CN117580863A - 嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了嵌合抗原受体(CAR)及其用途。所述CAR包含能够结合并激活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)以增强免疫细胞活化的第一共刺激结构域。还提供了编码所述CAR的核酸序列，包含编码所述CAR的核酸序列的核酸构建体，包含所述核酸序列或核酸构建体的载体，表达所述CAR的细胞，以及制备所述细胞的方法。

Description

嵌合抗原受体及其用途

本申请要求于2021年9月1日提交的中国专利申请202111019962.8的优先权，其全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。

发明领域

本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)及其用途，特别是在治疗癌症中的用途。

背景技术

近年来，过继性T细胞疗法在肿瘤治疗中取得巨大成功，尤其是靶向CD19抗原的嵌合受体T(CAR-T)细胞疗法在血液性肿瘤的治疗中表现出显著且持久的肿瘤抑制效果，成为临床上针对血液性肿瘤的一种行之有效的治疗手段。

尽管取得了一定的成功，但CAR-T细胞在癌症治疗中的广泛应用仍然面临重大挑战，尤其是在实体瘤的治疗中效果并不显著。目前，国内外已开展的众多针对实体瘤的CAR-T疗法临床试验均未获得理想疗效。研究表明CAR-T细胞受实体瘤微环境的影响导致其杀伤能力降低和持久性不足是导致其在实体瘤中治疗效果欠佳的关键原因。因此，如何进一步提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力是解决实体瘤CAR-T疗法治疗低效的关键问题之一。

CAR-T细胞实现其肿瘤杀伤功能的核心是CAR分子，它是通过模拟天然T细胞的TCR受体设计而成。但是，多项研究表明，CAR分子相较于TCR分子，其活化T细胞的能力显著降低，大约只相当于TCR活化能力的1/10-1/1000。因此，提高CAR分子活化T细胞的能力是提高CAR-T细胞肿瘤杀伤能力的关键途径。

CAR分子活化T细胞主要依赖于其胞内段的CD3ζ结构域。CD3ζ结构域中的ITAM基序可以被磷酸化而活化，活化的CD3ζ通过激活下游的ZAP70等分子激活一系列活化相关的信号通路，从而激活T细胞。如何提高CAR分子CD3ζ结构域的磷酸化水平是提高CAR-T细胞活化水平的关键。研究表明，SRC家族的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)是CAR-T细胞中磷酸化CD3ζ的ITAM基序的关键分子。因此，如果能够设法募集更多的活化形式的LCK激酶到CD3ζ的附近，就能提高CD3ζ的活化效率，进而提高CAR-T细 胞的活化水平。

因此，存在开发提高CAR-T细胞的活化水平的CAR分子的需求。

发明概述

发明人出人意料地发现，在T细胞中CD146分子的细胞内结构域(胞质区)能够与LCK分子发生直接的相互作用，并能够通过促进LCK自磷酸化的方式而促进LCK的活化。这种直接的相互作用至少部分依赖于CD146胞质区近膜端的KKGK基序。因此，通过对CAR分子细胞内结构域的改造，将CD146胞质区或其近膜端片段整合到CAR分子的细胞内结构域中，利用其结合并活化LCK的能力，将更多活化形式的LCK分子募集到CAR分子的细胞内结构域上，从而能够更好的活化CAR分子细胞内结构域的CD3ζ结构域，以提高CAR-T细胞活化水平，进而提高CAR-T细胞肿瘤杀伤能力。通过本发明改造的CAR分子能够改善CAR-T细胞的活化，增强CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力，从而应用于包括实体瘤在内的多种癌症的免疫疗法中。

相应地，在一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和细胞内共刺激结构域，其中所述细胞内共刺激结构域包含能够结合并激活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)以增强免疫细胞活化的第一共刺激结构域。

在本发明的CAR的一些实施方案中，所述第一共刺激结构域可以包含衍生自CD146分子的胞质区的序列。在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域可以包含CD146胞质区近膜端KKGK基序。

在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域可以包含CD146胞质区，或其近膜端片段。在一些实施方案中，所述CD146胞质区的近膜端片段的长度可以为4-55个氨基酸，优选10-45个氨基酸，更优选15-35个氨基酸，还更优选15-26个氨基酸。在一些实施方案中，所述CD146胞质区的近膜端片段包含CD146分子的第584-609位氨基酸。

在一些实施方案中，所述细胞内共刺激结构域还可以包含第二共刺激结构域，所述第二共刺激结构域选自4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、2B4、HVEM、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD30、CD40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MyD88、CD2、CD4、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的胞内信 号区或其任何组合。在一些实施方案中，所述第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区。

在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接，任选地通过接头连接。

在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域是CD146胞质区，所述第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区，并且所述第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接。

在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、ICOS(CD278)和CD66d的信号传导区或其任何组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导区。

在一些实施方案中，所述第一共刺激结构域、所述第二共刺激结构域和所述细胞内信号传导结构域从N端到C端的排列顺序为：第一共刺激结构域-第二共刺激结构域-细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域可以包含选自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(41BB)、CD152、CD154和PD1的跨膜结构域或其任何组合。

在一些实施方案中，所述抗原结合结构域可以结合一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)。所述TAA优选选自5T4、甲胎蛋白、BCMA、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、ROR1、GPC3、Tyrp-1、TACI、ALK、C型凝集素样分子1(CLL-1)、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、FLT3、黑色素瘤相关抗原、间皮素、MUC-1、VEGFR2。更优选地，所述抗原结合结构域特异性结合CD19。

在一些实施方案中，所述抗原结合结构域可以选自衍生自针对所述抗原的抗体的抗原结合结构域和衍生自所述抗原的天然配体的抗原结合结构域。优选地，所述衍生自抗体的抗原结合结构域是scFv、Fab或结构域抗体(dAb)的形式。

在一些实施方案中，所述CAR还可以包含铰链区。优选地，所述铰链区可以包含选自CD8、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的铰链 或其片段。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的CAR的核酸序列。

在又一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码本发明的CAR的核酸序列。

在本发明的核酸构建体的一些实施方案中，所述核酸构建体具有以下结构：

BD-hinge-TM-Costi-Singal；

其中：

BD是编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列；

hinge是编码铰链区的核苷酸序列；

TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

Costi是编码细胞内共刺激结构域的核苷酸序列；

Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸构建体具有以下结构：

BD-hinge-TM-Costi1-Costi2-Singal；

其中：

BD是编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列；

hinge是编码铰链区的核苷酸序列；

TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

Costi1是编码第一共刺激结构域的核苷酸序列；

Costi2是编码第二共刺激结构域的核苷酸序列；

Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸序列或核酸构建体的载体。

在一些实施方案中，所述载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体和人工染色体。

在另一方面，本发明提供了表达本发明的CAR的细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞、NK细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞，优选多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、造血干细胞或淋巴祖细胞。

在又一方面，本发明提供了一种制备本发明的细胞的方法，其包括用本发明的载体转导或转染细胞的步骤。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述转导或转染之前或之后扩增和/或活化细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载体、或细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的组合物的一些实施方案中，所述组合物还可以包含第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

在又一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的细胞。

在本发明的方法的实施方案中，所述细胞对于所述受试者是自体的或同种异体的。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)从所述受试者分离含有细胞的样品；(ii)用本发明的载体转导或转染所述细胞；和(iii)将步骤(ii)中得到的细胞施用于受试者。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括施用第二治疗剂。优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

在一些实施方案中，所述癌症可以选自淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。

在另一方面，本发明提供了本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载体、细胞或组合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。

在又一方面，本发明提供了本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载体、细胞或组合物，其用于治疗受试者中的癌症。

