導致Treg基因失活之框外插入缺失之頻率為約35%，此與用GR2 GRISPR/Cas9試劑處理之外周血T細胞之實驗觀察結果相似(約40%)。在地塞米松培養後，插入缺失之頻率增加至44%。不受任何理論束縛，此表明基因修飾之Treg之優先存活。獲得地塞米松抗性之細胞也顯示出框外插入缺失之富集。實例 4 ： Treg 中之同源定向修復
為了實現雙重藥物(類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑)抗性，使用Jurkat及原代T細胞來定義最佳同源定向修復(homology directed repair; HDR)之條件。比較並評估Cas9 mRNA及Cas9 RNP方法使用人AAVS1基因座處之報道HDR構建體促進HDR之能力。在此等研究中，觀察到Cas9 RNP隨後立即添加AAV病毒供體模板導致最大(＞ 65%HDR率)。設計HDR模板，並且如第 5A 圖 所示，並且含有與GFP共表現並由MND啟動子驅動之鈣調神經磷酸酶抗性基因。鈣調神經磷酸酶抗性基因之側翼係與NR3C1基因同源之供體靶向臂，使得插入破壞外顯子2，伴隨21個胺基酸之缺失(第 5A 圖 )。為了定義Treg中HDR之條件，使用對於AAV轉導係最佳的培養條件(Treg密度為2 x 106 個細胞/ml)。將供體包裝在AAV-6血清型病毒顆粒中，並以各種感染複數(multiplicities of infection; MOI)添加到已用GR2 gRNA及Cas9蛋白電穿孔之Treg中。使用在供體內部具有一個PCR引子並且在供體外部位於相鄰基因組基因座處之另一個PCR之由內而外PCR策略，在每個MOI下在Treg中觀察到HDR(第 5B 圖 )。Sanger測序顯示供體臂與內源基因座之連接(第 5C 圖 )。實例 5 ：在最佳 Treg 擴增條件下使用 GR2-Cas9 及 AAV 之 Treg 中之 HDR
為了在臨床相關之培養環境中優化HDR，將庫存之Treg解凍、刺激、擴增2天，然後用GR2-Cas9進行電穿孔。電穿孔後，用AAV以3 x 105 之MOI轉導細胞，並返回到最佳Treg擴增條件。在此等條件下，轉導後Treg擴增沒有顯著影響(第 6B 圖 )，並且觀察到來自HDR供體之GFP表現(第 6C 圖 )。用GR2-Cas9及CnB mut. AAV處理之Treg群體當與地塞米松一起培養時，顯示存活增加(第 6D 圖 )。實例 5 ：本發明之 Treg 在 ＞3 倍峰值治療條件下對 CsA 或 FK506 毒性不敏感
為了模擬CNI對Treg存活及擴增之活體內抑制作用，將庫存之Treg解凍、再刺激、擴增4±1天並用或不用環孢菌素(20、200及2000 ng/ml)或FK506(3、10、30 ng/ml)處理另外2-3天，並且藉由流式細胞術評估相對存活率。使用未分離之T reg、幼稚Treg及記憶Treg進行研究，以確定一個亞組是否對Dex及CNI具有差異敏感性，並確定IL-2依賴性差異是否允許較低之IL-2濃度。三個群體之結果參數沒有差異。
第 7 圖 顯示，在此等條件下，CsA或FK506對活體外Treg存活均無顯著影響，即使濃度超過峰值治療值＞3倍。鈣調神經磷酸酶及CNI之主要靶標之一係轉錄因子NFAT，該NFAT在CD28下游被活化並且係Treg發育所必需的。IL-2信號傳導也可以活化NFAT。不受任何理論之束縛，活體外對Treg之CsA及FK506毒性之缺乏可能係由於培養物中之超生理IL-2濃度。為了測試是否可以藉由降低IL-2濃度來揭示效果，解凍/再刺激之Treg在培養之最後3天在滴定濃度之IL-2中暴露於CsA或FK506，並藉由流式細胞術評估相對存活率。實例 6 ：建立用於活體內 GVHD 模型之糖皮質激素及鈣調神經磷酸酶抑制劑平台，以驗證 Treg 之基因修飾增加免疫抑制環境中之功效
為了測試基因修飾(GR2-CRISPR/Cas9)或基因編輯(GR2-CRISPR/Cas9/AAV-CaN mut.)Treg是否在糖皮質激素存在下，在活體內具有增加之功效，首先確定糖皮質激素(甲基-潑尼松龍)如何在臨床前小鼠模型中影響GVHD。同種異體GVHD模型之使用有以下幾個原因：1)建立最佳GVHD預防劑量之Csa(最佳80 mg/kg/天，相比之下20或40 mg/kg/天無效)及FK506 [在羧甲基纖維素中之36 mg/kg/天(55%-90%第100天存活率，相比之下使用媒劑第37天存活率為0%]，48 mg/kg/天具有一定毒性，12或24 mg/kg/天在水溶液中之效力較差；n = 16-26/組)；2)建立最佳Treg產生及擴增方案，導致＞90%之小鼠中之GVHD預防並進一步滴定Treg劑量以確定臨界值Treg:Teffector比率，該比率太低而不能均勻地預防GVHD(0.75:1被認為係次優的；0.5:1提供了長期存活率＜50%之水準之保護；及3)同種異體GVHD模型非常適合GVHD病理生理學研究，包括Treg及Teffector轉運、持久性及功能，促進深入Treg及Teffector研究。由於此等原因，以及同種異體GVHD模型在邏輯上更可行且具有成本效益之益處，首先測試在同種異體受體中用於GVHD預防及治療之優化之類固醇使用，然後應用於異種模型以使得能夠測試人Treg產物。使用C57BL/6(B6)供體骨髓+ 2 x 106 個T細胞之致死照射之BALB/c受體，在第1至28天測試劑量為1、3及6 mg/kg /劑量之甲基強的松龍，相比之下在第0至14天使用0.5 mg/kg/天之雷帕黴素，然後3x/週至第27天。存活率及p值如第 8 圖 所示。T細胞劑量減少至1.5 x 106 並從第3天或第4天(而非第1天預防)開始轉移至GVHD治療，並且將媒劑之無治療與潑尼松龍(n = 8/組)進行比較。第3天用潑尼松龍治療GVHD可改善結果(第 9 圖 )。
延遲潑尼松龍治療至第4天係無效的。接下來，進行實驗以確定10 mg/kg d3-28之潑尼松龍是否係可再現的，並且觀察到此情況(第 10 圖 )。
此等資料提供了GVHD之類固醇治療模型，其中類固醇可以拯救一部分小鼠，但不係治癒性的，從而提供了一個測試添加類固醇抗性或敏感之Treg之論壇。實例 7 ：在異種 GVHD 模型中建立基於類固醇及鈣調神經磷酸酶抑制劑之 GVHD 預防及治療方案
為了確定潑尼松龍、Csa及FK506之最佳劑量，給予非致死性照射(50拉德)、免疫缺陷之NOD/Scid/IL-2Rg-/-(NSG)小鼠15 x 106 個人外周血單核細胞(PBMC)。在第 11A 圖 中概述，給予小鼠高劑量潑尼松龍(30 mg/kg，第0-28天)，因為在同種異體GVHD模型中、在10 mg/kg下僅觀察到不完全之GVHD預防(根據第 8-10 圖 )。潑尼松龍之劑量/時程沒有提供存活優勢，並且治療之小鼠具有較低之中位存活率(25對29天)，儘管差異不顯著(第 11B 圖 )。除了存活，體重減輕及人T細胞擴增已被證明係該異種GVHD模型中疾病嚴重程度之標誌。在該實驗中，潑尼松龍處理之平均體重與對照沒有顯著差異(第 11C 圖 )。此等小鼠在第19天確實在血液中具有顯著更多之人CD4+及CD8+ T細胞(第 11D 圖 )。
