BR112021002579A2

BR112021002579A2 - novas construções de car compreendendo os domínios de tnfr2

Info

Publication number: BR112021002579A2
Application number: BR112021002579-0A
Authority: BR
Inventors: Tobias Abel; David Fenard; Julie Gertner-Dardenne; François Meyer
Original assignee: Sangamo Therapeutics France
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2019-08-09
Publication date: 2021-05-11
Also published as: IL280697A; SG11202101415UA; WO2020030979A2; JP2021534815A; US20210292389A1; KR20210046006A; EP3833446A2; MX2021001592A; AU2019318135A1; WO2020030979A3; WO2020030979A8; CA3109253A1; CN112888481A

Abstract

OVAS CONSTRUÇÕES DE CAR COMPREENDENDO OS DOMÍNIOS DE TNFR2 A presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio transmembrana (TM) de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e a uma célula imune que expressa o dito CAR. A presente invenção se refere adicionalmente a métodos terapêuticos que compreendem a administração de uma célula imune que expressa um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio transmembrana (TM) de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “NOVAS CONSTRUÇÕES DE CAR COMPREENDENDO OS DOMÍNIOS DE TNFR2” Referência a pedidos relacionados

[001] Esse pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos da América nº 62/717,234, depositado em 10 de agosto de 2018. A descrição desse pedido é incorporada nesse documento por referência em sua totalidade.

Listagem de Sequências

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é incorporada nesse documento por referência em sua totalidade. A cópia eletrônica da Listagem de Sequências, criada em 9 de agosto de 2019, tem o nome 025297_WO003_SL.txt e tem 195.578 bytes.

Campo da invenção

[003] A presente invenção se refere ao campo da imunoterapia. Em particular, a presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (ou chimeric antigen receptor - CAR) compreendendo um domínio transmembrana (TM) TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio intracelular TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo. A presente invenção se refere também a uma população celular que expressa o referido CAR e ao seu uso para o tratamento de doenças ou distúrbios.

Fundamentos da invenção

[004] A tecnologia de receptor de antígeno quimérico (CAR) revolucionou recentemente a terapia de câncer, especialmente no contexto de linfoma e leucemia de células B. Enquanto as células T pró-inflamatórias manipuladas de CAR são extensivamente estudadas e sugeridas para proporcionar eficácia no tratamento de malignidades hematológicas em testes clínicos de fase precoce, as células T regulatórias (Tregs) manipuladas por CAR são menos avaliadas.

[005] As Tregs humanas desempenham um papel chave na manutenção da homeostase imune e assim podem ser usadas como meios terapêuticos em diversas condições clínicas. Elas também possuem propriedades imunossupressoras potentes que podem ser desenvolvidas para conferir imunomodulação específica ao antígeno em uma situação terapêutica. Por essas razões, a terapia com células Treg foi desenvolvida com o objetivo de tratar, por exemplo, doenças inflamatórias crónicas, doenças autoimunes, doenças alérgicas e condições de transplante de órgãos tais como rejeição de enxerto ou doença de enxerto contra hospedeiro (ou graft-versus-host disease - GvHD).

[006] Na técnica, foi sugerida a transdução de células Treg com uma construção de CAR, por exemplo, na Publicação de Patente PCT WO 2008/095141.

[007] Foram desenvolvidos vários formatos moleculares de CAR, diferindo em seus domínios extracelulares, transmembranares e citoplásmicos. No campo de células T efetoras, o módulo intracelular do receptor de antígeno quimérico (CAR) consiste tipicamente em domínios CD28, ICOS ou 4-1BB juntamente com CD3 zeta. No entanto, o uso desses módulos prototípicos para conceber células CAR Treg leva frequentemente a uma sinalização constitutiva descontrolada que resulta em uma ativação constitutiva descontrolada. Essa sinalização tônica (correspondendo a um antecedente de ativação dependente de antígeno) pode levar à exaustão prematura de células CAR Treg, limitando assim o seu uso terapêutico.

[008] Existe, portanto, a necessidade de novas construções de CAR com sinalização tônica mais baixa quando expressa em células imunes, particularmente células Treg.

Sumário da invenção

[009] A presente invenção fornece novas construções de CAR compreendendo domínios transmembrana de TNFR2 ou fragmentos ou variantes dos mesmos e/ou domínios intracelulares de TNFR2 ou fragmentos ou variantes dos mesmos. Como demonstrado nesse documento, as células T manipuladas e as células Treg manipuladas expressando as referidas construções de CAR apresentam uma forte diminuição da sinalização tônica em comparação com as referidas células expressando um CAR convencional. Após o engajamento CAR, as células Treg manipuladas mostraram atividade supressora altamente eficiente sobre a proliferação de células T efetoras, demonstrando assim a vantagem destas células Treg para a terapia celular.

[0010] Em algumas modalidades, as células Treg humanas apresentam uma ou mais das seguintes características: a) comparadas com Tregs expressando um CAR tendo um domínio transmembrana CD8 humano e um domínio de sinalização intracelular coestimulador 4-1BB, as presentes células Treg expressam o CAR na superfície celular em um nível mais baixo no entanto exibem níveis comparáveis de ativação específica a CAR; b) as presentes células Treg retêm seu fenótipo Treg (por exemplo, níveis elevados de expressão de FoxP3, Helios e CD62L, e baixos níveis de expressão de CD127) após mais de uma semana (por exemplo, nove dias de cultura); e c) as presentes células Treg têm a capacidade de controlar GvHD in vivo (por exemplo, em um modelo GvHD de camundongo).

[0011] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um CAR compreendendo um domínio de ligação extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que  o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana do receptor de fator de necrose tumoral humano 2 (TNFR2) ou um fragmento ou variante do mesmo, ou  o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, ou  tanto (i) como (ii).

[0012] Em determinadas modalidades, um CAR descrito nesse documento compreende ainda um domínio de dobradiça extracelular, por exemplo, uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano. Em modalidades em particular, o domínio de dobradiça compreende a sequência da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 14

[0013] Em determinadas modalidades, o domínio intracelular de um CAR descrito nesse documento compreende um domínio de sinalização intracelular primário de célula imune, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário de células T de CD3 humano. Em modalidades em particular, o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano, opcionalmente compreendendo a sequência das SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com as SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31.

[0014] Em determinadas modalidades, o CAR compreende:  um domínio de ligação extracelular,

 um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano,  um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e  um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

[0015] Em determinadas modalidades, o CAR compreende:  um domínio de ligação extracelular,  um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano, um domínio transmembrana e  um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

[0016] Em determinadas modalidades, o CAR compreende:  um domínio de ligação extracelular,  um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano,  um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e

 um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

[0017] Em determinadas modalidades, o domínio transmembrana de um CAR descrito nesse documento compreende pelo menos oito aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 22. Em determinadas modalidades, o domínio transmembrana compreende pelo menos oito resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 22 em combinação com resíduos de aminoácidos de um domínio transmembrana de uma proteína que não é TNFR2. Em determinadas modalidades, o domínio transmembrana compreende a sequência de aminoácidos de VNCVIMTQV (SEQ ID NO: 63).

[0018] Em determinadas modalidades, o domínio intracelular de um CAR descrito nesse documento compreende pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 34. Em determinadas modalidades, o domínio intracelular compreende pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34 em combinação com resíduos de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de uma proteína que não é TNFR2.

Em determinadas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende os resíduos 1-70, 1-115 ou 1-156 da SEQ ID NO: 34.

[0019] Em determinadas modalidades, o CAR compreende:  um domínio de ligação extracelular,  um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça CD8 da SEQ ID NO: 14,  um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 da SEQ ID NO: 22, e  um domínio intracelular compreendendo:  um domínio de sinalização intracelular CD3 zeta humano primário da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, e  um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 da SEQ ID NO: 34.

[0020] Em determinadas modalidades, o domínio de ligação extracelular de um CAR descrito nesse documento é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

Em modalidades em particular, o domínio de ligação extracelular é um fragmento variável de cadeia simples (scFv). O domínio de ligação extracelular pode ligar especificamente, por exemplo,  um autoantígeno, em que o autoantígeno é opcionalmente o receptor de IL-23 (IL-23R);  um antígeno de célula B, opcionalmente selecionado de CD19 e CD20; ou

 uma molécula alogênica HLA de classe I ou classe II, em que a molécula de classe I é opcionalmente HLA-A2.

[0021] A presente invenção também fornece uma sequência de ácido nucleico que codifica um CAR descrito nesse documento, bem como um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico e uma célula hospedeira compreendendo a sequência de ácido nucleico ou o vetor.

[0022] A presente invenção também fornece uma população de células imunes expressando um CAR descrito nesse documento. Em algumas modalidades, as células imunes são selecionadas a partir do grupo consistindo em células T, células exterminadoras naturais (ou natural killer - NK), células T αβ, células T 𝛄δ, células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias (Treg), células imunes efetoras, células T efetoras, células B e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas, em que as células imunes são opcionalmente células humanas. Em modalidades em particular, a população compreende células Treg, em que as células Treg são opcionalmente células humanas.

[0023] Em determinadas modalidades, a população de células imunes compreende células Treg humanas expressando um CAR compreendendo:  um domínio de ligação extracelular,

 um domínio de dobradiça compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humano,  um domínio transmembrana de TNFR2 humano, e  um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

[0024] A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo uma célula imune, uma célula hospedeira, ou uma população de células imunes que expressa um CAR descrito nesse documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Também é fornecido um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano em necessidade do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo da composição farmacêutica.

[0025] A presente invenção também fornece um receptor de antígeno quimérico ou uma população de células imunes descrita nesse documento, para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano em necessidade do mesmo.

[0026] A presente invenção também fornece o uso de um receptor de antígeno quimérico ou população de células imunes descrita nesse documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano em necessidade do mesmo.

[0027] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é selecionado do grupo consistindo em uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, uma condição de transplante de órgão, um câncer e uma doença infecciosa.

[0028] Em algumas modalidades, o indivíduo humano tem necessidade de imunossupressão e o CAR é expresso em células Treg no indivíduo humano.

[0029] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, ou uma condição de transplante de órgão (por exemplo, rejeição de enxerto ou doença enxerto contra hospedeiro).

[0030] A invenção também fornece um receptor de antígeno quimérico ou uma população de células imunes descritos nesse documento para uso como um medicamento.

Breve descrição dos desenhos

[0031] A Figura 1 ilustra uma vista esquemática das construções CD19-CAR, CD20-CAR e IL-23R-CAR. Os CARs compreendem uma sequência líder CD8 humana (CD8), opcionalmente um marcador de hemaglutinina (HA), uma sequência scFv (anti-CD19, anti-CD20, ou anti-IL-23R), opcionalmente um marcador de estreptavidina (Tag), um domínio de dobradiça (ligante), um domínio transmembrana (TNFR2 ou CD8), um domínio de sinalização intracelular coestimulador (4-IBB Ou TNFR2) e CD3ζ). A construção de CAR está em quadro com uma sequência de codificação P2A-GFP.

[0032] A Figura 2 ilustra gráficos de pontos de citometria de fluxo mostrando a eficiência de transdução e expressão de CAR na superfície celular de Tregs. A eficiência de transdução foi avaliada por expressão de GFP e a expressão de CAR foi avaliada por expressão de HA para CD19-CAR (CD8TM/4-1BB ou TNFR2) ou coloração de proteína L para CD20- CAR(CD8TM/4-1BB ou TNFR2). MFI: Intensidade Média de Fluorescência (ou Mean Fluorescence Intensity).

[0033] A Figura 3 mostra a análise Western blot da expressão de CAR em Tregs humanos transduzidos com CD20-CAR (CD8TM/4-1BB ou TNFR2) ou não-transduzidos (“em branco”). A coloração com o anticorpo específico a CD3 zeta revelou o CD3 zeta endógeno a l6kD, o CD20-CAR (CD8TM/4-1BB) a 〜62 kD, e o CD20-CAR (TNFR2) a 82 kD (Painel A, em cima à esquerda). A membrana foi então lavada e sondada outra vez com anticorpo β-actina como um controle de carga (Painel A, em baixo à esquerda). A intensidade da banda foi quantificada usando Image J e os resultados são mostrados de dois doadores diferentes no Painel B.

[0034] A Figura 4 apresenta histogramas mostrando que os CARs derivados de TNFR2 mantêm a ativação específica a CAR. No dia 9, as Tregs FoxP3 transduzidos foram semeados isoladamente ou na presença de glóbulos revestidos anti-

CD3/anti-CD28, ou na presença de células B autólogas recentemente descongeladas. Após 24 horas, os CD19-CARs (à esquerda em cima), CD20-CARs (à direita em cima) e IL-23R- CARs (em baixo) foram corados para a expressão de superfície celular CD4 e CD69. As barras de erro representam a média ± SEM. CTRL: Células Treg não-transduzidas com um CAR.

[0035] A Figura 5 é um gráfico mostrando que os CARs derivados de TNFR2 exibem atividade supressora mediada por CAR eficiente. A supressão dependente de contato mediada por Tregs CD19-CAR (Painel A), Tregs CD20-CAR (Painel B), ou Tregs IL-23R-CAR (Painel C) na ausência de qualquer ativação (linhas tracejadas) ou após a ativação de CAR induzida por células B (linhas sólidas) foi avaliada medindo a proliferação de células T convencionais (Tconv) usando a citometria de fluxo. As linhas com círculos representam construções de CAR CD8TM/4-1BB e as linhas com quadrados representam construções de CAR TNFR2. As barras de erro representam a média ± SEM.

[0036] A Figura 6 ilustra uma vista esquemática de construções de CD19-CAR da invenção. O CAR compreende uma sequência líder CD8 humana (CD8), uma sequência scFv (anti- CD19), um marcador de estreptavidina (Tag), um domínio de dobradiça (ligante), um domínio transmembrana (CD8, TNFR2 ou CD8/TNFR2 fundido), um domínio de sinalização intracelular coestimulador (4-IBB, TNFR2 ou fragmentos TNFR2) e CD3 zeta

(CD3z). A construção de CAR está em quadro com uma sequência de codificação P2A-GFP.

[0037] A Figura 7 é um par de gráficos mostrando que as construções TNFR2 com supressão do C-terminal exibem diferentes níveis de expressão de superfície e são funcionais na sinalização de CD3z em células Jurkat-NFAT. As células Jurkat-NFAT foram transduzidas com as construções indicadas.

Após uma semana em cultura, a expressão de superfície de CAR foi determinada por coloração de proteína (Painel A), e as células foram ativadas por células Daudi expressando CD19 em uma proporção de 1:1. 24 horas mais tarde, a secreção de luciferase dependente de NFAT foi determinada usando um luminômetro Glowmax (Painel B).

[0038] A Figura 8 é um conjunto de gráficos de pontos mostrando a eficiência de transdução e a expressão de CAR na superfície celular (em cima e em baixo à esquerda) e um gráfico mostrando a viabilidade das células CAR-Treg transduzidas (em baixo à direita). A eficiência de transdução no dia 8 (%) foi avaliada usando os níveis de expressão de GFP, e a densidade de CAR (MFI) foi avaliada usando a marcação de proteína-L. A viabilidade celular foi avaliada usando o método de exclusão de iodeto de propídio. As barras de erro representam a média ± SD.

[0039] A Figura 9 é um gráfico mostrando a sinalização tônica independente do ligante e a capacidade de ativação de

CARs anti-CD20. No dia 9, as Tregs FoxP3 transduzidos foram semeados isoladamente (“nenhuma”), na presença de glóbulos revestidos anti-CD3/anti-CD28, ou na presença de células B autólogas recentemente descongeladas (células B). Após 24 horas, as células foram coradas para a expressão de superfície celular de CD4 e CD69. As barras de erro representam a média ± SD. Para a condição “nenhuma”, foi realizada uma análise estatística usando a condição GFP como um controle (*p<0,05, **p<0,0l e ***p<0,00l, teste T pareado).

[0040] A Figura 10 ilustra um conjunto de gráficos mostrando que os CARs CD20 derivados de TNFR2 exibem atividade supressora mediada por CAR eficiente, mas não os CARs CD20 derivados de 4-1BB e TNFR1. A supressão dependente de contato mediada por células Treg de CAR na ausência de qualquer ativação (“nenhuma”) ou após a ativação de CAR induzida por células B (“células B”) foi avaliada medindo a proliferação de células T convencionais (Tconv).

[0041] A Figura 11 é um conjunto de gráficos mostrando a potência da atividade supressora mediada por CAR. A supressão dependente de contato (%) após a ativação de CAR induzido por células B usando os CARs derivados de TNFR2 (em cima) ou derivado de TNFR1 (em baixo) foi representada como uma função do número de células CAR-Treg no ensaio. Esta representação permite o cálculo do número de CAR-Tregs necessários para desencadear uma supressão de 50%.

[0042] A Figura 12 ilustra uma vista esquemática de construções HLA-A2-CAR usados no Exemplo 5. Os CARs compreendem uma sequência líder CD8 humana (CD8), uma sequência scFv anti-HLA-A2, um domínio de dobradiça (ligante), um domínio transmembrana (TNFR2 ou CD8 TM), um domínio de co-sinalização (CD28 ou TNFR2 Ou TNFR2+4-1BB) e CD3 zeta (CD3Z). Estas construções de CAR estão em quadro com uma sequência de codificação P2A-GFP.

[0043] A Figura 13 ilustra gráficos de pontos de citometria de fluxo mostrando a eficiência de transdução e expressão de CAR na superfície celular de Tregs. A eficiência de transdução foi avaliada pela expressão de GFP e a expressão de CAR na superfície celular foi avaliada pela expressão de Dextramer®.

[0044] A Figura 14 ilustra gráficos de pontos de citometria de fluxo mostrando a presença de marcadores fenotípicos de Treg sobre CAR-Tregs HLA*A2.

[0045] A Figura 15 é um conjunto de gráficos mostrando a variação de peso corporal (em cima à esquerda), o escore GvHD (em cima à direita), e a porcentagem de doença livre de sobrevivência (em baixo) ao longo do tempo para os camundongos NSG injetados com HLA*A2-CAR-Tregs compreendendo domínios de TNFR2, CD28, ou TNFR2+4-1BB.

Descrição detalhada da invenção Definições

[0046] Na presente invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados:

[0047] Os termos "um" e "uma" se referem a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[0048] O termo "cerca de" quando se refere a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e similares, se destina a abranger variações de ± 20% ou em alguns casos ± 10%, ou em alguns casos ± 5%, ou em alguns casos ± 1%, ou em alguns casos ± 0,1% a partir do valor especificado, já que as referidas variações são apropriadas para realizar os métodos descritos.

[0049] O termo "ativação", como usado nesse documento, se refere ao estado de uma célula T (por exemplo, uma célula T regulatória) que foi suficientemente estimulada para induzir uma resposta celular detectável. A ativação também pode ser associada com a(s) função(ões) efetora(s) detectável(eis) tais como a produção de citocinas ou a atividade supressora. O termo células T regulatórias “ativadas” se refere a, entre outras coisas, células T regulatórias que são capazes de suprimir uma resposta imunológica.

[0050] O termo "aficorpo" é bem conhecido na técnica e se refere a proteínas de afinidade com base em um domínio de proteína de resíduo de aminoácido 58, derivado de um dos domínios de ligação de IgG de proteína estafilocócica A.

[0051] O termo "alogênico" se refere a qualquer material derivado de um indivíduo diferente da mesma espécie que o indivíduo no qual o material é introduzido. Dois ou mais indivíduos são referidos como sendo alogênicos entre si quando os genes em um ou mais locais não são idênticos. Em alguns aspectos, o material alogênico de indivíduos da mesma espécie pode ser suficientemente diferente geneticamente de modo a interagir antigenicamente.

[0052] O termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" (Ig), como usado nesse documento, se refere a uma sequência de proteína ou polipeptídeo derivada de uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente com um antígeno.

Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, de cadeia múltipla ou simples, ou imunoglobulinas intactas, e podem ser derivados de fontes naturais ou de fontes recombinantes.

O termo "anticorpo" também inclui anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada. Os anticorpos podem ser multímeros de moléculas de imunoglobulinas, tais como tetrâmeros de moléculas de imunoglobulina.

[0053] A unidade básica de anticorpo de quatro cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas (H)

idênticas.

A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser atribuída a um dentre dois tipos claramente distintos,

denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes (CL). Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes ou isótipos.

Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, tendo cadeias pesadas designadas alfa (⍺), delta (δ), epsilon (ε),

gama (𝛾) e mu (µ), respectivamente.

As classes 𝛾 e ⍺ são ainda divididas em subclasses com base em diferenças relativamente pequenas em sequência de CH e função, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses:

IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto que as duas cadeias H são ligadas entre si por uma ou mais ligações dissulfeto, dependendo do isótipo da cadeia H.

Cada cadeia H e L também possui pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas.

Cada cadeia H tem no N-terminal, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes

(CH) para cada uma das cadeias ⍺ e 𝛾 e quatro domínios CH para os isótipos µ e ε.

Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos específicos de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O pareamento de um VH e VL em conjunto forma um único local de ligação ao antígeno. Um anticorpo IgM consiste em cinco das unidades de heterotetrâmero básicas juntamente com um polipeptídeo adicional denominado cadeia J e, portanto, contém dez locais de ligação ao antígenos, enquanto os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes compreendendo 2-5 das unidades de 4 cadeias básicas juntamente com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem geralmente cerca de 150.000 Daltons. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª edição, Daniel P Stites, Abba I. Terr e Tristram G.

Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71, e Capítulo 6.

[0054] O termo "anticorpo monoclonal", como usado nesse documento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos individuais compreendidos na população são idênticos, exceto por mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em pequenas quantidades.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único local antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. Além de sua especificidade, anticorpos monoclonais são vantajosos pelo fato de que eles podem ser sintetizados não-contaminados por outros anticorpos. O modificador “monoclonal” não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, um anticorpo monoclonal pode ser preparado pela metodologia de hibridoma primeiro descrita por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou pode ser feito usando métodos de DNA recombinante em células bacterianas, eucarióticas de animal ou de planta (ver, por exemplo, Patente nos EUA nº

4.816.567). Um “anticorpo monoclonal” recombinante também pode ser isolado a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Marks et al., J Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo. Os anticorpos monoclonais descritos nesse documento incluem anticorpos “quiméricos”, compreendendo uma ou mais regiões de um anticorpo (por exemplo, domínios variáveis não-humanos) e uma ou mais regiões de um ou mais outros anticorpos (por exemplo, regiões constantes humanas).

[0055] O termo "fragmento de anticorpo" se refere a pelo menos uma porção de um anticorpo intacto, por exemplo, a região de ligação ao antígeno ou região variável do anticorpo intacto, que retém a capacidade de interagir especificamente com (por exemplo, por ligação, impedimento estérico, estabilização/desestabilização e/ou distribuição espacial) um epítopo de um antígeno. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, fragmentos de anticorpo scFv, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv), um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI, anticorpos lineares, anticorpos de domínio simples tal como sdAb (VL ou VH), domínios VHH de camelídeo, anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos tais como um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, e um CDR isolado ou outros fragmentos de ligação de epítopo de um anticorpo. Um fragmento de ligação ao antígeno também pode ser incorporado em anticorpos de domínio simples, maxicorpos, minicorpos, nanocorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (ver, por exemplo, Hollinger e Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)). Fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser enxertados em scaffolds com base em polipeptídeos, tais como uma fibronectina tipo

III (ver, por exemplo, a Patente dos EUA Nº 6.703.199, que descreve minicorpos de polipeptídeos de fibronectina). A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígenos idênticos, denominados fragmentos

“Fab”, e um fragmento “Fc” residual, uma designação refletindo a capacidade de cristalizar prontamente.

O fragmento Fab consiste em uma cadeia L inteira juntamente com o domínio da região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação à ligação ao antígeno,

isto é, tem um único local de ligação ao antígeno.

O tratamento com pepsina de um anticorpo produz um único fragmento F(ab’)2 grande que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto tendo atividade de ligação ao antígeno divalente e ainda é capaz de reticular antígeno.

Os fragmentos Fab’ diferem de fragmentos Fab por terem uns poucos resíduos adicionais no terminal carbóxi do domínio CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo.

Fab’-SH é a designação nesse documento para Fab’ em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre.

Os fragmentos de anticorpos F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ que possuem cisteínas de dobradiça entre os mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos

[0056] Um “anticorpo intacto” é um que compreende um local de ligação ao antígeno bem como um CL e pelo menos os domínios constantes de cadeia pesada CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência endógena (por exemplo, domínios constantes de sequência endógena humana) ou variantes de sequência de aminoácidos do mesmo. Um polinucleotídeo de “sequência endógena” é aquele que tem a mesma sequência de nucleotídeos que um polinucleotídeo derivado da natureza. Um polipeptídeo de “sequência endógena” é aquele que tem a mesma sequência de aminoácidos que um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) derivado da natureza (por exemplo, de qualquer espécie). Os referidos polinucleotídeos e polipeptídeos da sequência endógena podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos.

[0057] Como usado nesse documento, um “fragmento ou análogo funcional de um anticorpo” é um composto tendo atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo de comprimento total. Por exemplo, um fragmento ou análogo funcional de um anticorpo anti-IgE é aquele que pode se ligar a uma imunoglobulina IgE de forma a prevenir ou reduzir substancialmente a capacidade da referida molécula de ter a capacidade de se ligar ao receptor de alta afinidade, FcεRI.

[0058] O termo "cadeia pesada de anticorpo" se refere ao maior dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações de ocorrência natural, e que determina normalmente a classe à qual o anticorpo pertence.

[0059] O termo "cadeia leve de anticorpo" se refere ao menor dos dois tipos de cadeias de polipeptídeo presentes em moléculas de anticorpos em suas conformações de ocorrência natural. As cadeias leves Kappa (κ) e lambda (λ) se referem aos dois isótipos de cadeia leve de anticorpos principais.

[0060] As “anticalinas” são bem conhecidas na técnica e se referem a uma tecnologia mimética de anticorpos, em que a especificidade de ligação é derivada de lipocalinas. As anticalinas também podem ser formatadas como proteínas de direcionamento duplo, denominadas duocalinas.

[0061] O termo "antígeno" ou "Ag" se refere a uma molécula que provoca uma resposta imunológica. Esta resposta imunológica pode envolver a produção de anticorpos, a ativação de células imunologicamente competentes específicas, ou ambos. A pessoa versada na técnica entenderá que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteínas ou peptídeos, pode servir como um antígeno. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante ou genômico. Uma pessoa versada na técnica entenderá que qualquer DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de nucleotídeos parcial codificando uma proteína que provoca uma resposta imunológica, codifica, portanto, um “antígeno” como o termo é usado nesse documento.

Além disso, uma pessoa versada na técnica entenderá que um antígeno não precisa necessariamente ser codificado unicamente por uma sequência de nucleotídeos de comprimento total de um gene. Fica prontamente aparente que a presente invenção inclui, mas não se limita a, o uso de sequências de nucleotídeos parciais de mais de um gene e que essas sequências de nucleotídeos são dispostas em várias combinações para codificar polipeptídeos que provocam a resposta imunológica desejada. Além do mais, uma pessoa versada na técnica entenderá que um antígeno não precisa necessariamente ser codificado por um “gene” de todo. Fica prontamente aparente que um antígeno pode ser sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica, ou pode ser uma macromolécula além de um polipeptídeo. A referida amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a, por exemplo, uma amostra de tecido, uma célula ou um fluido com outros componentes biológicos.

[0062] O termo "célula que apresenta antígenos" ou "APC" (“antigen presenting cells”) se refere a uma célula de sistema imunológico tal como uma célula acessória (por exemplo, uma célula B, uma célula dendrítica, e semelhantes) que exibe um antígeno estranho complexado com grandes complexos de histocompatibilidade (ou major histocompatibility complexes - MHCs) em sua superfície. As células T podem reconhecer esses complexos usando seus receptores de células T (ou T cell receptors - TCRs). As APCs processam os antígenos e apresentam as mesmas a células T.

[0063] O termo "autólogo" se refere a qualquer material derivado do mesmo indivíduo ao qual será posteriormente introduzido.

[0064] Os “avímeros” são bem conhecidos na técnica e se referem a uma tecnologia mimética de anticorpos.

[0065] O termo "receptor quimérico" ou "receptor de antígeno quimérico" ou "CR" ou “CAR” se refere a um polipeptídeo ou a um conjunto de polipeptídeos, tipicamente dois nas modalidades mais simples, que quando em uma célula imune, fornece a célula com especificidade para um ligante alvo e com geração de sinal intracelular. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos são contíguos entre si. Em algumas modalidades, o receptor quimérico é uma proteína de fusão quimérica compreendendo o conjunto de polipeptídeos. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos inclui um comutador de dimerização que, na presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos entre si, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação de ligante a um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende uma sequência líder opcional no aminoterminal (N- ter) da proteína de fusão do receptor quimérico. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende uma sequência líder no N-terminal do domínio de ligação do ligante extracelular, em que a sequência líder é opcionalmente clivada do domínio de ligação do ligante durante o processamento celular e localização do receptor quimérico à membrana celular.

[0066] O termo "modificações de sequência conservadoras" se refere modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente a função biológica da proteína contendo a sequência de aminoácidos. As referidas modificações conservadoras incluem substituições, adições e eliminações de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em uma proteína através de técnicas padrão conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR. As “substituições de aminoácidos conservadoras” são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem propriedades similares, de modo que alguém versado na técnica de química de peptídeo esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo ficassem substancialmente inalteradas. As substituições de aminoácidos são, portanto, em geral, baseadas na similaridade relativa dos substituintes da cadeia lateral do aminoácido, por exemplo, sua hidrofobicidade,

hidrofilicidade, carga, tamanho e similares.

As substituições exemplares que tomam várias das características acima em consideração são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: arginina e lisina;

glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

As substituições de aminoácidos podem ainda ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade,

hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos.

Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico;

aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e aminoácidos com grupos principais polares não-

carregados tendo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina;

asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina.

Outros grupos de aminoácidos que podem representar alterações conservadoras incluem: (1) ala, pro, gly, glu,

asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val,

ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; e (5) phe, tyr,

trp, his.

Outras famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica.

Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas

(por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácidos dentro de um receptor quimérico da invenção podem ser substituídos por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral e o receptor quimérico alterado pode ser testado usando os ensaios funcionais descritos nesse documento.

[0067] O termo "promotor constitutivo" se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula sob a maior parte ou todas as condições fisiológicas da célula.

[0068] O termo "molécula coestimuladora" se refere a um parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente com um ligante coestimulador, mediando assim uma resposta coestimuladora pela célula T, tal como, mas não limitado a, proliferação. Moléculas coestimuladora são moléculas de superfície celular diferentes de receptores de antígenos ou seus ligantes que contribuem para uma resposta imunológica eficiente. Um domínio de sinalização coestimulador pode ser a porção intracelular de uma molécula coestimuladora. Uma molécula coestimuladora pode ser representada nas seguintes famílias de proteínas: proteínas de receptor de TNF, proteínas semelhantes a imunoglobulinas, receptores de citocina, integrinas, moléculas de ativação linfocítica de sinalização (proteínas SLAM – signaling lymphocytic activation molecules) e receptores de células NK ativadoras.

[0069] Uma “célula citotóxica” inclui qualquer célula capaz de mediar uma resposta de citotoxicidade.

[0070] O termo "derivado de", como usado nesse documento, indica uma relação entre uma primeira e uma segunda molécula. Se refere geralmente à similaridade estrutural entre a primeira molécula e uma segunda molécula e não conota ou inclui uma limitação um processo ou de fonte em uma primeira molécula que é derivada de uma segunda molécula. Por exemplo, no caso de um domínio de sinalização intracelular que é derivado de uma molécula CD3 zeta, o domínio de sinalização intracelular retém suficiente estrutura de CD3 zeta de modo que tem a função requerida, nomeadamente, a capacidade de gerar um sinal sob as condições apropriadas. Não conota ou inclui uma limitação a um processo em particular de produção do domínio de sinalização intracelular, por exemplo, não significa que, para fornecer o domínio de sinalização intracelular, se deve iniciar com uma sequência de CD3 zeta e eliminar a sequência indesejada, ou impor mutações, para chegar ao domínio de sinalização intracelular.

[0071] O termo "diacorpos" se refere a fragmentos de anticorpos pequenos preparados pela construção de fragmentos de sFv com ligantes curtos (cerca de 5-10 resíduos) entre os domínios VH e VL de forma que o pareamento intercadeia mas não intracadeia dos domínios V é obtido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, um fragmento com dois locais de ligação ao antígeno. Os diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFv de “cruzamento” nos quais os domínios VH e VL dos dois anticorpos estão presentes em diferentes cadeias de polipeptídeos. Os diacorpos são descritos de forma mais completa em, por exemplo, EP 0404097; WO 93/11161; e Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90: 6444-6448 (1993).

[0072] Um “anticorpo de domínio” é bem conhecido na técnica e se refere à menor unidade de ligação funcional de um anticorpo, correspondente à região variável da cadeia pesada ou leve de um anticorpo.

[0073] O termo "codificação" se refere à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, tal como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos que têm uma sequência definida de nucleotídeos (por exemplo, rRNA, tRNA e mRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes da mesma. Assim, um gene, cDNA ou RNA codifica uma proteína se a transcrição e tradução de mRNA correspondente a esse gene produz a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a fita de codificação, cuja sequência de nucleotídeos é idêntica à sequência de mRNA e é normalmente fornecida em listagens de sequências, como a fita não-codificadora, usada como o modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser referidas como codificando a proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.

A menos que especificado em contrário, uma “sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácidos” inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas entre si e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. A frase "sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ou um RNA” também pode incluir íntrons na medida em que a sequência de nucleotídeos codificando a proteína pode, em alguma versão, conter um íntron(s).

[0074] O termo "endógeno" se refere a qualquer material natural ou produzido naturalmente dentro de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[0075] O termo "manipulado" ou "modificado" se refere a uma célula que foi transfectada, transformada ou transduzida.

[0076] O termo "exógeno" se refere a qualquer material introduzido em ou produzido fora de um organismo, célula, tecido ou sistema.

[0077] O termo "expressão" se refere à transcrição e/ou tradução de uma sequência de nucleotídeos em particular acionada por um promotor.

[0078] O termo "vetor de expressão" se refere a um vetor compreendendo um polinucleotídeo recombinante compreendendo uma sequência de controle de expressão ligada operativamente a uma sequência de nucleotídeos a ser expressa. Um vetor de expressão compreende elementos de ação cis suficientes para a expressão; outros elementos para expressão podem ser fornecidos pela célula hospedeira ou em um sistema de expressão in vitro. Os vetores de expressão incluem todos os conhecidos na técnica, incluindo cosmídeos, plasmídeos (por exemplo, nus ou contido em lipossomos), transpósons (por exemplo, sleeping beauty) e vírus (por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus e vírus adenoassociados) que incorporam o polinucleotídeo recombinante.

[0079] O termo "fragmento" de polinucleotídeo, como usado nesse documento, é um polinucleotídeo que difere tipicamente de um polinucleotídeo especificamente descrito nesse documento em uma ou mais eliminações. Os referidos fragmentos podem ser de ocorrência natural ou podem ser sinteticamente gerados, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do fragmento codificado como descrito nesse documento e/ou usando qualquer uma de um número de técnicas bem conhecidas na técnica.

Consequentemente, o termo "fragmento" de polipeptídeo, como usado nesse documento, é um polipeptídeo que difere tipicamente de um polipeptídeo especificamente descrito nesse documento em uma ou mais eliminações. Os referidos fragmentos podem ser de ocorrência natural ou podem ser sinteticamente gerados, por exemplo, modificando uma ou mais das sequências de polipeptídeo da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo como descrito nesse documento e/ou usando qualquer uma de um número de técnicas bem conhecidas na técnica. Podem ser realizadas modificações na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção e resultarem ainda em uma molécula funcional que codifica ou é um fragmento polipeptídeo com características desejáveis e sem perda apreciável de utilidade ou atividade biológica. Em algumas modalidades, os fragmentos de polipeptídeo diferem de uma sequência endógena por eliminação de menos de 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos. Os fragmentos podem também (ou alternativamente) ser modificados por, por exemplo, a eliminação de aminoácidos que têm influência mínima na imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo.

[0080] O fragmento “Fc” de um anticorpo compreende as porções carboxi-terminais de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região Fc, e essa região é também a parte reconhecida por receptores Fc (FcR) encontrados em determinados tipos de células.

[0081] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antígeno e de ligação completo.

Este fragmento consiste de um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve em associação firme e não-covalente. A partir da dobragem destes dois domínios, saem seis laços hipervariáveis (três laços de cada uma das cadeias H e L) que contribuem os resíduos de aminoácidos para a ligação ao antígenos e conferem especificidade de ligação ao antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um antígeno) pode ter a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno,

embora a uma afinidade mais baixa do que o local de ligação inteiro.

[0082] Os resíduos “Framework” ou “FR” são aqueles resíduos de domínio variável que não são os resíduos da região hipervariável conforme definidos nesse documento.

