JP2019509738A - ゲノム編集された免疫エフェクター細胞 - Google Patents

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Abstract

本発明は、がん、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全を含むがこれらに限定されない多数の病態の治療、予防、または改善のための養子免疫エフェクター細胞療法に向けた、改良された組成物を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）条の下で、２０１６年４月１４日出願の米国仮特許出願第６２／３２２，６０４号、及び２０１６年３月１１日出願の米国仮特許出願第６２／３０７，２４５号の利益を主張するものであり、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿０６５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは１６８ＫＢであり、２０１７年３月９日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本発明は、養子細胞療法に向けた、改良された免疫エフェクター細胞組成物に関する。より詳細には、本発明は、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞組成物及びその作製方法に関する。
がんの世界的な負担は１９７５年〜２０００年の間に２倍となった。がんは、世界中の疾病率及び死亡率の２番目に高い要因であり、２０１２年において新たな症例はおよそ１４１０万件、がん関連死は８２０万件となっている。最もよく見られるがんは、乳癌、肺及び気管支癌、前立腺癌、結腸及び直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓及び腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たながん症例件数は、今後２０年以内で２２００万件に上昇すると予想される。
免疫系は、ヒトがんの検出及び撲滅において主要な役割を有する。形質転換細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原特異的Ｔ細胞の活性化を通して破壊される。したがって、がんは、免疫学的障害、すなわち、この疾患を恒久的に抑制及び排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。がんをより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発されたある特定の免疫療法介入は、Ｔ細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などのＴ細胞活性化を阻害する分子を標的とするモノクローナル抗体を使用する、より最近の療法は、より実質的な抗腫瘍効果を示してきたが、これらの治療はまた、全身免疫活性化に起因する実質的な毒性にも関連する。
より最近では、Ｔ細胞の単離、修飾、増殖、及び再注入に基づく養子細胞免疫療法戦略が探索されており、初期段階の臨床試験で試験されている。Ｔ細胞はしばしば、それらの選択的認識及び強力なエフェクター機構に起因して、がん免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、Ｔ細胞ベースのがん免疫療法の未だ理解されていない可能性を強調している。
細胞溶解性Ｔ細胞による腫瘍細胞関連抗原の成功裏の認識は、標的とする腫瘍の溶解を惹起し、任意の有効ながん免疫療法アプローチを実証する。腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、腫瘍関連抗原に特異的に指向されたＴＣＲを発現するが、実質的な数のＴＩＬは、少数のヒトがんのみに限定される。遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、多くのがん及び他の免疫障害に対するＴ細胞ベースの免疫療法の適用性を増加させる可能性がある。ＣＡＲを発現するトランスジェニックＴ細胞を用いた非常に有望な初期の結果にもかかわらず、ＣＡＲ Ｔ細胞ベースの免疫療法の有効性、安全性、及び拡張性は、クローン的に誘導されたＴＣＲの継続的発現によって限定される。
その上、残存ＴＣＲ発現が、遺伝子操作されたＴ細胞内でのＣＡＲシグナル伝達を干渉し得るか、またはそれが、自己または同種抗原に対するオフターゲット及び病理的応答を惹起し得る。しかしながら、内在性ＴＣＲシグナル伝達構成要素及びＴＣＲ発現を正確に破壊するための方法が不足している。結果として、ＣＡＲベースのＴ細胞は、自家移植において使用されてきたのみである。それでも、自家養子細胞免疫療法の安全性及び有効性に関して潜在的な懸念がある。すなわち、遺伝子操作された受容体のランダムな組込み及び予測のつかない発現が、修飾自家Ｔ細胞の有効性に影響を及ぼす場合があり、自己抗原を認識する自家Ｔ細胞が、望ましくない自己免疫応答を強化し得る。
その上、最新技術による遺伝子操作されたＴ細胞は依然として、がん細胞、炎症性細胞、間質細胞、及びサイトカインからなる複合の免疫抑制腫瘍微小環境によって調節される。これらの構成要素のうち、がん細胞、炎症性細胞、及び抑制性サイトカインがＴ細胞表現型及び機能を調節する。集合的に、腫瘍微小環境は、Ｔ細胞が疲弊したＴ細胞へと最終的に分化するよう駆り立てる。
Ｔ細胞疲弊は、阻害性受容体の増加した発現または阻害性受容体による増加したシグナル伝達、低減されたエフェクターサイトカイン産生、及び持続してがんを排除する能力の減少によって特徴付けられる慢性的環境における、Ｔ細胞機能不全の状態である。疲弊したＴ細胞はまた、階層的様態で機能喪失を示す。すなわち、減少したＩＬ−２産生及びエクスビボでの殺傷能力が疲弊の早期段階で失われ、ＴＮＦ−α産生が中間段階で失われ、ＩＦＮ−γ及びＧｚｍＢ産生が疲弊の後期段階で失われる。腫瘍微小環境におけるほとんどのＴ細胞は、疲弊したＴ細胞へと分化し、がんを排除する能力を失い、最終的には取り除かれる。
がんは、遺伝子操作されたＴ細胞が有効な治療選択肢を提供し得る唯一の疾患ではない。Ｔ細胞は、免疫系活性を刺激する身体の応答に必要不可欠である。例えば、Ｔ細胞受容体の多様性は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、特に慢性ＧＶＨＤにおいて役割を果たす。実際、Ｔ細胞受容体抗体の投与は、急性ＧＶＨＤの症状を低減することが示されてきた。
故に、種々の形態のがん及び他の免疫障害を治療するための、より有効で、標的化され、より安全、かつ持続的な療法が必要とされている。その上、高い効率性をもって内在性ＴＣＲ遺伝子を正確かつ再現可能に破壊し得る方法及び組成物が必要とされている。ほとんどのがんに対する今日の標準治療は、これらの基準のいくつかまたは全てを満たしていない。
本発明は全体として、部分的に、改良された免疫エフェクター細胞組成物、及びゲノム編集を用いたその製造方法に関する。特定の実施形態で企図される免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＴ細胞受容体遺伝子座の正確な破壊または修飾を含み、これがＴＣＲ発現及びシグナル伝達の妨害につながり、より有効かつより安全な養子細胞療法をもたらす。遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、養子細胞免疫療法の有効性及び特異性を増加させるための１つ以上のまたは遺伝子操作された抗原受容体をさらに含み得る。特定の実施形態で企図される免疫エフェクター細胞組成物は、養子細胞療法の有効性及び持続性を増加させるための１つ以上の免疫力エンハンサー及び／または免疫抑制シグナルダンパーの挿入をさらに含み得る。
種々の実施形態において、１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫力エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含む核酸とを含む、細胞が提供される。
種々の実施形態において、１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫抑制シグナルダンパーをコードするポリヌクレオチドを含む核酸とを含む、細胞が提供される。
種々の実施形態において、１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸とを含む、細胞が提供される。
種々の実施形態において、１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、及び遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸とを含む、細胞が提供される。
追加の実施形態において、修飾ＴＣＲαは、機能不全であるか、または実質的に低減された機能を有する。
ある特定の実施形態において、核酸は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、及び負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
特定の実施形態において、核酸は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、自己切断型ウイルスペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む。
ある特定の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは２Ａペプチドである。
さらなる実施形態において、自己切断型ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
特定の実施形態において、核酸は異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
追加の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含み、任意選択で、この細胞外ドメインは、その抗体または抗原結合断片である。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾された細胞内ドメインとを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
さらなる実施形態において、細胞外ドメインは、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合がん抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される免疫抑制因子に結合する。
特定の実施形態において、細胞外ドメインは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、哺乳類コロニー刺激因子１受容体（Ｍ−ＣＳＦ１）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導受容体（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合がん抗原（ＲＣＡＳ１Ｒ）、及びＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）からなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
追加の実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外リガンド結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である。
さらなる実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
ある特定の実施形態において、免疫抑制因子は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＧＦβ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＩＬ、ＲＣＡＳ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３からなる群から選択される。
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、及びフリップ受容体からなる群から選択される。
追加の実施形態において、ＢｉＴＥは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する第１の結合ドメインと、リンカーと、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択されるエフェクター細胞上の抗原に結合する第２の免疫結合ドメインとを含む。
さらなる実施形態において、ＢｉＴＥは、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体及びクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体からなる群から選択される抗原に結合する第１の結合ドメインと、リンカーと、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択されるエフェクター細胞上の抗原に結合する第２の免疫結合ドメインとを含む。
特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ケモカインは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
さらなる実施形態において、細胞毒素は、パーフォリン、グランザイムＡ、及びグランザイムＢからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、サイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、及びＩＬ−２１受容体からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、免疫賦活因子は、タンパク質不安定化ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインと、膜貫通と、細胞内ドメインとを含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１３受容体、またはＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択されるサイトカイン受容体の細胞外サイトカイン結合ドメインを含む細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された膜貫通ドメインと、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された細胞内ドメインとを含む。
追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された膜貫通ドメインと、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された細胞内ドメインとを含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含む。
ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＩＴＩＭ及び／またはＩＴＳＭを含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＲＣＡＳ１Ｒ、及びＦＡＳからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
さらなる実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
ある特定の実施形態において、細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩまたはＰＤ−１の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
ある特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
さらなる実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８から単離される。
追加の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４から単離される。
特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される。
特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７８から単離される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の主要シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
いくつかの実施形態において、１つ以上の主要シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから単離される。
ある特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、またはＩＬ−１５受容体膜貫通ドメインと、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、またはＩＬ−１５受容体から単離される細胞内ドメインとを含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＰＤ−１またはＣＤ２８膜貫通ドメイン膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択される１つ以上の細胞内共刺激及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含む。
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはキメラサイトカイン受容体からなる群から選択される。
特定の実施形態において、核酸は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
さらなる実施形態において、核酸は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
ある特定の実施形態において、核酸は、５’から３’へと、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
特定の実施形態において、両方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子が機能不全である。
いくつかの実施形態において、第１の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸を含み、第２の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する。
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１アルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＭＨＣ−ペプチド複合体、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体、またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する細胞外ドメインと、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
さらなる実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ受容体は、第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、及び任意選択で第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含み、架橋因子が、細胞表面上でのＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進し、この架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドの多量体化ドメインと結合ポリペプチドの多量体化ドメインとに会合し、それらの間に配置される。
ある特定の実施形態において、第１の及び第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰに対するトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンド（ＳＬＦ）またはその誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子に会合する。
いくつかの実施形態において、第１の及び第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ、ＦＫＢＰ及びカルシニューリン、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、ＦＫＢＰ及び細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリン及びシクロフィリン、ＰＹＬ１及びＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１及びＧＡＩ、またはそれらのバリアントから選択される対である。
ある特定の実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である。
いくつかの実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
特定の実施形態において、結合ドメインはｓｃＦｖを含む。
さらなる実施形態において、結合ドメインは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合するｓｃＦｖを含む。
ある特定の実施形態において、結合ドメインは、ＭＨＣ−ペプチド複合体、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体、またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するｓｃＦｖを含む；
特定の実施形態において、第１の及び第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
特定の実施形態において、第１の及び第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、及びＣＤ８αからなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
追加の実施形態において、１つ以上の共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
ある特定の実施形態において、１つ以上の主要シグナルドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
ある特定の実施形態において、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子が、シグナル伝達ポリペプチド、ウイルス自己切断型２Ａペプチド、及び結合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメインまたはヒンジドメインを含む。
さらなる実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
追加の実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
ある特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ含有主要シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激ドメインからなる群から選択される。
追加の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
さらなる実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、及びＣＤ３ζからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
特定の実施形態において、両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾され、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態において、両方のＴＣＲα対立遺伝子が機能不全であり、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、第１の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、本細胞は、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含み、第２の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
さらなる実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは異なる。
いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは各々独立して、免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする。
ある特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは各々独立して、フリップ受容体をコードする。
ある特定の実施形態において、両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾され、本明細書で企図される免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、一方の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、本細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む。
特定の実施形態において、核酸は、阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
特定の実施形態において、阻害性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはリボザイムである。
追加の実施形態において、核酸は、阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ヒトまたはマウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターからなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、本細胞は造血細胞である。
さらなる実施形態において、本細胞は免疫エフェクター細胞である。
いくつかの実施形態において、本細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである。
さらなる実施形態において、本細胞はＴ細胞である。
ある特定の実施形態において、本細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
特定の実施形態において、本細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
いくつかの実施形態において、本細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される。
特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される本細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激される細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全ての増加した発現を有する。
ある特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋの阻害剤の存在下で活性化され、刺激される本細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激される細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全ての増加した発現を有する。
さらなる実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
種々の実施形態において、本明細書で企図される細胞を含む組成物が提供される。
種々の実施形態において、本明細書で企図される細胞と、生理学的に許容される賦形剤とを含む組成物が提供される。
種々の実施形態において、Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖させること、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡをＴ細胞の集団に導入すること、Ｔ細胞の集団に、ドナー修復テンプレートを含む１つ以上のウイルスベクターを形質導入することを含み、遺伝子操作されたヌクレアーゼの発現が、ＴＣＲα対立遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出し、ドナー修復テンプレートが、２本鎖切断（ＤＳＢ）の部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）によってＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれる、Ｔ細胞の集団においてＴＣＲα対立遺伝子を編集する方法が提供される。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢのＴＣＲα配列５’に相同な５’相同アームと、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、ＤＳＢのＴＣＲα配列３’に相同な３’相同アームとを含む。
追加の実施形態において、５’及び３’相同アームの長さは、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから独立して選択される。
いくつかの実施形態において、５’及び３’相同アームの長さは、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される。
ある特定の実施形態において、５’相同アームは約１５００ｂｐであり、３’相同アームは約１０００ｂｐである。
特定の実施形態において、５’相同アームは約６００ｂｐであり、３’相同アームは約６００ｂｐである。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する。
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ６血清型を有する。
追加の実施形態において、レトロウイルスはレンチウイルスである。
ある特定の実施形態において、レンチウイルスはインテグラーゼ欠損レンチウイルスである。
さらなる実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥから遺伝子操作される。
ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを含む。
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
さらなる実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される。
特定の実施形態において、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥから遺伝子操作される。
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
ある特定の実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
追加の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択されるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
特定の実施形態において、ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
さらなる実施形態において、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８つの亜鉛フィンガーモチーフを含む。
ある特定の実施形態において、ＺＦＮは、ＴＡＬＥ結合ドメインを含む。
さらなる実施形態において、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
ある特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択されるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される。
さらなる実施形態において、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される。
いくつかの実施形態において、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＴＣＲα遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡが、Ｔ細胞の集団に導入される。
特定の実施形態において、ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びＴＣＲα遺伝子内のプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡが、Ｔ細胞の集団に導入される。
さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
特定の実施形態において、ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
さらなる実施形態において、ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、第１の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、本明細書で企図される免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のドナーテンプレートが、第２の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態において、第１のドナーテンプレート及び第２のテンプレートは、異なるポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは各々独立して、免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする。
追加の実施形態において、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは各々独立して、フリップ受容体をコードする。
特定の実施形態において、ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、本明細書で企図される免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、本細胞には、遺伝子操作された抗原受容体を含むレンチウイルスベクターがさらに形質導入される。
さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、ウイルス自己切断型２Ａペプチド及びエンドプロセシング酵素をさらにコードする。
さらなる実施形態において、本方法は、エンドプロセシング酵素をコードするｍＲＮＡをＴ細胞に導入することをさらに含む。
特定の実施形態において、エンドプロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する。
ある特定の実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
追加の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される。
ある特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激されるＴ細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激されるＴ細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全ての増加した発現を有する。
さらなる実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激されるＴ細胞は、ＰＩ３Ｋの阻害剤の不在下で活性化され、刺激されるＴ細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全ての増加した発現を有する。
特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である。
図１Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、蛍光タンパク質をコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子を示す。 図１Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬ、ＡＡＶテンプレート、ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートで処理された細胞、または対照処理細胞における、蛍光タンパク質発現、及び任意選択でＣＤ３（ＴＣＲ破壊）の発現を示す。発現を処理後１０日目にフローサイトメトリーによって測定した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートでのＴＣＲα遺伝子座の効率的な標的化は、蛍光タンパク質発現と共にしたＣＤ３発現の不在によって特徴付けられる。 図１Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬ、ＡＡＶテンプレート、ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートで処理された細胞、または対照処理細胞における、蛍光タンパク質発現、及び任意選択でＣＤ３（ＴＣＲ破壊）の発現を示す。発現を処理後１０日目にフローサイトメトリーによって測定した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートでのＴＣＲα遺伝子座の効率的な標的化は、蛍光タンパク質発現と共にしたＣＤ３発現の不在によって特徴付けられる。 図１Ｃは、ｍｅｇａＴＡＬ、ＡＡＶテンプレート、ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートで処理された細胞、または対照処理細胞における、蛍光タンパク質発現、及び任意選択でＣＤ３（ＴＣＲ破壊）の発現を示す。発現を処理後５日目及び１０日目にフローサイトメトリーによって測定した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートでのＴＣＲα遺伝子座の効率的な標的化は、蛍光タンパク質発現と共にしたＣＤ３発現の不在によって特徴付けられる。 図２Ａは、ＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、配列ＣＤ１９を標的としたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子を示す。 図２Ｂは、８日目にＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによりフローサイトメトリーによって分析したＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートで処理された細胞において安定した導入遺伝子発現が確認された。 図２Ｃは、ＴＣＲα遺伝子座に標的を定められたＣＤ１９ ＣＡＲが機能的であることを示す。形質導入されていないまたはｍｅｇａＴＡＬ／ＡＡＶ処理細胞をＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞と、１：１比で２４時間共培養した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＣＤ１９ ＣＡＲをコードするＡＡＶテンプレートの両方を受容した試料中でのみ、効率的なＩＦＮγ産生が観察された。 図３Ａは、ＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、ＣＤ１９を標的としたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子を示す。比較概略図は、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を駆動する異種ＭＮＤプロモーターを含むレンチウイルス構築物を示す。 図３Ｂは、８日目にＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによりフローサイトメトリーによって分析した、ＡＡＶ＋ｍｅｇａＴＡＬでまたはＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルスで処理されたＴ細胞におけるＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶテンプレートで処理された細胞において安定した導入遺伝子発現が確認された。ＣＤ１９ ＣＡＲ＋Ｔ細胞上でのＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌの発現が示される。染色データの概要が右に示される。 図３Ｃは、ＴＣＲα遺伝子座に標的を定められたＣＤ１９ ＣＡＲが標的細胞を殺傷可能であることを示す。レンチウイルス形質導入またはｍｅｇａＴＡＬ／ＡＡＶ処理細胞をＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞と、１：１比で２４時間共培養した。レンチウイルスベクターを受容した、またはｍｅｇａＴＡＬ＋ＡＡＶで処理された試料間で同等の細胞傷害活性が観察された。 図３Ｄは、ＴＣＲα遺伝子座に標的を定められたＣＤ１９ ＣＡＲがＣＤ１９＋腫瘍細胞の認識時にサイトカインを分泌可能であったことを示す。レンチウイルス形質導入またはｍｅｇａＴＡＬ／ＡＡＶ処理細胞をＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞と、１：１比で２４時間共培養した。レンチウイルスベクターを受容した、またはｍｅｇａＴＡＬ＋ＡＡＶで処理された試料間で同等のＩＦＮγ、ＩＬ２及びＴＮＦαサイトカイン産生が観察された。 図３Ｅは、ＣＤ１９ ＣＡＲの標的をＴＣＲａ遺伝子座に定めることがＴ細胞疲弊を誘発しないことを示す。レンチウイルス形質導入またはｍｅｇａＴＡＬ／ＡＡＶ処理細胞をＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞と、１：１比で７２時間共培養した。疲弊マーカー発現（ＰＤ１、ＣＴＬＡ４及びＴｉｍ３）をフローサイトメトリーによって分析した。 図４Ａは、二対立遺伝子発現用に設計された２つの導入遺伝子を示す。各導入遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子座の一方の対立遺伝子に統合されている別々の蛍光タンパク質の発現を駆動するプロモーターを含む。 図４Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬでトランスフェクトされ、その後、単一のＡＡＶ（ＧＦＰまたはＢＦＰ）を形質導入された、または両方のＡＡＶを二重に形質導入された細胞における導入遺伝子発現を示す。トランスフェクション／形質導入から１０日後に、蛍光タンパク質の発現をフローサイトメトリーによって分析した。二重に形質導入された試料において、ＣＤ３染色によって測定したＴＣＲ破壊を４つの象限の各々において評価すると、単一導入遺伝子及び二重導入遺伝子陽性集団における進行的破壊が確認された。 図５Ａは、ＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にノックインされた遺伝子トラップ導入遺伝子を示す。 図５Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬでトランスフェクトされ、その後、遺伝子トラップ導入遺伝子をコードするＡＡＶを形質導入された細胞における、導入遺伝子発現及びＴＣＲα遺伝子座破壊（ＣＤ３染色）を示す。トランスフェクション／形質導入から１０日後に、発現をフローサイトメトリーによって分析した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶのみで処理された試料を含んだ。 図５Ｃは、ＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１にノックインされた遺伝子トラップＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子を示す。 図５Ｄは、ｍｅｇａＴＡＬでトランスフェクトされ、その後、ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子トラップベクターをコードするＡＡＶを形質導入された細胞における、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示す。トランスフェクション／形質導入から１０日後に、発現をフローサイトメトリーによって分析した。対照は、標準的なＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルスベクターで処理された試料を含む。 図５Ｅは、ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ６細胞株に対するＣＤ１９ ＣＡＲの細胞傷害活性を示す。ＣＤ１９ ＣＡＲレンチウイルス形質導入を用い、かつＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子トラップノックインベクターを使用して生成されたＣＡＲ Ｔ細胞について、同等の細胞傷害活性が示される。 図６は、ゲノム編集条件の温度を変化させる代表的な実験からの結果を示す。活性化されたＰＢＭＣを、ＴＣＲαを標的としたｍｅｇａＴＡＬ＋／−ＡＡＶテンプレート（ＧＦＰをコードする）でトランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後２４時間、３０℃または３７℃で培養した。切断修復選択を、ＣＤ３発現（ＮＨＥＪ＋ＨＲ）またはＧＦＰ発現（ＨＲのみ）の喪失を分析することによって決定した。３０℃での細胞の培養がＴＣＲα遺伝子座におけるＮＨＥＪ事象を最大化した一方で、３７℃での細胞の培養は、ＨＲ率を大規模に変化させることなく、ＣＤ３破壊を減少させた。 図７Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、ＣＤ１９ Ｄａｒｉｃ構成要素をコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含むＤａｒｉｃ導入遺伝子を示す。 図７Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬでトランスフェクトされ、その後、Ｄａｒｉｃ導入遺伝子をコードするＡＡＶを形質導入された細胞における、ＣＤ１９ Ｄａｒｉｃ導入遺伝子発現を示す。トランスフェクション／形質導入から１０日後に、発現をＰＥ共役組換えＣＤ１９−Ｆｃでの染色及びフローサイトメトリーを介した分析によって分析した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶのみで処理された試料を含んだ。 図８Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、様々な長さの相同アーム、プロモーター、ＧＦＰをコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子を示す。
図８Ｂは、ｍｅｇａＴＡＬでトランスフェクトされ、その後、ＧＦＰ導入遺伝子をコードするが様々な相同アーム長を有するＡＡＶを形質導入された細胞における、ＧＦＰ導入遺伝子発現を示す。発現をフローサイトメトリーによって分析した。対照は、トランスフェクトされていない試料及びｍｅｇａＴＡＬのみで処理された試料を含んだ。要約棒グラフデータによって示されるように、全ての試料において同等レベルのＴＣＲα破壊が観察された。 図９Ａは、ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ−６細胞の存在下で２４時間培養された、レンチウイルス形質導入（ＬＶ−ＣＡＲ Ｔ細胞）または相同組換えＨＲ−ＣＡＲ Ｔ細胞）によって生み出された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞についての、Ｔ細胞疲弊マーカーの発現を示す。 図９Ｂは、ＣＤ１９発現Ｎａｌｍ−６細胞の存在下で７２時間培養された、レンチウイルス形質導入（ＬＶ−ＣＡＲ Ｔ細胞）または相同組換えＨＲ−ＣＡＲ Ｔ細胞）によって生み出された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞についての、Ｔ細胞疲弊マーカーの発現を示す。 図１０Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、ＣＡＲ及びＷＰＲＥをコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子を示す。 図１０Ｂは、蛍光強度中央値（Ｍｅｄｉａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を用いて、ＴＣＲαノックイン導入遺伝子がＷＰＲＥ要素と組み合わされるときの改良された導入遺伝子発現を示す。 図１１Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた２つの導入遺伝子設計を示す。ＭＮＤ−イントロン−ＣＡＲ−ＷＰＲＥ導入遺伝子は、プロモーター、イントロン、ＣＡＲ、ＷＰＲＥをコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む。ＭＮＤ−ＣＡＲ−イントロン−ＷＰＲＥ導入遺伝子は、プロモーター、イントロン、ＣＡＲ、ＷＰＲＥをコードする核酸配列、及びポリアデニル化シグナルを含む。 図１１Ｂは、ＴＣＲα遺伝子座にノックインされたＣＡＲ導入遺伝子が内部イントロンに続くか、または内部イントロンを有する場合の、同様のまたは低減された導入遺伝子発現を示す。 図１２Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた双方向導入遺伝子を示す。導入遺伝子は、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩをコードする核酸の発現を駆動するプロモーターと、反対向きに、ＣＡＲをコードする核酸配列の発現を駆動するプロモーターとを含む。代替的な設計では、Ｔ２Ａリボソームスキップ要素を用いてＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子を優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ導入遺伝子と組み合わせる。 図１２Ｂは、ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子構築物の発現と組み合わせたＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ受容体の発現を示す。 図１３Ａは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされたプロモーター及び遺伝子操作されたＴＣＲを含む導入遺伝子を示す。 図１３Ｂは、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされたＴＣＴ構築物の導入遺伝子発現を示す。 図１４は、遺伝子操作されたＴＣＲの発現を再構成するために二対立遺伝子発現用に設計された２つの導入遺伝子を示す。各導入遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子座の一方の対立遺伝子に統合されているＴＣＲの構成要素の発現を駆動するプロモーターを含む。 図１５は、遺伝子操作されたＴＣＲの発現を再構成するために二対立遺伝子発現用に設計された２つの遺伝子トラップ導入遺伝子を示す。各導入遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子座の一方の対立遺伝子に統合されている自己切断型２Ａペプチド、ＴＣＲの構成要素、及びポリアデニル化または２Ａペプチド配列を含む。 図１６は、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、２Ａ自己切断型ペプチド、フリップ受容体または優性ネガティブサイトカイン受容体を含む遺伝子トラップ導入遺伝子を示す。 図１７は、ＴＣＲα遺伝子座の定常領域のエクソン１にノックインされた、プロモーター、フリップ受容体または優性ネガティブサイトカイン受容体を含む導入遺伝子を示す。 図１８は、遺伝子操作されたＴＣＲ及び１つ以上のフリップ受容体の発現を再構成するために二対立遺伝子発現用に設計された２つの導入遺伝子を示す。各導入遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子座における一方の対立遺伝子に統合され、ＴＣＲの構成要素の発現を駆動するプロモーター、自己切断型２Ａペプチド、及び任意選択でフリップ受容体または優性ネガティブサイトカイン受容体を含む。 図１９は、遺伝子操作されたＴＣＲ及び１つ以上のフリップ受容体の発現を再構成するために二対立遺伝子発現用に設計された２つの遺伝子トラップ導入遺伝子を示す。各導入遺伝子は、ＴＣＲα遺伝子座における一方の対立遺伝子に統合され、自己切断型２Ａペプチド、ＴＣＲの構成要素（例えば、ＴＣＲβまたはＴＣＲα）、自己切断型２Ａペプチド、ならびに任意選択でフリップ受容体または優性ネガティブサイトカイン受容体、及び自己切断型２Ａペプチドまたはポリアデニル化配列を含む。