為了評估CNI對異種GVHD模型之影響，向小鼠正常給予人PBMC，並且給予2種劑量(36或12 mg/kg)之FK506或CsA(80 mg/kg)(第 12A 圖 )。接受高劑量FK506之小鼠存活率顯著降低(p＜0.03)，並且雖然接受12 mg/kg FK506之小鼠中位存活率較低(20對29天)，存活率無顯著差異(第 12B 圖 ；P = 0.45)。接受CsA之小鼠之趨勢係存活率增加(目前P = 0.15)。FK506及CsA均導致顯著之早期體重減輕(第 12C 圖 )。FK506及CsA均顯著降低人CD45+、CD4+及CD8+細胞之活體內擴增(第 12D 圖 ；每個CNI群組及每種細胞類型相對於僅PBMC對照動物之p＜0.05)。隨訪研究表明，用200拉德 + 1 x 107 人PBMC誘導之異種GVHD病理學更具可重複性，並且中位存活從約25天減少至約20天。為了評估較低劑量潑尼松及CNI在此改變之異種GVHD模型中之作用，對小鼠進行照射(200拉德)，注射人PBMC(ip，1 x 107 )，並給予潑尼松(ip，10 mg/kg))、FK506或CsA(ip，分別為2 mg/kg或20 mg/kg)(第 13 圖 )。實例 8 ：基因編輯之 Treg 之表徵
由於在電穿孔之前需要耗盡刺激性CD3/28珠子，因此評估此舉是否會對擴增產生負面影響。將活體外擴增之幼稚Treg解凍並用CD3/28珠子(3:1珠子:Treg)再刺激，並在第3天將樣品分開並將來自一個樣品之珠子磁性耗盡。在珠子耗盡後，將Treg再培養4天(總共7天)。如第 14 圖 所示，在所示之各種操作之後未發現對擴增(n = 5)之顯著影響。
由於Treg對細胞外DNA特別敏感，並且電穿孔可導致壞死性細胞死亡及DNA釋放，因此測試了電穿孔是否會影響Treg擴增。將活體外擴增之幼稚Treg解凍並用CD3/28珠子(3:1珠子:Treg)再刺激。在第3天，將珠子磁性耗盡，並且對Treg進行±電穿孔處理，之後將細胞再培養4天(總共7天)。發現電穿孔對擴增沒有顯著影響(第 14B 圖 )。作為電穿孔功效之標誌物，在活體外轉錄之GFP mRNA存在下電穿孔Treg樣品。mRNA不僅耐受良好，而且GFP在所有細胞中均以高水準均勻表現，並且轉導後表現持續至少7天(第 14C 及 14D 圖 )。實例 9 ： Treg 中之鹼基編輯
以編碼該鹼基編輯器之蛋白質或mRNA，藉由鹼基編輯器以及指導RNA之電穿孔對Treg細胞進行鹼基編輯，該指導RNA用於靶向鹼基以使用該鹼基編輯器進行編輯。然後分離所編輯之細胞之基因組DNA並PCR擴增靶基因座。然後藉由Sanger測序對PCR擴增之基因座進行測序。藉由在靶位點識別多個峰來觀察鹼基轉化。然後使用EDITR方法對PCR擴增子序列資料進行分解，以量化鹼基編輯頻率 (參見，Kluesner等人 「EditR: A novel base editing quantification software using Sanger sequenceing」.DOI: 10.1101/213496. 2017)。對於第19-22圖及第24-27圖，鹼基編輯序列用紅色開口框來標記。
第16圖描繪了顯示鹼基編輯之示意圖，其中CRISPR失活或切口DNA結合結構域係dCas9，並且鹼基編輯結構域係胞苷脫胺酶。根據第17圖中所示之流程圖，在分離之Treg中進行鹼基編輯。鹼基編輯器可以作為RNP複合物遞送，其中指導RNA可以或可以不用硫代磷酸酯鍵修飾以防止內源RNA酶之細胞內降解。對於本申請案，鹼基編輯器作為信使RNA遞送，並且合成指導RNA以包含5'及3'硫代磷酸酯鍵以防止細胞內降解。鹼基編輯靶向設計意欲/被設計用於轉化核苷酸，使得引入過早終止密碼子。此外，外顯子:內含子邊界處被定義為剪接供體及受體之序列，其係內含子切除及適當之開放閱讀框定向及表現所需的，也係轉化之目標，以便破壞剪接。具有內含子保留之不正確剪接之RNA使RNA不穩定，導致降解及蛋白質表現之喪失。
進行鹼基編輯以在NR3C1之外顯子2中引入過早終止密碼子。用鹼基編輯器mRNA及具有SEQ ID NO：7所示序列之指導RNA進行Treg之電穿孔。遺傳基因座之測序揭示，鹼基編輯導致將基因組序列中之胞嘧啶(C)編輯成胸腺嘧啶(T)，從而導致過早之TAA終止密碼子(第18及19圖)。
進行鹼基編輯以在NR3C1之外顯子2中引入過早終止密碼子。用鹼基編輯器mRNA及具有SEQ ID NO：8所示序列之指導RNA進行Treg之電穿孔。遺傳基因座之測序揭示鹼基編輯導致將基因組序列中之胞嘧啶(C)編輯成胸腺嘧啶(T)，從而導致過早之TAG終止密碼子(第20及21圖)。
第22圖描繪了破壞假設基因之剪接位點之結果之示意圖。剪接供體或剪接受體位點之鹼基編輯可破壞基因之正常剪接，導致基因表現下調。
進行鹼基編輯以破壞NR3C1中之剪接受體。用鹼基編輯器mRNA及具有SEQ ID NO：55所示序列之指導RNA進行Treg之電穿孔。遺傳基因座之測序揭示，鹼基編輯導致將基因組序列中之腺苷(A)編輯成鳥嘌呤(G)，從而產生突變GG剪接受體位點(第23及24圖)。
進行鹼基編輯以破壞NR3C1中之剪接供體。用鹼基編輯器mRNA及具有SEQ ID NO：56所示序列之指導RNA進行Treg之電穿孔。遺傳基因座之測序揭示鹼基編輯導致將基因組序列中之鳥嘌呤(G)編輯成腺苷(A)，從而產生突變剪接供體位點(第25及26圖)。實例 10 ：效應 T 細胞中之鹼基編輯
以編碼該鹼基編輯器之蛋白質或mRNA，藉由鹼基編輯器以及指導RNA之電穿孔對效應T細胞(Teff)進行鹼基編輯，該指導RNA用於靶向鹼基以使用該鹼基編輯器進行編輯。第27圖描繪了兩個實驗之總體輪廓。在一個實驗中，糖皮質激素受體基因座係使用BE4在效應T細胞(Teff)中進行鹼基編輯，伴以兩輪珠子刺激。在第二個實驗中，糖皮質激素受體基因座係使用BE4在效應T細胞中進行鹼基編輯，但僅伴以一輪珠子刺激。第28圖描繪了顯示在使用gRNA GR2(表1中之SEQ ID NO：8)或BE4(表2中之SEQ ID NO：20)修飾之供體之糖皮質激素受體鹼基編輯後，在存在或不存在地塞米松的情況下，CD4+效應T細胞(Teff)之相對存活百分比之資料。第一供體之細胞接受兩輪刺激，並且第二供體之細胞接受一輪刺激。接受兩輪刺激之Teff對地塞米松(Dex)非常敏感。在兩個實驗中，用兩輪BE4進行編輯比30 μg/ml之GR2更有效(分別為p≤0.001，p≤0.01)。
無
從以下結合附圖對說明性實施例之詳細描述，將更全面地理解本發明之前述及其他特徵及優點。
第 1 圖 描繪了示出本發明實施例之Treg庫存方案之一種形式之示意圖。