[0083] O termo "doença de enxerto contra hospedeiro" ou "GVHD", como usado nesse documento, se refere a uma complicação médica após o recebimento de tecido transplantado a partir de uma pessoa geneticamente diferente. As células imunes no tecido doado (o enxerto) reconhecem o receptor (o hospedeiro) como estranho. As células imunes transplantadas então atacam as células do corpo do hospedeiro. A GVHD é comumente associada ao transplante de células tronco; no entanto, o termo inclui a GVHD que surge de outras formas de enxerto de tecido. A GVHD pode também ocorrer após uma transfusão de sangue.

[0084] O termo "homologia" ou "identidade" se refere à identidade de sequência de subunidades entre duas moléculas poliméricas, por exemplo, entre duas moléculas de ácido nucleico, tais como duas moléculas de DNA ou duas moléculas de RNA, ou entre duas moléculas de polipeptídeo. Quando uma posição de subunidade em ambas as moléculas é ocupada pela mesma subunidade monomérica, por exemplo, se uma posição em cada uma de duas moléculas de DNA for ocupada por adenina, então elas são homólogas ou idênticas nessa posição. A homologia entre duas sequências é uma função direta do número de posições correspondentes ou homólogas; por exemplo, se a metade (por exemplo, cinco posições em um polímero com comprimento de dez subunidades) das posições em duas sequências são homólogas, as duas sequências são 50%

homólogas; se 90% das posições (por exemplo, 9 de 10) forem correspondentes ou homólogas, as duas sequências são 90%

homólogas.

Assim, o termo "homólogo" ou "idêntico", quando usado em uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos ou de duas ou mais moléculas de ácido nucléico,

se refere ao grau de relação de sequência entre polipeptídeos ou moléculas de ácido nucléico, como determinado pelo número de correspondências entre fitas de dois ou mais resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos.

A “identidade” mede a percentagem de correspondências idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de espaços (se houver) abordados por um modelo matemático ou programa de computador em particular (isto é, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser prontamente calculada através de métodos conhecidos.

Os referidos métodos incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, a M,

ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988;

Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D.

W.,

ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of

Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis In Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds.

M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48:1073 (1988). Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos de determinação de identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador exemplificativos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível do National Center For Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser usado para determinar a identidade.

[0085] O termo "humanizado" como se refere a formas de anticorpos não-humanos (por exemplo, de murino) se refere a imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ou outras subsequências de ligação ao antígeno de anticorpos)

que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulinas não-

humanas.

Na maior parte, os anticorpos humanizados e fragmentos de anticorpos dos mesmos são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor ou fragmento de anticorpo) em que os resíduos de uma região de determinação complementar

(CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como um camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas.

Em alguns casos, resíduos da região de quadro Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes.

Além disso, um anticorpo/fragmento de anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas sequências de CDR ou de quadro importadas.

Estas modificações podem refinar e otimizar adicionalmente o desempenho de anticorpos ou fragmentos de anticorpos.

Em geral, o anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado do mesmo compreenderá substancialmente todo de pelo menos um,

e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e toda ou uma porção significativa das regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana.

O anticorpo ou fragmento de anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr.

Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

[0086] Como usado nesse documento, o termo "células imunes" geralmente inclui glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células tronco hematopoiéticas (ou hematopoietic stem cells - HSC) produzidas na medula óssea.

Exemplos de células imunes incluem, mas não estão limitadas a, linfócitos (células T, células B e células exterminadoras naturais (NK)) e células derivadas de mieloides (neutrófilo, eosinófilo, basófilo, monócito, macrófago e células dendríticas).

[0087] Como usado nesse documento, o termo "célula efetora imune" se refere a uma célula do sistema imunológico que está em uma forma que é capaz de montar uma resposta imunológica específica.

[0088] Como usado nesse documento, o termo "célula regulatória imune" se refere a uma célula imune que atua em um modo “regulatório” para suprimir a ativação do sistema imunológico e desse modo mantém a homeostase do sistema imune e a tolerância a autoantígenos. As “células imunes regulatórias” podem também ter efeitos sobre as células não- imunes que resultam em um estado clínico melhorado tal como promover o reparo ou a regeneração do tecido. As células imunes regulatórias podem incluir, sem limitação, células T regulatórias (por exemplo, células T regulatórias CD4+, células T regulatórias CD8+, células T regulatórias de 𝛾δ, e/ou células T DN regulatórias), células B regulatórias, células NK regulatórias, macrófagos regulatórios e células dendríticas regulatórias.

[0089] Como usado nesse documento, o termo "resposta imunológica" inclui respostas imunológicas mediadas por células T e/ou mediadas por células B. Respostas imunológicas exemplificativas incluem respostas de células T, por exemplo, proliferação, produção de citocina e citotoxicidade celular. Além disso, o termo resposta imunológica inclui respostas imunológicas que são indiretamente afetadas por ativação de células T, por exemplo, produção de anticorpos (respostas humorais) e ativação de células responsivas à citocina, por exemplo, macrófagos. As células imunes envolvidas na resposta imunológica incluem linfócitos, tais como células B e células T (células CD4+, CD8+, Th1 e Th2); células apresentando antígenos (por exemplo, células apresentando antígenos profissionais tais como células dendríticas, macrófagos, linfócitos B, células de Langerhans e células apresentando antígenos não-profissionais tais como queratinócitos, células endoteliais, astrócitos, fibroblastos, oligodendrócitos); células exterminadoras naturais; e células mieloides, tais como macrófagos, eosinófilos, mastócitos, basófilos e granulócitos.

[0090] Como usado nesse documento, o termo "acomodação imunológica" se refere a uma condição de um receptor de transplante no qual um transplante de órgão ou tecido funciona normalmente apesar da presença de anticorpos no receptor que são específicos para o transplante de órgão ou tecido.

[0091] Como usado nesse documento, o termo "tolerância imunológica" ou “tolerância imune" se refere a a) um nível diminuído de uma resposta imunológica específica (pensa-se que é mediada pelo menos em parte por linfócitos T efetores específicos de antígeno, linfócitos B, anticorpos, ou seus equivalentes); b) um retardo no início ou progressão de uma resposta imunológica específica; ou c) um risco reduzido do início ou progressão de uma resposta imunológica específica, em uma população de indivíduos (por exemplo, indivíduos que foram submetidos a um tratamento, tal como um tratamento descrito nesse documento) em comparação com uma população diferente de indivíduos (por exemplo, indivíduos que não foram submetidos ao tratamento). A tolerância imunológica ou imune “específica” ocorre quando a tolerância imunológica ou imune é preferencialmente invocada contra determinados antígenos, em comparação com outros.

[0092] Como usado nesse documento, “RNA transcrito in vitro” se refere a RNA, por exemplo, mRNA, que foi sintetizado in vitro. Geralmente, o RNA transcrito in vitro é gerado a partir de um vetor de transcrição in vitro. O vetor de transcrição in vitro compreende um modelo que é usado para gerar o RNA transcrito in vitro.

[0093] O termo promotor “induzível" se refere a uma sequência de nucleotídeos que, quando operativamente ligada a um polinucleotídeo que codifica ou especifica um produto genético, faz com que o produto genético seja produzido em uma célula substancialmente apenas quando um indutor que corresponde ao promotor está presente na célula.

[0094] Como usado nesse documento, uma “capa 5’” (também denominada uma capa RNA, uma capa RNA 7- metilguanosina ou uma capa RNA m7G) é um nucleotídeo guanina modificado que foi adicionado à extremidade de “frente” ou 5’ de um RNA mensageiro eucariótico logo após o início da transcrição. A capa 5’ consiste em um grupo terminal que é ligado ao primeiro nucleotídeo transcrito. Sua presença é crítica para o reconhecimento do ribossomo e para a proteção contra RNases. A adição da capa é acoplada à transcrição, e ocorre de forma cotranscricional, de modo que cada uma influencia a outra. Logo após o início da transcrição, a extremidade 5’ do mRNA que está sendo sintetizado é ligada por um complexo sintetizante da capa associado à RNA polimerase. Este complexo enzimático catalisa as reações químicas que são necessárias para o capeamento de mRNA. A síntese prossegue como uma reação bioquímica multietapas. A fração de capeamento pode ser modificada para modular a funcionalidade do mRNA tal como sua estabilidade ou eficiência de tradução.

[0095] No contexto da presente invenção, são usadas as seguintes abreviações para as bases de ácido nucleico que ocorrem comumente. “A” se refere a adenina, “C” se refere a citosina, “G” se refere a guanina, “T” se refere a timina, e “U” se refere a uracila.

[0096] O termo "material de instrução" inclui uma publicação, um registro, um diagrama, ou qualquer outro meio de expressão que pode ser usado para comunicar a utilidade ou o uso das composições e métodos da invenção. O material de instrução do kit da invenção pode, por exemplo, ser fixado a um recipiente que contém um ácido nucleico, vetor, população celular, ou composição da invenção ou ser enviado juntamente com um recipiente que contém um ácido nucleico, vetor, população celular, ou composição da invenção.

Alternativamente, o material de instrução pode ser transportado separadamente do recipiente com a intenção de que a célula do material de instrução seja usada cooperativamente pelo receptor.

[0097] O termo "domínio de sinalização intracelular", como usado nesse documento, se refere a uma porção intracelular de uma molécula. O domínio de sinalização intracelular gera um sinal que promove uma função efetora imunológica da célula contendo o receptor quimérico.

Exemplos de função efetora imunológica em uma célula T com receptor quimérico podem incluir atividade citolítica, atividade supressora, atividade regulatória e atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas.

[0098] O termo "isolado" significa alterado ou removido do estado natural. Por exemplo, um ácido nucleico ou um peptídeo que está naturalmente presente em um animal vivo não é “isolado”, mas o mesmo ácido nucleico ou peptídeo parcialmente ou completamente separado dos materiais coexistentes de seu estado natural é “isolado”. Um ácido nucleico ou peptídeo isolado pode existir em forma substancialmente purificada, ou pode existir em um ambiente não-endógeno tal como, por exemplo, uma célula hospedeira.

Tipicamente, uma preparação de ácido nucleico ou peptídeo isolado contém o ácido nucleico ou peptídeo com pelo menos cerca de 80% de pureza, pelo menos cerca de 85% de pureza, pelo menos cerca de 90% de pureza, pelo menos cerca de 95% de pureza, superior a 95% de pureza, superior a cerca de 96% de pureza, superior a cerca de 97% de pureza, superior a cerca de 98% de pureza, ou superior a cerca de 99% de pureza.

Um “polipeptídeo isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural.

[0099] Um “ácido nucleico isolado” ou “sequência nucleica isolada” é um ácido nucleico que é substancialmente separado de outras sequências de DNA do genoma assim como proteínas ou complexos tais como ribossomos e polimerases que acompanham naturalmente uma sequência endógena. O termo abrange uma sequência de ácido nucleico que foi removida de seu ambiente de ocorrência natural, e inclui isolados de DNA recombinante ou clonado e análogos sintetizados quimicamente ou análogos sintetizados biologicamente por sistemas heterólogos. Um ácido nucleico substancialmente puro inclui formas isoladas do ácido nucleico. Naturalmente, isto se refere ao ácido nucleico como originalmente isolado e não exclui genes ou sequências posteriormente adicionadas ao ácido nucleico isolado pela mão do homem. Em algumas modalidades, um ácido nucleico isolado ou uma sequência nucleica isolada não ocorre na natureza.

[00100] Um “polipeptídeo isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo isolado será purificado (1) para acima de 95% em peso de polipeptídeo como determinado pelo método de Lowry, e em modalidades em particular para acima de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminal ou interno pelo uso de um sequenciador de copo centrífugo, ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras usando azul de Coomassie ou, em determinadas modalidades, coloração de prata. O polipeptídeo isolado inclui o polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Em algumas modalidades, um polipeptídeo isolado não ocorre na natureza

[00101] O termo "lentivírus" se refere a um género da família Retroviridae. Os lentivírus são únicos entre os retrovírus em que são capazes de infectar células não- divisórias. Devido ao fato de elas poderem liberar uma quantidade significativa de informação genética no DNA da célula hospedeira, elas são um dos vetores de distribuição de genes mais eficientes. HIV, SIV e FIV são todos exemplos de lentivírus.

[00102] O termo "vetor lentiviral" se refere a um vetor derivado de pelo menos uma porção de um genoma de lentivírus, incluindo, por exemplo, um vetor lentivírus auto-desativante como fornecido em Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464 (2009). Outros exemplos de vetores lentivirais que podem ser usados na clínica incluem, mas não estão limitados a, tecnologia de distribuição de genes LENTIVECTOR® da Oxford BioMedica e o sistema de vetor LENTIMAX™ da Lentigen. Também estão disponíveis tipos não-clínicos de vetores lentivirais e seriam conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00103] O termo "ligante" se refere a um elemento de um par ligante/receptor, e se liga ao outro membro (receptor) do par.

[00104] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" se refere a um polímero de nucleotídeos covalentemente ligados por ligações fosfodiéster, tais como ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA), na forma de fita simples ou dupla. A menos que seja especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma forma similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que seja indicado em contrário, uma sequência de ácido nucleico em particular também abrange implicitamente variantes conservadoramente modificadas da mesma (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs, e sequências complementares assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de códon degenerado podem ser obtidas pela geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

[00105] Um "nanocorpo" é bem conhecido na técnica e se refere a uma proteína terapêutica derivada de anticorpos que contém as propriedades estruturais e funcionais únicas de anticorpos de cadeia pesada de ocorrência natural. Estes anticorpos de cadeia pesada contêm um único domínio variável (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3).

[00106] Um polinucleotídeo de “sequência endógena” é aquele que tem a mesma sequência de nucleotídeos que um polinucleotídeo derivado da natureza. Um polipeptídeo de “sequência endógena” é aquele que tem a mesma sequência de aminoácidos que um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo) derivado da natureza (por exemplo, de qualquer espécie). Os referidos polinucleotídeos e polipeptídeos de sequência endógena podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos.

[00107] O termo "operativamente ligado" ou "controle transcricional" se refere a ligação funcional entre uma sequência regulatória e uma sequência de ácido nucleico heteróloga, resultando em expressão da última. Por exemplo, uma primeira sequência de ácido nucleico é operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico.

Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. As sequências de DNA operativamente ligadas podem ser contíguas entre si e, por exemplo, onde é necessário unir duas regiões de codificação de proteína, estão no mesmo quadro de leitura.

[00108] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável, e se referem a um composto compreendido por resíduos de aminoácidos ligados covalentemente por ligações peptídicas. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e não é colocada nenhuma limitação no número máximo de aminoácidos que pode compreender uma sequência da proteína ou do peptídeo. Os polipeptídeos incluem qualquer peptídeo ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas. Como usado nesse documento, o termo se refere a cadeias curtas, que também são comumente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, bem como a cadeias mais longas, que são geralmente referidas na técnica como proteínas, das quais existem muitos tipos. Os “polipeptídeos” incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, polipeptídeos substancialmente homólogos, oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos e proteínas de fusão, entre outros. Um polipeptídeo inclui um peptídeo natural, um peptídeo recombinante, ou uma combinação dos mesmos.

[00109] O termo "excipiente farmaceuticamente aceitável" ou "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um excipiente que não produz uma reação adversa, alérgica ou outra desfavorável quando administrado a um animal, por exemplo, um ser humano. Inclui todo e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similares. Para administração humana, as preparações devem satisfazer as normas de esterilidade, pirogenicidade, e de segurança e pureza gerais, como requerido por entidades regulatórias, tais como, por exemplo, a entidade FDA ou EMA.

[00110] O termo "poli(A)" se refere a uma série de adenosinas monofosfato fixadas ao mRNA. Em algumas modalidades de uma construção para expressão transiente, o poliA tem entre 50 e 5000 adenosinas monofosfato, por exemplo, igual ou superior a 64, igual ou superior a 100, ou igual ou superior a 300 ou 400 adenosinas monofosfato. As sequências de poli(A) podem ser modificadas quimicamente ou enzimaticamente para modular a funcionalidade do mRNA tal como a localização, a estabilidade ou a eficiência de tradução.

[00111] O termo "poliadenilação" se refere à ligação covalente de uma fração de poliadenilila, ou sua variante modificada, a uma molécula de RNA mensageiro. Em organismos eucarióticos, a maioria das moléculas de RNA mensageiro (mRNA) são poliadeniladas na extremidade 3’. A cauda 3’ de poli(A) é uma sequência longa de nucleotídeos de adenina (frequentemente de muitas centenas) adicionadas ao pré-mRNA através da ação de uma enzima, a poliadenilato polimerase.

Em eucariotas superiores, a cauda poli(A) é adicionada em transcritos que contêm uma sequência específica, o sinal de poliadenilação. A cauda poli(A) e a proteína ligada à mesma auxiliam na proteção do mRNA da degradação por exonucleases.

A poliadenilação é também importante para a terminação da transcrição, exportação do mRNA do núcleo e tradução. A poliadenilação ocorre no núcleo imediatamente após a transcrição do DNA em RNA, mas adicionalmente pode também ocorrer mais tarde no citoplasma. Após a transcrição ter sido terminada, a cadeia de mRNA é clivada através da ação de um complexo de endonuclease associado à RNA polimerase.

O local de clivagem é geralmente caracterizado pela presença da sequência de base AAUAAA próxima ao local de clivagem.

Após o mRNA ser clivado, os resíduos de adenosina são adicionados à extremidade 3’ livre no local de clivagem.

[00112] O termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA reconhecida pelo equipamento sintético de uma célula, ou equipamento sintético introduzido, necessário para iniciar a transcrição específica de uma sequência de polinucleotídeos.

[00113] O termo "sequência promotora/regulatória" se refere a uma sequência de ácido nucleico que é necessária para a expressão de um produto genético operativamente ligado à sequência promotora/regulatória. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência promotora do núcleo e, em outros casos, esta sequência pode também incluir uma sequência intensificadora e outros elementos regulatórios necessários para a expressão do produto genético. A sequência promotora/regulatória pode, por exemplo, ser uma que expressa o produto genético em uma forma específica ao tecido.

[00114] O termo "proteína ou peptídeo recombinante" se refere a uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) que é gerado usando tecnologia de DNA recombinante, tal como, por exemplo, uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) expresso por um bacteriófago ou sistema de expressão de levedura. O termo deve também ser interpretado para significar uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo) que foi gerado pela síntese de uma molécula de DNA que codifica a proteína ou peptídeo (por exemplo, o anticorpo) em que a molécula de DNA expressa uma proteína ou peptídeo (por exemplo, um anticorpo), ou uma sequência de aminoácidos especificando a proteína ou peptídeo (por exemplo, o anticorpo), em que a sequência de DNA ou de aminoácidos foi obtida usando a tecnologia de sequência de aminoácidos ou DNA recombinante que está disponível e é bem conhecida na técnica.

[00115] Os termos "linfócito T regulatório", “célula T regulatória”, “célula regulatória T”, “célula Treg” e “Treg”, como usados na presente invenção, são sinónimos e destinam-se a ter a definição padrão como usada na técnica.

As células Treg são uma subpopulação especializada de células T que agem de forma “regulatória” para suprimir a ativação do sistema imunológico e desse modo manter a homeostase do sistema imunológico e tolerância a autoantígenos. As Tregs foram referidos algumas vezes como células T supressoras. As células Treg são muitas vezes, mas nem sempre, caracterizadas pela expressão do fator de transcrição da família forkhead FoxP3 (forkhead box P3). Elas também podem expressar proteínas de superfície CD4 ou CD8. Elas usualmente também expressam CD25. As Tregs frequentemente são marcadas pelo fenótipo de CD4+CD25+CD127loFoxP3+. Em algumas modalidades, as Tregs são também CD45RA+, CD62Lhi e/ou GITR+. Em modalidades em particular, as Tregs são marcadas por CD4+CD25+CD127loCD62L+ ou CD4+CD45RA+CD25hiCD127lo. Como usado na presente invenção, e a menos que seja especificado de outra forma, as Tregs incluem Tregs “naturais” que se desenvolvem no timo, Tregs induzidos/adaptativos/periféricos que surgem através de um processo de diferenciação que ocorre fora do timo (por exemplo, em tecidos ou órgãos linfoides secundários, ou em um cenário de laboratório sob condições de cultura definidas), e Tregs que foram criadas usando tecnologia de DNA recombinante. As células Treg de ocorrência natural (CD4+CD25+FoxP3+) surgem como todas as outras células T no timo. Em contraste, células Treg induzidas/adaptativas/periféricas (que incluem Tregs CD4+CD25+FoxP3+, células Tr1, células Th3 e outras) surgem fora do timo. Uma forma de induzir Tregs é pela exposição de células T efetoras a IL-10 ou TGF-β. As células T podem também ser convertidas em células Treg por transfecção ou transdução do gene FoxP3 em uma população mista de células T. Uma célula T que é induzida para expressar FoxP3 adota o fenótipo Treg e os referidas Tregs recombinantes são também definidos nesse documento como “Tregs”.

[00116] O termo "rejeição" se refere a um estado no qual um órgão ou tecido transplantado não é aceite pelo corpo do recipiente. A rejeição resulta do ataque do sistema imunológico do receptor ao órgão ou tecido transplantado. A rejeição pode ocorrer dias a semanas após o transplante (aguda) ou meses a anos após o transplante (crónica).

[00117] Como usado nesse documento, um anticorpo ou um CAR é referido como sendo “imunoespecífico para”, “específico para” ou que se “liga especificamente a” um antígeno se reage em um nível detectável com o antígeno, por exemplo, com uma constante de afinidade, Ka, igual ou superior a cerca de 104 M-1, igual ou superior a cerca de 105 M-1, igual ou superior a cerca de 106 M-1, igual ou superior a cerca de 107 M-1, igual ou superior a cerca de 108 M-1, igual ou superior a cerca de 109 M-1, ou igual ou superior a cerca de 1010 M-1. A afinidade de um anticorpo para seu antígeno cognato também é geralmente expressa como uma constante de dissociação Kd, e em determinadas modalidades, um anticorpo se liga especificamente ao antígeno se ele se liga com um Kd igual ou menor que 10-4 M, igual ou menor que cerca de 10-5 M, igual ou menor que cerca de 10-6 M, igual ou menor que cerca de 10-7 M, igual ou menor que cerca de 10-8 M, igual ou menor que 5 x 10-9 M, ou igual ou menor que 10-9 M, ou igual ou menor que 5 x 10-10 M, ou igual ou menor que 10-10 M. As afinidades de anticorpos ou CARs podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, por exemplo, aquelas descritas por Scatchard et al., (Ann. N.Y. Acad.

Sci. USA 51:660(1949)). As propriedades de ligação de um anticorpo a antígenos, células ou tecidos dos mesmos podem geralmente ser determinadas e avaliadas usando métodos de imunodetecção incluindo, por exemplo, ensaios baseados em imunofluorescência, tais como imunohistoquímica (ou immunhistochemistry - IHC) e/ou separação de células ativadas por fluorescência (ou fluorescence-activated cell sorting - FACS). Em algumas modalidades, o termo "se liga especificamente" se refere a um anticorpo, um CAR ou um ligante que reconhece e se liga a um parceiro de ligação presente em uma amostra, mas que não reconhece substancialmente ou liga outras moléculas na amostra.

[00118] O termo "via de transdução de sinal" se refere à relação bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula.

[00119] O termo "domínio de sinalização" se refere a uma porção funcional de uma proteína que atua pela transmissão de informação dentro da célula para regular a atividade celular através de vias de sinalização definidas, pela geração de segundos mensageiros ou funcionando como efetores ao responder aos referidos mensageiros.

[00120] Como usado nesse documento, o termo "célula tronco" geralmente inclui células tronco pluripotentes ou multipotentes. As “células tronco” incluem, sem limitação, células tronco embrionárias (ou embryonic stem cells - ES); células tronco mesenquimais (ou mesenchymal stem cells - MSC); células tronco pluripotentes induzidas (ou induced-

pluripotent stem cells - iPS); e células progenitoras comprometidas (células tronco hematopoiéticas (HSC), células derivadas da medula óssea, etc.).

[00121] O termo "estimulação" se refere a uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimuladora (por exemplo, um complexo TCR/CD3 ou receptor quimérico) com seu ligante cognato mediando assim um evento de transdução de sinal, tal como, mas não limitado a, transdução de sinal através do complexo TCR/CD3 ou transdução de sinal através de domínios de sinalização do receptor quimérico. A estimulação pode mediar a expressão alterada de determinadas moléculas.

[00122] O termo "molécula estimuladora" se refere a uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK ou célula B) que fornece uma(s) sequência(s) de sinalização citoplásmica(s) que regula(m) a ativação da célula imune em um modo estimulador em pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células imunes. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário que é iniciado por, por exemplo, a ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula MHC carregada com peptídeo, e que leva à mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não limitado a proliferação, ativação, diferenciação, supressão e similares. Uma sequência de sinalização citoplásmica primária (também referida como um “domínio de sinalização primário”) que atua de uma forma estimuladora pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como motivo de ativação de imunoreceptor baseado em tirosina ou ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif).

[00123] O termo "indivíduo" destina-se a incluir organismos vivos nos quais uma resposta imunológica pode ser provocada (por exemplo, mamíferos tais como seres humanos).

Em algumas modalidades, um indivíduo pode ser um “paciente” de sangue quente, isto é, um animal de sangue quente tal como um ser humano, que está aguardando o recebimento de ou está recebendo cuidado médico ou foi/é/será objeto de um procedimento médico, ou é monitorado para o desenvolvimento da doença ou condição alvejada, tal como, por exemplo, uma condição inflamatória ou autoimune. Em algumas modalidades, o indivíduo é um adulto (por exemplo, um indivíduo com idade acima de 18 anos). Em algumas modalidades, o indivíduo é uma criança (por exemplo, um indivíduo com idade abaixo de 18 anos). Em algumas modalidades, o indivíduo é um macho. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma fêmea. Em algumas modalidades, o indivíduo é afetado (por exemplo, diagnosticado), com uma doença autoimune, tal como uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Em algumas modalidades, o indivíduo está em risco de desenvolver uma doença autoimune, tal como uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Exemplos de fatores de risco incluem, mas não estão limitados a predisposição genética e história familiar da doença autoimune mediada por autoanticorpos.

[00124] O termo "célula substancialmente purificada" se refere a uma célula que é essencialmente isenta de outros tipos de célula. Uma célula substancialmente purificada também se refere a uma célula que foi separada de outros tipos de célula com os quais ela está normalmente associada em seu estado de ocorrência natural. Em algumas modalidades, uma célula substancialmente purificada se refere a uma célula que é pelo menos cerca de 75% livre, 80% livre, ou 85% livre, ou cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% livre, de outros tipos de célula com os quais ela está normalmente associada em seu estado de ocorrência natural. Em alguns casos, uma população de células substancialmente purificadas se refere a uma população homogénea de células. Em algumas modalidades, uma população de células substancialmente purificadas se refere a uma população de células pelo menos cerca de 75% homogéneas, 80% homogéneas ou 85% homogéneas, e em modalidades em particular cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homogéneas. Em alguns casos, as células substancialmente purificadas se referem simplesmente a células que foram separadas das células com as quais elas estão naturalmente associadas em seu estado natural. Em alguns aspectos, as células são cultivadas in vitro. Em outros aspectos, as células não são cultivadas in vitro. Em determinadas modalidades, uma célula descrita nesse documento não pode ser usada para gerar um organismo multicelular.

[00125] O termo "célula T" inclui todos os tipos de células imunes expressando CD3 incluindo células CD4+ (por exemplo, células T helper), células T CD8+ (por exemplo, células T CD8+ citotóxicas e células T CD8+ regulatórias), células regulatórias T (Tregs), células T gama-delta e células T duplamente negativas.

[00126] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um agente (por exemplo, células expressando um CAR como descrito nesse documento) eficaz para obter um resultado biológico em particular. Assim, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa um nível ou quantidade de agente que é direcionado a, sem causar efeitos colaterais negativos ou adversos significativos ao alvo, (1) retardando ou prevenindo o início da doença ou condição alvejada; (2) reduzindo ou interrompendo a progressão, agravamento, ou deterioração de um ou mais sintomas da doença ou condição alvejada; (3) trazendo a melhora dos sintomas da doença ou condição alvejada; (4) reduzindo a severidade ou incidência da doença ou condição alvejada; ou (5) curando a doença ou condição alvejada. Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada antes do início da doença ou condição alvejada, para uma ação profilática ou preventiva.

Alternativamente ou adicionalmente, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada após a iniciação da doença ou condição alvejada, para uma ação terapêutica.

[00127] O termo "transfectado" ou “transformado" ou “transduzido” se refere a um processo pelo qual o ácido nucleico exógeno é transferido ou introduzido em uma célula hospedeira. Uma célula “transfectada” ou “transformada” ou “transduzida” é uma célula que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. A célula inclui a célula do indivíduo primária e sua progênie.

[00128] O termo "vetor de transferência" se refere a uma composição de matéria compreendendo um ácido nucleico isolado e que pode ser usado para entregar o ácido nucleico isolado ao interior de uma célula. Numerosos vetores são conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a polinucleotídeos lineares, polinucleotídeos associados a compostos iônicos ou anfifílicos, plasmídeos e vírus. Assim, o termo "vetor de transferência" inclui um plasmídeo ou um vírus que se replica autonomamente. O termo destina-se também a incluir compostos não-plasmídeos e não-virais que facilitam a transferência de ácido nucleico para as células, tais como, por exemplo, um composto de polilisina, lipossomo e similares. Exemplos de vetores de transferência virais incluem, mas não estão limitados a vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores retrovirais, vetores lentivírus, e similares.

[00129] Como usado nesse documento, “transiente” se refere à expressão de um transgene não-integrado por um período de horas, dias ou semanas, em que o período de tempo de expressão é menor do que o período de tempo para a expressão do gene se for integrado no genoma ou contido dentro de um replicon de plasmídeo estável na célula hospedeira.

[00130] Um “transplante”, como usado nesse documento, se refere a células, tecido ou um órgão que são introduzidos em um indivíduo. A fonte do material transplantado pode ser células cultivadas, células de outro indivíduo, ou células do mesmo indivíduo (por exemplo, após as células serem cultivadas in vitro e opcionalmente alteradas). Transplantes de órgãos exemplificativos são dos rins, fígado, coração, pulmão e pâncreas. Um transplante de tecido exemplificativo é as ilhotas. Um transplante de células exemplificativo é um transplante alogênico de células tronco hematopoiéticas.

[00131] Como usado nesse documento, os termos "tratar", "tratamento" e "tratando" se referem à redução ou melhora da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença ou condição alvejada, por exemplo, uma condição autoimune, ou a melhora de um ou mais sintomas (por exemplo, um ou mais sintomas discerníveis) de uma doença ou condição alvejada, por exemplo, uma condição autoimune, em que a referida melhora resulta da administração de uma ou mais terapias (por exemplo, um ou mais agentes terapêuticos tais como uma célula

Treg da invenção). Em modalidades específicas, os termos

"tratar", "tratamento" e "tratando" se referem à melhora de pelo menos um parâmetro físico mensurável de uma doença ou condição alvejada, por exemplo, uma condição autoimune.

Em algumas modalidades, os termos "tratar", "tratamento" e

"tratando" se referem à inibição da progressão de uma doença ou condição alvejada, por exemplo, uma condição autoimune,

quer fisicamente, por exemplo, pela estabilização de um sintoma discernível, quer fisiologicamente, por exemplo,

pela estabilização de um parâmetro físico, ou ambos.

Em algumas modalidades, os termos "tratar", "tratamento" e

"tratando" se referem à redução ou melhora da progressão,

gravidade e/ou duração de uma doença ou condição alvejada,

por exemplo, uma doença autoimune, ou a melhora de um ou mais sintomas de uma doença ou condição alvejada, por exemplo, uma doença autoimune. “Tratando” ou “tratamento” se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas profiláticas ou preventivas; em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) a doença ou condição alvejada.

Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição bem como aqueles propensos a ter a condição ou aqueles em que a condição deve ser prevenida. Um indivíduo é “tratado” com sucesso para uma doença ou condição se, após receber uma quantidade terapêutica de um agente (por exemplo, uma população de células compreendendo um receptor quimérico de acordo com a presente invenção), o indivíduo exibe melhora observável e/ou mensurável em um ou mais dos seguintes: redução no número de células patogênicas; redução na porcentagem de células totais que são patogênicas; alívio até certo ponto de um ou mais dos sintomas associados à condição específica; morbidez e mortalidade reduzidas, e/ou melhoria nas questões de qualidade de vida. Os parâmetros acima para a avaliação de tratamento e melhora bem sucedidos na condição são facilmente mensuráveis por procedimentos rotineiros conhecidos por um médico.

[00132] O termo "célula Treg" se refere a uma célula capaz de suprimir, inibir ou prevenir respostas inflamatórias excessivas ou indesejadas, tais como, por exemplo, a autoimunidade ou reações alérgicas. Em algumas modalidades, a população de células Treg da invenção é capaz de atividade supressora. Em algumas modalidades, a referida atividade supressora é independente do contato. Em algumas modalidades, a referida atividade supressora é dependente do contato. Em algumas modalidades, a população de células Treg da invenção apresenta uma ação supressora sobre as células

T efetoras; em determinadas modalidades, a referida ação supressora depende da expressão e/ou ativação de TCR.

[00133] Um “unicorpo” é bem conhecido na técnica e se refere a um fragmento de anticorpo sem a região de dobradiça de anticorpos IgG4. A eliminação da região de dobradiça resulta em uma molécula que tem essencialmente metade do tamanho dos anticorpos IgG4 tradicionais e tem uma região de ligação univalente em vez da região de ligação bivalente de anticorpos IgG4.

[00134] O termo "variável" se refere ao fato de que determinados segmentos dos domínios variáveis (V) diferem extensivamente nas sequência entre anticorpos. O domínio V faz a mediação da ligação ao antígeno e define a especificidade de um anticorpo em particular para seu antígeno em particular. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através da extensão dos aminoácidos 110 a 130 de um domínio variável. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariáveis denominados regiões de quadro (ou framework regions - FRs) de 15-30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de variabilidade extrema denominadas “regiões hipervariáveis”, ou “CDRs”, que têm cada uma um comprimento de 9-12 aminoácidos. Os domínios variáveis de cadeias endógenas pesadas e leves compreendem, cada um, quatro FRs, adotando no geral uma configuração em folha β, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam loops que conectam, e em alguns casos formam parte, da estrutura em folha β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed.

Public Health Service, National Institutes Of Health, Bethesda, Md (1991). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ou antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC).

[00135] O termo "variante" de polinucleotídeo, como usado nesse documento, é um polinucleotídeo que difere tipicamente de um polinucleotídeo especificamente descrito nesse documento em uma ou mais substituições, eliminações, adições e/ou inserções. As referidas variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, pela modificação de uma ou mais das sequências de polinucleotídeo da invenção e avaliação de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo codificado como descrito nesse documento e/ou pelo uso de qualquer uma de entre um número de técnicas bem conhecidas na técnica.

Consequentemente, o termo "variante de polipeptídeo", como usado nesse documento, é um polipeptídeo que difere tipicamente de um polipeptídeo especificamente descrito nesse documento em uma ou mais substituições, eliminações,

adições e/ou inserções.

As referidas variantes podem ser de ocorrência natural ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, pela modificação de uma ou mais das sequências de polipeptídeo da invenção e avaliação de uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo como descrito nesse documento e/ou pelo uso de qualquer uma de entre um número de técnicas bem conhecidas na técnica.

As modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção e resultarem ainda assim em uma molécula funcional que codifica ou é um polipeptídeo variante ou derivado com características desejáveis.

Quando é desejada a alteração da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo para criar uma variante ou porção de um polipeptídeo da invenção equivalente, ou mesmo melhorada, aqueles versados na técnica irão tipicamente alterar um ou mais dos códons da sequência de DNA codificadora.

Por exemplo, determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável de sua função

(por exemplo, capacidade de ligar outros polipeptídeos (por exemplo, antígenos) ou células). Sendo que é a capacidade de ligação e a natureza de uma proteína que definem a atividade funcional biológica da proteína, determinadas substituições de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteína e, naturalmente, na sua sequência de codificação de DNA subjacente, e resultam em uma proteína com propriedades similares. Considera-se assim que várias alterações podem ser feitas nas sequências de peptídeos da presente invenção, ou nas sequências de DNA correspondentes que codificam os referidos peptídeos, sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica. Em muitos casos, uma variante de polipeptídeo conterá uma ou mais substituições conservadoras. Uma variante pode também, ou alternativamente, conter alterações não-conservadoras. Em algumas modalidades, os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência endógena por substituição, eliminação ou adição de seis, cinco, quatro, três, dois ou um aminoácido(s). As variantes podem também (ou alternativamente) ser modificadas, por exemplo, pela eliminação ou adição de aminoácidos que têm influência mínima na imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo.

[00136] Os “versacorpos” são bem conhecidos na técnica e se referem a uma outra tecnologia mimética de anticorpos.

São proteínas pequenas de 3-5 kDa com >15% de cisteínas, que formam um scaffold de alta densidade de dissulfeto, substituindo o núcleo hidrofóbico de proteínas típicas.

[00137] O termo "xenogênica" se refere a qualquer material derivado de um indivíduo de uma espécie diferente.

O termo "xenoenxerto" se refere a um enxerto derivado de um indivíduo de uma espécie diferente.