在本发明的用途的一些实施方案中，所述癌症可以选自淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。

附图说明

图1显示了CD146与LCK之间的相互作用测定。(A)重组CD146胞质区蛋白的示意图。(B)重组CD146胞质区蛋白和LCK-His蛋白的Pull-down测定。

图2显示了CD146与LCK相互作用位点的确定。(A)CD146细胞内突变体的示意图。(B)使用抗CD146抗体AA1进行免疫沉淀实验以检测293T细胞中CD146细胞内突变体和LCK的相互作用。(C)柱状图显示LCK和CD146比率的量化(n＝3)。

图3显示了本发明的CAR分子在T细胞中的表达。(A)本发明的CAR分子(CD146cyt-4-1BB)和对照CAR分子(4-1BB)的结构示意图。(B)本发明的CAR分子(CD146cyt-4-1BB)和对照CAR分子(4-1BB)的在T细胞中的表达。

图4显示了通过流式细胞术测定的表达本发明CAR的T细胞的活化。(A)与靶细胞共培养后T细胞的活化。(B)与CD19抗原共培养后T细胞的活化。“CTR”表示未转染CAR的T细胞，“4-1BB”表示转染有41BB-CD3ζCAR的T细胞，“CD146cyt-4-1BB”表示转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR的T细胞。未转染CAR的T细胞作为阴性对照。

图5显示了通过流式细胞术测定的表达本发明CAR的T细胞的细胞因子分泌。“4-1BB”表示转染有41BB-CD3ζCAR的T细胞，“CD146cyt-4-1BB”表示转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR的T细胞。

图6显示了通过乳酸盐脱氢酶(LDH)法测定的表达本发明CAR的T细胞的肿瘤杀伤活性。“CTR”表示未转染CAR的T细胞，“4-1BB”表示转染有41BB-CD3ζCAR的T细胞，“CD146cyt-4-1BB”表示转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR的T细胞。未转染CAR的T细胞作为阴性对照。

图7显示了通过活体成像观察到的本发明的CAR T细胞对血液瘤小鼠模型的体内抑瘤作用。(A)效靶比为1:1时本发明的CAR T细胞对血液瘤小鼠模型的体内抑瘤作用。(B)效靶比为1:2时本发明的CAR T细胞对血液瘤小鼠模型的体内抑瘤作用。“CTR”表示注射未转染的人原代T细胞，“4-1BB”表示注射41BB-CD3ζCAR T细胞，“CD146cyt-4-1BB”表示注射CD146cyt-41BB-CD3ζCAR T细胞。

图8显示了通过活体成像观察到的本发明的CAR T细胞对实体瘤小鼠模型的体内抑瘤作用。“CTR”表示注射未转染的人原代T细胞，“4-1BB”表示注射41BB-CD3ζCAR T细胞，“CD146cyt-4-1BB”表示注射CD146cyt-41BB-CD3ζCAR T细胞。

发明详述

术语

除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，本文所使用的术语如Janeway CA Jr，Travers P，Walport M等的《免疫生物学》(Immunobiology)，第五版，New York：GarlandScience(2001)和“A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和 H.编辑(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland中所述的定义。

应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。

在本文中及所附权利要求书中使用术语“包含”时，其不排除其它元素。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中将组定义为包括或包含至少一定数量的实施方案，则还应被理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。

如本文使用的术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样地，如在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

CD146也称为黑素瘤细胞黏附分子、MCAM、MUC18。CD146是一种I型跨膜糖蛋白，在人类中由646个氨基酸组成。CD146蛋白由胞外区、跨膜区和胞质区组成。其中，CD146的胞质区由63个氨基酸(氨基酸584-646)组成，具有两个推定的PKC磷酸化位点和一个双亮氨酸基序。CD146胞质区的近膜端含有保守的带正电荷氨基酸簇KKGK基序，已知该基序充当ERM蛋白的结合位点。“CD146胞质区的近膜端片段”是指CD146靠近跨膜区的胞质区片段，其表示从CD146分子的第584位氨基酸开始到第646位氨基酸之前的片段。

先前的研究表明，CD146在多种细胞中发挥多种作用(Chen J,Luo Y,Hui H,Cai T,Huang H,Yang F,et al.CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2017；114(36):E7622-E31；Luo Y,Duan H,Qian Y,Feng L,Wu Z,Wang F,et al.Macrophagic CD146 promotes foam cell formation and retention during atherosclerosis.Cell Res.2017；27(3):352-72；Yan H,Zhang C,Wang Z,Tu T, Duan H,Luo Y,et al.CD146 is required for VEGF-C-induced lymphatic sprouting during lymphangiogenesis.Sci Rep.2017；7(1):7442；Wang Z,and Yan X.CD146,a multi-functional molecule beyond adhesion.Cancer Lett.2013；330(2):150-62)。

LCK也称为淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶，是Src激酶家族成员，在激活细胞内信号级联的细胞膜信号转导方面至关重要。LCK缺乏会消除近端TCR信号传导并阻断T细胞发育和激活。越来越多的证据表明LCK在Y394处的磷酸化对其激活至关重要(Philipsen L,Reddycherla AV,Hartig R,Gumz J,Kastle M,Kritikos A,et al.De novo phosphorylation and conformational opening of the tyrosine kinase Lck act in concert to initiate T cell receptor signaling.Sci Signal.2017；10(462))。结晶研究表明，LCK形成不对称的头对尾二聚体，其中一个单体的Y394激活环位于另一个单体的活性位点。据报道，转自磷酸化(Transautophosphorylation)对于LCK的激活至关重要(Eck MJ,Atwell SK,Shoelson SE,and Harrison SC.Structure of the regulatory domains of the Src-family tyrosine kinase Lck.Nature.1994；368(6473):764-9；Xu Q,Malecka KL,Fink L,Jordan EJ,Duffy E,Kolander S,et al.Identifying three-dimensional structures of autophosphorylation complexes in crystals of protein kinases.Sci Signal.2015；8(405):rs13)。

如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经工程化改造以包含靶向特定抗原的抗原结合结构域，并在与该抗原结合时激活免疫细胞(例如T细胞或NK细胞，如初始T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞或其组合)以攻击并破坏带有该抗原的细胞的分子。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可以靶向并杀伤肿瘤细胞。

经典的嵌合抗原受体(CAR)是一种嵌合I型跨膜蛋白质，其将细胞外抗原结合结构域连接到细胞内信号传导结构域。抗原结合结构域通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但是它可以基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式或衍生自抗原的天然配体的抗原结合结构域。通常需要铰链结构域以将抗原结合结构域与膜分开并允许其适当的定向。使用的常见铰链结构域是IgG1的Fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以满足条件，例如来自CD8α的茎，以及甚至仅仅单独的IgG1铰链。跨膜结构域将蛋白质锚定在细胞膜中，并将铰链结构域连接至细胞内结构域(胞内域)。

根据至少一种非限制性观点，已经存在至少三“代”的CAR分子。在第一 代CAR中，将其设计为具有衍生自FcεR1的γ链或CD3ζ的细胞内部分的细胞内结构域。因此，这些第一代CAR传输免疫信号1，其足以触发同源靶细胞的T细胞杀伤，但无法完全活化T细胞增殖和存活。为了克服此限制，已经构建了第二代CAR，其具有由T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3ζ的细胞内部分融合而产生的复合胞内域，从而可以在抗原识别后同时传输活化信号和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最有力的共刺激信号——即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还已经描述了一些CAR，其包括TNF受体家族胞内域，如传输存活信号的密切相关的OX40和41BB。现在已经描述了甚至更有力的第三代CAR，其具有能够传输活化、增殖和存活信号的胞内域。

因此，CAR通常包含：(i)抗原结合结构域；(ii)铰链结构域；(iii)跨膜结构域；和(iv)细胞内结构域，其包含信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。