（配列番号の簡単な説明）
配列番号１は、Ｉ−ＯｎｕＩのポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２は、配列番号１によってコードされるポリペプチド配列を記載する。
配列番号３及び４は、ゲノム編集のためのＴＣＲα標的部位の例示的な例を記載する。
配列番号５〜７は、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩバリアントのポリペプチド配列を記載する。
配列番号８は、プラスミドｐＢＷ７９０のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号９は、プラスミドｐＢＷ８５１のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１０は、ＴＣＲα Ｉ−ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬ標的部位を記載する。
配列番号１１は、ＴＣＲα Ｉ−ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬの例示的な例のポリペプチド配列を記載する。
配列番号１２は、プラスミドｐＢＷ１０１９のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１３は、プラスミドｐＢＷ１０１８のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１４は、プラスミドｐＢＷ１０２０のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１５は、プラスミドｐＢＷ８４１のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１６は、プラスミドｐＢＷ４００のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１７は、プラスミドｐＢＷ１０５７のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１８は、プラスミドｐＢＷ１０５８のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号１９は、プラスミドｐＢＷ１０５９のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２０は、プラスミドｐＢＷ１０８６のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２１は、プラスミドｐＢＷ１０８７のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２２は、プラスミドｐＢＷ１０８８のポリヌクレオチド配列を記載する。
配列番号２３〜３２は、種々の代表的な細胞透過性ペプチドのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３３〜４３は、種々の代表的なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３４〜６８は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
（詳細な説明）
Ａ．概観
本明細書で企図される種々の実施形態は全体として、部分的に、改良された養子細胞療法に関する。改良された養子細胞療法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現に関連する遺伝子座、例えば、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子またはＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）遺伝子のゲノム編集を通して製造される免疫エフェクター細胞を含む。特定の実施形態で企図される製造された免疫エフェクター細胞組成物は、がん、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全を含むがこれらに限定されない多数の病態の治療または予防において有用である。ゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、既存の細胞ベースの免疫療法と比較して、望ましくない自己免疫応答の減少した危険性に起因する改良された安全性、より予測可能な治療用遺伝子発現に正確に標的を定められた療法、腫瘍微小環境における増加した持続性、及び増加した有効性を含むがこれらに限定されない、多数の利点を提示する。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集方法は、部分的に、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子の１つ以上の対立遺伝子の修飾を通して実現される。特定の実施形態において、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子の修飾は、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を破壊するもしくは実質的に破壊する、ＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の発現を減少させ、かつ／またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）の１つ以上の機能を損なう、実質的に損なう、もしくは破壊するか、またはＴＣＲα対立遺伝子（複数可）を機能不全にする。特定の実施形態において、ＴＣＲα機能には、細胞表面へのＣＤ３の動員、抗原のＭＨＣ依存性認識及び結合、ＴＣＲαβシグナル伝達の活性化が含まれるが、これらに限定されない。
種々の実施形態で企図されるゲノム編集方法は、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子における標的ＤＮＡ配列に結合し、それを切断するように設計された、遺伝子操作されたヌクレアーゼを含む。特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖切断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって、修復され得る。ある特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼはまた、ニッカーゼとして遺伝子操作され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを用いて修復され得る、１本鎖ＤＮＡ切断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入及び欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対して相同性を有する配列が両側に位置する、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集方法は、部分的に、遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼ及びエンドプロセシング酵素により実現される。
細胞のＴＣＲα遺伝子においてＤＮＡ切断が生成される、種々の実施形態において、切断されたゲノム配列の末端のＮＨＥＪは、正常なＴＣＲ発現、機能喪失または機能獲得ＴＣＲの発現を有する細胞、または好ましくは、機能的ＴＣＲ発現を欠いた、例えば、ＣＤ３を細胞表面に動員する、ＴＣＲαβシグナル伝達を活性化する、ＭＨＣ−抗原複合体を認識し、それに結合する能力を欠いた、細胞をもたらし得る。
切断されたＴＣＲαゲノム配列の修復用のドナーテンプレートが提供される、種々の他の実施形態において、ＴＣＲα対立遺伝子は、ＤＮＡ切断部位における相同組換えによって相同組換えテンプレートの配列で修復される。好ましい実施形態において、修復テンプレートは、標的とするゲノム配列とは異なるポリヌクレオチド配列を含む。より好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、１つ以上の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞、例えば、免疫エフェクター細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子の一方または両方において生成されたＤＮＡ切断部での、減少した内在性ＴＣＲ発現及び／またはシグナル伝達、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの挿入または組込みを含み、任意選択で、レトロウイルス形質導入を介して細胞に導入された別の免疫力エンハンサーまたは遺伝子操作された抗原受容体を発現する。
したがって、本明細書で企図される方法及び組成物は、既存の養子細胞療法と比較した飛躍的改良を表す。
特定の実施形態の実践は、特にそれとは反対の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
Ｂ．定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法及び材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、及び材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書で使用される。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
「及び／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、何であれ「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。故に、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。故に、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通した種々の箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。
「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態で企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、すなわちＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞が含まれる。
「強力なＴ細胞」、及び「幼若Ｔ細胞」は、特定の実施形態において交換可能に使用され、Ｔ細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、次の生物学的マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３の発現を欠いている。
本明細書で使用されるとき、「増殖」という用語は、細胞の対称分裂であれ非対称分裂であれ、細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態において、「増殖」は、Ｔ細胞の対称分裂または非対称分裂を指す。「増加した増殖」は、非処理試料中の細胞と比較して処理試料中で細胞数の増加があるときに生じる。
本明細書で使用されるとき、「分化」という用語は、細胞の分化能もしくは増殖を減少させる、または細胞をより発生が制限された状態に移動させる方法を指す。特定の実施形態において、分化Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞機能を獲得する。
本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞製造」もしくは「Ｔ細胞の製造方法」という用語または同等の用語は、Ｔ細胞の治療用組成物を生産するプロセスを指し、その製造方法は、次の工程、すなわち採取、刺激、活性化、ゲノム編集、及び増殖のうちの１つ以上、または全てを含む。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件を最小限に変化させた生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集及び凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
「インビボ」という用語は、一般に、細胞自己再生及び細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）もしくは増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）などの、生物の内側で起こる活性を指す。一実施形態において、「インビボ増殖」という用語は、インビボで数が増加する細胞集団の能力を指す。一実施形態において、細胞は、インビボで遺伝子操作または修飾される。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）の、その同種のリガンドとの結合によって誘導され、それによって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を含むがこれらに限定されないシグナル伝達事象を媒介する、一次応答を指す。
「刺激分子」は、同種の刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
本明細書で使用される「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在するとき、Ｔ細胞上の同種の結合パートナー（本明細書で「刺激分子」と称される）と特異的に結合し、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を媒介することができる、リガンドを意味する。刺激リガンドには、ＣＤ３リガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２リガンド、例えば、抗ＣＤ２抗体、及びペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態において、活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能に関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲ単独を通して生成されたシグナルではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、１つ以上の二次または共刺激シグナルもまた必要とされる。故に、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及び１つ以上の二次共刺激シグナルを通した一次刺激シグナルを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を通したまたはＣＤ２を通した刺激などの一次活性化シグナルを受容したＴ細胞による増殖及び／またはサイトカイン産生によって明示され得る。
「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３連結反応などの主要シグナルと併せて、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、及び／または特定の分子（例えば、ＣＤ２８）の上方制御もしくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であり得るか、または表面上に提供され得る。「共刺激分子」は、共刺激リガンド（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と特異的に結合するＴ細胞上の同種の結合パートナーを指す。
本明細書で使用される「自家」は、ドナー及びレシピエントが同じ対象である細胞を指す。
本明細書で使用される「同種異系」は、ドナー及びレシピエントの種が同じであるが、細胞が遺伝的に異なる細胞を指す。
本明細書で使用される「同系」は、ドナー及びレシピエントの種が同じであり、ドナー及びレシピエントが異なる個体であり、ドナー細胞及びレシピエント細胞が遺伝的に同一である細胞を指す。本明細書で使用される「異種」は、ドナー及びレシピエントの種が異なる細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、「個体」及び「対象」という用語は、しばしば交換可能に使用され、がんまたは他の免疫障害の症状を呈し、かつ遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る、任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、及び飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、及び好ましくは、ヒト患者が含まれる。典型的な対象には、がんもしくは別の免疫障害を有する、そうであると診断された、またはそれを有する危険性があるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他の箇所で開示される方法で治療され得るがんまたは別の免疫障害であると診断された対象を指す。
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいずれの有益なまたは望ましい効果も含み、治療されている疾患または病態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などの１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療には、任意選択で、疾患または病態の進行を遅延させることが関わり得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
本明細書で使用されるとき、「予防」、及び「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった同様の語は、疾患または病態、例えば、がん、自己免疫疾患、免疫障害などの発生または再発を予防する、阻害する、または低減するための手法を指す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」及び同様の語は、疾患または病態の発症または再発前に疾患または病態の強度、影響、症状、及び／または負荷を低減することも含む。
本明細書で使用されるとき、「〜の少なくとも１つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療されている疾患または病態、例えば、がん、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全の１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態はがんであり、改善される１つ以上の症状には、衰弱、疲労、息切れ、打撲及び出血の起こりやすさ、頻繁な感染、腫脹したリンパ節、膨張したまたは痛みのある腹部（肥大した腹部臓器に起因）、骨または関節痛、骨折、意図しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、及び減少した排尿（腎機能不全に起因）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞が、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の予防結果または治療結果を達成するための「有効量（ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
「予防上有効量」は、遺伝子改変された治療用細胞が所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。必然的ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
遺伝子改変された治療用細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の能力などの要因に応じて異なり得る。治療上有効量はまた、治療上有益な効果が、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞の任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。治療的量が指示されるとき、特定の実施形態で企図される組成物の、投与されるべき正確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、重量、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態における個体差を考慮して決定され得る。
「免疫障害」は、免疫系からの応答を喚起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、がん、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染疾患を包含する。
本明細書で使用されるとき、「がん」という用語は一般に、異常な細胞が制限なく分裂し、近隣組織に浸潤し得る、疾患または病態の分類を指す。
本明細書で使用されるとき、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が無制限の成長（すなわち、正常な限度を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入及びその破壊）、及び転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への広がり）のうちの１つ以上を示す、がんを指す。
本明細書で使用されるとき、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分へのがんの広がりを指す。広がった細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、原発（一次）腫瘍と同様である細胞を含む。
本明細書で使用されるとき、「両性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長し得るが、身体の他の部分には広がらない腫瘍を指す。両性腫瘍は、自己制限的であり、典型的には浸潤または転移しない。
「がん細胞」または「腫瘍細胞」は、がん性成長または組織を伴う個々の細胞を指す。腫瘍は一般に、良性、前悪性、または悪性であり得る、細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指す。ほとんどのがんが腫瘍を形成するが、一部、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成するがんに関して、がん（細胞）及び腫瘍（細胞）という用語は、交換可能に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
「自己免疫疾患」は、身体がその自己の組織の一部の構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生み出す疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を「自己」として認識するその能力を喪失し、それをあたかも異物であるかのように標的とし攻撃する。自己免疫疾患は、主として１つの臓器が侵されるもの（例えば、溶血性貧血及び抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫疾患過程が多くの組織にわたって拡散するもの（例えば、全身性エリテマトーデス）とに分類され得る。例えば、多発性硬化症は、Ｔ細胞が脳及び脊髄の神経線維を包囲する鞘を攻撃することによって引き起こされると考えられている。これは、協調運動の喪失、衰弱、及び視朦をもたらす。自己免疫疾患は当該技術分野で知られており、例えば、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、関節リウマチ、溶血性貧血、抗免疫（ａｎｔｉ−ｉｍｍｕｎｅ）甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが含まれる。
「免疫不全」は、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この病態では、系は、異物に対して防御するのに必要とされる血球の数及び種類が不足するようになる。免疫不全病態または疾患は当該技術分野で知られており、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、及び糖尿病が含まれる。
「感染疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、微生物またはウイルス因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染疾患は当該技術分野で知られており、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア感染症、淋病）、結核症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、コレラ、及びインフルエンザが含まれる。
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより高い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図される組成物の能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、遺伝子操作されたＴＣＲもしくはＣＡＲ発現の増加、ＨＲもしくはＨＤＲ効率の増加、免疫エフェクター細胞増殖、活性化、持続性の増加、及び／またはがん細胞死殺傷能力の増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によって生み出される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である増加を含み得る。
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより低い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図される組成物の能力を指す。測定可能な応答には、内在性ＴＣＲ発現または機能の減少、免疫エフェクター細胞疲弊に関連するバイオマーカーの発現の減少などが含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、または対照組成物によって生み出される応答、または特定の細胞系譜における応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数及び小数点、例えば、１．５、１．６、１．７．１．８などを含む）である減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系譜における応答と比較して、細胞において実質的に同様のまたは同等の生理的応答（すなわち、下流作用）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図される組成物の能力を指す。同等の応答は、参照応答と有意に異なるまたは測定可能な異なる（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）ことはないものである。
本明細書で使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での１つの分子の、別の分子への結合を説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合するか、またはそれと会合する場合、標的分子に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれを超えるＫａを有する結合ドメインを指す。
代替的に、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ未満）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義されてもよい。特定の実施形態で企図される結合ドメインポリペプチドの親和性は、従来の技法、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によって、あるいは標識リガンドを使用した、もしくはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能である）などの表面プラズモン共鳴デバイス、もしくはＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅ（それぞれＣｏｒｎｉｎｇ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能である）などの光バイオセンサ技術を使用した、結合会合、または置換アッセイによって、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、及び米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等の文献を参照されたい）。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高い、バックグラウンド結合よりも約５倍高い、バックグラウンド結合よりも約１０倍高い、バックグラウンド結合よりも約２０倍高い、バックグラウンド結合よりも約５０倍高い、バックグラウンド結合よりも約１００倍高い、もしくはバックグラウンド結合よりも約１０００倍高い、またはそれを超える。
「抗原（Ａｇ）」は、動物に注射されるかまたは動物に吸収させられる組成物（腫瘍特異的タンパク質を含むものなど）を含めて、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激し得る、化合物、組成物、または物質、例えば、脂質、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ペプチド、もしくは核酸を指す。抗原は、開示される抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含めて、特異的な液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「標的抗原」または「目的とする標的抗原」は、本明細書で企図される遺伝子操作された抗原受容体の結合ドメインが結合するように設計される、抗原である。一実施形態において、抗原は、ＭＨＣ−ペプチド複合体、例えば、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体である。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合因子が結合する抗原の領域を指す。
本明細書で使用されるとき、「単離されたポリヌクレオチド」は、自然発生状態でその両側に位置する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、あるＤＮＡ断片に通常は隣接している配列から取り出されたそのＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」はまた、自然界には存在せず、人為的に作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドも指す。
本明細書で使用される「単離されタンパク質」、「単離されペプチド」、または「単離されポリペプチド」及び同様の用語は、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、及び細胞の他の構成要素との会合からのインビトロ合成、単離、及び／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と強く会合していない。
「単離され細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外基質を実質的に含まない、非自然発生細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞などを指す。
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換えによるドナーキャプチャを含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換プロセスを指す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における２本鎖切断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子をテンプレートとして使用して「標的」分子（すなわち、２本鎖切断を経験したもの）を修復し、それがドナーから標的への遺伝情報の伝播につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる伝播は、破損した標的とドナーとの間でのヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、及び／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化をもたらす。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって開始され得る。１本鎖切断及び２本鎖切断の両方が可能である。２本鎖切断は、２つの別々の１本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または段違い末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、標的化された２本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
「標的部位」または「標的配列」は、結合及び／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合する及び／または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。
「外来性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞に導入される分子である。代表的な外来性分子には、有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外来性分子を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で知られており、脂質媒介移入（すなわち、中性及び陽イオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、及びウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で細胞内に通常存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、もしくは他の細胞小器官のゲノム、または自然発生エピソーム核酸を含み得る。追加の内在性分子には、タンパク質、例えば、内在性ＴＣＲが含まれ得る。
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに、調節配列がコード及び／または転写配列に隣接するか否かに関わらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起源、基質結合部位、及び遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子の発現を回復させる、補正する、かつ／もしくは修飾する、ならびに／または１つ以上の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、及び遺伝子操作された抗原受容体を発現させる目的での、細胞のゲノム内の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、及び／または導入を指す。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位においてＤＮＡ損傷を生成するために、任意選択でドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼを細胞に導入することを含む。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体または染色体外付加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノム内の特定の部位に標的化されても標的化されなくてもよい。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子改変は、部位特異的ではない。
Ｃ．ヌクレアーゼ
特定の実施形態で企図される免疫エフェクター細胞組成物は、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する１つ以上の遺伝子座を標的とする遺伝子操作されたヌクレアーゼを用いて遂行される、ゲノム編集によって生成される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、遺伝子操作されたヌクレアーゼが、ゲノム編集を通してＴＣＲシグナル伝達構成要素を正確に破壊するように設計され、ひとたびヌクレアーゼ活性及び特異性が確認されると、ＴＣＲ発現及び／または機能の予測可能な破壊をもたらし、それによってより安全かつより効果的な治療用免疫エフェクター細胞組成物を提供することが企図される。
特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼは、標的配列において１本鎖ＤＮＡ切れ目または２本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生成する。さらに、ＤＳＢは、１本鎖ミック（ｍｉｃｋ）を生成する２つのヌクレアーゼ（ニッカーゼ）の使用によって標的ＤＮＡにおいて達成され得る。各ニッカーゼは、ＤＮＡの１本の鎖を切断し、２つ以上のニッカーゼの使用により、標的ＤＮＡ配列において２本鎖切断（例えば、段違いの２本鎖切断）を作り出すことができる。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断部位においてＤＳＢの相同組換えを介して標的配列に導入されるドナー修復テンプレートと併用される。
ゲノム編集に好適な、本明細書の特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ及び／またはエキソヌクレアーゼドメイン）、ならびに任意選択で、本明細書で企図される１つ以上のリンカーを含む。「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断標的配列に隣接するＤＮＡ結合標的配列に結合するように設計かつ／または修飾されている。遺伝子操作されたヌクレアーゼは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前に遺伝子操作されたヌクレアーゼから設計かつ／または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
標的配列に結合し、それを切断するように遺伝子操作され得るヌクレアーゼの例示的な例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、ｍｅｇａＴＡＬ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼ系が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合及び切断ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ）を含む（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。他の実施形態において、自然発生ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択される標的部位に結合するように改変されてもよい（例えば、同種の結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ）。例えば、メガヌクレアーゼが、それらの同種の結合部位とは異なる標的部位に結合するように設計されている（Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの標的を標的部位に定めるための核酸配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を必要とする。
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ／メガヌクレアーゼ
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼが、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する１つ以上の遺伝子座に結合するように、及びそこにおいて１本鎖切れ目または２本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように、遺伝子操作される。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」及び「メガヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、１２〜４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列及び構造モチーフに基づいて５つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、及びＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生ヌクレアーゼまたは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを指す。
遺伝子操作されたＨＥは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。遺伝子操作されたＨＥは、自然発生ＨＥまたは以前に遺伝子操作されたＨＥにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を作製する、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＨＥは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたＨＥは、１つ以上のリンカー及び／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＨＥは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、Ｔ細胞に導入される。ＨＥ及び３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖−側鎖間及び側鎖−ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。故に、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の自然または遺伝子操作されたＨＥの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたＨＥは、自然ＨＥ（または以前に遺伝子操作されたＨＥ）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされてもよい。ライブラリは、切断アッセイを用いて、各々予測されるＴＣＲα遺伝子座標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０を参照されたい）。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているメガヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類及び真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖１つあたり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または１本鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みによって特徴付けられる、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的及び特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を代表する。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点及び切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。
遺伝子操作されたＬＨＥが設計され得るＬＨＥの例示的な例としては、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、遺伝子操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択される。
一実施形態において、遺伝子操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩである。例えば、配列番号１及び２を参照されたい。
一実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とする遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、天然Ｉ−ＯｎｕＩから生成された。好ましい実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とする遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、以前に遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩから生成された。一実施形態において、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号３に記載されるヒトＴＣＲα遺伝子標的部位に対して生成された。一実施形態において、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号４に記載されるヒトＴＣＲα遺伝子標的部位に対して生成された。
特定の実施形態において、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、ＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）または配列番号５、６、もしくは７に記載されるＩ−ＯｎｕＩの遺伝子操作されたバリアント、またはそれらのさらに遺伝子操作されたバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
一実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）または配列番号５、６、もしくは７に記載されるＩ−ＯｎｕＩの遺伝子操作されたバリアント、またはそれらのさらに遺伝子操作されたバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
特定の実施形態において、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号２）または配列番号５、６、もしくは７に記載されるＩ−ＯｎｕＩの遺伝子操作されたバリアント、またはそれらのさらに遺伝子操作されたバリアントのＤＮＡ認識インターフェースにおいて、特に２４〜５０位、６８〜８２位、１８０〜２０３位、及び２２３〜２４０位に位置するサブドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
一実施形態において、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ配列全体のどこにでも位置する追加の位置に１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換されかつ／または修飾され得る残基には、核酸標的に接触する、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。１つの非限定的な例において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号２）または配列番号５、６、もしくは７に記載されるＩ−ＯｎｕＩの遺伝子操作されたバリアント、またはそれらのさらに遺伝子操作されたバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０位からなる群から選択される少なくとも１つの位置において、１つ以上、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０、さらにより好ましくは少なくとも２５個の置換及び／または修飾を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｌ２６Ｉ、Ｒ２８Ｄ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｅ、Ｖ３７Ｎ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｒ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｔ、Ｎ７５Ｒ、Ｓ７８Ｍ、Ｋ８０Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｙ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｋ、Ｓ１８８Ｖ、Ｓ１９０Ｇ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｋ、Ｑ１９５Ｙ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｓ、Ｋ２２５Ｗ、及びＤ２３６Ｅからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換及び／または修飾を含む。
一実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号５、６、もしくは７に記載されるアミノ酸配列、またはそれらのさらに遺伝子操作されたバリアントを有する。
２．ＭｅｇａＴＡＬ
種々の例示的な実施形態は、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する遺伝子座の標的領域に結合し、それを切断する、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼを企図する。「ｍｅｇａＴＡＬ」は、遺伝子操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと遺伝子操作されたメガヌクレアーゼとを含む遺伝子操作されたヌクレアーゼを指し、任意選択で、１つ以上のリンカー及び／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、Ｔ細胞に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬ及び３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物のトランスクリプトームを操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ−エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、デノボで、または自然発生ＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、及びＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３から、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１及びｈｐｘ１７から、遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導し、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、及び同特許で引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的に反復の１２位及び／または１３位に、反復可変Ｄｉ−残基（Ｒｅｐｅａｔ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｉ−Ｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、１２位及び１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態においては、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。
