KR20220107019A - B 세포의 대규모 조합된 car 형질 도입 및 crispr 유전자 편집 - Google Patents

B 세포의 대규모 조합된 car 형질 도입 및 crispr 유전자 편집 Download PDF

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KR20220107019A
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케이티 레즈바니
라펫 바사르
에밀리 엔슬리
코스타 데이비드 마린
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더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

본 개시 내용의 실시 형태는 조작된 B 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 개시 내용은 CRISPR을 사용하여 하나 이상의 유전자의 발현이 중단되고 또한 적어도 하나의 이종 항원 수용체를 발현하도록 조작되는 B 세포를 생성하기 위한 대규모 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시 형태는 상기 방법에 대한 특정 파라미터를 포함한다.

Description

B 세포의 대규모 조합된 CAR 형질 도입 및 CRISPR 유전자 편집
본 출원은 2019년 11월 27일자로 출원된 미국 가출원 US 62/941,651에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
본 개시 내용은 일반적으로 면역학, 세포 생물학, 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다.
B 세포는 크게 이펙터 세포와 조절 세포로 나어질 수 있다. 이펙터 B 세포는 병원체에 특이적인 항체를 생산하는 이의 능력 때문에 체액성 면역의 핵심 추진 요인이다. 조절 B 세포는 최근 IL-10, IL-35 및 TGF-베타를 비롯한 항염증성 사이토카인의 생산을 통해 여러 질환에서 염증 반응을 조절하는 것으로 나타났다. 이들 B 세포 서브세트가 면역 조절 및 체액성 면역에 미치는 중요한 영향은 이들을 다양한 면역 장애에 대한 귀중한 세포 요법 후보로 만든다. 따라서, B 세포 면역 요법의 개선된 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다. B 세포의 생체외 확장에 대한 도전과 배양에서 아폽토시스를 겪는 경향은 치료학적 잠재력을 제한하는 주요 요인이다. 탁월한 생존력을 갖는 성공적인 확장 프로토콜의 창출은 B 세포를 요법에서 직접 또는 생체외 항체 생산의 공급원으로서 사용할 수 있는 문을 열 것이다. 또한, B 세포 조작 전략은 요법에 대한 이의 유용성을 추가로 증가시킬 수 있다.
따라서, 특히 B 세포를 사용하는 세포 면역 요법의 개선된 방법에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
발명의 개요
본 개시 내용의 실시 형태는 그러한 활성을 갖도록 특이적으로 조작되는 B 세포의 생존력 및 지속성을 그렇게 조작되지 않은 B 세포와 비교하여 향상시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 구체적인 실시 형태는 아폽토시스의 위험을 감소시키도록 특이적으로 조작되는 B 세포에 대한 아폽토시스를 그렇게 조작되지 않은 B 세포와 비교하여 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 개시 내용의 방법은 상기 B 세포의 확장을 개선하고 이를 필요로 하는 개체에 대한 요법으로서 사용되는 이의 효능을 증가시키는 특정 파라미터를 활용한다.
본 개시 내용의 실시 형태는 CAR 형질 도입 및/또는 유전자 편집, 예를 들어, CRISPR 유전자 편집을 포함하거나 포함하지 않는 B 세포의 확장을 위한 신규한 대규모 접근법 (GMP 등급 포함)을 포함한다. 본 개시 내용은 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하고/하거나 상기 B 세포에서의 하나 이상의 내인성 유전자가 파괴되도록 유전자 편집된 조작된 B 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, CAR 형질 도입된 B 세포는 상기 B 세포에서의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 중단되도록 조작되고, 다른 실시 형태에서, 상기 B 세포에서의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 중단된 B 세포는 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하도록 형질 도입 또는 형질 감염된다. 특별한 실시 형태는 일차 CAR 형질 도입된 B 세포의 대규모 CRISPR/Cas9 매개성 조작 전략을 제공한다.
특정 실시 형태에서, 상기 방법은 상기 방법을 대규모로 되도록, 예를 들어, 최대 1x109, 1x1010, 1x1011 또는 그 이상의 세포로 조작하도록 하는 특정 파라미터, 예를 들어, 조건 및/또는 시약을 활용한다. 특별한 경우에서, 상기 방법은 하나 이상의 확장 단계 및 다음과 같이 상기 B 세포의 증식을 증진시키기 위한 세포의 변형을 포함하는 연속적인 단계를 활용한다: (1) 하나 이상의 이종 항원 수용체를 보유함; (2) 상기 B 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현이 결여되거나 이의 발현이 감소됨; 및/또는 (3) 하나 이상의 사이토카인 유전자를 발현함. (1), (2) 및 (3)에 대한 B 세포의 변형은 임의의 순서일 수 있다. 일부 경우에서, (1), (2) 및 (3) 중 하나 이상은 임의적이며, 사용되지 않을 수 있다. 구체적인 경우에서, 하나 이상의 내인성 유전자는 다중 유전자에 대해 CRISPR 및 가이드 RNA를 사용하여 녹아웃되거나 녹다운된다. 목적하는 B 세포를 생성하는 방법은 또한 상기 방법의 하나 이상의 특정 단계를 비롯하여 상기 방법의 특정 단계에 대한 특정 기간을 포함한다.
생성된 조작된 B 세포는 암, 감염성 질환 및/또는 면역 관련 장애와 같은 의학적 병태의 치료를 비롯한 임의의 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 B 세포는 사용 전에 적합하게 저장된다. 상기 조작된 B 세포의 수여체 개체는 상기 세포의 공급원과 관련하여 자가 또는 동종 이계일 수 있다. 일부 경우에서, 적절한 저장 후, 본 개시 내용의 방법에 의해 생성된 B 세포는 치료학적 목적으로 이용되며, 저장 중 생성 후에 추가로 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 예를 들어, B 세포는 이의 생존을 용이하게 하기 위해 상기 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 유전자 편집을 갖도록 조작될 수 있으며, 이어서, 상기 B 세포는 저장되지만, 사용 전에, 상기 B 세포는 상기 개체의 암 세포 상의 항원을 표적화하는 수용체와 같은 수여체 개체의 요구에 특이적인 이종 항원 수용체를 발현하도록 추가로 변형될 수 있다. 다른 경우에서, B 세포는, 예를 들어, 공지된 암 항원인 항원을 비롯한 이종 항원 수용체를 발현하도록 조작될 수 있으며, 이어서, 상기 B 세포는 저장되지만, 사용 전에, 상기 B 세포는 유전자 편집되어 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 중단시키도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 예에서, 상기 이종 항원 수용체는 널리 공지된 암 항원, 또는 다양한 암 세포 유형 상에 존재하는 항원을 표적화하도록 설계되거나 설계되지 않을 수 있다.
특별한 실시 형태에서, 상기 이종 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체이다. 상기 이종 항원 수용체는 종양 관련 항원을 표적화할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 이종 항원 수용체는 CD19, CD319 (CS1), ROR1, CD20, CD70, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD5, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, WT-1, TRAIL/DR4, VEGFR2, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원을 표적화한다. 다른 항원은 본 출원의 다른 곳에 나열되어 있다.
특별한 실시 형태에서, 상기 B 세포에서의 발현이 중단된 내인성 유전자는 억제 유전자이다. 구체적인 경우에서, 상기 B 세포에서의 발현이 중단된 내인성 유전자는 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, TDAG8, CD5, CD7, SLAMF7, CD38, LAG3, TCR, 베타2-마이크로글루불린, HLA, CD73, CD39 또는 이들의 조합이다.
특별한 실시 형태에서, 상기 B 세포는 유전자 편집되는데, 여기서, 하나 이상의 조성물은 전기 천공에 의해 상기 B 세포에게 전달된다. 상기 B 세포가 전기 천공되는 경우, 상기 전기 천공은 특정 양의 B 세포, 예를 들어, 약 200,000개 세포 내지 1x1011개 B 세포를 사용할 수 있다. 전기 천공은 약 200,000 내지 2,000,000개 세포를 사용할 수 있다. 구체적인 경우에서, 전기 천공은 약 1,000,000 내지 1x109개 또는 그 이상 (1010, 1011개)의 B 세포 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 사용할 수 있다.
본 출원의 방법 중 임의의 방법에서, 상기 조작된 B 세포 중 임의의 세포는 분석될 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포는 기능성 검정, 세포독성 검정 및/또는 생체내 활성에 의해 유전자 편집의 효능에 대해 분석된다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 세포는 유세포 측정, 질량 세포 측정, RNA 서열 분석, PCR 또는 이들의 조합에 의해 분석된다. 임의의 세포는, 예를 들어, 방법 중 특정 단계 후에 또는 최종 세포 생성물이 생성된 후에, 냉동 보존되는 것과 같이 저장될 수 있다. 유효량의 상기 B 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암, 감염성 질환 및/는 면역 관련 장애를 개체에게 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 실시 형태는 본 출원에 포함된 임의의 방법에 의해 생성된 B 세포의 집단을 포함한다. 본 개시 내용의 세포 집단을 포함하는 조성물이, 상기 집단이 약제학적으로 허용되는 담체에 있는 경우를 포함하여, 고려된다.
본 개시 내용의 실시 형태는 치료학적 유효량의 본 개시 내용의 임의의 방법에 의해 생성된 B 세포를 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 의학적 병태에 대해 치료하는 방법을 포함한다. 상기 개체는 상기 의학적 병태에 대해 하나 이상의 추가의 요법을 받은 적이 있을 수 있거나 또한 없을 수 있거나, 받는 중이거나, 받을 것이다.
본 개시 내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 변형이 본 상세한 설명으로부터 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이므로, 본 개시 내용의 특별한 실시 형태를 명시하고 있지만, 상세한 설명 및 구체적인 예는 단지 예로서 주어진 것이다는 것을 이해해야 한다.
본 개시 내용을 보다 완전하게 이해하기 위해, 이하에서는 첨부된 도면과 관련하여 주어진 하기 설명을 참조한다.
도 1. 말초 혈액 B 세포의 CD40L 형질 도입의 하나의 예의 개략도.
도 2a~2e. CD40L 및 CD40L-IL21에 의한 일차 B 세포의 형질 도입 효율. 피콜 밀도 원심 분리를 사용하여 PBMC를 말초 혈액으로부터 단리한다. 자성 선택을 사용하여 B 세포를 음성적으로 선택한다. CpG 및 항-IgM/IgG를 사용하여 B 세포를 48 시간 동안 활성화시킨다. 도 2a. 레트로바이러스 벡터를 통한 CD40L로 형질 도입된 B 세포의 형질 도입 효율; 좌측의 피크는 형질 도입되지 않는다. 도 2b. 레트로바이러스 벡터를 통한 CD40L-IL21로 형질 도입된 B 세포의 형질 도입 효율; 우측의 피크는 형질 도입되지 않는다. 도 2c. 다양한 사이토카인 조합으로 형질 도입되고 배양되었을 때의 B 세포 성장 속도. (청색: IL-2 및 IL-21과 함께 배양된 CD40L 형질 도입된 B 세포, 적색: IL-4 및 IL-21과 함께 배양된 CD40L 형질 도입된 B 세포, 녹색: IL-2 및 IL-4와 함께 배양된 CD40L 형질 도입된 B 세포, 자색 : IL-4와 함께 배양된 CD40L-IL21 형질 도입된 B 세포, 주황색: IL2와 함께 배양된 CD40L-IL21 형질 도입된 B 세포, 흑색: IL-2와 함께 배양된 형질 도입되지 않은 B 세포). 도 2d. T 세포 사이토카인 분비의 B 세포 억제. 동종 이계 T 세포를 냉동 PBMC 샘플로부터 단리하고 항-CD3/CD28 마이크로비드로 활성화시켰다. 이들을 48 시간 동안 다양한 비율로 B 세포와 배양한 다음, T 세포 내에서 IFNg, TNFa 및 IL-2 생산의 양을 평가하기 위해 세포내 염색을 수행하였다. 도 2e. 기능성 검정을 CD40L-IL21에 의한 B 세포 형질 도입 후 5, 7 및 9일에 수행하였다.
도 3a~3b. 도 3a. 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CD40L 및 CAR 형질 도입을 조합한 프로토콜의 개략도의 하나의 예. B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 레트로바이러스 벡터를 통해 B 세포를 CAR 작제물 (CD19 또는 CD5)로 다시 형질 도입한다. 필요에 따라, 충분한 수가 임의의 기능성 연구, 질량 세포 측정 및/또는 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지한다. 도 3b. CAR CD19 (좌측에서 두 번째 패널의 우측의 청색 피크) 또는 CAR CD5 (맨 우측 패널의 우측의 청색 피크)로 두 번째로 형질 도입된 CD40L-B 세포의 형질 도입 효율.
도 4a~4b. 도 4a. CD40L 형질 도입과 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CRISPR Cas9 유전자 편집을 조합한 프로토콜의 하나의 예에 대한 개략도. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (ribonucleoprotein complex: RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가 기능성 연구, 질량 세포 측정 및 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지한다. 도 4b. CD86, CD95, IL10R 및 PD-1 유전자의 녹아웃 효율 (녹아웃은 청색이며 피크는 좌측임; 야생형은 적색이며 피크는 우측임).
도 5a~5b. 도 5a. CD40L 형질 도입과 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CRISPR Cas9 유전자 편집을 조합한 프로토콜의 하나의 예에 대한 개략도. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가 임의의 기능성 연구, 질량 세포 측정 및 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지한다. 도 5b. 본 실험 설계는 단일 세션에서 개별, 이중 또는 삼중 유전자 녹아웃이 성공적으로 수행되도록 허용하며; 우측의 피크는 Cas9이고, 좌측 피크는 KO이다.
도 6. CD40L 형질 도입된 일차 B 세포의 대규모 CRISPR cas9 유전자 편집의 하나의 예에 대한 개략도. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가 기능성 연구, 질량 세포 측정 및 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지한다.
도 7a~7b. 소규모 및 대규모 CRISPR-Cas9 유전자 편집 설정 사이의 전기 천공 및 녹아웃 효율의 비교. 도 7a. 전기 천공 효율은 소규모 및 대규모 CRISPR 편집된 B 세포 모두에서 95% 이상이다. 도 7b. CD47 녹아웃 효율은 소규모 및 대규모 설정 모두에서 높게 유지된다.적색 히스토그램: WT: 야생형 (녹아웃 없음, 우측 피크); 청색 히스토그램 (녹아웃 후, 좌측 피크). 연구를 위해, Lonza 4-D Nucleofector를 1 ml LV Unit-V4LP-3002; 프로그램 EO-115; gRNA/Cas9의 몰비에서 사용하였다. 연구를 위해, 4.6 μM gRNA, 4 μM Cas9를 사용하였다 (비율을 변경하지 않고 최종 RNP 복합체 양을 증가시킴).
도 8. CRISPR-Cas9 매개성 유전자 녹아웃 후 B 세포의 miR-155 발현 수준. 최대 효율을 발견하기 위해, gRNA의 다양한 조합을 사용하였다. 2와 5의 gRNA 조합이 가장 효율적인 녹아웃을 달성하였다. G는 한 공여자를 나타내며, E는 또 다른 기증자를 나타낸다. 1+2, 1+5 및 2+5라는 용어는 가이드 RNA 수의 다양한 조합을 나타낸다. 1+2 또는 1+5 또는 2+5의 조합은 miR155 (즉, 녹아웃)의 상대적 발현을 감소시키지만, 가장 좋은 효과는 gRNA 2+5에서 관찰된다.
[표 1]
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I. 정의
본 출원의 명세서에서 사용되는 "한" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원의 청구항(들)에서 사용되는 "한" 또는 "하나"라는 단어는, "~을 포함하는"이라는 단어와 함께 사용될 때, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 또한, "갖는", "포함하는 (including)", "함유하는" 및 "포함하는 (comprising)"이라는 용어는 상호 교환적이며, 당해 분야의 통상의 기술자는 이러한 용어가 개방형 용어라는 것을 인지하고 있다. 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 양태는, 예를 들어, 본 개시 내용의 하나 이상의 서열로 "필수적으로 이루어지"거나 "이루어질" 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태는 본 개시 내용의 하나 이상의 요소, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실시될 수 있는 것으로 고려된다. 본 출원의 범위는 본 명세서에 기재되는 공정, 기계, 제조, 물질의 조성물, 수단, 방법들 및 단계들의 특정 실시 형태에 한정하고자 하는 것은 아니다. 본 출원에서 사용되는 "또는" 및 "및/또는"이라는 용어는 서로 조합적으로 또는 배타적으로 다수의 구성 요소를 기재하는데 사용된다. 예를 들어, "x, y 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y 및 z", "(x 및 y) 또는 z", "x 또는 (y 및 z)" 또는 "x 또는 y 또는 z"를 지칭할 수 있다. x, y 또는 z는 실시 형태로부터 구체적으로 제외될 수 있는 것으로 구체적으로 고려된다.
청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은, 명백하게 대안만을 지칭하는 것으로 명시되지 않거나, 본 개시 내용이 대안만 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침하고 있다고 하더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는다면, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 출원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 제2 또는 그 이상을 의미할 수 있다. "약", "실질적으로" 및 "대략"이라는 용어는 일반적으로 명시된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.
본 명세서 전체에 걸친 "하나의 실시 형태", "한 실시 형태", "특별한 실시 형태", "관련 실시 형태", "특정 실시 형태", "추가적 실시 형태" 또는 "추가의 실시 형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은, 당해 실시 형태와 관련하여 기재된 특별한 특징, 구조 또는 특성이 본 개시 내용의 적어도 하나의 실시 형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 장소에서의 상기 문구의 출현은 반드시 전부 동일한 실시 형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특별한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 실시 형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
"면역 장애", "면역 관련 장애" 또는 "면역 매개성 장애"는 면역 반응이 질환의 발생 또는 진행에 중요한 역할을 하는 장애를 지칭한다. 면역 매개성 장애로는 자가 면역 장애, 동종 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 및 염증성 및 알러지성 병태가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "조작된"이라는 용어는 세포, 핵산, 폴리펩타이드, 벡터 등을 비롯한 사람의 손에 의해 생성되는 엔터티 (entity)를 지칭한다. 적어도 일부 경우에서, 조작된 엔터티는 합성이며, 본 개시 내용에서 활용되는 방식으로 구성되거나 자연적으로 존재하지 않는 요소를 포함한다. B 세포와 관련하여, 상기 세포는 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 감소를 갖고/갖거나 하나 이상의 이종 유전자 (예를 들어, 합성 항원 수용체 및/또는 사이토카인)를 발현하기 때문에 조작될 수 있으며, 이 경우(들)에서, 상기 조작은 모두 사람의 손에 의해 수행된다. 항원 수용체와 관련하여, 상기 항원 수용체는 자연에서 발견되지 않는 방식으로 구성되도록, 예를 들어, 자연에서 발견되지 않는 구성 요소의 융합 단백질 형태로 이렇게 구성되도록 유전적으로 재조합되는 다수의 구성 요소를 포함하기 때문에 조작된 것으로 간주될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "대규모"라는 용어는 1010, 1011개 등을 포함하여 대략 109개 이하 또는 그 이상의 B 세포 수를 지칭한다.
질환 또는 병태의 "치료하는" 또는 치료는 당해 질환의 징후 또는 증상을 완화시키려는 노력으로 1종 이상의 약물을 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는 프로토콜을 실행하는 것을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 예후 개선을 포함한다. 완화는 질환 또는 병태의 징후나 증상이 출현하기 전 뿐만 아니라 이들의 출현 후 발생할 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 바람직하지 않은 병태의 "예방하는" 또는 "예방"을 포함할 수 있다. 또한, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하지 않으며, 치유를 요구하지 않으며, 특히, 환자에 대해 한계 효과만 갖는 프로토콜을 포함한다.
본 출원 전체에 걸쳐 사용되는 "치료학적 이득" 또는 "치료학적으로 유효한"이라는 용어는 이러한 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 복지를 촉진하거나 증진시키는 모든 것을 지칭한다. 이것은 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 암 치료는, 예를 들어, 종양 크기의 감소, 종양 침습의 감소, 암 성장 속도의 감소, 암 발명의 지연, 암의 하나 이상의 증상 발병의 지연, 전이의 예방 또는 전이 발병의 지연을 포함할 수 있다. 암 치료는 또한 암을 갖는 대상체의 생존 연장을 지칭할 수 있다.
"대상체" 또는 "환자" 및 "개체"는 영장류, 포유 동물 및 척추 동물과 같은 사람 또는 비사람을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "포유 동물"은 본 개시 내용의 방법을 위한 적절한 대상체이다. 포유 동물은 새끼에게 먹이기 위한 모유를 분비하는 암컷에서 출산, 체모 및 유선을 특징으로 하는, 사람을 비롯한 보다 높은 척추 동물 클래스 포유류의 임의의 구성원일 수 있다. 또한, 포유 동물은 변화하는 기후 조건에도 불구하고 일정한 체온을 유지하는 능력을 특징으로 한다. 포유 동물의 예로는 사람, 고양이, 개, 소, 마우스, 래트, 말, 염소, 양 및 침팬지가 있다. 포유 동물은 "환자", "대상체" 또는 "개체"로서 지칭될 수 있다.