如本文所用的术语“抗原结合结构域”是指嵌合抗原受体识别抗原的部分。在经典CAR中，抗原结合结构域包含：衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。还已经用结构域抗体(dAb)、VHH抗原结合结构域或衍生自抗原的天然配体的抗原结合结构域产生了CAR。

术语“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组DNA表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞是特异性的或者其可以广泛地表达。例如，抗原为肿瘤相关抗原，例如CD19或CD20的全部或片段。

如本文所用的术语“铰链区”是指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间并将抗原结合结构域与胞内域在空间上分开的CAR分子的细胞外结构域。铰链区也可称为“铰链结构域”或“间隔区”。铰链可以有助于受体表达、活性和/或稳定性。铰链还可以提供结合靶抗原的柔性，以允许抗原结合结构域以不同方向定向以促进结合。

在提及CAR的上下文中，“跨膜结构域”是指具有当存在于细胞表面或细胞膜处的分子中(例如跨越细胞膜的一部分或全部)，其具有存在于膜中的属性的结构域。跨膜结构域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常 是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白质的跨膜结构域可以用于提供嵌合受体的跨膜部分。蛋白质的跨膜结构域的存在和跨度可以由本领结构域技术人员使用TMHMM算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)确定。或者，可以使用人工设计的TM结构域。

细胞内结构域(胞内域)是嵌合抗原受体的信号传输部分。它包含信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。抗原识别后，受体簇天然CD45和CD148从突触中排除，且信号传输到细胞，从而激活一种或多种免疫细胞效应功能(例如天然免疫细胞效应功能)。最常用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3ζ的胞内域组分。抗原结合后，其向T细胞传输激活信号。CD3ζ可能不提供完全足够的激活信号，并且可能需要另外的共刺激信号传导。共刺激信号促进T细胞增殖和存活。共刺激信号存在两种主要类型：属于Ig家族(CD28、ICOS)和TNF家族(OX40、41BB、CD27、GITR等)的共刺激信号。

细胞内结构域的信号传导结构域介导免疫细胞的至少一种正常效应功能的激活。例如，T细胞的效应功能可以是包含细胞因子分泌的溶细胞活性或辅助活性。在一些实施方案中，细胞内结构域的信号传导结构域介导T细胞活化、增殖、存活和/或其他T细胞功能。细胞内结构域可以包含作为激活结构域的信号传导结构域(细胞内信号传导结构域)。细胞内结构域还可以包含作为共刺激信号传导结构域的信号传导结构域(细胞内共刺激结构域)。

如本文所用的术语“CD3ξ”定义为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质、或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“CD3ξ胞内信号区”定义为来自ξ链的胞质结构域的氨基酸残基，其足以功能性地传递T细胞活化所需的初始信号。例如，CD3ξ的胞质结构域包含GenBan登录号BAG36664.1的残基52至164、或其功能性直向同源物，即来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。

如本文所用的术语“41BB”指TNFR超家族的成员，其具有GenBank Acc.No.AAA62478.2的氨基酸序列、或来自非人物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。“41BB胞内信号区”定义为GenBank ACC.No.AAA62478.2的氨基酸序列214-255，或来自非分类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等价残基。

如本文所用，术语“核酸序列”、“核酸”和“多核苷酸”旨在彼此同义。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸 可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端处添加吖啶或聚赖氨酸链。出于本文所述用途的目的，应理解，可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。可以进行此类修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。

如本文所用的术语“序列同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性，但是高度保守性较低且具有缺失、添加或替换的序列可具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。

如本文所用的术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介的核酸分子，在该宿主细胞中作为载体的所述核酸分子可以例如复制和/或表达。

如本文所用的术语“细胞”是指能够表达本发明的CAR的任何类型的细胞，例如真核细胞或原核细胞。

如本文所用的术语“转染”是将核酸分子或多核苷酸(包括载体)引入靶细胞的过程。术语“转导”通常用于描述病毒介导的核酸分子或多核苷酸的转移。动物细胞的转染通常涉及在细胞膜中打开瞬时的孔或“洞”，以允许摄取材料。可以使用磷酸钙、通过电穿孔、通过细胞挤压或通过将阳离子脂质与材料混合以产生与细胞膜融合并将它们的运载物沉积入内部的脂质体，进行转染。用于转染真核宿主细胞的示例性技术包括脂质囊泡介导的摄取、热休克介导的摄取、磷酸钙介导的转染(磷酸钙/DNA共沉淀)、显微注射和电穿孔。

如本文所用的术语“治疗”包括在有需要的受试者中的治疗性或预防性治疗。“治疗性或预防性治疗”包括旨在完全预防临床和/或病理表现的预防性治 疗或旨在改善或缓解临床和/或病理表现的治疗性治疗。因此，术语“治疗”还包括改善或预防疾病。例如，治疗可以包括：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。

如本文所用的术语“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的治疗剂的量。“有效量”可根据化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。

如本文所用的术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理导入受试者。本文公开的活性剂的例示性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输液。

如本文中使用的，术语“受试者”、“个体”、和“患者”是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。实例包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种等。

术语“自体”是指源自其稍后重新导入到其中的同一个体的任何物质。例如，本文的治疗方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化改造以表达例如本发明的CAR，然后再施用回同一患者。

术语“同种异体”是指源自一个个体然后被导入相同物种的另一个个体的任何物质，例如同种异体T细胞移植。

本公开的其他特征、目的和优点在以下详细描述中是显而易见的。然而，应当理解，详细描述虽然指示了本公开的实施方案，但是其仅通过说明而非限制的方式给出。

在一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和细胞内共刺激结构域，其中所述细胞内共刺激结构域包含能够结合并激活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)以增强免疫细胞活化的第一共刺激结构域。

CAR可以包含共刺激结构域，例如以增加信号传导效力。参见美国专利 号7,741,465和6,319,494，以及Krause et al.和Finney et al.(同上),Song et al.,Blood 119:696-706(2012)；Kalos et al.,Sci Transl.Med.3:95(2011)；Porter et al.,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)和Gross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)。仅通过TCR产生的信号可能不足以完全激活T细胞，而二次或共刺激信号可以增加激活。因此，本发明的CAR包含激活一种或多种免疫细胞效应功能(例如本文所述的天然免疫细胞效应功能)的一个或多个共刺激结构域。可以使用此类共刺激结构域的一部分，只要该部分转导效应功能信号。

本发明人发现，在T细胞中CD146分子的胞质区能够与LCK分子发生直接的相互作用，并能够通过促进LCK自磷酸化的方式而促进LCK的活化。这种直接的相互作用至少部分依赖于CD146胞质区近膜端的KKGK基序，特别是CD146胞质区的第584-609位氨基酸。因此，通过将CD146胞质区或其近膜端片段(例如，近膜端的KKGK基序，特别是CD146胞质区的第584-609位氨基酸)整合到CAR分子的细胞内结构域中，利用其结合并活化LCK的能力，将更多活化形式的LCK分子募集到CAR分子的细胞内结构域上，从而提高CAR-T细胞活化水平，进而提高CAR-T细胞肿瘤杀伤能力。

因此，在本发明的CAR的一些实施方案中，第一共刺激结构域可以包含衍生自CD146分子的胞质区的序列。

在一些实施方案中，第一共刺激结构域可以包含CD146胞质区近膜端KKGK基序。在一些实施方案中，第一共刺激结构域可以包含CD146胞质区，或其近膜端片段。在一些实施方案中，第一共刺激结构域可以包含CD146胞质区或其近膜端片段的功能变体，所述功能变体相对于野生型序列可以包含一个或多个氨基酸的插入、缺失、取代或添加，只要该变体保留结合并激活LCK以增强免疫细胞活化的能力即可。例如，CD146胞质区或其近膜端片段的功能变体可以是保留KKGK基序并在CD146胞质区的除KKGK基序外的其他位置处包含一个或多个氨基酸的插入、缺失、取代或添加的多肽。