[00138] O termo "zeta" ou alternativamente, “cadeia zeta”, “CD3 zeta” ou “TCR-zeta” é definido como a proteína fornecida com o nº de acesso ao GenBank BAG36664.1, ou os resíduos equivalentes de uma espécie não-humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, e um “domínio estimulador de zeta” ou alternativamente, um “domínio estimulador de CD3 zeta”, ou um “domínio estimulador de TCR-zeta” é definido como os resíduos de aminoácidos do domínio citoplásmico da cadeia zeta, ou derivados funcionais da mesma, que são suficientes para transmitir funcionalmente um sinal inicial necessário para a ativação das células T.

Em algumas modalidades, o domínio citoplásmico de zeta compreende os resíduos 52 a 164 do Nº de acesso GenBank BAG36664.1 ou os resíduos equivalentes de uma espécie não- humana, por exemplo, camundongo, roedor, macaco, símio e similares, que são os ortólogos funcionais dos mesmos.

Receptores de Antígenos Quiméricos (ou Chimeric Antigen Receptors - CARs)

[00139] A presente invenção fornece um receptor quimérico compreendendo: pelo menos um domínio de ligação extracelular,

opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular, pelo menos um domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, qualquer domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos), e pelo menos um domínio intracelular (compreendendo pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário e opcionalmente compreendendo pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador, em que o pelo menos um Domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos), em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou o domínio de Sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende um ou mais polipeptídeos.

[00140] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um domínio de ligação ao antígeno, e o receptor quimérico assim também pode ser referido como um receptor de antígeno quimérico (ou CAR).

I. Domínios de Ligação Extracelular

[00141] Em algumas modalidades, o domínio extracelular compreende um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

A porção do receptor quimérico da invenção compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode existir em uma variedade de formas onde o domínio de ligação de ligante é expresso como parte de uma cadeia de polipeptídeo contígua incluindo, por exemplo, um fragmento de anticorpo de domínio simples (ou single domain antibody fragment - sdAb), um anticorpo de cadeia simples (ou single chain antibody - scFv), um anticorpo humanizado ou um anticorpo biespecífico (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Houston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Bird et al., Science 242:423-426 (1988)). Em alguns aspectos, o domínio de ligação ao antígeno de um receptor quimérico descrito nesse documento compreende um fragmento de anticorpo. Em alguns aspectos, o receptor quimérico compreende um fragmento de anticorpo compreendendo um scFv.

[00142] Em algumas modalidades, o referido anticorpo é uma molécula de anticorpo selecionada a partir do grupo consistindo em um anticorpo inteiro, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo de cadeia simples dimérico, um Fv, um scFv, um Fab, um F(ab)’2, um anticorpo desfucosilado, um anticorpo biespecífico, um diacorpo, um triacorpo, e um tetracorpo.

[00143] Em algumas modalidades, o referido anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado do grupo consistindo em um unicorpo, um anticorpo de domínio simples e um nanocorpo.

[00144] Em algumas modalidades, o referido anticorpo é um mimético de anticorpo selecionado do grupo consistindo em um aficorpo, uma afilina, uma afitina, uma adnectina, um atrímero, uma evasina, uma DARPin, uma anticalina, um avímero, um finômero, um versacorpo e uma duocalina.

[00145] As DARPins (proteínas de repetição de anquirina projetadas ou Designed Ankyrin Repeat Proteins) são bem conhecidas na técnica e se referem a uma tecnologia de DRP mimética de anticorpos (proteína de repetição projetada) desenvolvida para explorar as capacidades de ligação de polipeptídeos não-anticorpos.

[00146] Os fragmentos e derivados de anticorpos dessa invenção (que são abrangidos pelo termo "anticorpo" como usado nesse pedido, a menos que especificado de outra forma ou claramente contrariado pelo contexto), podem ser produzidos por técnicas que são conhecidas na técnica.

Os

“fragmentos” compreendem uma porção do anticorpo intacto,

geralmente o local de ligação ao antígeno ou a região variável.

Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab,

Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2 e fragmentos Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que é um polipeptídeo tendo uma estrutura primária consistindo em uma sequência ininterrupta de resíduos de aminoácidos contíguos (referido nesse documento como um “fragmento de anticorpo de cadeia simples”

ou “polipeptídeo de cadeia simples”), incluindo sem limitação (1) moléculas Fv de cadeia simples (2)

polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, ou um fragmento dos mesmos que contém as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem uma fração de cadeia pesada associada e (3) polipeptídeos de cadeia simples contendo apenas uma região variável de cadeia pesada, ou um fragmento dos mesmos contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma fração de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Os fragmentos dos presentes anticorpos podem ser obtidos usando métodos padrão.

Os limites precisos de sequências de aminoácidos de uma dada CDR podem ser determinados usando qualquer um de entre um número de esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al., (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração “Kabat”), Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997) (esquema de numeração “Chothia”), ou uma combinação dos mesmos.

[00147] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno de um CAR da invenção compreende ou consiste em um fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, um scFv. Em modalidades em particular, o domínio de ligação ao antígeno é um scFv.

[00148] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno de um CAR da invenção reconhece um antígeno específico ou fragmento do mesmo (por exemplo, associado a uma célula alvo). Assim, o domínio de ligação ao antígeno de um CAR pode reconhecer células alvo tais como, por exemplo, células infectadas, células danificadas ou células disfuncionais. Exemplos das referidas células alvo podem incluir células envolvidas em reações imunes disfuncionais (por exemplo, células envolvidas em doenças autoimunes ou alergias), células inflamatórias ativadas disfuncionalmente (por exemplo, células endoteliais inflamatórias), células cancerosas, e células infectadas (por exemplo, infetadas por vírus, bactérias ou parasitas).

[00149] Como usado nesse documento, o termo "fragmento" de um antígeno se refere a qualquer subconjunto de um antígeno, como um peptídeo mais curto. Em algumas modalidades, um fragmento de um antígeno é um peptídeo de comprimento de pelo menos 6 aminoácidos. Em algumas modalidades, um fragmento de um antígeno é um peptídeo com comprimento de 6 a 50 aminoácidos, de 6 a 30 aminoácidos, ou de 6 a 20 aminoácidos.

[00150] O termo "variante" de um antígeno se refere nesse documento a um antígeno que é quase idêntico ao antígeno natural e que compartilha a mesma atividade biológica. A diferença mínima entre o antígeno natural e sua variante pode ser, por exemplo, em uma substituição, eliminação e/ou adição de aminoácido. As referidas variantes podem conter, por exemplo, substituições conservadoras de aminoácidos. Em algumas modalidades, a variante de um antígeno apresenta uma identidade de sequência de pelo menos ou de cerca de 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% com a sequência do antígeno natural.

[00151] Em algumas modalidades, o antígeno é um autoantígeno. Exemplos de autoantígenos incluem, sem limitação, um antígeno associado a uma condição do sistema nervoso inflamatório (por exemplo, um antígeno associado à esclerose múltipla), um antígeno associado a articulações, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição de enxerto ou GVHD.

[00152] Exemplos de antígenos associados à esclerose múltipla incluem, sem limitação, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína associada a mielina (MAG), glicoproteína da mielina de oligodentrócitos (MOG), proteína proteolipídeo (PLP), oligoproteína da mielina de oligodentrócitos (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada a mielina (MOBP), proteína específica a oligodendrócito (OSP/Claudin-11), proteínas de choque térmico, proteínas específicas a oligodendrócitos (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína mielina periférica 22 (PMP22), 2’3’- nucleotídeo cíclico 3’-fosfodiesterase (CNPase), ou quaisquer fragmentos, variantes ou misturas dos mesmos.

[00153] Exemplos de antígenos associados a articulações incluem, sem limitação, peptídeos de filagrina lineares e cíclicos substituídos com citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, peptídeos de glicoproteína de cartilagem humana 39 (HCgp39), HSP, ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) peptídeos A2, hnRNP Bl, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 e HSP90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V, anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil-calpastatina, piruvato desidrogenase (PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl- l00, antígenos de fosfolipídeo incluindo a cardiolipina aniônica e fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina com carga neutra, metaloproteinase de matriz, fibrilina, agrecano e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00154] Exemplos de antígenos associados ao olho incluem, sem limitação, colágeno tipo II, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, arrestina da retina, S-arrestina, proteínas de ligação de retinoide do interfotoreceptor (IRBP1), beta- cristalina Bl, proteínas retinais, proteínas de coroide e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00155] Exemplos de antígenos de HSP humanos incluem, sem limitação, HSP60, HSP70, HSP90 humano e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00156] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno associado à condição do sistema nervoso inflamatório, por exemplo, um antígeno associado a esclerose múltipla.

Exemplos de antígeno associado à condição do sistema nervoso inflamatório (por exemplo, antígenos associados a esclerose múltipla) incluem, mas não estão limitados a, proteína básica da mielina (MBP), glicoproteína associada à mielina (MAG), proteína de oligodendrócito da mielina (MOG), proteína proteolipídeo (PLP), oligoproteína de da mielina de oligodendrócito (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada à mielina (MOBP), proteína específica de oligodendrócito (OSP/claudin-11), proteínas de choque térmico, proteínas específicas de oligodendrócito (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22 (PMP22), 2’3’-nucleotídeo cíclico 3’-fosfodiesterase (CNPase), e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00157] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno associado a articulações. Exemplos de antígenos associados a articulações incluem, mas não estão limitados a, peptídeos de filagrina cíclicos e lineares substituídos com citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, peptídeos de glicoproteína de cartilagem humana 39 (HCgp39), HSP, ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) peptídeos A2, hnRNP Bl, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, 65, 70 e 90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V, anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil- calpastatina, piruvato desidrogenase (PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl-l00, antígeno de fosfolipídeo incluindo a cardiolipina aniônica e a fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina com carga neutra, metaloproteinase de matriz, fibrilina, agrecano, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00158] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno associado ao olho. Exemplos de antígenos associados ao olho incluem, mas não estão limitados a colágeno tipo II, arrestina da retina, S-arrestina, proteínas de ligação de retinoide do interfotoreceptor (IRBP1), betaB1-cristalina, proteínas retinais, proteínas de coroide, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00159] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno HSP humano. Exemplos de antígenos HSP humanos incluem, mas não estão limitados a HSP60, HSP70, HSP90, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00160] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno associado à pele. Exemplos de antígenos associados à pele incluem, mas não estão limitados a, antígenos de queratinócito, um antígeno presente na derme ou na epiderme, um antígeno de melanócito (tal como, por exemplo, a melanina ou a tirosinase), desmogleína (por exemplo, a desmogleína 1 ou 3, que também pode ser referida como Dsg1/3), BP180, BP230, plectina, integrinas (por exemplo, integrina ⍺4β6), colágenos (por exemplo, colágeno tipo VII), lamininas (por exemplo, laminina 332 ou laminina 𝛾1), plaquinas (por exemplo, envoplaquina, periplaquina, ou desmoplaquinas), queratinas (por exemplo, KRT5, KRT8, KRT15, KRT17 e KRT31), proteínas associadas ao filamento de queratina, filagrina, corneodesmosina e elastina.

[00161] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno envolvido na rejeição de enxerto ou na GVHD. Exemplos dos referidos antígenos incluem, mas não estão limitados ao MHC específico ao tecido transplantado ou ao hospedeiro, β2- microglobulina, antígenos do sistema ABO, antígenos do sistema rhesus (por exemplo, antígenos C, c, E, e e D) E isohemaglutininas. Outros exemplos de antígenos que podem estar envolvidos na rejeição de enxerto ou na GVHD incluem, mas não estão limitados a, HLA-DR (em particular durante os primeiros seis meses após o enxerto), HLA-B (em particular durante os primeiros dois anos após o enxerto), HLA-A, antígenos de histocompatibilidade menores (miHA, por exemplo, HLA-E, HLA-F e HLA-G), HLAs correspondendo à classe I de MHC (A, B e C), HLAs correspondendo à classe II de MHC (DP, DM, DOA, DOB, DQ, e DR) e HLAs correspondendo à classe III de MHC (por exemplo, componentes do sistema complemento).

[00162] Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína de superfície celular HLA-A2. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular compreende um anticorpo direcionado a HLA-A2 ou a um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação HLA-A2 compreende um scFv direcionado a HLA-A2.

[00163] O termo "HLA-A2", como usado nesse documento, se refere a proteínas de antígeno de leucócito humano (HLA) incluindo proteínas de superfície celular, codificadas pela família de alelos HLA-A*02 no locus HLA-A do complexo genético de HLA.

As proteínas HLA abrangidas pelo termo "HLA-

A2" incluem proteínas HLA identificadas como pertencentes ao tipo de antígeno HLA-A*02 por testes serológicos ou genotipagem.

Os nomes adicionais para o tipo de antígeno

HLA-A*02 incluem “HLA-A2”, “HLA-A02” e “HLA-A*2”. Foram desenvolvidos vários sistemas de nomeação diferentes que identificam proteínas HLA codificadas por esta família de alelos incluindo o sistema de nomeação HLA desenvolvido em

2010 pelo Committee for Factors of the HLA System da WHO.

O termo “HLA-A2” se refere a proteínas HLA codificadas por alelos tendo designações de acordo com este sistema de nomeação que começam com “HLA-A*02”, incluindo mas não limitado às designações que começam com “HLA-A*02:01”, “HLA-

A*02:02”, “HLA-A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-

A*02:06”, “HLA-A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-

A*02:10”, and “HLA-A*02:11”. As designações de alelos podem estar em itálico.

As designações de alelos que começam com

“HLA-A*02:” seguido por 2 ou 3 dígitos adicionais podem constituir a designação completa ou uma porção inicial da designação.

O termo “HLA-A2” se refere também a proteínas

HLA identificadas com designações que começam com “HLA-A*02”

de acordo com este sistema de nomeação, incluindo mas não limitado às designações “HLA-A*02:01”, “HLA-A*02:02”, “HLA-

A*02:03”, “HLA-A*02:04”, “HLA-A*02:05”, “HLA-A*02:06”, “HLA-

A*02:07”, “HLA-A*02:08”, “HLA-A*02:09”, “HLA-A*02:10”, and “HLA-A*02:11”.

[00164] Em algumas modalidades, o domínio de ligação HLA-A2 compreende um anticorpo direcionado a HLA-A2 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em determinadas modalidades, o domínio de ligação HLA-A2 compreende um scFv direcionado a HLA-A2. Exemplos de scFvs direcionados a HLA- A2 incluem, mas não estão limitados a, scFvs consistindo em ou compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, e fragmentos ou variantes das mesmas; e scFvs anti-HLA-A2 divulgados nas publicações de patentes PCT WO 2018/183293 e WO 2019/056099. Por exemplo, um scFv anti-HLA-A2 usado em um CAR descrito nesse documento pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 68. Em ainda outro exemplo, um scFv anti-HLA-

A2 usado em um CAR descrito nesse documento pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:

70. Em ainda outro exemplo, um scFv anti-HLA-A2 usado em um CAR descrito nesse documento pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 92. Em ainda outro exemplo, um scFv anti-HLA-A2 usado em um CAR descrito nesse documento pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 103. Em ainda outro exemplo, um scFv anti-HLA-A2 usado em um CAR descrito nesse documento pode consistir em ou compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 107.

[00165] Outros exemplos de autoantígenos incluem, sem limitação, canais de água aquaporinas (tais como, por exemplo, o canal de água de aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2, proteína de mediador de resposta da colapsina 5 (CRMP5), anfifisina, canal de potássio ativado por voltagem (VGKC), receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido ⍺-amino-3- hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPAR), peroxidase da tiroide, tiroglobulina, receptor anti-N-metil-D-aspartato (subunidade NR1), antígenos de grupo sanguíneo Rh, antígeno I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP180, BP230, receptores pós-sinápticos nicotínicos de acetilcolina, receptores de tirotropina, integrina de plaquetas, GpIIb:IIIa, colágeno (tal como, por exemplo, cadeia de colágeno alfa-3(IV)), fator reumatoide, calpastatina, proteínas citrulinadas, proteína básica da mielina (MBP), peptídeos de glicoproteína de oligodendrócito da mielina (MOG), alfa-beta-cristalina, DNA, histonas, ribossomos, RNP, transglutaminase de tecido (TG2), fator intrínseco, antígeno de 65 kDa, fosfatidilserina, fosfoproteínas ribossômicas, anticorpo anti-citoplásmico de neutrófilo, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos (ANCA), Jo-1, anticorpos antimitocondriais, gp210, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeo, snRNP U1-70 kd, gangliosídeo GQ1b, GM1, asialo GM1, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASMA), anticorpo anti-fígado-rim microssomal-1 (ALKM-1), anticorpo anti-citosol hepático (ALC-1), anticorpos anti-endomisiais de IgA, proteínas de grânulo de neutrófilo, antígeno de parede celular estreptocócica, fator intrínseco de células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase de ácido glutâmico (GAA ou GAD), proteína tirosina fosfatase (tal como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[00166] Em algumas modalidades, o antígeno é um receptor IL-23 (IL-23R) expresso na superfície celular. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um anticorpo direcionado a IL-23R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00167] Em algumas modalidades, o antígeno é IL-23R solúvel. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um anticorpo direcionado a IL-23R solúvel ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00168] Em algumas modalidades, o antígeno é uma variante de IL-23R. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um anticorpo direcionado a uma variante de IL-23R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00169] Em algumas modalidades, um peptídeo variante de IL-23R é um peptídeo IL-23R modificado em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos são eliminados, adicionados ou substituídos em comparação com o peptídeo original.

[00170] Em algumas modalidades, o antígeno é uma variante de junção de IL-23R. Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um anticorpo direcionado a uma variante de junção de IL-23R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00171] Em algumas modalidades, um CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a um IL-23R humano. Em algumas modalidades, um CAR da invenção reconhece e é capaz de se ligar a um IL-23R de murino.

[00172] Em algumas modalidades, o domínio de ligação de IL-23R compreende um anticorpo direcionado a IL-23R ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação de IL-23R compreende um scFv direcionado a IL-23R. Exemplos de scFvs direcionados a

IL-23R incluem, mas não estão limitados a, scFvs consistindo em ou compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 e fragmentos ou variantes das mesmas.

[00173] Em algumas modalidades, o antígeno é um alergênio inalado, um alergênio ingerido ou um alergênio de contato.

[00174] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00175] O termo "antígeno alimentar da dieta humana comum" se refere a um peptídeo imunogênico vindo de géneros alimentícios comuns para seres humanos, tais como um antígeno alimentar da seguinte lista não limitante: ovalbumina, antígenos bovinos tais como lipocalina, ligante de Ca S100, alfa-lactalbumina, lactoglobulinas tais como beta- lactoglobulina, albumina de soro bovino e caseínas. Os antígenos alimentares também podem ser antígenos de salmão Atlântico tais como parvalbumina, antígenos de galinha tais como ovomucoide, Ag22, conalbumina, lisozima ou albumina de soro de galinha, amendoins, antígenos de camarão tais como tropomiosina, antígenos de trigo tais como aglutinina ou gliadina, antígenos de aipo tais como profilina de aipo, antígenos de cenoura, tais como profilina de cenoura, antígenos de maçã, tais como taumatina, proteína de transferência de lipídeo de maçã, profilina de maçã,

antígenos de pera, tais como profilina de pera, isoflavona redutase, antígenos de abacate, tais como endoquitinase, antígenos de damasco, tais como proteína de transferência de lipídeo de damasco, antígenos de pêssego tais como proteína de transferência de lipídeo de pêssego ou profilina de pêssego, antígenos de soja tais como HPS, profilina de soja ou (SAM 22) PR-I0 prot, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00176] Em algumas modalidades, o antígeno é uma proteína específica ao tecido. Exemplos de proteínas específicas ao tecido incluem, mas não estão limitadas a, integrinas e selectinas cuja expressão é limitada a um tecido ou órgão específico.

[00177] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de células B expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B (por exemplo, células B humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD20, BCMA, IgM, IgA, IgG, IgE, IgD, CD1, CD5, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD38, CD40, CD78, CD80, CD138, CD319, PDL-2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, Notch2, TLR4, IL-6, IL-10 e TGFβ. Em determinadas modalidades, o marcador de superfície da célula B é selecionado de CD19, CD20, BCMA, IgM, IgA, IgG, IgE, IgD, CD1, CD21, CD22, CD138. Em modalidades em particular, o marcador de superfície de células B é selecionado de CD19 e CD20.

[00178] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de célula proB expresso na superfície de uma célula proB. Exemplos de marcadores de superfície de células proB (por exemplo, células proB humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD10, CD19, CD24, CD34 e CD38.

[00179] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície celular préB expresso na superfície de uma célula préB. Exemplos de marcadores de superfície de células préB (por exemplo, células préB humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD5, CD10, CD19, CD20 e CD34, CD38.

[00180] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície da célula B imaturo (ou transicional) expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B imaturas (ou transicionais) (por exemplo, células B imaturas humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD5, CD10, CD19, CD20, CD22, CD24, CD38 e IgG.

[00181] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de células B de zona marginal expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B de zona marginal (por exemplo, células B de zona marginal humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD1, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD27, IgG e Notch2.

[00182] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de célula plasmática expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células plasmáticas (por exemplo, células plasmáticas humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD27, CD38, CD138, IgG, MHCII e IL-6.

[00183] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de células de plasmablasto expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de plasmablasto (por exemplo, plasmablastos humanos) incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD20, CD27, CD38, IgG e MHCII.

[00184] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície da célula B de memória expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B de memória (por exemplo, células B de memória humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD20, CD22, CD24, CD27, CD38, CD40, CD80, PD-L2, IgG, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, IgA, IgG e IgE.

[00185] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de célula B de centro germinativo expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B de centro germinativo (por exemplo, células B de centro germinativo humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD10, CD19, CD20, CD22, CD38 e IgG.

[00186] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície de célula B ativada expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B ativadas (por exemplo, células B ativadas humanas) incluem, mas não estão limitados a, CD19, CD25 e CD30.

[00187] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície da célula B regulatória expresso na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B regulatórias (células Breg) incluem, mas não estão limitados a, CD1, CD1d, CD5, CD19, CD21, CD23, CD24, CD40, ligante Fas, IL-10, TLR4, TGFβ, IgD, IgM, PD-L1, PD-L2, TIM- 1, TNFSF18, e TRAIL. Em modalidades em particular, exemplos de marcadores de superfície de células Breg humanas incluem, mas não estão limitados a, CD1, CD1d, CD5, CD19, CD21, CD24, CD40, IL-10, TLR4, TGFβ, IgD e IgM.

[00188] Em algumas modalidades, o antígeno é um marcador de superfície da célula B com Ig não-secretada expressa na superfície de uma célula B. Exemplos de marcadores de superfície de células B (por exemplo, células B humanas) com Ig não-secretada incluem, mas não estão limitados a, CD138 e Notch2.

[00189] Em algumas modalidades, o marcador de superfície da célula B é CD19. Em algumas modalidades, o domínio de ligação CD19 compreende um anticorpo direcionado a CD19 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de ligação CD19 compreende um scFv direcionado a CD19. Exemplos de scFvs direcionados a CD19 incluem, mas não estão limitados a, SEQ ID NO: 1 e FMC63 (SEQ ID NO: 2).

[00190] Em algumas modalidades, o marcador de superfície da célula B é CD20. Em algumas modalidades, o domínio de ligação CD20 compreende um anticorpo direcionado a CD20 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Exemplos de anticorpos CD20 incluem, mas não estão limitados a, rituximab ou um fragmento ou variante do mesmo (por exemplo, SEQ ID NO: 3 ou um fragmento ou variante da mesma). Exemplos de scFvs direcionados a CD20 incluem, mas não estão limitados a, scFvs compreendendo ou consistindo em uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, e fragmentos ou variantes das mesmas.

[00191] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de câncer.

[00192] Como usado nesse documento, o termo “antígeno de câncer” se refere a um antígeno que é expresso diferencialmente por células cancerosas e pode, portanto, ser explorado para alvejar células cancerosas. Antígenos de câncer são antígenos que podem potencialmente estimular respostas imunológicas aparentemente específicas de tumor.

Alguns desses antígenos são codificados, embora não necessariamente expressos, por células normais; esses antígenos podem ser caracterizados como aqueles que são normalmente silenciosos (isto é, não-expressos) em células normais, aqueles que são expressos apenas em determinados estágios de diferenciação e aqueles que são expressos temporalmente tais como antígenos embrionários e fetais.

Outros antígenos de câncer são codificados por genes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene ras ativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante) e proteínas de fusão resultantes de eliminações internas ou translocações cromossômicas. Ainda outros antígenos de câncer podem ser codificados por genes virais tais como aqueles transportados em vírus tumorais de RNA e DNA. Muitos antígenos de tumor foram definidos em termos de tumores sólidos múltiplos: MAGE 1, 2, e 3 (definidos por imunidade), MART-1/Melan-A, gpl00, antígeno carcinoembrionário (CEA), HER2, mucinas (isto é, MUC-l), antígeno específico da próstata (PSA), e fosfatase ácida prostática (PAP). Além disso, as proteínas virais tais como algumas codificadas pela hepatite B (HBV), Epstein-Barr (EBV) e papiloma humano (HPV) mostraram ser importantes no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, linfoma e câncer cervical, respectivamente.

[00193] Outros antígenos de câncer incluem, mas não estão limitados a, 707-AP (707 alanina prolina), AFP (fetoproteína alfa (a)), ART-4 (antígeno de adenocarcinoma reconhecido por células T4), BAGE (antígeno B; b-catenina/m,

b-catenina/mutada), BCMA (antígeno de maturação de célula

B), Bcr-abl (breakpoint cluster region-Abelson), CAIX

(anidrase carbónica IX), CD19 (grupamento de diferenciação

19), CD20 (grupamento de diferenciação 20), CD22 (grupamento de diferenciação 22), CD30 (grupamento de diferenciação 30)

, CD33 (grupamento de diferenciação 33), CD44v7/8

(grupamento de diferenciação 44, éxons 7/8), CAMEL (antígeno reconhecido por CTL em melanoma), CAP-1 (peptídeo de antígeno carcinoembrionário-1), CASP-8 (caspase-8), CDC27m (ciclo de divisão celular 27 mutado), CDK4/m (quinase dependente de ciclina 4 mutada), CEA (antígeno carcinoembrionário), CT

(câncer/testículos (antígeno)), Cyp-B (ciclofilina B), DAM

(melanoma de antígeno de diferenciação), EGFR (receptor de fator de crescimento epidérmico), EGFRvIII (receptor de fator de crescimento epidérmico, variante III), EGP-2

(glicoproteína epitelial 2), EGP-40 (glicoproteína epitelial

40), Erbb2, 3, 4 (homólogo de oncogene viral de leucemia eritroblástica -2, -3, 4), ELF2M (fator de alongamento 2 mutado), ETV6-AML1 (variante de ETS gene 6/leucemia mieloide aguda 1 gene ETS), FBP (proteína de ligação de folato), fAchR

(receptor de acetilcolina fetal), G250 (glicoproteína 250),

GAGE (antígeno G), GD2 (disialogangliosídeo 2), GD3

(disialogangliosídeo 3), GnT-V (N-

acetilglicosaminiltransferase V), Gpl00 (glicoproteína l00kD), HAGE (antígeno de helicose), HER-2/neu (receptor epidérmico humano-2/neurológico; também conhecido como

EGFR2), HLA-A (antígeno de leucócito humano-A) HPV (vírus do papiloma humano), HSP70-2M (proteína de choque térmico 70-2 mutada), HST-2 (tumor de anel de sinete humano-2), hTERT ou hTRT (transcriptase reversa de telomerase humana), iCE

(carboxil esterase intestinal), IL-13R-a2 (subunidade alfa-

2 de receptor de Interleucina-l3), KIAA0205, KDR (receptor de domínio de inserção de quinase), cadeia leve-κ, LAGE

(antígeno L), LDLR/FUT (receptor de lipídeo de baixa densidade/GDP-L-fucose: b-D-galactosidase 2-a-

Lfucosiltransferase), LeY (anticorpo Lewis-Y), L1 CAM

(molécula de adesão de célula L1) MAGE (antígeno de melanoma), MAGE-A1 (antígeno associado a melanoma 1),

mesotelina, células murinas infectadas por CMV, MART-

1/Melan-A (antígeno de melanoma reconhecido por células T-

I/antígeno de melanoma A), MC1 R (receptor de melanocortina

1), iosina/m (miosina mutada), MUC1 (mucina 1), MUM-1, -2,

-3 (melanoma ubíquo mutado -l, -2, -3), NA88-A (clone de cDNA NA de paciente M88), NKG2D (exterminadoras naturais grupo 2, membro D) ligantes, NY-BR-L (antígeno de diferenciação de mama New York 1), NY-ESO-1 (carcinoma de células escamosas esofágicas New York-l), antígeno oncofetal

(h5T4), P15 (proteína 15), pl90 menor bcr-abl (proteína de

190KD bcr-abl), Pm1/RARa (leucemia promielocítica/receptor de ácido retinoico a), PRAME (antígeno expresso preferencialmente de melanoma), PSA (antígeno específico da próstata), PSCA (antígeno de célula tronco da próstata), PSMA (antígeno da membrana específica da próstata), RAGE (antígeno renal), RU1 ou RU2 (células renais ubíquas 1 ou 2), SAGE (antígeno do sarcoma), SART-l ou SART-3 (tumor escamoso de rejeição de antígeno 1 ou 3), sarcoma sinovial X-1, -2, -3, -4 (SSX-1, -2, -3, -4), TAA (antígeno associado a tumor), TAG-72 (glicoproteína associada a tumor 72), TEL/AML1 (leucemia de translocação da família Ets/leucemia mieloide aguda 1), TPI/m (triose fosfato isomerase mutada), TRP-1 (proteína relacionada a tirosinase 1, ou gp75), TRP-2 (proteína relacionada a tirosinase 2), TRP-2/INT2 (TRP- 2/íntron 2), VEGF-R2 (receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2) ou WT1 (gene de tumor de Wilms).

[00194] Em algumas modalidades, o antígeno está associado a células infectadas.

[00195] Como usado nesse documento, o termo “células infectadas” se refere a células contaminadas com algo que afeta sua qualidade, caráter ou condição de forma desfavorável.

[00196] Em algumas modalidades, o antígeno está associado a células infectadas por vírus. Em algumas modalidades, o antígeno está associado a células infectadas por bactéria. Em algumas modalidades, o antígeno está associado a células infectadas com fungos. Em algumas modalidades, o antígeno está associado a células infectadas por parasita.

[00197] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é uma proteína ou um fragmento ou uma variante da mesma.

[00198] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular reconhece um autoanticorpo em uma célula B.

[00199] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é um autoantígeno.

[00200] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende um autoantígeno (que também pode ser referido como antígeno próprio) ou um fragmento ou variante do mesmo, e assim pode reconhecer anticorpos direcionados ao referido autoantígeno. Como usado nesse documento, o termo “autoantígeno” ou “antígeno próprio” se refere a um antígeno endógeno que estimula a produção de autoanticorpos. Em algumas modalidades, o autoantígeno está envolvido em uma doença autoimune. Em algumas modalidades, as células imunes da invenção são citotóxicas para células B que produzem anticorpos direcionados ao referido autoantígeno.

[00201] O termo “variante de um autoantígeno” se refere nesse documento a um autoantígeno que é quase idêntico ao autoantígeno natural e que compartilha a mesma atividade biológica. A diferença mínima entre o autoantígeno natural e uma variante do mesmo pode ser, por exemplo, em uma substituição, eliminação e/ou adição de aminoácido. As referidas variantes podem conter, por exemplo, substituições conservadoras de aminoácidos em que resíduos de aminoácidos são substituídos com resíduos de aminoácidos tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e cisteína), cadeias laterais não-polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Em algumas modalidades, a variante de um autoantígeno apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% com a sequência do autoantígeno natural.

[00202] Exemplos de autoantígenos incluem, mas não estão limitados a, canais de água de aquaporinas (tais como, por exemplo, o canal de água aquaporina-4 (AQP4)), Hu, Ma2, proteína mediadora de resposta de colapsina 5 (CRMP5),

anfifisina, canal de potássio ativado por tensão (VGKC),

receptor de N-metil-d-aspartato (NMDAR), ácido ⍺-amino-3-

hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiônico (AMPAR), peroxidase da tiroide, tiroglobulina, receptor anti-N-metil-D-aspartato

(subunidade NR1), antígenos de grupo sanguíneo Rh, antígeno

I, desmogleína 1 ou 3 (Dsg1/3), BP 180, BP230, receptores pós-sinápticos de acetilcolina nicotínica, receptores de tirotropina, integrina de plaquetas, GpIIb:IIIa, colágeno

(tal como, por exemplo, cadeia de colágeno alfa-3(IV)), fator reumatoide, calpastatina, proteínas citrulinadas, proteína básica de mielina (MBP), peptídeos de glicoproteína de oligodendrócito de mielina (MOG), alfa-beta-cristalina, DNA,

histona, ribossomos, RNP, transglutaminase de tecido (TG2),

fator intrínseco, antígeno de 65 kDa, fosfatidilserina,

fosfoproteínas ribossômicas, anticorpo citoplásmico anti-

neutrófilo, Scl-70, U1-RNP, ANA, SSA, anti-SSB, anticorpos antinucleares (ANA), anticorpos anti-neutrófilos citoplasmáticos (ANCA), Jo-1, anticorpos antimitocondriais,

gp2l0, p62, sp100, anticorpos antifosfolipídeo, snRNP Ul-70 kd, gangliosídeo GQ1b, GM1, GM1 asialo, GD1b, anticorpos anti-músculo liso (ASAMA anticorpo anti-fígado-rim microssomal-1 (ALKM-1), anticorpo anti-citosol hepático

(ALC-1), anticorpos anti-endomisiais de IgA, proteínas de grânulo de neutrófilo, antígeno de parede celular estreptocócica, fator intrínseco de células parietais gástricas, insulina (IAA), descarboxilase de ácido glutâmico (GAA ou GAD), proteína tirosina fosfatase (tal como, por exemplo, IA2 ou ICA512), PLA2R1 e THSD7A1.

[00203] Outros exemplos de autoantígenos estão listados nesse documento e incluem, sem limitação, antígenos associados a esclerose múltipla (tais como, por exemplo, proteína básica de mielina (MBP), glicoproteína associada a mielina (MAG), glicoproteína da mielina de oligodentrócitos (MOG), proteína proteolipídeo (PLP), oligoproteína da mielina de oligodentrócitos (OMGP), proteína básica de oligodendrócito associada a mielina (MOBP), proteína específica a oligodendrócito (OSP/Claudin-11), proteínas de choque térmico, proteínas específicas a oligodendrócitos (OSP), NOGO A, glicoproteína Po, proteína mielina periférica 22 (PMP22), 2’3’- nucleotídeo cíclico 3’-fosfodiesterase (CNPase), ou quaisquer fragmentos, variantes ou misturas dos mesmos); antígenos associados às articulações (tais como, por exemplo peptídeos de filagrina lineares e cíclicos substituídos com citrulina, peptídeos de colágeno tipo II, peptídeos de glicoproteína de cartilagem humana 39 (HCgp39), HSP, ribonucleoproteína nuclear heterogénea (hnRNP) peptídeos A2, hnRNP Bl, hnRNP D, Ro60/52, HSP60, HSP65, HSP70 e HSP90, BiP, queratina, vimentina, fibrinogênio, peptídeos de colágeno tipo I, III, IV e V, anexina V, glicose 6 fosfato isomerase (GPI), acetil-calpastatina, piruvato desidrogenase

(PDH), aldolase, topoisomerase I, snRNP, PARP, Scl-70, Scl- l00, antígenos de fosfolipídeo incluindo a cardiolipina aniônica e fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilcolina com carga neutra, metaloproteinase de matriz, fibrilina, agrecano e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos; antígenos associados ao olho (tais como, por exemplo, colágeno tipo II, arrestina da retina, S- arrestina, proteínas de ligação de retinoide do interfotoreceptor (IRBP1), beta-cristalina Bl, proteínas retinais, proteínas de coroide e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos; e antígenos HSP humanos (tais como, por exemplo, HSP60, HSP70, HSP90 humano, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos).

[00204] Em algumas modalidades, o autoantígeno é a desmogleína 1 ou a desmogleína 3 ou uma variante ou fragmento do mesmo, tal como, por exemplo, domínios extracelulares da desmogleína 1 ou 3. Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende domínios extracelulares 1 a 4 da desmogleína 3, tal como, por exemplo, uma sequência compreendendo ou consistindo em a SEQ ID NO: 7.

[00205] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um domínio de ligação extracelular contra um primeiro antígeno e pelo menos um outro domínio de ligação extracelular contra um outro antígeno. O referido CAR é capaz de se ligar a pelo menos 2 antígenos diferentes. Em determinadas modalidades, o referido pelo menos um outro domínio de ligação extracelular é um anticorpo direcionado a um antígeno específico ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em determinadas modalidades, o referido pelo menos um outro domínio de ligação extracelular compreende ou consiste em um fragmento de anticorpo, tal como, por exemplo, um scFv.

[00206] Em algumas modalidades, o anticorpo compreendido em um CAR da invenção é uma molécula de anticorpo multiespecífico, por exemplo, compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, em que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em algumas modalidades, a molécula de anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico. Um anticorpo biespecífico tem especificidade para dois antígenos, e é caracterizado por uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo.