"약제학적 또는 약리학적으로 허용되는"이라는 문구는, 적절한 경우, 사람과 같은 동물에게 투여될 때 불리한 알러지성 또는 기타 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔터티 및 조성물을 지칭한다. 항체 또는 추가의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제제는 본 개시 내용에 비추어 당해 분야의 통상의 기술자들에게 공지되어 있을 것이다. 또한, 동물 (예를 들어, 사람) 투여의 경우, 제제는 생물학적 표준의 FDA 사무국에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"로는, 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되는 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매 (예를 들어, 물, 알코올성 용액/수용액, 생리 식염수, 비경구 비히클, 예를 들어, 염화 나트륨, 링거 덱스트로오스 등), 비수성 용매 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기산 에스테르, 예를 들어, 에틸올레이트), 분산매, 코팅제, 계면 활성제, 산화 방지제, 보존제 (예를 들어, 항균제 또는 항진균제, 산화 방지제, 킬레이트화제 및 불활성 가스, 등장화제, 흡수 지연제, 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미료, 풍미제, 염료, 유체 및 영양분 보충제, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합이 포함된다. 약제학적 조성물 중 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 널리 공지된 파라미터에 따라 조정된다.
본 출원에 사용되는 유전자의 "파괴"는, 파괴의 부재하의 유전자 산물의 발현 수준과 비교하여, 세포에서 대상 유전자에 의해 인코딩되는 1종 이상의 유전자 산물의 발현의 제거 또는 감소를 지칭한다. 예시적인 유전자 산물은 mRNA 및 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 산물을 포함한다. 일부 경우에서의 파괴는 일시적 또는 가역적이고, 다른 경우에서는 영구적이다. 일부 경우에서의 파괴는, 절단된 또는 비-기능적 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고, 기능적 또는 전장 단백질 또는 mRNA를 생산한다. 본 출원의 일부 실시 형태에서, 유전자 활성 또는 기능은, 발현과 대조적으로, 중단된다. 유전자 파괴는 일반적으로 인위적인 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합체 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 DNA 수준에서와 같은 유전자의 핵산 또는 유전자와 관련된 핵산의 파괴에 의해 유도된다. 유전자 과괴를 위한 예시적인 방법으로는 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 파괴 기술, 예를 들어, 유전자 편집이 포함된다. 이의 예로는 일반적으로 발현의 일시적 감소를 초래하는 RNAi, siRNA, shRNA 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술 뿐만 아니라, 예를 들어, 파쇄의 유도 및/또는 상동 재조합에 의해 표적화된 유전자 불활성화 또는 파괴를 초래하는 유전자 편집 기술이 포함된다. 이의 예로는 삽입, 돌연변이 및 결실이 포함된다. 파괴는 전형적으로 유전자에 의해 인코딩되는 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 억제 및/또는 완전 부재를 초래한다. 예시적인 이러한 유전자 파괴는 전체 유전자의 결실을 비롯하여 유전자 또는 유전자 일부의 삽입, 프레임 이동 및 미스센스 돌연변이, 결실, 녹인 (knock-in), 녹아웃이다. 이러한 파괴는 코딩 영역에서, 예를 들어, 1종 이상의 엑손에서 일어날 수 있으며, 예를 들어, 정지 코돈의 삽입에 의해 전장 산물, 기능적 산물, 또는 임의의 산물의 생성 불능을 초래한다. 이러한 파괴는 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해서 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서의 파괴에 의해 일어날 수 있다. 유전자 파괴에는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 불활성화를 비롯하여 유전자 표적화가 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "이종"이라는 용어는 수여자와 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래되는 것을 지칭한다. 구체적인 경우에서, 이것은 합성되고/되거나 B 세포로부터 유래되지 않은 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 또한 합성적으로 유도된 유전자 또는 유전자 작제물을 지칭한다. 예를 들어, 사이토카인은 당해 사이토카인을 인코딩하는 핵산 서열을 보유하는 벡터에서 B 세포에 제공되는 것을 비롯하여 유전자 재조합에 의해서와 같이 합성적으로 유도되었기 때문에 상기 B 세포에 의해 자연적으로 생산되는 경우에도 상기 B 세포와 관련하여 이종인 것으로 간주될 수 있다.
본 개시 내용은 B 세포의 대규모 확장, CAR 형질 도입, 사이토카인 발현 및 유전자 편집을 위한 신규 접근법에 관한 것이지만, 대안적인 실시 형태에서는 이들 이벤트 중 하나 이상이 상기 B 세포의 생성에 이용되지 않는다. 이러한 접근법은 하나 이상의 사이토카인 유전자를 임의로 발현하는 것에 추가하여 불멸화 B 세포주 유래 (예를 들어, EBV 림프아구 세포주 유래), B 세포 하이브리도마 유래, PBMC 유래, 골수 유래, 말초 혈액 유래, 제대혈 유래 또는 줄기 세포 (예를 들어, 조혈 또는 유도 만능) 유래 B 세포를 다수로 확장시키고 형질 도입하여, 예를 들어, 종양 항원에 대한 특이성을 재지시하도록 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, B 세포의 기능은 일부 예로서 세포 소진 및 종양 유도 기능 장애와 관련된 것들과 같은 유전자(들)를 결실시킴으로써 추가로 개선된다.
특별한 실시 형태에서, 본 개시 내용은 개선된 항체 생산, 개선된 면역 조절 기능, 개선된 지속성, 개선된 수송 또는 이들의 조합을 비롯한 사람 B 세포의 개선된 기능에 기여하는 사람 B 세포에서 단일 또는 다중 유전자의 이종 항원 수용체 형질 도입 및 결실의 조합을 포함한다. 특히, 요법을 위한 B 세포의 생성을 가능하게 하는 대규모 및 GMP 등급 프로토콜이 개시된다. 본 개시 내용의 실시 형태는 환자 자신의 B 세포 또는 입양 전달된 B 세포의 기능을 증진시키는 신규한 면역 치료 접근법을 사용하는 개선된 환자 치료를 포함한다.
II. 방법
본 개시 내용의 실시 형태는 조작된 B 세포를 특히 대규모로 생성하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 방법은 특정 유형의 조작된 B 세포를 생성하기 위해 특정 파라미터의 조합을 이용하며, 여기서, 상기 파라미터는 특정 농도의 시약, 특정 유형의 B 세포 (이펙터 또는 조절 표현형 포함), 하나 이상의 단계에 대한 특정 기간, 특정 유형의 세포 변형 메커니즘 또는 이들의 조합을 포함한다. 통상의 기술자는, 최적의 변수가 본 출원에서 기재되어 있지만, 적합한 양의 조작된 B 세포를 여전히 생성할 방법의 변형이 또한 있으며, 이들도 또한 본 출원에 포함된다는 것을 인식할 것이다.
상기 방법은 일반적으로 연속 단계에 관한 것이며, 구체적인 실시 형태에서, 상기 연속은 B 세포의 확장, CD40L (CD154로도 또한 공지됨)에 의한 형질 도입 또는 형질 감염, CD40L에 의한 형질 도입 또는 형질 감염 이외의 1개, 2개 또는 그 이상의 양태에서 상기 B 세포의 조작 및 생성된 조작된 세포의 확장에 이어서, 임의의 분석 단계 및/또는 개체에 대한 임의의 투여 단계를 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 조작은 (1) 하나 이상의 이종 단백질, 예를 들어, 항원 수용체 및/또는 사이토카인을 발현하도록 상기 세포를 변형시키는 것과 (2) 상기 B 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 감소 (녹다운) 또는 발현 제거 (녹아웃)를 갖도록 상기 세포를 변형시키는 것을 모두 포함한다. 일부 경우에서, (1)은 (2) 전에 일어나는 반면, 다른 경우에서, (2)는 (1) 전에 일어난다. 발현 감소 또는 발현 제거를 갖는 상기 세포의 변형이 임의의 수단에 의해 일어날 수 있지만, 특별한 실시 형태에서, 상기 변형은 CRISPR에 의한 것이다.
상기 방법의 초기 단계는 최종 변형을 위한 B 세포 수의 증가를 가능하게 하는 B 세포의 확장을 포함할 수 있다. 상기 B 세포는, 예를 들어, 새로운 공급원 또는 저장소로부터 또는 상업적으로 수득될 수 있다. 상기 B 세포가 임의의 종류일 수 있지만, 구체적인 실시 형태에서, 상기 B 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 불멸화 B 세포주, B 세포 하이브리도마, 골수, 제대혈 단핵 세포 또는 이들의 혼합물로부터 수득된다. 특별한 실시 형태에서, 상기 확장 단계를 위한 B 세포의 출발 배양물은 적어도 5~100 백만개의 세포를 포함하며, 일부 경우에서, 1x109, 1x1010 또는 1x1011개 또는 그 이상의 세포가 사용된다. 따라서, 구체적인 경우에서, 상기 프로토콜을 개시하기 위한 B 세포의 수는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 백만개 또는 그 이상의 B 세포이다. 5~100, 5~90, 5~75, 5~50, 5~25, 5~10, 10~100, 10~90, 10~75, 10~60, 10~50, 10~25, 25~100, 25~90, 25~75, 25~50, 50~100, 50~90, 50~75, 75~100, 75~90, 또는 90~100 백만개 세포 및 그 사이에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 비롯한 다양한 세포가 상기 방법의 임의의 단계에서 사용될 수 있다.
1. B 세포 확장 및 CD40 리간드에 의한 형질 도입
구체적인 실시 형태에서, 벡터 (레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노 관련 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 포함)로 유전적으로 변형된 B 세포를 생성하기 위한 프로토콜은 하기와 같다:
0 일차에, 상기 B 세포를 적절한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 구체적인 경우에서, 말초 혈액 단핵 세포는 단일 백혈구 연층으로부터 단리된다 (또는 제대혈 단핵 세포는 제대혈로부터 단리된다). CliniMAC 면역 자성 비드를 사용하여 B 세포를 음성적으로 선택할 수 있지만, 특별한 실시 형태에서, 상기 세포를 양성적으로 선택한다. 라벨링되지 않은 B 세포를 수집하고, CliniMAC 완충액으로 세척하고, 완전 SCGM (90% 줄기 세포 성장 배지, GMP 아닌 경우 10% 소 태아 혈청, 또는 GMP 사용의 경우 10% 사람 AB 혈청)과 CpG (3 ug/ml), 항-IgM+IgG (10 ug/ml) 및 IL-4 (4 ng/ml) (조건이 B 세포를 이펙터 또는 조절 표현형을 향해 편중하도록 최적화되는 방법에 따라 IL-2 또는 IL-10 또는 IL-6)에서 0.5x106/ml로 자극한다. 상기 B 세포를 5% CO2하에 37°C에서, 일부 경우에서, 약 44~48 시간 (또는 30~55 시간, 35~50 시간, 40~50 시간 등) 동안 인큐베이션한다.
그 다음, 2 일차 또는 대략 2 일차에, B 세포를 (예를 들어, 이들의 생존 및 증식을 지원하기 위해) CD40 리간드로 형질 도입한다. 이렇게 하기 위해, 하나의 예로서, 인큐베이터에서 37°C에서 5 시간 동안 웰 당 PBS 중에 희석된 1% 레트로넥틴을 1 ml 함유하는 비조직 배양 플레이트를 인큐베이션함으로써 레트로넥틴 형질 도입 플레이트를 제조한다. 그 다음, 상기 레트로넥틴 플레이트를 실온에서 흡인하고, SCGM을 상기 웰에 첨가한다. 배지를 포함하는 플레이트를 10분 동안 인큐베이션한다. 그 다음, 상기 배지를 레트로바이러스 상청액으로 교체하고, 2,000 g 및 32°C에서 2 시간 동안 원심 분리한다. 다음으로, 상기 레트로바이러스 상청액을 새로운 레트로바이러스 상청액으로 교체한다. 0.5x106개 세포를 함유하는 B 세포 현탁액을 IL-4 (4 ng/ml) 및 IL-21 (30 ng/ml) (또는 IL-7을 포함하거나 포함하지 않는 본 출원의 다른 곳에서 언급된 바와 같은 다른 사이토카인) 또는 이들의 조합과 함께 각 웰에 첨가한다. 상기 플레이트를 2,000 g 및 32°C에서 30분 동안 원심 분리한 다음, 5% CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션하고; 형질 도입 후 24 시간에, IL-4 (4 ng/ml) 및 IL-21 (30 ng/ml)과 함께 1 ml의 SCGM를 각 웰에 첨가해야 한다. 5 일차에, CD40L 형질 도입된 B 세포를 플레이트로부터 제거하고, 원심 분리하고, IL-4 (4 ng/ml) 및 IL-21 (30 ng/ml) 또는 이들의 조합을 함유하는 SCGM에서 0.5x106개/ml로 배양한다. 이때, 유세포 측정을 이용하여 CD40L의 형질 도입 효율을 평가할 수 있다. 수확을 할 수 있을 때까지, SCGM/10% 혈청 + IL4 (4 ng/ml) 및 IL21 (30 ng/mL) (또는 확장 목적에 따라 다른 사이토카인)로 확장을 계속한다.
2. B 세포 확장 및 유전자 편집
본 단계에서, CD40L을 발현하는 상기 B 세포는 유전자 편집을 거쳐 상기 B 세포에서 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 중단시키며, 특정 실시 형태에서, 상기 B 세포는 또 다른 이종 분자의 유전자 편집 및/또는 형질 감염 전에 CD40L을 발현하도록 변형된다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 B 세포는 임의의 유전자 편집 단계 전에 임의로 확장된다. 본 출원의 임의의 방법은 상기 방법 중 임의의 지점에서 확장을 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 본 출원의 임의의 방법은 상기 방법 중 언제라도 CD40L에 의한 상기 B 세포의 형질 감염 또는 형질 전환을 이용하거나 이용하지 않을 수 있다.
특정 실시 형태에서, "B 세포 확장 및 CD40 리간드에 의한 형질 도입"에서 상세히 설명된 바와 같이 B 세포 자극 및 CD40 리간 형질 도입을 위한 절차를 따를 수 있다. CD40L 형질 도입 후 약 4~5 일차에, B 세포를 IL-4 (4 ng/ml) 및 IL-21 (30 ng/mL)의 존재하에 SCGM (90% 줄기 세포 성장 배지, GMP 아닌 경우 10% 소 태아 혈청, 또는 GMP 사용의 경우 10% 사람 AB 혈청) 중에 0.5~1 백만개/mL로 재현탁시키고, 하기에 기재된 프로토콜의 예를 사용하여 전기 천공을 수행한다. 1 또는 2개의 유전자를 편집하는 경우, CD40L 형질 도입 후 4~5 일차에 CRISPR-cas9에 대한 전기 천공을 수행한다. 2개 초과의 유전자를 표적화하는 경우, 적어도 일부 경우에서, 상기 제1 전기 천공 후 약 2~3일 동안 세포를 휴지시킨 다음, 목적하는 gRNA로 제2의 CRISPR + 전기 천공을 수행한다. (CRISPR Cas9 적용의 상세한 내용에 대해서는 하기를 참조한다). 파괴하고자 하는 유전자의 수에 따라. 제3, 제4 및 후속 전기 천공 단계가 있을 수 있다. 일부 경우에서, 2개 초과의 유전자를 동일한 전기 천공 단계에서 파괴한다.
3. B 세포 확장, 이종 항원 수용체 형질 도입 +/- 전기 천공
"B 세포 확장 및 CD40 리간드에 의한 형질 도입"에서 상세히 설명된 바와 같이 B 세포 자극 및 CD40 리간 형질 도입을 위한 절차를 따른다.
B 세포를 키메라 항원 수용체로 형질 도입하여 이의 특이성을 재지정할 수 있다. 또한, 이를 케모카인 또는 귀소 수용체, 사이토카인 유전자, 특정 면역글로불린 등으로 형질 도입할 수 있다.
CD40 리간드 형질 도입 후 약 2 내지 3일에 (배양 시작부터 약 4~5 일차에), 37°C에서 5 시간 동안 웰 당 PBS 중에 희석된 1% 레트로넥틴을 1 ml 함유하는 비조직 배양 플레이트를 인큐베이션함으로써 또 다른 레트로넥틴 형질 도입 플레이트를 제조한다. 그 다음, 상기 레트로넥틴 플레이트를 실온에서 흡인하고, SCGM/혈청을 상기 웰에 첨가한다. 배지를 포함하는 플레이트를 10분 동안 인큐베이션한다. 그 다음, 상기 배지를 레트로바이러스 상청액으로 교체하고, 2,000 g 및 32°C에서 2 시간 동안 원심 분리한다. 다음으로, 상기 레트로바이러스 상청액을 새로운 레트로바이러스 상청액으로 교체하고, 0.5x106개 세포를 함유하는 B 세포 현탁액을 IL4 (4 ng/ml) 및 IL21 (30 ng/mL)과 함께 각 웰에 첨가한다. 상기 플레이트를 2,000 g 및 32°C에서 30분 동안 원심 분리한 다음, 5% CO2와 함께 37°C에서 인큐베이션한다. 형질 도입 2일 후, 형질 도입 효율을 확인하고, 수확할 때까지 SCGM/10% 혈청 + IL4 (4 ng/ml) 및 IL21 (30 ng/mL)로 확장을 계속한다.
CRISPR-Cas9 유전자 편집 단계의 경우: 1~2개의 유전자를 표적화하는 경우, CAR 형질 도입의 2~3일 후 (즉, 배양 시작 후 약 6~7 일차에) 세포를 전기 천공한다. 2개 초과의 유전자를 표적화하는 경우, 상기 제1 전기 천공 후 약 2~3일 동안 세포를 휴지시킨 다음, 목적하는 gRNA로 제2의 CRISPR-Cas9 + 전기 천공을 수행한다. (CRISPR Cas9 적용의 상세한 내용에 대해서는 하기를 참조한다).
상기 프로토콜이 다른 CRISPR 프로토콜에 대해 외삽되거나 최적화될 수 있지만, 하기는 CRISPR 프로토콜의 하나의 구체적인 예를 제공한다. Cas9를 본 출원에서 이용되는 임의의 CRISPR 방법에 이용할 수 있지만, 일부 실시 형태에서, CpF1을 대신 이용한다.
crRNA 예비 복합체 형성 및 전기 천공 (Lonza 4D) (5~30 백만개의 B 세포에 대해)
단계 1: crRNA + tracrRNA 듀플렉스를 제조한다
Figure pct00002
crRNA 및 tracrRNA의 시작 농도는 200 uM이다. 이들을 등몰 농도로 혼합한 후의 최종 농도는 100 uM이다.
a. 피펫으로 혼합하고 원심 분리한다.
b. Thermocycler에서 5분 동안 95°C에서 인큐베이션한다.
c. 벤치탑에서 실온으로 냉각시킨다.
단계 2: crRNA: tracrRNA 듀플렉스와 Cas9 뉴클레아제를 합한다
Figure pct00003
Figure pct00004
a. 피펫으로 혼합하고 원심 분리한다.
b. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다.
단계 3: 단계 3으로부터의 crRNA # 1과 crRNA # 2를 합한다
Figure pct00005
Figure pct00006
단계 4: 전기 천공을 수행한다
a. IL-4 및 IL21과 함께 배지 (우선적으로는 항생제 무함유)로 배양 플레이트를 제조한다.
b. 5E+106개 세포를 제조하고 (PBS로 2회 세척하여 FBS를 제거함), 사용 직전에 100 ul의 P3 일차 세포 Nucleofector 용액 중에 재현탁시킨다.
c. 세포 현탁액과 RNP (최종 Cas9 농도는 4.6 uM이고, gRNA 농도는 4 uM임)를 혼합하고, 뉴클루오큐벳 (nucluocuvette)으로 옮기고, 뚜껑을 제자리에 클릭한다.
d. 전기 천공 프로그램은 EO-115이다.그 다음, 상기 세포를 상기 배양 플레이트에 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 회복되도록 한다.
e. 최대 5E+106-X 유닛 (카탈로그: AAF-1002X) (최종 제품의 20 ul이면 충분하며, 최종 농도에 대해서는 상기를 참조함).
f. 최대 30x106개까지 전기 천공하기 위해, 1 ml의 LV 키트 L 유닛 (카탈로그 번호: V4LC-2002)을 사용한다.
g. 최대 100x106개 또는 그 이상까지 전기 천공하기 위해, 1 ml의 LV 키트 L 유닛 (카탈로그 번호: AAF-1002L)을 사용한다.
h. 총 세포 수를 5x106으로 나눈 다음 단계 3으로부터의 RNP 복합체의 최종 양을 곱하여 필요한 RNP 복합체의 총량을 계산한다.
i. 예: 세포 수가 30x106개인 경우, 30x106/5x106 = 6, 따라서, 6 x 20 ul = 120 ul을 사용한다.
j. 예: 세포 수가 100x106개인 경우, 100x106/5x106 = 20, 따라서, 20 x 20 ul = 400 ul을 사용한다.