特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；及びＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊［（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する］が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例としては、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに挙げられ、同特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５〜１３個の反復単位、より好ましくは７〜１２個の反復単位、より好ましくは９〜１１個の反復単位、及びより好ましくは９、１０、または１１個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一の切頭型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含む。故に、特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５〜３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５〜１３．５個の反復単位、より好ましくは７．５〜１２．５個の反復単位、より好ましくは９．５〜１１．５個の反復単位、及びより好ましくは９．５、１０．５、または１１．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼとを含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個〜少なくとも１４０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
本明細書で使用されるとき、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも２０〜少なくとも８５またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５アミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、標的配列に結合し、それを切断するように遺伝子操作されたメガヌクレアーゼと、任意選択で、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意選択で互いに接合されたＮＴＤ及び／またはＣＴＤポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、任意選択でＮＴＤ及び／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬはリンカーポリペプチドに融合され、これが遺伝子操作されたメガヌクレアーゼにさらに融合されることが、企図される。故に、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性及び効率を増加させる。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択される、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩである、遺伝子操作されたＬＨＥとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位と、ＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択される、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩである、遺伝子操作されたＬＨＥとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、約９．５〜約１１．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択される、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩである、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２アミノ酸〜１３７アミノ酸のＮＴＤと、約９．５、約１０．５、または約１１．５個の結合反復単位と、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択される、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩである、遺伝子操作されたＩ−ＯｎｕＩ ＬＨＥとを含む。
３．ＴＡＬＥＮ
特定の実施形態において、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する遺伝子座の標的領域に結合し、それを切断する、ＴＡＬＥＮが企図される。「ＴＡＬＥＮ」は、本明細書の他の箇所で企図される遺伝子操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン）とを含む遺伝子操作されたヌクレアーゼを指し、任意選択で、１つ以上のリンカー及び／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、Ｔ細胞に導入され得る。ＴＡＬＥＮ及び３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
一実施形態において、標的化された２本鎖切断が、２つのＴＡＬＥＮにより達成され、ａｍエンドヌクレアーゼハーフドメインを含む各々を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。別の実施形態において、標的化された２本鎖切断が、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン及び２つのエンドヌクレアーゼハーフドメインを含む単一のポリペプチドを使用して達成される。
特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤと、約３〜３０個の反復単位、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤと、約３．５〜３０．５個の反復単位、例えば、約３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、ＣＴＤと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥＮは、本明細書の他の箇所で開示される約１２１アミノ酸〜約１３７アミノ酸のＮＴＤと、約９．５〜約１１．５個の反復単位（すなわち、約９．５、約１０．５、または約１１．５個の反復単位）を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、１つの型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位の）ＤＮＡに配列特異的に結合し、その結合部位でまたはその近くでＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から外れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合及びエンドヌクレアーゼドメインを有する。一実施形態において、ＴＡＬＥＮは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼハーフドメイン）と、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
特定の実施形態で企図される、ＴＡＬＥＮにおいて使用するのに好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインの例示的な例としては、「ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｕｂｌｉｓｔ？Ｓ」にて開示される少なくとも１６３３ ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインが挙げられる。
特定の実施形態で企図される、ＴＡＬＥＮにおいて使用するのに好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインの追加の例示的な例としては、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼのものが挙げられる。
一実施形態において、本明細書で企図されるＴＡＬＥＮは、Ｆｏｋ Ｉ ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
一実施形態において、本明細書で企図されるＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、切断特異性を強化するための少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのエンドヌクレアーゼハーフドメインとを含み、任意選択で、エンドヌクレアーゼハーフドメインは、ホモ二量体化を最小化または予防するための１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
特定の実施形態で企図される特定の実施形態において使用するのに好適な切断ハーフドメインの例示的な例としては、米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、同第２００８／０１３１９６２号、同第２００９／０３１１７８７号、同第２００９／０３０５３４６号、同第２０１１／００１４６１６号、及び同第２０１１／０２０１０５５号に開示されるものが挙げられ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
４．亜鉛フィンガーヌクレアーゼ
特定の実施形態において、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する遺伝子座の標的領域に結合し、それを切断する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が企図される。「ＺＦＮ」は、１つ以上の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼハーフドメイン）とを含む遺伝子操作されたヌクレアーゼを指し、任意選択で、１つ以上のリンカー及び／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ＺＦＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、Ｔ細胞に導入され得る。ＺＦＮ及び３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
一実施形態において、標的化された２本鎖切断が、２つのＺＦＮを使用して達成され、エンドヌクレアーゼハーフドメインを含む各々を使用して、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。別の実施形態において、標的化された２本鎖切断が、１つ以上の亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び２つのエンドヌクレアーゼハーフドメインを含む単一のポリペプチドにより達成される。
一実施形態において、ＺＮＦは、本明細書の他の箇所で企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、本明細書の他の箇所で企図されるエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼハーフドメイン）とを含む。
一実施形態において、ＺＮＦは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、本明細書の他の箇所で企図されるメガヌクレアーゼとを含む。
特定の実施形態において、ＺＦＮは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれよりも多くのジンガー（ｚｉｎｇｅｒ）フィンガーモチーフを有するジンガー（ｚｉｎｇｅｒ）フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼハーフドメイン）とを含む。典型的には、単一の亜鉛フィンガーモチーフは、約３０アミノ酸長である。亜鉛フィンガーチーフは、標準的Ｃ２Ｈ２亜鉛フィンガー、ならびに、例えばＣ３Ｈ亜鉛フィンガー及びＣ４亜鉛フィンガーなどの、非標準的亜鉛フィンガーの両方を含む。
亜鉛フィンガー結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列に結合するように遺伝子操作され得る。所与の３ｂｐ ＤＮＡ標的配列に対する候補となる亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインが特定されており、複数のドメインを、対応する複合ＤＮＡ標的配列に標的を定められたマルチフィンガーペプチドへと連結するためのモジュラー組立て戦略が考案されている。当該技術分野で既知の他の好適な方法、例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリ、コンピュータ／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからのクローニング、合成構築などもまた使用して、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計及び構築することができる。（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２：３４４−３４８（１９９５）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：５６８９−５６９５（１９９４）、Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ８９：７３４５−７３４９（１９９２）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：９３−９６（１９９５）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９２：９７５２−９７５６（１９９５）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：５５２５−５５３０（１９９７）、Ｇｒｉｅｓｍａｎ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７−６６１（１９９７）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照されたい）。
個々の亜鉛フィンガーモチーフは、３つまたは４つのヌクレオチド配列に結合する。亜鉛フィンガー結合ドメインが結合するように遺伝子操作された配列（例えば、標的配列）の長さが、遺伝子操作された亜鉛フィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガーモチーフの数を決定するであろう。例えば、亜鉛フィンガーモチーフが重複サブユニットに結合しないＺＦＮの場合、６ヌクレオチド標的配列には２フィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチド標的配列には３フィンガー結合ドメインが結合する、などである。特定の実施形態において、標的部位における個々の亜鉛フィンガーモチーフについてのＤＮＡ結合部位は、連続している必要はなく、むしろ、マルチフィンガー結合ドメインにおける亜鉛フィンガーモチーフ間のリンカー配列の長さ及び性質に応じて、１つまたは複数のヌクレオチドによって隔てられ得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＺＮＦは、２、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれよりも多くの亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインと、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＺＮＦは、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれよりも多くの亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択される少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からのエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＺＮＦは、３、４、５、６、７、もしくは８つまたはそれよりも多くの亜鉛フィンガーモチーフを含む亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ Ｉ ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのエンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む。
一実施形態において、本明細書で企図されるＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、切断特異性を強化するための少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼからのエンドヌクレアーゼハーフドメインとを含み、任意選択で、エンドヌクレアーゼハーフドメインは、ホモ二量体化を最小化または予防するための１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系
種々の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系は、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）及びＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座が挙げられるが、これらに限定されない、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の一因となる１つ以上の遺伝子座において、１本鎖ニックまたは２本鎖切断（ＤＳＢ）に結合する及びそれを導入するように遺伝子操作される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、哺乳動物ゲノム遺伝子操作に使用され得る細菌系に基づいた最近遺伝子操作されたヌクレアーゼ系である。例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３−８２６、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３−１１８３、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００４７１、Ｄａｖｉｄ Ｓｅｇａｌ （２０１３）ｅＬｉｆｅ ２：ｅ００５６３、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８（１１）：２２８１−２３０８、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９−７７１を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、標的部位、例えば、転写促進ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）にＣａｓヌクレアーゼを動員するＣａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のＲＮＡを含む。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、本明細書で「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される１つのポリヌクレオチド配列に遺伝子操作され得る。
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼまたは触媒的に死滅したＣａｓとして遺伝子操作され、ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子座内に位置するプロトスペーサー標的配列の部位特異的ＤＮＡ認識及び部位特異的切断に対して、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡで標的複合体を形成する。プロトスペーサーモチーフは、Ｃａｓ／ＲＮＡ複合体の動員に関与する短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する。Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、特定のＣａｓポリペプチドに特異的な特定の３’ＰＡＭ配列によって隣接した２本鎖ポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の鎖を標的化及び切断するために使用され得る。ＰＡＭは、バイオインフォマティクスを用いてまたは実験的アプローチを用いて特定され得る。Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６−１１２１、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインまたは亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥまたは亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインへのＣａｓヌクレアーゼの融合は、ＤＮＡ切断効率及び特異性を増加させる。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、任意選択では、１つ以上のリンカー及び／または追加の機能的ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセシング酵素でＴ細胞に導入され得る。Ｃａｓヌクレアーゼ及び３’プロセシング酵素は、別々に、例えば、異なるベクターまたは別々のｍＲＮＡにおいて、または一緒に、例えば、誘導タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドまたはＩＲＥＳ要素によって分離されるポリシストロニック構築物において導入され得る。
種々の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
定の実施形態で企図される特定の実施形態での使用に好適なＣａｓ９ポリペプチドの例示的な例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａが挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
特定の実施形態で企図される特定の実施形態での使用に好適なＣｐｆ１ポリペプチドの例示的な例は、とりわけ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐ．が挙げられるが、これらに限定されない、細菌種から得られ得る。
Ｃａｓ９オルソログの保存領域は、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。Ｃｐｆ１オルソログは、ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ Ｈドメインを有するが、認識可能なＨＮＨドメインを有しない。ＨＮＨ及びＲｕｖＣ様ドメインは、それぞれ、２本鎖ＤＮＡ標的配列の１つの鎖を切断するのに関与する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼポリペプチドのＨＮＨドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ様ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに相補的でないＤＮＡ鎖を切断する。Ｃｐｆ１は、Ｃｐｆ１の各ＲｕｖＣ様ドメインが、標的部位の相補的または非相補的鎖のいずれかを切断する二量体として作用すると予測される。特定の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、バリアントドメインのヌクレアーゼ活性を減少または排除するＨＮＨまたはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインにおける１つ以上のアミノ酸付加、欠失、変異、または置換を含むことが企図される。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するＣａｓ９ ＨＮＨ変異の例示的な例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ１０Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ９Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ１３Ａ）、及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ１６Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ドメインにおけるヌクレアーゼ活性を減少または排除するＣａｓ９ ＲｕｖＣ様ドメイン変異の例示的な例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはＮ８６３Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、またはＮ６２２Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ８７８Ａ、Ｈ８７９Ａ、またはＮ９０２Ａ）、及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、またはＮ６１１Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｄ．ドナー修復テンプレート
本明細書における特定の実施形態で企図される免疫エフェクター細胞組成物は、遺伝子操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集及び１つ以上のドナー修復テンプレートの導入によって生成される。いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞中の１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼの発現が、標的部位、例えば、ＴＣＲα遺伝子で１本または２本鎖ＤＮＡ切断を生成し、ドナー修復テンプレートの存在下でヌクレアーゼ発現及び切断の生成が、相同組換えによって標的部位でテンプレートの挿入または組込みをもたらし、それによって切断を修復することが企図される。
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
種々の実施形態において、異なる免疫抑制経路を標的化する免疫力エンハンサー及び／または免疫抑制シグナルダンパーを独立してコードする複数のドナー修復テンプレートの存在下で、細胞を遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供することは、治療有効性及び持続性の増加を有するゲノム編集されたＴ細胞を産出することが企図される。例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩ経路の組み合わせを標的とする免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルは、特定の実施形態において好ましい場合がある。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、１つ以上の相同アームを含む。本明細書で使用されるとき、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断を隣接するＤＮＡ配列と同一、またはほぼ同一であるドナーテンプレート中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナーテンプレートは、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列５’と同一、またはほぼ同一である核酸を含む５’相同アームを含む。一実施形態において、ドナーテンプレートは、ＤＮＡ切断部位のＤＮＡ配列３’と同一、またはほぼ同一である核酸を含む３’相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナーテンプレートは、５’相同アーム及び３’相同アームを含む。
特定の実施形態で企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ、またはそれより長い相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な相同アーム長さの追加の例示的な例としては、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、５’及び３’相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。一実施形態において、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。一実施形態において、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。
ドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に企図される、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’相同アーム、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び３’相同アームを含む。
種々の実施形態において、ＴＣＲα対立遺伝子は、５’相同アーム、１つ以上の自己切断型ポリペプチド、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、及び３’相同アームを含むドナー修復テンプレートで修飾される。
１．免疫力エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でＴＣＲα遺伝子座においてＤＳＢを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力かつ／または耐性で作製される。本明細書で使用されるとき、「免疫力エンハンサー」という用語は、Ｔ細胞中で腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する、Ｔ細胞の活性化及び／または機能、免疫賦活因子、及び非天然ポリペプチドを刺激及び／または増強する非天然分子を指す。
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、及び／またはサイトカイン受容体が挙げられるが、これらに限定されない、免疫賦活因子；及びフリップ受容体からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫賦活因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。
ａ．二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＣＲα遺伝子座においてＤＳＢを導入することによってより強力になるように作製される。ＢｉＴＥ分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第１の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第２の結合ドメインとを含む二分分子である。第１の及び第２の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、及び炭水化物から選択され得る。
特定の実施形態において、第１の及び第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。
特定の実施形態において、第１の及び第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、第１の及び第２の結合ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
特定の実施形態において第１の結合ドメインによって認識及び結合され得る標的抗原の例示的な例としては、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
標的抗原の他の例示的な実施形態は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含み、任意選択で、ペプチドは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＭＡＧＥ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１から処理される。
特定の実施形態において第２の結合ドメインによって認識及び結合される免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子の例示的な例としては、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘導され、ＢｉＴＥを含むドナー修復テンプレートは、細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
ｂ．免疫賦活因子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集された細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、及びサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＣＲα遺伝子座においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインをコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるケモカインをコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、パーフォリン、グランザイムＡ、及びグランザイムＢからなる群から選択される細胞毒素をコードする。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、及びＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
ｃ．フリップ受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境によって誘発される免疫抑制因子による免疫抑制シグナルを陽性免疫刺激シグナルに「フリップすること」または「逆にすること」による疲弊に対してより強力になるように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、フリップ受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＣＲα遺伝子座においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。本明細書で使用されるとき、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞中の免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫刺激シグナルをＴ細胞に伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインまたは細胞外結合ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫賦活サイトカイン受容体の細胞内ドメインとを含むフリップ受容体を含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１３受容体、またはＴＧＦβ受容体の細胞外サイトカイン結合ドメインである免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される膜貫通と、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される細胞内ドメインとを含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβに結合する抗体またはその抗原結合断片である免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される膜貫通と、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される細胞内ドメインとを含む。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含むフリップ受容体を含む。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞外ドメインの例示的な例としては、ＩＴＩＭ及び／またはＩＴＳＭを含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞外ドメインのさらなる例示的な例としては、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＲＣＡＳ１Ｒ、及びＦＡＳの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含むフリップ受容体を含む。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な膜貫通ドメインの例示的な例としては、タンパク質：ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩＴ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４のアルファまたはベータ鎖膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、免疫刺激シグナルを増加させるために、ＴＣＲシグナル伝達複合体、例えば、ＣＤ３と関連する膜貫通ドメインを選択することが好ましい場合がある。
種々の実施形態において、フリップ受容体は、免疫刺激シグナルを誘発する細胞内ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「細胞内ドメイン」という用語は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）、共刺激シグナル伝達ドメイン、主要シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞において免疫刺激シグナルを誘発することと関連する、別の細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない、免疫刺激モチーフまたはドメインを指す。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞内ドメインの例示的な例としては、ＩＴＡＭモチーフを含むドメインが挙げられるが、これに限定されない。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞内ドメインの追加の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、またはＺＡＰ７０から単離される共刺激シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞内ドメインの追加の例示的な例としては、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるフリップ受容体の特定の実施形態での使用に好適な細胞内ドメインのさらなる例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄから単離される主要シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、またはＴＧＦβＲＩＩからの細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、及びＴＧＦβＲＩＩからの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、またはＴＧＦβＲＩＩからの細胞外ドメインを含む細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｉ．ＰＤ−１フリップ受容体
ＰＤ−１は、Ｔ細胞上で発現され、腫瘍微小環境に存在する免疫抑制因子による免疫抑制の対象となる。ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の発現は、いくつかのヒト悪性腫瘍における予後と相関する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達経路は、Ｔ細胞疲弊のある重要な調節経路である。ＰＤ−Ｌ１は、がん細胞及び間質細胞において多量に発現され、モノクローナル抗体を用いたＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の遮断が、Ｔ細胞抗腫瘍機能を増強する。ＰＤ−Ｌ２もまた、ＰＤ−１に結合し、Ｔ細胞機能を負に調節する。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＰＤ−１フリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＰＤ−１フリップ受容体は、ヒトＰＤ−１受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＰＤ−１、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｉｉ．ＬＡＧ−３フリップ受容体
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）は、Ｔ細胞機能への多様な生物学的効果を有する細胞表面分子である。ＬＡＧ−３シグナル伝達は、自己免疫応答のＣＤ４＋制御性Ｔ細胞抑制に関連する。その上、ＬＡＧ−３発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原刺激時に増加し、腫瘍微小環境においてＴ細胞疲弊に関連する。ＬＡＧ−３のインビボの抗体遮断は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積及びエフェクター機能の増加に関連する。ある群は、特定の抗腫瘍ワクチン接種と組み合わせた抗ＬＡＧ−３抗体の投与が、腫瘍柔組織の腫瘍及び破壊において活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加をもたらしたことを示した。Ｇｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１１）：３３８３−３３９２。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＬＡＧ−３フリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＬＡＧ−３フリップ受容体は、ヒトＬＡＧ−３受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＬＡＧ−３、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｉｉｉ．ＴＩＭ−３フリップ受容体
Ｔ細胞免疫グロブリン−３（ＴＩＭ−３）は、負の調節分子として構築されており、免疫耐性に関与する。ＴＩＭ−３発現は、がんにおいて、及び慢性感染中に疲弊したＴ細胞を特定する。ＴＩＭ−３発現ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、減少した量のサイトカインを産生するか、または抗原に応答して増殖が少ない。ＴＩＭ−３発現の増加は、Ｔ細胞増殖の減少ならびにＩＬ−２、ＴＮＦ、及びＩＦＮ−γの産生の減少に関連する。ＴＩＭ−３シグナル伝達経路の遮断は、増殖を回復し、抗原特異的Ｔ細胞におけるサイトカイン産生を増強する。
ＴＩＭ−３は、共発現され、癌胎児性抗原細胞粘着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）を有するヘテロ二量体、活性化されたＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞阻害に関与する別の公知の分子を形成する。ＣＥＡＣＡＭ１の存在は、ＴＩＭ−３に阻害性機能を与える。ＣＥＡＣＡＭ１は、各分子の高度に関連した膜遠位Ｎ末端ドメインを通してシスのヘテロ二量体相互作用を形成することによってＴＩＭ−３の成熟及び細胞表面の発現を促進する。ＣＥＡＣＡＭ１及びＴＩＭ−３はまた、それらのＮ末端ドメインを通してトランスにも結合する。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＴＩＭ−３フリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＴＩＭ−３フリップ受容体は、ヒトＴＩＭ−３受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＴＩＭ−３、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｉｖ．ＣＴＬＡ−４フリップ受容体
ＣＴＬＡ４は、主に、Ｔ細胞上に発現され、Ｔ細胞活性化の初期段階の振幅を調節する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激受容体、ＣＤ２８の活性に対抗する。ＣＤ２８は、ＴＣＲが、初めに同族抗原によって係合しない限り、Ｔ細胞活性化に影響を及ぼさない。一旦抗原認識が生じると、ＣＤ２８シグナル伝達は、Ｔ細胞を活性化するために、ＴＣＲシグナル伝達を強力に増幅する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４は、同一のリガンド：ＣＤ８０（別名Ｂ７．１）及びＣＤ８６（別名Ｂ７．２）を共有する。ＣＴＬＡ４は、両方のリガンドに対してはるかに高い全体的な親和性を有し、ＣＤ８０及びＣＤ８６に結合する際にＣＤ２８を打ち負かすことによって、ならびにＴ細胞に阻害シグナルを活発に送達することによってＴ細胞の活性化を抑える。ＣＴＬＡ４はまた、ＣＤ２８係合からＣＤ８０及びＣＤ８６の金属イオン封鎖、ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面からのＣＤ８０及びＣＤ８６の活性除去を通してシグナル伝達非依存性Ｔ細胞阻害も与える。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＣＴＬＡ−４フリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＣＴＬＡ−４フリップ受容体は、ヒトＣＴＬＡ−４受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｖ．ＴＩＧＩＴフリップ受容体
Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフ［ＩＴＩＭ］ドメイン（ＴＩＧＩＴ）は、複数の固形腫瘍型にわたって一貫して高度に発現されたとして特定したＴ細胞共阻害性受容体である。ＴＩＧＩＴは、抗腫瘍及び他のＣＤ８＋Ｔ細胞依存性慢性免疫応答を限定する。ＴＩＧＩＴは、ヒト及びマウス腫瘍浸潤Ｔ細胞上に高度に発現される。ＴＩＧＩＴの遺伝子破壊または抗体遮断は、インビトロ及びインビボでのＮＫ細胞殺傷及びＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングを増強することが示されており、実験的自己免疫脳炎などのＣＤ４＋Ｔ細胞依存性自己免疫疾患の重症度を悪化させ得る（Ｇｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｊｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｌｏｚａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｓｔｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。逆に、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質またはアゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、インビトロでＴ細胞活性化及びインビボでＣＤ４＋Ｔ細胞依存性遅延型過感受性を抑制した（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．、２００９）。ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５に結合するために、それに対抗共刺激受容体ＣＤ２２６を打ち負かすことによってその免疫抑制効果を発揮する可能性がある。
がん及び慢性ウイルス感染の両方のモデルにおいて、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１の抗体共遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能を相乗的かつ特異的に増強し、それぞれ、有意な腫瘍及びウイルス排除をもたらす。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＴＩＧＩＴフリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＴＩＧＩＴフリップ受容体は、ヒトＴＩＧＩＴ受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
ｖｉ．ＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体
形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）は、多くのアームの免疫系を二極化させ得る腫瘍細胞及び免疫細胞によって産生される免疫抑制サイトカインである。腫瘍細胞及び腫瘍浸潤リンパ球によるＴＧＦβを含む免疫抑制サイトカインの過剰産生は、免疫抑制腫瘍微小環境に貢献する。ＴＧＦβは、しばしば、がんに罹患している患者における免疫細胞の機能及び不良な予後を阻害する、腫瘍転移及び浸潤に関連する。腫瘍特異的ＣＴＬ中のＴＧＦβＲＩＩを通してＴＧＦβシグナル伝達は、腫瘍におけるそれらの機能及び頻度を抑え、モノクローナル抗体によるＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＧＦβシグナル伝達の遮断は、腫瘍部位でより急速な腫瘍監視及び多くのさらなるＣＴＬの存在をもたらす。
一実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＣＲα対立遺伝子において誘発され、ＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体を含むドナー修復テンプレートは、該細胞に導入され、相同組換えによってＴＣＲα対立遺伝子に挿入される。
特定の実施形態で企図されるＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体は、ヒトＴＧＦβＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７からの膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、及び／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