II. Domínios Espaçador e de Dobradiça

[00207] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular é conectado a um domínio transmembrana por um domínio espaçador ou um domínio de dobradiça. Exemplos de ligantes incluem, mas não estão limitados a, ligantes GS como descrito nesse documento. Em determinadas modalidades, o ligante pode compreender ou consistir em a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 111)

[00208] Em algumas modalidades, um ligante curto de oligo ou polipeptídeo, tendo um comprimento que varia de, por exemplo, 2 a 10 aminoácidos, pode formar o domínio de dobradiça. Em algumas modalidades, o termo "ligante" se refere a um ligante de polipeptídeo flexível.

[00209] Por exemplo, um dupleto de glicina-serina pode fornecer um domínio de dobradiça adequado (ligante GS). Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um ligante Gly/Ser. Exemplos de ligantes Gly/Ser incluem, mas não estão limitados a, ligantes GS, ligantes G2S, ligantes G3S e ligantes G4S.

[00210] Exemplos de ligantes G2S incluem, mas não estão limitados a, GGS.

[00211] Os ligantes G3S compreendem a sequência de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n, também referida como (GGGS)n ou (SEQ ID NO: 112)n, onde n é um número inteiro positivo igual ou maior do que 1 (tal como, por exemplo, n=l, n=2, n=3 n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 ou n=10). Exemplos de ligantes G3S incluem, mas não estão limitados a, GGGSGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 113).

[00212] Exemplos de ligantes G4S incluem, mas não estão limitados a, (Gly4 Ser) correspondendo a GGGGS (SEQ ID NO: 114); (Gly4 Ser)2 correspondendo a GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 115); (Gly4 Ser)3 correspondendo a GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 116); e (Gly4 Ser)4 correspondendo a GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 117).

[00213] Em algumas modalidades, um domínio espaçador pode ter um comprimento de até 300 aminoácidos, por exemplo, 10-100 aminoácidos, 25-50 aminoácidos, ou 2-10 aminoácidos.

[00214] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é um ligante curto de oligo ou polipeptídeo, por exemplo, tendo um comprimento que varia de 2 a 10 aminoácidos, como descrito nesse documento. Um exemplo de um domínio de dobradiça que pode ser usado na presente invenção é descrito na Publicação de Patente PCT WO2012/138475, incorporada neste documento por referência.

[00215] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo da sequência de aminoácidos AGSSSSGGSTTGGSTT (SEQ ID NO: 8), a sequência de aminoácidos GTTAASGSSGGSSSGA (SEQ ID NO: 9), a sequência de aminoácidos SSATATAGTGSSTGST (SEQ ID NO: 10), e a sequência de aminoácidos TSGSTGTAASSTSTST (SEQ ID NO: 11)

[00216] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é codificado por uma sequência de nucleotídeos de GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC (SEQ ID NO: 12).

[00217] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma dobradiça KIR2DS2 correspondendo a KIRRDSS (SEQ ID NO: 13).

[00218] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de uma dobradiça CD8 (por exemplo, compreendendo ou consistindo em a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma dobradiça CD8 codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de ácido nucléico com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 15.

[00219] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de uma dobradiça IgG4 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma dobradiça de IgG4 codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de ácido nucléico com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 17.

[00220] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de uma dobradiça IgD (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma dobradiça IgD codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 19 ou uma sequência de ácido nucléico com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 19.

[00221] Em algumas modalidades, a região de dobradiça compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de uma dobradiça CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:20) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma dobradiça CD28 codificada pelo ácido nucleico da SEQ ID NO: 21 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 21 III. Domínios transmembrana

[00222] Exemplos de domínios transmembrana que podem ser usados em um receptor quimérico da invenção incluem, mas não estão limitados a, domínios transmembrana de TNFR2, CD28, CD8, ou de uma cadeia alfa, beta ou zeta de um receptor de células T, ou de CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD3 zeta, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R a, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, PD1, ITGAX, CDl1c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRT AM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CDIOO (SEMA4D), SLAMF6 (NTB- A, Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, e/ou NKG2C.

[00223] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana pode compreender o domínio transmembrana inteiro da molécula a partir do qual é derivado, ou pode compreender um fragmento funcional ou variante do mesmo.

[00224] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende pelo menos um domínio transmembrana selecionado de um domínio transmembrana de TNFR2, um domínio transmembrana de CD8 e um domínio transmembrana de CD28.

[00225] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 22.

[00226] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de TNFR2 é codificado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23, ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 23.

[00227] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de TNFR2 compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 22, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 aminoácidos contíguos da sequência de SEQ ID NO: 22. Em determinadas modalidades, o domínio transmembrana de TNFR2 compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em CVIMTQV (SEQ ID NO: 62), VNCVIMTQV (SEQ ID NO: 63), ou TALGLLIIGVVNCVIMTQV (SEQ ID NO: 64). Em modalidades em particular, o domínio transmembrana de TNFR2 compreende a sequência de aminoácidos de VNCVIMTQV (SEQ ID NO: 63).

[00228] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de TNFR2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 66, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84 ou 87 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 23 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 23, por exemplo, pelo menos 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60,

63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84 ou 87 nucleotídeos contíguos da sequência de SEQ ID NO: 23.

[00229] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD8 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24), ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24.

[00230] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD8 é codificado pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 25, ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25.

[00231] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD8 compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 24 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 aminoácidos contíguos da sequência de SEQ ID NO: 24.

[00232] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD8 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69 ou 72 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 25 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25, por exemplo, pelo menos 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69 ou 72 nucleotídeos contíguos da sequência de SEQ ID NO: 25.

[00233] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26.

[00234] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana CD28 codificado pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 27 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD28 compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 26 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 26, por exemplo, pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27 aminoácidos contíguos da sequência de SEQ ID NO: 26.

[00235] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana CD28 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78 ou 81 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 27 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27, por exemplo, pelo menos 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78 ou 81 nucleotídeos contíguos da sequência de SEQ ID NO:

27.

[00236] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico pode compreender uma combinação de pelo menos dois domínios transmembrana, por exemplo, selecionados de um domínio transmembrana de TNFR2, um domínio transmembrana de CD8 e um domínio transmembrana de CD28. Os referidos domínios transmembrana podem ser domínios transmembrana inteiros ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e podem estar ligados entre si em uma ordem aleatória ou em uma ordem especificada.

Em determinadas modalidades, a combinação dos pelo menos dois domínios transmembrana ou fragmentos ou variantes dos mesmos compreendem pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 aminoácidos.

[00237] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD8 (por exemplo,

compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo. Em determinadas modalidades, o receptor quimérico compreende um domínio transmembrana de fusão compreendendo as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 59 e 62, SEQ ID NOs: 60 e 63, ou SEQ ID NOs: 61 e 64.

[00238] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00239] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos do domínio transmembrana CD8 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00240] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico pode compreender uma combinação de pelo menos três domínios transmembrana, por exemplo, selecionados de um domínio transmembrana de TNFR2, um domínio transmembrana de CD8 e um domínio transmembrana de CD28. Os referidos domínios transmembrana podem ser domínios transmembrana inteiros ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em determinadas modalidades, a combinação dos pelo menos três domínios de transmembrana, um fragmento ou variante dos mesmos, compreende pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ou 50 aminoácidos.

[00241] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD8, por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de (SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00242] Assim, em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio transmembrana de um CAR da invenção compreende a sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da

SEQ ID NO: 23) ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou a sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana CD8 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25) ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou a sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00243] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de um CAR da invenção compreende a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD8 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou a sequência de aminoácidos de um domínio transmembrana CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que as sequências compreendidas no domínio transmembrana são expressas no mesmo quadro e como uma cadeia de polipeptídeo simples.

[00244] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana de um CAR da invenção compreende pelo menos dois domínios diferentes (por exemplo, um domínio de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e pelo menos um outro domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembrana CD8 ou CD28) ou um fragmento ou variante do mesmo) que podem estar ligados entre si em uma ordem aleatória ou em uma ordem especificada.

[00245] Opcionalmente, um ligante curto de oligo ou polipeptídeo, por exemplo, com um comprimento entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) pode formar a ligação entre domínios transmembrana distintos.

[00246] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana pode ser recombinante. Em determinadas modalidades, o domínio transmembrana recombinante compreende predominantemente aminoácidos hidrofóbicos tais como valina ou leucina.

IV. Domínios Intracelulares

[00247] Em algumas modalidades, o domínio intracelular de um CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de células T (ou uma sequência derivada do mesmo) e opcionalmente um ou mais domínio(s) intracelular(es) de uma molécula coestimuladora de célula T (ou sequência(s) derivada do mesmo).

[00248] Em algumas modalidades, o domínio intracelular pode compreender a porção intracelular inteira ou o domínio de sinalização intracelular endógeno inteiro, da molécula a partir da qual é derivado, ou um fragmento ou variante funcional do mesmo.

[00249] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular consiste em pelo menos um domínio de sinalização primário (por exemplo, um domínio de sinalização primário de células T) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00250] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular consiste em pelo menos um domínio de sinalização coestimulador (por exemplo, um domínio intracelular de molécula coestimuladora de células T) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00251] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular compreende um ou mais domínio(s) intracelular(es) de uma molécula coestimuladora de células T ou um fragmento ou variante do mesmo. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular consiste em um ou mais domínio(s) intracelular(es) de uma molécula coestimuladora de células T ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00252] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção compreende pelo menos um domínio coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo e pelo menos um domínio de sinalização primário ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00253] Em outra modalidade, o domínio de sinalização intracelular do CAR da invenção consiste em um domínio coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo e um domínio de sinalização primário ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00254] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende pelo menos um, dois, três ou quatro domínios coestimuladores ou um fragmento ou variante do(s) mesmo(s) e pelo menos um domínio de sinalização primário ou um fragmento ou variante do mesmo.

Em determinadas modalidades, um ou mais dos domínios coestimuladores são domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T. Em determinadas modalidades, o pelo menos um domínio de sinalização primário é um domínio de sinalização primário de células T.

[00255] Em algumas modalidades da invenção, o domínio de sinalização primário compreende um domínio de sinalização de uma proteína selecionada do grupo que consiste em CD3 zeta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, FcR gama comum (FCER1G), FcR beta (Fc Epsilon Rib) CD79a, CD79b, Fcgama RIIa, DAP10, e DAP1, e sequências derivadas das mesmas.

[00256] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário é um domínio de sinalização primário de células T compreendendo ou consistindo em pelo menos um domínio de sinalização funcional de CD3 zeta ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00257] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário de células T compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de CD3 zeta da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31.

[00258] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário de CD3 zeta compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações, em comparação com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31.

[00259] Assim, em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização primário de células T compreende ou consiste em a sequência de ácido nucleico do domínio CD3 zeta da SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33, ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO:

33.

[00260] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário de CD3 zeta compreende pelo menos 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou 112 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, por exemplo, pelo menos 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 ou 112 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31.

[00261] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário de CD3 zeta é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 ou 336 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33, ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33, por exemplo, pelo menos 6, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 ou 336 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33.

[00262] Em algumas modalidades, os domínios de sinalização primária de células T que agem de forma estimulante podem compreender motivos de sinalização conhecidos como motivos de ativação à base de imunoreceptores tirosina (ou immunoreceptor tyrosine-based activation motifs - ITAMS). Exemplos de domínios de sinalização intracelular primários de células T contendo ITAM que são de uso particular na invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles de (ou que são derivados de) CD3 zeta, FcR gama comum (FCER1G), Fc gama RIIa, FcR beta (Fc epsilon R1b), CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD5, CD22, CD66b, CD79a, CD79b, DAP10 e DAP12.

[00263] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização primário de células T compreende um domínio ITAM modificado, por exemplo, um domínio ITAM mutado que tem atividade alterada (por exemplo, aumentada ou diminuída) em comparação com o domínio ITAM endógeno. Em algumas modalidades, um domínio de sinalização primária compreende um domínio de sinalização intracelular primário modificado contendo ITAM, por exemplo, um domínio de sinalização intracelular primário contendo ITAM otimizado e/ou truncado. Em determinadas modalidades, um domínio de sinalização primário pode compreender um, dois, três, quatro ou mais motivos ITAM.

[00264] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de células T (tal como, por exemplo, um domínio de sinalização de CD3 zeta ou um fragmento ou variante do mesmo), combinado com um ou mais domínios de sinalização coestimuladores, em que os referidos domínios de sinalização coestimuladores são domínios de sinalização intracelular coestimuladores inteiros ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00265] Exemplos de domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T incluem, mas não estão limitados aos domínios de sinalização de proteínas selecionadas do grupo consistindo em TNFR2

(CD120b/TNFRSF1B), 4-1BB (CD137), ICOS (CD278), CD27, CD28,

CTLA-4 (CD152), PD-1, uma molécula MHC de classe I, BTLA, um receptor de ligante Toll, OX40, CD30, CD40, antígeno associado à função de linfócitos - 1 (LFA-1), CD2, CD7,

LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligante que se liga especificamente a CD83, CDS, ICAM-1, GITR, ARHR, BAFFR, HVEM (LIGHTR),

SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD160 (BY55),

CD19, CD19a, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2ra, IL6Ra, IL2R beta,

IL2R gama, IL7R alfa, IL-13RA1/RA2, IL-33R(IL1RL1), IL-

10RA/RB, IL-4R, IL-5R (CSF2RB), IL-21R, ITGA4, VLA1, CD49a,

ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE,

CD103, ITGAL, CD11a/CD18, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1,

CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, CD95, TNFR1

(CD120a/TNFRSF1A), TGFbR1/2/3, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226),

SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM,

Ly9 (CD229), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A,

Lyl08), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG

(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, cadeia gama comum,

um ligante que se liga especificamente a CD83, NKp44, NKp30,

NKp46, NKG2D, e qualquer combinação dos mesmos.

[00266] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende pelo menos um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T selecionada do grupo consistindo em TNFR2, 4-1BB, ICOS, CD27, OX40, CD28, CTLA4 e PD-1.

[00267] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende pelo menos um domínio de sinalização coestimulador, em que o referido domínio de sinalização coestimulador é um domínio de sinalização coestimulador inteiro ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00268] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34.

[00269] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T é codificado pela sequência de nucleotídeos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35), ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 35.

[00270] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador intracelular de TNFR2 compreende pelo menos 2, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 ou 174 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 34, por exemplo, pelo menos 2, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 ou 174 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34.

[00271] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador intracelular de TNFR2 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 18, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 260, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 510 ou 522 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 35 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 35, por exemplo, pelo menos 6, 18, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 260, 270, 300,

330, 360, 390, 420, 450, 480, 510 ou 522 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 35.

[00272] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador intracelular compreende os domínios I e II, os domínios I-III, os domínios I-IV, ou os domínios I-V Do domínio de sinalização coestimulador intracelular de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34). Em determinadas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador intracelular compreende os domínios I e II do domínio coestimulador intracelular de TNFR2.

[00273] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador intracelular compreende os resíduos 1-20 (Δ151), 1-70 (Δ104), 1-115 (Δ59), ou 1-156 (Δ18) da SEQ ID NO: 34.

[00274] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:36) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 36Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações,

mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36.

[00275] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T é codificado por uma sequência de nucleotídeos do domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37), ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 37.

[00276] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB compreende pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, ou 42 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 36 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 36, por exemplo, pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 ou 42 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 36.

[00277] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117 ou 126 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 37 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 37, por exemplo, pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117 ou 126 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:

37.

[00278] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% Ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 38.Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38.

[00279] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T é codificado por uma sequência de nucleotídeos do domínio da sinalização intracelular coestimuladora de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39), ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 39.

[00280] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 compreende pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45 ou 48 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 38 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 38, por exemplo, pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45 ou 48 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 38.

[00281] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117, 126, 135 ou 144 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 39 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 39, por exemplo, pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117, 126, 135 ou 144 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 39.

[00282] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 40Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos uma, duas ou três modificações, mas não mais do que 20, 10 ou 5 modificações em comparação com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40.

[00283] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização coestimulador de células T é codificado por uma sequência de nucleotídeos do domínio de sinalização intracelular coestimuladora de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo em a SEQ ID NO: 41), ou uma sequência de nucleotídeos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 41.

[00284] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 compreende pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 ou 41 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 40 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 40, por exemplo, pelo menos 2, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 ou 41 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 40.

[00285] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 é codificado por uma sequência de nucleotídeos de pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117 ou 123 nucleotídeos da sequência de SEQ ID NO: 41 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 41, por exemplo, pelo menos 6, 18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 96, 99, 108, 117 ou 123 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO:

41.

[00286] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico compreende uma combinação de pelo menos dois domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T. Em determinadas modalidades, os pelo menos dois domínios intracelulares podem ser selecionados a partir de um domínio intracelular de TNFR2, um domínio intracelular de 4-1BB, um domínio intracelular de CD27 e um domínio intracelular de CD28. Em modalidades em particular, os referidos domínios de sinalização intracelular coestimuladores são domínios de sinalização intracelular coestimuladores inteiros ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00287] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00288] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de Aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00289] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00290] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00291] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00292] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo,

compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00293] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico compreende uma combinação de pelo menos três domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T, por exemplo, selecionado de um domínio intracelular de TNFR2, um domínio intracelular de 4-1BB, um domínio intracelular de CD27 e um domínio intracelular de CD28.

[00294] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico pode compreender pelo menos três domínios de sinalização intracelular coestimuladores, em que os referidos domínios são domínios de sinalização intracelular coestimuladores inteiros ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00295] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00296] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00297] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00298] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27, por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00299] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico compreende uma combinação de pelo menos quatro domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T, por exemplo, selecionados de um domínio intracelular de TNFR2, um domínio intracelular de 4-1BB, um domínio intracelular de CD27 e um domínio intracelular de CD28.

[00300] Em algumas modalidades da invenção, o receptor quimérico pode compreender uma combinação de pelo menos quatro domínios intracelulares de uma molécula coestimuladora de células T, em que os referidos domínios de sinalização intracelular coestimuladores são domínios de sinalização intracelular coestimuladores inteiros ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00301] Em algumas modalidades, o receptor quimérico compreende a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e a sequência de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00302] Assim, em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização coestimulador de células T compreende a sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 35) ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou a sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37) ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou a sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 39) ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou a sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00303] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende:  um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34, ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38 e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 40; e/ou  um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31, ou um fragmento ou variante do mesmo; em que as sequências compreendidas no domínio intracelular são expressas no mesmo quadro e como uma cadeia simples de polipeptídeo.

[00304] Assim, em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico que codifica o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende:  uma sequência de ácido nucleico do domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 da SEQ ID NO: 35 ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou uma sequência de ácido nucleico do domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB da SEQ ID NO: 37 ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou uma sequência de ácido nucleico do domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 da SEQ ID NO: 39 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou uma sequência de ácido nucleico do domínio da sinalização intracelular coestimulador de CD28 da SEQ ID NO: 41 ou um fragmento ou variante do mesma; e/ou  um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta da SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 33 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00305] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende pelo menos dois domínios diferentes (por exemplo, um domínio de sinalização primário ou um fragmento ou variante do mesmo e pelo menos um domínio intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou um fragmento ou variante do mesmo) que podem estar ligados entre si em uma ordem aleatória ou em uma ordem especificada.

[00306] Opcionalmente, um ligante curto de oligo ou polipeptídeo, por exemplo, com comprimento entre 2 e 10 aminoácidos (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) pode formar a ligação entre domínios de sinalização distintos. Em algumas modalidades, um dupleto de glicina-serina (GS) é usado como um ligante adequado. Em algumas modalidades, um único aminoácido, por exemplo, uma alanina (A), uma glicina (G), é usado como um ligante adequado. Outros exemplos de ligante são descritos nesse documento.

[00307] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um CAR da invenção compreende dois ou mais domínios de sinalização intracelular coestimuladores (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais). Em algumas modalidades, qualquer um ou todos os dois ou mais domínios de sinalização coestimuladores (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) são separados por uma molécula ligante, por exemplo, uma molécula ligante como descrita nesse documento.

[00308] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) e o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34).

[00309] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) e o domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB (por Exemplo, SEQ ID NO: 36).

[00310] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) e o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38).

[00311] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular de um receptor quimérico da invenção compreende o domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) e o domínio de sinalização intracelular coestimulador de CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40).

[00312] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende qualquer combinação de um domínio de ligação extracelular como descrito nesse documento, um domínio transmembrana como descrito nesse documento, um domínio de sinalização intracelular como descrito nesse documento, e opcionalmente um espaçador ou domínio de dobradiça como descrito nesse documento.

[00313] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende ainda uma sequência líder localizada no N- terminal a partir do domínio de ligação extracelular específico. Um exemplo não limitante é uma sequência líder de CD8 que pode compreender ou consistir na sequência da SEQ ID NO: 42.

[00314] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende ainda um marcador, tal como, por exemplo, um marcador para controle de qualidade, enriquecimento, rastreamento in vivo e similares. O referido marcador pode estar localizado no N-terminal, no C-terminal e/ou internamente. Exemplos de marcadores que podem ser usados em um CAR da invenção são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, mas sem limitação, um marcador usado na invenção pode ser um marcador selecionado do grupo consistindo em marcador de estreptavidina (por exemplo, SEQ ID NO: 47), marcador de hemaglutinina, marcador de poli arginina, marcador de poli histidina, marcador Myc, marcador strep, marcador S-tag, marcador HAT, marcador 3x flag, marcador de peptídeo de ligação de calimodulina, marcador SBP, marcador de domínio de ligação de quitina, marcador GST, marcador de proteína de ligação de maltose, marcador de proteína fluorescente, marcador T7, marcador V5 e marcador Xpress. Outros exemplos de marcadores incluem, sem limitação, NWSHPQFEK (SEQ ID NO: 43) ou SAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 44).

[00315] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende ainda as sequências de P2A (SEQ ID NO: 45) e/ou de GFP (SEQ ID NO: 46).

[00316] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo, e

 pelo menos um domínio de sinalização primário intracelular ou um fragmento ou variante do mesmo.

 Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00317] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4 (por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos um domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29,

30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo. Em modalidades em particular, pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00318] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo, e  pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio intracelular transmembrana de TNFR2 ou um domínio intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00319] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo de domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ

ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador selecionado do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular de 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00320] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4

(por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;

 pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em domínio transmembrana de TNFR2

(por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ

ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26)

ou um fragmento ou variante do mesmo; e

 pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador selecionado do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34)

ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular

CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo,

em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

Em modalidades em particular, o pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00321] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo,  pelo menos um domínio de sinalização coestimulador intracelular ou um fragmento ou variante do mesmo, e  pelo menos um domínio intracelular de sinalização primária de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00322] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador selecionado do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00323] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;

 pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ

ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4

 pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22)

ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana

CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;

CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e

 pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que o pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo. Em modalidades em particular, o pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00324] De acordo com algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo,  pelo menos dois domínios de sinalização coestimuladores intracelulares ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e  opcionalmente, pelo menos um domínio de sinalização primário de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou domínios de sinalização intracelulares coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00325] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos dois domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e

 opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre os domínios transmembrana de TNFR2 e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00326] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4 (por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;

 pelo menos dois domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em modalidades em particular, o pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00327] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,

 pelo menos um domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo,  pelo menos três domínios de sinalização intracelular coestimuladores ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e  opcionalmente, pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelulares coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00328] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio transmembrana selecionado do grupo consistindo em TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos três domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00329] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4 (por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;

CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;

 pelo menos três domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34)

ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular de 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular

 opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO:

28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo;

em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em modalidades em particular, o pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00330] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo,  pelo menos quatro domínios de sinalização intracelular coestimuladores ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e  opcionalmente, pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00331] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;

CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;

 pelo menos quatro domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34)

28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo;

em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[00332] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:

 pelo menos um domínio de ligação extracelular;

ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4

(SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo,

e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou fragmentos ou variante do mesmo;

ou um fragmento ou variante do mesmo;

CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio intracelular de sinalização coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em modalidades em particular, o pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00333] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um dos domínios transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00334] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana selecionados do grupo consistindo em domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um dos domínios transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00335] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende: pelo menos um domínio de ligação extracelular; pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4 (por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;

pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana selecionados do grupo consistindo em TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo; e opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um dos domínios transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00336] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana ou fragmentos ou variantes dos mesmos,  pelo menos 1, 2, 3 ou 4 domínios de sinalização coestimuladores intracelulares ou fragmentos ou variantes dos mesmos, e

 opcionalmente, pelo menos um domínio de sinalização primário de célula T ou um fragmento ou variante do mesmo, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00337] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana selecionados do grupo consistindo em domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos 1, 2, 3 ou 4 domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00338] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:  pelo menos um domínio de ligação extracelular;  pelo menos um domínio de dobradiça selecionado do grupo consistindo em CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14) ou um fragmento ou variante do mesmo, CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 20) ou um fragmento ou variante do mesmo, IgG4 (por exemplo, SEQ ID NO: 16) ou um fragmento ou variante do mesmo, e IgD (por exemplo, SEQ ID NO: 18) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos 1, 2 ou 3 domínios transmembrana selecionados do grupo consistindo em domínio transmembrana de TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 22) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio transmembrana CD8 (por exemplo, SEQ

ID NO: 24) ou um fragmento ou variante do mesmo, ou domínio transmembrana CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 26) ou um fragmento ou variante do mesmo;  pelo menos 1, 2, 3 ou 4 domínios de sinalização intracelular coestimuladores selecionados do grupo consistindo em domínio intracelular TNFR2 (por exemplo, SEQ ID NO: 34) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular 4-1BB (por exemplo, SEQ ID NO: 36) ou um fragmento ou variante do mesmo, domínio intracelular CD27 (por exemplo, SEQ ID NO: 38) ou um fragmento ou variante do mesmo, e domínio intracelular CD28 (por exemplo, SEQ ID NO: 40) ou um fragmento ou variante do mesmo; e  opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização primário CD3 zeta (por exemplo, SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31) ou um fragmento ou variante do mesmo; em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e/ou os domínios de sinalização intracelular coestimuladores é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante dos mesmos. Em modalidades em particular, pelo menos um domínio de dobradiça é um domínio de dobradiça CD8 (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00339] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende:

 pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana,  pelo menos um domínio intracelular, em que o pelo menos um domínio intracelular compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário e opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador, e em que pelo menos um domínio transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, e/ou o pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, e em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e do domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00340] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humana, um domínio transmembrana de TNFR2 humano, um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia de CD3ζ humano, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48.

[00341] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48.

[00342] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48.

[00343] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48.

[00344] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48 ou uma sequência ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 48.

[00345] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humano, um domínio transmembrana de TNFR2 humano, um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia CD3ζ humana, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110.

[00346] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110.

[00347] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110.

[00348] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110.

[00349] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou 110 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 49, 50, 51 ou

110.

[00350] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humano, um domínio transmembrana de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia de CD3ζ humana, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52.

[00351] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52.

[00352] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52.

[00353] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52.

[00354] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 52.

[00355] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humana, um domínio transmembrana de CD8 humana, um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia de CD3ζ humana e um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[00356] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[00357] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[00358] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[00359] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 53.

[00360] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humana, um domínio transmembrana de CD8 humano, um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia CD3ζ humana, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00361] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00362] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00363] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00364] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 54 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 54.

[00365] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende uma sequência compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humana, uma combinação de domínio transmembrana de CD8 humano e domínio transmembrana de TNFR2 humano, um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário da cadeia de CD3ζ humana, em que a referida sequência corresponde à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, 56 ou 57 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 55, 56 ou 57.

[00366] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-HLA-A2 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106 ou 107), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, 56 ou 57 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 55, 56 ou 57.

[00367] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-IL-23R (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 65, 66 ou 67), ligado à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, 56 ou 57 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 55, 56 ou 57.

[00368] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CDl9 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 1 ou 2) ligada a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, 56 ou 57 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 55, 56 ou 57.

[00369] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um scFv anti-CD20 (por exemplo, compreendendo ou consistindo na sequência de domínio de ligação da SEQ ID NO: 4, 5 ou 6) ligado a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 55, 56 ou 57 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a SEQ ID NO: 55, 56 ou 57.

[00370] Em algumas modalidades, um CAR da invenção (por exemplo, qualquer CAR descrito nesse documento compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo) tem pelo menos uma das seguintes propriedades:

a. exibe menos expressão na superfície celular do que um CAR com a mesma sequência exceto que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana CD8 e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador 4-lBB;

b. exibe níveis comparáveis de ativação específica ao

CAR como um CAR com a mesma sequência exceto que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana

CD8 e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador 4-1BB;

c. não reduz os níveis na superfície celular de um marcador de células T regulatório tal como qualquer um ou mais (por exemplo, todos) de entre

FoxP3, Helios e CD62L após pelo menos 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, ou mais dias de cultura; e d. não aumenta os níveis na superfície celular de um marcador de células T não-regulatório tal como CD127 após pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais dias de cultura.

Células Imunes

[00371] A presente invenção se refere ainda a uma célula imune que expressa um CAR como descrito nesse documento, e a uma população das referidas células imunes.

[00372] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um CAR da presente invenção é introduzido em uma célula imune, gerando assim uma célula manipulada que expressa o CAR na superfície celular.

[00373] Como usado nesse documento, o termo “células imunes” geralmente inclui glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células tronco hematopoiéticas (HSC) produzidas na medula óssea. Exemplos de células imunes incluem, mas não estão limitadas a, linfócitos (células T, células B e células exterminadoras naturais (NK)) e células derivadas de mieloides (neutrófilo, eosinófilo, basófilo, monócito, macrófago, células dendríticas).

[00374] Em algumas modalidades, uma célula imune da invenção é geneticamente modificada para expressar um receptor quimérico compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00375] Em algumas modalidades, uma célula imune da invenção é uma célula imune de mamífero, por exemplo, uma célula imune humana, uma célula imune de um animal de fazenda (por exemplo, uma vaca, porco ou cavalo), ou uma célula imune de um animal de estimação (por exemplo, um gato ou um cachorro).

[00376] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada do grupo consistindo em linfócitos, células derivadas de mieloides, e qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, a célula imune é um linfócito, por exemplo, selecionado do grupo consistindo em células T, células B, células exterminadoras naturais (NK), e qualquer combinação das mesmas. Em modalidades em particular, a célula imune é uma célula T, que em determinadas modalidades é selecionada do grupo consistindo em células T CD4+, células T CD8+, células T γδ, células T duplamente negativas (DN), e qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, a célula imune é uma célula T CD4+, tal como, por exemplo, uma célula T helper, uma célula T regulatória, uma célula T efetora, e qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T CD8+, tal como, por exemplo, uma célula T CD8+ citotóxica ou uma célula T regulatória CD8+. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T γδ. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T manipulada para expressar uma células Gama delta TCR (TEGγδ) definidas. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T DN. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula B. Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula NK.

[00377] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula derivada de mieloides, por exemplo, selecionada do grupo consistindo em neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas, ou qualquer combinação dos mesmos. Em determinadas modalidades, a célula imune é um macrófago. Em determinadas modalidades, a célula imune é uma célula dendrítica.

[00378] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula imune regulatória, tal como, por exemplo, qualquer célula imune regulatória adequada para uso em terapia celular. Em determinadas modalidades, a célula imune regulatória é selecionada do grupo consistindo em uma célula T regulatória, uma célula T regulatória CD4+, uma célula T regulatória CD8+, uma célula T γδ regulatória, uma célula T DN regulatória, uma célula B regulatória, uma célula NK regulatória, um macrófago regulatório, uma célula dendrítica regulatória, e qualquer combinação das mesmas.

[00379] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula T regulatória (Treg), em particular,

uma Treg derivada do timo ou uma Treg adaptativa ou induzida.

Em determinadas modalidades, a célula imune é uma célula T regulatória CD4+ (Treg). Em determinadas modalidades, a Treg é uma Treg derivada do timo ou uma Treg adaptativa ou induzida. Em determinadas modalidades, a Treg é uma célula T regulatória CD4+FoxP3+ ou uma célula T regulatória CD4+FoxP3- (célula Tr1). Em modalidades em particular, a célula imune é uma célula T regulatória CD4+FoxP3+.

[00380] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T regulatória CD8+. Exemplos de células T regulatórias CD8+ incluem, mas não estão limitadas a, uma célula T regulatória CD8+CD28+, uma célula T regulatória CD8+CDl03+, uma célula T regulatória CD8+FoxP3+, uma célula T regulatória CD8+CD122+, e qualquer combinação das mesmas.

[00381] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula T γδ regulatória.

[00382] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula T DN regulatória.

[00383] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula B regulatória. Um exemplo de uma célula B regulatória inclui, mas não está limitada a, uma célula B CD19+CD24hiCD38hi.

[00384] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula NK regulatória.

[00385] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é um macrófago regulatório.

[00386] Em algumas modalidades, a célula imune regulatória é uma célula dendrítica regulatória.

[00387] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula imune efetora, tal como, por exemplo, qualquer célula imune efetora adequada para uso em terapia celular. Em determinadas modalidades, a célula imune efetora é selecionada a partir do grupo consistindo em uma célula T efetora, uma célula T efetora CD4+, uma célula T efetora CD8+, uma célula T γδ efetora, uma célula T DN efetora, uma célula B efetora, uma célula NK efetora, um macrófago efetor, uma célula dendrítica efetora, e qualquer combinação das mesmas.

[00388] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T efetora. Em determinadas modalidades, a célula imune efetora é uma célula T efetora CD4+. Exemplos de células T efetoras CD4+ incluem, mas não estão limitadas a, células Th1, células Th2, células Th9, células Thl7, células Th22, células helper foliculares CD4+T (Tfh), e qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a célula imune efetora é uma célula T efetora CD8+. Exemplos de células T efetoras CD8+ incluem, mas não estão limitadas a, uma célula T efetora CD8+CD45RO+CCR7-CD62L-, uma célula T efetora CD8+CD45RA+CCR7- CD62L-, e qualquer combinação das mesmas.

[00389] Em uma modalidade, a célula imune é uma célula T γδ efetora.

[00390] Em uma modalidade, a célula imune é uma célula T DN efetora.

[00391] Em uma modalidade, a célula imune é uma célula B efetora. Exemplos de células B efetoras incluem, mas não estão limitadas a, uma célula B CD19+CD25hi, células B ativadas e células plasmáticas, e qualquer combinação das mesmas.

[00392] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula NK efetora.

[00393] Em algumas modalidades, a célula imune é um macrófago efetor.

[00394] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula dendrítica efetora.

[00395] Em algumas modalidades, a célula imune é selecionada do grupo consistindo em células T, células exterminadoras naturais (NK), células T γδ, células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias, células imunes efetoras, células T efetoras, células B e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas.

[00396] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um CAR da presente invenção é introduzido em uma célula tronco pluripotente (PSC), que pode então ser diferenciada para uma célula T. As PSCs são células capazes de dar origem a qualquer tipo de célula no corpo e incluem, por exemplo, células tronco embrionárias (ou embryonic stem cells - ESCs), PSCs derivadas por transferência nuclear celular somática, e PSCs induzidas (iPSCs). Como usado nesse documento, o termo “células tronco embrionárias” se refere a células tronco pluripotentes obtidas a partir de embriões precoces; em algumas modalidades, esse termo se refere a ESCs obtidas a partir de uma linhagem de células tronco embrionárias previamente estabelecida e exclui as células tronco obtidas por destruição recente de um embrião humano.

[00397] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um CAR da presente invenção é introduzido em uma célula multipotente tal como uma célula tronco hematopoiética (HSCs tais como aquelas isoladas de medula óssea ou sangue do cordão), células progenitoras hematopoiéticas (por exemplo, células progenitoras linfoides), ou células tronco mesenquimais (MSC). As células multipotentes são capazes de se desenvolver em mais de um tipo celular, mas são mais limitadas em potencial de tipo celular do que as células pluripotentes. As células multipotentes podem ser derivadas de linhagens celulares estabelecidas ou isoladas de medula óssea humana ou cordões umbilicais. A título de exemplo, as HSCs podem ser isoladas a partir de um paciente ou um dador saudável após a mobilização induzida por G-CSF, a mobilização induzida por plerixafor, ou uma combinação das mesmas. Para isolar HSCs do sangue ou da medula óssea, as células no sangue ou na medula óssea podem ser varridas por anticorpos que ligam células indesejadas, tais como anticorpos a CD4 e CD8 (células T), CD45 (células B), GR-l (granulócitos) e Iad (células apresentando antígeno diferenciado). As HSCs podem então ser selecionadas positivamente por anticorpos para CD34.

[00398] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um CAR da presente invenção é introduzido em uma célula linfoide não-Treg que é diferenciada em uma célula Treg após a edição do genoma. As células não-Treg editadas podem ser diferenciadas em células Treg antes do enxerto em um paciente como descrito acima. Alternativamente, as células não-Treg editadas podem ser induzidas para diferenciar em células Treg após o enxerto em um paciente.

[00399] Em algumas modalidades, o nível de expressão de moléculas é determinado por citometria de fluxo, imunofluorescência ou análise de imagem, por exemplo, análise de alto conteúdo. Em determinadas modalidades, o nível de expressão de moléculas é determinado por citometria de fluxo. Em modalidades em particular, antes de realizar a análise de citometria de fluxo, as células são fixadas e permeabilizadas, permitindo assim a detecção de proteínas intracelulares.