CRISPR CAS9: 소규모 프로토콜 (0.25~3 백만개의 시작 세포 집단)
1. sgRNA-Cas9 예비 복합체 형성 및 전기 천공 (Neon-Thermo Fisher)
a. 가까운 영역에 걸쳐 있는 1 또는 2개의 sgRNA를 각 유전자에 대해 설계하고 사용하였다. 1.5 ug cas9 (PNA Bio) 및 500 ng sgRNA (모든 sgRNA의 합계) 반응을 각 유전자에 대해 수행하고, 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션하였다.
b. 20분 후 T 완충액* (Neon 전기 천공 키트과 함께 포함됨, Invitrogen, RNP 복합체 및 세포를 함유하는 총 부피는 14 ul이어야 함) 중에 재현탁된 250,000개의 B 세포를 첨가하고, Neon 형질 감염 시스템을 사용하여 10 ul의 전기 천공 팁으로 전기 천공한다.
c. 전기 천공 조건은 B 세포에 대해 1,600 V, 10 ms 및 3 펄스이다. 그 다음, 상기 세포를 배지 및 사이토카인 (IL4 및 IL21)을 함유하는 배양 플레이트에 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 회복되도록 한다.
2. crRNA 예비 복합체 형성 및 전기 천공 (Neon-Thermo Fisher)
단계 1: crRNA + tracrRNA 듀플렉스를 제조한다
Figure pct00007
crRNA 및 tracrRNA의 시작 농도는 200 uM이다. 이들을 등몰 농도로 혼합한 후의 최종 농도는 44 uM이다.
d. 피펫으로 혼합하고 원심 분리한다.
e. Thermocycler에서 5분 동안 95°C에서 인큐베이션한다.
f. 벤치탑에서 실온으로 냉각시킨다.
단계 2: cas9 뉴클레아제를 제조한다
Figure pct00008
단계 3: crRNA: tracrRNA 듀플렉스와 Cas9 뉴클레아제를 합한다
Figure pct00009
Figure pct00010
g. 피펫으로 혼합하고 원심 분리한다.
h. 상기 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다.
단계 4: 단계 3으로부터의 crRNA # 1과 crRNA # 2를 합한다
Figure pct00011
Figure pct00012
Step 5: 전기 천공을 수행한다.
● 웰 당 250,000개의 세포를 제조하고, 사용 직전에 7.5 ul의 T 완충액 중에 재현탁시킨다.
● 전기 천공 조건은 1,600 V, 10 ms 및 3 펄스이다. 그 다음, 상기 세포를 배양 플레이트에 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 회복되도록 한다.
상기 프로토콜의 확장 단계(들)과 관련하여, 특별한 실시 형태에서, 확장 단계가 일어나는 상기 배지는 하나 이상의 사이토카인과 같은 확장을 용이하게 하는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 배지 중 사이토카인의 농도는 100~300 유닛/mL의 범위, 예를 들어, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 유닛/mL, 또는 1~500 nM 또는 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위이다. 상기 사이토카인은 상기 B 세포에 대해 목적하는 표현형 (이펙터 또는 조절 표현형)에 따라 IL4, IL2, IL10, IL-21 또는 IL6 또는 이들의 조합일 수 있다. 임의의 확장 단계는 35°C, 36°C, 37°C 또는 38°C를 비롯한 약 35°C~38°C와 같은 특정 온도에서 일어날 수 있다. 임의의 확장 단계는 3%~7% CO2와 같은 특정 수준의 산소에서 일어날 수 있으며; 구체적인 실시 형태에서, 상기 확장 단계는 3%, 4%, 5%, 6% 또는 7% CO2에서 일어난다. 임의의 확장 단계는 특정 일 수와 같은 특정 기간 동안 지속될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 확장 단계는 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상 동안 지속되지만, 구체적인 실시 형태에서, 상기 확장 단계는 4~7, 4~6, 4~5, 5~6, 5~7 또는 6~7일 지속된다. 특별한 실시 형태에서, 상기 확장 단계 중의 상기 배지는 확장 동안 교체되거나 교체되지 않을 수 있지만, 구체적인 실시 형태에서, 확장 단계 개시 후 3 일차에, 상기 배지는 교체된다. 배지는 이전과 동일한 배지 조성 또는 상이한 배지 조성으로 변경되도록 교체될 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 세포를 원심 분리하고, 이전과 동일하거나 유사한 배지, 예를 들어, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 유닛/mL의 사이토카인을 포함하는 배지 중에서 재현탁시킨다. 구체적인 양태에서, 상기 확장 단계는 기체 투과성 생물 반응기, 예를 들어, G-Rex®100M 또는 G-Rex100®과 같은 생물 반응기에서 일어난다. 특정 양태에서, 상기 생물 반응기는 기체 투과성 생물 반응기이다. 특별한 양태에서, 상기 기체 투과성 생물 반응기는 G-Rex®100M 또는 G-Rex100®이다. 일부 양태에서, 단계 (b)의 자극은 특정 부피의 배지, 예를 들어, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5 L의 배지와 같은 3~5 L의 배지 중에서 수행된다.
상기 B 세포의 확장 개시 후 약 2 일차에, CD40L에 의한 형질 도입을 통해 상기 확장된 B 세포를 변형시킬 수 있다. CD40 L 형질 도입 후 약 2~3 일차에 (배양 개시 후 4~5 일차에), 상기 세포를 하나 이상의 이종 유전자, 예를 들어, 하나 이상의 이종 항원 수용체, 하나 이상의 케모카인 수용체, 하나 이상의 귀소 수용체, 하나 이상의 사이토카인 유전자 및/또는 하나 이상의 면역글로불린으로 형질 도입 또는 형질 감염시킬 수 있다.
CD40L 형질 도입 또는 형질 감염 후의 변형은 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하기 위한 상기 B 세포의 형질 도입 또는 형질 감염일 수 있지만, 일부 경우에서, CD40L 형질 도입 또는 형질 감염 후의 변형은 상기 B 세포의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 중단시키는 것이다. 변형이 이종 항원 수용체를 발현하기 위한 상기 B 세포의 형질 도입 또는 형질 감염일 때, 후속 변형은 상기 B 세포의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 중단시키는 것일 수 있다. 변형이 상기 B 세포의 하나 이상의 내인성 유전자의 발현을 중단시키는 것일 때, 후속 변형은 이종 항원 수용체를 발현하기 위한 상기 B 세포의 형질 도입 또는 형질 감염이다.
구체적인 실시 형태에서, 하나 이상의 내인성 유전자의 발현 중단을 위해 상기 세포를 유전자 편집하기 전에, 이종 항원 수용체 유전자를 보유하도록 상기 확장된 B 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시킨다. 특별한 실시 형태에서, 하나 이상의 키메라 항원 수용체, 하나 이상의 T 세포 수용체 또는 이들의 조합을 인코딩하는 발현 작제물을 포함하는 특정 벡터로 상기 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시킨다. 상기 벡터는 적어도 나노 입자, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 벡터 등을 비롯한 임의의 종류일 수 있다. 상기 B 세포가 이종 항원 수용체(들), 자살 유전자 및 하나 이상의 사이토카인, 예를 들어, IL-4, IL-10, IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 이종 사이토카인과 같은 다중 이종 단백질을 발현하도록 하는 벡터로 상기 B 세포를 형질 감염 또는 형질 도입시킬 수 있다. 상기 다중 이종 단백질에 대한 유전자가 동일한 벡터에 존재할 수 있지만, 일부 경우에서, 이는 다중 벡터에 존재한다. 상기 세포가 형질 도입 또는 형질 감염되면, 이를 상기 이종 단백질(들)의 발현에 대해 테스트할 수 있으며, 이는 형질 감염/형질 도입의 1, 2, 3일 또는 그 이상 후에 일어날 수 있다. 변형 (형질 도입 또는 형질 감염)된 B 세포 집단의 분취량을 테스트할 때, 상기 B 세포의 유전자 편집 이전과 같은 추가의 변형 이전에 상기 테스트를 수행하거나 수행하지 않을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 B 세포, 예를 들어, 변형된 B 세포의 확장 개시 후 약 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 이내에 유전자 편집 방법을 겪을 수 있다. 상기 유전자 편집 단계는 형질 감염/형질 도입 단계 후 1, 2, 3일 또는 그 이상 이내에 일어나거나 일어나지 않을 수 있다. 상기 변형된 B 세포의 유전자 편집은 임의의 적합한 방법에 의해 일어날 수 있지만, 특별한 실시 형태에서, 상기 B 세포 (변형된 B 세포 포함)의 유전자 편집은 CRISPR 방법에 의해 일어난다. 따라서, 특별한 실시 형태에서, 상기 변형된 세포를 적합한 양의 Cas9 및 가이드 RNA에 노출시킨다. 상기 B 세포의 1개 초과의 유전자를 발현에 대해 파괴해야 하는 경우, 편집하고자 하는 각각의 목적하는 유전자에 대한 하나 이상의 서열 특이적 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 그룹이 있을 수 있다. 특별한 실시 형태에서, 상기 변형된 B 세포는 1, 2, 3일 또는 그 이상 만큼 시간적으로 분리된 2개 이상의 상이한 전기 천공 단계에 적용된다. 이러한 경우에서, 제1 전기 천공 단계는 하나 이상의 유전자를 표적화하는 것을 포함하며, 제2 전기 천공 단계는 상기 제1 전기 천공 단계에서와 상이한 유전자인 하나 이상의 유전자를 표적화하는 것을 포함한다. 일부 경우에서, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 추가의 전기 천공 단계를 포함하여 2개의 전기 천공 단계를 초과하는 연속적인 전기 천공 단계가 있다. 다중 전기 천공 단계를 사용하는 임의의 경우에서, 다음 전기 천공은 특정 기간 후에만, 예를 들어, 이전 전기 천공 단계 이후 1, 2, 3, 4일 또는 그 이상 후에만 일어나거나 일어나지 않을 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 B 세포는 먼저 유전자 편집 단계에 이어서 형질 도입 또는 형질 감염 단계를 거쳐 이종 항원 수용체 유전자를 보유한다.
상기 B 세포의 유전자 편집 및 형질 전환/형질 도입 후, 상기 B 세포는 변형된 유전자 편집된 B 세포의 수를 증가시키기 위해 제2 확장 단계를 거치거나 거치지 않을 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 방법의 제2 또는 후속 확장 단계는 상기 방법의 상기 제1 확장 단계와 실질적으로 동일할 수 있지만, 대안적 실시 형태에서, 상기 제2 또는 후속 확장 단계는 상이한 배지, 상이한 외인성 첨가된 화합물, 배양/확장을 위한 상이한 기간, 몇 가지 예를 들면 GREX 또는 WAVE 또는 이들의 조합과 같은 상이한 확장 플라스크 등을 갖는 것과 같이 상기 제1 확장 단계와 상이하다. 구체적인 경우에서, 상기 제2 또는 후속 확장 단계는 상기 변형된 유전자 편집된 B 세포를 특정한 하나 이상의 사이토카인과 함께 배양하는 것을 포함한다.
상기 방법의 임의의 단계에서, 상기 세포를 이용, 분석, 저장 등을 할 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 세포를 기능성, 세포독성, 생체내 활성 등에 대해 분석한다. 예를 들어, 상기 세포를 (1) 표적 항원에 결합하는 이종 항원 수용체의 능력; (2) 발현의 녹다운 또는 녹아웃을 확인하기 위한 상기 편집된 유전자의 발현 또는 이의 결여; 또는 (3) 둘 다에 대해 분석할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 세포는, 예를 들어, 질량 분광법 및/또는 RNA 서열 분석을 거친다.
특별한 실시 형태에서, 상기 생성된 B 세포를, 예를 들어, 냉동 보존과 같이 저장한다. 예를 들어, 출발 B 세포를 수득한 개체가 사용하기 위해 상기 B 세포를 냉동 보존할 수 있거나, 출발 B 세포를 수득한 개체와 상이한 개체가 사용하기 위해 상기 B 세포를 냉동 보존할 수 있다.
III. 이종 항원 수용체
본 개시 내용의 B 세포는 조작된 TCR, CAR, 키메라 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 이들의 조합 등과 같은 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 상기 이종 항원 수용체는 사람의 손에 의해 합성적으로 생산된다. 특별한 실시 형태에서, 상기 B 세포는 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 하나 이상의 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 변형된다. 예를 들어, 상이한 항원에 대한 다중 CAR 및/또는 TCR은 상기 B 세포에 첨가될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 면역 세포는 CRISPR를 사용하는 것과 같이 특정 유전자좌에서 CAR 또는 TCR의 녹인 (knock-in)에 의해 CAR 또는 TCR을 발현하도록 조작된다.
상기 B 세포가 특히 CRISPR를 사용하여 편집되지만, 대안적인 적합한 변형 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook and Ausubel, 상기와 동일]을 참조한다. 예를 들어, 상기 세포는 문헌 [Heemskerk et al., 2008] 및 [Johnson et al., 2009]에 기재된 형질 도입 기법을 사용하여 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 TCR을 발현하도록 형질 도입될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 인코딩하는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산, 및 이러한 핵산의 유전자 조작된 산물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종인데, 즉, 조작되는 세포 및/또는 이러한 세포가 유래되는 유기체에서 통상적으로 발견되지 않는 또 다른 유기체 또는 세포로부터 수득된 것과 같이 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플 중에 존재하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 핵산은 자연적으로 발생하지 않는데, 예를 들어, 자연에서 발견되지 않는 핵산 (예를 들어, 키메라)이다.
일부 실시 형태에서, 상기 B 세포는 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 세포외 항원 인식 도메인을 포함하는 것과 같은 CAR을 발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 상기 항원은 암 세포의 표면 상을 비롯한 세포의 표면 상에서 발현되는 단백질이다. 일부 실시 형태에서, CAR은 TCR 유사 CAR이며, 상기 항원은 가공된 펩타이드 항원, 예를 들어, TCR과 같이 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원이다.
CAR 및 재조합 TCR을 비롯한 예시적 항원 수용체 뿐만 아니라, 수용체를 조작하고 세포에 도입하기 위한 방법은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2000/14257, WO 2013/126726, WO 2012/129514, WO 2014/031687, WO 2013/166321, WO 2013/071154, WO 2013/123061, 미국 출원공개 US 2002/131960, US 2013/287748, US 2013/0149337, 미국 특허 US 6,451,995, US 7,446,190, US 8,252,592, US 8,339,645, US 8,398,282, US 7,446,179, US 6,410,319, US 7,070,995, US 7,265,209, US 7,354,762, US 7,446,191, US 8,324,353 및 US 8,479,118, 유럽 특허 출원 EP 2537416에 기재된 것들, 및/또는 문헌 [Sadelain et al., 2013]; [Davila et al., 2013]; [Turtle et al., 2012]; [Wu et al., 2012]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 조작된 항원 수용체로는 미국 특허 US 7,446,190에 기재된 바와 같은 CAR 및 국제공개공보 WO 2014/055668 A1에 기재된 것들이 포함된다.
A. 키메라 항원 수용체
일부 실시 형태에서, CAR은 다음을 포함한다: a) 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인, b) 막 관통 도메인 및 c) 하나 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인. 상기 세포외 도메인이 2개 이상의 항원 결합 영역을 포함하는 경우, 상기 2개 이상의 항원은 상이한 항원이며, 예를 들어, 일부 경우에서, 동일한 세포 또는 동일한 유형의 세포의 표면 상에 발현되는 상이한 항원이다.
일부 실시 형태에서, 조작된 항원 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 공동 자극 CAR (국제공개공보 WO 2014/055668 참조) 및/또는 억제 CAR (iCAR, 문헌 [Fedorov et al., 2013] 참조)을 비롯한 CAR을 포함한다. CAR은 일반적으로 일부 양태에서는 링커들 및/또는 막 관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된 세포외 항원 (또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 이러한 분자들은 전형적으로 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동 자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 근사한다.
본 개시 내용의 특정 실시 형태는 세포내 신호 전달 도메인, 막 관통 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키기 위해 사람화된 CAR (hCAR)을 비롯하여 항원 특이적 CAR 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 비롯한 핵산의 용도에 관한 것이다. 특정 실시 형태에서, CAR은 하나 이상의 항원들 사이의 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 결합 영역은 단클론 항체의 상보성 결정 영역, 단클론 항체의 가변 영역 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 특이성은 수용체에 결합하는 펩타이드 (예를 들어, 사이토카인)로부터 유래한다.
사람 CAR 핵산은 사람 환자에 대한 세포 면역 요법을 증진시키는데 사용되는 사람 유전자일 수 있는 것으로 고려된다. 구체적인 실시 형태에서, 본 발명은 전장 CAR cDNA 또는 코딩 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 7,109,304에 기재된 것들과 같은 특정 사람 단클론 항체로부터 유래된 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편은 또한 사람 항원 특이적 항체의 다수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서, 상기 단편은 사람 세포에서 발현을 위한 사람 코돈 용법에 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원 특이적 scFv이다.
정렬은 디아바디 또는 다량체와 같은 다량체일 수 있다. 상기 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 페어링에 의해 디아바디로 형성될 가능성이 높다. 작제물의 힌지 부분은, 완전히 결실된 것에서부터, 제1 시스테인이 유지된 것, 세린 보다는 오히려 프롤린 치환, 제1 시스테인까지 절단된 것까지, 여러 대체물을 가질 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화하는 임의의 단백질은 이러한 목적을 제공할 수 있다. Fc 도메인, 예를 들어, 사람 면역글로불린 유래의 CH2 또는 CH3 도메인 중 단지 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량체화를 개선시키기 위해 변형된 사람 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파의 일부를 사용할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 CAR 핵산은 막 관통 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호 전달 도메인과 같은 다른 공동 자극 수용체 도메인을 인코딩하는 서열을 포함한다. 구체적인 공동 자극 수용체로는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10, DAP12 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. CD3ζ에 의해 개시된 원발성 신호에 추가하여, 사람 CAR에 삽입된 사람 공동 자극 수용체에 의해 제공된 추가의 신호는 B 세포의 완전한 활성화에 중요하며, 입양 면역 요법의 생체내 지속성 및 치료학적 성공의 개선을 보조할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 입양 요법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예를 들어, 암 마커 및/또는 약화된 반응을 유도하도록 의도되는 항원, 예를 들어, 정상 또는 비-질환 세포 유형 상에 발현되는 항원과 같은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 갖는 CAR이 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 이의 세포외 부분에서 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, CAR은 단클론 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유래된 단일 쇄 항체 단편 (scFv)와 같은 항체 분자의 항원 결합 부분 또는 부분들을 포함한다.
키메라 항원 수용체의 특정 실시 형태에서, 수용체의 항원 특이적 부분 (항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로서 지칭될 수 있음)은 종양 관련 항원 또는, 일부 경우에서, 병원체 특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원은 덱틴-1과 같은 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적 실시 형태로는 CD19, CD20, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등이 포함된다. 특정 실시 형태에서, 상기 CAR은 사이토카인과 공동 발현되어, 낮은 양의 종양 관련 항원이 있을 때 지속성을 개선시킬 수 있다. 이러한 경우, 상기 사이토카인은 상기 CAR 단백질의 일부가 아니다. 예를 들어, CAR은 IL-4, IL-10, IL-7, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 사이토카인과 공동 발현될 수 있다.
키메라 수용체를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 합성될수 있거나 (예를 들어, PCR을 통해), 이들의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라, 인트론이 mRNA를 안정화시키는 것으로 밝혀켰기 때문에, cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화시키기 위해 내인성 또는 외인성 비-코딩 영역을 사용하는 것이 추가로 유리할 수 있다.
키메라 작제물은 네이키드 (naked) DNA로서 또는 적합한 벡터로 면역 세포 내에 도입될 수 있는 것으로 고려된다. 네이키드 DNA를 사용하는 전기 천공에 의해 세포를 안정하게 형질 감염시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,410,319를 참조한다. 네이키드 DNA는 일반적으로 발현을 위한 적당한 배향으로 플라스미드 발현 벡터 내에 함유된 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 지칭한다.
일부 경우에서, 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터)를 사용하여 키메라 작제물을 면역 세포 내에 도입할 수 있다. 본 개시 내용의 방법에 따라 사용하기에 적합한 벡터는 면역 세포에서 비복제성이다. 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 하는 벡터와 같은, 세포에 유지되는 바이러스의 카피 수가 세포의 생존력을 유지하기에 충분히 낮은 바이러스를 기반으로 하는 다수의 벡터가 공지되어 있다.