第 2A-2D 圖 描繪了顯示地塞米松對Treg存活之影響之資料。如所述進行四次實驗。顯示之資料係來自所有實驗之聚合資料，並且代表平均值±平均值之1標準誤差。第 2A 圖 描繪了顯示培養條件之時間線之示意圖。第 2B 圖 描繪了顯示地塞米松對存活之影響之圖。第 2C 圖 描繪了顯示地塞米松對FOXP3+ CD127-細胞之影響之圖。第 2D 圖 描繪了顯示地塞米松對抑制活性之影響之圖。在每個Treg:PBMC比率下，兩組之間之P值≤0.05。
第 3A-3D 圖 描繪了CRISPR指導RNA及Cas9對NR3C1糖皮質激素受體進行基因編輯之過程。第 3A 圖 描繪了說明基因轉移過程之示意圖。收穫T細胞或Treg並用CD3/CD28珠子活化48 h(新鮮)或72 h(冷凍)。氖電穿孔裝置用於將Cas9 mRNA或蛋白質與基因特異性指導RNA一起遞送。第 3B 圖 描繪了說明NR3C1基因靶向之示意圖。鑑定並測試了外顯子2中之四個位點。確定了四個候選物。候選物使用Surveyor方法進行測試。第 3C 圖 描繪了說明Surveyor測定之示意圖。將基因修飾(「突變擴增子」)及未修飾(「野生型擴增子」)雜交，產生同源或異源雙鏈。由基因編輯及野生型序列配對引起之異源雙鏈被Surveyor酶切割，產生可預測之DNA片段。
第 4A-4D 圖 描繪了Treg中CRISPR/Cas9介導之NR3C1敲除。將指導RNA候選物GR1及GR2作為具有Cas9肽之核糖核蛋白顆粒(RNP)電穿孔到活化之Treg中。第 4A 圖 描繪了說明培養過程之示意圖。第 4B 圖 描繪了評估在所示條件下添加30 μg/mL地塞米松72 h之後Treg存活率之圖。第 4C 圖 及第 4D 圖 顯示地塞米松前(第 4C 圖 )及地塞米松後(第 4D 圖 )之NR3C1基因座之分子分析。從細胞庫擴增NR3C1基因座，並藉由TIDE進行插入缺失分析。對於地塞米松前後細胞，總基因修飾率分別為35%及44%。該圖對應於在每個群體中觀察到之插入缺失模式。不受任何理論之束縛，預測框外插入缺失(例如，不可被3整除之彼等)將導致基因失活。Y軸表示插入缺失之總數百分比。X軸表示相對於未修飾(在位置0中顯示為條形)之插入缺失。缺失顯示在0位置之左側，並且每個條形距離靶位點1-10 bp。在0位置之右側顯示+1 bp之插入。星號顯示+1、-1及-7 bp插入/缺失，並且此等事件之頻率隨著地塞米松暴露而增加(將第 4C 圖 與第 4D 圖 比較)，第 4C-4D 圖 中之深黑條表示編輯事件＜0.5%。
第 5A-5C 圖 描繪了Treg中之同源定向修復(HDR)。第 5A 圖 描繪了基因靶向策略。設計與GFP共表現之鈣調神經磷酸酶抗性基因，使其可以靶向NR3C1基因之外顯子2，導致21個胺基酸之缺失。將供體包封在AAV-6顆粒中，並使用內部/外部PCR進行篩選，該內部/外部PCR在靶標基因座處使用供體內及供體外之引子(由水平箭頭指示)。第 5B 圖 描繪了基因靶向優化。活化之Treg用NR3C1 Cas9 RNP電穿孔，並添加不同指定量之AAV-6供體。展示內部/外部PCR結果，並且Sanger測序證實供體與相鄰基因座序列之間之連接如第 5C 圖 所示。
第 6A-6D 圖 描繪了在最佳Treg擴增條件下使用GR2-Cas9及AAV在Treg中之HDR藉由插入鈣調神經磷酸酶變體(CnB mut)來挽救糖皮質激素破壞之Treg之存活。第 6A 圖 描繪了說明培養過程之示意圖。第 6B 圖 (p≤0.07) 描述了對照及鈣調神經磷酸酶變體(CnB mut)AAV轉導之Treg在2天時間內之倍數擴增。第 6C 圖 描繪了如對於對照(黑色)或鈣調神經磷酸酶變體(CnB mut；灰色)所列出之在無或地塞米松條件下之GFP表現百分比。第 6D 圖 描繪了模擬轉導或暴露於指定之地塞米松濃度之Treg之相對存活率。P值如所示，並代表來自四種不同培養物之聚合資料。
第 7A-7D 圖 描繪了與IL-2濃度相關之Treg藥物敏感性。第 7A 圖 描繪了說明用於獲得第 7B 圖 之資料之培養過程之示意圖。第 7B 圖 描繪了顯示沒有藥物(對照)或用CsA或他克莫司(FK506)培養之Treg存活百分比之資料(對於所有比較，p =不顯著)。顯示了相對於沒有藥物之對照Treg之存活百分比。使用300 U/mL之IL-2濃度。第 7C 圖 描繪了說明用於獲得第 7D 圖 之資料之培養過程之示意圖。第 7D 圖 描繪了顯示相對於在如所示之30、100或300 U/mL之IL-2存在下用指定濃度之藥物培養之Treg之相對存活率，在IL-2 300 U/mL下沒有藥物之Treg之相對存活率之資料。顯示三個(第 7B 圖 )或四個(第 7D 圖 )分開之培養物之平均值±平均值之標準誤差。
第 8 圖 描繪了同種異體BMT受體中GVHD預防之類固醇劑量反應。每組n = 8。對BALB/c小鼠進行致死照射，從第1-28天，給予B6 BM + 2 M T細胞及指定劑量之類固醇。使用低雷帕黴素劑量(第0-14天，每週3次至第27天)作為比較物。發現每組與媒劑對照顯著不同。
第 9 圖 描繪了同種異體BMT受體中基於類固醇之GVHD治療。每組n = 8。對BALB/c小鼠進行致死照射，如所示，在第3-28或4-28天，給予B6 BM + 1.5 M T細胞及10 mg/kg/天之類固醇。發現第3天治療顯著優於媒劑對照(p = 0.03)。
第 10 圖 描繪了同種異體BMT受體中基於類固醇之GVHD治療。n = 15(BM-圓圈)，16(媒劑-正方形)及25(潑尼松龍-三角形)。對BALB/c小鼠進行致死性照射，在3-28天，給予B6 BM + 1.5 M T細胞及10 mg/kg/天之類固醇。發現第3天治療顯著優於媒劑對照(p = 0.0016)。
第 11A-11D 圖 描繪了小鼠中GVHD之監測。將人PBMC(15 x 106 )注射到經照射之(50拉德)NSG小鼠±甲基強的松龍(15 mg/kg)，並監測GVHD之徵象。第 11A 圖 描繪了指示群組(每組n = 7只小鼠)、給藥時程及分析點之實驗之示意圖。第 11B 圖 描繪了僅接受PBMC或PBMC +潑尼松龍之小鼠之Kaplan-Meier存活曲線(p = 0.104)。第 11C 圖 描繪了藉由體重減輕來監測之疾病進展(p =不顯著)。第11D圖描繪了藉由定量PBMC衍生之CD45+、CD4+、CD8+及CD4+ FOXP3+ T細胞之數量來監測疾病進展(分別為p ＜0.03、＜0.05、＜0.03以及不顯著)。在第19天對動物進行放血以進行評估。
第 12A-12D 圖 描繪了小鼠中GVHD之監測。將人PBMC(15 x 106 )注射到經照射之(50拉德)NSG小鼠±FK506(36或12 mg/kg)或CsA(80 mg/kg)，並監測GVHD之徵象。第 12A 圖 描繪了指示群組(對於所有組，n = 7只小鼠，除了CsA n = 5)、給藥時程及分析點之實驗之示意圖。第 12B 圖 描繪了僅接受PBMC或PBMC + CNI之小鼠之Kaplan-Meier存活曲線(僅PBMC相比於FK506(36 mg/kg)，p ≤0.04)。第 12C 圖 描繪了藉由體重減輕來監測之疾病進展(p =不顯著)。第 12D 圖 描繪了藉由定量PBMC衍生之CD45+、CD4+、CD8+及CD4+ FOXP3+ T細胞之數量來監測疾病進展(分別為p ＜0.03、＜0.05、＜0.02以及不顯著)。在第18天對動物進行放血以進行評估。