[00400] Em algumas modalidades, a determinação do nível de expressão de uma molécula em uma população de células compreende a determinação da percentagem de células da população de células expressando a molécula (isto é, células “+” para a molécula). Em determinadas modalidades, a referida porcentagem de células expressando a molécula é medida por FACS.

[00401] Os termos “expressando”, “positivo”, ou “+” e “não expressando”, “negativo” ou –” são bem conhecidos na técnica e se referem ao nível de expressão do marcador celular de interesse, pelo fato de que o nível de expressão do marcador celular que corresponde a “+” é elevado ou intermédio (também referido como “+/-”), e o nível de expressão do marcador celular correspondendo a “-” é nulo.

[00402] O termo “baixo nível” (“low”) ou “baixo” (“lo”) ou “baixo/-” (“lo/-”) é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador celular de interesse, em que o nível de expressão do marcador celular é baixo em comparação com o nível de expressão desse marcador celular na população de células que estão sendo analisadas como um todo. Mais particularmente, o termo "lo" se refere a uma população distinta de células expressando o marcador celular a um nível mais baixo do que uma ou mais outras populações distintas de células.

[00403] O termo “alto nível” (“high”) ou “alto” (“hi”) ou “alta intensidade” (“bright”) é bem conhecido na técnica e se refere ao nível de expressão do marcador celular de interesse, em que o nível de expressão do marcador celular é elevado em comparação com o nível de expressão desse marcador celular na população de células que estão sendo analisadas como um todo.

[00404] Geralmente, as células nas porcentagens 2, 3, 4 ou 5% mais elevadas de intensidade de coloração são designadas como “hi”, e aquelas na metade superior da população categorizada como sendo “+”. As células que estão abaixo de 50%, de intensidade de fluorescência, são designadas como células “lo” e abaixo de 5% como células “- ”.

[00405] O nível de expressão do marcador celular de interesse é determinado pela comparação da Intensidade de Fluorescência Mediana ou Intensidade de Fluorescência Média (MFI) das células da população celular corada com anticorpo marcado com fluorescência específico para este marcador, com a intensidade de fluorescência (FI) de células da mesma população celular coradas com anticorpo marcado com fluorescência com especificidade irrelevante mas com o mesmo isótipo, a mesma sonda fluorescente e originada da mesma espécie (referida como controle de isótipo). As células da população corada com anticorpos marcados com fluorescência específicos para este marcador e mostrando MFI equivalente ou MFI mais baixo do que as células coradas com o controle do isótipo, são consideradas como não expressando este marcador e são designadas (-) ou negativas. As células da população corada com anticorpos marcados com fluorescência específicos para este marcador e mostrando um valor MFI superior ao das células coradas com o controle do isótipo são consideradas como expressando este marcador e são designadas (+) ou positivas.

[00406] A invenção também se refere a uma população isolada e/ou substancialmente purificada de células imunes conforme definida nesse documento.

[00407] Assim, a invenção fornece uma população isolada e/ou substancialmente purificada de células imunes, em que as células da população compreendem um CAR como descrito nesse documento, por exemplo, um CAR compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00408] Como usado nesse documento, uma “população isolada” se refere a uma população celular que é removida de seu ambiente natural (tal como o sangue periférico) e que é isolada, purificada ou separada, e é pelo menos cerca de 75%

livre, 80% livre, 85% livre, e em determinadas modalidades cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% livre, de outras células com as quais está naturalmente presente, mas que não têm os marcadores de superfície celular que formaram a base para o isolamento das células.

[00409] A presente invenção se refere ainda a uma população de células imunes enriquecida conforme definida nesse documento.

[00410] Em algumas modalidades, a população de células imunes isolada, purificada e/ou enriquecida da invenção foi congelada e descongelada.

[00411] Em algumas modalidades, as células T da população de células imunes da invenção expressam um receptor quimérico (CAR) como descrito nesse documento e podem assim ser definidas como monoespecíficas para CAR (isto é, todas as células Treg reconhecem o mesmo antígeno com o CAR que elas expressam). Em algumas modalidades, a população de células Treg é monoespecífica para TCR (isto é, todas as células Treg reconhecem o mesmo antígeno com seu TCR). Em algumas modalidades, a população de células Treg é poliespecífica para TCR (isto é, as células Treg podem reconhecer diferentes antígenos com seu TCR).

[00412] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR reconhece um antígeno,

um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos.

[00413] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00414] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado a esclerose múltipla, um antígeno associado a articulações, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição de enxerto ou GVHD. Exemplos dos referidos autoantígenos são dados nesse documento.

[00415] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um alergênio inalado, um alergênio ingerido ou um alergênio de contato.

[00416] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno selecionado do grupo consistindo em ovalbumina, MOG, colágeno tipo II, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00417] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para ovalbumina ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00418] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para MOG ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00419] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para colágeno tipo II ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00420] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para a vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, ou um fragmento, variante, ou mistura dos mesmos.

[00421] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para HLA- A2 ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo (por exemplo, como descrito nesse documento).

[00422] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para IL- 23R ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo (por exemplo, como descrito nesse documento).

[00423] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um marcador de superfície de células B, tal como, por exemplo, CD19 ou CD20 ou um fragmento, variante, ou mistura dos mesmos (por exemplo, como descrito nesse documento).

[00424] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno de câncer ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo, como descrito nesse documento.

[00425] Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR reconhece células infectadas. Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno bacteriano ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno viral ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno fúngico ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, a população de células T é monoespecífica para TCR, e o TCR é específico para um antígeno parasítico ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00426] Em algumas modalidades, as células imunes expressando um CAR da invenção são supressoras contra as células reconhecidas pelo CAR. Em determinadas modalidades,

as células imunes são células T. Em modalidades em particular, as células imunes são células Treg. Em algumas modalidades, as células Treg são obtidas através da diferenciação in vitro de células T naïve.

[00427] Em algumas modalidades, as células imunes da invenção não são citotóxicas. Em determinadas modalidades, as células imunes são células T. Em modalidades em particular, as células imunes são células Treg.

[00428] Em algumas modalidades, as células imunes regulatórias da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo consistindo em células CD4+CD25+FoxP3+ Treg, células Tr1, células Th3 secretando TGF-β, células T NK regulatórias, células T γδ regulatórias, células T CD8+ regulatórias, e células T regulatórias duplamente negativas.

[00429] Em algumas modalidades, as células imunes da invenção são citotóxicas. Em determinadas modalidades, as células imunes são citotóxicas para células expressando um antígeno de câncer ou um fragmento ou variante do mesmo, como descrito nesse documento. Em modalidades em particular, as células imunes da invenção são citotóxicas para células cancerosas. Em modalidades em particular, as células imunes da invenção são citotóxicas para células infectadas.

[00430] Em algumas modalidades, as células imunes da invenção são células imunes citotóxicas. As células imunes citotóxicas compreendem, por exemplo, células T citotóxicas,

células T CD8+, células exterminadoras naturais (NK), células B citotóxicas, macrófagos e monócitos. Mediante a ativação, cada uma destas células imunes citotóxicas aciona a destruição de células alvo. Por exemplo, as células imunes citotóxicas acionam a destruição das células cancerosas alvo por um ou ambos os meios seguintes. Primeiro, mediante a ativação, as células imunes liberam citotoxinas tais como perforina, granzimas e granulisina. A perforina e a granulisina criam poros na célula alvo, e as granzimas entram na célula e acionam uma cascata de caspase no citoplasma que induz a apoptose (morte celular programada) da célula.

Segundo, a apoptose pode ser induzida através da interação de ligante FAS-FAS entre as células imunes e as células tumorais alvo.

[00431] Em algumas modalidades, as células imunes citotóxicas são células autólogas.

[00432] Em algumas modalidades, as células imunes citotóxicas são células heterólogas.

[00433] Em algumas modalidades, as células imunes citotóxicas são células alogênicas.

[00434] Em algumas modalidades, as células imunes da invenção são citotóxicas para células proB, células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células plasmáticas, linfoblastos, células B da zona marginal,

células B do centro germinativo B, células do plasmablastos e/ou células B regulatórias (células Breg).

[00435] Em algumas modalidades, a célula imune da invenção não é citotóxica para células Breg.

[00436] Em algumas modalidades, a população de células Treg monoespecífica da invenção é citotóxica para células B expressando e apresentando uma imunoglobulina em sua superfície. Exemplos de células B expressando e apresentando uma imunoglobulina em sua superfície incluem, mas não estão limitadas a, células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células B da zona marginal, células B de centro germinativo e células B regulatórias (células Breg).

[00437] Em algumas modalidades, a população de células Treg monoespecífica da invenção é citotóxica para células B maduras, por exemplo, para células B ativadas maduras. Em determinadas modalidades, a população de células Treg monoespecífica da invenção é citotóxica para células B maduras (por exemplo, células B ativadas maduras) expressando em sua superfície um marcador de superfície de células B reconhecido pelo receptor quimérico expresso pelas células da população de células Treg monoespecífica.

[00438] Em algumas modalidades, a população de células Treg monoespecífica da invenção é citotóxica para pelo menos um tipo de célula selecionado de células proB, células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células plasmáticas, linfoblastos, células B de zona marginal, células B de centro germinativo, plasmablastos e células B regulatórias (células Breg). Em modalidades em particular, a população de células Treg monoespecífica é citotóxica para pelo menos um tipo de célula selecionado de células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células B de zona marginal, células B de centro germinativo e células B regulatórias (células Breg).

[00439] Em algumas modalidades, a população de células Treg monoespecífica da invenção é citotóxica para pelo menos um tipo de célula selecionado de células proB, células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células plasmáticas, linfoblastos, células B de zona marginal, células B do centro germinativo e plasmablastos. Em modalidades em particular, a população de células Treg monoespecífica é citotóxica para pelo menos um tipo de célula selecionado de células préB, células B imaturas (ou transicionais), células B naïve maduras, células B ativadas, células B de memória, células B de zona marginal, e células B de centro germinativo.

[00440] Em algumas modalidades, uma população de células imunes da invenção expressa em sua superfície celular um CAR da invenção (nesse documento referido como “primeiro receptor”), e um outro receptor (nesse documento referido como “segundo receptor”) que se liga a outro ligante distinto. Em determinadas modalidades, o segundo receptor compreende um domínio de ligação de ligante extracelular, opcionalmente um domínio de dobradiça, pelo menos um domínio transmembrana, e pelo menos um domínio de sinalização intracelular, por exemplo, como descrito nesse documento.

[00441] Em algumas modalidades, o segundo receptor é endógeno (tal como, por exemplo, o TCR endógeno). Em algumas modalidades, o segundo receptor é exógeno, e sua expressão é induzida na população de células imunes da invenção por transformação ou transdução de um ácido nucleico que codifica o mesmo. O referido receptor exógeno pode ser um TCR ou um CAR exógeno. Portanto, em algumas modalidades, a população de células imunes da invenção expressa dois CARs, em que cada um dos primeiro e segundo CARs reconhece um ligante distinto. Em algumas modalidades, a população de células imunes da invenção expressa dois CARs, em que o primeiro reconhece um primeiro epítopo em um antígeno, e o segundo reconhece um segundo epítopo distinto no mesmo antígeno. Em algumas modalidades, a população de células imunes da invenção expressa dois CARs, em que a primeira reconhece um antígeno, e a segunda reconhece um segundo antígeno distinto (tal como, por exemplo, uma variante de antígeno).

[00442] Em algumas modalidades, pelo menos um de entre o CAR da invenção e o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é induzível, isto é, sua expressão sobre a superfície celular pode ser induzida.

[00443] Em algumas modalidades, a expressão de pelo menos um de entre o CAR da invenção e do segundo receptor (por exemplo, o segundo CAR) é induzida pela ativação do outro receptor. Em determinadas modalidades, a expressão do CAR da invenção é induzida pela ativação do segundo receptor.

Em determinadas modalidades, a expressão do segundo receptor é induzida pela ativação do CAR da invenção. Os CARs induzíveis foram descritos na técnica, tal como, por exemplo, por Roybal et al., (Cell 167(2):419-432(2016)).

[00444] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno, um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos.

[00445] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno alimentar da dieta humana comum.

[00446] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um autoantígeno (por exemplo, um autoantígeno descrito nesse documento), tal como, por exemplo, um antígeno associado a esclerose múltipla, um antígeno associado a articulações, um antígeno associado ao olho, um antígeno de HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição de enxerto ou GVHD. Em determinadas modalidades, o antígeno é um antígeno associado à pele. Em determinadas modalidades, o antígeno é um antígeno envolvido em rejeição de enxerto ou GVHD.

[00447] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um alergênio inalado, um alergênio ingerido ou um alergênio de contato.

[00448] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno selecionado do grupo consistindo em ovalbumina, MOG, fragmentos de colágeno tipo II, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00449] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para a ovalbumina ou fragmento, variante ou mistura da mesma.

[00450] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para MOG ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00451] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para colágeno tipo II ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00452] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado ou um fragmento, variante ou mistura dos mesmos.

[00453] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para HLA-A2 ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00454] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para IL-23R ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00455] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um marcador de superfície de células B, tal como, por exemplo, CD19 ou CD20, ou um fragmento, variante ou mistura dos mesmos.

[00456] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno de câncer ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo, como descrito nesse documento.

[00457] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) reconhece células infectadas. Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno bacteriano ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno viral ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um antígeno fúngico ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00458] Em algumas modalidades, o domínio de ligação extracelular do segundo receptor é uma proteína ou um fragmento ou uma variante da mesma, tal como, por exemplo, um autoantígeno ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00459] Em algumas modalidades, o segundo receptor (por exemplo, um segundo CAR) é específico para um autoanticorpo, tal como, por exemplo, um autoanticorpo expresso em uma célula B ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00460] Em algumas modalidades, um CAR da invenção compreende um primeiro domínio de sinalização intracelular, e o segundo receptor compreende um segundo domínio de sinalização intracelular distinto. Em determinadas modalidades, um CAR da invenção compreende um domínio de sinalização primário de célula T (tal como, por exemplo, CD3 zeta), e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização coestimulador (tal como, por exemplo, o domínio coestimulador de TNFR2 ou CD8 ou uma combinação de domínios de sinalização coestimuladores TNFR2 e CD8). Em determinadas modalidades, um CAR da invenção compreende um domínio de sinalização intracelular coestimulador (tal como, por exemplo, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2, 4-1BB, CD27 ou CD28 ou uma combinação de domínios de sinalização intracelular coestimuladores de TNFR2 e 4- 1BB), e o segundo receptor compreende um domínio de sinalização intracelular primário de célula T (tal como, por exemplo, CD3 zeta). De acordo com estas modalidades, a ativação completa da população de células imunes da invenção requer tanto a ligação do CAR da invenção ao ligante ao qual é direcionado, quanto a ligação do segundo receptor ao ligante ao qual é direcionado.

[00461] Em algumas modalidades, o ligante reconhecido pelo segundo receptor é expresso ou presente no tecido ou órgão doente, ou no local da resposta autoimune.

Consequentemente, a atividade supressora para células expressando o ligante da primeira CAR da invenção será induzida apenas no tecido ou órgão doente ou no local da resposta autoimune, quando o referido ligante estará presente e reconhecido pelo segundo receptor nas células da população de células imunes (por exemplo, Treg).

[00462] Em algumas modalidades, o segundo receptor quimérico compreende ainda um domínio de ligação de ligante extracelular que reconhece um ligante distinto do ligante reconhecido pelo primeiro receptor quimérico da invenção. Em algumas modalidades, o referido domínio de ligação de ligante é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo receptor quimérico compreende ainda um domínio de ligação de ligante extracelular que reconhece um epítopo distinto do mesmo antígeno reconhecido pelo primeiro receptor quimérico.

[00463] Em algumas modalidades, o receptor quimérico da invenção compreende um domínio de ligação de ligante extracelular compreendendo um primeiro domínio de ligação de ligante que se liga a um primeiro ligante e um segundo domínio de ligação de ligante que se liga a um segundo ligante distinto do referido primeiro ligante. Em algumas modalidades, o referido domínio de ligação de ligante é um anticorpo bifuncional que reconhece tanto o primeiro quanto o segundo ligante. Em algumas modalidades, o referido domínio de ligação de ligante é um anticorpo bifuncional que reconhece dois epítopos distintos do mesmo antígeno.

Preparação de Ácidos Nucleicos, Vectores e CAR

[00464] A presente invenção também se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento, em que a referida sequência de ácido nucleico compreende: pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio de ligação extracelular,

opcionalmente pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio de dobradiça extracelular, pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana,

pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio intracelular, em que a pelo menos uma sequência de ácido nucleico do domínio intracelular compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular primário e opcionalmente pelo menos uma sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador,

em que a sequência de ácido nucleico do domínio transmembrana é uma sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma sequência de ácido nucleico de qualquer domínio transmembrana ou fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, e/ou a sequência de ácido nucleico do domínio de sinalização intracelular coestimulador é uma sequência de ácido nucleico de um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma sequência de ácido nucleico de qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, em que a sequência de ácido nucleico do domínio transmembrana é uma sequência de ácido nucleico de um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou a sequência de ácido nucleico do domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00465] A invenção também fornece um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR como descrito nesse documento. Exemplos de vetores que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, um vetor de DNA, um vetor de RNA, um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus e um cosmídeo.

[00466] A tecnologia de vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al., (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus que são úteis como vetores incluem, mas não estão limitados a, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus.

[00467] Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, locais de endonuclease de restrição convenientes e um ou mais marcadores selecionáveis (ver, por exemplo, as Publicações de Patente PCT WO 01/96584 e WO01/29058 e a Patente dos EUA 6.326.193, incorporadas nesse documento por referência).

[00468] Vários sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para a transferência de genes em células de mamíferos. Por exemplo, os retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de distribuição de genes. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e embalado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e distribuído para células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Vários sistemas retrovirais são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são usados vetores adenovírus. Além disso, vários vetores adenovírus são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são usados vetores lentivírus.

[00469] Elementos transcricionalmente ativos adicionais, por exemplo, promotores e intensificadores, regulam a frequência de iniciação transcricional.

Tipicamente, o promotor do núcleo, estes estão localizados na região 30-110 bp a montante do local de início, embora tenha sido demonstrado que vários promotores contêm elementos funcionais a jusante do local de início também, e os elementos intensificadores são geralmente localizados 500-2000 bp a montante do local de início. O espaçamento entre os elementos promotores frequentemente é flexível, de modo que a função promotora seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos um em relação ao outro.

No promotor timidina quinase (tk), o espaçamento entre os elementos promotores pode ser aumentado para 50 bp, antes da atividade começar a declinar. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar tanto cooperativamente quanto independentemente para ativar a transcrição.

[00470] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência promotora do citomegalovírus precoce imediata (CMV). Esta sequência promotora é uma sequência promotora constitutiva forte capaz de acionar elevados níveis de expressão de qualquer sequência de polinucleotídeos operativamente ligada à mesma. Um outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento de Elongação - la (EF-la). Um outro exemplo de um promotor adequado é o promotor fosfoglicerato quinase (PGK). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas podem também ser usadas, incluindo, mas não limitadas ao promotor precoce de vírus de símio 40 (SV40), vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), promotor de repetição terminal longo (LTR) de vírus de imunodeficiência humano (HIV), promotor MoMuLV, um promotor de vírus de leucemia aviária, um promotor precoce imediato de vírus de Epstein-Barr, e um promotor de vírus de sarcoma de Rous, bem Como promotores de gene humano tais como, mas não limitados a, promotor de actina, promotor de miosina, o promotor de hemoglobina, e o promotor da creatina quinase. Além disso,

a invenção não deve ser limitada ao uso de promotores constitutivos. Os promotores induzíveis também são contemplados como parte da invenção. O uso de um promotor induzível fornece um comutador molecular capaz de ligar a expressão da sequência de polinucleotídeos à qual está operativamente ligado, quando a referida expressão é desejada, ou desligar a expressão quando a expressão não é desejada. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina. Além disso, os promotores bidirecionais que permitem a expressão eficiente e coordenada de dois ou mais genes também podem ser de interesse na presente invenção.

Exemplos de promotores bidirecionais incluem, mas não estão limitados a, os promotores descritos por Luigi Naldini na Publicação de Patente dos EUA 2006/200869, incorporada nesse documento por referência, descrevendo um promotor bidirecional compreendendo i) uma primeira sequência promotora mínima derivada de genomas de citomegalovírus (CMV) ou vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV) e ii) uma sequência promotora eficiente total derivada de um gene animal.

[00471] A fim de avaliar a expressão de um polipeptídeo de CAR ou porções do mesmo, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula T também pode conter quer um gene marcador selecionável tal como CD34, CD271 quer um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células expressivas a partir da população de células procuradas para serem transfectadas ou infectadas através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser carregado em uma peça separada de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Tanto os marcadores selecionáveis como os genes repórter podem ser flanqueados com sequências regulatórias apropriadas para permitir a expressão em células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibiótico, tais como a neomicina e similares.

[00472] Em algumas modalidades da invenção, a tecnologia de genes suicida pode ser usada. Diferentes tecnologias de genes suicidas são descritas na técnica dependendo de seu mecanismo de ação (ver, por exemplo, Jones et al., Frontiers in Pharmacology 5:254(2014)). Exemplos de terapia de pró- fármacos de enzima direcionada ao gene (ou gene-directed enzyme prodrug therapy - GDEPT) que convertem um fármaco não-tóxico a um fármaco tóxico incluem a timidina quinase do vírus do herpes simplex (HSV-TK) e a citosina desaminase (CD). Outros exemplos são proteínas quiméricas compostas de um domínio de ligação ao fármaco ligado a componentes apoptóticos, tais como, por exemplo, os sistemas induzíveis Fas (iFas) ou Caspase 9 (iCasp9). Outros exemplos incluem sistemas mediados por anticorpos terapêuticos tais como a indução da superexpressão de c-myc na superfície da célula manipulada para induzir sua eliminação através da administração de um anticorpo anti-c-myc. O uso de EGFR é descrito como um sistema similar comparado ao sistema c-myc.

[00473] Os genes repórter são usados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade de sequências regulatórias. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente em ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão é manifestada por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é testada em um tempo adequado após a introdução de DNA nas células receptoras. Os genes repórter adequados podem incluir genes que codificam a luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina secretada, ou o gene de proteína fluorescente verde (ver, por exemplo, Ui-Tei et al., FEBS Letters 479:79-82(2000)). Os sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados usando técnicas conhecidas ou obtidos comercialmente. Em geral, a construção com a região flanqueadora 5’ mínima mostrando o nível mais elevado de expressão do gene repórter é identificado como o promotor. As referidas regiões promotoras podem estar ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes para a capacidade de modular a transcrição acionada por promotor.

[00474] Os métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula de mamífero, bacteriana, de levedura ou de inseto, por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[00475] Os métodos físicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem a precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e semelhantes. Os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica.

Ver, por exemplo, Sambrook et al., (2001, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque). Em algumas modalidades da invenção, um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira usando a transfecção de fosfato de cálcio.

[00476] Os métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Os vetores virais, e especialmente vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em células de mamíferos, por exemplo, células humanas. Outros vetores virais podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simplex I, adenovírus e vírus adenoassociados, e semelhantes. Ver, por exemplo, as Patentes dos EUA 5.350.674 e 5.585.362.

[00477] Os meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídeos incluindo emulsões óleo-em-água, micelas, micelas mistas, e lipossomos. Um sistema coloidal exemplificativo para uso como um veículo de distribuição in vitro e in vivo é um lipossomo (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial). O “lipossomo” é um termo genérico abrangendo uma variedade de veículos lipídicos simples e multilamelares formados pela geração de bicamadas ou agregados de lipídeo fechados. Os lipossomos podem ser caracterizados como tendo estruturas vesiculares com uma membrana bicamada de fosfolipídeo e um meio aquoso interno. Os lipossomos multilamelares possuem múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Elas se formam espontaneamente quando os fosfolipídeos são suspensos em um excesso de solução aquosa.

Os componentes lipídicos sofrem um auto-rearranjo antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh et al., Glycobiology 5:505-10(1991)). No entanto, as composições que têm estruturas diferentes em solução em relação à estrutura vesicular normal também são abrangidas. Por exemplo, os lipídeos podem assumir uma estrutura micelar ou simplesmente existem como agregados não-uniformes de moléculas lipídicas.

Também são contemplados os complexos de lipofectamina-ácido nucleico.

[00478] O uso de formulações lipídicas é contemplado para a introdução de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira (in vitro, ex vivo ou in vivo). Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado com um lipídeo. O ácido nucleico associado com um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado dentro da bicamada lipídica de um lipossomo, fixado a um lipossomo através de uma molécula de ligação que está associada tanto ao lipossomo como ao oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela, ou de outra forma associado com um lipídeo. As composições associadas a lipídeo, lipídeo/DNA ou lipídeo/vetor de expressão não são limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo,

eles podem estar presentes em uma estrutura de duas camadas, como micelas, ou com uma estrutura “colapsada”. Elas também podem ser simplesmente intercaladas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou formato. Os lipídeos são substâncias graxas que podem ser de ocorrência natural ou lipídeos sintéticos. Por exemplo, os lipídeos incluem as gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e derivados dos mesmos, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois, e aldeídos.

[00479] Os lipídeos adequados para uso podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, o dimiristil fosfatidilcolina (“DMPC”) pode ser obtido da Sigma, St Louis, MO; dicetil fosfato (“DCP”) pode ser obtido na K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol (“Choi”) pode ser obtido na Calbiochem-Behring; e dimiristil fosfatidil glicerol (“DMPG”) e outros lipídeos podem ser obtidos na Avanti Polar Lipids, Inc (Birmingham, AL). As soluções de caldo de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20° C. O clorofórmio é usado como o único solvente uma vez que é mais rapidamente evaporado do que metanol.

[00480] Independente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, pode ser realizada uma variedade de ensaios. Os referidos ensaios incluem, por exemplo, ensaios “biológicos moleculares” bem conhecidos por aqueles versados na técnica, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; ensaios “bioquímicos”, tais como a detecção da presença ou ausência de um peptídeo em particular, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios descritos nesse documento para identificar agentes que se encontram dentro do escopo da invenção.

[00481] Em algumas modalidades, as células imunes da invenção são modificadas através da introdução de RNA. Em algumas modalidades, um CAR de RNA transcrito in vitro pode ser introduzido em uma célula como forma de transfecção transitória. O RNA é produzido por transcrição in vitro usando um modelo gerado por reação em cadeia de polimerase (PCR). O DNA de interesse de qualquer fonte pode ser convertido diretamente por PCR em um modelo para a síntese de mRNA in vitro usando primers apropriados e RNA polimerase.

A fonte do DNA pode ser, por exemplo, DNA genômico, DNA de plasmídeo, DNA de fagos, cDNA, sequência de DNA sintética ou qualquer outra fonte apropriada de DNA. Em determinadas modalidades, o modelo para a transcrição in vitro é o CAR da presente invenção.

[00482] Em algumas modalidades, o DNA a ser usado para PCR contém um quadro de leitura aberta. O DNA pode ser, por exemplo, de uma sequência de DNA de ocorrência natural do genoma de um organismo. Em algumas modalidades, o DNA é um gene de comprimento total de interesse ou uma porção de um gene. O gene pode incluir algumas ou todas as regiões não- traduzidas (UTRs) 5’ e/ou 3’. O gene pode incluir éxons e íntrons. Em algumas modalidades, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano. Em algumas modalidades, o DNA a ser usado para PCR é um gene humano incluindo UTRs 5’ e 3 ‘. O DNA pode alternativamente ser uma sequência de DNA artificial que não é normalmente expressa em um organismo de ocorrência natural. Uma sequência de DNA artificial exemplificativa é uma que contém porções de genes que são ligadas entre si para formar um quadro de leitura aberta que codifica uma proteína de fusão. As porções de DNA que são ligadas em conjunto podem ser de um único organismo ou de mais de um organismo.

[00483] A PCR pode ser usada para gerar um modelo para transcrição in vitro de mRNA que é usado para transfecção.

Os métodos para a realização de PCR são bem conhecidos na técnica. Os primers para uso em PCR são concebidos para ter regiões que são substancialmente complementares às regiões do DNA a serem usadas como um modelo para a PCR. O termo "substancialmente complementar", como usado nesse documento,

se refere a sequências de nucleotídeos onde a maioria ou todas as bases na sequência do primer são complementares, ou uma ou mais bases são não-complementares ou desfasadas. As sequências substancialmente complementares são capazes de fazer o recozimento ou hibridizar com o alvo de DNA pretendido sob condições de recozimento usadas para PCR. Os primers podem ser concebidos para serem substancialmente complementares a qualquer porção do modelo de DNA. Por exemplo, os primers podem ser concebidos para amplificar a porção de um gene que é normalmente transcrita em células (o quadro de leitura aberta), que pode incluir UTRs 5’ e 3’. Os primers também podem ser concebidos para amplificar uma porção de um gene que codifica um domínio de interesse em particular. Em algumas modalidades, os primers são concebidos para amplificar a região de codificação de um cDNA humano, incluindo todas ou partes das UTRs 5’ e 3’. Os primers úteis para PCR são gerados por métodos sintéticos que são bem conhecidos na técnica.

[00484] Os “primers senso” são primers que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares aos nucleotídeos no modelo de DNA que estão a montante da sequência de DNA a ser amplificada. O termo “a montante” é usado nesse documento para se referir a um local 5’ à sequência de DNA a ser amplificada em relação à fita de codificação. Os “primers antissenso” são primers que contêm uma região de nucleotídeos que são substancialmente complementares a um modelo de DNA de fita dupla que estão a jusante da sequência de DNA a ser amplificada. O termo “a jusante” é usado nesse documento para se referir a um local 3’ à sequência de DNA a ser amplificada em relação à fita de codificação.

[00485] Qualquer DNA polimerase útil para PCR pode ser usada nos métodos descritos nesse documento. Os reagentes e polimerase estão comercialmente disponíveis em várias fontes.

[00486] As estruturas químicas com a capacidade de promover estabilidade e/ou eficiência de tradução também podem ser usadas. Em algumas modalidades, o RNA pode ter UTRs 5’ e 3’. Em algumas modalidades, a UTR 5’ tem um comprimento entre zero e 3000 nucleotídeos. O comprimento das sequências de UTR 5’ e 3’ a serem adicionadas à região de codificação pode ser alterado por métodos diferentes, incluindo, mas não limitado a, conceber primers para PCR que recozem para diferentes regiões das UTRs. Usando esta abordagem, alguém versado na técnica pode modificar os comprimentos de UTR 5’ e 3’ necessários para obter a eficiência de tradução ideal após a transfecção do RNA transcrito. As UTRs 5’ e 3’ podem ser as UTRs endógenas 5’ e 3’ de ocorrência natural para o gene de interesse.

Alternativamente, as sequências UTR que não são endógenas ao gene de interesse podem ser adicionadas pela incorporação das sequências UTR nos primers senso e antissenso ou por quaisquer outras modificações do modelo. O uso de sequências UTR que não são endógenas ao gene de interesse pode ser útil para modificar a estabilidade e/ou a eficiência de tradução do RNA. Por exemplo, sabe-se que os elementos ricos em AU em sequências UTR 3’ podem diminuir a estabilidade do mRNA.

Portanto, as UTRs 3’ podem ser selecionadas ou concebidas para aumentar a estabilidade do RNA transcrito com base nas propriedades de UTRs que são bem conhecidas na técnica.

[00487] Em algumas modalidades, a UTR 5’ pode conter a sequência de Kozak do gene endógeno. Alternativamente, quando uma UTR 5’ que não é endógena ao gene de interesse está sendo adicionada por PCR como descrito acima, uma sequência de Kozak de consenso pode ser reconcebida pela adição da sequência de UTR 5’. As sequências de Kozak podem aumentar a eficiência da tradução de alguns transcritos de RNA, mas não parecem ser necessárias para todos os RNAs para permitir a tradução eficiente. A necessidade de sequências de Kozak para muitos mRNAs é conhecida na técnica. Em outras modalidades, a UTR 5’ pode ser derivada de um vírus RNA cujo genoma de RNA é estável em células. Em outras modalidades, vários análogos de nucleotídeos podem ser usados nas UTR 3’ ou 5’ para impedir a degradação da exonuclease do mRNA.

[00488] Para permitir a síntese de RNA a partir de um modelo de DNA sem a necessidade de clonagem de genes, um promotor de transcrição deve ser fixado ao modelo de DNA a montante da sequência a ser transcrita. Quando uma sequência que funciona como um promotor para uma RNA polimerase é adicionada à extremidade 5’ do primer senso, o promotor da RNA polimerase fica incorporado no produto de PCR a montante do quadro de leitura aberta a ser transcrita. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor T7 polimerase, como descrito em outro lugar nesse documento. Outros promotores úteis incluem, mas não estão limitados a, promotores de RNA polimerase T3 e SP6. As sequências de nucleotídeos de consenso para os promotores T7, T3 e SP6 são conhecidas na técnica.

[00489] Em algumas modalidades, o mRNA tem tanto uma capa na extremidade 5’ quanto uma cauda poli(A) 3’ que determinam a ligação de ribossomo, iniciação de tradução e estabilidade do mRNA na célula. Em um modelo de DNA circular, por exemplo, DNA de plasmídeo, a RNA polimerase produz um produto concatemérico longo que não é adequado para expressão em células eucarióticas. A transcrição de DNA de plasmídeo linearizado na extremidade da UTR 3’ resulta em mRNA de tamanho normal que não é eficaz na transfecção eucariótica mesmo se for poliadenilado após a transcrição.

[00490] Em um modelo de DNA linear, a RNA polimerase T7 de fago pode estender a extremidade 3’ do transcrito para além da última base do modelo (Schenborn e Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva e Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

[00491] O método convencional de integração de trechos poliA/T em um modelo de DNA é a clonagem molecular. No entanto, as sequências poliA/T integradas em DNA de plasmídeo podem causar instabilidade do plasmídeo, e é por isso que os modelos de DNA de plasmídeo obtidos a partir de células bacterianas são frequentemente altamente contaminados com eliminações e outras aberrações. Isto torna os procedimentos de clonagem não apenas laboriosos e demorados, mas frequentemente não-confiáveis. É por isso que um método que permite a construção de modelos de DNA com trecho de poliA/T 3’ sem clonagem é altamente desejável.

[00492] O segmento poliA/T do modelo de DNA transcricional pode ser produzido durante a PCR usando um primer antissenso contendo uma cauda poliT, tal como a cauda 100T (o tamanho pode ser de 50-5000 T), ou após a PCR por qualquer outro método, incluindo, mas não limitado a, ligação de DNA ou recombinação in vitro. As caudas poli(A) também fornecem estabilidade aos RNAs e reduzem sua degradação.

Geralmente, o comprimento de uma cauda poli(A) está positivamente correlacionada com a estabilidade do RNA transcrito. Em algumas modalidades, a cauda poli(A) está entre 100 e 5000 adenosinas.

[00493] As caudas poli(A) de RNAs podem ser adicionalmente estendidas após a transcrição in vitro com o uso de uma poli(A) polimerase, tal como a poliA polimerase de E. coli (E-PAP). Em algumas modalidades, o aumento do comprimento de uma cauda poli(A) de 100 nucleotídeos para entre 300 e 400 nucleotídeos resulta em um aumento de cerca de duas vezes na eficiência de tradução do RNA.

Adicionalmente, a fixação de diferentes grupos químicos à extremidade 3’ pode aumentar a estabilidade do mRNA. A referida fixação pode conter nucleotídeos modificados/artificiais, aptâmeros e outros compostos. Por exemplo, análogos de ATP podem ser incorporados na cauda poli(A) usando a poli(A) polimerase. Os análogos de ATP podem aumentar ainda mais a estabilidade do RNA.

[00494] As capas 5’ nos RNAs também podem fornecer estabilidade às moléculas de RNA. Em algumas modalidades, os RNAs produzidos pelos métodos descritos nesse documento incluem uma capa 5’. A capa 5’ é fornecida usando técnicas conhecidas na técnica e descritas nesse documento (Cougot et al., Trends in Biochem. Sci. 29:436-444 (2001); Stepinski et al., RNA 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys Res. Commun. 330:958-966 (2005)).

[00495] Os RNAs produzidos pelos métodos descritos nesse documento também podem conter uma sequência de local de entrada de ribossomo interno (ou internal ribosome entry site - IRES). A sequência IRES pode ser qualquer sequência viral, cromossômica ou artificialmente concebida que inicia a ligação de ribossomo dependente da capa ao mRNA e facilita a iniciação da tradução. Quaisquer solutos adequados para a eletroporação da célula, que podem conter fatores que facilitam a permeabilidade e a viabilidade celular, tais como açúcares, peptídeos, lipídeos, proteínas, antioxidantes e tensoativos, podem ser incluídos.

[00496] O RNA pode ser introduzido em células alvo usando qualquer um de vários métodos diferentes, por exemplo, métodos comercialmente disponíveis que incluem, mas não estão limitados a, eletroporação (por exemplo, Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Alemanha), ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.), Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colorado), ou Multiporator (Eppendort, Hamburg, Alemanha)), transfecção mediada por lipossomo catiônica usando lipofecção, encapsulação de polímeros, transfecção mediada por peptídeos, ou sistemas de administração de partículas biolísticos tais como “gene gun” (“arma de genes”), (ver, por exemplo, Nishikawa et al., Hum Gene Ther. 12(8):861-70(2001)).