일부 양태에서, 항원 특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막 관통 및 세포내 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 실시 형태에서, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막 관통 도메인을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 자연적으로 CAR 내 도메인 중 하나와 연합된 막 관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 상기 막 관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막 관통 도메인에 결합하는 것을 방지하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 실시 형태에서, 상기 막 관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래한다. 상기 공급원이 천연인 경우, 일부 양태에서는 도메인이 임의의 막결합 또는 막 관통 단백질로부터 유래한다. 막 관통 영역으로는 T 세포 수용체, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D 및 DAP 분자의 알파, 베타 또는 제타 쇄 (즉, 이들의 적어도 막 관통 영역(들) 포함)로부터 유래된 것들이 포함된다. 대안으로, 일부 실시 형태에서는 막 관통 도메인이 합성이다. 일부 양태에서, 합성 막 관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
특정 실시 형태에서, B 세포와 같은 면역 세포를 유전적으로 변형시키기 위해 본 출원에서 기재된 플랫폼 기술은 (i) 전기 천공 장치 (예를 들어, 뉴클레오펙터)를 사용하는 비-바이러스 유전자 전달, (ii) 엔도도메인 (예를 들어, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ 또는 다른 조합)을 통해 신호를 전달하는 CAR, (iii) 항원 인식 도메인을 세포 표면에 연결하는 다양한 길이의 세포외 도메인을 갖는 CAR, 및 일부 경우에는 (iv) CAR+ 면역 세포를 강력하고 수적으로 확장시킬 수 있도록 K562로부터 유래된 인공 항원 제시 세포 (artificial antigen presenting cell: aAPC)를 포함한다 (문헌 [Singh et al., 2008]; [Singh et al., 2011]).
B. T 세포 수용체 (TCR)
일부 실시 형태에서, 상기 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연 발생 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 쇄 (각각 TCRα 및 TCRβ로서도 또한 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 쇄 (각각 TCRγ 및 TCRδ로서도 또한 공지됨)를 함유하고 MHC 수용체에 결합된 항원 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 αβ 형태이다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 특유의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 여기서, 이것은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 담당한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janeway et al, 1997] 참조). 예를 들어, 일부 양태에서, TCR의 각 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막 관통 영역 및 C-말단의 짧은 세포질 꼬리를 보유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 신호 전달을 매개하는데 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 연관된다. 달리 명시되지 않는다면, "TCR"이라는 용어는 이의 기능적 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 비롯하여 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본 출원의 목적상, TCR에 대한 언급은 임의의 TCR 또는 기능적 단편, 예를 들어, MHC 분자, 즉, MHC-펩타이드 복합체에 결합된 특정 항원성 펩타이드에 결합하는 TCR의 항원 결합 부분을 포함한다. 상호 교환적으로 사용될 수 있는 TCR의 "항원 결합 부분" 또는 항원 결합 단편"은, TCR의 구조적 도메인의 일부를 함유하지만 완전한 TCR이 결합하는 항원 (예를 들어, MHC-펩타이드 복합체)에 결합하는 분자를 지칭한다. 일부 경우에서, 항원 결합 부분은 TCR의 가변 도메인, 예를 들어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 결합을 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 쇄 및 가변 β 쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 함유하며, 여기서, 일반적으로, 각각의 쇄는 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 실시 형태에서, TCR 쇄의 가변 도메인들은, TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 항원 인식을 부여하고 펩타이드 특이성을 결정하는, 면역글로불린과 유사한 루프 또는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)을 형성하기 위해 연합한다. 전형적으로, 면역글로불린 처럼, CDR은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된다 (예를 들어, 문헌 [Jores et al., 1990]; [Chothia et al., 1988]; [Lefranc et al., 2003] 참조). 일부 실시 형태에서, CDR3은 가공된 항원을 인식하는 역할을 하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩타이드의 N-말단부와 상호 작용하는 것으로 나타난 반면, 베타 쇄의 CDR1은 펩타이드의 C-말단부와 상호 작용한다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 생각된다. 일부 실시 형태에서, β 쇄의 가변 영역은 초가변 (HV4) 영역을 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 TCR 쇄는 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 면역글로불린 처럼, TCR 쇄 (예를 들어, α 쇄, β 쇄)의 세포외 부분은 N-말단에서 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, Va 또는 Vp; 전형적으로 Kabat 넘버링 (문헌 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.])을 기준으로 1 내지 116번 아미노산), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α 쇄 불변 도메인 또는 Ca, 전형적으로 Kabat를 기준으로 117 내지 259번 아미노산, β 쇄 불변 도메인 또는 Cp, 전형적으로 Kabat를 기준으로 117 내지 295번 아미노산)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 2개의 쇄에 의해 형성되는 TCR의 세포외 부분은 CDR을 함유하는 2개의 막 근위 불변 도메인 및 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성하는 짧은 연결 서열을 함유하여, 2개의 쇄 사이를 연결한다. 일부 실시 형태에서, TCR은 TCR이 불변 도메인에서 2개의 디설파이드 결합을 함유하도록 α 및 β 쇄 각각에서 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 TCR 쇄는 막 관통 도메인을 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 막 관통 도메인은 양으로 하전되어 있다. 일부 경우에서, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에서, 상기 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 연합할 수 있게 한다. 예를 들어, 막 관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시키고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 연합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유 동물의 3개의 특유의 쇄 (γ, δ 및 ε) 및 ζ 쇄를 보유할 수 있는 다중 단백질 복합체이다. 예를 들어, 포유 동물에서, 상기 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, 및 CD3ζ 쇄의 동종 이량체를 함유할 수 있다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 함유하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 높은 관련 세포 표면 단백질이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 막 관통 영역은 음으로 하전되어 있으며, 이는 이러한 쇄들이 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특징이다. CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리 각각은 면역 수용체 타이로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호 전달 능력에 관여한다. 이러한 보조 분자들은 음으로 하전된 막 관통 영역을 가지며 신호를 TCR로부터 세포로 전파하는 역할을 수행한다. CD3 쇄 및 ζ 쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로서 공지된 것을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 TCR은 2개의 쇄 α 및 β (또는 임의로 γ 및 δ)의 이종 이량체일 수 있거나, 이것은 단일쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 TCR은, 예를 들어, 디설파이드 결합 또는 다설파이드 결합들에 의해 연결된 2개의 별개의 쇄 (α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 함유하는 이종 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 TCR을 동정하고 세포에 도입한다. 일부 실시 형태에서, TCR을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, 공중에게 이용 가능한 TCR DNA 서열의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCR은 생물학적 공급원으로부터, 예를 들어, T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공중에게 이용 가능한 공급원과 같은 세포로부터 수득된다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 생체내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 높은 친화성 T 세포 클론은 환자 및 단리된 TCR로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 사람 면역계 유전자 (예를 들어, 사람 백혈구 항원 시스템 또는 HLA)로 조작된 형질 전환 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원 (예를 들어, 문헌 [Parkhurst et al., 2009] 및 [Cohen et al., 2005] 참조)을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 파지 디스플레이를 사용하여 표적 항원에 대한 TCR을 단리한다 (예를 들어, 문헌 [Varela-Rohena et al., 2008] 및 [Li, 2005] 참조). 일부 실시 형태에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성으로 생성될 수 있다.
C. 항원 제시 세포
대식 세포, B 림프구 및 수지상 세포를 비롯한 항원 제시 세포는 특정 MHC 분자의 발현에 의해 구분된다. APC는 항원에 침투하여 이의 외부 세포막 상의 MHC 분자와 함께 당해 항원의 일부를 재발현시킨다. 상기 MHC는 다중 유전자좌를 갖는 대형 유전자 복합체이다. MHC 유전자좌는 클래스 I 및 클래스 II MHC로 지칭되는 2개의 주요 클래스의 MHC 막 분자를 인코딩한다. T 보조 림프구는 일반적으로 MHC 클래스 II 분자와 관련된 항원을 인식하며, T 세포독성 림프구는 MHC 클래스 I 분자와 관련된 항원을 인식한다. 사람에서, MHC는 HLA 복합체로서 지칭되며, 마우스에서는 H-2 복합체로서 지칭된다.
일부 경우에서, aAPC는 실시 형태의 치료학적 조성물 및 세포 치료제를 제조하는데 있어서 유용하다. 항원 제시 시스템의 제조 및 사용에 관한 일반적 가이드에 대해, 예를 들어, 미국 특허 US 6,225,042, US 6,355,479, US 6,362,001 및 US 6,790,662; 미국 출원공개 US 2009/0017000 및 US 2009/0004142; 및 국제공개공보 WO 2007/103009를 참조한다.
aAPC 시스템은 적어도 하나의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 사용될 수 있다. 상기 보조 분자는 공동 자극 분자 및 부착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공동 자극 분자로는 CD86, CD64 (FcγRI), 41BB 리간드 및 IL-21이 포함된다. 부착 분자로는 셀렉틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막 관통 결합 당단백질, 카데린과 같은 칼슘 의존적 단백질, 및, 예를 들어, 세포 대 세포 또는 세포 대 기질 접촉을 촉진하는, 세포내 부착 분자 (intercellular adhesion molecule: ICAM)와 같은 단일 통과 막 관통 면역글로불린 (Ig) 수퍼패밀리 단백질이 포함될 수 있다. 예시적인 부착 분자로는 LFA-3 및 ICAM, 예를 들어, ICAM-1이 포함된다. 공동 자극 분자 및 부착 분자를 비롯한 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기법, 방법 및 시약은, 예를 들어, 미국 특허 US 6,225,042, US 6,355,479 및 US 6,362,001에 예시되어 있다.
D. 항원
유전자 조작된 항원 수용체에 의해 표적화된 항원들 중에서, 입양 세포 요법을 통해 표적화되는 질환, 병태 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 것들이 있다. 질환 및 병태 중에서, 혈액학적 암, 면역계의 암, 예를 들어, 림프종, 백혈병 및/또는 골수종, 예를 들어, B, T 및 골수성 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종을 포함한 암 및 종양을 비롯한 증식성, 신생물성 및 악성 질환 및 장애가 있다. 일부 실시 형태에서, 항원은, 정상 또는 비표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 병태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 실시 형태에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/되거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
임의의 적합한 항원은 본 방법에서 표적화될 수 있다. 상기 항원은 특정 암 세포와 관련될 수 있지만, 일부 경우에서, 비-암성 세포와 관련되지 않는다. 예시적인 항원으로는 감염체, 자가/자기 항원, 종양/암 관련 항원 및 종양 신생 항원으로부터의 항원 분자가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다 (문헌 [Linnemann et al., 2015]). 특별한 양태에서, 상기 항원으로는 NY-ESO, EGFRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 및 CEA가 포함된다. 특별한 양태에서, 2개 이상의 항원 수용체에 대한 항원으로는 CD19, EBNA, WT1, CD123, NY-ESO, EGFRvIII, MUC1, HER2, CA-125, WT1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4 및/또는 CEA가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항원들의 서열은 당해 분야, 예를 들어, GenBank® 데이터 베이스에서 공지되어 있다: CD19 (수탁 번호 NG_007275.1), EBNA (수탁 번호 NG_002392.2), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), CD123 (수탁 번호 NC_000023.11), NY-ESO (수탁 번호 NC_000023.11), EGFRvIII (수탁 번호 NG_007726.3), MUC1 (수탁 번호 NG_029383.1), HER2 (수탁 번호 NG_007503.1), CA-125 (수탁 번호 NG_055257.1), WT1 (수탁 번호 NG_009272.1), Mage-A3 (수탁 번호 NG_013244.1), Mage-A4 (수탁 번호 NG_013245.1), Mage-A10 (수탁 번호 NC_000023.11), TRAIL/DR4 (수탁 번호 NC_000003.12) 및/또는 CEA (수탁 번호 NC_000019.10).
종양 관련 항원은 전립선암, 유방암, 결장직장암, 폐암, 췌장암, 신암, 중피종 암, 난소암, 간암, 뇌암, 골암, 위암, 비장암, 고환암, 자궁 경부암, 항문암, 담낭암, 갑상선암 또는 흑색종 암으로부터 유래될 수 있다. 예시적인 종양 관련 항원 또는 종양 세포 유래 항원으로는 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4 (또는 국제공개공보 WO 99/40188에 개시된 것들과 같은 다른 MAGE 항원); PRAME; BAGE; RAGE, Lage (NY ESO 1로도 또한 공지됨); SAGE; 및 HAGE 또는 GAGE가 포함된다. 종양 항원의 이러한 비제한적인 예들은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다. 예를 들어, 미국 특허 US 6,544,518을 참조한다. 전립선암 종양 관련 항원으로는, 예를 들어, 전립선 특이적 막 항원 (prostate specific membrane antigen: PSMA), 전립선 특이적 항원 (prostate-specific antigen: PSA), 전립선 산성 포스페이트, NKX3.1, 및 전립선의 6개 막 관통 상피 항원 (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate: STEAP)이 포함된다.
기타 종양 관련 항원으로는 Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto 및 Criptin이 포함된다. 추가로, 종양 항원은 다수의 암 치료에 유용한, 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬 (GnRH)과 같은 자가 펩타이드 호르몬, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다.
종양 항원으로는 HER-2/neu 발현과 같은 종양 관련 항원 발현을 특징으로 하는 암에서 유래된 종양 항원이 포함된다. 관심 대상 종양 관련 항원은 계통 특이적 종양 항원, 예를 들어, 멜라닌 세포 흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 타이로시나아제 및 타이로시나아제 관련 단백질을 포함한다.
예시적인 암 항원으로는 CD19, EBNA, CD123, HER2, CA-125, TRAIL/DR4, CD20, CD70, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CD56, AKT, Her3, 상피 종양 항원, CD319 (CS1), ROR1, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, CD5, CD23, CD30, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99, p53, 돌연변이된 p53, Ras, 돌연변이된 Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나아제 (예를 들어, A-Raf, B-Raf 및 C-Raf, 사이클린 의존적 키나아제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, 흑색종 관련 항원, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MC1R, mda-7, gp75, Gp100, PSA, PSM, 타이로시나아제, 타이로시나아제 관련 단백질, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시타이드 3-키나아제 (Phosphoinositide 3-kinase: PI3K), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 윌름스 종양 항원 (WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HAGE, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달 인자 1 (Tumor-associated calcium signal transducer 1: TACSTD1), TACSTD2, 수용체 타이로신 키나아제 (예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor receptor: EGFR) (특히, EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (platelet derived growth factor receptor: PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (vascular endothelial growth factor receptor: VEGFR)), VEGFR2, 세포질 타이로신 키나아제 (예를 들어, src 계열, syk-ZAP70 계열), 인테그린 연결 키나아제 (integrin-linked kinase: ILK), 신호 전달 인자 및 전사 활성 인자 (signal transducer and activator of transcription) STAT3, STATS, 및 STATE, 저산소증 유발 인자 (hypoxia inducible factor: HIF) (예를 들어, HIF-1 및 HIF-2), 핵 인자-카파 B (NF-B), 노치 수용체 (예를 들어, 노치 1-4), NY ESO 1, c-Met, 라파마이신의 포유 동물 표적 (mammalian targets of rapamycin: mTOR), WNT, 세포외 신호 조절 키나아제 (extracellular signal-regulated kinase: ERK), 및 이의 조절 서브 유닛, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신세포 암종-5T4, SM22-알파, 탄산 무수화 효소 I (carbonic anhydrases I: CAI) 및 IX (CAIX) (G250으로도 또한 공지됨), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나아제3, hTERT, 육종 전위 변곡점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔린 (mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SAGE, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1 및 LRRN1이 포함된다.
항원은 종양 세포에서 돌연변이된 유전자로부터 또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 상이한 수준으로 전사되는 유전자로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드, 예를 들어, 텔로머라아제 효소, 서바이빈, 메소텔린, 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이된 또는 야생형 p53, 시토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제-V; 흑색종 및 B-세포 림프종에서 특유의 이디오타입을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론 재정렬; 종양 바이러스 과정으로부터 유래된 에피토프 영역 또는 에피토프 펩타이드를 포함하는 종양 항원, 예를 들어, 사람 파필로마 바이러스 단백질 E6 및 E7; 엡스타인 바 바이러스 단백질 LMP2; 종양 선택적 발현을 갖는 비돌연변이된 종양 태아성 단백질, 예를 들어, 암배아 항원 및 알파-태아 단백질을 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 항원은 병원성 미생물로부터 또는 기회 감염성 병원성 미생물 (본 출원에서 감염 질환 미생물로서도 또한 불림), 예를 들어, 바이러스, 진균, 기생충 및 세균으로부터 수득되거나 유래된다. 특정 실시 형태에서, 이러한 미생물로부터 유래된 항원은 전장 단백질을 포함한다.
이의 항원이 본 출원에서 기재된 방법에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 병원체로는 사람 면역 결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus: HIV), 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus: CMV), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus: EBV), 인플루엔자 A, B 및 C, 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus: VSV), 폴리오마바이러스 (예를 들어, BK 바이러스 및 JC 바이러스), 아데노바이러스, 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종, 및 스트렙토코커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)를 비롯한 스트렙토코커스 종이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용하기 위해 이들 및 다른 병원성 미생물로부터 유래된 단백질 및 당해 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 간행물 및 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다.
사람 면역 결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래된 항원은 HIV 비리온 구조 단백질 (예를 들어, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사 효소, 또는 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu로 인코딩된 HIV 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
단순 헤르페스 바이러스 (예를 들어, HSV 1 및 HSV2)로부터 유래된 항원은 HSV 후기 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 후기 유전자 그룹은 대부분 비리온 입자를 형성하는 단백질을 인코딩한다. 이러한 단백질은, 각각 본 출원에서 기재된 바와 같은 항원으로서 사용될 수 있는, 바이러스 캡시드 UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45 및 UL27을 형성하는 (UL) 중 5개의 단백질을 포함한다. 본 출원에서 항원으로서 사용하기 위해 고려되는 다른 예시적인 HSV 단백질로는 ICP27 (H1, H2), 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 단백질이 포함된다. HSV 게놈은 적어도 74개의 유전자를 포함하며, 각각은 항원으로서 잠재적으로 사용될 수 있는 단백질을 인코딩한다.
사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유래된 항원으로는 CMV 구조 단백질, 바이러스 복제의 급초기 및 초기 중에 발현되는 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 피막 단백질, 저급 기질 단백질 pp65 (ppUL83), p52 (ppUL44), IE1 및 1E2 (UL123 및 UL122), UL128~UL150 유래의 유전자 클러스터로부터 수득된 단백질 산물 (문헌 [Rykman, et al., 2006]), 외피성 당단백질 B (gB), gH, gN 및 pp150이 포함된다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 기재된 항원으로서 사용하기 위한 CMV 단백질은 GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®과 같은 공개 데이터베이스에서 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Bennekov et al., 2004], [Loewendorf et al., 2010], [Marschall et al., 2009] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 엡스타인 바 바이러스 (EBV)로부터 유래된 항원으로는 EBV 용균 단백질 gp350 및 gp110, 엡스타인 바 핵 항원 (Epstein-Ban nuclear antigen: EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-선도 단백질 (EBNALP)을 비롯한 잠복기 감염 중에 생산된 EBV 단백질, 및 잠재성 막 단백질(latent membrane protein: LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Lockey et al., 2008] 참조).
본 출원에서 사용하기 위해 고려되는 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)로부터 유래된 항원으로는 RSV 게놈에 의해 인코딩되는 11개의 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: NS1, NS2, N (뉴클레오캡시드 단백질), M (기질 단백질) SH, G 및 F (바이러스 피막 단백질), M2 (제2 기질 단백질), M2-1 (연장 인자), M2-2 (전사 조절), RNA 폴리머라아제 및 인단백질 P.
사용하기 위해 고려되는 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로부터 유래된 항원으로는 VSV 게놈에 의해 인코딩되는 5개의 주요 단백질 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것이 포함된다: 거대 단백질 (L), 당단백질 (G), 핵단백질 (N), 인단백질 (P) 및 기질 단백질 (M) (예를 들어, 문헌 [Rieder et al., 1999] 참조).
특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 인플루엔자 바이러스로부터 유래되는 항원으로는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다아제 (NA), 핵단백질 (NP), 기질 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 및 PB2가 포함된다.
또한, 예시적인 바이러스 항원으로는 아데노바이러스 폴리펩타이드, 알파바이러스 폴리펩타이드, 칼리시바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩타이드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩타이드, 에볼라 바이러스 폴리펩타이드, 엔테로바이러스 폴리펩타이드, 플라비바이러스 폴리펩타이드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩타이드 (B형 간염 코어 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 코어 또는 비구조 단백질), 헤르페스바이러스 폴리펩타이드 (단순 헤르페스 바이러스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질 포함), 전염성 복막염 바이러스 폴리펩타이드, 백혈병 바이러스 폴리펩타이드, 마르부르크 바이러스 폴리펩타이드, 오르토믹소바이러스 폴리펩타이드, 유두종 바이러스 폴리펩타이드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 폴리펩타이드), 파라믹소바이러스 폴리펩타이드, 파보바이러스 폴리펩타이드, 페스티바이러스 폴리펩타이드, 피코르나 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩타이드), 폭스 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 백시니아 바이러스 폴리펩타이드), 광견병 바이러스 폴리펩타이드 (예를 들어, 광견병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스 폴리펩타이드, 레트로바이러스 폴리펩타이드 및 로타바이러스 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 형태에서, 상기 항원은 세균 항원일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 관심 대상 세균 항원은 분비된 폴리펩타이드일 수 있다. 다른 특정 실시 형태에서, 세균 항원은 세균의 외부 세포 표면 상에 노출된 폴리펩타이드의 부분 또는 부분들을 가지는 항원을 포함한다.