第 13 圖 描繪了指示群組(n = 7只小鼠)、給藥時程及分析點之示意圖。將人PBMC(15 x 106 )注射到經照射之(50拉德)NSG小鼠±潑尼松龍(10 mg/kg)、FK506(12 mg/kg)或CsA(20 mg/kg)，並且監測GVHD之徵象(包括存活、體重、臨床評分及人T細胞擴增)。
第 14A-14C 圖 描述了在進行所示之各種操作後對擴增之影響。
第 15 圖 描繪了說明編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白之核酸供體插入物之示意圖。
第 16 圖 描繪了顯示作為Cas9-脫胺酶融合基因/肽之鹼基編輯器平台之示意圖，該鹼基編輯器平台能夠使用本發明之方法來引入取代，以及靶向策略及分子分析及定量之一般方案。
第 17 圖 描繪了顯示在Treg中實現鹼基編輯之一般步驟之流程圖。
第 18 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：20)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將過早終止密碼子引入NR3C1。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 19 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：20)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將過早終止密碼子引入NR3C1。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 20 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：21)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將過早終止密碼子引入NR3C1中顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 21 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：21)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將過早終止密碼子引入NR3C1。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 22 圖 描繪了顯示使用本發明之方法將取代引入剪接位點之示意圖。
第 23 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：55)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將修飾引入NR3C1之剪接受體。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 24 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：55)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將修飾引入NR3C1之剪接受體。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 25 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：56)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將修飾引入NR3C1之剪接供體中。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 26 圖 描繪了對照細胞及用gRNA(SEQ ID NO：56)電穿孔之細胞之基因組測序資料，該gRNA被設計用於將修飾引入NR3C1之剪接供體中。顯示了與gRNA相對應之基因組中每個位置處之T、G、C或A核苷酸之出現百分比。
第 27 圖 描繪了兩個實驗之總體輪廓。在一個實驗中，糖皮質激素受體基因座係使用BE4在效應T細胞(Teff)中進行鹼基編輯，具有兩輪珠子刺激。在第二個實驗中，糖皮質激素受體基因座係使用BE4在效應T細胞中進行鹼基編輯，但僅有一輪珠子刺激。
第 28 圖 描繪了顯示在使用gRNA GR2(表1中之SEQ ID NO：8)或BE4(表2中之SEQ ID NO：20)修飾之供體之糖皮質激素受體鹼基編輯後，在存在或不存在地塞米松的情況下，CD4+效應T細胞(Teff)之相對存活百分比之資料。第一供體之細胞接受兩輪刺激，並且第二供體之細胞接受一輪刺激。接受兩輪刺激之Teff對地塞米松(Dex)非常敏感。在兩個實驗中，用兩輪BE4進行編輯比30 pg/ml之GR2更有效(分別為p ≤0.001，p ≤0.01)。
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (172)

  1. 一種類固醇抗性CRISPR修飾細胞，該細胞包括： 編碼NR3C1之基因座中之遺傳修飾，其中該修飾能夠下調NR3C1之基因表現，其中該修飾位於NR3C1之外顯子、剪接供體或剪接受體中，並且其中該修飾之細胞由於該基因修飾而具有類固醇抗性。
  2. 如請求項1所述之修飾細胞，其中該細胞係多能幹細胞、造血前體細胞或造血細胞。
  3. 如請求項1-2中任一項所述之修飾細胞，其中該遺傳修飾由CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1系統、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas相關家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶介導。
  4. 如請求項1所述之修飾細胞，其中該修飾係插入缺失。
  5. 如請求項4所述之修飾細胞，其中該插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。
  6. 如請求項4-5中任一項所述之修飾細胞，其中NR3C1中之插入缺失係由CRISPR系統介導的。
  7. 如請求項3或請求項6所述之修飾細胞，其中該CRISPR系統包含CRISPR核酸酶及指導RNA。
  8. 如請求項7所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  9. 如請求項7所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。