术语“功能变体”是指与亲本多肽具有显著的序列同一性并且保留了亲本多肽的生物活性的多肽。功能变体涵盖，例如，保留了以与亲本多肽类似的程度、以与亲本多肽相同的程度或以比亲本多肽更高的程度结合并激活LCK的能力的本文所述CD146胞质区或其近膜端片段的变体。功能变体的氨基酸序列与亲本多肽的氨基酸序列可以例如，具有至少约30％、50％、75％、80％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

功能变体可以是在亲本多肽中插入、缺失或取代一个或多个氨基酸所形成的功能变体。例如，功能变体可以包含具有至少一个保守性氨基酸取代的亲本多肽的氨基酸序列。保守性氨基酸取代为本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被更换为具有相同化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸取代。例如，保守性氨基酸取代可以为酸性氨基酸置换为另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸置换为具有非极性侧链的另一氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸置换为另一碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸置换为具有极性侧链的另一氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。

术语“CD146胞质区的近膜端片段”是指CD146靠近跨膜区的胞质区片段，其表示从CD146分子的第584位氨基酸开始到第646位氨基酸之前的片段。

例如，CD146胞质区的近膜端片段的长度可以为4-55个氨基酸，优选10-45个氨基酸，更优选15-35个氨基酸，还更优选15-26个氨基酸。在一些实施方案中，CD146胞质区的近膜端片段包含CD146分子的第584-609位氨基酸。

在一些实施方案中，第一共刺激结构域可以包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或者其插入、缺失或取代一个或多个氨基酸所形成的功能变体。

在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域还可以包含第二共刺激结构域。第二共刺激结构域可以选自4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、2B4、HVEM、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD30、CD40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MyD88、CD2、CD4、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的胞内信号区或其任何组合。在一些实施方案中，第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区。

本文提供的第二共刺激结构域的氨基酸序列是本领域已知的。在某些情况下，第二共刺激结构域可以包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接，任选地通过接头连接。

在一些实施方案中，第一共刺激结构域是CD146胞质区，第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区，并且第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接。

可以在抗原与免疫细胞结合时转导信号的细胞内信号传导结构域是已知的，其中任何一个都可以包含在本公开的CAR中。例如，已知T细胞受体(TCR)的细胞质序列在TCR与抗原结合后启动信号转导(参见例如，Brownlie et al.,Nature Rev.Immunol.13:257-269(2013))。

在某些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包含但不限于TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD28、CD29、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CDS、CEACAM1、DNAM1(CD226)、GADS、IA4、ICAM-1、ICAM-1、CD79a、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ICOS、整合素、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LTBR、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞性激活分子(SLAM蛋白)SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、VLA1或VLA-6，或其片段或任何组合。

在一些实施方案中，本发明的细胞内信号传导结构域可以包含选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、ICOS(CD278)和CD66d的信号传导区或其任何组合。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域优选为CD3ζ的信号传导区。

本文提供的细胞内信号传导结构域的氨基酸序列是本领域已知的。在某些情况下，细胞内信号传导结构域可以包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的第一共刺激结构域、第二共刺激结构域和细胞内信号传导结构域从N端到C端的排列顺序为：第一共刺激结构域-第二共刺激结构域-细胞内信号传导结构域。它们任选地通过接头连接。

本发明的CAR中包含的跨膜结构域的类型不限于任何类型。在一些实施方案中，选择与抗原结合结构域和/或细胞内结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域包含一个或多个氨基酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)，例如以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合以最小化与受体复合物其他成员的相互作用。

跨膜结构域可以衍生自天然来源或来自合成来源。当来源为天然来源时，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。示例性跨膜结构域可以衍生自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的ζ链、CD28、CD3ε、CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD4、CD5、CD7、CD8、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD22、CD27、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、TNFSFR25、CD154、4-1BB/CD137、活化的NK细胞受体、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD276(B7-H3)、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、CD79a、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ICOS、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGBl、KIRDS2、LAT、LFA-1、与CD83结合的配体、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Ly108)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、VLA1或VLA-6，或它们的片段或任何组合。

在一些实施方案中，跨膜结构域可以包含选自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(41BB)、CD152、CD154和PD1的跨膜结构域或其任何组合。优选地，跨膜结构域为CD8的跨膜结构域。

在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的(并且可以例如主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸)。在一些实施方案中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体包含在合成跨膜结构域的每个末端。在一些实施方案中，跨膜结构域直接连接至细胞内结构域。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度介于2和10个氨基酸之间)可以在跨膜结构域和细胞内结构域之间形成连接。在一些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。

本文提供的跨膜结构域的氨基酸序列是本领域已知的。在某些情况下，跨膜结构域可以包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

抗原结合结构域是指嵌合抗原受体识别抗原的部分。在一些实施方案中，本发明的抗原结合结构域可以结合一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)。所述TAA优选选自5T4、甲胎蛋白、BCMA、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、ROR1、GPC3、Tyrp-1、TACI、ALK、C型凝集素样分子1(CLL-1)、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、FLT3、黑色素瘤相关抗原、间皮素、MUC-1、VEGFR2。更优选地，所述抗原结合结构域特异性结合CD19。

在一些实施方案中，抗原结合结构域可以选自衍生自针对所述抗原的抗体的抗原结合结构域和衍生自所述抗原的天然配体的抗原结合结构域。优选地，衍生自抗体的抗原结合结构域可以是scFv、Fab或结构域抗体(dAb)的形式。

例如，抗原结合结构域可以是单克隆抗体的Fab片段形式。Fab CAR包含两条链：一条具有抗体轻链可变区(VL)和恒定区(CL)；而一条具有重链可变区(VH)和恒定区(CH)。一条链还包含跨膜结构域和细胞内结构域域。CL和CH之间的缔合引起受体的组装。

Fab CAR的两条链可以具有一般结构：

VH-CH-铰链区-跨膜结构域-细胞内结构域；和VL-CL

或者

VL-CL–铰链区-跨膜结构域-细胞内结构域；和VH-CH。

对于本文所述的Fab型嵌合受体，抗原结合结构域由来自一条多肽链的VH和来自另一条多肽链的VL组成。

多肽链可以包含在VH/VL和CH/CL之间的接头。接头可以是柔性的，并且用于将VH/VL与CH/CL在空间上分开。

柔性接头可以由小的非极性残基(如甘氨酸，苏氨酸和丝氨酸)组成。接头可以包含甘氨酸-丝氨酸接头的一个或多个重复序列，例如(Gly ₄Ser) _n接头，其中n是重复的数目。所述接头或每个接头的长度可以小于50、40、30、20或10个氨基酸。

本文所述的靶向一种或多种TAA的抗原结合结构域的氨基酸序列是已知的。例如，先前已经以CAR形式描述了几种抗CD19抗体，如fmc63、4G7、SJ25C1、CAT19(如WO2016/139487中所述)和CD19ALAb(如WO2016/102965中所述)。这些抗CD19抗体及其抗原结合片段均可用于本发明的CAR中。在 某些情况下，抗原结合结构域可以包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的CAR还可以包含铰链区。铰链区可以位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间。

铰链区可以衍生自天然来源或来自合成来源。在一些实施方案中，铰链区可以是、来自或衍生自CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A、CD79B、CD84(SLAMF5)、CD96、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、ICOS、LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、FcRγ、MHC I类分子、MHC II类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、激活NK细胞受体或Toll配体受体，或其片段或任何组合。

在一些实施方案中，铰链区可以包含选自CD8、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的铰链或其片段。优选地，铰链区可以是CD8铰链。