사용하기 위해 고려되는 메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스 (MRSA)를 비롯한 스태필로코커스 종으로부터 유래된 항원으로는 병독성 조절 인자, 예를 들어, Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체 (Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP가 포함된다. 항원의 역할을 할 수 있는 다른 스태필로코커스 단백질로는 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타아제, CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay] 참조). 2종의 스태필로코커스 아우레우스 (N315 및 Mu50)에 대한 게놈은 서열 분석되었으며, 예를 들어, PATRIC (문헌 [PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007])에서 공개적으로 이용 가능하다. 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 항원으로서 사용하기 위한 스태필로코커스 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GenBank®, Swiss-Prot® 및 TrEMBL®에서 확인될 수 있다.
본 출원에서 기재된 특정 실시 형태에서 사용하기 위해 고려되는 스트렙토코커스 뉴모니아에로부터 유래된 항원으로는 뉴몰리신, PspA, 콜린 결합 단백질 A (choline-binding protein A: CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht 및 필린 단백질 (RrgA; RrgB; RrgC)이 포함된다. 스트렙토코커스 뉴모니아에의 항원성 단백질은 또한 당해 분야에 공지되어 있으며, 일부 실시 형태에서 항원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zysk et al., 2000] 참조). 스트렙토코커스 뉴모니아의 병독성 균주의 완전한 게놈 서열은 서열 분석되었으며, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 출원에서 사용하기 위한 스트렙토코커스 뉴모니아 단백질은 또한 다른 공개 데이터베이스, 예를 들어, GENBANK®, SWISS-PROT® 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다. 본 개시 내용에 따른 항원에 대한 특별한 관심 대상 단백질은 뉴모코커스의 표면에서 노출되는 것으로 예상되는 병독성 인자 및 단백질을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Frolet et al., 2010] 참조).
항원으로서 사용될 수 있는 세균 항원의 예로는 액티노마이세스 (Actinomyces) 폴리펩타이드, 바실러스 (Bacillus) 폴리펩타이드, 박테로이데스 (Bacteroides) 폴리펩타이드, 보르데텔라 (Bordetella) 폴리펩타이드, 바르토넬라 (Bartonella) 폴리펩타이드, 보렐리아 (Borrelia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 보렐리아 부르그도르페리 (B. burgdorferi) OspA), 브루셀라 (Brucella) 폴리펩타이드, 캄필로박터 (Campylobacter) 폴리펩타이드, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 폴리펩타이드, 클라미디아 (Chlamydia) 폴리펩타이드, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 폴리펩타이드, 콕시엘라 (Coxiella) 폴리펩타이드, 더마토필러스 (Dermatophilus) 폴리펩타이드, 엔테로코커스 (Enterococcus) 폴리펩타이드, 에를리히아 (Ehrlichia) 폴리펩타이드, 에세리키아 (Escherichia) 폴리펩타이드, 프란시셀라 (Francisella) 폴리펩타이드, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 폴리펩타이드, 헤모바르토넬라 (Haemobartonella) 폴리펩타이드, 헤모필러스 (Haemophilus) 폴리펩타이드 (예를 들어, b형 헤모필러스 인플루엔자 (H. influenzae) 외막 단백질), 헬리코박터 (Helicobacter) 폴리펩타이드, 클렙시엘라 (Klebsiella) 폴리펩타이드, L형 세균 폴리펩타이드, 렙토스피라 (Leptospira) 폴리펩타이드, 리스테리아 (Listeria) 폴리펩타이드, 마이코박테리아 (Mycobacteria) 폴리펩타이드, 마이코플라스마 (Mycoplasma) 폴리펩타이드, 나이세리아 (Neisseria) 폴리펩타이드, 네오리케차 (Neorickettsia) 폴리펩타이드, 노카르디아 (Nocardia) 폴리펩타이드, 파스퇴렐라 (Pasteurella) 폴리펩타이드, 펩토코커스 (Peptococcus) 폴리펩타이드, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 폴리펩타이드, 뉴모코커스 (Pneumococcus) 폴리펩타이드 (즉, 스트렙토코커스 뉴모니아에 폴리펩타이드), 프로테우스 (Proteus) 폴리펩타이드, 슈도모나스 (Pseudomonas) 폴리펩타이드, 리케차 (Rickettsia) 폴리펩타이드, 로칼리마에아 (Rochalimaea) 폴리펩타이드, 살모넬라 (Salmonella) 폴리펩타이드, 시겔라 (Shigella) 폴리펩타이드, 스태필로코커스 (Staphylococcus) 폴리펩타이드, A군 스트렙토코커스 (streptococcus) 폴리펩타이드 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) M 단백질), B군 스트렙토코커스 아갈락티아에 (S. agalactiae) 폴리펩타이드, 트레포네마 (Treponema) 폴리펩타이드 및 여시니아 (Yersinia) 폴리펩타이드 (예를 들어, 여시니아 페스티스 (Y. pestis) F1 및 V 항원)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
진균 항원의 예로는 압시디아 (Absidia) 폴리펩타이드, 아크레모늄 (Acremonium) 폴리펩타이드, 알터나리아 (Alternaria) 폴리펩타이드, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 폴리펩타이드, 바시디오볼루스 (Basidiobolus) 폴리펩타이드, 비폴라리스 (Bipolaris) 폴리펩타이드, 블라스토마이세스 (Blastomyces) 폴리펩타이드, 칸디다 (Candida) 폴리펩타이드, 콕시디오이데스 (Coccidioides) 폴리펩타이드, 코니디오볼루스 (Conidiobolus) 폴리펩타이드, 크립토코커스 (Cryptococcus) 폴리펩타이드, 쿠르발라리아 (Curvalaria) 폴리펩타이드, 에피더모파이톤 (Epidermophyton) 폴리펩타이드, 엑소피알라 (Exophiala) 폴리펩타이드, 게오트리쿰 (Geotrichum) 폴리펩타이드, 히스토플라스마 (Histoplasma) 폴리펩타이드, 마두렐라 (Madurella) 폴리펩타이드, 말라세지아 (Malassezia) 폴리펩타이드, 마이크로스포룸 (Microsporum) 폴리펩타이드, 모닐리엘라 (Moniliella) 폴리펩타이드, 모르티에렐라 (Mortierella) 폴리펩타이드, 무코르 (Mucor) 폴리펩타이드, 패실로마이세스 (Paecilomyces) 폴리펩타이드, 페니실리움 (Penicillium) 폴리펩타이드, 피알레모니움 (Phialemonium) 폴리펩타이드, 피알로포라 (Phialophora) 폴리펩타이드, 프로토테카 (Prototheca) 폴리펩타이드, 슈달레세리아 (Pseudallescheria) 폴리펩타이드, 슈도마이크로도키움 (Pseudomicrodochium) 폴리펩타이드, 피시움 (Pythium) 폴리펩타이드, 리노스포리듐 (Rhinosporidium) 폴리펩타이드, 리조푸스 (Rhizopus) 폴리펩타이드, 스콜레코바시디움 (Scolecobasidium) 폴리펩타이드, 스포로트릭스 (Sporothrix) 폴리펩타이드, 스템파일리움 (Stemphylium) 폴리펩타이드, 트리코파이톤 (Trichophyton) 폴리펩타이드, 트리코스포론 (Trichosporon) 폴리펩타이드 및 자일로히파 (Xylohypha) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
원생 기생충 항원의 예로는 바베시아 (Babesia) 폴리펩타이드, 발란티디움 (Balantidium) 폴리펩타이드, 베스노이티아 (Besnoitia) 폴리펩타이드, 크립토스포리디움 (Cryptosporidium) 폴리펩타이드, 에이메리아 (Eimeria) 폴리펩타이드, 엔세팔리토준 (Encephalitozoon) 폴리펩타이드, 엔타모에바 (Entamoeba) 폴리펩타이드, 지아르디아 (Giardia) 폴리펩타이드, 함몬디아 (Hammondia) 폴리펩타이드, 헤파토준 (Hepatozoon) 폴리펩타이드, 이소스포라 (Isospora) 폴리펩타이드, 라이슈마니아 (Leishmania) 폴리펩타이드, 마이크로스포리디아 (Microsporidia) 폴리펩타이드, 네오스포라 (Neospora) 폴리펩타이드, 노세마 (Nosema) 폴리펩타이드, 펜타트리코모나스 (Pentatrichomonas) 폴리펩타이드, 플라스모디움 (Plasmodium) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 연충 기생충 항원의 예로는 아칸토케일로네마 (Acanthocheilonema) 폴리펩타이드, 아엘루로스트롱질루스 (Aelurostrongylus) 폴리펩타이드, 안실로스토마 (Ancylostoma) 폴리펩타이드, 안지오스트롱질루스 (Angiostrongylus) 폴리펩타이드, 아스카리스 (Ascaris) 폴리펩타이드, 브루기아 (Brugia) 폴리펩타이드, 부노스토뭄 (Bunostomum) 폴리펩타이드, 카필라리아 (Capillaria) 폴리펩타이드, 차베르티아 (Chabertia) 폴리펩타이드, 쿠페리아 (Cooperia) 폴리펩타이드, 크레노소마 (Crenosoma) 폴리펩타이드, 딕티오카울루스 (Dictyocaulus) 폴리펩타이드, 디옥토파임 (Dioctophyme) 폴리펩타이드, 디페탈로네마 (Dipetalonema) 폴리펩타이드, 디파일로보트리움 (Diphyllobothrium) 폴리펩타이드, 디플라이디움 (Diplydium) 폴리펩타이드, 디로필라리아 (Dirofilaria) 폴리펩타이드, 드라쿤쿨루스 (Dracunculus) 폴리펩타이드, 엔테로비우스 (Enterobius) 폴리펩타이드, 필라로이데스 (Filaroides) 폴리펩타이드, 헤몬쿠스 (Haemonchus) 폴리펩타이드, 라고킬라스카리스 (Lagochilascaris) 폴리펩타이드, 로아 (Loa) 폴리펩타이드 폴리펩타이드, 만소넬라 (Mansonella) 폴리펩타이드, 무엘레리우스 (Muellerius) 폴리펩타이드, 나노파이터스 (Nanophyetus) 폴리펩타이드, 네카토르 (Necator) 폴리펩타이드, 네마토디루스 (Nematodirus) 폴리펩타이드, 외소파고스토뭄 (Oesophagostomum) 폴리펩타이드, 온코세르카 (Onchocerca) 폴리펩타이드, 오피스토르키스 (Opisthorchis) 폴리펩타이드, 오스테르타기아 (Ostertagia) 폴리펩타이드, 파라필라리아 (Parafilaria) 폴리펩타이드, 파라고니무스 (Paragonimus) 폴리펩타이드, 파라스카리스 (Parascaris) 폴리펩타이드, 파이살로프테라 (Physaloptera) 폴리펩타이드, 프로토스트롱질루스 (Protostrongylus) 폴리펩타이드, 세타리아 (Setaria) 폴리펩타이드, 스피로세르카 (Spirocerca) 폴리펩타이드, 스피로메트라 (Spirometra) 폴리펩타이드, 스테파노필라리아 (Stephanofilaria) 폴리펩타이드, 스트롱질로이데스 (Strongyloides) 폴리펩타이드, 스트롱질루스 (Strongylus) 폴리펩타이드, 텔라지아 (Thelazia) 폴리펩타이드, 톡사스카리스 (Toxascaris) 폴리펩타이드, 톡소카라 (Toxocara) 폴리펩타이드, 트리키넬라 (Trichinella) 폴리펩타이드, 트리코스트롱질루스 (Trichostrongylus) 폴리펩타이드, 트리쿠리스 (Trichuris) 폴리펩타이드, 운시나리아 (Uncinaria) 및 우케레리아 (Wuchereria) 폴리펩타이드 (예를 들어, 플라스모디움 팔시파룸 포자소체 (P. falciparum circumsporozoite: PfCSP)), 포자소체 표면 단백질 2 (P. falciparum sporozoite surface protein 2: PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카복시 말단 (P. falciparum carboxyl terminus of liver state antigen 1: PfLSA1 c-말단) 및 외수송 단백질 1 (P. falciparum exported protein 1: PfExp-1), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 폴리펩타이드, 사코시스티스 (Sarcocystis) 폴리펩타이드, 시스토소마 (Schistosoma) 폴리펩타이드, 테일레리아 (Theileria) 폴리펩타이드, 톡소플라스마 (Toxoplasma) 폴리펩타이드, 트립파노소마 (Trypanosoma) 폴리펩타이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
외부 기생충 항원의 예로는 벼룩; 진드기, 예를 들어, 참 진드기 및 물렁 진드기; 파리, 예를 들어, 깔따구, 모기, 모래파리, 먹파리, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 체체파리, 침파리, 구더기증 유발 파리 및 각다귀; 개미; 거미, 이; 진드기; 및 노린재, 예를 들어, 빈대 및 침노린재 유래의 폴리펩타이드 (알러지원 뿐만 아니라 항원 포함)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
E. 자살 유전자
일부 경우에서, 본 개시 내용의 임의의 세포는 이종 사이토카인, 조작된 수용체 등 이외의 하나 이상의 작용제를 생산하도록 변형된다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 세포, 예를 들어, B 세포는 하나 이상의 자살 유전자를 보유하도록 조작되며, 본 출원에서 사용되는 "자살 유전자"라는 용어는, 프로드럭의 투여시, 유전자 산물을 숙주 세포를 사멸시키는 화합물로 전이시키는데 영향을 미치는 유전자로서 정의된다. 일부 경우에서, 상기 B 세포 요법을 받고 있고/있거나 상기 B 세포 요법을 받은 적이 있는 개체가 하나 이상의 이상 반응의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 사이토카인 방출 증후군, 신경독성, 아나필락시스/알러지 및/또는 온-표적/오프-비종양 독성 (예로서)을 나타내거나 일촉즉발을 포함하여 하나 이상의 증상을 가질 위험이 있는 것으로 간주될 때, 상기 B 세포 요법은 임의의 종류의 하나 이상의 자살 유전자의 사용을 겪을 수 있다. 상기 자살 유전자의 사용은 요법에 대해 계획된 프로토콜의 일부일 수 있거나, 이의 사용에 필요한 것으로 인정되는 경우에만 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 세포 요법이 더 이상 필요하지 않기 때문에 상기 자살 유전자 또는 이로부터의 유전자 산물을 표적화하는 작용제(들)의 사용에 의해 상기 세포 요법을 종료한다.
자살 유전자의 예로는 조작된 비분비성 (막 결합 포함) 종양 괴사 인자 (TNF)-알파 돌연변이체 폴리펩타이드 (그 전체가 본 출원에 참조로 포함되는 국제출원 PCT/US19/62009 참조)가 포함되며, 이것은 상기 TNF-알파 돌연변이체에 결합하는 항체의 전달에 의해 표적화될 수 있다. 사용될 수 있는 자살 유전자/프로드럭 조합의 예로는 단순 헤르페스 바이러스-티미딘 키나아제 (HSV-tk) 및 간시클로비르, 아시클로비르 또는 FIAU; 옥시도리덕타아제 및 사이클로헥시미드; 사이토신 데아미나아제 및 5-플루오로사이토신; 티미딘 키나아제 티미딜레이트 키나아제 (Tdk::Tmk) 및 AZT; 및 데옥시시티딘 키나아제 및 사이토신 아라비노사이드이다. 프로드럭 6-메틸퓨린 데옥시리보사이드를 독성 퓨린 6-메틸퓨린으로 전환시키는 소위 자살 유전자로 불리는 이. 콜라이 (E.coli) 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제가 사용될 수 있다. 다른 자살 유전자로는 예로서 CD20, CD52, 유도성 카스파아제 9, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라아제 (purine nucleoside phosphorylase: PNP), 시토크롬 p450 효소 (CYP), 카복시펩티다아제 (CP), 카복실에스테라아제 (CE), 니트로디럭타아제 (NTR), 구아닌 리보실트랜스퍼라아제 (XGRTP), 글리코시다아제 효소, 메티오닌-α,γ-리아제 (MET) 및 티미딘 포스포릴라아제 (TP)가 포함된다.
F. 전달 방법
당해 분야의 통상의 기술자는 본 개시 내용의 항원 수용체의 발현을 위해 표준 재조합 기술 (예를 들어, 둘 다 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et al., 2001] 및 [Ausubel et al., 1996] 참조)을 통해 벡터를 작제할 준비가 잘 되어 있을 것이다. 벡터로는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예를 들어, YAC), 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 (몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도), 이의 복제 컴피턴트, 복제 결여 및 무기력한 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인 바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터, 파보바이러스 벡터, 소아 마비 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 마라바 바이러스 벡터 및 그룹 B 아데노바이러스 에나데노툭시레브 벡터가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 실시 형태에서, 상기 벡터는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제출원 PCT/US19/62014에서 기재된 것과 같은 다시스트론성 벡터이다. 이러한 경우, 단일 벡터는 상기 CAR 또는 TCR (및 발현 작제물은 상기 CAR 또는 TCR의 부분을 상호 교환할 수 있도록 모듈 형식으로 구성될 수 있음), 자살 유전자 및 하나 이상의 사이토카인을 인코딩할 수 있다.
1. 바이러스 벡터
항원 수용체를 인코딩하는 바이러스 벡터가 본 개시 내용의 특정 양태에서 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터의 생성에서, 비필수 유전자는 전형적으로 이종 (또는 비-본래) 단백질에 대한 유전자 또는 코딩 서열로 대체된다. 바이러스 벡터는 바이러스 서열을 이용하여 핵산 및 가능하게는 단백질을 세포 내로 도입하는 발현 작제물의 일종이다. 수용체 매개성 엔도사이토시스를 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고 숙주 세포 게놈 내로 통합되어 바이러스 유전자를 안정하게 효율적으로 발현시키는 특정 바이러스의 능력은, 이들을 외래 핵산의 세포 (예를 들어, 포유 동물 세포)로 전달하기 위한 매력적인 후보가 되도록 하였다. 본 발명의 특정 양태의 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기재된다.
렌티바이러스는, 공통 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env에 추가하여 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유하는 복합적인 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 US 6,013,516 및 US 5,994,136 참조).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있으며, 생체내 및 생체외 유전자 전달과 핵산 서열의 발현 둘 모두에 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스 - 여기서, 적합한 숙주 세포는 패키징 기능, 즉, gag, pol 및 env 뿐만 아니라 rev 및 tat를 갖는 2종 이상의 벡터로 형질 감염된다 - 는 미국 특허 US 5,994,136 (본 출원에 참조로 포함)에 기재되어 있다.
a. 조절 요소
본 개시 내용에서 유용한 벡터에 포함되는 발현 카세트는, 특히, (5'에서 3' 방향으로) 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 진핵 생물의 전사 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 함유한다. 진핵 세포에서 단백질 인코딩 유전자의 전사를 조절하는 프로모터 및 인핸서는 다중 유전자 요소로 구성된다. 세포 기구는, 상이한 유전자가 전사 조절의 특유의 종종 복잡한 패턴을 진전시키도록 하는, 각각의 요소에 의해 운반된 조절 정보를 모으고 통합할 수 있다. 본 개시 내용의 맥락에서 사용되는 프로모터로는 항시성, 유도성 및 조직 특이적 프로모터가 포함된다.
b. 프로모터/인핸서
본 출원에서 제공되는 발현 작제물은 프로그래밍 유전자의 발현을 구동시키기 위한 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 공지된 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어, 포유 동물의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 유전자를 위한 프로모터 및 SV40 후기 유전자를 위한 프로모터와 같은 TATA 박스가 결여된 일부 프로모터에서는 개시 부위 위에 놓이는 별개의 요소 자체가 개시 장소의 고정을 보조한다. 추가의 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 다수의 프로모터가 개시 부위의 다운스트림에도 또한 기능 요소를 함유하는 것으로 밝혀졌지만, 이들은 개시 부위의 업스트림의 30110 bp 영역에 위치한다. 프로모터"의 제어하에" 코딩 서열을 가져오기 위해서, 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 3')에 전사 리딩 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 인코딩된 RNA의 발현을 촉진시킨다.
프로모터 요소들 사이의 간격이 자주 유연하므로, 프로모터 기능은 요소가 서로에 대해 역방향이거나 이동될 때 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은, 활성이 감소하기 시작하기 전에, 50 bp 간격으로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용성 조절 서열을 나타내는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는, 인코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치하는 5' 비-코딩 서열을 단리함으로써 수득될 수 있기 때문에, 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로서 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 결합된 것일 수 있다. 대안으로, 특정 이점은 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합되지 않은 프로모터를 지칭하는 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 분절을 위치시킴으로써 수득될 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않은 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연 발생"이 아닌 프로모터 또는 인핸서, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 발현을 변경시키는 돌연변이를 함유하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔히 사용되는 프로모터로는 β-락타마아제 (페니실리나아제), 락토오스 및 트립토판 (trp-) 프로모터 시스템이 포함된다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성으로 생성하는 것에 추가하여, 서열들은 본 출원에 개시된 조성물과 관련하여 PCR™을 포함하는 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내에서 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열도 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.