  10. 如請求項7所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。
  11. 如請求項1所述之修飾細胞，其中該修飾係鹼基對取代。
  12. 如請求項11所述之修飾細胞，其中NR3C1中之取代係由CRISPR系統介導的。
  13. 如請求項11-12中任一項所述之修飾細胞，其中該CRISPR系統包含鹼基編輯器及指導RNA。
  14. 如請求項13所述之修飾細胞，其中該鹼基編輯器包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。
  15. 如請求項14所述之修飾細胞，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係Cas9結構域。
  16. 如請求項14所述之修飾細胞，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係變體Cas9結構域。
  17. 如請求項16所述之修飾細胞，其中該變體Cas9結構域係核酸酶非活性之Cas9結構域。
  18. 如請求項14-17中任一項所述之修飾細胞，其中該鹼基編輯結構域係脫胺酶結構域。
  19. 如請求項18所述之修飾細胞，其中該脫胺酶結構域對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。
  20. 如請求項18所述之修飾細胞，其中該脫胺酶結構域係胞苷或腺苷脫胺酶。
  21. 如請求項11-20中任一項所述之修飾細胞，其中該取代在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  22. 如請求項13-21中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。
  23. 如請求項13-21中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  24. 如請求項13-23中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。
  25. 如請求項14-20中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與包含NR3C1之剪接受體或剪接供體之靶序列充分互補之指導序列。
  26. 如請求項25所述之修飾細胞，其中該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  27. 如請求項25所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO 55或56中任一者所示之核酸序列。
  28. 如前述請求項中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞對皮質類固醇具有抗性。
  29. 如前述請求項中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞對糖皮質類固醇具有抗性。
  30. 如請求項29所述之修飾細胞，其中該糖皮質類固醇選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。
  31. 如請求項29所述之修飾細胞，其中該糖皮質類固醇選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。
  32. 一種鈣調神經磷酸酶抑制劑(CNI)抗性、經遺傳之修飾細胞，其在該細胞之基因組中包含外源鈣調神經磷酸酶抑制劑(CNI)抗性基因，其中該CNI抗性基因由於CRISPR介導之同源定向修復(HDR)而得以插入，並且其中該修飾之細胞由於該抗性基因而具有CNI抗性。
  33. 如請求項32所述之修飾細胞，其中該細胞係多能幹細胞、造血前體細胞或造血細胞。
  34. 如請求項32所述之修飾細胞，其中該遺傳修飾由CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1系統、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas-相關家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶介導。
  35. 如請求項32所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入於編碼NR3C1之基因座處。
  36. 如請求項32-35中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式，或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。
  37. 如請求項36所述之修飾細胞，其中使用外源供體DNA序列藉由同源重組將該突變鈣調神經磷酸酶基因插入該NR3C1基因座。
  38. 如請求項37所述之修飾細胞，其中該外源供體DNA序列包含SEQ ID NO：11所示之核酸序列。
  39. 如請求項32-38中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。
  40. 如請求項39所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。
  41. 如請求項39所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。
  42. 如請求項39-41中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白結合鈣調神經磷酸酶抑制劑但不結合鈣調神經磷酸酶，從而導致該鈣調神經磷酸酶抑制劑之隔離及鈣調神經磷酸酶抑制之預防。
  43. 如請求項32-42中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾細胞對選自環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物組成之群之鈣調神經磷酸酶抑制劑具有抗性。
  44. 一種經遺傳修飾、類固醇抗性及鈣調神經磷酸酶抑制劑(CNI)抗性細胞，其包含(1)包含編碼NR3C1之基因座中之插入缺失之第一遺傳修飾，其中該插入缺失能夠下調NR3C1之基因表現，及(2)包含插入細胞基因組中之外源CNI抗性基因之第二遺傳修飾，其中該CNI抗性基因位於編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點處，其中該修飾之細胞由於該等遺傳修飾而具有類固醇及CNI抗性。