２．免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませるある限定または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊による免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、低下したサイトカイン発現及びエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を低下または減衰することによって疲弊に対してより耐性になるように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＣＲα遺伝子座においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
本明細書で使用されるとき、「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、Ｔ細胞への腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルの伝達を低下させる非天然ポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、任意選択で、膜貫通ドメインと、任意選択で、修飾細胞内ドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むため、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路への抑制する、抑える、または優性ネガティブ効果を誘発するポリペプチドを指す。
特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫抑制因子を認識及び結合する細胞外結合ドメインである。
特定の実施形態において、修飾細胞内ドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異される。好適な変異戦略としては、アミノ酸置換、付加、または欠失が挙げられるが、これらに限定されない。好適な変異としては、さらに、シグナル伝達ドメインを除去するための細胞内ドメイン切断、シグナル伝達モチーフ活性にとって重要な残基を除去するための変異細胞内ドメイン、及び受容体循環を遮断するための変異細胞内ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、存在するとき、免疫抑制シグナルを伝達しないか、または実質的に低減されたシグナル伝達を有する。
故に、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境から１つ以上の免疫抑制因子のためのシンクの役割を果たし、Ｔ細胞において対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。
ある免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化によって媒介される。がん細胞においてインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるトリプトファン異化は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞への免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Ｐｌａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２（２１）：５４３５−４０を参照されたい。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。
特定の実施形態での使用に好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例としては、Ｌ−キヌレニンヒドロラーゼが挙げられるが、これに限定されない。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態で企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的化される免疫抑制因子の例示的な例としては、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合がん抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が挙げられるが、これらに限定されない。
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないまたは免疫抑制シグナルを伝達する実質的に低減された能力を有する修飾細胞内ドメインとを含む。
本明細書で使用されるとき、「細胞外ドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、細胞外ドメインは、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。
免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態での使用に好適な細胞外ドメインの例示的な例としては、抗体もしくはその抗原結合断片、またはポリペプチド：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１）、受容体結合がん抗原上で発現されるＳｉＳｏ細胞（ＲＣＡＳ１Ｒ）、及びＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）から単離された細胞外リガンド結合ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
多くの膜貫通ドメインは、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態で企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態での使用に好適な膜貫通ドメインの例示的な例としては、タンパク質：Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書で企図される養子細胞療法は、ＴＧＦβＲＩＩを通して腫瘍微小環境からの免疫抑制ＴＧＦβシグナルの伝達を阻害または遮断する免疫抑制シグナルダンパーを含む。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインと、及び切断された、機能不全ＴＧＦβＲＩＩ細胞内ドメインとを含む。別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインとを含み、細胞内ドメインを欠いている。
３．遺伝子操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体である。
ａ．遺伝子操作されたＴＣＲ
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲを含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、単一のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。別の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖は、ＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入され、遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖は、他のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたＴＣＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及び／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
天然Ｔ細胞受容体は、２つのサブユニット、アルファ鎖及びベータ鎖サブユニットを含み、これらのそれぞれは、各Ｔ細胞のゲノムにおいて組換え事象によって産生される固有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対してそれらの選択性についてスクリーニングされ得る。このように、標的抗原に対して高い結合活性及び反応性を有する天然ＴＣＲは、選択され、クローン化され、その後、養子免疫療法に対して使用されるＴ細胞の集団に導入され得る。
一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子において、ＤＳＢでＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートに導入することによって修飾され、ＴＣＲサブユニットは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞への特異性を与えるＴＣＲを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットは、サブユニットが、ＴＣＲを形成する能力を保持し、トランスフェクトＴ細胞が標的細胞に誘導される能力を与え、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、天然サブユニットと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。遺伝子操作されたＴＣＲはまた、好ましくは、高い結合活性を有する関連のある腫瘍関連ペプチドを表示する標的細胞に結合し、及び任意選択で、インビボで関連ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介する。
遺伝子操作されたＴＣＲをコードする核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（天然に存在する）染色体においてそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所で記載される、好適なベクターに組み込まれ得る。それらを含む核酸及びベクターの両方が、細胞に、好ましくは、特定の実施形態において、Ｔ細胞に移動され得る。次いで、修飾Ｔ細胞は、形質導入された核酸または核酸によってコードされるＴＣＲのうちの１つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを正常に発現しないＴ細胞に導入されるため、外因性ＴＣＲである。遺伝子操作されたＴＣＲの本質的態様は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的構成要素によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有することである。遺伝子操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣの独立した様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
ＴＣＲは、結合したさらなるポリペプチドが、機能的Ｔ細胞受容体及びＭＨＣ依存性抗原認識を形成するアルファ鎖またはベータ鎖の能力に干渉しない限り、ＴＣＲの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に結合するさらなるポリペプチドで発現され得る。
特定の実施形態で企図される遺伝子操作されたＴＣＲによって認識される抗原としては、血液癌及び固形腫瘍の両方における抗原を含む、がん抗原が挙げられるが、これに限定されない。例示的な抗原としては、アルファ葉酸受容体、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをコードするポリヌクレオチドまたは第１の自己切断型ウイルスペプチド、ならびに１つの修飾及び／または機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖及び／またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをコードするポリヌクレオチドまたは第１の自己切断型ウイルスペプチド、ならびに１つの修飾及び／または機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５’から３’の、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチド、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに１つの修飾及び／または機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に統合された遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。このような場合には、他のＴＣＲα対立遺伝子は、機能的であり得る、あるいは機能を低下させるかまたはＤＳＢによる機能不全及びＮＨＥＪによる修復され得る。一実施形態において、他のＴＣＲα対立遺伝子は、本明細書で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼによって修飾され、機能を低下させるかまたは機能不全であり得る。
ある特定の実施形態において、両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾され、機能を低下するかまたは機能不全であり、第１の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド及び遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、第２の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチド及び遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたＣＡＲ、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及び／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体またはその構成要素、または１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入されるキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを有する標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体系特異性を組み合わせる分子である。本明細書で使用される、「キメラ」という用語は、異なるタンパク質の部分または異なる起源からのＤＮＡからなることを説明する。
種々の実施形態において、ＣＡＲは、特異的標的抗原（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによって、主要組織適合性（ＭＨＣ）の独立した様式で、標的抗原を発現する細胞の細胞死を媒介し得る、分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用する。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍細胞上で発現される標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、キメラ受容体、例えば、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲまたはＤａｒｉｃを提供する。結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子、またはその構成要素）に特異的に認識及び結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的となる生物学的分子に対する、任意に天然に存在する、合成、半合成、または組換え技術によって産生された結合パートナーを含む。
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものである、標的抗原のエピトープに特異的に認識及び結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、及びその抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗原は、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に特異的結合親和性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つの、２つの、３つの、４つの、または５つもしくはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５のアミノ酸、約５〜約２０のアミノ酸、または約１０〜約２０のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長である。
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後ろに、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３を含む。
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にするためにエフェクター細胞表面から離れて抗原結合ドメインを位置決めする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結される。ＣＡＲは、一般には、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
本明細書に記載のＣＡＲでの使用に好適な例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、及びＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子から野生型ヒンジ領域であり得るか、または変化され得る。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分及び細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）に由来し得る（すなわち、それらを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、好ましくは、ＴＭドメイン及びＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長のＣＤ８α及び短オリゴまたはポリペプチドリンカーに由来するＴＭドメインを含む。グリシン−セリンリンカーは、特定の好適なリンカーを提供する。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に形質導入して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害性活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。
「エフェクター機能」という用語は、該細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解性活性またはサイトカインの分泌を含む、補助もしくは活性であり得る。故に、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を、特殊機能を行うように誘導するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を使用する範囲内で、そのような切断部分を、エフェクター機能シグナルを伝達する限りは、ドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であること、及び二次または共刺激シグナルも必要であることが公知である。故に、Ｔ細胞活性化は、２つの別個のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存的一次活性化を開始する主要シグナル伝達ドメインと、抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルをもたらす共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されるということができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「主要シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
主要シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激性に作用する主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシン依存性モチーフまたはＩＴＡＭとして公知であるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
特定の実施形態で企図されるＣＡＲでの使用に好適な主要シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内主要シグナル伝達及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び増殖を増強するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
特定の実施形態で企図されるＣＡＲでの使用に好適なかかる共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
種々の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
ｃ．Ｄａｒｉｃ受容体
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＤａｒｉｃ受容体を含む。本明細書で使用されるとき、「Ｄａｒｉｃ受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、Ｄａｒｉｃの１つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃまたはその１つ以上の構成要素は、単一のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
一実施形態において、遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子及び免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及び／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの１つ以上で挿入されないＤａｒｉｃを含むか、またはＤａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
Ｄａｒｉｃアーキテクチャ及び構成要素の例示的な例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０１７２１４及び米国特許公開第２０１５０２６６９７３号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、Ｄａｒｉｃ構成要素：第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、及び任意選択で第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む機能的Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチド及び結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連する及びそれらとの間に配置される架橋因子を有する細胞表面上にＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含む。
特定の実施形態において、第１の及び第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のためのトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンドまたはその誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子と関連する。
ラパマイシン類似体（ラパログ）の例示的な例は、米国特許第６，６４９，５９５号に開示されるものを含み、ラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果を有するラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」は、臨床的にまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）もしくはインビボでのサロゲートで測定される、等モル量のラパマイシンに観察されたまたは期待された免疫抑制効果を少なくとも０．１〜０．００５倍未満有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」は、同じアッセイにおいてラパマイシンに観察されたＥＣ５０値よりも少なくとも１０〜２５０倍大きいかかるインビトロアッセイにおいてＥＣ５０値を有するラパログを指す。
ラパログの他の例示的な例としては、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、及びゾタロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と関連があるであろう。例えば、第１の及び第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ及びＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質及びラパマイシンまたはそのラパログと共に三部分複合体を形成することができるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒト及び他の種からのｍＴＯＲタンパク質（文献においてＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称される）、Ｔｏｒ１及びＴｏｒ２を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダＦＲＡＰホモログを含む、多くの天然に存在するタンパク質中に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、及びこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、既に当該技術分野で既知である。例えば、ヒトｍＴＯＲにおけるタンパク質配列アクセッション番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３４０７５．１である（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：７５６，１９９４）。
本明細書で企図される特定の実施形態での使用に好適なＦＲＢドメインは、一般に、少なくとも約８５〜約１００個のアミノ酸残基を含有する。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質で使用するＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づいて、９３アミノ酸配列Ｉｌｅ−２０２１〜Ｌｙｓ−２１１３及びＴ２０９８Ｌの変異を含むであろう。特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃｓで使用するＦＲＢドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したＦＫＢＰタンパク質の複合体に結合することができるであろう。ある特定の実施形態において、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）相同タンパク質のヒトｍＴＯＲの少なくとも示された９３アミノ酸領域または対応する領域に及ぶ天然に存在するペプチド配列、（ｂ）天然に存在するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸または約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている天然に存在するＦＲＢのバリアント、または（ｃ）天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝コードの縮重がなかったら、天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを含む。
ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、及びラパマイシンなどのマクロライドの細胞質受容体であり、種線にわたって高度に保存される。ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質または融合タンパク質を用いて三部分複合体をさらに形成することができるタンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」と称され得る。ヌクレオチド配列、クローニング、及び種々のＦＫＢＰ種の他の態様に関連する情報は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４６：６７１，１９９０（ヒトＦＫＢＰ１２）、Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：３６１，１９９６を参照されたい）。他の哺乳動物種、酵母、及び他の生物における相同ＦＫＢＰタンパク質はまた、当該技術分野で既知であり、本明細書に開示されている融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態で企図されるＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう（かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように）。
特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃでの使用に好適なＦＫＢＰドメインの例示的な例としては、好ましくはヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ５８４７６．１）から、またはそこから単離されたペプチド配列、別のヒトＦＫＢＰから、マウスもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰから、またはいくつかの他の動物、酵母、もしくは真菌ＦＫＢＰから単離された天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、天然に存在するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸または約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている天然に存在するＦＫＢＰのバリアント、あるいは天然に存在するＦＫＢＰドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝コードの縮重がなかったら、天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃでの使用に好適な多量体化ドメインの他の例示的な例としては、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ、ＦＫＢＰ及びカルシニューリン、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、ＦＫＢＰ及び細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリン及びシクロフィリン、ＰＹＬ１及びＡＢＩ１、またはＧＩＢ１及びＧＡＩ、またはそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに他の実施形態において、抗架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチド及び結合ポリペプチドと架橋因子との関連性を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６は、ラパマイシンを滴定するための抗架橋因子として使用され、したがって、１つの多量体化ドメインのみが結合するため、シグナル伝達を停止し得る。ある特定の実施形態において、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子は、特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃ構成要素の機能を遮断または最小限に抑え、同時に、臨床設定において望ましくないまたは病理学的炎症応答を阻害または遮断するために使用され得る。
一実施形態において、第１の多量体化ドメインは、ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
別の実施形態において、第１の多量体化ドメインは、ＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第１の膜貫通ドメイン及び結合ポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーを含む。第１の及び第２の膜貫通ドメインの例示的な例は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素での使用に好適な主要シグナル伝達ドメインの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特に好ましい実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内主要シグナル伝達及び共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結することができる。
特定の実施形態で企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素での使用に好適なかかる共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。
抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものである、標的抗原のエピトープに特異的に認識及び結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、及びその抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
一実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約２〜約３５個のアミノ酸、または約４〜約２０個のアミノ酸または約８〜約１５個のアミノ酸または約１５〜約２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、適切な細胞／細胞接触、抗原結合及び活性化を可能にするためにドメインを位置決めする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」を含む。Ｄａｒｉｃは、結合ドメインと多量体化ドメイン及び／または膜貫通ドメイン（ＴＭ）または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジまたはＣＤ４ヒンジである。
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
ｄ．ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子で挿入されないキメラサイトカイン受容体、ならびに１つ以上のｏｆ免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及び／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体またはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体受容体は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に連結することができる支援領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ膜貫通免疫受容体である。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現されるとき、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現するような細胞に、Ｔ細胞活性を誘導する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、様々ながんの治療への適用と共に、具体的には、ヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌／パラクリンサイトカイン系を介してＴ細胞の抗原特異性を再指向する。
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激ドメインを含有するＩＴＡＭからなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される。
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される。
一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインからなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
Ｅ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、改良された養子細胞療法組成物を提供する。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される方法によって製造されたゲノム編集された免疫エフェクター細胞が、インビボでの増加した改良された安全性、有効性、及び持続性を含む優れた特性が染み込んでいると考えられる。
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、免疫エフェクター細胞、例えば、本明細書で企図される組成物及び方法によって編集される１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子を有するＴ細胞を含む。
特定の実施形態において、Ｔ細胞の集団においてＴＣＲα対立遺伝子を編集する方法は、Ｔ細胞の集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖させること、遺伝子操作されたヌクレアーゼをＴ細胞の集団に導入すること、Ｔ細胞の集団に、ドナー修復テンプレートを含む１つ以上のベクターを形質導入することを含み、遺伝子操作されたヌクレアーゼの発現が、ＴＣＲα対立遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出し、ドナー修復テンプレートが、２本鎖切断（ＤＳＢ）の部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）によってＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれる。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、自己移植／自家（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自己移植（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。本明細書で使用される、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される、「自家」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される、「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対照の細胞を指す。本明細書で使用される、「異種」は、相対的に細胞に異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、多くの源から得られ得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、沈降、例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に既知の任意の数の技法を使用して、対象から収集した血液単位から得ることができる。
特定の実施形態において、Ｔ細胞を含む細胞の集団、例えば、ＰＢＭＣは、本明細書で企図されるゲノム編集組成物及び方法に供される。他の実施形態において、Ｔ細胞の単離または精製された集団が、使用される。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって、細胞を単離することができる。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣを単離した後、細胞傷害性及びヘルパーＴリンパ球の両方を、活性化、増殖、及び／または遺伝子改変の前またはその後に、ナイーブ、メモリー、及びエフェクターＴ細胞サブ集団に選別することができる。
マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現する、Ｔ細胞の特定のサブ集団を、正または負の選択技法によってさらに単離することができる。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７；またはＣＤ３８またはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現する、Ｔ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法によってさらに単離される。種々の実施形態において、製造されたＴ細胞組成物は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
一実施形態において、Ｔ細胞の単離または精製された集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、マーカーのうちの１つ以上を発現する。
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、個体から単離され、第１に、ゲノム編集を行う前に、活性化され、刺激されて、インビトロで増殖させる。
Ｔ細胞組成物の十分な治療量を達成するために、Ｔ細胞は、しばしば、刺激、活性化、及び／または増殖の１つ以上のラウンドに供される。Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、及び同第６，８６７，０４１号（これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、方法を使用して、活性化し、増大させ得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞にゲノム編集組成物を導入する前に、約１日〜約４日、約１日〜約３日、約１日〜約２日、約２日〜約３日、約２日〜約４日、約３日〜約４日、または約１日、約２日、約３日、または約４日間活性化し、増大させ得る。
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞にゲノム編集組成物を導入する前に、約６時間、約１２時間、約１８時間または約２４時間活性化し、増大させる。
一実施形態において、Ｔ細胞にゲノム編集組成物を導入するのと同時に、Ｔ細胞が活性化される。
一実施形態において、共刺激リガンドは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によって提供される主要シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、リンホトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドが挙げられるが、これらに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
好適な共刺激リガンドは、可溶形態で提供され得るか、またはゲノム編集されたＴ細胞上で発現される遺伝子操作された抗原受容体に結合するＡＰＣまたはａＡＰＣ上で発現され得る、標的抗原をさらに含む。
種々の実施形態において、Ｔ細胞のゲノムを編集する方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を活性化し、Ｔ細胞の集団を増幅することを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通してまたはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介して第１の刺激シグナルを提供することによって及びアクセサリー分子、例えば、ＣＤ２８を通して第２の副刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）刺激シグナルを提供することによって達成され得る。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞を、好適なＣＤ３結合剤、例えば、ＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体と接触させることによって刺激され得る。ＣＤ３抗体の例示的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、及び６４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、ＣＤ２結合剤は、一次刺激シグナルをＴ細胞に提供するために使用され得る。ＣＤ２結合剤の例示的な例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３６：８９７−９０６）、及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（ＴＩ １．１として同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ、Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００）が挙げられるが、これらに限定されない。上述の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。本明細書の他の箇所に開示される標準的技術によって、追加の抗体、または抗体の組み合わせを調製及び特定することができる。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体、またはＣＤ２を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘発は、二次共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。ＣＤ２８結合剤の例示的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６）などのタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー；ＣＤ２８分子を架橋することができる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子は、同じ表面に結合される。
ある特定の実施形態において、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上でのその発現に好適な形態で、結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクトまたは形質導入することにより、または代替として、結合剤を細胞表面に結合することにより達成され得る。
別の実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子は、抗原提示細胞上に表示される。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２を通して刺激を提供する分子、及び共刺激分子が、別個の表面上に提供される。
ある特定の実施形態において、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性（溶液で提供される）であり、他の薬剤（複数可）が、１つ以上の表面上に提供される。
特定の実施形態において、刺激及び共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるＴ細胞ゲノム編集の方法は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化することを含む。
一実施形態において、本明細書で企図される方法によって活性化されたＴ細胞の増幅は、数時間（約３時間）〜約７日〜約２８日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値の間、Ｔ細胞を含む細胞集団を培養することをさらに含む。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２１日間培養され得る。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るように、数サイクルの刺激／活性化／増殖が望ましい場合もある。
特定の実施形態において、Ｔ細胞培養に適切な条件は、適切な培地（例えば、最小必須培地、またはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、もしくはＸ−ｖｉｖｏ １５，（Ｌｏｎｚａ））、ならびに血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞の成長に好適な任意の他の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖及び生存能に必要な１つ以上の因子を含む。
細胞培養培地のさらに例示的な例としては、ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５、及びＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ、これにアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは定義されたホルモン一式、ならびに／またはＴ細胞の成長及び増幅に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充されるかのいずれかである。
抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培地にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％Ｃ０２）下で維持される。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、一般にビーズまたは他の表面に結合される抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触させられる。
他の実施形態において、様々な共刺激分子及びサイトカインの安定した発現及び分泌を指向するために、Ｋ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒ細胞を遺伝子操作することによって人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態において、Ｋ３２またはＵ３２ ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。Ｔ細胞集団は、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６が挙げられるが、これらに限定されない、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣによって増幅され得る。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅し、ＣＤ８Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、Ｔ細胞においてＴＣＲα対立遺伝子を編集するための方法は、本明細書で企図される１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼをＴ細胞の集団に導入することを含む。
一実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のヌクレアーゼは、活性化及び刺激前に、Ｔ細胞に導入される。
別の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のヌクレアーゼは、Ｔ細胞が刺激されるのとほぼ同時にＴ細胞に導入される。