[00497] Em algumas modalidades, as sequências de CAR descritas nesse documento são introduzidas em células imunes da invenção usando um vetor retroviral ou lentiviral. Os vetores retrovirais e lentivirais expressando CAR podem ser introduzidos em diferentes tipos de células eucarióticas bem como em tecidos e organismos inteiros usando células transduzidas como veículos ou a introdução local ou sistémica livre de células de vetores encapsulados, ligados ou nus. O método usado pode ser para qualquer finalidade onde a expressão estável é necessária ou suficiente.

[00498] Em algumas modalidades, as sequências de CAR são introduzidas em células imunes da invenção através do uso de mRNA transcrito in vitro. Os CARs de mRNA transcritos in vitro podem ser introduzidos em diferentes tipos de células eucarióticas bem como em tecidos e organismos inteiros usando células transfectadas como veículos ou a introdução local ou sistémica livre de células de mRNA encapsulado, ligado ou nu. O método usado pode ser para qualquer finalidade onde a expressão transiente é necessária ou suficiente.

[00499] Em algumas modalidades, o CAR desejado pode ser expresso nas células por meio de transpósons.

[00500] Em algumas modalidades, uma célula imune da invenção é, por exemplo, uma célula T. Antes da expansão e modificação genética de células T (tais como células Treg) como descrito nesse documento, as células são obtidas a partir de um indivíduo. As células T podem ser obtidas a partir de várias fontes, incluindo células mononucleares de sangue periférico, medula óssea, tecido de nódulo linfático, sangue do cordão, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores.

Em determinadas modalidades da presente invenção, qualquer número de linhagens de células T disponíveis na técnica pode ser usado. Em determinadas modalidades da presente invenção, células T podem ser obtidas a partir de uma unidade de sangue coletada a partir de um indivíduo usando qualquer número de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, tais como a separação Ficoll™, a centrifugação através de um gradiente PERCOLL® após a lise de glóbulos vermelhos e depleção de monócitos, elutriação centrífuga de contrafluxo, leucoferese, e isolamento citométrico de fluxo ou magnético subsequente baseado em marcadores de superfície celular. Em algumas modalidades, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por aférese. O produto de aférese contém, tipicamente, linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e plaquetas. Em algumas modalidades, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas por leucoferese.

[00501] Em algumas modalidades, as células coletadas por leucoferese podem ser lavadas para remover a fração plasmática e para colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modalidades da invenção, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e pode carecer de magnésio ou pode carecer de muitos, se não todos os cátions divalentes. Após a lavagem, as células podem ser ressuspensas em qualquer uma de uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como, por exemplo, PBS livre de Ca2+, PBS livre de Mg2+, PlasmaLyte A, ou outras soluções salinas com ou sem tampão. Alternativamente, os componentes indesejáveis da amostra de leucoferese podem ser removidos e as células ressuspensas diretamente em meio de cultura.

[00502] Uma subpopulação específica de células T pode ainda ser isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células T são isoladas por incubação com grânulos conjugados com anti- CD3/anti-CD28 (isto é, 3x28), tais como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas. Em algumas modalidades, o período de tempo é de cerca de 30 minutos. Em uma modalidade adicional, o período de tempo varia de 30 minutos a 36 horas ou mais e todos os valores de número inteiros entre os mesmos. Em uma outra modalidade, o período de tempo é pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Em algumas modalidades, o período de tempo é de 10 a 24 horas. Em determinadas modalidades, o período de tempo de incubação é de 24 horas.

Podem ser usados tempos de incubação mais longos para isolar células T em qualquer situação em que existem poucas células T em comparação com outros tipos de células. Assim, simplesmente pela diminuição ou aumento do tempo em que as células T são deixadas a se ligar aos grânulos anti-CD3/anti- CD28 e/ou pelo aumento ou diminuição da proporção de grânulos para células T (como descrito adicionalmente nesse documento) as subpopulações de células T podem ser preferencialmente selecionadas para ou contra na iniciação de cultura ou em outros pontos de tempo durante o processo.

Adicionalmente, pelo aumento ou diminuição da proporção de anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 nos grânulos ou outra superfície, as subpopulações de células T podem ser selecionadas preferencialmente para ou contra na iniciação de cultura ou em outros pontos de tempo desejados. A pessoa versada na técnica reconheceria que vários ciclos de seleção também podem ser usadas no contexto desta invenção.

[00503] Em algumas modalidades, pode ser desejável realizar o procedimento de seleção e usar as células “não- selecionadas” no processo de ativação e expansão. As células “não-selecionadas” também podem ser submetidas a ciclos adicionais de seleção. O enriquecimento de uma população de células T por seleção negativa pode ser obtido com uma combinação de anticorpos direcionados para marcadores de superfície únicos para as células negativamente selecionadas. Um método é a classificação e/ou seleção celular por meio de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um coquetel de anticorpos monoclonais direcionados para os marcadores de superfície celular presentes nas células selecionadas negativamente.

Por exemplo, para enriquecer para células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais inclui tipicamente anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em determinadas modalidades, as células regulatórias T são esgotadas por grânulos conjugados por anti-CD25 ou outro método similar de seleção.

[00504] Para o isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partículas tais como grânulos) pode ser variada. Em determinadas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual os grânulos e as células são misturadas (isto é, aumento da concentração de células), para assegurar o máximo contato de células e grânulos. Por exemplo, em algumas modalidades, é usada uma concentração de 2 mil milhões de células/mL. Em algumas modalidades, é usada uma concentração de mil milhões de células/mL. Em uma modalidade adicional, são usadas mais de 100 milhões de células/mL. Em uma outra modalidade, é usada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/mL. Em algumas modalidades, é usada uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/mL. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL. O uso de elevadas concentrações pode resultar em rendimento aumentado de células, ativação de células e expansão de células. Além disso, o uso de elevadas concentrações de células permite uma captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente os antígenos alvo de interesse, tais como células T CD28-negativas, ou a partir de amostras onde há muitas células tumorais presentes (isto é, sangue leucêmico, tecido tumoral, etc.). As referidas populações de células podem ter valor terapêutico e podem ser desejáveis para se obter.

[00505] As células T para estimulação também podem ser congeladas após uma etapa de lavagem. Não desejando estar preso à teoria, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente proporciona um produto mais uniforme pela remoção de granulócitos e em alguma extensão de monócitos na população de células. Após a etapa de lavagem que remove o plasma e as plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução de congelamento. Embora muitas soluções e parâmetros de congelamento sejam conhecidos na técnica e serão úteis neste contexto, um método envolve usar PBS contendo 20% de

DMSO e 8% de albumina de soro humano, ou meio de cultura contendo 10% de Dextran 40 e 5% de Dextrose, 20% de albumina de soro humano e 7,5% de DMSO, ou 31,25% de PlasmaLyte-A, 31,25% de Dextrose a 5%, 0,45% de NaCl, 10% de Dextran 40 e 5% de Dextrose, 20% de albumina de soro humano, e 7,5 % DMSO ou outros meios de congelamento de células adequados contendo, por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, as células são então congeladas até -80° C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Outros métodos de congelamento controlado podem ser usados, bem como o congelamento descontrolado imediatamente a -20° C ou em nitrogênio líquido.

[00506] Em determinadas modalidades, as células criopreservadas são descongeladas e lavadas como descrito nesse documento e deixadas a descansar por uma hora à temperatura ambiente antes da ativação.

[00507] Também contemplada no contexto da invenção é a coleta de amostras de sangue ou produto de leucoferese de um indivíduo em um período de tempo antes de quando as células expandidas como descritas nesse documento podem ser necessárias. Como tal, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada em qualquer ponto de tempo necessário, e as células desejadas, tais como células T, isoladas e congeladas para uso posterior em terapia de células T para qualquer número de doenças ou condições que se beneficiariam da terapia de células T, tais como aquelas descritas nesse documento. Em algumas modalidades, uma amostra de sangue ou um produto de leucoferese é tomada a partir de um indivíduo geralmente saudável. Em determinadas modalidades, uma amostra de sangue ou um produto de leucoferese é tomada a partir de um indivíduo geralmente saudável que está em risco de desenvolver uma doença, mas que ainda não desenvolveu uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em determinadas modalidades, as células T podem ser expandidas, congeladas e usadas em um momento posterior.

[00508] Quer antes ou depois da modificação genética das células Treg para expressar um CAR desejável, as células T podem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; e 6,867,041; e na Publicação de Patente dos EUA 2006/0121005, incorporadas nesse documento por referência.

[00509] Geralmente, as células T (por exemplo, células Treg) da invenção são expandidas por contato com uma superfície tendo fixada à mesma um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um ligante que estimula uma molécula coestimuladora na superfície das células. Em particular, as células T (por exemplo, células Treg) podem ser estimuladas como descrito nesse documento, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado sobre uma superfície, ou por contato com um ativador de proteína quinase C (por exemplo, briostatina) juntamente com um ionóforo de cálcio. Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, é usado um ligante que liga a molécula acessória. Por exemplo, uma população de células T pode ser contatada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação das células T. Para estimular a proliferação de células T CD4+, podem ser usados um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem, sem limitação, 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besançon, França). Podem ser usados outros métodos de expansão conhecidos comumente na técnica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977 (1998); Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328 (1999); Garland et al., J.

Immunol Meth. 227(l-2):53-63 (1999)).

[00510] Em determinadas modalidades, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para as células T (por exemplo, Tregs) da invenção podem ser fornecidos por protocolos diferentes. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução e/ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem estar acoplados à mesma superfície (isto é, na formação “cis”) ou em superfícies separadas (isto é, na formação “trans”). Alternativamente, um agente pode estar acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em algumas modalidades, o agente que fornece o sinal coestimulador é ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em determinadas modalidades, ambos os agentes podem estar em solução. Em algumas modalidades, os agentes podem estar em forma solúvel e, depois, reticulados a uma superfície, tal como uma célula que expressa receptores Fc ou um anticorpo ou outro agente de ligação que se ligará aos agentes. A este respeito, ver por exemplo, as Publicações de Patentes dos EUA 2004/0101519 e 2006/0034810, incorporadas nesse documento por referência, para células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) que são contempladas para o uso na ativação e expansão de células T na presente invenção.

[00511] Em algumas modalidades, os dois agentes são imobilizados em grânulos, quer no mesmo grânulo, isto é, “cis”, ou em grânulos separados, isto é, “trans”. A título de exemplo, o agente que fornece o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e o agente que fornece o sinal coestimulador é um anticorpo anti-CD28 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e ambos os agentes são co- imobilizados no mesmo grânulo em quantidades moleculares equivalentes. Em algumas modalidades, é usada uma proporção de 1:1 de cada anticorpo ligado aos grânulos para a expansão da células T CD4+ e crescimento de células T. Em determinados aspectos da presente invenção, é usada uma proporção de anticorpos anti-CD3:anti-CD28 ligados aos grânulos de modo que é observado um aumento na expansão de células T em comparação com a expansão observada usando uma proporção de 1:1. Em algumas modalidades, um aumento de cerca de 1 a cerca de 3 vezes é observado em comparação com a expansão observada usando uma proporção de 1:1. Em algumas modalidades, a proporção de anticorpo anti-CD3:anti-CD28 ligado aos grânulos varia de 100:1 a 1:100 e todos os valores de números inteiros entre os mesmos. Em algumas modalidades, mais anticorpo anti-CD28 é ligado às partículas do que o anticorpo anti-CD3, isto é, a proporção de CD3:CD28 é menor do que um.

Em determinadas modalidades da invenção, a proporção de anticorpo anti-CD28 para anticorpo anti-CD3 ligado aos grânulos é maior do que 2:1. Em uma modalidade em particular, é usada uma proporção de 1:100 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em algumas modalidades, é usada uma proporção de 1:75 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em uma outra modalidade, é usada uma proporção de 1:50 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em algumas modalidades, é usada uma proporção de 1:30 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em determinadas modalidades, é usada uma proporção de 1:10 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em algumas modalidades, é usada uma proporção de 1:3 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos. Em algumas modalidades, é usada uma proporção de 3:1 de anticorpos CD3:CD28 ligados aos grânulos.

[00512] Podem ser usadas as proporções de partículas para células de 1:500 a 500:1 e quaisquer valores de números inteiros entre os mesmos para estimular as células T ou outras células alvo. Como aqueles versados na técnica podem facilmente apreciar, a proporção de partículas para células pode depender do tamanho de partícula em relação à célula alvo. Por exemplo, os grânulos de tamanho pequeno podem ligar apenas umas poucas células, enquanto os grânulos maiores podem ligar muitas. Em determinadas modalidades, as células T podem ser estimuladas com uma proporção de células para partículas variando de 1:100 a 100:1 e quaisquer valores de números inteiros entre os mesmos. Em modalidades em particular, a proporção compreende 1:9 a 9:1 e quaisquer valores de números inteiros entre os mesmos. A proporção de partículas acopladas anti-CD3 e anti-CD28 para células T que resultam na estimulação de células T pode variar como observado acima; no entanto, determinadas modalidades de valores incluem 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9,

1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1,

6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, e 15:1 com uma proporção em particular sendo de pelo menos 1:1 de partículas por célula

T.

Em algumas modalidades, é usada uma proporção de partículas para células de 1:1 ou menor.

Em determinadas modalidades, a proporção de partícula:célula é de 1:5. Em outras modalidades, a proporção de partículas para células pode variar dependendo do dia de estimulação.

Por exemplo,

em algumas modalidades, a proporção de partículas para células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células a cada dia ou a cada dia alternado depois do primeiro, até 10 dias, em proporções finais de 1:1 a 1:10 (com base em contagens de células no dia de adição). Em uma modalidade em particular, a proporção de partículas para células é 1:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:5 nos terceiro e quinto dias de estimulação.

Em algumas modalidades, as partículas são adicionadas em uma base diária ou a cada dia alternado até uma proporção final de 1:1 no primeiro dia, e 1:5 nos terceiro e quinto dias de estimulação.

Em algumas modalidades, a proporção de partículas para células é de 2:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:10 nos terceiro e quinto dias de estimulação.

Em algumas modalidades, as partículas são adicionadas em uma base diária ou a cada dia alternado até uma proporção final de 1:1 no primeiro dia, e 1:10 nos terceiro e quinto dias de estimulação. Alguém versado na técnica apreciará que uma variedade de outras proporções pode ser adequada para uso na presente invenção. Em particular, as proporções irão variar dependendo do tamanho das partículas e do tamanho e do tipo da célula.

[00513] Em modalidades adicionais da presente invenção, as células imunes são combinadas com grânulos revestidos com agente, os grânulos e as células são subsequentemente separadas, e então as células são cultivadas. Em modalidades alternativas, antes da cultura, os grânulos revestidos com agente e as células não são separados mas são cultivadas juntas. Em algumas modalidades, os grânulos e células são primeiramente concentradas por aplicação de uma força, tal como uma força magnética, resultando em ligação aumentada de marcadores de superfície celular, induzindo assim a estimulação de células.

[00514] A título de exemplo, as proteínas de superfície celular podem ser ligadas ao permitir grânulos paramagnéticos aos quais estão fixados anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (3x28 grânulos) para contatar as células Treg da invenção. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, 104 a 109 células T) e grânulos (por exemplo, grânulos paramagnéticos DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T em uma proporção de 1:1) são combinadas em um tampão tal como PBS (por exemplo, sem cátions divalentes tais como cálcio e magnésio).

Novamente, aqueles versados na técnica podem facilmente apreciar que qualquer concentração de células pode ser usada dependendo da circunstância. Por exemplo, a célula alvo pode ser muito rara na amostra e compreender apenas 0,01% da amostra ou toda a amostra (isto é, 100%) pode compreender a célula alvo de interesse. Consequentemente, qualquer número de células está dentro do contexto da presente invenção. Em determinadas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual as partículas e as células são misturadas (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em uma modalidade, é usada uma concentração de cerca de 2 mil milhões de células/mL. Em outra modalidade, são usadas mais de 100 milhões de células/mL. Em uma outra modalidade, é usada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/mL. Em ainda outra modalidade, é usada uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/mL. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL. O uso de elevadas concentrações pode resultar em rendimento aumentado de células, ativação de células e/ou expansão de células.

Além disso, o uso de elevadas concentrações de células permite uma captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente os antígenos alvo de interesse, tais como células T CD28-negativas. As referidas populações de células podem ter valor terapêutico e podem ser desejáveis de obter em determinadas modalidades.

[00515] Em algumas modalidades da presente invenção, a mistura pode ser cultivada por várias horas (por exemplo, cerca de 3 horas) até cerca de 14 dias ou qualquer valor horário de número inteiro entre os mesmos. Em algumas modalidades, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Em algumas modalidades da invenção, as grânulos e as células T são cultivadas conjuntamente por cerca de oito dias. Em algumas modalidades, as grânulos e células T são cultivadas conjuntamente durante 2-3 dias. Vários ciclos de estimulação também podem ser desejados de modo que o tempo de cultura das células T pode ser de 60 dias ou mais. As condições apropriadas para a cultura de células T incluem meios apropriados (por exemplo, Meio Essencial Mínimo ou Meio RPMI 1640 ou, X-vivo 15, (Lonza)) que podem conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro bovino fetal ou soro humano), interleucina-2 (IL-2), insulina,IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, and TNF-α ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecidos por aquele versado na técnica. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não estão limitados a, tensoativo, Plasmanate, e agentes redutores tais como N-acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol. Os meios podem incluir RPMI 1640, AIM- V, DMEM, MEM, a-MEM, F- 12, X-Vivo 15, e X-Vivo 20, Optimizer, com aminoácidos, piruvato de sódio, e vitaminas adicionados, pode ser livre de soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T. Os antibióticos, por exemplo, a penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células a serem infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura (por exemplo, 37° C) e uma atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2) apropriadas.

[00516] As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem apresentar características diferentes. Por exemplo, os produtos de células mononucleares de sangue periférico submetido a aférese ou de sangue típico têm uma população de células T helper (Th, CD4+) que é maior do que a população de células T citotóxicas ou supressoras (Tc, CD8+). A expansão ex vivo de células T por estimulação de receptores CD3 e receptores CD28 produz uma população de células T que antes de cerca dos dias 8-9 consiste predominantemente em células Th, enquanto após cerca dos dias 8-9, a população de células T compreende uma população crescente de células Tc. Dependendo do propósito de tratamento, em algumas modalidades, a infusão de um indivíduo com uma população de células T compreendendo predominantemente as células Th pode ser vantajosa. Em algumas modalidades, se um subconjunto específico ao antígeno de células Tc tiver sido isolado, pode ser benéfico expandir este subconjunto em maior grau.

[00517] Além disso, para além dos marcadores CD4 e CD8, outros marcadores fenotípicos variam significativamente, mas em grande parte, reprodutivamente durante o curso do processo de expansão de células. A referida reprodutibilidade possibilita a capacidade de moldar um produto de células T ativadas para finalidades específicas.

[00518] Em algumas modalidades da invenção, as células T podem ser cultivadas na presença de rapamicina a fim de obter células T regulatórias, como descrito por exemplo na Publicação de Patente PCT WO 2007/110785 (incorporada nesse documento por referência). Um outro método para gerar células T regulatórias é descrito na Publicação de Patente dos EUA 2016/024470 (incorporada nesse documento por referência), em que as células T são cultivadas com um ativador de receptor de células T (TCR)/CD3 tal como por exemplo, anticorpos

TCR/CD3, um ativador coestimulador de TCR tal como, por exemplo, anticorpos CD28, CD137 (4-1BB), GITR, B7-1/2, CD5, ICOS, OX40, CD40 ou CD137, e rapamicina.

[00519] Em algumas modalidades da invenção, as células T geneticamente modificadas pela expressão de um CAR como descrito nesse documento podem também ter sido geneticamente modificadas pela expressão de pelo menos um fator intracelular tal como ROR-C, FoxP3, Foxo1, T-bet, ou Gata 3, c-Maf ou AhR. Em algumas modalidades, a célula imune geneticamente modificada da invenção expressa FoxP3. Em algumas modalidades, a célula imune geneticamente modificada da invenção expressa Foxo1.

[00520] Em algumas modalidades, a célula imune geneticamente modificada da invenção pode ser uma célula imune alogênica. Nos referidos casos, a célula pode ser manipulada para reduzir a rejeição do hospedeiro à célula (rejeição de enxerto) e/ou ao ataque potencial da célula sobre o hospedeiro (doença de enxerto contra hospedeiro). A título de exemplo, a célula pode ser manipulada para ter um genótipo nulo para um ou mais dos seguintes: (i) Receptor de células T (cadeia alfa ou cadeia beta de TCR); (ii) uma molécula polimórfica de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I ou II (por exemplo, HLA-A, HLA- B, ou HLA-C; HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ ou HLA-DR; ou β2-microglobulina (B2M)); (iii) um transportador associado com o processamento de antígenos (por exemplo, TAP-1 ou TAP-2); (iv) Transativador de MHC de classe II (CIITA); (v) um antígeno de histocompatibilidade menor (MiHA; por exemplo, HA-1/A2, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1H, ou HB- 1Y); e (vi) qualquer combinação dos mesmos. As células manipuladas alogênicas também podem expressar um HLA ou CD47 invariante para proteger as células Treg manipuladas da rejeição pelo hospedeiro. Estas modificações genéticas adicionais podem ser realizadas através das técnicas de edição de genes conhecidas na técnica e aquelas descritas nesse documento.

[00521] As células alogênicas adicionalmente editadas são particularmente úteis porque elas podem ser usadas em múltiplos pacientes sem questões de compatibilidade. As células alogênicas podem, portanto, ser denominadas células “universais”, e podem ser usadas diretamente. O uso de células “universais” melhora muito a eficiência e reduz os custos da terapia celular adotiva.

[00522] Em determinadas modalidades, a célula imune alogênica pode ser manipulada de modo que não expresse qualquer TCR funcional em sua superfície, manipulada de modo que não expresse uma ou mais subunidades compreendendo um TCR funcional ou manipulada de modo que produza muito pouco TCR funcional sobre a sua superfície. Por exemplo, uma célula imune como descrita nesse documento pode ser manipulada de modo que a expressão da superfície celular de moléculas TCR seja regulada negativamente. Alternativamente, a célula T pode expressar um TCR substancialmente comprometido, por exemplo, pela expressão de formas mutadas ou truncadas de uma ou mais das subunidades do TCR. O termo “TCR substancialmente comprometido” significa que este TCR não suscitará uma reação imune adversa em um hospedeiro.

[00523] Em determinadas modalidades, a célula imune alogênica pode ser manipulada de modo que não expresse um HLA funcional em sua superfície. Por exemplo, uma célula imune, como descrita nesse documento, pode ser manipulada de modo que a expressão de superfície celular de HLA, por exemplo, moléculas HLA classe 1 e/ou HLA classe II e/ou HLA não-clássicas, seja regulada negativamente.

[00524] Em determinadas modalidades, a célula T pode carecer de um TCR funcional e de um HLA funcional tal como HLA classe I e/ou HLA classe II.

[00525] As células imunes modificadas que carecem de expressão de um TCR e/ou HLA funcional podem ser obtidas por qualquer meio adequado, incluindo um knock out ou knock down de uma ou mais subunidades de TCR e/ou HLA. Por exemplo, a célula Treg pode incluir um knock down de TCR e/ou HLA usando siRNA, shRNA, repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (ou clustered regularly interspaced short palindromic repeats - CRISPR), nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição (ou transcription-activator like effector nuclease - TALEN), endonuclease dedo de zinco (ou zinc finger endonuclease - ZFN), meganuclease (mn, também conhecida como endonuclease de homing), ou megaTAL (combinando uma efetor TAL com um domínio de clivagem de mn).

[00526] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento é inserido em um locus específico no genoma de uma célula imune, tal como, por exemplo, no locus de um gene a ser eliminado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica um CAR, como descrito nesse documento, é inserido dentro de um locus TCR e/ou HLA, resultando assim na inibição da expressão de TCR e/ou HLA.

[00527] Em algumas modalidades, a expressão de TCR e/ou HLA pode ser inibida usando siRNAs ou shRNAs que alvejam um ácido nucleico que codifica um TCR e/ou HLA em uma célula T.

A expressão de siRNAs e shRNAs em células T pode ser obtida usando qualquer sistema de expressão convencional, por exemplo, tal como um sistema de expressão lentiviral. siRNAs e shRNAs exemplificativos que regulam negativamente a expressão de genes HLA de classe I e/ou de classe II são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente dos EUA 2007/0036773. Os shRNAs exemplificativos que regulam negativamente a expressão de componentes do TCR são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente dos EUA 2012/0321667.

[00528] o termo “CRISPR” ou “CRISPR a TCR e/ou HLA” ou “CRISPR para inibir TCR e/ou HLA”, como usado nesse documento, se refere a um conjunto de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas, ou um sistema compreendendo o referido conjunto de repetições. “Cas”, como usado nesse documento, se refere a uma proteína associada a CRISPR. Um sistema “CRISPR/Cas” se refere a um sistema derivado de CRISPR e Cas que pode ser usado para silenciar ou mutar um gene TCR e/ou HLA.

[00529] Os sistemas CRISPR/Cas de ocorrência natural são encontrados em aproximadamente 40% de genomas de eubactérias sequenciados e 90% de arqueia sequenciada. Ver, por exemplo, Grissa et al., (BMC Bioinformatics 8:172 (2007)). Este sistema é um tipo de sistema imunológico procariótico que confere resistência a elementos genéticos estranhos tais como plasmídeos e fagos e fornece uma forma de imunidade adquirida. Ver, por exemplo, Barrangou et al., Science 315:1709-1712 (2007); Marragini et al., Science 322:1843- 1845 (2008). O sistema CRISPR/Cas foi modificado para uso em edição de genes (silenciamento, intensificação ou alteração de genes específicos) em eucariotas tais como camundongos ou primatas. Ver, por exemplo, Wiedenheft et al., Nature

482:331-8 (2012). Isto é realizado pela introdução de um plasmídeo contendo CRISPR especificamente concebidas e uma ou mais sequências de codificação de Cas apropriadas.

A sequência de CRISPR, por vezes denominada locus de CRISPR,

compreende repetições e espaçadores alternados.

Na CRISPR de ocorrência natural, os espaçadores usualmente compreendem sequências estranhas à bactéria, tal como uma sequência de plasmídeo ou sequência de fago; no sistema CRISPR/Cas TCR e/ou HLA, os espaçadores são derivados da sequência de genes de TCR e/ou HLA.

O RNA do locus de CRISPR é expresso e processado constitutivamente por proteínas Cas em pequenos

RNAs.

Estes compreendem um espaçador flanqueado por uma sequência de repetição.

Os RNAs guiam outras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos ao nível de RNA ou DNA.

Ver, por exemplo, Horvath et al., Science 327:167-

170 (2010); Makarova et al., Biology Direct 1:7 (2006). Os espaçadores servem assim como modelos para moléculas de RNA,

analogamente aos siRNAs.

Ver, por exemplo, Pennisi, Science

341:833-836 (2013). O sistema CRISPR/Cas pode assim ser usado para editar um gene TCR e/ou HLA (adicionar ou eliminar um par de bases), ou introduzir uma parada prematura que diminui a expressão de um TCR e/ou HLA.

O sistema CRISPR/Cas alternativamente ou adicionalmente pode ser usado como interferência de RNA, desligando o gene de TCR e/ou HLA de forma reversível.

Em uma célula de mamífero, por exemplo, o

RNA pode guiar a proteína Cas a um promotor de TCR e/ou HLA, bloqueando estericamente as RNA polimerases.

[00530] Podem ser gerados sistemas CRISPR/Cas artificiais para inibir TCR e/ou HLA, usando a tecnologia conhecida na técnica, por exemplo, aquela descrita na Publicação de Patente dos EUA 2014/0068797, e Cong, Science 339:819-823 (2013). Outros sistemas CRISPR/Cas artificiais que são conhecidos na técnica podem também ser gerados para inibir TCR e/ou HLA, por exemplo, aqueles descritos em Tsai, Nature Biotechnol. 32:6569-576 (2014) e nas Patentes dos EUA 88,871,445; 8,865,406; 8,795,965; 8,771,945; e 8,697,359.

[00531] Está entendido que os procedimentos acima também podem ser realizados por sistemas CRISPR que usam endonucleases diferentes de Cas, tais como Cpf1 e C2c1/2/3.

[00532] “TALEN” ou “TALEN para TCR e/ou HLA” ou “TALEN para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease efetora semelhante a ativador de transcrição, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. As TALENs são produzidas artificialmente através da fusão de um domínio de ligação de DNA de efetor TAL a um domínio de clivagem de DNA. Os efetores semelhantes a ativador de transcrição (TALEs) podem ser manipulados para ligar qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma porção do gene de TCR e/ou HLA. Combinando um TALE manipulado com um domínio de clivagem de DNA, pode ser produzida uma enzima de restrição que é específica a qualquer sequência de DNA desejada, incluindo uma sequência de TCR e/ou HLA. Estes podem então ser introduzidos em uma célula, em que podem ser usados para a edição do genoma. Ver, por exemplo, Boch, Nature Biotech. 29:135-6 (2011); Boch et al., Science 326:1509-12 (2009); e Moscou et al., Science 326:3501 (2009).

[00533] As TALEs são proteínas secretadas por bactérias Xanthomonas. O domínio de ligação de DNA contém uma sequência repetida de 33-34 aminoácidos que é altamente conservada com a exceção dos l2º e l3º aminoácidos. Estas duas posições são altamente variáveis, mostrando uma forte correlação com o reconhecimento específico do nucleotídeo. Elas podem assim ser manipuladas para se ligarem a uma sequência de DNA desejada. Para produzir uma TALEN, uma proteína TALE é fundida a uma nuclease (N), que é uma endonuclease Fokl do tipo selvagem ou mutada. Foram realizadas várias mutações em Fokl para seu uso em TALENs; estas, por exemplo, melhoram a especificidade ou a atividade da clivagem. Ver, por exemplo, Cermak et al., Nucl. Acids Res. 39:e82 (2011); Miller et al., Nature Biotech. 29:143-8 (2011); Hockemeyer et al., Nature Biotech. 29:731-734 (2011); Wood et al., Science 333:307 (2011); Doyon et al., Nature Methods 8:74-79 (2010); Szczepek et al., Nature Biotech. 25:786-793 (2007); and Guo et al., J. Mol. Biol. 200:96 (2010). O domínio Fokl funciona como um dímero, requerendo duas construções com domínios de ligação de DNA únicos para locais no genoma alvo com orientação e espaçamento apropriados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação de DNA TALE e o domínio de clivagem Fokl e o número de bases entre os dois locais de ligação TALEN individuais parecem ser parâmetros importantes para a obtenção de elevados níveis de atividade (Miller et al., Nature Biotech. 29:143-8 (2011)).

Uma TALEN de TCR e/ou HLA pode ser usada dentro de uma célula para produzir uma ruptura de fita dupla (ou double-stranded break - DSB). Uma mutação pode ser introduzida no local de ruptura se os mecanismos de reparo repararem inadequadamente a ruptura através da união de extremidades não-homólogas.

Por exemplo, um reparo inadequado pode introduzir uma mutação de deslocamento de quadro. Alternativamente, DNA estranho pode ser introduzido na célula juntamente com a TALEN; dependendo das sequências do DNA estranho e da sequência cromossômica, este processo pode ser usado para corrigir um defeito no gene de TCR e/ou HLA ou para introduzir o referido defeito em um gene HLA wt, diminuindo assim a expressão de TCR e/ou HLA. As TALENs específicas para sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídas usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo vários esquemas usando componentes modulares (Zhang et al., Nature Biotech. 29:149- 53 (2011); Geibler et al., PLoS ONE 6:el9509 (2011)).

[00534] “ZFN” ou “Nuclease de Dedo de Zinco” ou “ZFN para TCR e/ou HLA” ou “ZFN para inibir TCR e/ou HLA” se refere a uma nuclease de dedo de zinco, uma nuclease artificial que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. Como uma TALEN, uma ZFN compreende um domínio nuclease Fokl (ou derivado do mesmo) fundido a um domínio de ligação de DNA. No caso de uma ZFN, o domínio de ligação de DNA compreende um ou mais dedos de zinco. Ver, por exemplo, Carroll et al., Genetics Society of America 188:773-782 (2011); e Kim et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 93:1156-1160 (1996). Um dedo de zinco é um pequeno motivo estrutural de proteína estabilizado por um ou mais íons de zinco. Um dedo de zinco pode compreender, por exemplo, Cys2His2, e pode reconhecer uma sequência de aproximadamente 3 bp. Vários dedos de zinco de especificidade conhecida podem ser combinados para produzir polipeptídeos multi-dedos que reconhecem sequencias de cerca de 6, 9, 12, 15 ou 18 bp.

Várias técnicas de seleção e montagem modular estão disponíveis para gerar dedos de zinco (e combinações dos mesmos) que reconhecem as sequências específicas, incluindo o phage display, os sistemas de monohíbrido em levedura, os sistemas de monohíbrido e duplo-híbrido em bactérias, e células de mamíferos.

[00535] Tal como uma TALEN, uma ZFN deve dimerizar para clivar DNA. Assim, um par de ZFNs é necessário para alvejar locais de DNA não-palindrômicos. As duas ZFNs individuais devem ligar fitas opostas do DNA com suas nucleases apropriadamente espaçadas (Bitinaite et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 95:10570-5 (1998)). Também tal como uma TALEN, uma ZFN pode criar uma ruptura de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento de quadro caso seja reparado de forma inadequada, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula. As ZFNs também podem ser usados com recombinação homóloga para mutar o gene de TCR e/ou HLA. As ZFNs específicas a sequências em TCR e/ou HLA podem ser construídas usando qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Provasi, Nature Med. 18:807-815 (2011); Torikai, Blood 122:1341-1349 (2013); Cathomen et al., Mol. Ther. 16:1200-7 (2008); Quo et al., J. Mol. Biol. 400:96 (2010); e as Publicações de Patente dos EUA 2011/0158957 e 2012/0060230.

[00536] “Meganuclease” ou “meganuclease para TCR e/ou HLA” ou “meganuclease para inibir TCR e/ou HLA”, se refere a uma endonuclease monomérica com grandes locais de reconhecimento (> 14 pares de bases), que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. As meganucleases (mn) são proteínas monoméricas com atividade da nuclease inata que são derivadas de endonuclease de homing bacterianas e manipuladas para um local alvo único. As endonucleases de homing são enzimas de clivagem de DNA que podem gerar rupturas de fita dupla em locais individuais em seus genomas hospedeiros, e desse modo acionar eventos de conversão de gene específicos ao local (Stoddard, Structure l9(l):7-15 (2011)). Apesar de seu pequeno tamanho, as endonucleases de homing reconhecem sequências de DNA longas (tipicamente 20 a 30 pares de bases). As endonucleases de homing são extremamente abundantes e são encontradas em micróbios, bem como em fagos e vírus. As enzimas LAGLIDADG e His-Cys (que são as enzimas mais específicas à sequência destas enzimas) baseiam-se em folhas-β antiparalelas que se encaixam nos sulcos principais de seus locais alvo de DNA (Flick et al., Nature 394(6688):96-l0l (1998); Jurica et al., Mol. Cell.

2(4):469-76 (1998). Aí estabelecem uma coleção de contatos específicos à sequência e não-específicos à sequência que são distribuídos não-uniformemente através de múltiplos pares de bases consecutivos (Chevalier et al., J Mol Biol.

329(2):253-269 (2003); Scalley-Kim et al., J Mol Biol.

372(5):1305-19 (2007).

[00537] A família de endonucleases de homing LAGLIDADG (LHE) é a fonte primária das enzimas manipuladas usadas para aplicações de alvejamento de genes. A família LHE é primariamente codificada dentro de arqueias e nos genomas de cloroplasto e mitocondriais de algas e fungos (Chevalier et al., em Homing Endonucleases and Inteins. Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 16 (2005); Dalgaard et al., Nucleic

Acids Res. 25(22):4626-38 (1997); Sethuraman et al., Mol Biol Evol. 26(10):2299-315 (2009). As meganucleases que possuem um único motivo LAGLIDADG conservado (SEQ ID NO: 58) por cadeia de proteína formam proteínas homodiméricas que clivam sequências alvo de DNA palindrômico e quase palindrômico, enquanto aquelas que contêm dois dos referidos motivos por cadeia de proteína formam monômeros maiores, pseudossimétricos que podem alvejar sequências de DNA totalmente assimétricas.

[00538] As meganucleases podem ser manipuladas para alvejar TCR e/ou HLA e assim criar uma ruptura de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento de quadro caso não seja reparado de forma adequada, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula.