  45. 如請求項44所述之修飾細胞，其中該細胞係多能幹細胞、造血前體細胞或造血細胞。
  46. 如請求項44所述之修飾細胞，其中該基因座對應於NR3C1之外顯子2。
  47. 如請求項44-46中任一項所述之修飾細胞，其中該插入缺失由CRISPR系統介導，該CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列之指導RNA。
  48. 如請求項44-47中任一項所述之修飾細胞，其中該插入缺失由CRISPR系統介導，該CRISPR系統包含含有SEQ ID NO：8所示核酸序列之指導RNA。
  49. 一種經遺傳修飾、類固醇抗性及鈣調神經磷酸酶抑制劑(CNI)抗性細胞，該細胞包含(1)包含NR3C1基因座中之修飾之第一遺傳修飾，其中該修飾能夠下調NR3C1之基因表現，及(2)包含插入細胞基因組中之外源CNI抗性基因之第二遺傳修飾，其中該修飾之細胞由於該等遺傳修飾而具有類固醇及CNI抗性。
  50. 如請求項49所述之修飾細胞，其中該細胞係多能幹細胞、造血前體細胞或造血細胞。
  51. 如請求項49所述之修飾細胞，其中第一或第二修飾由CRISPR-Cas9系統、CRISPR-Cpf1系統、Cas9直向同源物、Cas9旁系同源物、Cas-相關家族成員、鋅指、TALEN或大範圍核酸酶介導。
  52. 如請求項49所述之修飾細胞，其中該修飾係插入缺失。
  53. 如請求項52所述之修飾細胞，其中該插入缺失位於NR3C1之外顯子2中。
  54. 如請求項52-54中任一項所述之修飾細胞，其中NR3C1中之插入缺失係由CRISPR系統介導的。
  55. 如請求項54所述之修飾細胞，其中該CRISPR系統包含CRISPR核酸酶及指導RNA。
  56. 如請求項55所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  57. 如請求項55-56中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。
  58. 如請求項55-57中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。
  59. 如請求項49所述之修飾細胞，其中該修飾係鹼基對取代。
  60. 如請求項59所述之修飾細胞，其中NR3C1中之取代係由CRISPR系統介導的。
  61. 如請求項60所述之修飾細胞，其中該CRISPR系統包括鹼基編輯器及指導RNA。
  62. 如請求項61所述之修飾細胞，其中該鹼基編輯器包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。
  63. 如請求項62所述之修飾細胞，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係Cas9結構域。
  64. 如請求項62所述之修飾細胞，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係變體Cas9結構域。
  65. 如請求項64所述之修飾細胞，其中該變體Cas9結構域係核酸酶非活性之Cas9結構域。
  66. 如請求項62-65中任一項所述之修飾細胞，其中該鹼基編輯結構域係脫胺酶結構域。
  67. 如請求項66所述之修飾細胞，其中該脫胺酶結構域對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。
  68. 如請求項66所述之修飾細胞，其中該脫胺酶結構域係胞苷或腺苷脫胺酶。
  69. 如請求項59-68中任一項所述之修飾細胞，其中該取代在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  70. 如請求項61-69中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。
  71. 如請求項61-70中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  72. 如請求項61-70中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。
  73. 如請求項61-68中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含與包含NR3C1之剪接受體或剪接供體之靶序列充分互補之指導序列。
  74. 如請求項73所述之修飾細胞，其中該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  75. 如請求項73-74中任一項所述之修飾細胞，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：55-56中任一者所示之核酸序列。
  76. 如請求項49-75中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾細胞對皮質類固醇具有抗性。
  77. 如請求項49-76中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾細胞對糖皮質類固醇具有抗性。
  78. 如請求項77所述之修飾細胞，其中該糖皮質類固醇選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。
  79. 如請求項77所述之修飾細胞，其中該糖皮質類固醇選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。
  80. 如請求項49-79中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式，或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。
  81. 如請求項49-80中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。
  82. 如請求項81所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。
  83. 如請求項81-82中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。
  84. 如請求項81-83中任一項所述之修飾細胞，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白結合鈣調神經磷酸酶抑制劑但不結合鈣調神經磷酸酶，從而導致鈣調神經磷酸酶抑制劑之隔離及鈣調神經磷酸酶抑制之預防。