好ましい実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のヌクレアーゼは、Ｔ細胞の活性化及び刺激後、例えば、約１、２、３、または４日後に、Ｔ細胞に導入される。特定の実施形態において、Ｔ細胞に導入されるヌクレアーゼとしては、エンドヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ；及び任意選択でエンドプロセシングヌクレアーゼまたはその生物学的に活性な断片、例えば、５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が挙げられるが、これらに限定されない。エンドヌクレアーゼ及びエンドプロセシングヌクレアーゼは、融合タンパク質として発現され得、多シストロン性ｍＲＮＡから発現され、または独立して、１つ以上の発現カセットから発現され得る。
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ベクターを用いてＴ細胞に導入される。他の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、好ましくは、ｍＲＮＡとしてＴ細胞に導入される。ヌクレアーゼは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入などによってＴ細胞に導入され得る。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集方法は、標的部位でＤＳＢを作り出すために、本明細書で企図される１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼを、活性化され、刺激されたＴ細胞の集団に導入することと、続いて、相同組換えによってＤＳＢ部位で細胞のゲノムに組み込まれるであろうＴ細胞集団に１つ以上のドナー修復テンプレートを導入することと、を含む。
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及び／またはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＤａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のドナーテンプレートは、Ｔ細胞の集団に導入される。ドナーテンプレートは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入などによってＴ細胞に導入され得る。
好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ＡＡＶ形質導入によってＴ細胞に導入される。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ、及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つからの血清型を含み得る。好ましい実施形態において、ＡＡＶ ベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ及びＡＡＶ６由来の血清型を含み得る。
別の好ましい実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、１つ以上のドナー修復テンプレートは、レンチウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。レンチウイルスベクター骨格は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来し得る。
１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼが、細胞に導入される前、それと同時に、またはその後に送達され得る。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼと同時に送達される。他の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、例えば、１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼの約１分〜約３０分、約１分〜約６０分、約１分〜約９０分、約１時間〜約２４時間前、または１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼの２４時間超前が挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上のドナー修復テンプレートの数秒〜数時間〜数日前に１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼの前に送達される。ある特定の実施形態において、１つ以上のドナー修復テンプレートは、ヌクレアーゼの後に、好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、または８時間以内に、より好ましくは、約１、２、３、または４時間以内に、またはより好ましくは、約４時間以内に送達される。
１つ以上のドナー修復テンプレートは、１つ以上の遺伝子操作されたヌクレアーゼと同じ送達系を用いて送達され得る。非限定的な例として、同時に送達されるとき、ドナー修復テンプレート及び遺伝子操作されたヌクレアーゼは、同じベクター、例えば、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６）によってコードされ得る。特に好ましい実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ電気穿孔によって送達され、ドナー修復テンプレートは、ＡＡＶベクターによる形質導入によって送達される。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｔ細胞においてＴＣＲα対立遺伝子を修飾するために使用される場合、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、及びゲノム及びドナー修復テンプレートに編集される部位付近に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする発現カセットが、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターによる形質導入によって送達される。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｔ細胞においてＴＣＲα対立遺伝子を修飾するために使用される場合、ゲノムに編集される部位付近に結合するＣａｓヌクレアーゼ及びｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入され、ドナー修復テンプレートは、ＩＤＬＶレンチウイルスベクターまたはＡＡＶベクターによる形質導入によって送達される。
一実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５及び３’末端を化学的に保護されている化学的に合成したＲＮＡである。
別の実施形態において、Ｃａｓ９は、化学的に合成したｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと複合体形成されたタンパク質として送達される。
種々の実施形態において、免疫エフェクター細胞を編集する方法は、細胞を、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上で共刺激分子を刺激するリガンドと接触させることを含む。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞を編集する方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを伴う培養培地において、可溶性抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に付着させた抗体などの刺激剤及び共刺激剤と細胞に接触させることを含む。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞を編集する方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／もしくはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン及び／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を伴う培養培地において、可溶性抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズまたは他の表面に付着させた抗体などの刺激剤及び共刺激剤と細胞に接触させることを含む。本明細書で使用されるとき、「ＡＫＴ阻害剤」という用語は、ＡＫＴの少なくとも１つの活性を阻害する、核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する薬剤」という用語は、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つの活性、例えば、その基質（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢ及びｅＥＦ２）のうちの少なくとも１つに対するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞を編集する方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／もしくはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン及び／またはＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を伴う培養培地において、可溶性抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズまたは他の表面に付着させた抗体などの刺激剤及び共刺激剤と細胞に接触させることを含む。
本明細書で使用されるとき、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合する及びその少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、３つのクラス、クラス１ ＰＩ３Ｋ、クラス２ ＰＩ３Ｋ、及びクラス３ ＰＩ３Ｋに分類することができる。クラス１ ＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つと調節サブユニットの２つのファミリーの１つとからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤を標的化する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のイソ型に対する選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γまたはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）を提示するであろう。別の態様において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、イソ型選択性を提示せず、「汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤」と見なされるであろう。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＡＴＰとＰＩ３Ｋ触媒ドメインとの結合について競合するであろう。
ある特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、標的ＰＩ３ＫならびにＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路中のさらなるタンパク質を標的化し得る。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋの両方を標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤またはＰＩ３Ｋ阻害剤のいずれかと称され得る。ＰＩ３Ｋのみを標的化するＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と称され得る。一実施形態において、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ及び／またはその経路中の他のタンパク質に対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＰＩ３Ｋに対する５０％阻害性濃度を示す薬剤を指すことが理解され得る。
特定の実施形態において、代表的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋを、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ、またはそれ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で阻害する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋを、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で阻害する。
特定の実施形態で企図されるＴ細胞を製造する方法での使用に好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例示的な例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及びＰＸ−８６６（クラス１ ＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γイソ型、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例示的な例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ−１４５が挙げられるが、これらに限定されない。
汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらなる例示的な例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
一実施形態において、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いないで培養したＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いて培養したＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
一実施形態において、本明細書で企図される製造する方法は、ナイーブまたは発生的に強力なＴ細胞のうちの１つ以上のマーカーを含むＴ細胞の数を増加する。いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤によるＴ細胞を含む細胞の集団の培養が、既存のＴ細胞療法と比較して、発生的に強力なＴ細胞の増殖の増加をもたらし、より強固かつ有効な養子Ｔ細胞免疫療法を提供すると考えられる。
特定の実施形態で企図される方法を用いて製造されたＴ細胞において増加されたナイーブまたは発生的に強力なＴ細胞のマーカーの例示的な例としては、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ナイーブＴ細胞は、発現しない発現しないかまたはマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を実質的に発現しない。
Ｔ細胞に関して、特定の実施形態で企図される種々の増殖方法から得られるＴ細胞集団は、用いられる条件に応じて様々な特定の表現型特性を有し得る。種々の実施形態において、増幅されたＴ細胞集団は、表現型マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ８、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を含む。
一実施形態において、かかる表現型マーカーには、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上、または全ての強化された発現を含む。特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ８＋Ｔリンパ球が、増幅される。
一実施形態において、かかる表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つ以上または全ての強化された発現を含む。特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８を含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられるＣＤ８＋Ｔリンパ球が、増幅される。
特定の実施形態において、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含む中枢メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、グランザイムＢに対して陰性であるＴ細胞は、増強される。いくつかの実施形態において、中枢メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌを含むナイーブＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられ、ＣＤ４５ＲＡ及び／またはＣＤ４５ＲＯの発現に対して陰性であるＣＤ４＋Ｔリンパ球は、増強される。いくつかの実施形態において、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯ陽性を含む中枢メモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現によって特徴付けられる、ＣＤ４＋細胞。いくつかの実施形態において、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ４５ＲＯ陰性である。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、及びＰＩ３Ｋ阻害剤などの刺激剤及び共刺激剤の存在下で細胞を活性化され、刺激することによって編集される。活性化及び刺激から約１、２、３、４、または５日後に、本明細書で企図される１つ以上のヌクレアーゼは、細胞に導入される。特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼが本細胞に導入されてから約１、２、３、４、５、６、７、または８時間後に、本細胞が、ドナー修復テンプレートをコードするベクターで形質導入される。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、編集プロセスにわたって存在し、他の実施形態において、ＰＩ３Ｋは、活性化、刺激、及び増殖中に存在する。一実施形態において、ＰＩ２Ｋ阻害剤は、増殖中のみに存在する。
Ｆ．ポリペプチド
メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、遺伝子操作された抗原受容体、治療ポリペプチド、融合ポリペプチド、及びポリペプチドを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書で企図される。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２、５〜７、及び１１に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチド及び他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換え及び／または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然または非天然の両方の、当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
本明細書で使用される、「単離ペプチド」または「単離ポリペプチド」などは、細胞環境からの、及び本細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロ単離及び／または精製を指す、すなわち、これは、インビボ物質とは著しく関係していない。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドの例示的な例としては、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃｓ、治療ポリペプチド及び融合ポリペプチド及びそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、及び／または挿入において天然ポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、天然であり得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成によって生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドへの１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入を導入することによって遺伝子操作されたヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドには、本明細書で企図される任意の参照配列に対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントが、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の天然に存在するポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。ポリペプチド断片は、天然に存在するまたは組換え技術によって産生されたポリペプチドの１つ以上のアミノ酸のアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失もしくは置換を有する単量体または多量体であり得るポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長さのアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。
ポリペプチド断片の例示的な例には、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、抗体断片、細胞外リガンド結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメインなどが挙げられる。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、及び挿入を含む様々な方法で変更することができる。かかる操作のための方法は、一般に当該技術分野で既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発及びヌクレオチド配列変更は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及びそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造及びハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等の、またはさらに改良された、バリアントポリペプチドを作製するためポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望ましいとき、当業者は、例えば、表１に従って例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させ得る。
アミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得る決定するためのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は、一般に、４つのファミリー：酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく行われ得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
かかる変化を行う際に、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが、考慮され得る。タンパク質上の相互作用的生物学的機能の付与におけるアミノ酸のハイドロパシーインデックスの重要性は、一般に、当該技術分野で理解される（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２、参照により本明細書に組み込まれる）。各アミノ酸に、その疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／システイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
ある特定のアミノ酸が、同様のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、依然として同様の生物学的活性を生じる、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質を得ることが、当該技術分野で既知である。かかる変化を作製する際に、そのハイドロパシー指標が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そのハイドロパシー指標が、±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該技術分野で理解されている。
米国特許第４，５５４，１０１号において詳細に記載されている通り、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸で、同様の親水性の値を有し、なお生物学的に等価である、具体的には、免疫学的に等価であるタンパク質が得られる別のアミノ酸を置換することができることが理解される。かかる変化では、その親水性の値が、±２の範囲内であるアミノ酸の置換が、好ましく、±１の範囲内であるものが、特に好ましく、及び±０．５の範囲内であるものが、なおさらに特に好ましい。
上記に概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的に類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、及びサイズなどに基づき得る。
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化された形態、他の分子との集合的共役体、及び無関係の化学的部分（例えば、ペグ化分子）との共有結合共役体をさらに含む。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸の鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントはまた、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び変異タンパク質も含む。タンパク質の機能的活性に影響を及ぼさない領域の短縮または欠失もバリアントである。
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望である場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で開示されているＩＲＥＳ配列によって分離することができる。
特定の実施形態で企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチド及び融合ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドが、提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、を含む。１つ以上のＤＮＡ結合ドメイン及び１つ以上のヌクレアーゼ、ならびに１つ以上のリンカー及び／または自己切断型ポリペプチドを含む。
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、１つ以上の細胞外ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、または抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、及び任意選択で１つ以上の多量体化ドメインを含む。
特定の実施形態で企図される融合タンパク質の例示的な例では、ポリペプチドは、少なくとも約を有するポリペプチドを含み、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、遺伝子操作された抗原受容体、及び他のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
融合ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン、クロマチンリモデリングドメイン、ヒストン修飾ドメイン、後成的修飾ドメイン、細胞外ドメイン、細胞外リガンド結合ドメイン、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、多量体化ドメイン、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、及びＨＡ）、ポリペプチドリンカー、及びポリペプチド切断シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的に、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限りは、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、及び種間ホモログも含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学結合によって産生することができるか、または一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるヌクレアーゼは、触媒的に不活性なバリアントであり、転写因子のリプレッサードメイン、ヒストンメチラーゼもしくはデメチラーゼドメイン、ヒストンアセチラーゼもしくはデアセチラーゼドメイン、ＳＵＭＯ化ドメイン、ユビキチン化ドメイン、またはＤＮＡメチラーゼドメインが挙げられるが、これらに限定されない、転写を抑制するドメインを含む。
一実施形態において、本明細書で企図されるヌクレアーゼは、触媒的に不活性なバリアントであり、ｍＳｉｎ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＳＩＤ４Ｘ、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＳＵＰＥＲＭＡＮタンパク質からのＳＲＤＸドメインからなる群から選択されるリプレッサードメインを含む。本明細書で使用される、ＳＩＤドメインは、いくつかの転写レプレッサータンパク質中に存在する相互作用ドメインであり、追加のリプレッサードメイン及びコリプレッサーで機能し得る。本明細書で使用される、ＳＩＤ４Ｘは、短ペプチドリンカーによって一緒に４つのＳＩＤドメインリンカーのタンデムリピートである。本明細書で使用される、ＫＲＡＢドメインは、いくつかの亜鉛フィンガータンパク質系転写因子、例えば、ＫＯＸ１のＮ末端に通常見出されるドメインである。
一実施形態において、本明細書で企図されるヌクレアーゼは、触媒的に不活性なバリアントであり、ＫＲＡＢドメインを含む。
種々の実施形態において、転写を抑制するドメインを含む本明細書で企図される触媒的に不活性なヌクレアーゼ変異体は、標的遺伝子の転写的ノックダウンまたはノックアウト発現への遺伝子を標的化するのに有用であり得る。
一実施形態において、融合パートナーは、天然組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質（発現エンハンサー）が発現されるように補助する配列を含む。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解度を増加させるか、またはタンパク質が所望の細胞内区画に標識化することを可能にするか、または細胞膜を通した融合タンパク質の輸送を促進するように選択され得る。
種々の実施形態において、融合ポリペプチドは、１つ以上のＣＰＰを含む。ポリペプチド化合物の投与における重要な要因は、このポリペプチドが、細胞の形質膜、または核などの細胞内区画の膜を横断する能力を有することを保証することである。細胞膜は、小型、非イオン性親油性化合物は自在に透過し、かつ極性化合物、巨大分子、及び治療的または診断的物質に対しては本来の不透過性である、脂質−タンパク質二層からなる。しかしながら、細胞膜を越えてポリペプチドを移行する能力を有する、タンパク質、脂質、及び他の化合物が、説明されている。
タンパク質の細胞への取り込みを促進することができるペプチド配列の例としては、ＨＩＶ ＴＡＴポリペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４〜１０３に相当する２０残基ペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：８４）；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａの６０−アミノ酸長ホメオドメインの第３のヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４）；Ｋａｐｏｓｉ線維芽細胞成長因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域などのシグナルペプチドのｈ領域；及びＨＳＶからのＶＰ２２転座ドメイン（Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３）が挙げられるが、これらに限定されない。その上、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ ｉｏｔａ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ毒素、及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル酸シクラーゼ（ＣＹＡ）を含む、いくつかの細菌毒素を使用して、ペプチドを、細胞の細胞質ゾルへ、内部またはアミノ−末端融合体として送達している。Ａｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４−３３４１、Ｐｅｒｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：５１４７−５１５６、Ｓｔｅｎｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１３：１０２５−１０３２、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：３５３０−３５３４、Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５、Ｓｅｂｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１−３８５７、Ｋｌｉｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０２７７−１０２８１、及びＮｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６−１７１９３。
他の代表的なＣＰＰアミノ酸配列としては、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２３）、ＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２４）、及びＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号２５）（ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質に由来する）、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号２６）、ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ（配列番号２７）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２８）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｐタンパク質から）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＳＫＫ（配列番号２９）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｆｔｚタンパク質から）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＫＲＡＫＩＫＫ（配列番号３０）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅｎｇｒａｉｌｅｄタンパク質から）、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３１）（ヒトＨｏｘ−Ａ５タンパク質から）、及びＲＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号３２）（ヒトＩｓｌ−１タンパク質から）が挙げられるが、これらに限定されない。かかる部分配列は、細胞膜を越えて本明細書で企図される融合ポリペプチドを含む、ポリペプチド転座を促進するために使用することができる。
融合ポリペプチドは、任意選択で、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次及び三次構造に折り畳むのを確保するのに十分な距離により、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子：（１）可撓性延長配座を採用する能力、（２）第１の及び第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できない能力、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒ残基を含む。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含むとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的に、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。
代表的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号３３）、ＤＧＧＧＳ（配列番号３４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号３５）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号３６）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記を参照）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４または５である）（配列番号３７）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６−１１６０（１９９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号３８）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３９）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４０）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４１）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４２）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号４３）が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位及びペプチド自体の両方をモデリングし得るコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。代表的なプロテアーゼ切断部位としては、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、及びエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号４４）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４５）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４６）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。

種々の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドまたは融合ポリペプチドの発現または安定性は、１つ以上のタンパク質不安定化配列またはタンパク質分解配列（デグロン）によって調節される。急速なプロテオソームターンオーバーを強化するためにタンパク質を不安定にするいくつかの戦略が、本明細書で企図される。
タンパク質不安定化配列の例示的な例としては、不安定化ボックス（Ｄボックス）、９つのアミノ酸は、細胞周期内にサイクリングを達成するために急速かつ完全ユビキチン媒介性タンパク質分解を受ける必要がある細胞周期依存性タンパク質中に存在する（例えば、Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｅｍｂｏ Ｊ １７：５６７０−８を参照されたい）、ＫＥＮボックス、Ｃｄｈ１によって標的化されるＡＰＣ認識シグナル（例えば、Ｐｆｌｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４：６５５−６５を参照されたい）、Ｏボックス、元の認識複合体タンパク質１（ＯＲＣ１）中に存在するモチーフであり、Ｆｚｒ／Ｃｄｈ１によって活性化された後期促進複合体（ＡＰＣ）によりＭ期の終わり及びＧ１の大部分を通して分解される（例えば、Ａｒａｋｉ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １９（２０）：２４５８−２４６５を参照されたい）、Ａボックス、オーロラ−Ａに存在するモチーフであり、Ｃｄｈ１による有糸分裂終了中分解される（例えば、Ｌｉｔｔｌｅｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．２００２．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １６：２２７４−２２８５を参照されたい）、ＰＥＳＴドメイン、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びスレオニン（Ｔ）残基に濃縮され、急速なプロテオソーム破壊のためのタンパク質を標的化するモチーフ（Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２１（７）：２６７−２７１）、Ｎ末端ルールモチーフ、Ｎ−デグロンモチーフ、及びユビキチン融合分解（ＵＦＤ）モチーフ、これらはプロテオソーム破壊のために迅速に処理される（例えば、Ｄａｎｔｕｍａ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８：５３８−４を参照されたい）。
特定の実施形態での使用に好適なデグロンのさらなる例示的な例としては、リガンド制御可能なデグロン及び温度制御可能なデグロンが挙げられるが、これらに限定されない。リガンド制御可能なデグロンの非限定的な例としては、Ｓｈｉｅｌｄ １によって安定化されたもの（例えば、Ｂｏｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｖｉｏｌ．７（８）：５３１−５３７を参照されたい）、オーキシンによって不安定なもの（例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（１２）：９１７−９２２を参照されたい）、及びトリメトプリムによって安定化されたもの（例えば、Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１７（９）：９８１−８を参照されたい）が挙げられる。
温度調節可能なデグロンの非限定的な例としては、ＤＨＦＲＴＳデグロンが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｄｏｈｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（５１５１）：１２７３−１２７６）。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドは、Ｄボックス、Ｏボックス、Ａボックス、ＫＥＮモチーフ、ＰＥＳＴモチーフ、サイクリンＡ及びＵＦＤドメイン／基質、リガンド制御可能なデグロン、及び温度制御可能なデグロンからなる群から選択される１つ以上の分解配列を含む。
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のメガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、治療ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖であり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、合成ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００またはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することは容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
ポリヌクレオチドの例示的な例としては、配列番号２、５〜７、及び１１をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、８〜１０、及び１２〜２２に記載する。
種々の例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドとしては、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに発現ベクター、ウイルスベクター、及び移入プラスミドを含むポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列でハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドで実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加または欠失され、または修飾される、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、及び置換を含む、ある特定の変更が、参照ポリヌクレオチドに行われ得、それによって、変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野で十分に理解される。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％と同一するヌクレオチド配列がハイブリダイズのままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特異的な配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、及び核酸濃度下で）である。標的配列が、一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が、平衡状態で占有されている。
本明細書で使用される、「配列同一性」または、例えば、「配列５０％同一性」という記述は、比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。故に、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性の割合を得ることができる。典型的に、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれる。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５〜１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定及び比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドを比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査及び選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のユニット１９．３に見出すことができる。
本明細書で使用される、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、天然で存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語としては、５’（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチド末端）及び３’（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチド末端）が挙げられる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の方向または３’から５’の方向で注記され得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、３’から５’の方向で書かれた５’から３’の配列または５’から３’の方向で書かれた３’から５’の配列を指す。
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補的鎖は、３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、左に５’末端及び右に３’末端を有する逆相補鎖、５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
本明細書で使用される、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後ポリペプチドを発現することができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現対照配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、及び目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画にトランスロケーションされ得るような位置及び配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合させたその３’及び５’末端を有し、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットを除去し、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図される、阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリペプチドまたは融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
さらに、本明細書で企図されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードすることができる多くのヌクレオチド配列があることは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなる天然遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／または置換などの１つ以上の変異の結果として変更される内在性ポリヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、治療ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするドナー修復テンプレートを含む。