[00539] “MegaTAL” ou “MegaTAL para TCR e/ou HLA” ou “MegaTAL para inibir TCR e/ou HLA”, se refere a uma nuclease artificial, que pode ser usada para editar o gene de TCR e/ou HLA. As megaTALs são nucleases monoméricas híbridas obtidas através da fusão de domínios efetores TAL (semelhantes a ativador de transcrição) mínimos ao N- terminal de meganucleases derivadas da família de endonucleases de homing LAGLIDADG (Boissel et al., Nucleic Acids Res. 42(4):259l-601 (2014); Takeuchi et al., Methods Mol Biol. 1239:105-32 (2015)). As megaTALs consistem assim de uma cabeça de clivagem de meganuclease específica ao local com afinidade e especificidade adicionais fornecidas por um domínio de Ligação de DNA de efetor TAL.

[00540] As MegaTALs podem ser manipuladas para alvejar TCR e/ou HLA e assim criar uma ruptura de fita dupla no DNA, que pode criar uma mutação de deslocamento de quadro caso não seja reparado de forma adequada, levando a uma diminuição na expressão e quantidade de TCR e/ou HLA em uma célula. Uma variante da meganuclease (mn) I-OnuI foi usada para conceber uma TCR⍺-megaTAL para fazer o knockout do gene receptor de células T alfa (TCR⍺). A TCR⍺ mn foi fundida a um conjunto TALE de 10.5 repetições concebido para ligar uma sequência de DNA a montante do local de ligação de TCR⍺ mn. Foi descoberto que a megaTAL alvejando o TCR⍺ atingiu uma perturbação de gene extremamente elevada sem qualquer clivagem fora do alvo detectável em células T primárias humanas (Boissel et al., Nucleic Acids Res 42(4):259l-601 (2014)).

[00541] Em algumas modalidades, uma população de células T que expressa um CAR da invenção é uma que carece de um receptor de células T endógeno (TCR) ou foi alterada para reduzir ou eliminar a expressão ou atividade do TCR endógeno.

É entendido que qualquer um dos métodos descritos nesse documento para inibir ou eliminar a expressão de HLA também pode ser usado para alvejar um ou mais componentes do TCR endógeno.

[00542] Em algumas modalidades, a transfecção com um gene de telomerase pode alongar os telômeros de uma célula T e melhorar a persistência da célula T no paciente. Ver, por exemplo, June, Journal of Clinical Investigation 117:1466-1476 (2007). Assim, em algumas modalidades, uma célula Treg geneticamente modificada da invenção expressa ectopicamente uma subunidade da telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica da telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. Em alguns aspectos, esta descrição fornece um método de produção de uma célula de expressão de receptor quimérico da invenção, compreendendo contatar a célula com um ácido nucleico que codifica uma subunidade da telomerase, por exemplo, a subunidade catalítica da telomerase, por exemplo, TERT, por exemplo, hTERT. A célula pode ser contatada com o ácido nucleico antes, em simultâneo com, ou depois de ser contatada com uma construção que codifica o receptor quimérico (por exemplo, um CAR como descrito nesse documento).

[00543] A presente invenção se refere ainda a um método para a obtenção de uma célula imune da invenção, em que o referido método compreende transduzir de pelo menos uma célula imune com um ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento, e opcionalmente expandir as células transduzidas. Em algumas modalidades, o método é um método ex vivo.

[00544] Em algumas modalidades, o método de obtenção de células imunes da invenção compreende: Uma etapa de isolamento/enriquecimento de células imunes a partir de uma população de PBMC (por exemplo, recuperada por leucoferese), opcionalmente, uma etapa de ativação, uma etapa de transdução com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um CAR como descrito nesse documento, opcionalmente uma etapa de expansão, opcionalmente uma etapa de lavagem e, opcionalmente uma etapa de congelamento.

[00545] Em algumas modalidades, as células Treg manipuladas da invenção podem ser cultivadas em meio de cultura de tecido contendo rapamicina e/ou uma elevada concentração de IL-2 para manter o fenótipo Treg e/ou aumentar a expressão de FoxP3 e do transgene.

Composições

[00546] Um outro objetivo da invenção é uma composição compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pelo menos uma célula imune ou população de células imunes da invenção como descritas nesse documento. Em algumas modalidades, a referida célula imune ou população de células imunes da invenção é selecionada a partir do grupo consistindo em células T, células exterminadoras naturais (NK), células T 𝛾δ, células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias, células imunes efetoras, células T efetoras, células B e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas.

[00547] Como usado nesse documento, o termo “consistindo essencialmente em”, em referência a uma composição farmacêutica ou medicamento, significa que a pelo menos uma célula imune ou população celular da invenção é o único agente terapêutico ou agente com uma atividade biológica dentro da referida composição ou medicamento.

[00548] Em algumas modalidades, a referida composição compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma população de células imunes isoladas e/ou substancialmente purificadas da invenção, como descrito nesse documento.

[00549] Em algumas modalidades, a referida composição compreende, consiste ou consiste essencialmente em pelo menos uma população de células imunes da invenção, como descrita nesse documento, manipulada para expressar na superfície celular um CAR descrito nesse documento (por exemplo, um CAR compreendendo: pelo menos um domínio de ligação extracelular, opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular, pelo menos um domínio transmembrana,

e pelo menos um domínio intracelular, em que o pelo menos um domínio intracelular compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário e opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador), em que o pelo menos um domínio transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio transmembrana ou fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos e/ou o pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00550] Em algumas modalidades, a referida composição foi congelada e descongelada.

[00551] Outro objetivo da invenção é uma composição farmacêutica compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos uma célula imune ou população como descrito nesse documento e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00552] Um outro objetivo da invenção é um medicamento compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em pelo menos uma população de células imunes como descrito nesse documento.

[00553] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ou medicamento compreende pelo menos uma população de células imunes isoladas e/ou substancialmente purificadas da invenção, como descrito nesse documento.

[00554] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ou medicamento compreende uma combinação de populações de células imunes como descrito nesse documento (isto é, pelo menos duas populações de células imunes distintas da invenção).

[00555] Em algumas modalidades, a composição, composição farmacêutica ou medicamento da invenção compreende ainda pelo menos uma segunda população de células imunes distinta, em que as células da referida segunda população de células imunes expressam sobre a superfície celular um segundo CAR distinto específico para um antígeno, um fragmento de um antígeno, uma variante de um antígeno ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um antígeno alimentar da dieta humana comum. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um autoantígeno, tal como, por exemplo, um antígeno associado a esclerose múltipla, um antígeno associado a articulações, um antígeno associado ao olho, um antígeno HSP humano, um antígeno associado à pele ou um antígeno envolvido na rejeição de enxerto ou GVHD. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um alergênio inalado, um alergênio ingerido ou um alergênio de contato. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um antígeno selecionado do grupo consistindo em ovalbumina, MOG, colágeno tipo II, vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado, fibrinogênio citrulinado, e fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

[00556] Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para a ovalbumina ou um fragmento, variante ou mistura da mesma. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para MOG ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para colágeno tipo II ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para o vimentina citrulinada, colágeno tipo II citrulinado ou fibrinogênio citrulinado, ou fragmentos, variantes e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para HLA-A2 ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para IL-23R ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo.

Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um marcador de superfície de células B, tal como, por exemplo, CD19, CD20, ou fragmentos, variantes e misturas dos mesmos.

Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um antígeno de câncer como descrito nesse documento ou um fragmento, variante ou mistura do mesmo.

[00557] Em algumas modalidades, o segundo CAR reconhece células infectadas. Em algumas modalidades, o segundo CAR é específico para um antígeno viral ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo; um antígeno bacteriano ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo; ou um antígeno fúngico ou um fragmento, variante, ou mistura do mesmo.

[00558] Em algumas modalidades, as células da referida segunda população de células imunes expressam sobre a superfície celular um CAR em que o domínio de ligação extracelular do referido CAR é uma proteína ou um fragmento ou variante da mesma, tal como, por exemplo, um autoantígeno ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00559] Em algumas modalidades, as células da referida outra população de células imunes expressam sobre a superfície celular um CAR específico para um autoanticorpo, tal como, por exemplo, um autoanticorpo expresso em uma célula B.

[00560] As composições e medicamentos descritos nesse documento podem compreender, por exemplo, tampões tais como água esterilizada, solução salina fisiológica, solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e semelhantes; sais; antibióticos; agentes isotônicos; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose, dextranos, e manitol; proteínas tais como albumina de soro humano); polipeptídeos; aminoácidos tais como glicina e arginina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições e medicamentos podem adicionalmente compreender fatores que são favoráveis ao fenótipo e crescimento de Treg (por exemplo, IL-2 e rapamicina ou derivados dos mesmos), citocinas anti- inflamatórias (por exemplo, IL-10, TGF-β e IL-35), e outras células para a terapia celular (por exemplo, células efetoras T de CAR para terapia de câncer ou células para terapia regenerativa). Para armazenamento e transporte, as células podem opcionalmente ser criopreservadas. Antes do uso, as células podem ser descongeladas e diluídas em um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00561] As composições da presente invenção são em algumas modalidades formuladas para administração intravenosa.

[00562] Em algumas modalidades, as células expressando os CARs da invenção exibem sinalização tônica reduzida em comparação com as células expressando os CARs sem um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou sem um domínio de sinalização coestimulador intracelular TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00563] O termo “sinalização tônica”, como usado nesse documento, se refere a um antecedente de ativação independente de antígeno.

[00564] Os métodos para medir a sinalização tônica são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, e incluem, sem limitação, a medição da atividade metabólica das células expressando CAR, a medição de um ou mais indicadores de ativação celular na ausência de estimulação por um antígeno reconhecido pelo receptor, a medição de uma ou mais alterações fenotípicas relacionadas com o envelhecimento celular ou a senescência celular, a determinação da progressão do ciclo celular na ausência de estimulação antigênica; e a medição do tamanho das células expressando o receptor comparado com o tamanho das células não modificadas.

[00565] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas com CAR expressando um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização coestimulador intracelular TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo possuem sinalização tônica reduzida em comparação com as células imunes manipuladas com CAR que não expressam um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio coestimulador intracelular TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo quando medido nas condições do TESTE A.

TESTE A:

[00566] Um indicador de ativação de células T é usado para medir a sinalização tónica. Nas condições do TESTE A, o nível de células CD69 positivas é medido na população celular antes e depois da ativação do CAR da invenção. O ensaio de ativação é realizado no dia 9 da cultura de células imunes. Resumidamente, 0.05 x 106 células imunes são semeadas em placas de fundo de 96 U isoladamente ou na presença de grânulos revestidos com anti-CD28/anti-CD3 (em uma proporção de célula imune para grânulos de 1:1), ou na presença de células B autólogas recentemente descongeladas (em uma proporção de células imunes para células B de 1:1) em um volume final de 200 µl. Depois de 24h a 37° C, 5% de CO2, as células são coradas para CD69 e um marcador relacionado a uma população de células imunes específicas (por exemplo, CD19 para células B, ou CD4 ou CD8 para células T) e então analisadas usando a citometria de fluxo. O monitoramento da expressão espontânea de CD69 (significando sem qualquer simulação antigênica) pelas células expressando um CAR descrito nesse documento (por exemplo, compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização coestimulador intracelular TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo), em comparação com as células não-transduzidas, permite a determinação da intensidade de sinalização tônica. As células transduzidas com um CAR que não compreende um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio de sinalização coestimulador intracelular TNTNR2 são usadas como um controle.

[00567] Em algumas modalidades, as construções de CAR da invenção podem ser usadas para produzir uma célula imune manipulada com sinalização tônica reduzida. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para produzir uma célula imune manipulada (isto é, uma célula que expressa um CAR) com sinalização tônica reduzida. As construções de CAR atualmente disponíveis, especialmente aquelas usadas no campo de efetores CAR, são frequentemente associadas a uma sinalização tónica elevada, limitando a potência das células manipuladas CAR. De fato, referida sinalização tônica é associada com a ativação constitutiva de células manipuladas CAR, levando à sua exaustão prematura ou mesmo à sua morte. As construções de CAR da invenção (compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e/ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo) fornecem uma sinalização tônica diminuída e ativação constitutiva de células.

Usos terapêuticos

[00568] A invenção fornece um método para o tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração ao indivíduo de uma célula imune ou composição manipulada com CAR como descrito nesse documento. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso como um medicamento. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na preparação de um medicamento. As doenças que podem ser tratadas com células imunes manipuladas da invenção incluem, mas não estão limitadas a, doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças alérgicas, condições de transplante de órgãos, câncer e doenças infecciosas.

[00569] Em algumas modalidades, o método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende administrar ao indivíduo pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento, por exemplo, uma população de células imunes regulatórias manipuladas (tal como uma população de células Treg), em que a referida doença ou distúrbio é uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, ou uma condição de transplante de órgãos. Em determinadas modalidades, a doença ou distúrbio é a rejeição de enxerto ou a doença enxerto contra hospedeiro.

[00570] Em algumas modalidades, o método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende administrar ao indivíduo pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento, por exemplo, uma população de células imunes efetoras manipulada (tal como uma população de células Treg), em que a referida doença ou distúrbio é um câncer ou uma doença infecciosa.

[00571] Em algumas modalidades, o método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo compreende administrar ao indivíduo pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento, por exemplo, uma população de células imunes efetoras manipulada (tal como uma população de células Treg), em que o referido indivíduo está em necessidade de terapia genética (por exemplo, terapia genética à base de AAV) para a referida doença ou distúrbio.

[00572] Em algumas modalidades, o método é um método de terapia celular.

[00573] Em algumas modalidades, a terapia celular é autóloga.

[00574] Em algumas modalidades, a terapia celular é heteróloga.

[00575] Em algumas modalidades, a terapia celular é alogênica.

[00576] Em algumas modalidades, o método é um método de terapia genética e envolve a administração de um ácido nucleico ou vetor como descrito nesse documento.

1. Doenças Inflamatórias

[00577] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições inflamatórias em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em determinadas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas para promover a tolerância imune neste contexto. A presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença ou distúrbio inflamatório em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma população de células imunes como descrito nesse documento.

A presente invenção também se refere a pelo menos uma população de células imunes como descrito nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso no tratamento de uma doença inflamatória ou distúrbio. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo,

em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento), para o uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio inflamatório.

[00578] Os termos “distúrbio inflamatório” e “doença inflamatória” são usados de forma intercambiável e como usados nesse documento, se referem a qualquer anormalidade associada à inflamação.

[00579] Em algumas modalidades, a condição inflamatória compreende doenças inflamatórias e inflamação ligada a uma infecção ou ligada ao câncer.

[00580] Em algumas modalidades, a condição inflamatória compreende doenças inflamatórias e inflamação ligadas a doenças autoimunes.

[00581] As doenças, distúrbios, ou condições inflamatórias exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, artrite, artrite reumatoide, espondilite anquilosante, osteoartrite, artrite psoriásica, artrite idiopática juvenil, artrite reumatoide juvenil, artrite uriática, gota, poliartrite crônica, periartrite escapuloumeral, artrite cervical, artrite lombossacra, artrite enteropática e espondilite anquilosante, asma, dermatite, psoríase, esclerodermia, polimiosite, dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, cirrose biliar primária, fibrose, fibrose cística, fibrose pulmonar,

cirrose, endomiocardiofibrose, fibrose dediastinal,

mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose nefrogênica,

queloides, esclerodermia, artrofibrose, rejeição de órgão sólido crônica e tardia pós-transplante, esclerose múltipla,

lúpus eritematoso sistémico, lúpus nefrite, pênfigo, pênfigo vulgar, pênfigo herpetiforme, pênfigo vegetante, pênfigo por

IgA, pênfigo eritematoso, penfigoide bulhoso, penfigoide gestacional, dermatose de membrana mucosa, penfigoide nodular, dermatose bulhosa por IgA linear, líquen plano bulhoso, epidermólise bulhosa adquirida, diabetes autoimune,

retinopatia diabética, nefropatia diabética, doença vascular diabética, inflamação ocular, uveíte, rinite, lesão por isquemia-reperfusão, restenose pós-angioplastia, doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), glomerulonefrite, doença de Graves, alergias gastrointestinais, conjuntivite,

aterosclerose, doença coronária, angina, doença da artéria pequena, encefalomielite disseminada aguda, purpura trombocitopênica idiopática, esclerose múltipla, esclerose sistémica, síndrome de antifosfolipídeo, síndrome de

Sjoegren, anemia hemolítica autoimune, colite, doença de

Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória intestinal

(IBD), embolia, embolia pulmonar, embolia arterial, embolia venosa, inflamação alérgica, doença cardiovascular, doenças relacionadas com enxerto, doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD), distúrbios associados com a rejeição de transplante de enxerto, rejeição crónica, e aloenxertos ou xenoenxertos de tecido ou células, doenças autoimunes, degeneração após trauma, acidente vascular cerebral, rejeição de transplante, condições alérgicas e hipersensibilidade, por exemplo, rinite alérgica, eczema alérgico e semelhantes, doenças da pele, distúrbios inflamatórios dérmicos, e qualquer combinação dos mesmos.

[00582] Exemplos de doenças da pele incluem, mas não estão limitadas a, acne; queratose actínica; dermatite atópica; dermatite de contato; úlceras de decúbito (escaras); eczema; eritrodermia; hemangioma, tal como, por exemplo, hemangioma da infância; cicatrização hipertrófica; líquen plano distúrbios de liquenoide; linfangiogênese; psoríase; granulomas piogênicos; molusco contagioso; neurofibromatose; rosácea; epidermólise bulhosa distrófica recessiva; cicatrizes (queloides); esclerodermia; queratose seborreica; cânceres de pele tais como angiossarcoma, carcinoma de células basais, hemangioendotelioma, sarcoma de Karposi, melanoma maligno, melanoma, carcinoma de células escamosas; úlceras da pele; lesões cutâneas após enxertos de pele tais como autotransplante e alotransplante; síndromes de Steven-Johnson e necrólise epidérmica tóxica; síndrome de Sturge-Weber; esclerose tuberosa; úlceras venosas; verruga vulgar; verrugas, tais como, por exemplo, verrugas virais; feridas; e semelhantes.

[00583] Os exemplos de distúrbios inflamatórios dérmicos incluem, mas não estão limitados a, psoríase, psoríase gutata, psoríase inversa, psoríase pustulosa, eritrodermia psoríase, dermatose neutrofílica aguda febril, eczema,

eczema asteatótico, eczema disidrótico, eczema palmoplantar vesicular, acne vulgar, dermatite atópica, dermatite de contato, dermatite de contato alérgica, dermatomiosite,

dermatite esfoliativa, eczema das mãos, ponfolix, rosácea,

rosácea causada por sarcoidose, rosácea causada por esclerodermia, rosácea causada pela síndrome de Sweet,

rosácea causada por lúpus eritematoso sistémico, rosácea causada por urticária, rosácea causada por dor associada a zoster, doença de Sweet, hidradenite neutrofílica, pustulose estéril, erupções devido a drogas, dermatite seborreica,

pitiríase rósea, doença cutânea de kikuchi, pápulas e placas urticariformes pruriginosas da gravidez, síndrome de

Stevens-Johnson e necrólise epidérmica tóxica, reações a tatuagem, síndrome de Wells (celulite eosinofílica), artrite reativa (síndrome de Reiter), síndrome de dermatose-artrite associada ao intestino, dermatose reumatoide neutrofílica,

hidradenite écrina neutrofílica, dermatose neutrofílica do dorso das mãos, balanite plasmocitária de Zoon,

balanopostite, doença de Behcet, eritema anular centrífugo,

eritema discrómico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, dermatite das mãos, líquen nítido, líquen plano,

líquen escleroso e atrófico, líquen simples crônico, líquen espinuloso, dermatite numular, pioderma gangrenoso, sarcoidose, dermatose pustulosa subcórnea, urticária, e dermatose acantolítica transitória.

2. Doenças Autoimunes

[00584] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições autoimunes em um indivíduo em necessidade do mesmo.

Em determinadas modalidades, a células imunes modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover tolerância imune neste contexto. Assim, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma população de células imunes como descrito nesse documento. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrito nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso no tratamento de uma doença autoimune. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune.

[00585] Exemplos de doenças autoimunes incluem, mas não estão limitados a, lúpus (por exemplo, lúpus eritematoso, lúpus nefrite, etc.), tireoidite de Hashimoto, mixedema primário, doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, doença de Addison, diabetes (por exemplo, diabetes mellitus dependente de insulina, diabetes mellitus tipo I, diabetes mellitus tipo II, etc.), síndrome de Goodpasture, miastenia grave, pênfigo, doença de Crohn, oftalmia simpática, uveíte autoimune, esclerose múltipla, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crónica, colite ulcerativa, síndrome de Sjogren, doenças reumáticas (por exemplo, artrite reumatoide), polimiosite, esclerodermia, psoríase, doença de tecido conjuntivo misto, e semelhantes.

3. Doenças Alérgicas

[00586] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições alérgicas em um indivíduo em necessidade do mesmo.

Em determinadas modalidades, as células imunes modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover a tolerância imune neste contexto. A presente invenção fornece assim um método de tratamento de uma doença, distúrbio,

sintoma ou condição alérgica em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento.

A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso no tratamento de uma doença, distúrbios, sintomas ou condições alérgicas. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças, distúrbios, sintomas ou condições alérgicas.

[00587] Exemplos de doenças alérgicas incluem, mas não estão limitadas a, doenças alérgicas contra um alergênio inalado, um alergênio ingerido ou um alergênio de contato.

Outros exemplos de doenças alérgicas incluem, mas não estão limitadas a, asma alérgica, doenças pulmonares de hipersensibilidade, alergia alimentar, dermatite atópica, rinite alérgica, rinoconjuntivite alérgica, urticária crónica, distúrbios de hipersensibilidade do tipo retardado e anafilaxia sistemática.

4. Transplante

[00588] Em algumas modalidades, as células imunes de manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições associadas ao transplante de órgãos ou tecidos (por exemplo, rejeição/disfunção do órgão ou tecido, GVHD e/ou condições associadas à mesma). A rejeição de transplante envolve a destruição do tecido transplantado do doador pelas células imunes do receptor através de uma resposta imunológica. Uma resposta imunológica está também envolvida na GVHD; no entanto, neste caso, os tecidos do receptor são destruídos pelas células imunes do doador transferidas para o receptor através do transplante. Consequentemente, o redirecionamento e ativação de células imunes mediado por CAR fornecem um método de supressão da rejeição de células e/ou tecidos diferentes por células efetoras imunes em receptores de transplante ou de inibição da ação patogênica de células imunocompetentes transplantadas no caso da GVHD.

Em algumas modalidades, as células e/ou tecidos diferentes compreendem células e/ou tecidos HLA-A2 diferentes. As células imunes modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover a tolerância imune, a tolerância operacional e/ou a acomodação imune em um indivíduo, em particular após o transplante de um órgão ou tecido. Assim, a presente invenção fornece um método para promoção da tolerância imune, tolerância operacional e/ou acomodação imune em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma célula imune manipulada por CAR, ou uma composição farmacêutica, como descrito nesse documento. Em algumas modalidades, o método pode ser para a promoção de tolerância imune, tolerância operacional e/ou acomodação imune a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na promoção de tolerância imune, tolerância operacional e/ou acomodação imune a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo ou a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na fabricação de um medicamento para a promoção da tolerância imune, tolerância operacional e/ou acomodação imune a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo ou a um órgão ou tecido transplantado em um indivíduo.

[00589] Em algumas modalidades, uma célula imune manipulada por CAR (por exemplo, uma célula Treg manipulada por CAR da invenção é administrada ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do órgão ou tecido.

[00590] Em algumas modalidades, uma célula imune manipulada por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da invenção pode ser usada para prevenir ou tratar a rejeição de um órgão ou tecido transplantado. Exemplos de rejeição de um órgão ou tecido transplantado incluem, mas não estão limitados a, rejeição hiperaguda de um órgão ou tecido transplantado, e rejeição mediada por anticorpos de um órgão ou tecido transplantado.

[00591] Em algumas modalidades, o método da invenção compreende a administração de células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção a um indivíduo exposto a um órgão ou tecido transplantado.

[00592] Em algumas modalidades, o órgão ou tecido transplantado pode abranger um transplante de medula óssea, um transplante de órgão, uma transfusão de sangue ou qualquer outro tecido ou célula estranhos que são propositadamente introduzidos em um indivíduo.

[00593] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção podem ser usadas como terapia para inibir a rejeição de enxerto após o transplante, incluindo, sem limitação, a rejeição de aloenxerto ou rejeição de xenoenxerto.

[00594] Um outro objetivo da invenção é um método de prevenção ou tratamento da rejeição de transplante de órgão ou tecido em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo as referidas células imunes.

[00595] Um outro objetivo da invenção é um método para aumentar o período de tempo de sobrevivência de enxerto em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo as mesmas.

[00596] Em algumas modalidades, o método fornece um período de tempo de sobrevivência de enxerto de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 20 anos, 30 anos, 40 anos, 50 anos, 60 anos, 70 anos, 80 anos, 90 anos, 100 anos, ou a vida toda do indivíduo.

[00597] Em algumas modalidades, a administração de uma célula imune ou composição da invenção permite a redução na quantidade de uma terapia de agente imunossupressor recebida pelo indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo não requer, e/ou não está submetido a, quaisquer terapias com agente imunossupressor.

[00598] Em algumas modalidades, o enxerto é um aloenxerto. Em algumas modalidades, o transplante pode ser exposto às células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do transplante no receptor. Em algumas modalidades, o transplante de órgão ou tecido pode ser um coração, válvula cardíaca, pulmão, rim, fígado, pâncreas, intestino, pele, vasos sanguíneos, medula óssea, células tronco, osso, ou células das ilhotas.

No entanto, a invenção não é limitada a um tipo específico de transplante.

[00599] Em algumas modalidades, o transplante doador pode ser um transplante “pré-condicionado” ou “pré-tratado” através do tratamento do transplante de órgão ou tecido antes de ser transplantado no receptor com células imunes manipuladas por CAR da invenção a fim de reduzir a imunogenicidade do transplante contra o receptor, reduzindo ou impedindo assim a rejeição do enxerto.

[00600] Em algumas modalidades, o hospedeiro ou receptor do transplante é HLA-A2 negativo. Em algumas modalidades, o hospedeiro ou receptor do transplante é HLA-A2 negativo e é positivo para um subtipo de HLA-A selecionado do grupo consistindo em HLA-A25, HLA-A29 e HLA-A30.

[00601] Em algumas modalidades, o transplante é HLA-A2 positivo.

[00602] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção podem ser usadas para prevenir ou tratar a doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). Em determinadas modalidades, a GVHD pode ocorrer após o transplante de células tronco hematopoiéticas. Em algumas modalidades, o método compreende a administração de células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção a um indivíduo exposto a um órgão ou tecido transplantado. Em algumas modalidades, o órgão ou tecido transplantado pode abranger um transplante de medula óssea, um transplante de órgão, uma transfusão de sangue, ou qualquer outro tecido ou célula estranhos que sejam introduzidos propositadamente em um indivíduo. Por exemplo, a GVHD pode ocorrer após o transplante de coração, válvula cardíaca, pulmão, rim, fígado, pâncreas, intestino, pele, vaso sanguíneo, medula óssea, célula tronco, osso ou células das ilhota. No entanto, a invenção não é limitada a um tipo específico de transplante.

[00603] Um outro objetivo da invenção é um método para a prevenção ou tratamento da doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD) em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo de células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) ou uma composição farmacêutica como descrito nesse documento.

[00604] Em algumas modalidades, a invenção fornece um método de contatar um transplante de doador, por exemplo, uma malha biocompatível ou um tecido, órgão ou célula doadores, com células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção ao mesmo tempo que, antes ou após o transplante do transplante em um receptor.

[00605] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção podem ser usadas para melhorar, inibir ou reduzir uma resposta adversa pelo transplante doador contra o receptor, prevenindo ou tratando assim a GVHD.

[00606] Um outro objetivo da presente invenção é um método para a prevenção ou retardamento do início da GVHD em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo das células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) ou uma composição farmacêutica como descrita nesse documento.

[00607] Em algumas modalidades, o início da GVHD é retardado por 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos, 10 anos, 20 anos, 30 anos, 40 anos, 50 anos, 60 anos, 70 anos, 80 anos, 90 anos, 100 anos, ou a toda a vida do indivíduo.

[00608] Em algumas modalidades, a administração de uma célula imune ou composição da invenção permite a redução na quantidade de uma terapia de agente imunossupressor recebida pelo indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo não requer, e/ou não é submetido a, quaisquer terapias de agente imunossupressor.

[00609] Em algumas modalidades, a GVHD pode ser GVHD aguda ou GVHD crónica.

[00610] Em algumas modalidades, o transplante doador pode ser “pré-condicionado” ou “pré-tratado” através do tratamento do transplante antes de ser transplantado no receptor com células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da invenção a fim de reduzir a imunogenicidade do transplante contra o receptor, reduzindo ou prevenindo assim a GVHD. Em algumas modalidades, o transplante pode ser contatado com células ou com um tecido do receptor antes do transplante a fim de ativar as células T que podem estar associadas ao transplante. Após o tratamento do transplante com células ou um tecido do receptor, as células ou tecido podem ser removidos do transplante. O transplante tratado pode então ser contatado com células imunes manipuladas por CAR (por exemplo, células Treg manipuladas por CAR) da presente invenção para reduzir, inibir ou eliminar a atividade das células efetoras imunes que foram ativadas pelo tratamento com as células ou tecido do receptor. Após este tratamento, as células imunes manipuladas por CAR podem ser removidas do transplante antes de ser transplantado no receptor. No entanto, algumas células imunes manipuladas por CAR podem aderir ao transplante e, portanto, podem ser introduzidas no receptor com o transplante. Nesta situação, as células imunes manipuladas por CAR introduzidas no receptor podem suprimir uma resposta imunológica contra o receptor causada por uma célula associada ao transplante.

[00611] Em algumas modalidades, o hospedeiro ou receptor do transplante é HLA-A2 negativo. Em algumas modalidades, o hospedeiro ou receptor do transplante é HLA-A2 negativo e é positivo para um subtipo de HLA-A selecionado do grupo consistindo em HLA-A25, HLA-A29 e HLA-A30.

[00612] Em algumas modalidades, o transplante é HLA-A2 positivo.

[00613] As células imunes podem ser obtidas a partir de qualquer fonte. Por exemplo, em algumas modalidades, as células imunes podem ser obtidas a partir do doador de tecido, do receptor de transplante ou de uma fonte de outra forma não relacionada (por exemplo, um indivíduo ou espécie totalmente diferente) para a geração de células imunes modificadas por CAR da presente invenção. Consequentemente, as células imunes modificadas por CAR da presente invenção podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas para o receptor do transplante ou a partir de uma fonte de outra forma não relacionada. Em algumas modalidades, as células imunes modificadas por CAR são células CAR-Treg que podem ser autólogas, alogênicas ou xenogênicas para o receptor do transplante. Em algumas modalidades, as células CAR-Treg podem ser autólogas para o receptor do transplante.

5. Cânceres

[00614] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de um ou mais cânceres em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em determinadas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas para promover uma resposta imunológica específica contra células cancerosas. A presente invenção fornece assim um método de tratamento de um câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso no tratamento do câncer. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.

[00615] Como usado nesse documento, o termo “câncer” pode ser qualquer câncer que esteja associado a um antígeno de superfície ou marcador de câncer.

[00616] Exemplos de cânceres incluem, mas não estão limitados a, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), carcinoma cístico adenoide, adrenocortical, carcinoma, cânceres relacionados com AIDS, câncer anal, câncer do apêndice, astrocitomas, tumor teratoide/rabdoide atípico, leucemia de células B, linfoma ou outras malignidades de células B, carcinoma de células basais, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, câncer ósseo, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco cerebral, tumores cerebrais, câncer de mama, tumores brônquicos, linfoma de Burkitt, tumores carcinoides, cânceres do sistema nervoso central, câncer cervical, cordoma, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, câncer colorretal,

craniofaringioma, linfoma de células T cutâneo, tumores embrionários, câncer endometrial, ependimoblastoma,

ependimoma, câncer esofágico, estesioneuroblastoma, família de tumores de sarcoma de Ewing, tumor de células germinativas extracraniano, tumor de células germinativas extragonadal,

câncer de duto biliar extra-hepático, câncer de olho,

histiocitoma fibroso de osso e osteossarcoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumores estromais gastrointestinais (GIST), sarcoma de tecidos moles, tumor de células germinativas, tumor trofoblástico gestacional,

glioma, leucemia de célula pilosa, câncer de cabeça e pescoço, câncer de coração, câncer hepatocelular (fígado),

histiocitose, linfoma de Hodgkin, câncer hipofaríngeo,

melanoma intraocular, tumores de células das ilhotas

(pâncreas endócrino), sarcoma de Kaposi, câncer de rim,

histiocitose de células de Langerhans, câncer de laringe,

leucemia, câncer de boca e cavidade oral, câncer de fígado

(primário), carcinoma lobular in situ (LCIS), câncer de pulmão, linfoma, macroglobulinemia, câncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de osso,

meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, carcinoma de células Merkel, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metastático com carcinoma de trato mediano primário oculto envolvendo o gene NUT, câncer da boca, síndromes de neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo/neoplasma de células plasmáticas, micose fungoide, síndromes mielodisplásicas,

neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativos, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica (CML), leucemia mieloide aguda (AML), mieloma múltiplo, distúrbios mieloproliferativos, câncer da cavidade nasal e do seio paranasal, câncer da nasofaringe, neuroblastoma, linfoma não-Hodgkin, câncer pulmonar de células não-pequenas, câncer oral, câncer da cavidade oral, câncer da orofaringe,

osteossarcoma, câncer do ovário, câncer pancreático,

papilomatose, paraganglioma, câncer do seio paranasal e da cavidade nasal, câncer da paratireoide, câncer do pénis,

câncer da faringe, feocromocitoma, tumores do parênquima pineal de diferenciação intermediária, pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, tumor pituitário, neoplasma de células plasmáticas/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar e câncer de mama, linfoma do sistema nervoso central primário (SNC), câncer da próstata, câncer retal, câncer de células renais (do rim),

pélvis renal e ureter, câncer de células transicionais,

retinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândulas salivares, sarcoma, síndrome de Sezary, câncer de pulmão de células pequenas, câncer do intestino delgado, sarcoma de tecidos moles, carcinoma de células escamosas, câncer de pescoço escamoso, câncer de estômago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, linfoma de células T, câncer cutâneo, câncer testicular, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer de célula transicional da pelve renal e ureter, tumor trofoblástico, câncer de ureter e da pelve renal, câncer uretral, câncer uterino, sarcoma uterino, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom e tumor de Wilms.

[00617] Em alguns aspectos, o câncer é uma malignidade das células B. Exemplos de malignidades das células B incluem, mas não são limitadas a, linfomas não-Hodgkin (NHL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL/CLL), linfoma de células do manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma da zona marginal (MZL), linfoma extranodal (por exemplo, MALT), linfoma nodal (por exemplo, células B monocitoides), linfoma esplênico, linfoma de célula grande difusa, leucemia/linfoma linfocítico crônico de células B, linfoma de Burkitt e linfoma linfoblástico.

6. Doenças Infecciosas

[00618] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da invenção podem ser usadas no tratamento de uma ou mais doenças, distúrbios, sintomas ou condições infecciosas em um indivíduo em necessidade do mesmo. Em determinadas modalidades, as células imunes modificadas por CAR da invenção podem ser usadas para promover a tolerância imune neste contexto. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma doença infecciosa em um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o referido método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso no tratamento de uma doença infecciosa. A presente invenção também fornece pelo menos uma população de células imunes como descrita nesse documento (por exemplo, em uma composição, composição farmacêutica ou medicamento como descrito nesse documento) para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença infecciosa.

[00619] Em algumas modalidades, a doença infecciosa é uma doença infecciosa viral. Como usado nesse documento, uma “doença infecciosa viral” pode ser uma infecção causada por qualquer vírus que causa uma doença ou condição patológica no hospedeiro.

[00620] Exemplos de doenças infecciosas virais incluem, mas não estão limitadas a, uma infecção viral causada por um vírus Epstein-Barr (EBV); uma infecção viral causada por um vírus da hepatite A, vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C; uma infecção viral causada por um vírus do herpes simplex tipo 1, vírus do herpes simplex tipo 2, ou vírus do herpes simplex tipo 8; infecção viral causada por um citomegalovírus (CMV); uma infecção viral causada por um vírus da imunodeficiência humana (HIV); uma infecção viral causada por um vírus de influenza; uma infecção viral causada por um vírus de sarampo ou caxumba; uma infecção viral causada por um vírus de papiloma humano (HPV); uma infecção viral causada por um vírus de parainfluenza; uma infecção viral causada por um vírus de rubéola; uma infecção viral causada por um vírus sincicial respiratório (RSV); ou uma infecção viral causada por vírus de varicela-zoster. Em alguns aspectos, uma infecção viral pode levar a ou resultar no desenvolvimento de câncer em um indivíduo com infecção viral (por exemplo, a infecção com HPV pode causar ou estar associada ao desenvolvimento de vários cânceres, incluindo câncer cervical, vulvar, vaginal, peniano, orofaríngeo, e a infecção por HIV pode causar o desenvolvimento de sarcoma de Kaposi).

[00621] Em algumas modalidades, a doença infecciosa é uma doença infecciosa bacteriana. Como usado nesse documento, uma “doença infecciosa bacteriana” pode ser uma infecção causada por qualquer bactéria que causa uma doença ou condição patológica no hospedeiro.