당연히, 발현을 위해 선택된 소기관, 세포 유형, 조직, 장기 또는 유기체에서 DNA 분절의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 통상의 기술자는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 용도를 일반적으로 알고 있다 (예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sambrook et　al. 1989] 참조). 사용되는 프로모터는, 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에 유리한 바와 같이, 도입된 DNA 분절의 높은 수준의 발현을 지시하기 위한 적절한 조건하에 항시성, 조직-특이적, 유도성 및/또는 유용성일 수 있다. 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.
추가로, 임의의 프로모터/인핸서 조합 (예를 들어, epd.isb-sib.ch/의 월드 와이드 웹을 통한 진핵 생물의 프로모터 데이터베이스 EPDB에 따름)은 또한 발현을 구동시키기 위해 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시 형태이다. 적절한 세균 폴리머라아제가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가의 유전자 발현 작제물로서 제공되는 경우, 진핵 생물 세포는 특정 세균 프로모터로부터의 세포질 전사를 지원할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예로는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어, SV40 초기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 급초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus: RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어, 베타 액틴 프로모터, GADPH 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 및 연쇄 반응 요소 프로모터, 예를 들어, 사이클릭 AMP 반응 요소 프로모터 (cre), 혈청 반응 요소 프로모터 (sre), 포르볼 에스테르 프로모터 (TPA) 및 최소 TATA 박스 근처의 반응 요소 프로모터 (tre)가 포함된다. 사람 성장 호르몬 프로모터 서열 (예를 들어, Genbank 수탁 번호 X05244의 뉴클레오타이드 283~341에 기술된 사람 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유선 종양 프로모터 (ATCC 카탈로그 번호 ATCC 45007로부터 입수 가능)도 또한 사용 가능하다. 특정 실시 형태에서, 프로모터는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 사람 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 프로모터이지만, 치료학적 유전자의 발현을 구동시키는데 유용한 임의의 다른 프로모터가 본 개시 내용의 실시에 적용 가능하다.
특정 양태에서, 본 개시 내용의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉, 프로모터의 활성을 증가시키는 핵산 서열 및 심지어 상대적으로 긴 거리 (표적 프로모터로부터 수 킬로베이스 (kilobase) 이하)에 걸쳐서도 이들의 배향에 관계없이 시스로 작용하는 잠재력을 갖는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러나, 인핸서 기능은 주어진 프로모터와 매우 근접하게 기능할 수도 있으므로 이러한 긴 거리에 반드시 제한되는 것은 아니다.
c. 개시 신호 및 연계 발현
특정 개시 신호는 또한 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 본 개시 내용의 방법에서 제공되는 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있을 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 용이하게 이것을 결정하고 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다. 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 "프레임 내에서" 존재해야 한다는 것은 잘 공지되어 있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 또는 합성일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시켜 증진될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 내부 리보솜 진입 부위 (internal ribosome entry site: IRES) 요소의 사용은 다중 유전자 또는 다시스트론성 메시지를 생성하는데 사용된다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존적 번역의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다. 피코르나바이러스 계열의 2개의 구성원 (소아마비 및 뇌 심근염)으로부터의 IRES 요소 뿐만 아니라 포유 동물 메시지로부터의 IRES도 기재되어 있다. IRES 요소는 이종 오픈 리딩 프레임과 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임들은 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 다시스트론성 메세지를 생성한다. IRES 요소 때문에, 각각의 오픈 리딩 프레임은 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근 가능하다. 다중 유전자는 단일 메시지를 전사하기 위해 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현될 수 있다.
추가로, 특정 2A 서열 요소는 본 개시 내용에서 제공되는 작제물에서 유전자들의 연계 발현 또는 공동 발현을 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 절단 서열은 오픈 리딩 프레임들을 연결하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공동 발현시키는데 사용될 수 있다. 예시적인 절단 서열은 F2A (구제역 바이러스 2A) 또는 "2A 유사" 서열 (예를 들어, 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스 2A; T2A)이다.
d. 복제의 원점
숙주 세포에서 벡터를 증식시키기 위해, 이것은 하나 이상의 복제 기원 부위 (종종 "ori"라고 칭함), 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍에서 유사하거나 상승된 기능을 갖는 유전자 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있으며, 상기 핵산 서열은 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 상기에서 기재된 바와 같은 다른 염색체외성 복제 바이러스 또는 자율 복제성 서열 (autonomously replicating sequence: ARS)의 복제 원점이 사용될 수 있다.
e. 선택 및 스크리닝 가능한 마커
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시켜 시험관내에서 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 허용하는 세포에 확인 가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 허용하는 것이고, 한편 음성 선택 마커는 마커의 존재가 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 한 예는 약물 내성 마커이다.
일반적으로, 약물 선택 마커의 함유는 형질 전환주의 클로닝 및 동정을 보조하며, 예를 들어, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 부여하는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 실시에 기초한 형질 전환주의 식별을 허용하는 표현형을 부여하는 마커에 추가하여, 비색 분석에 기초하는 GFP와 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함하는 다른 유형의 마커도 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase: CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 스크리닝 가능한 효소가 이용될 수 있다. 당해 분야의 통상의 기술자는 또한 면역학적 마커를 가능하게는 FACS 분석과 함께 사용하는 방법을 알고 있을 것이다. 사용되는 마커는 유전자 산물을 인코딩하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝 가능한 마커의 추가 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
2. 기타 핵산 전달 방법
항원 수용체를 인코딩하는 핵산의 바이러스 전달에 추가하여, 다음은 주어진 숙주 세포로의 추가의 재조합 유전자 전달 방법이며, 이에 따라 본 개시 내용에서 고려된다.
본 개시 내용의 면역 세포 내로의 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 도입은 본 출원에서 기재된 바와 같이 또는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 바와 같이 세포의 형질 전환을 위한 핵산을 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는, 예를 들어, 생체외 형질 감염에 의한, 미세 주사를 비롯한 주사에 의한; 전기 천공에 의한; 칼슘 포스페이트 침전에 의한; DEAE-덱스트란에 이어서 폴리에틸렌 글리콜의 이용에 의한; 직접 초음파 부하에 의한; 리포솜 매개성 형질 감염 및 수용체 매개성 형질 감염에 의한; 미세 입자 투사법에 의한; 실리콘 카바이드 섬유 교반에 의한; 아그로박테리움 (Agrobacterium) 매개성 형질 전환에 의한; 건조/억제 매개성 DNA 흡수에 의한; 및 이러한 방법들의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접 전달이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 기술의 적용을 통해, 소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 유기체(들)가 안정하게 또는 일시적으로 형질 전환될 수 있다.
IV. 유전자 편집 및 CRISPR
본 개시 내용의 B 세포 생성 방법은 상기 B 세포의 유전자 편집을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 유전자 편집은 이종 항원 수용체를 발현하는 B 세포에서 일어나는 반면, 다른 경우에서, 상기 유전자 편집은 이종 항원 수용체를 발현하지 않는 B 세포에서 일어난다. 특별한 실시 형태에서, 유전자 편집된 상기 B 세포는 확장된 B 세포이다.
특별한 경우에서, 상기 B 세포의 하나 이상의 내인성 유전자는 변형되며, 예를 들어, 발현을 부분적으로 또는 전체적으로 감소시키는 발현에서 파괴된다. 구체적인 경우에서, 하나 이상의 유전자는 본 개시 내용의 방법을 사용하여 녹다운 또는 녹아웃된다. 구체적인 경우에서, 다중 유전자는 동일한 단계 또는 다중 단계에서 녹다운 또는 녹아웃된다. 상기 B 세포에서 편집되는 유전자는 임의의 종류의 것일 수 있지만, 구체적인 실시 형태에서, 상기 유전자는 유전자 산물이 B 세포의 활성 및/또는 증식을 억제하는 유전자이다. 구체적인 경우에서, 상기 B 세포에서 편집되는 유전자는 상기 B 세포가 종양 미세 환경에서 보다 효과적으로 작동하도록 한다. 구체적인 경우에서, 상기 유전자는 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, TDAG8, CD5, CD7, SLAMF7, CD38, LAG3, TCR, 베타2-마이크로글루불린, HLA, CD73 및 CD39 중 하나 이상이다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 TGFBR2 유전자는 상기 B 세포에서 녹아웃 또는 녹다운된다.
일부 실시 형태에서, 상기 유전자 편집은 RNA 가이드된 엔도뉴클레아제 (RNA-guided endonuclease: RGEN)를 통한 변경과 같은 하나 이상의 DNA 결합 핵산을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 상기 변경은 클러스터형의 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복체 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 및 CRISPR 관련 (Cas) 단백질을 사용하여 수행될 수 있으며, CpF1은 Cas9 대신에 사용된다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr (트랜스 활성화 CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr 메이트 (mate) 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA 가공된 부분 직접 반복체 및 "직접 반복체" 포함), 가이드 서열 (내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 또한 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 비롯하여 CRISPR 관련 ("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성의 지시에 관여하는 전사물 및 기타 요소를 통칭하여 지칭한다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자 (가이드) RNA 및 뉴클레아제 기능성 (예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유도될 수 있다.
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA (고정 tracrRNA와 표적 서열에 대해 특이적인 crRNA의 융합 포함)를 세포에 도입한다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에서의 표적 부위는 상보적 염기쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, 유전자에 표적화한다. 상기 표적 부위는 전형적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프 (protospacer adjacent motif: PAM) 서열의 바로 5' 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개의 뉴클레오타이드를 변형하여 표적 DNA 서열에 상응하도록 함으로써 목적하는 서열에 표적화된다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, "표적 서열"은, 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 일반적으로 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.
CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 파손 (double stranded break: DSB)을 유도한 후 본 출원에서 논의된 바와 같은 중단 또는 변경을 유도할 수 있다. 다른 실시 형태에서, "니카아제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 틈새 도입하는데 사용된다. 쌍을 이룬 니카아제는, 예를 들어, 특이성을 개선하기 위해 사용될 수있으며, 각각은 틈새의 도입시에 5' 오버행이 동시에 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 지시된다. 다른 실시 형태에서, 촉매적 불활성 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제 물질 또는 활성화제와 같은 이종 이펙터 도메인에 융합된다.
상기 표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 표적 서열은 세포의 소기관내와 같은 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화 유전자좌로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오타이드" 또는 "편집 서열"로서 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리 뉴클레오타이드는 편집 주형으로서 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체 (표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함)의 형성은 표적 서열의 내부 또는 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 또는 그 이상의 염기쌍 이내)의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 tracr 서열 (예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드)은 또한, 예를 들어, 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 대해 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 하이브리드화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. 상기 tracr 서열은 CRISPR 복합체의 하이브리드화 및 이의 형성에 참여하기에 충분한 tracr 메이트 서열에 대한 상보성, 예를 들어, 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖는다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동시키는 하나 이상의 벡터가 세포 내로 도입됨으로써, CRISPR 시스템의 요소의 발현은 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시할 수 있다. 구성 요소는 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 벡터로 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성 요소를 제공한다. 상기 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 ("클로닝 부위"로도 또한 지칭됨)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다.
벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 또한 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 동족체, 또는 이들의 변형 버전이 포함된다. 이러한 효소는 공지되어 있으며; 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9 (예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 뉴모니아에 (S. pneumonia) 유래)일 수 있다. 일부 경우에서, CpF1을 Cas9 대신 엔도뉴클레아제로서 사용할 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내와 같은 표적 서열의 위치에 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 상기 벡터가 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되는 CRISPR 효소를 인코딩함으로써, 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오타이드의 1개 또는 2개의 가닥을 절단하는 능력이 결여될 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에 있는 아스파테이트-투-알라닌 치환 (D10A)은 Cas9를 2개의 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 나카아제 (단일 가닥을 절단함)로 전환한다. 일부 실시 형태에서, Cas9 니카아제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 2개의 가닥이 틈새 도입되고 NHEJ 또는 HDR을 유도하는데 사용되도록 한다.
일부 실시 형태에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 사람, 마우스, 래트, 래빗, 개 또는 비사람 영장류를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 포유 동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이러한 유기체로부터 유래될 수있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 본래 아미노산 서열을 유지하면서 본래 서열 중 적어도 하나의 코돈을 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하여 관심 대상 숙주 세포에서 증진된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 지칭한다. 다양한 종들은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향 (유기체들 사이의 코돈 사용법의 차이)은 결국 그 중에서도 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA (tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨지는 전령 RNA (mRNA)의 번역 효율성과 종종 상관 관계가 있다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 코돈 최적화를 기반으로 조정될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열이다. 일부 실시 형태에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상이다.
최적 정렬은 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용에 의해 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 Smith-Waterman 알고리즘, Needleman-Wunsch 알고리즘, Burrows-Wheeler 변환 기반 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), Clustal W, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 이용 가능)이 포함된다.
CRISPR 효소는 1종 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및, 임의로, 임의의 2개의 도메인들 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예로는 제한 없이 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 다음 활성들 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예로는 히스티딘 (His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌 (influenza hemagglutinin: HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신 (Trx) 태그가 포함된다. 리포터 유전자의 예로는 글루타티온-5-트랜스퍼라아제 (glutathione-5- transferase: GST), 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase: HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 (chloramphenicol acetyltransferase: CAT) 베타갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP), HcRed, DsRed, 시안 형광 단백질 (cyan fluorescent protein: CFP), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein: YFP), 및 자가 형광 단백질을 포함하는 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein: BFP)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. CRISPR 효소는 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein: MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인 (DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 도메인 융합 및 단순 헤르페스 바이러스 (herpes simplex virus: HSV) BP16 단백질 융합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원공개 US 2011/0059502에 기재되어 있다.
V. 치료 방법
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 방법에 의해 생성된 B 세포는 이를 필요로 하는 개체를 위한 치료 방법에 이용된다. 본 개시 내용의 실시 형태는 예로서 암, 임의의 종류의 감염 및/또는 임의의 면역 장애에 대해 개체를 치료하는 방법을 포함한다. 상기 개체는 본 개시 내용의 치료 방법을 초기 치료로서 또는 또 다른 치료 후에 (또는 이와 함께) 이용할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 면역 요법 방법은 암의 유형 및/또는 병기에 기초하여 암이 있는 개체의 요구에 맞추어질 수 있고, 적어도 일부 경우에서, 상기 면역 요법은 상기 개체에 대한 치료 과정 동안 변형될 수 있다.
구체적인 경우에서, 치료 방법의 예는 다음과 같다: 1) 임의의 유형의 혈액학적 악성 종양이 있는 암 환자를 치료하기 위한 상기 생성된 B 세포 (생체외 확장되거나 CAR 및/또는 TCR을 발현함)에 의한 입양 세포 요법, (2) 임의의 유형의 고형암이 있는 암 환자를 치료하기 위한 상기 생성된 B 세포 (생체외 확장되거나 CAR 및/또는 TCR을 발현함)에 의한 입양 세포 요법, (3) 감염성 질환 또는 면역 장애가 있는 환자를 치료하기 위한 상기 생성된 B 세포 (생체외 확장되거나 CAR 및/또는 TCR을 발현함)에 의한 입양 세포 요법.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 방법에 의해 생성된 유효량의 B 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 면역 요법을 위한 방법을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유도하는 본 출원의 방법에 의해 생성된 B 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 암 또는 감염은 면역 반응을 유도하는 본 개시 내용의 방법에 의해 생성된 B 세포 집단의 전달에 의해 치료된다. 유효량의 항원 특이적 B 세포 요법을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 치료하거나 이의 진행을 지연시키는 방법이 본 출원에서 제공된다. 본 방법은 면역 장애, 고형암, 혈액학적 암 및/또는 바이러스 감염의 치료에 적용될 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양으로는 임의의 악성 종양 세포 유형, 예를 들어, 고형 종양 또는 혈액학적 종양에서 발견되는 것들이 포함된다. 예시적인 고형 종양으로는 췌장, 결장, 맹장, 위장, 뇌, 머리, 목, 난소, 신장, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선 및 유방으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 장기의 종양이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적인 혈액학적 종양으로는 골수 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 모세포종, 골수종 등이 포함된다. 본 출원에서 제공되는 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가의 예로는 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 세포 암종 포함), 복막암, 위암 또는 위장암 (위장관암, 위장관 기질암 포함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암 및 흑색종이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 암은 구체적으로는 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 악성 신생물; 암종; 미분화형 암종; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평 세포 암종; 림프 상피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행 세포 암종; 유두상 이행 세포 암종; 선암종; 악성 가스트린종; 담관 암종; 간 세포 암종; 간 세포 암종과 담관 암종의 조합; 섬유주 선암종; 선양 낭성 암종; 선종 폴립 내의 선암종; 가족성 대장 폴립증 선암종; 고형 암종; 악성 카르시노이드 종양; 기관세지-폐포성 선암종; 유두상 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종 (acidophil carcinoma); 호산성 선암종 (oxyphilic adenocarcinoma); 호염구 암종; 투명 세포 선암종; 과립 세포 암종; 여포성 선암종; 유두상 및 여포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신 피질 암종; 자궁내막 암종; 피부 부속 기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점액표피양 암종; 낭선암종; 유두상 낭선암종; 유두상 장액 낭선암종; 점액성 낭선암종; 점액성 선암종; 인환 세포 암종; 침윤성 유관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 유방 파제트병; 세엽 세포 암종; 선편평 세포 암종; 선암종 w/편평 세포 화생; 악성 흉선종; 악성 난소 기질 종양; 악성 난포막종; 악성 과립막 세포 종양; 악성 남성 모세포종; 세르톨리 세포 암종; 악성 라이디히 세포 종양; 악성 지질 세포 종양; 악성 부신경절종; 악성 유방외 부신경절종; 크롬친화세포종; 사구맥관 육종; 악성 흑색종; 무색소성 흑색종; 표재 확장성 흑색종; 흑점 악성 흑색종; 말단 흑자 흑색종; 결절성 흑색종; 거대 착색 모반 내의 악성 흑색종; 상피모양 세포 흑색종; 악성 청색 모반; 육종; 섬유 육종; 악성 섬유질 조직구종; 점액 육종; 지방 육종; 평활근 육종; 횡문근 육종; 배아 횡문근 육종; 폐포성 횡문근 육종; 기질 육종; 악성 혼합 종양; 뮬레리안 혼합 종양; 신아세포종; 간모세포종; 암 육종; 악성 간엽 세포종; 악성 브레너 종양; 악성 엽상 종양; 활막 육종; 악성 중피종; 미분화 배세포종; 배아 암종; 악성 기형종; 악성 난소 갑상선종; 융모막 암종; 악성 중신종; 혈관 육종; 악성 혈관 내피종; 카포시 육종; 악성 혈관 주위 세포종; 림프관 육종; 골 육종; 피질 주위 골 육종; 연골 육종; 악성 연골 모세포종; 간엽 연골 육종; 골의 거대 세포 종양; 유잉 육종; 악성 치원성 종양; 법랑아세포성 치아 육종; 악성 사기질 모세포종; 법랑아세포성 섬유 육종; 악성 송과체종; 척삭종; 악성 신경교종; 뇌실막종; 성상 세포종; 원형질 성상 세포종; 원섬유성 성상 세포종; 성상 모세포종; 교모세포종; 희소 돌기 아교 세포종; 희소 돌기 모세포종; 원시 신경 외배엽성; 소뇌 육종; 신경절 신경 모세포종; 신경 모세포종; 망막 모세포종; 후각 신경성 종양; 악성 수막종; 신경 섬유 육종; 악성 신경 집종; 악성 과립 세포 종양; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 파라육아종; 소림프구성 악성 림프종; 대세포 미만성 악성 림프종; 여포성 악성 림프종; 균상 식육종; 다른 특정 비호지킨 림프종; B 세포 림프종; 저등급/여포성 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프구성 (small lymphocytic: SL) NHL; 중간 등급/여포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프 아구성 NHL; 고등급 소 비분할 세포 NHL; 큰 부피 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 발덴스트룀 거대 글로불린 혈증; 악성 조직구 증식증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역 증식성 소장 질환; 백혈병; 림프양 백혈병; 형질 세포 백혈병; 적백혈병; 림프 육종 세포 백혈병; 골수 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵 아구성 백혈병; 골수 육종; 모발상 세포 백혈병; 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia: CLL); 급성 림프 아구성 백혈병 (acute lymphoblastic leukemia: ALL); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukemia: AML); 및 만성 골수 아구성 백혈병.