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたは別の阻害性ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ」または「短干渉ＲＮＡ」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１、及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、免疫抑制シグナル伝達経路の構成要素をコードするｍＲＮＡを標的化する。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１の鎖及び第２の鎖を含むが、第１及び第２の鎖は、第１及び第２の鎖上の２つの末端ヌクレオシドが相補鎖上の残基と対合しないように相殺される。場合によっては、対合されない２つのヌクレオシドは、チミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはその断片が標的遺伝子の下方調節を媒介することができるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含み、ヌクレオチドに関して十分な長さのものであるべきである。故に、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的である領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的との間に完全な相補性が存在する必要はないが、その対応は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が、標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などにより配列特異的サイレンシングを指向することができるのに十分でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性は所望されることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して、１つ以上だが、好ましくは１０、８、６、５、４、３、２またはそれ以下のミスマッチを含む。ミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合、好ましくは、末端領域、または例えば、５’及び／もしくは３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内の領域にある。センス鎖は、分子の全体的な２本鎖の特徴を維持するために、アンチセンス鎖と十分に相補的である必要があるのみである。ｓｉＲＮＡの各鎖は、長さが３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド以下であり得る。鎖は、好ましくは、長さが少なくとも１９ヌクレオチドである。例えば、各鎖は、長さが２１〜２５ヌクレオチドであり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の２本鎖領域、及び２〜３ヌクレオチドの１つ以上のオーバーハング、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１または２つの３’オーバーハングを有する。
本明細書で使用されるとき、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、２０〜２２ヌクレオチド、典型的に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られている約７０ヌクレオチドホールドバックＲＮＡ前駆体構造から切り取られた、小さい非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度に応じて、２つの方法のうちの１つでそれらの標的を負に調節する。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡは、免疫抑制シグナル伝達経路の構成要素をコードするｍＲＮＡを標的化する。第１に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完全なまたはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘発する。それらのｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全な相補的部位に結合することによってそれらの調節作用を発揮するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものに類似する、またはそれとおそらく同一であるＲＩＳＣ複合体を通して、見かけ上は翻訳のレベルで、翻訳後に標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一致して、この機序を使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを減少させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限にしか影響されない。ｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡ、ならびに任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的化し得る人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態において、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現される短ヘアピンＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、Ｄｒｏｓｈａプロセシング部位をヘアピン構築物に付加し、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示されている（Ｐｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ヘアピンステムは、２２−ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に完全な相補性を有する）及びヒトｍｉＲからの１５〜１９−ｎｔのループからなる。ヘアピンの片側または両側のｍｉＲループ及びｍｉＲ３０フランキング配列の付加は、マイクロＲＮＡなしの従来のｓｈＲＮＡ設計と比較したときに、発現されたヘアピンのＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセシングの１０倍超の増加をもたらす。Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒプロセシングの増加は、発現されたヘアピンに対してより多くのｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生及びより多くの潜在性に翻訳する。
本明細書で使用されるとき、「ｓｈＲＮＡ」または「短ヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的なＲＮＡ鎖によって形成される２本鎖構造を指す。好ましい実施形態において、ｓｈＲＮＡは、免疫抑制シグナル伝達経路の構成要素をコードするｍＲＮＡを標的化する。標的遺伝子のコードまたは非コード配列の一部と同一であるヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ構築物は、阻害のためには好ましい。標的配列と比較して挿入、欠失、及び単一点変異を有するＲＮＡ配列はまた、阻害に有効であることが見出されている。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の部分の間での９０％超の配列同一性、またはさらに１００％の配列同一性が、好ましい。ある特定の好ましい実施形態において、ｓｈＲＮＡの２本鎖を形成する部分の長さは、例えば、Ｄｉｃｅｒ依存性切断によって産生されるＲＮＡ産物に対してサイズが相当する、少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、長さが少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、長さが４００〜８００塩基である。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列及びループサイズの変化に対して極めて耐性がある。
本明細書で使用されるとき、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的な切断が可能な触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。好ましい実施形態において、リボザイムは、免疫抑制シグナル伝達経路の構成要素をコードするｍＲＮＡを標的化する。いくつかのサブタイプは、例えば、ハンマーヘッド及びヘアピンリボザイムに説明されている。リボザイムの触媒活性及び安定性は、非触媒塩基でリボヌクレオチドに対してデオキシリボヌクレオチドを代用することによって改良され得る。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、特定のｍＲＮＡを破壊するために使用することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が、好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域によって指向される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが、２つの塩基：５’−ＵＧ−３’の配列を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築及び産生は、当該技術分野で公知である。
一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構造的なｐｏｌ ＩＩＩ、例えば、ヒトまたはマウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構造的なｐｏｌ ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
コード配列それ自体の長さに関わらず、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるまたは当該技術分野で既知であるように、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされ得、それにより、それらの全体的な長さが、大幅に変動し得る。したがって、ほとんどのいかなる長さのポリヌクレオチド断片も採用することができ、合計の長さは、好ましくは調製の容易さ及び意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用によって制限されることが特定の実施形態で企図される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、入手可能な様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、発現、及び／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、及び置き換え可能な要素、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの追加の例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、及び宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、前記ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、アルファ、ベータ、またはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母からのＤＮＡ複製の起源または「ｏｒｉ」をコードする配列を保有するように操作される。典型的に、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。アルファヘルペスウイルスは、比較的短い再生サイクル、可変宿主範囲、感染細胞の効果的な破壊を有し、主に、知覚神経節における潜伏感染を成立させる。アルファヘルペスウイルスの例示的な例は、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、及びＶＺＶを含む。ベータヘルペスウイルスは、長い再生サイクル及び制限された宿主範囲を有する。感染細胞は、拡大される場合がある。血液の白血球、腎臓、分泌腺、及び他の組織において潜伏性が維持され得る。ベータヘルペスウイルスの例示的な例は、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６、及びＨＨＶ−７を含む。ガンマヘルペスウイルスは、ＴまたはＢリンパ球に特異的であり、しばしば、リンパ系組織において潜伏性を示す。ガンマヘルペスウイルスの例示的な例は、ＥＢＶ及びＨＨＶ−８を含む。
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度及び特異性が異なり得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写及び翻訳要素を使用することができる。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクター及びウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない、ベクターであり、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの外因性、内在性、または異種制御配列を含む。「内在性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作された細胞とは異なる種からの外因性配列である。
「合成」制御配列は、もう１つの内在性及び／または外因性配列、ならびに／またはインビトロもしくはシリコン内で特定の遺伝子療法のための最適なプロモーター及び／またはエンハンサー活性を提供することが決定された配列の要素を含んでもよい。本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域を含み、及び／または転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであってよい。
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能及びエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、及び／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が指向される機能的連結を指す。
本明細書で使用されるとき、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞及び組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、制限された様々な細胞及び組織型をそれぞれ可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
特定の実施形態での使用に好適な例示的な遍在発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、短伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ （ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、または組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させるために）細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
本明細書で使用される、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大または減少を引き起こす処理または条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
条件発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的に、２つの）部位（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、または変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、それらの断片、及びバリアントを含む。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチドは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みのために必要な任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対コア配列と隣接した２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ、Ｂ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の代表的なｌｏｘＰ部位としては、 ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
ＦＬＰリコンビナーゼのために好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識される。φＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）の間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢ及びａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノム及びファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。産物の部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。故に、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置付け、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接した修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位によって隣接する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
本明細書で使用される、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）及びウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、及びインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤ及びＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販の脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２−９）、及びＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、及びＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、及びＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）及びＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳである。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号６９）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、及びＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
異種核酸転写物の効率的な終止及びポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ｐｏｌｙＡ部位」または「ｐｏｌｙＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止及びポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡ尾部からコード配列の３’末端の付加によってｍＲＮＡの安定性を促進し、及び故に、転写効率の増加に寄与し得る。組換え転写物の効率的なポリアデニル化は、ポリＡ尾部を欠いている転写物が不安定であり、急速に分解されるため、望ましい。ベクターに使用され得るポリＡシグナルの例示的な例には、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知である別の好適な異種または内在性ポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたは細胞は、直接毒性及び／または制御されていない増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量化の特定の活性化された化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、インビボでネガティブ選択の影響を受けやすい本明細書で企図される遺伝子改変細胞を生じる遺伝子セグメントを含む。「ネガティブ選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として除去され得る注入された細胞を指す。陰性の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は、当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ）遺伝子；細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌シトシンデアミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、インビトロでネガティブ選択可能な表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。ポジティブ選択可能なマーカーは、宿主細胞へ導入されたとき、その遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であってもよい。この型の遺伝子は当技術分野で既知であり、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与える、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、ポジティブ選択可能なマーカー及びネガティブ選択可能な要素は、ネガティブ選択可能な要素の消失がまた必ず、ポジティブ選択可能なマーカーの消失を伴うように連結される。特定の実施形態において、ポジティブ及びネガティブ選択可能なマーカーは、一方の消失が、義務的に、他方の消失をもたらすように、融合される。発現産物として、上述の所望のポジティブ選択特徴及びネガティブ選択特徴の両方を与えるポリペプチドを生じる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ・チミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、及びインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを生じる。優性ポジティブ選択可能なマーカーをネガティブ選択可能なマーカーと融合することに由来する二機能性選択可能な融合遺伝子の使用について記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
好ましいポジティブ選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態で企図される代表的な二機能性選択可能な融合遺伝子としては、ポジティブ選択可能なマーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、ネガティブ選択可能なマーカーが、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択可能なマーカーに由来する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、１つ以上のメガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、治療ポリペプチド、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルス方法及びウイルス方法の両方によって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入することができる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってまたは異なる方法によって、及び／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、遺伝子銃、及び熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される特定の実施形態での使用に好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、及びＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態で企図される。
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的に、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。代替として、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞にエクスビボで、または万能ドナー造血幹細胞に送達し、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
一実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼ及び／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。代替として、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、及び電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常用いられる任意の経路による。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に周知であり、１つを超える経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもさらに即時的かつさらに有効な反応を提供し得る場合が多い。
本明細書で企図される特定の実施形態での使用に好適なウイルスベクター系の例示的な例としては、遺伝子移入のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
種々の実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソームである。非エンベロープウイルス。ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的に、最低限で、導入遺伝子及びその調節配列、ならびに５’及び３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離される、ＩＴＲ及びカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は、異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列及びＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、及びＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちの任意の１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列及びＡＡＶ６に由来するカプシド配列を含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された及び選択方法を、ＡＡＶカプシドに適用して、それらを目的となる細胞を伝達する
ｒＡＡＶベクターの構築、産生、及びその精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号及び、同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合するＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態での使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が、好ましい。
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で論じられるように、１つ以上のＬＴＲ、及びアクセサリー要素：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、輸出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意選択で、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体要素、選択可能なマーカー、及び細胞自殺遺伝子を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組込みまたは非組込みまたは組込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用されるとき、「組込み欠損レンチウイルス」または「という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組込み−インコンピテントウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
インテグラーゼ活性を低減させるために好適なＨＩＶ−１ ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、及びＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域を含有する、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。
本明細書で使用されるとき、「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン区域及び中央終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。
本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
「輸送要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照されたい）、及びＢ型肝炎ウイルス転写後調節転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、及び任意選択で、転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増大する。様々な転写後調節要素は、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３８６４）；及び同様のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）タンパク質における異種核酸の発現が増大し得る。
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの改変の結果としていくつかの安全性の増強を含有する。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、１回目のウイルス複製を越えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として公知の右側の（３’）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が改変された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の増強は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆動させるために、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例は、例えば、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター。
本明細書で使用される、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化されるため、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になる。
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
本明細書で企図されるある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／またはレンチウイルス配列の多くの異なる源を用いることができるか、またはある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた及び多数の置換及び変更を、移入ベクターの本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させることができることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが、当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを生成するために適合され得る。
種々の実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要しない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、及び／またはＥ３遺伝子を置き換えるように遺伝子操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増幅する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、及び筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの作製及び増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と呼ばれる特有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから可欠であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３または両方の領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２）及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注入（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、及び脳内への定位接種（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
種々の実施形態において、遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはドナー修復テンプレートは、細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために１つ以上の最初期、早期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子においてされ得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏期に入る能力、及び最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容することができるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、及び同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、同第ＷＯ９６／０４３９４号、同第ＷＯ９８／１５６３７号、及び同第ＷＯ９９／０６５８３号において記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｈ．組成物及び製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び免疫エフェクター細胞組成物を含み得る。組成物としては、薬学的組成物が挙げられるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。必要に応じて、組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与することができることも理解されよう。組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加の薬剤が、組成物の意図された療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に釣り合った他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒト及び動物の組織との接触での使用に好適である、これらに組成物、材料、組成物、及び／または剤形を指すように本明細書で使用される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」としては、ヒトまたは家畜用に許容されるものとして米国食品医薬品局によって認可されている、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；コーンスターチ及びポテトスターチなどのスターチ；セルロース、及びその誘導体、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなど；トラガカント；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物及び植物性脂肪、パラフィン、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；油、などのピーナツ油、綿実油、サンフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張性生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；及び薬学的製剤に用いられる任意の他の相溶性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書で企図される方法によって製造されるある量のゲノム編集されたＴ細胞を含む。好ましい実施形態において、薬学的Ｔ細胞組成物は、１つ以上の修飾及び／または機能不全ＴＣＲα対立遺伝子を含み、１つ以上の免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、または他の治療ポリペプチドを発現するゲノム編集されたＴ細胞を含む。
一般に、特定の実施形態で企図される方法によって製造されたＴ細胞を含む薬学的組成物が、これらの範囲内の全ての整数値を含む、約１０２〜約１０１０個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０９個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０８個の細胞／ｋｇ体重、約１０５〜約１０７個の細胞／ｋｇ体重、約１０７〜約１０９個の細胞／ｋｇ体重、または約１０７〜約１０８個の細胞／ｋｇ体重の投与量で投与され得る。細胞の数は、組成物の最終的な用途に依存するであろうし、それに含まれる細胞の型も同様であろう。本明細書に提供される使用については、細胞は、一般に、１リットル以下の体積であり、５００ｍＬ以下、さらに２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。したがって、所望の細胞の密度は、典型的に、約１０６個の細胞／ｍＬより大きく、一般には、約１０７個の細胞／ｍＬより大きく、一般に、約１０８個の細胞／ｍＬまたはそれ以上である。臨床的に関連する数の免疫細胞を、複数回に分わけて注入することができ、これを累積すると、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個の細胞に等しいか、あるいはそれを上回る。
いくつかの実施形態において、特に、注入された細胞の全てが、特定の標的抗原に対して再度向けられるであろうとの理由から、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲のより少数の細胞が投与され得る。遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、またはＤａｒｉｃを発現するために修飾されたＴ細胞は、これらの範囲の投与量で複数回投与され得る。細胞は、療法を行う患者に対して同種異系、同系、異種、または自己由来のものであってよい。必要に応じて、治療はまた、注入されたＴ細胞の生着及び機能を増強するために、本明細書に記載のマイトジェン（例えば、ＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、及び／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）を投与することも含んでよい。
一般に、本明細書に記載される、活性化し、増大させた細胞を含む組成物を、免疫障害を持つ個体において生じる疾患の治療及び予防において利用することができる。特に、本明細書で企図される方法によって製造された修飾Ｔ細胞を含む組成物は、がんの治療において使用される。特定の実施形態で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、単独で、あるいは、担体、希釈剤、賦形剤、及び／またはＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／もしくはＩＬ−１５または他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成要素と組み合わせた薬学的組成物として投与することができる。特定の実施形態において、本明細書で企図される薬学的組成物は、１つ以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、ある量のゲノム編集されたＴ細胞を含む。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含む薬学的組成物は、をさらに含み得る。中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；グリシンなどのポリペプチドまたはアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート化剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤をさらに含んでよい。特定の実施形態で企図される組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与用に製剤化することが好ましい。
液体の薬学的組成物は、溶液か、懸濁物か、または他の同様の形態であるかにかかわらず、以下のうちの１つ以上を含んでよい：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理的食塩水、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、及び、張度を調整するための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースなど。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られる、アンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルに封入することができる。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは滅菌である。
一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与のために好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
無血清培地は、簡易化及びより良好な定義された組成物、低減された度合いの汚染物質、感染剤の潜在源の除外、及びより低い費用を含む、血清含有培地にわたっていくらかの利点を有する。種々の実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択で、タンパク質を含み得ない。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換え、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
特定の組成物中に使用された無血清培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＸ−ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液中に製剤化される。
別の好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液中に製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後に、高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中に使用された凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を５０：５０で含む溶液中で製剤化される。
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、単独でまたは１つ以上の治療剤と組み合わせて、有効量の増幅されたゲノム編集されたＴ細胞組成物を含む。故に、Ｔ細胞組成物は、単独でまたは放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学的療法などの他の既知のがん治療と組み合わせて投与され得る。組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与され得る。かかる治療剤は特定のがんなどの本明細書に記載の特定の疾患状態に対する標準的な治療として当該技術分野で許容され得る。特定の実施形態で企図される例示的な治療剤には、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症剤、化学療法剤、放射線療法剤、または他の活性作用物質及び補助的作用物質が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるＴ細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併用で投与することができる。化学療法剤の例示的な例には、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）及びトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む、エチレンイミン及びメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸誘導体、例えば、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）；ＯＮＴＡＫ（商標）（デノロイキンディフティトックス）；エスペラマイシン；カペシタビン；上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン；ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または、誘導体が含まれる。この定義には、抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドなどの抗アンドロゲン剤、及びゴセレリン、ならびに上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸、または、誘導体が含まれる。
様々な他の治療剤は、本明細書で企図される組成物と併用で投与することができる。一実施形態において、Ｔ細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬物としては、ステロイド及びグルココルチコイド（ベータメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬剤、シクロホスファミド、及びミコフェノーレートを含む非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されない。
他の代表的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）及びＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤、及びシアリレートからなる群から選択される。代表的な鎮痛剤は、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポキシフェンのトラマドールからなる群から選択される。代表的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。代表的な生物学的反応修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対する分子、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、及び接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的反応修飾物質としては、モノクローナル抗体ならびに組換え型の分子が挙げられる。代表的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、Ｇｏｌｄ（経口用（オーラノフィン）及び筋肉内）及びミノサイクリンが挙げられる。
特定の実施形態で企図されるゲノム編集されたＴ細胞と組み合わせるのに好適な治療抗体の例示的な例としては、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュシジツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、ティガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、及び３Ｅ８が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、サイトカインと併用で投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」とは、１つの細胞集団により放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質に対する一般的な用語を意味する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファ及び腫瘍壊死因子−ベータ；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの形質転換増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉ及びインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導性因子；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、及びインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書に開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養される本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含み、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現し、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。一実施形態において、組成物は、Ｔ細胞の特定のサブ集団を含み、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現し、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離される。種々の実施形態において、組成物は、発現しないか、またはマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を実質的に発現しない。
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いないで活性化し、増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いないで活性化し、増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤を用いないで活性化し、増大させたＴ細胞の集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。