  85. 如請求項80-84中任一項所述之修飾細胞，其中使用外源供體DNA序列藉由同源重組將該突變鈣調神經磷酸酶基因插入該細胞之基因組中。
  86. 如請求項80-85中任一項所述之修飾細胞，其中該突變鈣調神經磷酸酶基因插入該NR3C1基因座。
  87. 如請求項49-85中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾細胞對選自環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物組成之群之鈣調神經磷酸酶抑制劑具有抗性。
  88. 如請求項49-87中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係修飾之免疫細胞。
  89. 如請求項49-88中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係修飾之調節性T細胞(Treg)。
  90. 如請求項49-88中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係修飾之效應T細胞(Teff)。
  91. 如請求項49-89中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係自體細胞。
  92. 如請求項49-89中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係同種異體細胞。
  93. 如請求項49-92中任一項所述之修飾細胞，其中該修飾之細胞係從人類受試者中分離的。
  94. 如請求項93所述之修飾細胞，其中該人類受試者已接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。
  95. 如請求項93所述之修飾細胞，其中該人類受試者已接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。
  96. 如請求項93所述之修飾細胞，其中該人類受試者患有自體免疫疾病。
  97. 如請求項93所述之修飾細胞，其中該人類受試者患有移植物抗宿主病(GVHD)。
  98. 如請求項93所述之修飾細胞，其中該人類受試者患有1型糖尿病。
  99. 一種產生修飾細胞之方法，該方法包括以下步驟：向該細胞中引入基因編輯系統，該系統在編碼NR3C1之基因座中產生修飾，其中該修飾能夠下調NR3C1之基因表現。
  100. 如請求項99所述之方法，其中該細胞係多能幹細胞、造血前體細胞或造血細胞。
  101. 如請求項99所述之方法，其中該修飾係NR3C1之外顯子2中之插入缺失。
  102. 如請求項99所述之方法，其中該基因編輯系統係CRISPR系統。
  103. 如請求項102所述之方法，其中該CRISPR系統包含CRISPR核酸酶及指導RNA。
  104. 如請求項103所述之方法，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  105. 如請求項103-104中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：7-10中任一者所示之核酸序列。
  106. 如請求項103-105中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：8所示之核酸序列。
  107. 如請求項99所述之方法，其中該修飾係鹼基對取代。
  108. 如請求項102所述之方法，其中該CRISPR系統包括鹼基編輯器及指導RNA。
  109. 如請求項108所述之方法，其中該鹼基編輯器包含CRISPR失活或切口DNA結合結構域或其變體，以及鹼基編輯結構域。
  110. 如請求項109所述之方法，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係Cas9結構域。
  111. 如請求項109所述之方法，其中該CRISPR失活或切口DNA結合結構域係變體Cas9結構域。
  112. 如請求項111所述之方法，其中該變體Cas9結構域係核酸酶非活性之Cas9結構域。
  113. 如請求項109-112中任一項所述之方法，其中該鹼基編輯結構域係脫胺酶結構域。
  114. 如請求項113所述之方法，其中該脫胺酶結構域對胞嘧啶或腺嘌呤具有特異性。
  115. 如請求項113所述之方法，其中該脫胺酶結構域係胞苷或腺苷脫胺酶。
  116. 如請求項107-115中任一項所述之方法，其中該取代在NR3C1中引入過早終止密碼子，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  117. 如請求項108-116中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含與NR3C1外顯子中之靶序列充分互補之指導序列。
  118. 如請求項108-117中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含與NR3C1之外顯子2中之靶序列充分互補之指導序列。
  119. 如請求項108-117中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：17-54中任一者所示之核酸序列。
  120. 如請求項108-115中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含與包含NR3C1之剪接受體或剪接供體之靶序列充分互補之指導序列。
  121. 如請求項120所述之方法，其中該取代能夠破壞NR3C1 mRNA之剪接，從而導致NR3C1之基因表現下調。
  122. 如請求項120-121中任一項所述之方法，其中該指導RNA包含SEQ ID NO：55-56中任一者所示之核酸序列。
  123. 如請求項99-122中任一項所述之方法，其中該CRISPR核酸酶/鹼基編輯器及該指導RNA包含核糖核蛋白(RNP)複合物。
  124. 如請求項99-122中任一項所述之方法，其中該CRISPR核酸酶/鹼基編輯器及/或該指導RNA由多核苷酸編碼。
  125. 如請求項124所述之方法，其中該多核苷酸包含載體及/或合成mRNA。
  126. 如請求項123-125中任一項所述之方法，其中藉由電穿孔引入該RNP或多核苷酸。
  127. 如請求項99-126中任一項所述之方法，該方法進一步包括以下步驟：將外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因插入該細胞之基因組中。
  128. 如請求項127所述之方法，其中該外源鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因之插入係藉由同源重組。