특별한 실시 형태는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액 또는 골수의 암이며, 혈액 세포, 일반적으로는 백혈구의 비정상적 증식 (증식에 의한 생성) (백혈병)을 특징으로 한다. 이것은 혈액학적 신생물로 호칭되는 질환의 광범위한 그룹의 일부이다. 백혈병은 다양한 질환을 포함하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 및 병리학적으로 급성 및 만성 형태로 나누어진다
본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 상기 B 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 암 또는 감염을 앓고 있는 개체에게 전달된다. 그 다음, 상기 세포는 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격하도록 개체의 면역계를 증진시킨다. 일부 경우에서, 상기 개체는 상기 B 세포의 1개 이상의 용량을 제공받는다. 상기 개체가 상기 B 세포의 2개 이상의 용량을 제공받는 경우, 투여 사이의 기간은 상기 개체에서 증식을 위한 시간을 허용하기에 충분해야 하며, 구체적인 실시 형태에서, 용량 사이의 기간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 또는 그 이상, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 이상, 또는 1, 2, 3, 4주 또는 그 이상, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월 또는 그 이상, 및 이들 사이에서 유도 가능한 임의의 범위이다. 연속 용량은 서로 양이 동일하거나 동일하지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 상기 연속 용량은 시간 경과에 따라 감소하거나 시간 경과에 따라 증가한다.
본 개시 내용의 특정 실시 형태는 면역 매개성 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 자가 면역 질환을 갖는다. 자가 면역 질환의 비제한적인 예로는 다음이 포함된다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군 (antiphospholipid syndrome), 자가 면역 애디슨 질환, 부신의 자가 면역 질환, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 간염, 자가 면역 난소염 및 고환염, 자가 면역 혈소판 감소증, 베체트 병, 수포성 유사 천포창, 심근증, 셀리악 스페이트-피부염 (celiac spate-dermatitis), 만성 피로 면역 기능부전 증후군 (CFIDS), 만성 염증 탈수초 다발 신경병증, 처그-스트라우스 증후군 (Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유천포창 (cicatrical pemphigoid), CREST 증구훈, 한냉 응집 질환 (cold agglutinin disease), 크론 병, 원판성 루프스 (discoid lupus), 한랭 글로불린 혈증 (essential mixed cryoglobulinemia), 섬유 근통-섬유 근염 (fibromyalgia-fibromyositis), 사구체 신염 (glomerulonephritis), 그레이브스 병, 길랑-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니어 병, 혼성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역 매개성 진성 당뇨병, 중증 근무력증, 신증후군 (예를 들어, 최소 변화 질환, 병소 사구체 경화증, 또는 막성 신장병증), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발 동맥염, 다발 연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 1차 무감마글로불린 혈증, 1차 담즙성 경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노드 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 사람 증후군, 전신 홍반성 낭창, 홍반 루프스, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염 (예를 들, 결절성 다발 관절염, 타카야수 관절염, 측두 동맥염/거대 세포 관절염, 또는 피부염 포진 혈관염), 백반증, 및 베게너 육아종증. 따라서, 본 출원에서 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 일부 예로는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, I형 진성 당뇨병, 크론병; 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 사구체 신염, 강직성 척추염, 혈관염 또는 건선이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 대상체는 또한 천식과 같은 알러지성 장애를 가질 수 있다.
더 또 다른 실시 형태에서, 상기 대상체는 이식된 장기 또는 줄기 세포의 수용자이며, 면역 세포는 거부 반응을 예방하고/하거나 치료하는데 사용된다. 특정 실시 형태에서, 상기 대상체는 이식편 대 숙주 질환을 갖거나 발병할 위험이 있다. GVHD는 혈연 관련 또는 무혈연 관련 공여자 유래의 줄기 세포를 사용하거나 포함하는 모든 이식의 가능한 합병증이다. GVHD에는 급성과 만성의 2 종류가 있다. 급성 GVHD는 이식 후 처음 3개월 이내에 나타난다. 급성 GVHD의 징후는 피부가 벗겨지거나 수포가 생기면서 퍼질 수 있고 보다 심해질 수 있는 손과 발의 붉은 피부 발진을 포함한다. 급성 GVHD는 또한 위와 내장에 영향을 줄 수 있으며, 이러한 경우에는 경련, 메스꺼움 및 설사가 나타난다. 피부와 눈의 황변 (황달)은 급성 GVHD가 간에 영향을 미쳤다는 것을 나타낸다. 만성 GVHD는 중증도에 따라 순위가 매겨지며; 단계/1등급은 경증이고, 단계/4등급은 중증이다. 만성 GVHD는 이식 후 3개월 또는 그 이후에 발생한다. 만성 GVHD의 증상은 급성 GVHD의 증상과 유사하지만, 또한 만성 GVHD는 눈의 점액선, 입의 침샘, 위 내막과 내장을 윤활하는 선에도 영향을 줄 수 있다. 본 출원에서 개시된 면역 세포의 임의의 집단은 이용될 수 있다. 이식되는 장기의 예로는 신장, 간, 피부, 췌장, 폐 및/또는 심장과 같은 고형 장기 이식물, 또는 섬, 간세포, 근모세포, 골수 또는 조혈 또는 기타 줄기 세포와 같은 세포성 이식물을 포함한다. 이식물은 안면 조직과 같은 복합 이식물일 수 있다. 면역 세포는 이식 전에, 이식과 동시에 또는 이식 후에 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 이식 전에, 예를 들어, 이식 전 적어도 1 시간, 적어도 12 시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 하나의 구체적인 비제한적 예에서, 치료학적 유효량의 면역 세포의 투여는 이식 전 3~5일에 일어난다.
일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 면역 세포 요법 전에 비골수 파괴성 림프구 제거 화학 요법을 투여받을 수있다. 상기 비골수 파괴성 림프구 제거 화학 요법은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있는 임의의 적합한 이러한 요법일 수 있다. 상기 비골수 파괴성 림프구 제거 화학 요법은, 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 흑색종인 경우, 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈을 투여하는 예시적인 경로는 정맥내이다. 마찬가지로, 임의의 적합한 용량의 사이클로포스파마이드 및 플루다라빈이 투여될 수 있다. 특별한 양태에서, 약 60 mg/kg의 사이클로포스파마이드가 2일 동안 투여된 후, 약 25 mg/m2 플루다라빈이 5일 동안 투여된다.
특정 실시 형태에서, 상기 B 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 성장 인자가 대상체에게 상기 B 세포에 부수적으로 또는 상기 B 세포에 이어서 투여된다. 상기 성장 인자는 상기 B 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 면역 세포 성장 인자의 예로는 IL-2, IL-4, IL10, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 및/또는 IL-21이 포함되며, 이들은 단독으로 또는 다양한 조합, 예를 들어, 예로서 IL-2와 IL-7, IL-2와 IL-15, IL-7과 IL-15, IL-2, IL-4 및 IL-10, IL-7 및 IL-15, IL-12와 IL-7, IL-12와 IL-15, 또는 IL-12와 IL-2로 사용될 수 있다.
치료학적 유효량의 상기 생성된 B 세포는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 종양내, 척수강내, 뇌실내, 저장소를 통해, 관절내 주사 또는 주입을 비롯한 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
입양 세포 요법에 사용하기 위한 상기 생성된 B 세포의 치료학적 유효량은 치료하고자 하는 대상체에서 목적하는 효과를 달성하는 양이다. 예를 들어, 이것은 진행을 억제하거나 자가 면역 또는 동종 면역 질환의 퇴행을 유발하기 위해 필요하거나 통증 및 염증과 같은 자가 면역 질환에 기인하는 증상을 경감시킬 수 있는 면역 세포의 양일 수 있다. 이것은 염증, 예를 들어, 통증, 부종 및 승온과 관련된 증상을 경감시키기 위해 필요한 양일 수 있다. 이것은 또한 이식된 장기의 거부를 감소시키거나 예방하는데 필요한 양일 수 있다.
상기 생성된 B 세포 집단은 질환에 맞는 치료 요법, 예를 들어, 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수일에 걸친 1회 또는 수회 용량, 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 예방하기 위해 연장된 시간에 걸쳐 주기적 용량으로 투여될 수 있다. 상기 제형 중에 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 질환 또는 장애의 중증도에 좌우될 것이며, 진료 의사의 판단 및 각각의 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. B 세포의 치료학적 유효량은 치료되는 대상체, 고통의 중증도 및 유형 및 투여 방식에 좌우될 것이다. 일부 실시 형태에서, 사람 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8Х104, 적어도 3.8Х105, 적어도 3.8Х106, 적어도 3.8Х107, 적어도 3.8Х108, 적어도 3.8Х109 또는 적어도 3.8Х1010개 B 세포/m2의 범위이다. 특정 실시 형태에서, 사람 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8Х109 내지 약 3.8Х1010개 B 세포/m2의 범위이다. 추가의 실시 형태에서, B 세포의 치료학적 유효량은 체중 kg 당 약 5Х106개 세포 내지 체중 kg 당 약 7.5Х108개 세포, 예를 들어, 체중 kg 당 약 2Х107개 세포 내지 약 5Х108개 세포, 또는 체중 kg 당 약 5Х107개 세포 내지 약 2Х108개 세포로 다양할 수 있다. B 세포의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 상태를 기준으로 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정된다. 유효한 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
상기 B 세포는 면역 매개성 장애의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 조합 요법으로는 하나 이상의 항미생물제 (예를 들어, 항생제, 항바이러스제 및 항진균제), 항종양제 (예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포사이드, 독소루비신 또는 빈크리스틴), 면역 고갈제 (예를 들어, 플루다라빈, 에토포사이드, 독소루비신 또는 빈크리스틴), 면역 억제제 (예를 들어, 아자티오프린 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어, 덱사메타손 또는 프레드니손), 항염증제 (예를 들어, 글루코코르티코이드, 예를 들어, 하이드로코르티손, 덱사메타손 또는 프레드니손, 또는 비스테로이드성 항염증제, 예를 들어, 아세틸살리실산, 이부프로펜 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인 (예를 들어, 인터루킨-10 또는 형질 전환 성장 인자-베타), 호르몬 (예를 들어, 에스트로겐) 또는 백신이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 추가로, 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 사이클로스포린 및 타크롤리무스); mTOR 억제제 (예를 들어, 라파마이신); 마이코페놀레이트 모페틸, 항체 (예를 들어, CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG 또는 B 세포 인식); 화학 요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 트레오설판, 부설판); 방사선 조사; 또는 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 억제제 (예를 들어, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나아제 억제제)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 면역 억제제 또는 면역 허용제가 투여될 수 있다. 이러한 추가의 약제학적 제제는 목적하는 효과에 따라 면역 세포의 투여 전에, 투여 동안에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 상기 세포 및 상기 제제의 이러한 투여는 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 및 동일 부위에 또는 상이한 부위에 이루어질 수 있다.
A. 약제학적 조성물
본 출원에 포함된 방법에 의해 생성된 B 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형이 본 출원에서 제공된다.
본 출원에서 기재된 바와 같은 약제학적 조성물 및 제형은 목적하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분 (예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드)을 하나 이상의 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012])와 혼합하여 감압 동결 건조된 (lyophilized) 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 투약량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화 방지제, 예를 들어, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물, 예를 들어, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어, EDTA; 당류, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어, 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면 활성제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본 출원의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체로는 간질성 약물 분산제, 예를 들어, 가용성 중성 활성 히알루로니다아제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 사람 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)이 추가로 포함된다. rHuPH20을 비롯한 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 공개출원 US 2005/0260186 및 US 2006/0104968에 기재되어 있다. 하나의 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예를 들어, 콘드로이티나아제와 조합된다.
B. 조합 요법
특정 실시 형태에서, 본 실시 형태의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가의 요법과 조합하여 B 세포 집단을 포함한다. 상기 추가의 요법은 방사선 요법, 수술 (예를 들어, 종양 절제술 및 유방 절제술), 화학 요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역 요법 (본 출원에 포함된 것 이외), 골수 이식, 나노 요법, 단클론 항체 요법 또는 상기한 것들의 조합일 수 있다. 상기 추가의 요법은 아쥬반트 (adjuvant) 또는 네오아쥬반트 (neoadjuvant) 요법의 형태일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항전이제의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 부작용 제한제 (side-effect limiting agent) (예를 들어, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소시키는 제제, 예를 들어, 항구역제 등)의 투여이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 방사선 요법이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 수술이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 방사선 요법과 수술의 조합이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 감마선 조사이다. 일부 실시 형태에서, 상기 추가의 요법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적화하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아폽토시스 억제제 및/또는 화학 예방제이다. 상기 추가의 요법은 당해 분야에 공지된 화학 요법제 중 하나 이상일 수 있다.
본 개시 내용의 B 세포 요법은 면역 체크포인트 요법과 같은 추가의 암 요법에 대하여 이전에, 동안에, 이후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 동시 내지 수분, 수일, 수주의 범위의 간격으로 이루어질 수 있다. 면역 세포 요법이 추가의 치료제와 완전히 별개로 환자에게 제공되는 실시 형태에서, 2개의 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 상당한 기간이 각각의 전달 시간 사이에 경과하지 않았다는 것을 일반적으로 보장할 것이다. 이러한 경우에서, 환자에게 항체 요법 및 항암 요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72 시간 이내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6~12 시간 이내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서, 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 각각의 투여 사이에 경과하는 경우, 치료 기간을 유의미하게 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 조합이 이용될 수 있다. 하기 예의 경우, 면역 세포 요법은 "A"이며, 항암 요법은 "B"이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에 대한 본 실시 형태의 임의의 화합물 또는 요법의 투여는 존재하는 경우 제제의 독성을 고려하여 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 실시 형태에서는 조합 요법에 기인할 수 있는 독성을 모니터링하는 단계가 존재한다.
1. 화학 요법
매우 다양한 화학 요법제가 본 실시 형태에 따라 사용될 수 있다. "화학 요법"이라는 용어는 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 지칭한다. "화학 요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 함축하기 위해 사용된다. 이러한 제제 또는 약물은 세포 내에서의 이들의 활성 방식, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 단계에 의해 분류된다. 대안으로, 제제는 DNA를 직접 가교하는 능력, DNA에 삽입되는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사 분열을 유도하는 능력에 기초하여 특성화될 수 있다.
화학 요법제의 예로는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 사이클로포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드 및 우라실 머스타드; 나이트로스우레아, 예를 들어, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라님무스틴; 항생제, 예를 들어, 에네다인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마lI 및 칼리키아마이신 오메가I1); 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어, 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네다인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라르니신 (authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르니신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항-대사 물질, 예를 들어, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 프테로프테린 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어, 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈 및 플록스우리딘; 안드로겐, 예를 들어, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항-부신, 예를 들어, 미토탄 및 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어, 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어, 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 나이트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK다당류 복합체; 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어, 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (예를 들어, CPT-11); 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예를 들어, 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 겜시타빈, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라아제 억제제, 트랜스플라티눔, 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
2. 방사선 요법
DNA 손상을 초래하고 광범위하게 사용되는 다른 인자는 γ선, X선으로서 흔히 공지된 것 및/또는 방사선 동위 원소의 종양 세포로의 유도된 전달을 포함한다. 다른 형태의 DNA 손상 인자, 예를 들어, 마이크로파, 양성자 빔 조사 및 UV 조사도 또한 고려된다. 이러한 인자 모두는 DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 의미의 손상에 영향을 미칠 수 있다. X선에 대한 선량 범위는 장기간 동안 (3 내지 4주) 동안의 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량으로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 1회 선량까지의 범위이다. 방사선 동위 원소의 선량 범위는 매우 다양하며, 동위 원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 흡수에 좌우된다.
3. 면역 요법
통상의 기술자는 추가의 면역 요법이 본 실시 형태의 방법과 조합하여 또는 함께 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역 요법제는 일반적으로 암 세포를 표적화하고 파괴하기 위한 면역 이펙터 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙 (리툭산®)은 이러한 예이다. 상기 면역 이펙터는, 예를 들어, 종양 세포의 표면 상의 일부 마커에 대해 특이적인 항체이다. 상기 항체 단독은 요법의 이펙터의 역할을 할 수 있거나, 세포 사멸에 실제로 영향을 미치기 위해 다른 세포를 동원할 수 있다. 상기 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학 요법제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 컨쥬게이션될 수 있으며, 표적화제의 역할을 할 수 있다. 대안으로, 상기 이펙터는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 이펙터 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 컨쥬게이트 (antibody-drug conjugate: ADC)는 세포 사멸 약물과 공유적으로 연결되는 단클론 항체 (MAb)를 포함하며, 조합 요법에서 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 항원 표적에 대한 MAb의 높은 특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 조합하여, 페이로드 (약물)를 농축된 수준의 항원을 갖는 종양 세포에 전달하는 "무장한 (armed)" MAb를 생성한다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서의 노출을 최소화하여 독성을 감소시키고 치료 지수를 개선시킨다. 예시적인 ADC 약물로는 ADCETRIS® (브렌툭시맙 베도틴) 및 KADCYLA® (트라스투주맙 엠탄신 또는 T-DM1)가 포함된다.
면역 요법의 하나의 양태에서, 종양 세포는 표적화를 잘 받아 들이는, 즉, 다른 세포의 대부분에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하며, 이들 중 임의의 것은 본 실시 형태의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 흔한 종양 마커로는 CD20, 암배아 항원, 타이로시나아제 (p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역 요법의 대안적인 양태는 면역 자극 효과와 항암 효과를 조합하는 것이다. 다음을 포함하는 면역 자극 분자도 또한 존재한다: 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어, MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어, FLT3 리간드.
면역 요법의 예로는 면역 아쥬반트, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovi), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠 및 방향족 화합물; 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β 및 γ, IL-1, GM-CSF 및 TNF; 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2 및 p53; 및 단클론 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2 및 항-p185가 포함된다. 1종 이상의 항암 요법이 본 출원에서 기재된 항체 요법과 함께 이용될 수 있는 것으로 고려된다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역 요법은 면역 체크포인트 (checkpoint) 억제제이다. 면역 체크포인트는 신호 (예를 들어, 공동 자극 분자)를 높이거나 신호를 낮춘다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체 (adenosine A2A receptor: A2AR), B7-H3 (CD276으로도 또한 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠자 (B and T lymphocyte attenuator: BTLA), 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4: CTLA-4, CD152로도 또한 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (indoleamine 2,3-dioxygenase: IDO), 살해 세포 면역글로불린 (killer-cell immunoglobulin: KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (lymphocyte activation gene-3: LAG3), 프로그램된 사멸 1 (programmed death 1: PD-1), T 세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3: TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제 인자 (V-domain Ig suppressor of T cell activation: VISTA)가 포함된다. 특히, 상기 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
상기 면역 체크포인트 억제제는 소분자, 재조합 형태의 리간드 또는 수용체와 같은 약물일 수 있거나, 특히, 사람 항체와 같은 항체이다. 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있으며, 특히, 키메라화, 사람화 또는 사람 형태의 항체가 사용될 수 있다. 통상의 기술자가 알고 있는 바와 같이, 대체 명칭 및/또는 등가 명칭이 본 개시 내용에 언급된 특정 항체에 대해 사용될 수 있다. 이러한 대체 명칭 및/또는 등가 명칭은 본 개시 내용의 맥락에서 상호 교환 가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙은 또한 대체 명칭 및 등가 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙으로 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 리간드 결합 파트너에 대한 PDL-1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, 상기 PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 실시 형태에서, PDL1 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PDL1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 PDL2 결합 길항제는 결합 파트너에 대한 PDL2의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 상기 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 융합 단백질 또는 올리고 펩타이드일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화 항체 또는 키메라 항체)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 면역 접합체 (예를 들어, 불변 영역 (예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역 접합체)이다. 일부 실시 형태에서, 상기 PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 및 OPDIVO®로도 또한 공지된 니볼루맙은 사용될 수 있는 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA® 및 SCH-900475로도 또한 공지된 펨브롤리주맙은 예시적인 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 또한 공지된 CT-011은 또한 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 또한 공지된 AMP-224는 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
본 출원에서 제공되는 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 또한 공지된 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4 (CTLA-4)이다. 사람 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁 번호 L15006을 갖는다. CTLA-4는 T 세포의 표면 상에서 발견되며, 항원 제시 세포의 표면 상에서 CD80 또는 CD86에 결합될 때 "오프 (off)" 스위치로서의 역할을 한다. CTLA4는, 헬퍼 T 세포의 표면 상에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전달하는 면역글로불린 수퍼 패밀리의 구성원이다. CTLA4는 T 세포 공동 자극 단백질인 CD28과 유사하며, 두 분자는 모두 항원 제시 세포 상에서 CD80 및 CD86 (각각 B7-1 및 B7-2로도 또한 호칭됨)에 결합한다. CTLA4는 억제 신호를 T 세포에 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되며, 이의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체와 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
일부 실시 형태에서, 상기 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체 (예를 들어, 사람 항체, 사람화 항체 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 융합 단백질 또는 올리고펩타이드이다.
본 방법에서 사용하기에 적합한 항-사람-CTLA-4 항체 (또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안으로, 당해 분야에서 인식된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙 (10D1, MDX-010, MDX-101 및 Yervoy®로도 또한 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다. 다른 실시 형태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 상기 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인과 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 항체는 상기에서 언급된 항체와 CTLA-4 상의 동일한 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 항체는 상기에서 언급된 항체와 적어도 약 90%의 가변 영역 아미노산 서열 동일성 (예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95% 또는 99%의 가변 영역 동일성)을 갖는다.