本文提供的铰链区的氨基酸序列是本领域已知的。在某些情况下，铰链区可以包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供了编码本发明的CAR的核酸序列。

在又一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含编码本发明的CAR的核酸序列。

在本发明的核酸构建体的一些实施方案中，所述核酸构建体具有以下结构：

BD-hinge-TM-Costi-Singal；

其中：

BD是编码抗原结合结构域的核苷酸序列；

hinge是编码铰链区的核苷酸序列；

TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

Costi是编码细胞内共刺激结构域的核苷酸序列；

Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述核酸构建体具有以下结构：

BD-hinge-TM-Costi1-Costi2-Singal；

其中：

BD是编码抗原结合结构域的核苷酸序列；

hinge是编码铰链区的核甘酸序列；

TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

Costi1是编码第一共刺激结构域的核苷酸序列；

Costi2是编码第二共刺激结构域的核苷酸序列；

Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。

在本发明的核酸构建体的实施方案中，抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、细胞内共刺激结构域、第一共刺激结构域和第二共刺激结构域如上文所定义。

优选地，抗原结合结构域特异性结合CD19；铰链区为CD8铰链区；跨膜结构域是CD8跨膜结构域；第一共刺激结构域是CD146分子的胞质区；第二共刺激结构域是41BB胞内信号区；和细胞内信号传导结构域是CD3ζ胞内信号区。

在一些实施方案中，编码抗原结合结构域的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码铰链区的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码跨膜结构域的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码第一共刺激结构域的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码第二共刺激结构域的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列可以是如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或99％序列同一性的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的核酸序列或核酸构建体的载体。

载体的非限制性实例包括但不限于质粒、病毒载体(包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、牛痘病毒载体、多瘤病毒载体和腺病毒相关载体(AAV))、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体本身通常是核苷酸序列，通常是包含插入物(转基因)的DNA序列和作为载体“骨架”的较大序列。

工程化载体通常包含在宿主细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、遗传标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签。如本领域技术人员已知的，大量合适的载体是本领域技术人员已知的，并且许多可商购获得。在J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第4版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2012)中提供了合适载体的实例，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，载体优选选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体和人工染色体。

在另一方面，本发明提供了表达本发明的CAR的细胞。

在一些实施方案中，所述细胞选自淋巴细胞(例如T细胞、NK细胞)和单核细胞(例如PBMC)。在一些实施方案中，所述细胞是T细胞。T细胞可为任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞或来自培养的T细胞系的T细胞，例 如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，则T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。T细胞也可被富集或纯化。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞为分离自人的T细胞。T细胞可以为任何类型的T细胞并且可以为任何发育阶段的T细胞，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞，例如Th1和Th2细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆性T细胞(例如，中心记忆性T细胞和效应记忆性T细胞)、初始T细胞等。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，优选T细胞、NK细胞或巨噬细胞。在某些实施方案中，所述细胞是干细胞，优选多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、造血干细胞或淋巴祖细胞。

在又一方面，本发明提供了一种制备本发明的细胞的方法，其包括用本发明的载体转导或转染细胞的步骤。在一些实施方案中，所述方法还可以包括在所述转导或转染之前或之后扩增和/或活化细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载体、或细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的组合物特别是指适合施用于人的组合物。然而，其通常也涵盖适合施用于非人动物的组合物。所述组合物及其组分(即活性剂和任选的载体或赋形剂)优选为药物上可接受的，即在接受者中能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用。本发明的药学上可接受的组合物可以是例如无菌的。具体地，术语“药学上可接受的”可以表示由管理机构或其他公认的药典认可用于动物，更特别是用于人中。

赋形剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。用于本发明的组合物中的示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。

在本发明的组合物的一些实施方案中，所述组合物还可以包含第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。

第二治疗剂的优选实例包括已知的抗癌药物，例如顺铂、美登素衍生物、 雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；和肽细胞毒素，例如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，例如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，例如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，例如IL-2，趋化因子例如IL-8、血小板因子4；抗体或其片段，例如抗CD3抗体或其片段；补体活化剂；病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。

在又一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明的细胞。

用于治疗疾病的方法涉及本发明细胞的治疗性用途。在本文中，可以对已患有疾病或病况的受试者施用细胞以减轻、降低或改善至少一种与疾病相关的症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进展。

本领域技术人员采用已知技术可确定所施用的细胞的有效量。合适的剂量提供足够量的本发明活性剂，并且优选是治疗有效的，即足以在合理的时间范围内引起受试者或动物的例如治疗性或预防性响应。例如，本发明的细胞的剂量应在从施用时起约2小时或更久，例如12小时至24小时或更久时间(例如，6个月、12个月、24个月等)的时段内足以结合癌症抗原或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段甚至可以更久。如本领域已知，针对治疗目的(如缓解相对于疾病的急性发作)，给药途径、时间和频率，给药制剂的时间和频率，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，疾病状态的严重程度，药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/响应的调整可能是必要的。

用于确定施用剂量的许多测定为本领域已知的。为了本发明的目的，测定可用于确定待施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定包括，将给定剂量的表达本发明CAR的T细胞施用于一组哺乳动物中的哺乳动物(各自被施用不同剂量的T细胞)后，比较靶细胞裂解或由此类T细胞分泌的IFN-γ所达到的程度。在施用某剂量后，靶细胞裂解或IFN-γ分泌所达到的程度可以通过本领域已知的方法测定。本发明的细胞的剂量也通过可能伴随本发明细胞的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师决定施用于每个个 体患者的本发明细胞的剂量，这考虑到多种因素，如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的活性剂、施用途径以及治疗病况的严重程度。在本公开的治疗方法的一些实施方案中，每次输注施用的细胞数目可以例如从约1×10 ⁶至约1×10 ¹²个细胞或更多个细胞之间变化。在某些实施方案中，可以施用少于1x 10 ⁶个细胞。

应认识到，治疗可能需要单次施用治疗有效剂量或多次施用治疗有效剂量的本发明的活性剂。例如，根据特定组合物的配方、半衰期和清除率，一些组合物可以每3至4天施用、每周施用，或每两周施用一次，或在一个月内施用一次。

本发明的细胞可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

受试者是指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。一般而言，哺乳动物受试者包括人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、乳牛等。然而，很容易理解，特别设想将本文提供的细胞和药物组合物用于治疗人类受试者。

在本发明的方法的实施方案中，所述细胞对于所述受试者是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，所述细胞是CAR-T细胞或CAR-NK细胞。

在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(i)从所述受试者分离含有细胞的样品；(ii)用本发明的载体转导或转染所述细胞；和(iii)将步骤(ii)中得到的细胞施用于受试者。

可以从受试者或从其他来源分离含有例如T细胞的样品，例如，可以从患者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物(第二方)的环境中，或从来自不相关供体的外周血(第三方)分离细胞。

在一些实施方案中，所述方法还可以包括施用第二治疗剂。优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。第二治疗剂的优选实例如上文所述。

在一些实施方案中，癌症可以选自淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。

在某些实施方案中，癌症可以是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、急性髓样白血病、B细胞幼淋巴细胞性白血病、B细胞急性淋巴样 白血病(“BALL”)、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性髓样白血病、慢性或急性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、毛细胞白血病、霍奇金病、恶性淋巴组织增生性病况、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、浆细胞增殖性病症(包括无症状性骨髓瘤(郁积型多发性骨髓瘤或惰性骨髓瘤)、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞赘生物、浆细胞瘤(包括浆细胞恶液质；孤立性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；和多发性浆细胞瘤)、POEMS综合征(也称为Crow-Fukase综合征；Takatsuki病；和PEP综合征)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、系统性淀粉样蛋白轻链淀粉样变、T细胞急性淋巴样白血病(“TALL”)、T细胞淋巴瘤、转化滤泡性淋巴瘤或瓦氏巨球蛋白血症、套细胞淋巴瘤(MCL)、转化滤泡性淋巴瘤(TFL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)、多发性骨髓瘤、毛细胞淋巴瘤或白血病。