Ｉ．標的細胞
実施形態において、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞が標的細胞、例えば、腫瘍またはがん細胞へと再指向され、該細胞上の標的抗原に結合する結合ドメインを有する遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、またはＤａｒｉｃを含むことが企図される。かかるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、１つ以上の免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、または他の治療ポリペプチドをさらに含むＴ細胞を含む。
一実施形態において、標的細胞は、抗原、例えば、他の正常な（所望の）細胞の表面上に実質的に見出されない標的抗原を発現する。
一実施形態において、標的細胞は、骨細胞（ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、星状細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、胃腸細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、鼻咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、膵臓実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、精巣細胞、造血細胞、リンパ系細胞、または骨髄性細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、固形がん細胞である。
特定の実施形態で企図される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、固形がん：副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫（ｆｉｂｒｏｕｓ ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽細胞腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線管癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、標的細胞は、液体がんまたは血液がん細胞である。
血液癌の例示的な例としては、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、白血病：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、及び真性赤血球増加症が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、リンパ腫：ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫のものが挙げられるが、これらに限定されず、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫：バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫；及びＴ細胞非ホジキンリンパ腫：菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態で企図される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例示的な例としては、多発性骨髄腫：顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫のうちのものが挙げられるが、これらに限定されない。
別の特定の実施形態において、標的細胞は、がんに罹患している患者における細胞などのがん細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、細胞、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、及びＥＢＶが挙げられるが、これらに限定されないウイルスによって感染されたがん細胞である。
一実施形態において、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１のエピトープである。
Ｊ．治療方法
本明細書で企図される組成物及び方法によって製造されたゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、がん、感染疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全が挙げられるが、これらに限定されない、種々の条件の治療での使用のために改良された養子細胞療法を提供する。特定の実施形態において、一次Ｔ細胞の特異性は、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、またはＤａｒｉｃで一次Ｔ細胞を遺伝的に改変することによって腫瘍またはがん細胞に再指向される。一実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ゲノム編集されたＴ細胞は、インビボで複製することができ、故に、持続したがん療法をもたらすことができる長期持続性がもたらされる。さらに、特定の実施形態で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、機能的に内在性ＴＣＲ発現を実質的に欠いており、それによって潜在的な移植片拒絶を低減させるため、安全かつより効果的な養子細胞療法を提供し、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の耐久性及び持続性を増大する、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体のうちの１つ以上を含む１つ以上を含む。
一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、インビボでＴ細胞増殖を強固にし得、延長した時間持続し得る。別の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、任意の追加の腫瘍形成または成長を阻害するために再活性化され得る特定のメモリーＴ細胞に進化する。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中線管癌、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、膵臓、膀胱、及び肺が挙げられるが、これらに限定されない、様々ながんの治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、液体がんまたは血液癌の治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療で使用される。
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽細胞性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない、液体がんの治療で使用される。
特定の実施形態において、有効上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞またはそれを含む組成物を、単独でまたは１つ以上の治療剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含む方法が、提供される。ある特定の実施形態において、本細胞は、がんを発症するリスクがある患者の治療に使用される。故に、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、少なくとも１つの症状の治療または予防または改善を含む。
一実施形態において、治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、有効量、例えば、治療上有効量の、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物を投与することを含む。投与の量及び頻度は、適切な投与量が臨床試験によって決定され得るが、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度のような因子によって決定されよう。
一実施形態において、対象に投与される組成物において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞である。
特定の実施形態において、約１×１０７個のＴ細胞〜約１×１０９個のＴ細胞、約２×１０７個のＴ細胞〜約０．９×１０９個のＴ細胞、約３×１０７個のＴ細胞〜約０．８×１０９個のＴ細胞、約４×１０７個のＴ細胞〜約０．７×１０９個のＴ細胞、約５×１０７個のＴ細胞〜約０．６×１０９個のＴ細胞、または約５×１０７個のＴ細胞〜約０．５×１０９個のＴ細胞は、対象に投与される。
一実施形態において、対象に投与される組成物において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ体重である。
特定の実施形態において、約１×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約１×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約２×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．９×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約３×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．８×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約４×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．７×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．６×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、または約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．５×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重は、対象に投与される。
当業者は、特定の実施形態で企図される組成物の複数回投与が所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間、またはそれ以上の間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回またはそれ以上投与され得る。
ある特定の実施形態において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを実施し）、その血液からＴ細胞を活性化し、患者にこれらの活性化し、増大させたＴ細胞を再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃもしくはそれ以上採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコルを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するのに役立ち得る。
特定の実施形態で企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の都合のよい様式で行うことができる。好ましい実施形態において、組成物は、非経口に投与される。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口に投与される」という語句は、経腸及び局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内への注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、対象に、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって投与する。
一実施形態において、それを必要とする対象に、対象におけるがんに対する細胞性免疫応答を増加させるために、有効量の組成物を投与する。免疫応答は、感染細胞を死滅させることが可能な細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、及びヘルパーＴ細胞応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化し、したがって、抗体産生を導くことが可能なヘルパーＴ細胞によって主に媒介される体液性免疫応答も誘導することができる。組成物によって誘導される免疫応答の型を分析するために様々な技法を使用することができ、それらは当該技術分野で十分に記載されている、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ。
一実施形態において、がんと診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、前記免疫エフェクター細胞のゲノムを編集することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を生成することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態で企図される細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボでゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると、成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆体の再導入をもたらすために有効な任意の方法を含む。１つの方法は、エクスビボにおいて末梢血Ｔ細胞をゲノム編集し、形質導入された細胞を対象に戻すことを含む。
本明細書において引用される刊行物、特許出願、及び発行特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行された特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解及び実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化及び改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に同様の結果を得るために変化または改変され得る種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
実施例１
Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子座への蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む導入遺伝子カセットを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号８及び９）が、設計され、構築された。ＡＡＶ ＩＴＲ要素の完全性は、ＸｍａＩ消化で確認された。導入遺伝子カセットを、相同組換え（ＡＡＶを標的としたベクター）による標的化を可能にするＴＣＲα遺伝子の定常領域のエクソン１内の２つの相同領域の間に配置した。５’及び３’相同領域は、それぞれ、約１５００ｂｐ及び約１０００ｂｐ長であり、いずれの相同領域も、完全ｍｅｇａＴＡＬ標的部位（配列番号１０）を含有しなかった代表的な発現カセットは、短い伸長因子１アルファ（ｓＥＦ１α）または骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠失した陰性対照領域、蛍光ポリペプチド、例えば、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含有する。図１Ａ。発現カセットもまた、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルも含有する。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、必要な複製、カプシド、及びアデノウイルスヘルパー要素を提供する１つ以上のプラスミドでＨＥＫ ２９３Ｔ細胞を一時的に共トランスフェクトすることによって調製した。ｒＡＡＶを、イオジキサノール系勾配における超遠心分離を使用して共トランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞培養から精製した。
ｍｅｇａＴＡＬで誘発された相同組換えは、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化され、ＩＬ−２を補充した完全培地中で培養された初代ヒトＴ細胞において評価された。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、ＴＣＲα標的化ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１１）をコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡで電気穿孔し、その後、ｓＥＦ１アルファ−ＢＦＰまたはＭＮＤ−ＧＦＰ導入遺伝子カセットのいずれかをコードする精製された組換えＡＡＶを形質導入した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するＴ細胞を含んだ。フローサイトメトリーは、蛍光タンパク質を発現するＴ細胞の頻度を測定し、非統合ｒＡＡＶを標的としたベクターから蛍光タンパク質の一時的発現を分化するために複数の時点で使用された。ＴＣＲα遺伝子のｍｅｇａＴＡＬ媒介性破壊を、ＣＤ３染色の喪失によって検出した。図１Ｂ。
長期導入遺伝子発現は、ｍｅｇａＴＡＬ及びｒＡＡＶを標的としたベクターの両方で処理されたＴ細胞の２０〜６０％で観察された。相同組換えは、定量的ＰＣＲ及びサザンブロット分析で確認された。対照試料中で、ｒＡＡＶ処理単独は、可変レベルの一時的蛍光タンパク質発現（より高い一時的発現が、ＭＮＤ−ＧＦＰ導入遺伝子で観察された）、ゲノムへの統合の欠如と一致する、処理されたＴ細胞中の非常に低いレベル（＜１％）の長期蛍光タンパク質発現を生成した。ＴＣＲα遺伝子座のＭｅｇａＴＡＬの破壊は、５０％〜９０％の範囲であった（ＣＤ３表面発現の喪失）。ＭｅｇａＴＡＬ活性は、ｍｅｇａＴＡＬ及びｍｅｇａＴＡＬ＋ｒＡＡＶを標的としたベクターで処理されたＴ細胞の間で同様であり、ＨＲ媒介性導入遺伝子カセット挿入が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって駆動された挿入／欠失事象に置き換えられたことを示した。ＣＤ３陰性コンパートメント内のＧＦＰ＋細胞の濃縮は、ＨＲが機能的及び機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に生じることを強く示唆した。結果は、いくつかの独立したドナーから単離されたＴ細胞で行われた実験において確認された。図１Ｄ。
実施例２
ＴＣＲα遺伝子座へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１２）が、設計され、構築され、検証された。図２Ａ。ＣＡＲ発現カセットは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、ＣＤ１９抗原を標的とした一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８α由来のヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含有した。より大きなＣＡＲ導入遺伝子で効率的なｒＡＡＶ産生を可能にするために、５’及び３’相同領域をそれぞれ、約６５０ｂｐ減少させた。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。ＴＣＲα遺伝子座へのＣＡＲ導入遺伝子のＭｅｇａＴＡＬによって誘導されたＨＲを、ＴＣＲαを標的としたｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡで電気穿孔された活性化された初代ヒトＴ細胞を用いて評価した。電気穿孔されたＴ細胞を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶで形質導入し、ＩＬ２の存在下で３７℃で培養した。ＣＡＲ染色を、電気穿孔から７日後に行った（合計１０日の培養）。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶ処理のみを含有するＴ細胞、及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットを含むレンチウイルス（ＬＶ）ベクターで形質導入されたＴ細胞を含んだ。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによってフローサイトメトリーによって分析した。
ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡ及びｒＡＡＶ−ＣＡＲで処理されたＴ細胞は、全細胞の３０〜６０％の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現を示した。同様の割合のＴ細胞増殖及び同様のＴ細胞表現型を、処理されない、ＬＶで処理された（ＬＶ−Ｔ）、ｍｅｇａＴＡＬで処理された、ｍｅｇａＴＡＬ／ｒＡＡＶ ＣＡＲで処理されたＴ細胞の間で観察された。図２Ｂ。
機能分析を、ＣＤ１９腫瘍抗原を安定して発現するＫ５６２赤白血病細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９＋）を用いて行った。Ｔ細胞細胞傷害性及びサイトカイン産生を、Ｋ５６２−ＣＤ１９＋細胞を１：１の比で混合したＴＣＲα遺伝子座に統合された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞（ＨＲ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞）中で分析した（図２Ｃ）。同様の細胞傷害性率が、高いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の比で観察され、ＨＲ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、より低いＥ：Ｔの比でＬＶ処理細胞と比較して、わずかに低下した細胞傷害性を示した。逆に、ＩＦＮγ産生は、ＬＶ処理細胞と比較して、ＨＲ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞培養においてより高かった。
実施例３
ＴＣＲα遺伝子座へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１２）が、設計され、構築され、検証された。ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターもまた、設計され、構築され、検証された。図３Ａ。
ＣＡＲ発現カセットは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、ＣＤ１９抗原を標的とした一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ８α由来のヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含有した。より大きなＣＡＲ導入遺伝子で効率的なｒＡＡＶ産生を可能にするために、５’及び３’相同領域をそれぞれ、約６５０ｂｐ減少させた。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。ＴＣＲα遺伝子座へのＣＡＲ導入遺伝子のＭｅｇａＴＡＬによって誘導されたＨＲを、ＴＣＲαを標的としたｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロで転写されたｍＲＮＡで電気穿孔された活性化された初代ヒトＴ細胞を用いて評価した。電気穿孔されたＴ細胞を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶで形質導入し、ＩＬ２の存在下で３７℃で培養した。ＣＡＲ染色を、電気穿孔から７日後に行った（合計１０日の培養）。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶ処理のみを含有するＴ細胞、及び抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットを含むレンチウイルス（ＬＶ）ベクターで形質導入されたＴ細胞を含んだ。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによってフローサイトメトリーによって分析した。
図３Ｂは、ＣＡＲがＴＣＲα定常領域のエクソン１へのＨＲによってまたはＬＶＶによって導入されたＴ細胞中のＣＤ１９発現を示す。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡの発現も、示される。
機能分析を、ＣＤ１９腫瘍抗原を安定して発現するＫ５６２赤白血病細胞株（Ｋ５６２−ＣＤ１９＋）を用いて行った。Ｔ細胞細胞傷害性及びサイトカイン産生を、Ｋ５６２−ＣＤ１９＋細胞を１：１の比で混合したＴＣＲα遺伝子座（ＨＲ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞）に統合された抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞中で分析した。同様の細胞傷害性率が、ＨＲ−ＣＡＲ＋及びＬＶ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞試料の両方で観察された（図３Ｃ）。サイトカイン産生もまた、Ｋ５６−ＣＤ１９＋標的細胞で共培養した後、ＨＲ−ＣＡＲ＋及びＬＶ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞の両方で同様であった（図３Ｄ）。Ｔ細胞は、標的細胞で共培養後、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、及びＣＴＬＡ４などの疲弊マーカーの発現について表現型を決定した。ＨＲ−ＣＡＲ＋及びＬＶ−ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、Ｋ５６２−ＣＤ１９＋標的細胞で共培養後に、同様の発現疲弊マーカープロファイルを示した。図３Ｅ。
実施例４
ＴＣＲα遺伝子座の両方の対立遺伝子への固有のプロモーター導入遺伝子カセットの多重相同組換え
プロモーター、蛍光レポーター導入遺伝子及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号８及び９）が、設計され、構築され、検証された。図４Ａ。２つの異なるｒＡＡＶベクターバッチを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一時的に共トランスフェクトすることによって調製した。第１のｒＡＡＶベクターは、ＢＦＰ及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたＥＦ１αプロモーターを含有し、第２のベクターは、ＧＦＰ及びＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含有した。両方のベクターは、同じ長さのＴＣＲα相同アームを有し、実施例１に記載されるように、イオジキサノール勾配を用いて精製した。ｒＡＡＶ−ｓＥＦ１α−ＢＦＰベクターは、相同組換えの不在下で最小のＢＦＰ発現を産生した。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、活性化し、ＴＣＲαを標的としたｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した。電気穿孔したＴ細胞を、ｒＡＡＶ−ＭＮＤ−ＧＦＰを標的としたベクターまたはｒＡＡＶ−ｓＥＦ１α−ＢＦＰを標的としたベクターのいずれかで形質導入した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するＴ細胞を含んだ。
相同組換えを、一時的発現対長期導入遺伝子発現を分化するために形質導入後の種々の時点でフローサイトメトリーによって分析した。ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するＴ細胞は、ｍｅｇａＴＡＬ及びｒＡＡＶを標的としたベクターの両方で処理された試料と比較して、非常に低いレベル（＜１．５％）の長期発現を示した。明確に定義された集団（２０〜３０％のＢＦＰ＋またはＧＦＰ＋）は、ｍｅｇａＴＡＬ及びｒＡＡＶ−ｓＥＦ１α−ＢＦＰまたはｒＡＡＶ−ＭＮＤ−ＧＦＰのいずれかを標的としたベクター（ＨＲ＋細胞）で処理された試料中で観察された。ＨＲ＋細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子の一方または両方でＨＲを行った細胞を含む。図４Ｂ。
ｍｅｇａＴＡＬならびにｒＡＡＶ−ｓＥＦ１α−ＢＦＰ及びｒＡＡＶ−ＭＮＤ−ＧＦＰを標的としたベクターで処理されたＴ細胞は、いくつかの個々の細胞集団：ＧＦＰ＋陽性細胞；ＢＦＰ＋細胞；ＧＦＰ＋／ＢＦＰ＋細胞（ＤＰ）；及びどちらのレポーターも発現しない細胞（ＤＮ）を生成した。ＧＦＰ＋及びＢＦＰ＋細胞集団は、ＴＣＲα対立遺伝子の一方または両方で相同組換えを行った細胞からなるが、ＤＰ細胞は、両方の対立遺伝子でＨＲを行った。この観察と一致して、ＧＦＰ＋及びＢＦＰ＋細胞の両方において明らかな（１０〜１５％）ＣＤ３＋集団があった。ＣＤ３＋集団は、一方のＴＣＲα対立遺伝子でＨＲを行った細胞を表す。特に、ＤＰ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子の両方でＨＲと一致する、ほとんど検出可能なＣＤ３＋細胞（＜２％）を有しなかった。図４Ｂ。
実施例５
ＴＣＲα遺伝子座への蛍光タンパク質またはＣＡＲをコードするプロモーターレス導入遺伝子の相同組換え
ウイルス自己切断型ペプチド、例えば、Ｔ２Ａペプチド、蛍光レポーター導入遺伝子及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１３）が、設計され、構築され、検証された。図５Ａ。Ｔ２Ａペプチドは、内在性ＴＣＲα ｍＲＮＡへの蛍光レポーター導入遺伝子の発現に連結させ、蛍光シグナルまたはＣＡＲ発現を内在性ＴＣＲαプロモーターの制御下で配置する。導入遺伝子発現は、相同組換えの不在下で観察されない。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔した。電気穿孔したＴ細胞を、Ｔ２Ａを含有する蛍光レポーターをコードするｒＡＡＶで形質導入した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するＴ細胞を含んだ。蛍光レポーター発現を、フローサイトメトリーによってトランスフェクション後の種々の時点で分析した。レポーター発現は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するＴ細胞を観察しなかった。同様のｍｅｇａＴＡＬ活性率を、ＡＡＶ形質導入の有無にかかわらず観察した。しかしながら、ｍｅｇａＴＡＬ及び相同を含有するＡＡＶを標的としたベクターの両方を受けたＴ細胞のみが、蛍光細胞集団を生成した。内在性ＴＣＲαプロモーターによって駆動された蛍光レポーター発現は、外因性プロモーター駆動型受容体発現と比較して実質的に低かった（蛍光強度の約５倍の低下、実施例１を参照されたい）。図５Ｂ。
ウイルス自己切断型ペプチド、例えば、Ｔ２Ａペプチド、ＣＤ１９−ＣＡＲ導入遺伝子及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号２０）が、設計され、構築され、検証された。図５Ｃ。内在性ＴＣＲα ｍＲＮＡへのＣＡＲを連結するＴ２Ａペプチドは、ＣＡＲ発現が、内在性ＴＣＲαプロモーターによって調節することを確実にする。導入遺伝子発現は、相同組換えの不在下で観察されなかった。
ＣＤ１９−ＣＡＲレンチウイルスベクターで処理された細胞と、２Ａ−ＨＤＲ−ＣＡＲ構築物で処理された細胞との比較は、ＨＤＲ−ＣＡＲ−ノックイン試料中でより低いＣＡＲ発現を実証した（図５Ｄ）。しかしながら、ＬＶ−ＣＡＲ及びＨＤＲ−ＣＡＲ−ノックイン試料の両方が、Ｋ５６２−ＣＤ１９＋腫瘍細胞に対する同様の細胞傷害性率を有した（図５Ｅ）。
実施例６
トランスフェクション及び形質導入プロトコルを操作することによって非相同末端結合（ＮＨＥＪ）上のバイアス相同組換え（ＨＲ）の結果
ＮＨＥＪ対ＨＲの相対速度は、組換え反応の温度を変化させることによって調節され得る。低体温条件（＜３７°）に対するヌクレアーゼ処理細胞の一時的曝露は、ＮＨＥＪ活性を増加させることを示したが、Ｔ細胞中の相同組換えにおける温度の影響は、まだ調査中であり、不明のところが多い。ＭＮＤ−ＣＡＲレポーター導入遺伝子を含有するｒＡＡＶが、設計され、構築され、検証された（配列番号１２）。
活性化されたＴ細胞を、実施例１に記載されるように、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入した。形質導入したＴ細胞を、３７℃または３０℃のいずれかで約２２時間培養し、相同組換え／ＣＡＲ発現を、トランスフェクション後に種々の時点でＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによって分析した。ＣＤ３染色の喪失は、ＴＣＲα遺伝子座でｍｅｇａＴＡＬ媒介性ＮＨＥＪ活性のインジケータとして評価した。図６。
３０℃のインキュベーション工程でのｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞の一時的曝露は、標準的な３７℃の条件下でｍｅｇａＴＡＬで処理した細胞を培養することと比較して、著しく増加したＮＨＥＪ活性をもたらした。その上、ＣＡＲ発現によって判定されるように、３７℃対３０℃の条件下で培養されたＴ細胞中でＨＲ活性のわずかな低下があった。対照的には、ＨＲ：ＮＨＥＪ事象の相対比は、３７°で培養された細胞に対してはるかに大きく、ＣＤ３−細胞のほぼ５０％が、一時的な３０℃のインキュベーション後のＣＤ３−細胞の約２５％と比較して、３７°のインキュベーション後のＣＡＲ＋であった。バイアスは、ＮＨＥＪ事象の頻度を著しく増加させる一過性低体温症と一致したが、全体的なＨＲ効率に対して比較的わずかな影響を有した。
実施例７
ＴＣＲα遺伝子座へのポリタンパク質をコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、自己切断型ウイルス２Ａペプチド（ポリタンパク質）によって分離される２つのタンパク質をコードする導入遺伝子、及び後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１４）が、設計され、構築され、検証された。図７Ａ。ポリタンパク質導入遺伝子は、薬物調節されたＣＤ１９を標的としたキメラ抗原受容体（Ｄａｒｉｃ）の２つの独立した構成要素をコードした（配列番号１５）。自己切断型ウイルス２Ａペプチドは、単一のｍＲＮＡ転写物から２つの異なるタンパク質の発現を可能にする。導入遺伝子は、実施例２に記載されるように、最小のＴＣＲα相同アームによって隣接した。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化されたＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ポリタンパク質導入遺伝子をコードするｒＡＡＶで形質導入した。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはＡＡＶを標的としたベクターのみを含有するｔ細胞、及び同じポリタンパク質発現カセットをコードするＬＶで形質導入したＴ細胞を含んだ。ＣＤ１９−Ｄａｒｉｃ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃを用いてフローサイトメトリーによって分析した。図７Ｂ。ＣＤ１９−Ｆｃ反応性は、ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶを標的としたベクターの両方を受けた試料中でのみ観察された。
実施例８
ＨＲ効率における相同アーム長の効果
異なる長さの相同アーム、プロモーター、ＧＦＰをコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する一連のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図８Ａ。ＦＬ構築物は、約１５００ｂｐの５’相同アーム及び約１０００ｂｐの３’相同アームを有し、Ｍ構築物は、約１０００ｂｐの５’相同アーム及び約６００ｂｐの３’相同アームを有し、Ｓ構築物は、約６００ｂｐの５’相同アーム及び約６００ｂｐの３’相同アームを有した。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、変動する相同アーム長さを有するＧＦＰをコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。対照は、トランスフェクトされていない試料及びｍｅｇａＴＡＬのみで処理された試料を含む。ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによって分析した。
構築物は、同様のＨＲ効率を示した。図８Ｂ。
実施例９
ＴＣＲα遺伝子座への抗ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子の相同組換えは、Ｔ細胞疲弊マーカーの低減した発現に関連する
プロモーター、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
レンチウイルスベクターは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域及び膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むＣＡＲ発現カセットを含有した。レンチウイルスは、構築されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶを標的としたベクター（ＨＲ−ＣＡＲ Ｔ細胞）で形質導入されたか、または活性化された初代ヒトＴ細胞を、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするレンチウイルス（ＬＶ−ＣＡＲ Ｔ細胞）で形質導入された。
ＬＶ−Ｔ及びＨＲ−Ｔ細胞を、１：１のエフェクター（Ｅ）細胞対標的（Ｔ）細胞比でＮａｌｍ−６細胞を発現するＣＤ１９と、共培養した。Ｔ細胞疲弊マーカー発現（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、及びＴｉｍ−３）を、２４時間及び７２時間の共培養で測定した。２４時間で、ＨＲ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＬＶ−ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の上方調節の低減を示した。図９Ａ。７２時間で、ＨＲ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＬＶ−ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して、ＰＤ−１及びＴｉｍ−３の上方調節の低減を示した。図９Ｂ。
実施例１０
ＴＣＲα遺伝子座へのＣＡＲ及びＷＰＲＥをコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル、及びＷＰＲＥを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号９）が、設計され、構築され、検証された。図１０Ａ。導入遺伝子を、約６５０ｂｐのＴＣＲα相同アームによって隣接した。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含む。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによってフローサイトメトリーによって分析した。ＡＡＶ骨格へのＷＰＲＥ要素の組み込みは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって決定されるＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子の発現を大幅に強化した。図１０Ｂ
実施例１１
ＴＣＲα遺伝子座へのイントロンを含有するＣＡＲをコードする導入遺伝子の相同組換え
プロモーター、イントロンを含有するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１７及び１８）が、設計され、構築され、検証された。図１１Ａ。いくつかの実施形態において、イントロンは、導入遺伝子開始コドンの直ちに５’に配置された。他の実施形態において、二重イントロンは、ＣＡＲ導入遺伝子を分裂し、ＴＣＲα遺伝子座で内在性ｍＲＮＡを模倣するために使用された。導入遺伝子を、約６５０ｂｐのＴＣＲα相同アームによって隣接した。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成された。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含む。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによってフローサイトメトリーによって分析した。ｒＡＡＶ骨格への５’イントロンの組み込みは、ＴＣＲα遺伝子座においてＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子発現に悪影響を受けた。ＣＤ１９ ＣＡＲ導入遺伝子への内部イントロンの組み込みは、５’イントロンを有するか、またはイントロンを完全に欠如する構築物と比較して、発現をさらに減少した。図１１Ｂ。
実施例１２
ＴＣＲα遺伝子座への二重プロモーター導入遺伝子の相同組換え
二重プロモーター、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする２つの導入遺伝子（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及びＴＧＦβＲ１Ｉ−優性ネガティブ（ＤＮ））、ならびに２つのポリアデニル化部位を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（配列番号１９及び２１）が、設計され、構築され、検証された。導入遺伝子を、約６５０ｂｐのＴＣＲα相同アームによって隣接した。バリアントは、自己切断可能なＴ２Ａリンカーによって分類される、ＣＡＲ及びＴＧＦβＲＩＩ−ＤＮ導入遺伝子の発現を駆動するために、単一のＭＮＤプロモーターを使用した。図１２Ａ。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。対照は、ｍｅｇａＴＡＬまたはｒＡＡＶを標的としたベクターのみを含む。抗ＣＤ１９−ＣＡＲ発現を、ＰＥ共役ＣＤ１９−Ｆｃで染色することによってフローサイトメトリーによって分析し、ＴＧＦβＲ１−ＤＮ発現を、標識ＴＧＦβで染色することによって分析した。二重プロモーターの組み込みは、低減されたが、ＣＡＲ及びＴＧＦβＲＩＩ−ＤＮの両方の検出可能な発現をもたらした。発現は、ＣＤ１９−ＣＡＲをＴＧＦβＲＩＩ−ＤＮ導入遺伝子と混合するために、Ｔ２Ａ要素を用いて単一プロモーターＣＡＲまたは二重導入遺伝子構築物と比較して低かった。図１２Ｂ。
実施例１３
ＴＣＲα遺伝子座へのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の相同組換え
新規の標的物へのＴ細胞特異性の再方向は、ゲノム編集技術の重要な利点である。プロモーター、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のアルファ及びベータ鎖、ならびにポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された、例えば、配列番号２２。図１３Ａ。ＴＣＲアルファ及びベータ鎖のコード配列は、自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列によって分離される。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入した。
成功した相同組換えを、ＰＥ共役ＷＴ−１四量体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子（ＨＲ＋Ｔ細胞）で処理されたＴ細胞の機能的能力を、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致したＷＴ−１＋標的細胞でＨＲ＋Ｔ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分類することによって決定した。ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子の発現を、ＷＴ１四量体で染色することによって決定した。また、ＷＴ１四量体＋細胞は全て、ＣＤ３発現に対して陽性であり、ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子の成功したＨＤＲのＴＣＲ発現の回復を示した。図１３Ｂ。
実施例１４
ＴＣＲα遺伝子座で別々の対立遺伝子への異種調節したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）構成要素の相同組換え
内在性Ｔ細胞受容体は、２つの異なるα／β鎖の共発現によって形成される。相同組換えは、個々のＴＣＲα対立遺伝子にαまたはβ鎖を送達することによって内在性転写機構の正確なモデリングを可能にする。プロモーター、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、ならびにポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１４。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞は、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子のαまたはβ鎖のいずれかをコードする２つの固有のｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。
成功した相同組換えを、ＰＥ共役ＷＴ−１四量体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＬＡと一致したＷＴ−１＋標的細胞でＨＲ＋Ｔ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定する。
実施例１５
ＴＣＲα遺伝子座で別々の対立遺伝子に内在的に調節されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）構成要素の相同組換え
相同組換えは、多構成要素導入遺伝子の発現に対する細胞性転写機構の正確なモデリングを可能にする。自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、ならびにポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１５。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞は、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子のαまたはβ鎖のいずれかをコードする２つの固有のｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。成功した相同組換え後、αまたはβ鎖の発現は、内在性ＴＣＲαプロモーターによって調節される。
成功した相同組換えを、ＰＥ共役ＷＴ−１四量体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＬＡと一致したＷＴ−１＋標的細胞でＨＲ＋Ｔ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定する。
実施例１６
ＴＣＲα遺伝子座への異種調節したＰＤ１フリップ受容体の相同組換え
ＰＤ１フリップ受容体の相同組換えは、阻害性入力を陽性共刺激出力に潜在的に変換する。プロモーター、ＰＤ１細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン。及びポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１６。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体をコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。
成功した相同組換えは、処理された細胞の分子分析によって判定される。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＰＤ１−フリップ受容体で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＲ＋Ｔ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞と培養し、αＣＤ３またはαＣＤ３／αＣＤ２８刺激で処理した後にサイトカイン産生を分析することによって判定される。
実施例１７
ＴＣＲα遺伝子座への内在的に調節したＰＤ１フリップ受容体の相同組換え
ＰＤ１フリップ受容体の相同組換えは、阻害性入力を陽性共刺激出力に潜在的に変換する。自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列、ＰＤ１細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン及びポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１７。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体をコードするｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。成功した相同組換え後、ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体の発現は、内在性ＴＣＲαプロモーターによって調節される。
成功した相同組換えは、処理された細胞の分子分析によって判定される。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＰＤ１−フリップ受容体で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＲ＋Ｔ細胞を、ＰＤ−Ｌ１を発現する標的細胞と培養し、αＣＤ３またはαＣＤ３／αＣＤ２８刺激で処理した後にサイトカイン産生を分析することによって判定される。
実施例１８
ＴＣＲα遺伝子座の個々の対立遺伝子への異種調節したバイシストロン性導入遺伝子の相同組換え
相同組換えは、標的遺伝子座の個々の対立遺伝子への複数の導入遺伝子の送達を可能にする。プロモーター、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のアルファ鎖、自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体、及びポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。その上、プロモーター、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のベータ鎖、自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン、及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１８。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞は、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、第２のＰＤ１−ＣＤ２８フリップまたはＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ受容体と組み合わせたＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子のαまたはβ鎖のいずれかをコードする２つの固有のｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。
成功した相同組換えを、ＰＥ共役ＷＴ−１四量体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。ＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ受容体の成功した発現を、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体を用いたフローサイトメトリー分析によって文書化した。ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体の相同組換えを、分子分析によって判定した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＬＡと一致したＷＴ−１＋標的細胞でＨＲ＋Ｔ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定する。ＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ構成要素の機能的能力を、定義された量のＴＧＦβに添加し、ＨＬＡと一致するＷＴ−１＋標的細胞の存在下でＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を分析することによって判定した。ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体の機能的能力を、ＨＬＡと一致する、ＰＤ−Ｌ１＋ＷＴ１＋標的細胞の存在下でＴ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定した。