  129. 如請求項127-128中任一項所述之方法，其中該插入發生在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點。
  130. 如請求項127-129中任一項所述之方法，其中該插入發生在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點。
  131. 如請求項127-130中任一項所述之方法，其中該插入藉由來自外源供體DNA序列之同源重組發生在編碼NR3C1之基因座中之插入缺失位點。
  132. 如請求項131所述之方法，其中該外源供體DNA序列包含SEQ ID NO：11所示之核酸序列。
  133. 如請求項131-132中任一項所述之方法，其中藉由病毒轉導來引入該外源供體DNA序列。
  134. 如請求項131-132中任一項所述之方法，其中藉由電穿孔來引入該外源供體DNA序列。
  135. 如請求項131-134中任一項所述之方法，其中該外源供體DNA序列包含與編碼報道分子之核酸可操作連接之啟動子。
  136. 如請求項135所述之方法，其中該啟動子及編碼該報道分子之核酸藉由一接頭分開。
  137. 如請求項136所述之方法，其中該接頭包含T2A序列。
  138. 如請求項132-137中任一項所述之方法，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因係選自PPP3Ca、PPP3Cb及PPP3Cc組成之群之鈣調神經磷酸酶A(CNa)基因之突變形式，或選自PPP3R1及PPP3R2組成之群之鈣調神經磷酸酶B(CNb)基因之突變形式。
  139. 如請求項132-138中任一項所述之方法，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑抗性基因編碼鈣調神經磷酸酶變體蛋白。
  140. 如請求項139所述之方法，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白選自CNa12、CNa22及CNb30組成之群。
  141. 如請求項139-140中任一項所述之方法，其中該鈣調神經磷酸酶變體蛋白包含SEQ ID NO：3-5中任一者所示之胺基酸序列。
  142. 如請求項99-141中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係修飾之免疫細胞。
  143. 如請求項99-142中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係修飾之調節性T細胞(Treg)。
  144. 如請求項99-142中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係修飾之效應T細胞(Teff)。
  145. 如請求項99-144中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係自體細胞。
  146. 如請求項99-144中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係同種異體細胞。
  147. 如請求項99-146中任一項所述之方法，其中該修飾之細胞係從人類受試者中分離的。
  148. 如請求項147所述之方法，其中該人類受試者已接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。
  149. 如請求項147所述之方法，其中該人類受試者已接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。
  150. 如請求項147所述之方法，其中該人類受試者患有自體免疫疾病。
  151. 如請求項147所述之方法，其中該人類受試者患有移植物抗宿主病(GVHD)。
  152. 如請求項147所述之方法，其中該人類受試者患有1型糖尿病。
  153. 一種在有此需要之受試者中實現免疫抑制作用之方法，該方法包括以下步驟：向該受試者投與如請求項1-98中任一項之修飾細胞。
  154. 如請求項153所述之方法，其中該受試者患有同種異體反應及/或自體免疫反應。
  155. 一種在有此需要之受試者中實現預防性治療效果之方法，該方法包括以下步驟：在發生同種異體反應及/或自體免疫反應之前，向該受試者投與如請求項1-98中任一項之修飾細胞群。
  156. 如請求項155所述之方法，其中該同種異體反應及/或自體免疫反應在移植生物材料之後。
  157. 如請求項156所述之方法，其中該生物材料選自細胞、組織及器官組成之群。
  158. 如請求項156-157中任一項所述之方法，其中該生物材料係同種異體的。
  159. 如請求項153-158中任一項所述之方法，其中該受試者係人。
  160. 如請求項159所述之方法，其中該人類受試者已接受幹細胞移植或係幹細胞移植之候選者。
  161. 如請求項159所述之方法，其中該人類受試者已接受實體器官移植或係實體器官移植之候選者。
  162. 如請求項159所述之方法，其中該人類受試者患有自體免疫疾病。
  163. 如請求項159所述之方法，其中該人類受試者患有移植物抗宿主病(GVHD)。
  164. 如請求項159所述之方法，其中該人類受試者患有1型糖尿病。
  165. 如請求項153-164中任一項所述之方法，其中該等經修飾之細胞與類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑組合投與。
  166. 如請求項165所述之方法，其中在投與該等修飾細胞之前投與該類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑。
  167. 如請求項165所述之方法，其中該類固醇及/或鈣調神經磷酸酶抑制劑在投與該等修飾細胞之同時或之後投與。
  168. 如請求項165-167中任一項所述之方法，其中該類固醇係皮質類固醇。
  169. 如請求項165-168中任一項所述之方法，其中該類固醇係糖皮質類固醇。
  170. 如請求項169所述之方法，其中該糖皮質類固醇選自黃體酮型糖皮質類固醇、氫化可體松型糖皮質類固醇、美達松型糖皮質類固醇及丙酮化物型糖皮質類固醇組成之群。
  171. 如請求項169所述之方法，其中該糖皮質類固醇選自地塞米松、倍他米松、氫化可體松(皮質醇)、潑尼松、潑尼松龍、氯替潑諾、地夫可特、甲基強的松龍、曲安奈德、氟氫可體松及脫氧皮質酮組成之群。
  172. 如請求項165-171中任一項所述之方法，其中該鈣調神經磷酸酶抑制劑選自環孢菌素A(CsA)、伏孢素、他克莫司(FK-506，藤黴素)、吡美莫司及其衍生物及類似物組成之群。
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