在某些实施方案中，癌症可以是腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或直肠肛门癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性癌症、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠道类癌肿瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌或膀胱癌。

在另一方面，本发明提供了一种增强免疫细胞活化的方法，其包括向所述免疫细胞导入本发明的CAR。在一些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，所述方法包括用本发明的载体转导或转染免疫细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供了本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载体、细胞或组合物在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。

在又一方面，本发明提供了本发明的CAR、核酸序列、核酸构建体、载 体、细胞或组合物，其用于治疗受试者中的癌症。

在本发明的用途的一些实施方案中，所述癌症可以选自淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。癌症的非限制性实例如上文所述。

通过下面的具体实施例进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，例如，Sambrook和Russeii等人，分子克隆：实验室手册(第三版)(2001)，CSHL出版社中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。

实施例1.CD146与LCK之间的相互作用测定

已有研究表明CD146与免疫应答期间T细胞的活化有关(Pickl WF,et al.MUC18/MCAM(CD146),an activation antigen of human T lymphocytes.Journal of immunology(Baltimore,Md:1950).1997；158(5):2107-15；Elshal MF,et al.CD146(Mel-CAM),an adhesion marker of endothelial cells,is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood.Blood.2005；106(8):2923-4；Brucklacher-Waldert V,et al.Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis.Brain.2009；132(Pt 12):3329-41)。为了确定CD146调节TCR信号传导的机制，首先通过免疫沉淀实验(IP)来检测CD146是否与TCR信号传导相关的分子(例如CD3、CD4、Zap70、LAT、PLCγ、Fyn和LCK)相互作用。结果表明，CD146与CD3、CD4、Zap70、LAT、PLCγ以及Fyn之间没有相互作用，但与LCK之间存在相互作用(数据未显示)。

为了确定CD146与LCK之间的相互作用是直接的还是间接的，构建了两个CD146胞质区的重组体，其中GST蛋白连接在CD146胞质区的C端或N端(分别为CD146胞质区-接头-GST或GST-接头-CD146胞质区)，其结构如图1A所示。将这两个重组体与重组LCK-His蛋白(Abacan，货号ab82185)一起用于Pull-down实验。使重组CD146蛋白连接在GST珠上，洗涤三次后，加入重组LCK-His蛋白并在4℃下孵育1小时。然后用PBS/裂解缓冲液(9:1)洗涤三次，将样品溶解于1X SDS还原样品缓冲液中，然后用抗GST和抗LCK 抗体进行免疫印迹分析，结果如图1B所示。结果显示两种重组体都直接与LCK相互作用，这表明CD146与LCK之间存在直接的相互作用。

为了确定CD146的哪些残基参与其与LCK的相互作用，构建了CD146的三个截短部分，即C19(627个氨基酸，删除了628-646位氨基酸)、C37(609个氨基酸，删除了610-646位氨基酸)和C63(583个氨基酸，删除了584-646位氨基酸)(图2A)。将编码这些CD146截短部分的质粒转染到LCK稳定转染的293T细胞中。用细胞裂解液裂解细胞，细胞裂解物用蛋白A/GSepharose珠预清除，然后上清液在4℃下用抗CD146抗体AA1免疫沉淀过夜。添加蛋白A/G Sepharose珠，并将样品再孵育2小时。用PBS/裂解缓冲液(9:1)洗涤3次后，将样品溶解在1x SDS还原样品缓冲液中并进行(10％)SDS-PAGE。使用CD146和LCK的抗体进行免疫印迹分析，结果如图2B-2C所示。结果显示，仅C63削弱了CD146与LCK之间的相互作用，而C19和C37并未削弱相互作用，这表明CD146与LCK之间的相互作用位点位于胞质结构域的584-609位氨基酸。

先前的研究表明，CD146胞质尾的近膜端区域中保守的带正电荷氨基酸簇KKGK基序充当ERM蛋白的结合位点(Luo Y,Zheng C,Zhang J,Lu D,Zhuang J,Xing S,et al.Recognition of CD146 as an ERM-binding protein offers novel mechanisms for melanoma cell migration.Oncogene.2012；31(3):306-21)。因此，设想该KKGK基序也可能参与与LCK的相互作用。为了验证这一猜想，构建了突变体KKGK-AAGA(图2A)。将编码该突变体的质粒转染到已稳定转染了编码LCK的质粒的293T细胞中，并如上所述进行免疫沉淀实验。结果显示，KKGK突变体显著削弱了与LCK的相互作用，这表明KKGK确实是LCK相互作用所必需的。同时，还构建了另一个带正电荷氨基酸簇RRS基序(其类似于CD4或CD44中与LCK相互作用的基序RRR)的突变体RRS-AAS，并进行类似的实验，结果显示，该突变体未导致与LCK的相互作用削弱(图2B-C)。因此，CD146与LCK的相互作用主要依赖于KKGK基序。

这些结果表明，在T细胞中，CD146分子的细胞内结构域(胞质区)能够与LCK分子发生直接的相互作用，并能够通过促进LCK自磷酸化的方式而促进LCK的活化。这种直接的相互作用依赖于CD146胞质区近膜端的KKGK基序，特别是CD146胞质区的第584-609位氨基酸。因此，设想将这 一发现应用到CAR分子上——通过对CAR分子胞内段结构进行改造，将CD146胞质区或其近膜端片段(例如，近膜端的KKGK基序，特别是CD146胞质区的第584-609位氨基酸)整合到CAR分子的细胞内结构域中，利用其结合并活化LCK的能力，将更多活化形式的LCK分子募集到CAR分子的细胞内结构域上，从而能够更好的活化CAR分子细胞内结构域的CD3ζ结构域，以提高CAR-T细胞活化水平，进而提高CAR-T细胞肿瘤杀伤能力。

实施例2.编码CAR的载体的构建

对第二代CAR进行改造，以使其细胞内结构域(例如在近膜端)包含CD146的胞质区。作为示例，使用Lenti-EF1a-CD19(FMC63)-2nd-CAR(4-1BB)-EGFRt载体(爱康得生物医学技术(苏州)有限公司)构建了编码抗CD19CAR的载体。该载体设计为包含抗CD19scFv(FMC63)、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、CD146胞质区和41BB-CD3ζ胞内信号区。CAR分子与EGFRt片段通过P2A连接子相连接，实现所插入基因片段和EGFRt标记分子的同时转录和翻译，以便后续实验通过EGFRt标记分子检测慢病毒转染效率。根据制造商(和元生物)的说明，将载体进行慢病毒包装，以用于后续转导T细胞。

CAR分子各组分的氨基酸序列和编码序列如下所示。

抗CD19抗原结合结构域(FMC63)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

抗CD19抗原结合结构域(FMC63)的编码序列(SEQ ID NO:2)：

CD8铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

CD8铰链区的编码序列(SEQ ID NO:4)：

CD8跨膜结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

CD8跨膜结构域的编码序列(SEQ ID NO:6)：

CD146胞质区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)：

CD146胞质区的编码序列(SEQ ID NO:8)：

41BB胞内信号区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：

41BB胞内信号区的编码序列(SEQ ID NO:10)：

CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：

CD3ζ胞内信号区的编码序列(SEQ ID NO:12)：

实施例3.CAR-T细胞的构建

通过以下程序构建可稳定表达本发明的CAR分子的T细胞：

(1)培养皿包被：用抗人CD3抗体(1μg/ml)、抗人CD28抗体(1μg/ml)和重组人纤维蛋白片段(5μg/ml)提前4℃过夜包被细胞培养板；

(2)T细胞获得：来源于健康人的外周血单核细胞(PBMC)由北京大学人民医院血液科提供，该样品的使用符合机构审查委员会的伦理规定。利用金克隆品牌的人外周血淋巴细胞分离液(CB6100)分离单个核细胞，再通过MojoSort ^TM Human CD3 T Cell Isolation Kit(货号480021)从中分选出T 细胞。