実施例１９
ＴＣＲα遺伝子座の個々の対立遺伝子への内在的に調節したバイシストロン性導入遺伝子の相同組換え
相同組換えは、標的遺伝子座の個々の対立遺伝子への複数の導入遺伝子の送達を可能にする。自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のアルファ鎖、第２の２Ａペプチド配列ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体、及びポリアデニル化シグナルを含有する個々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。その上、自己切断型ウイルス２Ａペプチド配列、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ１−ＴＣＲ）に特異的なＴ細胞受容体のベータ鎖、第２の２Ａペプチド配列、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン、及びポリアデニル化シグナルを含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドが、設計され、構築され、検証された。図１９。ｒＡＡＶは、実施例１に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって生成される。
初代ヒトＴ細胞は、実施例１に記載されるように、ＣＤ３及びＣＤ２８で活性化される。活性化された初代ヒトＴ細胞は、インビトロで転写されたｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡで電気穿孔し、第２のＰＤ１−ＣＤ２８フリップまたはＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ受容体と組み合わせたＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子のαまたはβ鎖のいずれかをコードする２つの固有のｒＡＡＶを標的としたベクターで形質導入された。
成功した相同組換えを、ＰＥ共役ＷＴ−１四量体で染色することによって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。ＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ受容体の成功した発現を、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体を用いたフローサイトメトリー分析によって文書化した。ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体の相同組換えを、分子分析によって判定した。ｍｅｇａＴＡＬ及びＡＡＶ ＷＴ−１ ＴＣＲ導入遺伝子で処理されたＴ細胞（ＨＲ＋Ｔ細胞）の機能的能力を、ＨＬＡと一致したＷＴ−１＋標的細胞でＨＲ＋Ｔ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定する。ＴＧＦβＲＩＩ優性ネガティブ構成要素の機能的能力を、定義された量のＴＧＦβに添加することによって判定し、ＨＬＡと一致するＷＴ−１＋標的細胞の存在下でＴ細胞増殖及びサイトカイン産生を分析する。ＰＤ１−ＣＤ２８フリップ受容体の機能的能力を、ＨＬＡと一致する、ＰＤ−Ｌ１＋ＷＴ１＋標的細胞の存在下でＴ細胞を培養し、サイトカイン産生及び標的細胞溶解を分析することによって判定した。
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態への特許請求の範囲に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

Claims (162)

  1. ａ）１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、
    ｂ）前記１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫力エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、を含む、細胞。
  2. ａ）１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、
    ｂ）前記１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫抑制シグナルダンパーをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、を含む、細胞。
  3. ａ）１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、
    ｂ）前記１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、を含む、細胞。
  4. ａ）１つ以上の修飾Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）対立遺伝子と、
    ｂ）前記１つ以上の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入された、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、及び遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸と、を含む、細胞。
  5. 前記修飾ＴＣＲαは、機能不全であるか、または実質的に低減された機能を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞。
  6. 前記核酸は、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞。
  7. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、及び負の制御領域が欠失した骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーのｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項６に記載の細胞。
  8. 前記核酸は、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された自己切断型ウイルスペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
  9. 前記自己切断型ウイルスペプチドは２Ａペプチドである、請求項８に記載の細胞。
  10. 前記自己切断型ペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、及び脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される、請求項８または請求項９に記載の細胞。
  11. 前記核酸は異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞。
  12. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、請求項２、及び４〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  13. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む、請求項１２に記載の細胞。
  14. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含み、任意選択で、前記細胞外ドメインは、その抗体または抗原結合断片である、請求項２、及び４〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  15. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む、請求項２、及び４〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  16. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾された細胞内ドメインとを含む、請求項２、及び４〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  17. 前記細胞外ドメインは、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の細胞。
  18. 前記細胞外ドメインは、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合がん抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される免疫抑制因子に結合する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の細胞。
  19. 前記細胞外ドメインは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体抑制性チロシン依存性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、哺乳類コロニー刺激因子１受容体（Ｍ−ＣＳＦ１）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導受容体（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合がん抗原（ＲＣＡＳ１Ｒ）、及びＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）からなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
  20. 前記細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の細胞。
  21. 前記細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の細胞。
  22. 前記免疫抑制シグナルダンパーは、優性ネガティブＴＧＦβＲＩＩ受容体である、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
  23. 前記膜貫通ドメインは、前記Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の細胞。
  24. 前記免疫抑制因子は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＧＦβ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＲＡＩＬ、ＲＣＡＳ１、ＦａｓＬ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３からなる群から選択される、請求項１４〜２３の請求項のいずれか１項に記載の細胞。
  25. 前記免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、及びフリップ受容体からなる群から選択される、請求項１及び４〜１１のいずれか１項に記載の細胞。
  26. 前記ＢｉＴＥは、
    ａ）アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する第１の結合ドメインと、
    ｂ）リンカーと、
    ｃ）ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択される免疫エフェクター細胞上の抗原に結合する第２の結合ドメインと、を含む、請求項２５に記載の細胞。
  27. 前記ＢｉＴＥは、
    ａ）クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体及びクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体からなる群から選択される抗原に結合する第１の結合ドメインと、
    ｂ）リンカーと、
    ｃ）ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択される免疫エフェクター細胞上の抗原に結合する第２の結合ドメインと、を含む、請求項２５に記載の細胞。
  28. 前記免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項２５に記載の細胞。
  29. 前記サイトカインは、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＴＮＦ−αからなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  30. 前記ケモカインは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  31. 前記細胞毒素は、パーフォリン、グランザイムＡ、及びグランザイムＢからなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  32. 前記サイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、及びＩＬ−２１受容体からなる群から選択される、請求項２８に記載の細胞。
  33. 前記免疫賦活因子は、タンパク質不安定化ドメインを含む、請求項２５〜３２のいずれかに記載の細胞。
  34. 前記フリップ受容体は、免疫抑制サイトカインに結合する細胞外ドメインと、膜貫通と、細胞内ドメインとを含む、請求項２５に記載の細胞。
  35. 前記フリップ受容体は、
    ａ）ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１３受容体、またはＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択されるサイトカイン受容体の細胞外サイトカイン結合ドメインを含む細胞外ドメインと、
    ｂ）ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された膜貫通ドメインと、
    ｃ）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された細胞内ドメインと、を含む、請求項２６に記載の細胞。
  36. 前記フリップ受容体は、
    ａ）ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβに結合する抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外ドメインと、
    ｂ）ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された膜貫通ドメインと、
    ｃ）ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離された細胞内ドメインと、を含む、請求項２６に記載の細胞。
  37. 前記フリップ受容体は、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含む、請求項２５に記載の細胞。
  38. 前記細胞外ドメインは、ＩＴＩＭ及び／またはＩＴＳＭを含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項３７に記載の細胞。
  39. 前記細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＲＣＡＳ１Ｒ、及びＦＡＳからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項３７または請求項３８に記載の細胞。
  40. 前記細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、及びＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の細胞。
  41. 前記細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲＩＩまたはＰＤ−１の細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項４０に記載の細胞。
  42. 前記膜貫通ドメインは、前記Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
  43. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の細胞。
  44. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項３７〜４３のいずれか１項に記載の細胞。
  45. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の細胞。
  46. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８から単離される、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の細胞。
  47. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４から単離される、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の細胞。
  48. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の細胞。
  49. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７８から単離される、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の細胞。
  50. 前記１つ以上の主要シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の細胞。
  51. 前記１つ以上の主要シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから単離される、請求項３７〜５０のいずれか１項に記載の細胞。
  52. 前記フリップ受容体は、ＴＧＦβＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、またはＩＬ−１５受容体膜貫通ドメインと、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、またはＩＬ−１５受容体から単離される細胞内ドメインとを含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
  53. 前記フリップ受容体は、ＰＤ−１受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＰＤ−１またはＣＤ２８膜貫通ドメイン膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ２７８からなる群から選択される１つ以上の細胞内共刺激及び／または主要シグナル伝達ドメインとを含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
  54. 前記遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはキメラサイトカイン受容体からなる群から選択される、請求項３〜５３のいずれか１項に記載の細胞。
  55. 前記核酸は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記アルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項５４に記載の細胞。
  56. 前記核酸は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記ベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項５４または５５に記載の細胞。
  57. 前記核酸は、５’から３’へと、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記アルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に統合された前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記ベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
  58. 両方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子が機能不全である、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の細胞。
  59. 前記第１の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記アルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸を含み、前記第２の修飾ＴＣＲα対立遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、前記遺伝子操作されたＴＣＲの前記ベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項５８に記載の細胞。
  60. 前記遺伝子操作されたＴＣＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
  61. 前記ＣＡＲは、
    ａ）アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、
    ｂ）前記Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、
    ｃ）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
    ｄ）ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインと、を含む、請求項３〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
  62. 前記ＣＡＲは、
    ａ）ＭＨＣ−ペプチド複合体、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体、またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する細胞外ドメインと、
    ｂ）前記Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、
    ｃ）ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
    ｄ）ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインと、を含む、請求項３〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
  63. 前記ＣＡＲは、
    ａ）ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、及びＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、
    ｂ）ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、
    ｃ）ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
    ｄ）ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインと、を含む、請求項３〜６０のいずれか１項に記載の細胞。
  64. 前記Ｄａｒｉｃ受容体は、
    （ａ）第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン及び／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、
    （ｂ）結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、及び任意選択で第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドと、を含み、
    架橋因子が、前記細胞表面上でのＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進し、前記架橋因子は、前記シグナル伝達ポリペプチドの前記多量体化ドメインと前記結合ポリペプチドの前記多量体化ドメインとに会合し、それらの間に配置される、請求項３〜６３のいずれか１項に記載の細胞。
  65. 前記第１の及び第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰに対するトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンド（ＳＬＦ）またはその誘導体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子に会合する、請求項６４に記載の細胞。
  66. 前記第１の及び第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ、ＦＫＢＰ及びカルシニューリン、ＦＫＢＰ及びシクロフィリン、ＦＫＢＰ及び細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリン及びシクロフィリン、ＰＹＬ１及びＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１及びＧＡＩ、またはそれらのバリアントから選択される対である、請求項６４または請求項６５に記載の細胞。
  67. 前記第１の多量体化ドメインはＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌを含み、前記第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、前記架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
  68. 前記第１の多量体化ドメインはＦＲＢを含み、前記第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、前記架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
  69. 前記結合ドメインはｓｃＦｖを含む、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の細胞。
  70. 前記結合ドメインは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、及びＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合するｓｃＦｖを含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の細胞。
  71. 前記結合ドメインは、ＭＨＣ−ペプチド複合体、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体、またはクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するｓｃＦｖを含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の細胞；
  72. 前記第１の及び第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の細胞。
  73. 前記第１の及び第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、及びＣＤ８αからなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される、請求項６４〜７２のいずれか１項に記載の細胞。
  74. 前記１つ以上の共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載の細胞。
  75. 前記１つ以上の主要シグナルドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の細胞。
  76. 前記シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢ Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、前記結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、前記架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である、請求項６４〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
  77. 前記シグナル伝達ポリペプチドは、ＦＲＢの第１の多量体化ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインを含み、前記結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメイン、及びＣＤ４膜貫通ドメインを含み、前記架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項６４〜７５のいずれか１項に記載の細胞。
  78. 一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子が、前記シグナル伝達ポリペプチド、ウイルス自己切断型２Ａペプチド、及び前記結合ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項６４〜７７のいずれか１項に記載の細胞。
  79. 前記キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３〜６３のいずれか１項に記載の細胞。
  80. 前記サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、及びインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される、請求項７９に記載の細胞。
  81. 前記リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメインまたはヒンジドメインを含む、請求項７９または請求項８０に記載の細胞。
  82. 前記リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤの前記ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の細胞。
  83. 前記リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の細胞。
  84. 前記膜貫通ドメインは、前記Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の細胞。
  85. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ含有主要シグナル伝達ドメイン及び／または共刺激ドメインからなる群から選択される、請求項７９〜８４のいずれか１項に記載の細胞。
  86. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項７９〜８５のいずれか１項に記載の細胞。
  87. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項７９〜８５のいずれか１項に記載の細胞。
  88. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、及びＣＤ３ζからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項７９〜８５のいずれか１項に記載の細胞。
  89. 両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される、請求項５４〜８８のいずれか１項に記載の細胞。
  90. 両方のＴＣＲα対立遺伝子が機能不全であり、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、第１の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、前記細胞は、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含み、第２の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される、請求項５４〜８８のいずれか１項に記載の細胞。
  91. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは異なる、請求項９０に記載の細胞。
  92. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは各々独立して、免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする、請求項９０または請求項９１に記載の細胞。
  93. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは各々独立して、フリップ受容体をコードする、請求項９０または請求項９１に記載の細胞。
  94. 両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードするポリヌクレオチドを含む第１の核酸が、一方の機能不全ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、前記細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、請求項５４〜８８のいずれか１項に記載の細胞。
  95. 前記核酸は、阻害性ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜９４のいずれか１項に記載の細胞。
  96. 前記阻害性ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはリボザイムである、請求項９５に記載の細胞。
  97. 前記核酸は、前記阻害性ＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターをさらに含む、請求項９５または９６に記載の細胞。
  98. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、ヒトまたはマウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーターからなる群から選択される、請求項９６に記載の細胞。
  99. 前記細胞は造血細胞である、請求項１〜９８のいずれか１項に記載の細胞。
  100. 前記細胞は免疫エフェクター細胞である、請求項１〜９９のいずれか１項に記載の細胞。
  101. 前記細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである、請求項１〜１００のいずれか１項に記載の細胞。
  102. 前記細胞はＴ細胞である、請求項１〜１０１のいずれか１項に記載の細胞。
  103. 前記細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項１〜１０２のいずれか１項に記載の細胞。
  104. 前記細胞の源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題（ｉｓｓｕｅ）、感染部位由来組織、復水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項１〜１０３のいずれか１項に記載の細胞。
  105. 前記細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される、請求項１〜１０４のいずれか１項に記載の細胞。
  106. 前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される前記細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激される細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）前記マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全ての増加した発現を有する、請求項１０５に記載の細胞。
  107. 前記ＰＩ３Ｋの阻害剤の存在下で活性化され、刺激される前記細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激される細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）前記マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全ての増加した発現を有する、請求項１０５に記載の細胞。
  108. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である、請求項１０５〜１０７のいずれか１項に記載の細胞。
  109. 請求項１〜１０８のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物。
  110. 請求項１〜１０８のいずれか１項に記載の細胞と、生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、組成物。
  111. Ｔ細胞の集団においてＴＣＲα対立遺伝子を編集する方法であって、
    ａ）Ｔ細胞の集団を活性化し、前記Ｔ細胞の集団を刺激して、増殖させること、
    ｂ）遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを前記Ｔ細胞の集団に導入すること、
    ｃ）前記Ｔ細胞の集団に、ドナー修復テンプレートを含む１つ以上のウイルスベクターを形質導入すること、を含み、
    前記遺伝子操作されたヌクレアーゼの発現が、前記ＴＣＲα対立遺伝子内の標的部位で２本鎖切断を作り出し、前記ドナー修復テンプレートは、前記２本鎖切断（ＤＳＢ）の前記部位での相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれる、方法。
  112. 前記ドナー修復テンプレートは、前記ＤＳＢの前記ＴＣＲα配列５’に相同な５’相同アームと、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドと、前記ＤＳＢの前記ＴＣＲα配列３’に相同な３’相同アームと、を含む、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記５’及び３’相同アームの長さは、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから独立して選択される、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記５’及び３’相同アームの前記長さは、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される、請求項１１２または請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記５’相同アームは約１５００ｂｐであり、前記３’相同アームは約１０００ｂｐである、請求項１１２〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
  116. 前記５’相同アームは約６００ｂｐであり、前記３’相同アームは約６００ｂｐである、請求項１１２〜１１４のいずれか１項に記載の方法。
  117. 前記ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項１１２〜１１６のいずれか１項に記載の方法。
  118. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項１１７または請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶ６血清型を有する、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記レトロウイルスはレンチウイルスである、請求項１１７に記載の方法。
  122. 前記レンチウイルスはインテグラーゼ欠損レンチウイルスである、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記遺伝子操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１１１〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から遺伝子操作される、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項１１１〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項１１１〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼとを含む、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  128. 前記ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、及びＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項１２７または請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、及びＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから遺伝子操作される、請求項１２７〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ ＬＨＥから遺伝子操作される、請求項１２７〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. 前記ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項１３２または請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択されるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項１３２〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
  136. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項１３２〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたはハーフドメインとを含む、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  138. 前記亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８つの亜鉛フィンガーモチーフを含む、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記ＺＦＮはＴＡＬＥ結合ドメインを含む、請求項１３７または請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項１３９に記載の方法。
  141. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項１３７〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、Ａａｒ Ｉ、Ａｃｅ ＩＩＩ、Ａｃｉ Ｉ、Ａｌｏ Ｉ、Ａｌｗ２６ Ｉ、Ｂａｅ Ｉ、Ｂｂｒ７ Ｉ、Ｂｂｖ Ｉ、Ｂｂｖ ＩＩ、ＢｂｖＣ Ｉ、Ｂｃｃ Ｉ、Ｂｃｅ８３ Ｉ、ＢｃｅＡ Ｉ、Ｂｃｅｆ Ｉ、Ｂｃｇ Ｉ、ＢｃｉＶ Ｉ、Ｂｆｉ Ｉ、Ｂｉｎ Ｉ、Ｂｍｇ Ｉ、Ｂｐｕ１０ Ｉ、ＢｓａＸ Ｉ、Ｂｓｂ Ｉ、ＢｓｃＡ Ｉ、ＢｓｃＧ Ｉ、ＢｓｅＲ Ｉ、ＢｓｅＹ Ｉ、Ｂｓｉ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｍＡ Ｉ、ＢｓｍＦ Ｉ、Ｂｓｐ２４ Ｉ、ＢｓｐＧ Ｉ、ＢｓｐＭ Ｉ、ＢｓｐＮＣ Ｉ、Ｂｓｒ Ｉ、ＢｓｒＢ Ｉ、ＢｓｒＤ Ｉ、ＢｓｔＦ５ Ｉ、Ｂｔｒ Ｉ、Ｂｔｓ Ｉ、Ｃｄｉ Ｉ、ＣｊｅＰ Ｉ、Ｄｒｄ ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ Ｉ、Ｅｃｏ３１ Ｉ、Ｅｃｏ５７ Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ Ｉ、Ｅｓｐ３ Ｉ、Ｆａｕ Ｉ、Ｆｉｎ Ｉ、Ｆｏｋ Ｉ、Ｇｄｉ ＩＩ、Ｇｓｕ Ｉ、Ｈｇａ Ｉ、Ｈｉｎ４ ＩＩ、Ｈｐｈ Ｉ、Ｋｓｐ６３２ Ｉ、Ｍｂｏ ＩＩ、Ｍｌｙ Ｉ、Ｍｍｅ Ｉ、Ｍｎｌ Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ Ｐｌｅ Ｉ、Ｐｐｉ Ｉ Ｐｓｒ Ｉ、ＲｌｅＡ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、ＳｆａＮ Ｉ、Ｓｉｍ Ｉ、ＳｓｐＤ５ Ｉ、Ｓｔｈ１３２ Ｉ、Ｓｔｓ Ｉ、ＴｓｐＤＴ Ｉ、ＴｓｐＧＷ Ｉ、Ｔｔｈ１１１ ＩＩ、ＵｂａＰ Ｉ、Ｂｓａ Ｉ、及びＢｓｍＢ Ｉからなる群から選択されるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼから単離される、請求項１３７〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
  143. 前記エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩから単離される、請求項１３７〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び前記ＴＣＲα遺伝子内のプロトスペーサーを標的とする１つ以上のｃｒＲＮＡが、前記Ｔ細胞の集団に導入される、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  145. ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及び前記ＴＣＲα遺伝子内のプロトスペーサー配列を標的とする１つ以上のｓｇＲＮＡが、前記Ｔ細胞の集団に導入される、請求項１１１〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
  146. 前記ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９またはＣｐｆ１である、請求項１４４または請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記Ｃａｓヌクレアーゼは１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１４４〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
  148. ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される、請求項１１１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  149. ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、第１の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のドナーテンプレートが、第２の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される、請求項１１１〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
  150. 前記第１のドナーテンプレート及び前記第２のテンプレートは、異なるポリヌクレオチドを含む、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは各々独立して、免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする、請求項１４９または請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは各々独立して、フリップ受容体をコードする、請求項１４９または請求項１５０に記載の方法。
  153. ＤＳＢが両方のＴＣＲα対立遺伝子内に生成され、請求項１〜８８のいずれか１項に記載の免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のドナーテンプレートが、一方の修飾ＴＣＲα対立遺伝子に挿入され、前記細胞には、遺伝子操作された抗原受容体を含むレンチウイルスベクターがさらに形質導入される、請求項１１１〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
  154. 前記Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項１１１〜１５３のいずれか１項に記載の方法。
  155. 前記遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードする前記ｍＲＮＡは、ウイルス自己切断型２Ａペプチド及びエンドプロセシング酵素をさらにコードする、請求項１１１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
  156. 前記方法は、エンドプロセシング酵素をコードするｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入することをさらに含む、請求項１１１〜１５４のいずれか１項に記載の方法。
  157. 前記エンドプロセシング酵素は、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する、請求項１５５または請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１４９〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  159. 前記Ｔ細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される、請求項１１１〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
  160. 前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化され、刺激される前記Ｔ細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激されるＴ細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）前記マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全ての増加した発現を有する、請求項１５９に記載の方法。
  161. 前記ＰＩ３Ｋの阻害剤の存在下で活性化され、刺激される前記Ｔ細胞は、前記ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の不在下で活性化され、刺激されるＴ細胞と比較して、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）前記マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全ての増加した発現を有する、請求項１５９に記載の方法。
  162. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤はＺＳＴＫ４７４である、請求項１５９〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
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