4. 수술
암을 갖는 사람 중 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기 결정 (staging), 근치 및 완화 수술을 비롯한 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 근치 수술은, 모두 또는 일부의 암성 조직이 물리적으로 제거되고, 절개되고/되거나 파괴되는 절제를 포함하며, 본 발명의 실시 형태의 치료, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역 요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제는 적어도 일부의 종양의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제에 추가하여, 수술 치료로는 레이저 수술, 냉동 수술, 전기 수술 및 현미경 제어 수술 (모스 수술)이 포함된다.
일부 또는 모든 암성 세포, 조직 또는 종양의 절개시, 공동이 체내에 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가의 항암 요법에 의한 부위의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 또한 투약량을 다양하게 할 수 있다.
5. 기타 제제
기타 제제가 치료제의 치료학적 효능을 개선하기 위해 본 발명의 특정 실시 형태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 추가의 제제로는 세포 표면 수용체와 GAP 결합의 상향 조절에 영향을 미치는 제제, 세포 증식 억제 및 분화 제제, 세포 접착 억제제, 아폽토시스 유발제에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 제제, 또는 다른 생물학적 제제가 포함된다. GAP 결합 수의 증가에 의한 세포간 신호 전달의 증가는 인접하는 과다 증식성 세포 집단에 대한 항-과다 증식성 효과를 증가시킬 것이다. 다른 실시 형태에서, 세포 증식 억제 또는 분화 제제는 치료제의 항-과다 증식성 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있다. 세포 접착 억제제는 본 발명의 실시 형태의 효능을 개선하는 것으로 고려된다. 세포 접착 억제제의 예로는 초점 접착 키나아제 (focal adhesion kinase: FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 아폽토시스에 대한 과다 증식성 세포의 감수성을 증가시키는 기타 제제, 예를 들어, 항체 c225가 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 실시 형태의 특정 양태와 조합하여 사용될 수 있는 것으로 추가로 고려된다.
VI. 제조 물품 또는 키트
B 세포를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 또한 본 출원에서 제공된다. 조작된 B 세포 및/또는 이를 생성하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 본 출원에서 제공된다. 상기 B 세포는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있고 본 출원에 포함된 방법에 의해 생성될 수 있거나, 상기 키트는 이러한 조작된 B 세포를 생성하기 위한 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 B 세포는 이미 CD40L을 발현하도록 변형되었으며, 예를 들어, 유전자 편집되고/되거나 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하는 것과 같이 추가로 변형될 수 있도록 상기 키트에 제공될 수 있다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 B 세포는 하나 이상의 이종 항원 수용체를 발현하고/하거나 유전자 편집되도록 이미 변형되었으며, 추가로 변형될 수 있도록 상기 키트에 제공될 수 있다.
구체적인 실시 형태에서, 상기 B 세포를 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 예를 들어, 특정 유전자를 표적화하는 시약, 하나 이상의 이종 항원 수용체 (또는 상기 이종 항원 수용체(들)를 생성하기 위한 하나 이상의 시약), CD40L 형질 감염 또는 형질 도입 벡터 또는 발현 작제물 또는 이들의 조합을 포함하는 시약이 상기 키트에 제공된다. 일반적인 실시 형태에서, 상기 시약은 DNA 또는 RNA, 단백질, 배지, 완충액, 염, 보조 인자 등을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 구체적인 경우에서, 상기 키트는 목적하는 특정 유전자를 표적화하기 위한 하나 이상의 CRISPR 관련 시약을 포함한다.
제조 물품 또는 키트는 개체에서 암의 진행을 치료하거나 지연시키는데 또는 암을 갖는 개체의 면역 기능을 증진시키는데 면역 세포를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본 출원에서 기재된 임의의 항원 특이적 면역 세포가 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어, 유리, 플라스틱 (예를 들어, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀) 또는 금속 합금 (예를 들어, 스테인리스 스틸 또는 하스텔로이)으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 용기는 제형을 보유하고, 용기 상에 부착된 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 사용상의 주의 사항을 명시할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 설명서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제조 물품은 1종 이상의 또 다른 제제 (예를 들어, 화학 요법제 및 항신생물제)를 추가로 포함한다. 1종 이상의 제제에 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 백 및 주사기를 포함한다.
상기 키트의 구성 요소가 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공될 때, 상기 액체 용액은 수용액일 수 있으며, 멸균 수용액이 특히 고려된다. 상기 조성물은 또한 주사 가능한 조성물 또는 정맥내 투여와 같은 투여에 적합한 임의의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 경우, 용기 수단은 그 자체가 주사기, 피펫 및/또는 이와 유사한 기타 장치일 수 있으며, 이로 인해, 상기 제형을 신체의 감염 부위에 적용하고/하거나, 동물에게 주사하고/하거나, 심지어 상기 키트의 다른 구성 요소에 적용하고/하거나 이와 혼합할 수 있다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 입증하기 위해 포함된다. 당해 분야의 통상의 기술자라면, 하기 실시예들에 개시되는 기술들이 본 발명의 실시에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 밝혀진 기술들을 나타내기 때문에, 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 고려될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 그러나, 당해 분야의 통상의 기술자라면, 본 개시 내용을 고려하여, 수많은 변경이 개시된 구체적인 실시 형태에서 이루어질 수 있으며 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고도 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 인식해야 한다.
실시예 1
일차 B 세포의 대규모 CRISPR/Cas9 매개성 조작 전략
본 실시예는 CRISPR/Cas9에 의한 편집을 비롯한 B 세포의 대규모 조작을 위한 프로토콜의 예를 포함한다. 하나의 예로서, 도 1은 말초 혈액 (PB) B 세포를 먼저 CpG, 항-BCR (B 세포 수용체에 대한 항체 (IgG+iIM) 및 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN-감마 (개별적으로 또는 조합으로))으로 48 시간 동안 자극하는 프로토콜을 예시한다. 그 다음, 이를 레트로바이러스 벡터와 같은 벡터를 통해 CD40L 작제물로 형질 도입시킨다. 일부 경우에서, 이를 CD40L 및 IL-21로 형질 도입시킨다. 상기 IL-21은 막 결합되거나 결합되지 않을 수 있다. 어떤 경우에도, IL-21 및 CD40L은 하나의 이시스트론성 (bicistronic) 작제물에서 또는 상이한 작제물로부터 발현될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 형질 도입된 세포는, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인의 존재하에서 확장된다. 그 다음, B 세포를 필요에 따라 사용하거나 저장할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 B 세포는 기능성 연구, 질량 세포 측정 및/또는 RNA 서열 분석을 거친다.
하나의 예에서, CD40L 대 CD40L-IL21에 의한 일차 B 세포의 형질 도입 효율을 결정한다. 피콜 밀도 원심 분리를 사용하여 PBMC를 말초 혈액으로부터 단리하고, 자성 선택을 사용하여 상기 B 세포를 음성적으로 선택한다. CpG 및 항-IgM/IgG를 사용하여 B 세포를 48 시간 동안 활성화시킨다. 레트로바이러스 벡터를 통해 CD40L로 형질 도입된 B 세포의 형질 도입 효율은 도 2a에 도시되어 있으며, 레트로바이러스 벡터를 통해 CD40L-IL21로 형질 도입된 B 세포의 형질 도입 효율은 도 2b에 도시되어 있다. 상기 형질 도입된 B 세포 성장률을 특정 기간 동안 다양한 사이토카인 조합과의 배양 후에 결정하였다. 도 2d는 T 세포 사이토카인 분비의 B 세포 억제를 입증한다. 동종 이계 T 세포를 냉동 PBMC 샘플로부터 단리하고 항-CD3/CD28 마이크로비드로 활성화시켰다. 이들을 48 시간 동안 다양한 비율로 B 세포와 배양한 다음, T 세포 내에서 IFNg, TNFa 및 IL-2 생산의 양을 평가하기 위해 세포내 염색을 수행하였다. B 세포는 용량 의존적 방식으로 T 세포 사이토카인 생산의 양을 감소시킬 수 있었다. 기능성 검정을 CD40L-IL21에 의한 B 세포 형질 도입 후 5, 7 및 9일에 수행하였으며, B 세포가 배양물에 머물면서 억제 능력을 상실한다 (도 2e).
도 3a는 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CD40L 및 CAR 형질 도입을 조합한 프로토콜의 또 다른 예를 제공한다. B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN-감마 (개별적으로 또는 조합으로))으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 레트로바이러스 벡터를 통해 B 세포를 CAR 작제물 (예로서만 CD19 또는 CD5)로 다시 형질 도입한다. B 세포는 적어도 일부 경우에서 IL-4 및 IL-21을 포함하여 배양 상태로 유지된다. 일부 경우에서, 충분한 수가 기능성 연구, 질량 세포 측정 (CytoF) 및/또는 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, 이를 배양한다. 도 3b는 CAR CD19 또는 CAR CD5로 두 번째로 형질 도입된 CD40L-B 세포의 형질 도입 효율을 제공한다. 제2 형질 도입은 일차 CD40L 형질 도입의 발현을 저하시키지 않는다.
도 4a는 CD40L 형질 도입과 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CRISPR Cas9 유전자 편집을 조합한 프로토콜의 또 다른 예를 예시한다. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN-감마 (개별적으로 또는 조합으로))으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가, 예를 들어, 기능성 연구, 질량 세포 측정 및 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지할 수 있다. CD86, CD95, IL10R 및 PD-1 유전자의 녹아웃 효율은 도 4b에서 제공된다.
CD40L 형질 도입과 일차 말초 혈액 유래 B 세포의 CRISPR Cas9 유전자 편집을 조합한 추가의 프로토콜은 도 5a에 도시되어 있다. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN-감마 (개별적으로 또는 조합으로))으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가 기능성 연구, 질량 세포 측정 및 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지할 수 있다. 도 5b에서 입증된 바와 같이, 본 실험 설계는 단일 세션에서 개별, 이중 또는 삼중 유전자 녹아웃이 성공적으로 수행되도록 허용한다.
도 6은 CD40L 형질 도입된 일차 B 세포의 대규모 CRISPR cas9 유전자 편집의 구체적인 실시 형태를 도시한다. PB B 세포를 먼저 48 시간 동안 CpG, 항-BCR 및 사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IFN-감마 (개별적으로 또는 조합으로))으로 시험관 내에서 자극한다. 그 다음, 레트로바이러스 벡터를 통해 이들을 CD40L로 형질 도입하고 IL-21 및 IL-4로 보충한다. CD40L 형질 도입 후 2일에, 리보핵산 단백질 복합체 (RNP)를 사용하여 CRISPR-cas9 유전자 편집을 수행한다. 필요에 따라, 충분한 수가 기능성 연구, 질량 세포 측정 및/또는 RNA 서열 분석에 사용 가능할 때까지, B 세포를 배양 상태로 유지한다.
소규모 및 대규모 CRISPR-Cas9 유전자 편집 설정 사이의 전기 천공 및 녹아웃 효율의 비교은 도 7에서 제공된다. 도 7a에서 도시된 바와 같이, 전기 천공 효율은 소규모 및 대규모 CRISPR 편집된 B 세포 모두에서 95% 이상이다. 도 7b는 CD47 녹아웃 효율이 소규모 및 대규모 설정 모두에서 높게 유지된다는 것을 입증한다.
도 8은 CRISPR-Cas9 매개성 유전자 녹아웃 후 B 세포의 miR-155 발현 수준을 입증한다. 최대 효율을 발견하기 위해, gRNA의 다양한 조합을 사용하였다. 2와 5의 gRNA 조합이 가장 효율적인 녹아웃을 달성하였다.
* * *
본 출원에서 개시되고 청구된 모든 방법들은 본 개시 내용을 고려하여 과도한 실험 없이도 만들어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 실시 형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변화들을 본 출원에 기재된 방법들, 이들의 단계들 또는 이들의 단계들의 순서에 적용할 수 있다는 사실은 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 한, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련되어 있는 특정 작용제가 본 출원에서 기재된 작용제를 대체할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 당해 분야의 통상의 기술자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상, 범위 및 개념에 속하는 것으로 간주된다.
<110> BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> LARGE-SCALE COMBINED CAR TRANSDUCTION AND CRISPR GENE EDITING OF B CELLS <130> UTSC.P1202WO-1001143837 <140> PCT/US2020/062345 <141> 2020-11-25 <150> 62/941,651 <151> 2019-11-27 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gggccgcaca agttttgatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 aagccacccc aagttagatc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ggtccacctt gtcttcccgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 ctgcagggaa cctccaccat 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tgaccgtctg gaggtaat 18 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 gtaagggtga gcgtgct 17 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 ggcttcgggt ccagcaga 18 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 gctggcactg tacgagt 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 ctcatgctcg cccggctt 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ctactgaagt atacgtaaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ccccttcggt caccacgagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 tcgcttcccg aagtaacaag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 accgaagtcc catatgctcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 cacgttttac gagggagagc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gctaatatgt aggagtcagt 20

Claims (47)

  1. 하기 단계들을 포함하는, 조작된 B 세포를 생성하는 시험관내 방법:
    (a) 제1 기간 동안 말초 혈액 단핵 세포, 조혈 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 불멸화 B 세포주, B 세포 하이브리도마, 골수 및/또는 제대혈 단핵 세포로부터 수득된 B 세포를 자극하되, 상기 자극이 하나 이상의 적절한 사이토카인에 노출시켜 자극된 B 세포를 생성하는 것을 포함하는 단계;
    (b) 상기 자극된 B 세포를 CD40 리간드로 형질 도입하여 CD40L-양성 B 세포를 생성하고 제2 기간 동안 상기 CD40L-양성 B 세포를 수치적으로 확장시키는 단계; 및
    다음 (c1)과 (d1) 또는, (c2)와 (d2) 중 하나:
    (c1) 유효량의 Cas9 또는 CpF1 및 하나 이상의 가이드 RNA를 상기 확장된 CD40L-양성 B 세포에 전달하여 상기 B 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현을 중단시킴으로써 유전자 편집된 B 세포를 생성하는 단계; 및
    (d1) (c1)의 유전자 편집된 B 세포를 이종 항원 수용체를 인코딩하는 벡터로 형질 도입 또는 형질 감염시켜 변형된 유전자 편집된 B 세포를 생성하는 단계;
    또는
    (c2) 상기 확장된 CD40L-양성 B 세포를 이종 항원 수용체를 인코딩하는 벡터로 형질 도입 또는 형질 감염시켜 변형된 B 세포를 생성하는 단계; 및
    (d2) 유효량의 Cas9 또는 CpF1 및 하나 이상의 가이드 RNA를 상기 변형된 B 세포에 전달하여 상기 B 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현을 중단시킴으로써 변형된 유전자 편집된 B 세포를 생성하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자 편집된 변형된 B 세포가 (c1) 및 (d1) 단계로부터 생성되는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 편집된 변형된 B 세포가 (c2) 및 (d2) 단계로부터 생성되는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, (c1) 및 (d2) 단계가 각각 2개 이상의 전달 단계로서 추가로 한정되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 전달 단계가 하나 이상의 유전자를 표적화하는 가이드 RNA를 전달하는 것을 포함하고, 제2 전달 단계가 상기 제1 전달 단계에서의 하나 이상의 유전자와 상이한 하나 이상의 유전자를 표적화하는 가이드 RNA를 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 전달 단계와 상기 제2 전달 단계 사이의 기간이 적어도 약 2일인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 제1 전달 단계와 상기 제2 전달 단계 사이의 기간이 약 2 내지 3일인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 기간이 약 44~48 시간인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 기간이 형질 도입 후 약 4~5일인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 확장이 IL-4, IL-10, IL-21, IL-2, CpG, 항-BCR 또는 이들의 조합의 존재하에 일어나는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, (c1) 또는 (d2) 단계가 IL-4 및/또는 IL-21의 존재하에 일어나는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전달 단계가 전기 천공에 의한 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 전기 천공이 약 200,000개 세포 내지 1x109개 B 세포를 사용하는, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 전기 천공이 약 200,000 내지 2,000,000개 세포를 사용하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 전기 천공이 약 1,000,000 내지 1x109개 B 세포를 사용하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 천공 단계에서의 가이드 RNA의 농도가 3, 4 또는 5 μM인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전기 천공 단계에서의 CpF1 또는 Cas9 뉴클레아제의 농도가 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 μM인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인이 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 또는 이들의 조합인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 사이토카인의 농도가 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300 유닛/ml 또는 1~500 nM인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, 케모카인 수용체 또는 귀소 수용체인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극된 B 세포, 확장된 CD40L-양성 B 세포, 유전자 편집된 B 세포 또는 변형된 유전자 편집된 B 세포가 하나 이상의 사이토카인 유전자 및/또는 하나 이상의 면역글로불린으로 형질 도입 또는 형질 감염되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 암 항원을 표적화하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 항원 수용체가 CD19, EBNA, CD123, HER2, CA-125, TRAIL/DR4, CD20, CD70, 암배아 항원, 알파 태아 단백질, CD56, AKT, Her3, 상피 종양 항원, CD319 (CS1), ROR1, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, CD5, CD23, CD30, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, CD33, CD47, CLL-1, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, BCMA, CD99, p53, 돌연변이된 p53, Ras, 돌연변이된 ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나아제, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, 흑색종 관련 항원, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7A, GAGE-7B, GAGE-8, NA88-A, MC1R, MDA-7, gp75, Gp100, PSA, PSM, 타이로시나아제, 타이로시나아제 관련 단백질, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시타이드 3-키나아제, TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 윌름스 종양 항원 (WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파아제-8/m, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HAGE, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신 II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (interferon regulatory factor 4: IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달 인자 1 (Tumor-associated calcium signal transducer 1: TACSTD1), TACSTD2, 수용체 타이로신 키나아제, 표피 성장 인자 수용체 (Epidermal Growth Factor receptor: EGFR), EGFRvIII, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (platelet derived growth factor receptor: PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (ascular endothelial growth factor receptor: VEGFR), VEGFR2, 세포질 타이로신 키나아제, 인테그린 연결 키나아제 (integrin-linked kinase: ILK), 전사의 신호 전달 인자 및 활성 인자 STAT3, STATS 및 STATE, HIF-1, HIF-2, 핵 인자-카파 B (NF-B), 노치 수용체 NY ESO 1, c-Met, 라파마이신의 포유 동물 표적 (mammalian targets of rapamycin: mTOR), WNT, 세포외 신호 조절 키나아제 (extracellular signal-regulated kinase: ERK), PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신세포 암종-5T4, SM22-알파, 탄산 무수화 효소 I (carbonic anhydrases I: CAI; CAIX), STEAD, TEL/AML1, GD2, 프로테이나아제3, hTERT, 육종 전위 변곡점, EphA2, ML-IAP, EpCAM, TMPRSS2 ETS 융합 유전자, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실 GM1, 메소텔리안, PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SAGE, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구메인, TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항원을 표적화하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 세포에서의 발현이 중단된 유전자가 억제 유전자인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 억제 유전자가 NKG2A, SIGLEC-7, LAG3, TIM3, CISH, FOXO1, TGFBR2, TIGIT, CD96, ADORA2, NR3C1, PD1, PDL-1, PDL-2, CD47, SIRPA, SHIP1, ADAM17, RPS6, 4EBP1, CD25, CD40, IL21R, ICAM1, CD95, CD80, CD86, IL10R, TDAG8, CD5, CD7, SLAMF7, CD38, LAG3, TCR, 베타2-마이크로글루불린, HLA, CD73, CD39 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 따라, 상기 세포가 IL-4 및/또는 IL-21의 존재하에 확장되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 중 임의의 것이 분석되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 기능성 검정, 세포독성 검정 및/또는 생체내 활성에 의해 분석되는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 세포가 유세포 측정, 질량 세포 측정, RNA 서열 분석, CytoF 또는 이들의 조합에 의해 분석되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 중 임의의 것이 저장되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 중 임의의 것이 냉동 보존되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 상기 변형된 유전자 편집된 B 세포가 이를 필요로 하는 개체에게 전달되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 개체가 암, 감염성 질환 또는 면역 관련 장애를 갖는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 B 세포 집단.
  35. 제32항의 집단을 포함하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 집단이 약제학적으로 허용되는 담체에 포함되어 있는, 조성물.
  37. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 B 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 의학적 병태에 대해 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 의학적 병태가 암인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 암이 혈액학적 악성 종양 또는 고형 종양을 포함하는, 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 의학적 병태가 감염성 질환 및/또는 면역 관련 장애인, 방법.
  41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 세포가 상기 개체에게 1회 또는 수회 투여되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 B 세포가 상기 개체에게 수회 투여될 때, 투여 사이의 기간이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간을 포함하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 B 세포가 상기 개체에게 수회 투여될 때, 투여 사이의 기간이 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일을 포함하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 B 세포가 상기 개체에게 수회 투여될 때, 투여 사이의 기간이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개월을 포함하는, 방법.
  45. 제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체가 상기 의학적 병태에 대해 유효량의 하나 이상의 추가의 요법을 투여받는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 추가의 요법이 상기 B 세포의 투여 전, 투여 동안 및/또는 투여 후에 상기 개체에게 투여되는, 방법.
  47. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 B 세포 및/또는 상기 B 세포를 생성하기 위한 하나 이상의 시약을 포함하는 키트.
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