(3)T细胞激活培养：用T细胞增殖培养基(配方为RPMI 1640培养基+10％热灭活的胎牛血清+丙酮酸钠+非必须氨基酸+青霉素/链霉素+1000IU/ml人IL2)重悬T细胞，使其浓度为1×10 ⁶细胞/ml。每孔500μl接种到用抗人CD3抗体、抗人CD28抗体和重组人纤维蛋白片段提前4℃过夜包被的48孔细胞培养板中，于37℃、5％CO ₂培养箱中进行激活培养。激活24-36小时后的T细胞在抗体和纤连蛋白的作用下贴于细胞培养板底面，细胞体积变大、形态由圆形逐渐变为极化状态，此时细胞即将开始快速增殖，可用于慢病毒感染。

(4)慢病毒感染：将浓缩后的实施例1的慢病毒加入T细胞培养孔中(MOI＝10-30)，再将T细胞培养板在32℃、1700rpm的条件下离心100分钟，然后放回二氧化碳培养箱中继续培养。离心感染36-48小时后，给T细胞更换T细胞增殖培养基(配方为RPMI 1640培养基+10％热灭活的胎牛血清+丙酮酸钠+非必须氨基酸+青霉素/链霉素+1000IU/ml人IL2)，并按照2×10 ⁶细胞/ml的密度转移到新的不含抗CD3抗体、抗CD28抗体和纤连蛋白的培养板中进行扩增培养。每隔一天给T细胞补充新鲜的等倍体积的培养基，维持细胞密度在1×10 ⁶至3×10 ⁶个细胞/ml。离心感染4-5天后，通过慢病毒转导的基因在T细胞中稳定表达(结果如图3所示)，可用于后续分选进行体外实验或直接进行动物实验。

实施例4.CAR-T细胞活化的测定

将未转染的T细胞、转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞、转染有CD146胞质区(CD146cyt)-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞分别与高表达CD19分子的Raji细胞(人Burkitt淋巴瘤细胞系)以1:1的效应细胞-靶细胞比(E:T比)共培养24h。然后通过流式细胞术，利用FITC-抗人CD69抗体检测三种T细胞表面的CD69分子(T细胞活化的标志物)的表达，结果如图4A所示。进一步地，将CD19抗原按照指定浓度(1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml)包被48孔板，然后将上述转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞、转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞加入孔板内，5小时后通过流式细胞术检测两种T细胞的CD69 ⁺细胞比例，结果如图4B所示。

结果显示，在与靶细胞共培养后，与转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分 子的T细胞相比，转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞的活化效率明显增加，从41.4％增加到50％(图4A)。在与CD19抗原共培养后，转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的CD69 ⁺T细胞比例相比转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的CD69 ⁺T细胞比例增加了50％以上(图4B)。这些结果表明CD146胞质区的引入显著促进了CAR-T细胞的活化。

实施例5.CAR-T细胞的细胞因子分泌

将转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞和转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞分别与高表达CD19分子的Raji细胞以1:1的E:T比共培养48h。然后通过流式细胞术检测T细胞内TNF-α、IL-2和IFN-γ的产生，结果如图5所示。

结果显示，与转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞相比，转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞的细胞因子分泌明显增加，TNF-α的分泌从20％增加到31.3％；IL-2的分泌从19.7％增加到34.2％；IFN-γ的分泌从38.8％增加到42％。这表明CD146胞质区的引入显著促进了CAR-T细胞内细胞因子的释放。

实施例6.CAR-T细胞的体外肿瘤杀伤活性

将未转染的T细胞、转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞、转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞分别与高表达CD19分子的Raji细胞以1:1和2:1的E:T比共培养36h后，离心分别收集上清和细胞。

利用非同位素标记的细胞死亡试剂盒(CytoTox96 Non-radioactive Cytotoxicity Assay)检测培养上清中的乳酸盐脱氢酶(其检测原理在于：细胞死亡后，细胞内的乳酸盐脱氢酶(LDH)释放到培养基中，因此通过酶促变色反应检测培养基中LDH的水平，即可换算得出细胞死亡的数量)。靶细胞最大释放组扣减体积校正对照组，实验组和自释放组扣减培养基空白对照组后，按照下列公式计算杀伤率：

杀伤率(％)＝(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放/靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)×100％。

结果显示，与转染有41BB-CD3ζ第二代CAR分子的T细胞相比，转染有CD146cyt-41BB-CD3ζCAR分子的T细胞的肿瘤杀伤效率明显增加，表明 CD146胞质区的引入增加了CAR-T细胞杀伤肿瘤的活性(图6)。这表明在现有CAR分子的细胞内结构域中引入CD146胞质区可进一步提高CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性，从而可用于各种癌症的治疗中。

实施例7.CAR-T细胞对血液肿瘤的体内杀伤活性

本实施例采用雌性NSG免疫缺陷型小鼠为模型。NSG小鼠缺乏T细胞、B细胞、NK细胞和补体系统，并且其巨噬细胞和树突状细胞也存在缺陷。NSG小鼠具有严重的免疫缺陷，因其不会对移植瘤、T细胞产生排斥反应，从而广泛应用于T细胞治疗的临床前研究。本实施例采用6周龄的雌性NSG小鼠，每批实验中小鼠体重差异控制在2g以内。小鼠饲养于无特定病原体(SPF)的清洁级屏障内的独立通风笼中，提供正常饮食和pH偏酸的饮用水，以防止病原体污染。

为构建异种移植血液瘤模型，选取高表达CD19的Raji-luc细胞作为荷瘤细胞，其表达荧光素酶(luciferase)基因，因此可在小鼠体内通过荧光素化学发光、活体成像的方式实时监测血液瘤的发展变化。为充分证明CD146cyt-41BB-CD3ζCAR-T细胞对肿瘤治疗的效果，分别以1:1和1:2的效靶比进行实验，具体实验程序如下所述。

第0天:将Raji-luc细胞以1.5*10 ⁶(效靶比1:1)或1*10 ⁶(效靶比1:2)个细胞/只的接种剂量尾静脉注射到NSG小鼠体内；

第4天:流式细胞术检测每组CAR-T细胞的阳性率(检测EGFR ⁺T细胞占总T细胞的百分比)；

第5天:将荷瘤小鼠编号并随机分为3组，每组三只小鼠。3组小鼠分别为：人T细胞组(注射未转染的人原代T细胞)、41BB CAR-T组(注射FMC63-4-1BB-2 ^nd-CAR T细胞)、CD146cyt-41BB-CAR-T组(注射FMC63-CD8TM-CD146cyt-4-1BB-CD3-CAR T细胞)；

41BB CAR-T组、CD146cyt-41BB-CAR-T组分别以1.5*10 ⁶(效靶比1:1)或5*10 ⁵(效靶比1:2)个CAR-T细胞/只的接种剂量尾静脉注射CAR-T细胞(注射总T细胞数＝1.5*10 ⁶或5*10 ⁵/CAR-T细胞阳性率)；人T细胞组尾静脉注射与其他两组总T细胞数相近的人原代T细胞作为对照。

分别于第8天、第12天、第16天、第20天、第24天，利用小动物活体成像仪lumina3检测每只小鼠中Raji-luc细胞在小鼠体内的生长情况，以评 估CAR-T细胞的体内肿瘤杀伤效率，结果如图7所示。

结果显示，在效靶比1:1时，CD146cyt-41BB CAR-T组和41BB CAR-T组均能抑制血液瘤的生长，两者效果相当；而在效靶比1:2时，CD146cyt-41BB CAR-T组比41BB CAR-T组具有更加显著的抑瘤效果。

实施例8.CAR-T细胞对实体肿瘤的体内杀伤活性

为构建实体肿瘤模型，本实施例利用NSG小鼠，将上述Raji-luc细胞进行皮下荷瘤，每只小鼠接种3*10 ⁶个细胞，接种后第7天将荷瘤小鼠编号并随机分为3组，每组两只小鼠。3组小鼠分别为：人T细胞组(注射未转染的人原代T细胞)、41BB CAR-T组(注射FMC63-4-1BB-2 ^nd-CAR T细胞)、CD146cyt-41BB-CAR-T组(注射FMC63-CD8TM-CD146cyt-4-1BB-CD3-CAR T细胞)。每组小鼠每只注射相应T细胞4*10 ⁶个，分别在接种后第13天和第18天成像检测，结果如图8所示。

结果显示，相较于人T细胞组，41BB CAR-T组的肿瘤荧光显著降低，表明41BB第二代CAR-T细胞对实体肿瘤具有一定的杀伤能力；而相较于41BB CAR-T组，CD146cyt-41BB-CAR-T组的肿瘤荧光也明显降低，表明CD146cyt-41BB-CAR T细胞对实体肿瘤的杀伤优于41BB第二代CAR T细胞。

本申请参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本申请作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所述排除没有在本申请中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。

虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。

Claims (37)

1. 一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和细胞内共刺激结构域，其中所述细胞内共刺激结构域包含能够结合并激活淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)以增强免疫细胞活化的第一共刺激结构域。
2. 根据权利要求1的CAR，其中所述第一共刺激结构域包含衍生自CD146分子的胞质区的序列。
3. 根据权利要求1或2的CAR，其中所述第一共刺激结构域包含CD146胞质区近膜端KKGK基序。
4. 根据权利要求1-3中任一项的CAR，其中所述第一共刺激结构域包含CD146胞质区，或其近膜端片段。
5. 根据权利要求4的CAR，其中所述CD146胞质区的近膜端片段的长度为4-55个氨基酸，优选10-45个氨基酸，更优选15-35个氨基酸，还更优选15-26个氨基酸。
6. 根据权利要求4或5的CAR，其中所述CD146胞质区的近膜端片段包含CD146分子的第584-609位氨基酸。
7. 根据权利要求1-6中任一项的CAR，其中所述细胞内共刺激结构域还包含第二共刺激结构域，所述第二共刺激结构域选自4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、ICOS(CD278)、2B4、HVEM、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、CD30、CD40、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、MyD88、CD2、CD4、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的胞内信号区或其任何组合。
8. 根据权利要求7的CAR，其中所述第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区。
9. 根据权利要求7或8的CAR，其中所述第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接，任选地通过接头连接。
10. 根据权利要求7的CAR，其中所述第一共刺激结构域是CD146胞质区，所述第二共刺激结构域是41BB的胞内信号区，并且所述第一共刺激结构域的C端与第二共刺激结构域的N端连接。
11. 根据权利要求1-10中任一项的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含选自TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、 CD79a、CD79b、ICOS(CD278)和CD66d的信号传导区或其任何组合。
12. 根据权利要求11的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导区。
13. 根据权利要求7-12中任一项的CAR，其中所述第一共刺激结构域、所述第二共刺激结构域和所述细胞内信号传导结构域从N端到C端的排列顺序为：

    第一共刺激结构域-第二共刺激结构域-细胞内信号传导结构域。
14. 根据权利要求1-13中任一项的CAR，其中所述跨膜结构域包含选自T细胞受体(TCR)的α链、TCR的β链、TCR的ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(41BB)、CD152、CD154和PD1的跨膜结构域或其任何组合。
15. 根据权利要求1-14中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域结合一种或多种肿瘤相关抗原(TAA)。
16. 根据权利要求15的CAR，其中所述TAA选自5T4、甲胎蛋白、BCMA、CA-125、癌胚抗原、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD40、CD56、CD79、CD78、CD123、CD138、c-Met、CSPG4、ROR1、GPC3、Tyrp-1、TACI、ALK、C型凝集素样分子1(CLL-1)、EGFR、EGFRvIII、ERBB2、FLT3、黑色素瘤相关抗原、间皮素、MUC-1、VEGFR2，优选地，所述抗原结合结构域特异性结合CD19。
17. 根据权利要求1-16中任一项的CAR，其中所述抗原结合结构域选自衍生自针对所述抗原的抗体的抗原结合结构域和衍生自所述抗原的天然配体的抗原结合结构域。
18. 根据权利要求17的CAR，其中所述衍生自抗体的抗原结合结构域是scFv、Fab或结构域抗体(dAb)的形式。
19. 根据权利要求1-18中任一项的CAR，其中所述CAR还包含铰链区，优选所述铰链区包含选自CD8、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM的铰链或其片段。
20. 一种核酸序列，其编码根据权利要求1-19中任一项的CAR。
21. 一种核酸构建体，其包含编码根据权利要求1-19中任一项的CAR的核酸序列。
22. 根据权利要求21的核酸构建体，其具有以下结构：

    BD-hinge-TM-Costi-Singal；

    其中：

    BD是编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列；

    hinge是编码铰链区的核苷酸序列；

    TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

    Costi是编码细胞内共刺激结构域的核苷酸序列；

    Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
23. 根据权利要求22的核酸构建体，其具有以下结构：

    BD-hinge-TM-Costi1-Costi2-Singal；

    其中：

    BD是编码所述抗原结合结构域的核苷酸序列；

    hinge是编码铰链区的核苷酸序列；

    TM是编码跨膜结构域的核苷酸序列；

    Costi1是编码第一共刺激结构域的核苷酸序列；

    Costi2是编码第二共刺激结构域的核苷酸序列；

    Singal是编码细胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
24. 一种载体，其包含根据权利要求20的核酸序列或根据权利要求21-23中任一项的核酸构建体。
25. 根据权利要求24的载体，其中所述载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体和人工染色体。
26. 一种细胞，其表达根据权利要求1-19中任一项的CAR。
27. 根据权利要求26的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，优选T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
28. 根据权利要求26的细胞，其中所述细胞是干细胞，优选多能干细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、造血干细胞或淋巴祖细胞。
29. 一种制备权利要求26-28中任一项的细胞的方法，其包括用权利要求24或25的载体转导或转染细胞的步骤。
30. 根据权利要求29的方法，其还包括在所述转导或转染之前或之后扩增和/或活化细胞的步骤。
31. 一种组合物，其包含根据权利要求1-19中任一项的CAR、根据权利 要求20的核酸序列、根据权利要求21-23中任一项的核酸构建体、根据权利要求24或25的载体、或根据权利要求26-28中任一项的细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
32. 根据权利要求31的组合物，其中所述组合物还包含第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。
33. 一种治疗受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求26-28中任一项的细胞。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的或同种异体的。
35. 根据权利要求34的方法，其包括以下步骤：

    (i)从所述受试者分离含有细胞的样品；

    (ii)用权利要求24或25的载体转导或转染所述细胞；和

    (iii)将步骤(ii)中得到的细胞施用于受试者。
36. 根据权利要求33-35中任一项的方法，其中所述方法还包括施用第二治疗剂，优选地，所述第二治疗剂选自抗体、化疗剂和小分子药物。
37. 根据权利要求33-36中任一项的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病和实体瘤。