[00622] Exemplos de doenças infecciosas bacterianas incluem, mas não são limitadas a pneumonia, otite média,

sinusite, bronquite, amigdalite e mastoidite associada à infecção por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus ou do género Peptostreptococcus; faringite, febre reumática e glomerulonefrite causada por infecção por Streptococcus pyogenes, Grupos C e G de Streptococcus, Clostridium diptheriae ou Actinobacillus haemolyticum; infecções das vias aéreas associadas à infecção por Mycoplasma pneumoniae,

Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, ou Chlamydia pneumoniae; infecções não-complexas da pele e tecidos moles, furúnculos,

osteomielite e febre puerperal associada à infecção por

Staphylococcus aureus, Staphylococcus positivo para coagulase (por exemplo, S. epidermidis, S. hemolyticus,

etc), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae,

grupos C-F de Streptococcus (Streptococcus de microcolónias), Viridans streptococcus, Corynebacterium minutissimum, género Clostridium, ou Bartonella henselae;

infecção do trato urinário aguda não-complexa; uretrite e cervicite associada à infecção por Staphylococcus saprophyticus ou género Enterococcus; e doença sexualmente transmissiva associada à infecção por Chlamydia trachomatis,

Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, ou Neiserria gonorrheae; doenças tóxicas associadas à infecção por S. aureus (intoxicação alimentar e síndrome de choque tóxico), estreptococos de grupos A, B e C; úlceras associadas à infecção por Helicobacter pylori; síndrome da febre sistémica associada à infecção por Borrelia recurrentis; doença de Lyme associada à infecção por Borrelia burgdorferi; conjuntivite, queratite e dacriocistite associada à infecção por Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H.

influenzae ou género Listeria; doença da síndrome de Mycobacterium avium difuso (MAC) associada à infecção por Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare; gastroenterite associada à infecção por Campylobacter jejuni; infecção dentária associada à infecção por Viridans streptococcus; tosse persistente associada à infecção por Bordetella pertussis; gangrena gasosa associada à infecção por Clostridium perfringens ou o género Bacteroides; e aterosclerose acompanhada por infecção por Helicobacter pylori ou Chlamydia pneumoniae. Em determinadas modalidades, a infecção bacteriana pode ser causada por, por exemplo, bactérias do género Escherichia, do género Listeria, do género Salmonella, ou do género Staphylococcus.

[00623] Em algumas modalidades, a doença infecciosa é uma doença infecciosa fúngica. Como usado nesse documento, uma “doença infecciosa fúngica” pode ser uma infecção causada por qualquer fungo que causa uma doença ou condição patológica no hospedeiro.

[00624] Exemplos de doenças infecciosas causadas por fungos incluem, mas não estão limitadas a, infecções fúngicas tópicas, mucosas e/ou sistémicas causadas por, por exemplo, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Coccidioides, Paracoccidioides, Histoplasma ou Blastomyces. Outros distúrbios associados a fungos exemplificativos incluem candidíase oral, candidíase vaginal, aspergilose, candidose, cromomicose, coccidioidiocicose, criptocococose, entomoftoromicose, linfangite epizoótica, geotricose, histoplasmose, mucormicose, micetoma, blastomicose da América do Norte, oomicose, pecilomicose, peniciliose, rinosporidiose, e esporotricose em animais (por exemplo, seres humanos).

[00625] Em algumas modalidades, a doença infecciosa é uma doença infecciosa parasítica. Como usado nesse documento, uma “doença infecciosa parasítica” pode ser uma infecção causada por quaisquer protozoários, helmintos ou ectoparasitas que causam uma doença ou condição patológica no hospedeiro.

[00626] Exemplos de protozoários que podem ser infecciosos para seres humanos incluem, mas não estão limitados a, Entamoeba; Giardia, Leishmania balantidium, Plasmodium, e Cryptosporidium.

[00627] Exemplos de helmintos que podem ser infecciosos a seres humanos incluem, mas não estão limitados a, Filariasis, Onchocerciasis, Ascariasis, Trichuriasis, Necatoriasis, Trichostrongyliasis, Dracunculiasis, Baylisascaris, Echinococcosis, Hymenolepiasis, Taeniasis, Cysticercosis, Coenurosis, Amphistomiasis, Clonorchiasis, Fascioliasis, Fasciolopsiasis, Opisthorchiasis, Paragonimiasis, Schistosomiasis e Bilharziasis.

[00628] Exemplos de ectoparasitas que podem ser infecciosos para seres humanos incluem, mas não estão limitados a, insetos (artrópodes de seis pernas) e aracnídeos (artrópodes de oito pernas).

Administração de CAR

[00629] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas isoladamente ou como uma composição farmacêutica descrita nesse documento (por exemplo, em combinação com diluentes e/ou com outros componentes, incluindo, sem limitação, IL-2 ou outras citocinas ou populações celulares).

[00630] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo de qualquer forma adequada, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas nesse documento podem ser administradas a um indivíduo por administração parenteral. Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas nesse documento podem ser administradas a um indivíduo por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, intraesternal, por injeção intravenosa (i.v.) injeção, por técnicas de infusão ou por via intraperitoneal.

Em modalidades em particular, as composições de células imunes modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo por injeção intradérmica ou subcutânea. Em algumas modalidades, as composições de células imunes modificadas por CAR da presente invenção podem ser administradas por injeção i.v. Em algumas modalidades, as composições de células imunes modificadas por CAR podem ser injetadas diretamente em um nódulo linfático, local de infecção, local de inflamação ou local de rejeição de tecido ou órgão. Em algumas modalidades, as composições de células imunes modificadas por CAR podem ser injetadas diretamente no local da doença autoimune e/ou inflamatória.

[00631] Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado (ou deve ser administrado) com células autólogas.

[00632] Em algumas modalidades, o indivíduo é administrado (ou deve ser administrado) com células alogênicas.

[00633] Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um mamífero. Em modalidades em particular, o indivíduo pode ser um ser humano.

[00634] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de uma forma apropriada para a doença a ser prevenida ou tratada. A quantidade e frequência de administração serão determinadas por fatores tais como a condição do indivíduo e o tipo e gravidade da doença do indivíduo, embora as dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.

[00635] Quando é indicada uma “quantidade eficaz” ou uma “quantidade terapêutica”, a quantidade precisa das composições da presente invenção a ser administrada pode ser determinada com a consideração de diferenças individuais em idade, peso, titulação de anticorpos, e condição do indivíduo. Em geral, pode ser afirmado que uma composição farmacêutica compreendendo as células imunes manipuladas por CAR como descrita nesse documento pode ser administrada em uma dosagem de pelo menos 1 x 102, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 ou 1 x 109 células/kg de peso corporal ou 1 x 105 a 100 x 105 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores de números inteiros contidos nessas faixas. As composições de células imunes manipuladas por CAR podem também ser administradas múltiplas vezes em qualquer uma destas dosagens ou em qualquer combinação das mesmas. As células imunes manipuladas por CAR podem ser administradas pelo uso de técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia. O regime ideal de dosagem e tratamento para um indivíduo em particular pode ser determinado pelo monitoramento do indivíduo para sinais de doença e pelo ajuste do tratamento de acordo com o mesmo.

[00636] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo juntamente com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo mas não limitado a tratamento com agentes tais como terapia antiviral, quimioterapia (isto é, um agente quimioterápico), agentes alquilantes, radiação, agentes imunossupressores, anticorpos, agentes imunoablativos, citocinas, irradiação e agentes anti-infecciosos.

[00637] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas juntamente com um agente quimioterápico.

Qualquer agente quimioterápico conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitados a, uma antraciclina (por exemplo,

doxorubicina (por exemplo, doxorrubicina lipossômica)), um alcaloide vinca (por exemplo, vimblastina, vincristina, vindesina, ou vinorelbina), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, dacarbazina, melfalano, ifosfamida, ou temozolomida), um anticorpo de célula imune (por exemplo, alemtuzamab, gemtuzumab, rituximab, ofatumumab, tositumomab, ou brentuximab), um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase (por exemplo, fludarabina)), um inibidor de mTOR, um agonista de proteína relacionada a TNFR induzida por glicocorticoide TNFR (GITR), um inibidor de proteassomo (por exemplo,, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomibe), um imunomodulador tal como talidomida ou um derivado de talidomida (por exemplo, lenalidomida).

[00638] Outros agentes quimioterápicos considerados para uso em terapias de combinação da invenção incluem, mas não estão limitados a, anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), bussulfano (Myleran®), injeção de bussulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4-pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorcitidina, carboplatina (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucil (Leukeran®), cisplatina (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® ou Neosar®), citarabina, citosina arabinosida (Cytosar-U®), injeção de lipossomo de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC- Dome®), dactinomicina (Actinomicyn D, Cosmegan), cloridrato de daunorrubicina (Cerubidine®), injeção de citrato de daunorrubicina lipossomal (DaunoXome®), dexametasona, docetaxel (Taxotere®), cloridrato de doxorubicina (Adriamycin®, Rubex®), etoposide (Vepesid®), fludarabina fosfato (Fludara®), 5-fluorouracil (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gencitabina (difluorodesoxicitidina), hidroxiuréia (Hydrea®), Idarrubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecano (Camptosar®), L-asparaginase (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalano (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®), mitoxantrona (Novantrona®), milotarg, paclitaxel (Taxol®), Phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosana 20 com implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), teniposida (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), cloridrato de topotecana para injeção (Hycamptin®), vimblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), e vinorelbina (Navelbine®).

[00639] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo antes, após ou concomitantemente com o agente quimioterápico.

[00640] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas juntamente com um agente de alquilação.

Qualquer agente de alquilação conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de agentes de alquilação incluem, sem limitação, mostardas de nitrogénio, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila, nitrosoureias e triazenos, mostarda de uracila (Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, and Uramustine®), clormetina (Mustargen®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, e Revimmune™), ifosfamida (Mitoxana®), melfalano (Alkeran®), Clorambucil (Leukeran®), pipobromano (Amedel®, Vercyte®), trietileno melamina (Hemel®, Hexalen® e Hexastat®), trietilenotiofosforamina, Temozolomida (Temodar®), tiotepa (Thioplex®), bussulfano (Busilvex® e Myleran®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CeeNU®), estreptozocina (Zanosar®) e dacarbazina (DTIC- Dome®). Agentes alquilantes exemplificativos adicionais incluem, sem limitação, oxaliplatina (Eloxatin®); temozolomida (Temodar® e Temodal®); dactinomicina (também conhecida como actinomicina-D, Cosmegen®); melfalano (também conhecido como L-PAM, L-sarcolisina, e mostarda de fenilalanina, Alkeran®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Carmustina (BiCNU®); Bendamustina (Treanda®); Bussulfano (Busulfex® e Myleran®); Carboplatina (Paraplatin®); Lomustina (também conhecida como CCNU, CeeNU®); cisplatina (Também conhecida como CDDP, Platinol® e Platinol®-AQ); Clorambucil (Leukeran®); ciclofosfamida (Cytoxan® e Neosar®); dacarbazina (também conhecida como DTIC, DIC e imidazol carboxamida, DTIC- Dome®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), Hexalen®); Ifosfamida (Ifex®); Prednumustina; Procarbazina (Matulane®); Mecloretamina (também conhecida como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridrato de mecloretamina, Mustargen®); estreptozocina (Zanosar®); Tiotepa (também conhecido como tiofosfamida, TESPA e TSPA, e Tioplex ®); Ciclofosfamida (Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, e Revimmune ®); e Bendamustina HC1 (Treanda®).

[00641] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo antes, após ou concomitantemente com o agente alquilante.

[00642] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas juntamente com um agente imunossupressor.

Qualquer agente imunossupressor conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de agentes imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, ciclosporina, azatioprina, metotrexato, metoxsaleno, rapamicina, micofenolato mofetil,

ácido micofenólico, rituximab, sirolimus, basiliximab, daclizumab, muromonab-CD3, tacrolimus, glicorticoesteroides, esteroides adrenocorticais tais como prednisona e prednisolona, e qualquer combinação dos mesmos.

[00643] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo antes, depois ou concomitantemente com o agente imunossupressor.

[00644] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção e/ou o(s) agente(s) imunossupressor(es) podem ser administrados ao indivíduo após o transplante.

Alternativamente, ou adicionalmente, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção e/ou o(s) agente(s) imunossupressor(es) podem ser administrados ao indivíduo antes do transplante. Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção e/ou o(s) agente(s) imunossupressor(es) podem ser administrados ao indivíduo durante a cirurgia de transplante.

[00645] Em algumas modalidades, a administração de células imunes manipuladas por CAR ao indivíduo é realizada uma vez que a terapia imunossupressora tenha sido iniciada.

[00646] Em algumas modalidades, o método é realizado mais de uma vez, por exemplo, para monitorar o receptor de transplante ao longo do tempo, e, se aplicável, em diferentes regimes de terapia imunossupressora.

[00647] Em algumas modalidades, a terapia imunossupressora é reduzida se for previsto que o receptor de transplante será tolerante ao transplante. Em algumas modalidades, não é prescrita nenhuma terapia imunossupressora, por exemplo, a terapia imunossupressora é interrompida, se for previsto que o receptor de transplante será tolerante ao transplante.

[00648] As células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas após um diagnóstico de rejeição de órgão ou tecido de transplante seguido por doses de tanto as células imunes manipuladas por CAR da invenção quanto agente(s) imunossupressor(es) até que os sintomas de rejeição de órgão ou tecido diminuam.

[00649] Em uma outra modalidade, as composições de células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas a um indivíduo juntamente com (por exemplo, antes, em simultâneo com ou após) um transplante de medula óssea.

[00650] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas após a terapia ablativa de células B tais como agentes que reagem com CD20, por exemplo, rituximab. Por exemplo, em algumas modalidades, os indivíduos podem ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia de dosagem elevada seguido por transplante de células tronco de sangue periférico. Em determinadas modalidades, após o transplante, os indivíduos podem receber uma infusão das células imunes manipuladas por CAR expandidas da presente invenção. Em determinadas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR podem ser administradas antes ou após a cirurgia.

[00651] Em algumas modalidades, as células imunes manipuladas por CAR da presente invenção podem ser administradas juntamente com um agente anti-infeccioso.

Qualquer agente anti-infeccioso conhecido na técnica pode ser usado. Exemplos de agentes anti-infecciosos incluem, mas não estão limitados a, amebicidas, aminoglicosídeos, anti- helmínticos, antiparasitários, antifúngicos (antifúngicos azóis, equinocandinas, outros antifúngicos e polienos), agentes antimalária (combinações antimalária, quinolinas antimalária, e outros antimalariais), agentes antituberculose (aminossalicilatos, combinações antituberculose, diarilquinolinas, derivados de hidrazida, outros agentes antituberculose, derivados de ácido nicotínico, derivados de rifamicina e derivados de Streptomyces), agentes antivirais (antivirais de adamantano, reforçadores antivirais, combinações antivirais, interferons antivirais, antagonistas do receptor de quimiocina, inibidor de transferência de fita de integrase, outros antivirais, inibidores de neuraminidase, NNRTIs, inibidores de NS5A, inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo (NRTIs),

inibidores de protease, e nucleosídeos purina), carbapenens, inibidores de carbapenens/beta-lactamase, cefalosporinas (inibidores de cefalosporinas/beta-lactamase, cefalosporinas de primeira geração, cefalosporinas de quarta geração, cefalosporinas de próxima geração, cefalosporinas de segunda geração, e cefalosporinas de terceira geração), antibióticos, antibióticos de glicopeptídeos, glicilciclinas, leprostáticos, derivados de lincomicina derivados de macrolídeos (cetolídeos e macrolídeos), outros antibióticos, antibióticos de oxazolidinona, penicilinas (aminopenicilinas, penicilinas antipseudomonais, inibidores de beta-lactamase, penicilinas naturais, penicilinase e penicilinas resistentes), quinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas e anti-infecciosos urinários.

[00652] Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) recebe uma administração inicial de uma célula ou população imune da invenção, e uma ou mais administrações subsequentes, em que as uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos do que 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ou 2 dias após a administração prévia.

[00653] Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células imunes da invenção é administrada ou é para ser administrada ao indivíduo.

[00654] Em algumas modalidades, o número de células imunes da população de células imunes da invenção administrada ao indivíduo é pelo menos de 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células.

[00655] Em algumas modalidades, o número de células imunes da população de células imunes da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 102 a cerca de 109, de cerca de 103 a cerca de 108, de cerca de 104 a cerca de 107, ou de cerca de 105 a cerca de 106 células.

[00656] Em algumas modalidades, o número de células imunes da população de células imunes da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 102 a cerca de 109, de cerca de 102 a 108, de cerca de 102 a 107, de cerca de 102 a 106, de cerca de 102 a 105, de cerca de 102 a 104, ou de cerca de 102 a 103 células. Em algumas modalidades, o número de células imunes da população imune da invenção administrada ao indivíduo é de cerca de 102, cerca de 103, cerca de 104, cerca de 105, cerca de 106, cerca de 107, cerca de 108 ou cerca de 109 células.

[00657] Em algumas modalidades, o número de células imunes da população de células imunes da invenção administrada ao indivíduo é pelo menos 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 ou 109 células/kg de peso corporal.

[00658] Em algumas modalidades, o número de células imunes da população de células imunes da invenção administrada ao indivíduo varia de cerca de 102 a 109 células/kg de peso corporal ou 103 a 108 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores de números inteiros dentro dessas faixas.

[00659] Em algumas modalidades, o indivíduo recebe mais do que uma administração da população de células imunes da invenção por semana, por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações de uma população de células Treg da invenção administrada por semana ao indivíduo.

[00660] Em algumas modalidades, a população de células Treg é administrada ao indivíduo em necessidade da mesma em combinação com um agente ativo. De acordo com algumas modalidades, a população de células imunes é administrada antes, ao mesmo tempo, ou após a administração de um agente ativo.

[00661] Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar as células imunes ativadas da invenção a um indivíduo e subsequentemente voltar a realizar a coleta de sangue (ou realizar uma aférese), ativar as células imunes do mesmo de acordo com a presente invenção, e reinfundir o indivíduo com estas células imunes ativadas e expandidas.

Este processo pode ser realizado várias vezes de algumas em algumas semanas. Em determinadas modalidades, as células imunes podem ser ativadas a partir de coletas de sangue de 10 cc a 400 cc. Em determinadas modalidades, as células imunes são ativadas a partir de coletas de sangue de 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc ou 100 cc.

Não querendo estar limitado à teoria, o uso deste protocolo de múltiplas coletas/múltiplas reinfusões pode servir para eliminar determinadas populações de células imunes.

[00662] É entendido que os CARs, populações de células e composições descritas nesse documento podem ser usados em um método de tratamento como descrito nesse documento, podem ser usados como um medicamento como descrito nesse documento, podem ser usados em um tratamento como descrito nesse documento, e/ou podem ser usados na fabricação de um medicamento para um tratamento como descrito nesse documento.

Artigos de Fabricação e Kits

[00663] A presente invenção também fornece artigos de fabricação compreendendo qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores, populações de células, ou composições descritas nesse documento, bem como métodos para a fabricação dos referidos artigos.

[00664] Além disso, a presente invenção fornece kits compreendendo em um recipiente adequado qualquer um dos ácidos nucleicos, vetores, populações de células, ou composições descritas nesse documento.

Modalidades

[00665] As modalidades em particular da invenção são listadas abaixo:

1. Um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana,  pelo menos um domínio intracelular, em que o pelo menos um domínio intracelular compreende opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário, e em que  o pelo menos um domínio transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, e/ou  o pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo ou qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo ou uma combinação dos mesmos, e em que pelo menos um de entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo ou um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

2. O CAR de acordo com a modalidade 1, em que o referido domínio transmembrana de TNFR2 humano compreende pelo menos 2 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 22, preferivelmente pelo menos 2 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 22.

3. O CAR de acordo com a modalidade 1 ou modalidade 2, em que o referido domínio transmembrana de TNFR2 humano é combinado com pelo menos um outro domínio transmembrana.

4. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 3, em que o referido domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano compreende pelo menos 2 aminoácidos da sequência de SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70%

de identidade com a SEQ ID NO: 34, preferivelmente pelo menos 2 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 34.

5. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 4, em que o referido domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 é combinado com pelo menos um outro domínio de sinalização intracelular coestimulador.

6. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 5, em que o domínio de sinalização intracelular primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário de célula imune, preferivelmente um domínio de sinalização intracelular primário de célula T de CD3 humano, mais preferivelmente um domínio de sinalização intracelular primário de células T de CD3 zeta humano tendo uma sequência das SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID: 28, 29, 30 ou 31.

7. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 6, em que o domínio de dobradiça é uma região de dobradiça de CD8 humano, preferivelmente da SEQ ID NO: 14 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 14.

8. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 7, em que o CAR compreende pelo menos um domínio transmembrana de TNFR2 e pelo menos um domínio intracelular, em que o referido domínio intracelular compreende opcionalmente pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de células imunes.

9. O CAR de acordo com qualquer uma das modalidades de 1 a 7, em que o CAR compreende pelo menos um domínio transmembrana e pelo menos um domínio intracelular, em que o referido domínio intracelular compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de células imunes.

10. Uma sequência de ácido nucleico que codifica o CAR de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9.

11. Um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico de acordo com a modalidade 10.

12. Uma população de células imunes compreendendo a sequência de ácido nucleico da modalidade 10, ou o vetor da modalidade 11, ou que expressa um CAR de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 9.

13. A população de células imunes, de acordo com a modalidade 12, em que a referida população de células imunes é selecionada a partir do grupo compreendendo células T, células exterminadoras naturais (NK), células T 𝛾δ, células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias, células imunes efetoras, células T efetoras, células B e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas.

14. Uma composição compreendendo pelo menos uma população de células de acordo com qualquer uma das modalidades de 12 a 13.

15. A composição de acordo com a modalidade 14, sendo uma composição farmacêutica e compreendendo ainda pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

16. Um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração a um indivíduo de pelo menos uma população de células imunes de acordo com as modalidades 12 ou 13 ou uma composição de acordo com as modalidades 14 ou 15.

17. O método de acordo com a modalidade 16, em que o referido método é um método de terapia celular.

18. O método de acordo com as modalidades 16 ou 17, em que a referida doença ou distúrbio inclui doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças alérgicas,

condições de transplante de órgãos, cânceres e doenças infecciosas.

19. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 18, em que a população de células imunes é uma população de células imunes regulatórias, ou uma população de células Treg e em que a referida doença ou distúrbio é uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, ou uma condição de transplante de órgão, preferivelmente selecionada a partir de rejeição de enxerto e doença enxerto contra hospedeiro.

20. O método de acordo com qualquer uma das modalidades 16 a 18, em que a população de células imunes é uma população de células efetoras T, uma população de células NK ou uma população de células 𝛾δ e em que a referida doença ou distúrbio é um câncer ou uma doença infecciosa.

[00666] A presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo:  pelo menos um domínio de ligação extracelular,  opcionalmente pelo menos um domínio de dobradiça extracelular,  pelo menos um domínio transmembrana (por exemplo, um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, qualquer domínio transmembrana ou um fragmento ou variante do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos), e  pelo menos um domínio intracelular (compreendendo pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário e opcionalmente compreendendo pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo, em que o pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, qualquer domínio de sinalização intracelular coestimulador ou um fragmento ou variante do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos), em que o domínio transmembrana é um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo, e/ou o domínio de sinalização intracelular coestimulador é um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo.

[00667] Em algumas modalidades, o referido domínio ou fragmento transmembrana de TNFR2 humano ou fragmento ou variante do mesmo compreende pelo menos 2 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 2 aminoácidos contíguos) da sequência de SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 22.

[00668] Em algumas modalidades, o referido domínio ou transmembrana de TNFR2 humano ou fragmento ou variante do mesmo é combinado com pelo menos um outro domínio transmembrana ou fragmento ou variante do mesmo.

[00669] Em algumas modalidades, o referido domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou variante ou fragmento do mesmo compreende pelo menos 2 aminoácidos (por exemplo, pelo menos 2 aminoácidos contíguos) da sequência de SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO:

34.

[00670] Em algumas modalidades, o referido domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 ou variante ou fragmento do mesmo é combinado com pelo menos um outro domínio de sinalização intracelular coestimulador ou fragmento ou variante do mesmo.

[00671] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular primário compreende um domínio de sinalização intracelular primário de células imunes. Em determinadas modalidades, o domínio de sinalização intracelular primário é um domínio de sinalização intracelular primário de células T de CD3 humano. Em modalidades em particular, o domínio de sinalização intracelular primário é um domínio de sinalização intracelular primário de célula T de CD3 zeta humano tendo uma sequência da SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31 ou uma sequência tendo pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID: 28, 29, 30 ou 31.

[00672] Em algumas modalidades, o domínio de dobradiça é uma região de dobradiça de CD8 humano, preferivelmente a SEQ ID NO: 14 ou uma sequência que tem pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 14.

[00673] Em algumas modalidades, o CAR compreende pelo menos um domínio transmembrana de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo, e pelo menos um domínio intracelular, em que o referido domínio intracelular compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de células imunes e opcionalmente compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador.

[00674] Em algumas modalidades, o CAR compreende pelo menos um domínio transmembrana e pelo menos um domínio intracelular, em que o referido domínio intracelular compreende pelo menos um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 ou um fragmento ou variante do mesmo e pelo menos um domínio de sinalização intracelular primário de células imunes.

[00675] A presente invenção se refere ainda a uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR de acordo com a presente invenção.

[00676] A presente invenção se refere ainda a um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[00677] A presente invenção se refere ainda a uma população de células imunes compreendendo a sequência de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ou o vetor de acordo com a presente invenção, ou expressando um CAR de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, a população de células imunes é selecionada a partir do grupo consistindo em células T, células exterminadoras naturais (NK), células T 𝛾δ, células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias, células imunes efetoras, células T efetoras, células B e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas.

[00678] A presente invenção se refere ainda a uma composição compreendendo pelo menos uma população celular de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica e compreende ainda pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00679] A presente invenção se refere ainda a um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo em necessidade do mesmo, compreendendo a administração a um indivíduo de pelo menos uma população ou composição celular de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o método é um método de terapia celular. Em algumas modalidades, as referidas doenças ou distúrbios incluem doenças inflamatórias, doenças autoimunes, doenças alérgicas, condições de transplante de órgãos, cânceres e doenças infecciosas. Em algumas modalidades, a população celular é uma população de células imunes regulatórias ou uma população de células Treg, e a referida doença ou distúrbio é uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, ou uma condição de transplante de órgão (por exemplo, rejeição de enxerto ou doença de enxerto contra hospedeiro). Em algumas modalidades, a população de células imunes é uma população de células efetoras T, uma população de células NK ou uma população de células 𝛾δ e a referida doença ou distúrbio é um câncer ou uma doença infecciosa.

[00680] A menos que seja de outra forma definido nesse documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente descrição devem ter os significados que são comumente entendidos por aqueles versados na técnica. Os métodos e materiais exemplificativos são descritos abaixo, embora também possam ser usados métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse documento na prática ou testagem da presente descrição. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, irá controlar. Geralmente, a nomenclatura usada em conexão com, e as técnicas de, cultura celular e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética, química analítica, química orgânica sintética, química medicinal e farmacêutica, e química de proteína e de ácido nucleico e hibridização descritas nesse documento são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica ou como descrito nesse documento. Além disso, a menos que de outra forma exigido pelo contexto, os termos singulares devem incluir as pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Em todo este relatório descritivo e modalidades, será entendido que as palavras “ter” e “compreender” ou variações tais como “tem”, “tendo”, “compreende” ou “compreendendo”, implicam a inclusão de um número inteiro especificado ou grupo de números inteiros mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. É para ser entendido que aspectos e variações da invenção descritas nesse documento incluem os aspectos e as variações de “consistindo em” e “consistindo essencialmente em”. Todas as publicações e outras referências mencionadas nesse documento são incorporadas por referência em sua totalidade. Embora vários documentos sejam citados nesse documento, esta citação não constitui uma admissão de que qualquer um desses documentos forma parte do conhecimento geral comum na técnica.

EXEMPLOS

[00681] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1: CAR-Tregs derivadas de TNFR2 Materiais e Métodos Isolamento de PBMC

[00682] As células sanguíneas de doadores saudáveis anónimos foram coletadas pelo Etablissement Français du Sang (EFS) seguindo as diretrizes EFS e com o consentimento informado dos doadores. No dia após a coleta de sangue, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas da capa leucocitária por centrifugação de gradiente de Ficoll, que permite a remoção de frações indesejadas de produto sanguíneo tais como granulócitos, plaquetas e contaminantes de glóbulos vermelhos remanescentes. As células de interesse foram então isoladas como descrito abaixo.

Isolamento de FoxP3 Treg

[00683] Tregs CD4+CD25+CD127low foram isolados usando o kit de isolamento de células T regulatórias CD4+CD127lowCD25+ humanas (StemCell), seguindo as instruções do fabricante.

Resumidamente, as células CD25+ foram primeiramente isoladas de 400-500 x 106 PBMC por seleção positiva imunomagnética, isenta de coluna, usando EasySep™ Releasable RapidSpheres™.

Então, as partículas magnéticas ligadas foram removidas das células CD25+ isoladas por EasySep™, e as não-Tregs indesejadas foram alvejadas para o esgotamento. A fração isolada final continha células CD4+CD127lowCD25+ altamente purificadas expressando níveis elevados de FoxP3 e foram usadas imediatamente para aplicações a jusante.

Isolamento de células B autólogas

[00684] As células B CD19+CD20+ autólogas foram isoladas usando o kit de isolamento de células B humanas (StemCell) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, as células B CD19+CD20+ foram isoladas de 200 x 106 PBMC por seleção negativa imunomagnética. Após o isolamento, as células foram congeladas imediatamente para uso posterior como células apresentando CD19+CD20+.

Isolamento de células T convencionais CD4+CD25-

[00685] As células T CD4+CD25- foram isoladas pela realização do protocolo opcional do kit de isolamento de células T regulatórias (StemCell) permitindo o isolamento de células T CD4+CD25- para uso em estudos funcionais em paralelo com Tregs.

Ativação e cultura de Tregs isoladas

[00686] As células Treg isoladas foram ativadas e cultivadas por 9 dias. Resumidamente, no dia 0, as células Treg (0,5 x 106) foram cultivadas em placas de 24 poços (Costar) em meio livre de soro Xvivo15 contendo transferrina humana (OZYME) e suplementada com 1000 U/mL de IL-2 (Eurmedex) e 100 nM de rapamicina (Sigma-Aldrich). A ativação policlonal foi realizada com Dynabeads anti-CD3/anti-CD28 da Life Technology (0,5 x 106 grânulos por poço). Nos dias 2, 4 ou 5, e 7 ou 8, as células foram alimentadas com meio de cultura novo suplementado com 1000 U/mL de IL-2. Finalmente, no dia 8 ou 9, as células foram recuperadas, contadas e reativadas.

Protocolo de transdução

[00687] As Tregs foram transduzidas com um receptor de antígeno quimérico (ver abaixo) 2 dias após a sua ativação.

Resumidamente, a transdução foi realizada pelo carregamento de 0,5xl07 Unidades de Transdução (TU) por mL em cada poço.

Após 6 horas a 37° C, as partículas virais foram removidas por lavagem. As placas foram então incubadas a 37° C com CO2 a 5%. Após cinco dias, a eficiência de transdução foi analisada por medição da porcentagem de células GFP positivas em citometria de fluxo.

Quantificação da expressão de CAR

[00688] A quantificação da expressão de CAR na superfície celular foi realizada pela marcação do CAR com proteína L conjugada com APC ou com anticorpo anti- hemaglutinina (HA) conjugado com APC para CARs marcados com HA, e analisadas usando a citometria de fluxo.

[00689] A quantificação da expressão total de CAR foi realizada por análise Western blot. Resumidamente, as Tregs transduzidas ou Tregs não-transduzidas (“em branco”) foram lisadas em tampão RIPA, submetidas a SDS-PAGE em condições de desnaturação, e colocados em uma membrana PVDF. Então, o CD3𝜁 expresso por CAR bem como o CD3 𝜁 endógeno foram corados com anticorpo específico de CD3𝜁 (anti-CD247, BD Pharmingen). Finalmente, a membrana foi lavada e sondada mais uma vez com anticorpo β-actina como controle de carga.

Um software Image J foi usado para quantificar a intensidade da banda.

Construções de CAR usados para transdução

[00690] Os CARs compostos pelos domínios transmembrana (TM) e domínios de sinalização intracelular coestimuladores de TNFR2, TNFR1 ou CD8 juntamente com CD3𝜁 e associados a um scFv prototípico direcionado contra CD19 (FMC63), CD20 (B9E9), e/ou IL-23R (14-11-D07; Publicação de Patente PCT WO 2016/184570; SEQ ID NO: 65) foram concebidos. As construções usadas neste estudo são listados e descritos na Tabela 1 e na Figura 1.

Tabela 1: Construções de CAR Domínio de sinalização Nome do CAR scFv TM CD3𝜁 intracelular coestimulador CD19-CAR (CD8TM/4-1BB) FMC63 CD8 4-1BB SIM CD19-CAR (TNFR2) FMC63 TNFR2 TNFR2 SIM CD20-CAR (CD8TM/4-1BB) B9E9 CD8 4-1BB SIM CD20-CAR (TNFR2) B9E9 TNFR2 TNFR2 SIM CD20-CAR (TNFR1) B9E9 TNFR1 TNFR1 SIM

IL-23R-CAR (CD8TM/4- 14-11- CD8 4-1BB SIM 1BB) D07 14-11- IL-23R-CAR (TNFR2) TNFR2 TNFR2 SIM D07

[00691] Mais precisamente, os CARs anti-CD19 são compostos da sequência líder CD8 humana (aa1-22), um marcador de Hemaglutinina, o scFv FMC63 direcionado contra CD19 humano, e um ligante derivado de CD8 alfa humano (aa138- 182).

[00692] Seguindo o ligante, a construção de CD19-CAR (CD8TM/4-1BB) é composta pelo domínio transmembrana (TM) de CD8 alfa humano (aa183-206) e pelo domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB humano (aa214-255) e CD3 zeta humano (aa52-164); enquanto que a construção de CD19- CAR (TNFR2) é composta pelo domínio TM e intracelular de TNFR2 humano (aa258-461) e CD3 zeta.

[00693] Os CARs anti-CD20 são compostos pela sequência líder CD8 humana (aa1-22), o scFv B9E9 direcionado contra CD20 humano, um marcador de estreptavidina, e um ligante derivado de CD8 alfa humano (aa138-182).

[00694] Seguindo o ligante, a construção de CD20-CAR (CD8TM/4-1BB) é composta pelo domínio TM de CD8 alfa humano (aa183-206) e a sinalização intracelular coestimuladora de 4-1BB humano (aa214-255) e CD3 zeta humano (aa52-164); enquanto:

 a construção de CD20-CAR (TNFR2) é composta pelos domínios TM e domínios de sinalização intracelular de TNFR2 humano (aa258-4661) e CD3 zeta humano; e  o CD20-CAR (TNFR1) é composto pelos domínios TM e domínios de sinalização intracelular de TNFR1 humano (aa212-455) e CD3 zeta humano.

[00695] Os CARs anti-IL-23R são compostos pela sequência líder CD8 humana (aa1-22), um scFv direcionado contra IL-23R humano, e um ligante derivado de CD8 alfa humano (aa138- 182).

[00696] Seguindo o ligante, a construção de IL-23R-CAR (CD8TM/4-1BB) é composta pelo domínio transmembrana de CD8 alfa humano (aa183-206) e pelo domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB humano (aa214-255) e CD3 zeta humano (aa52-164); enquanto que a construção de IL-23R- CAR (TNFR2) é composta pelos domínios transmembrana e de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano (aa258-461) e CD3 zeta humano.

[00697] Todos as construções de CAR são clonadas em fase com um ligante P2A e com o quadro de leitura aberta da proteína fluorescente verde (GFP) intensificada.

Análise de fenótipo de Treg transduzidas

[00698] No dia 9 da cultura, o fenótipo Treg foi analisado por citometria de fluxo, para assegurar que o procedimento de transdução não impactou o estado de Treg. Os marcadores usados para esta análise são listados na Tabela

2.

Tabela 2: Materiais e reagentes Reagentes Fabricante Cat. No.

CD4 VioGreen Miltenyi 130-096-900 Helios eF450 (HamIgG) eBioscience 48-9883-42 CD25 PE Miltenyi 130-109-020 CD152 (CTLA-4) PE/Cy7 Biolegend 369614 (mIgG2a) FoxP3 AF647 (mIgG1; 2 µl) BD 560045 CD127-APC-Vio770 Miltenyi 130-109-438 Ensaio de ativação de CARs

[00699] A ativação de CAR foi avaliada quer na linhagem de células Jurkat-Lucia-NFAT (Invivogen) ou em Tregs primárias humanas. Para a linhagem de células repórter, após o engajamento de CAR com células Daudi CDl9+ (proporção 1:1), a ativação NFAT foi avaliada pelo monitoramento da atividade de luciferase de Lucia (ver instruções do fabricante) e usando um luminômetro GloMax (Promega).

[00700] Para as Tregs, o ensaio de ativação foi realizado no dia 9 da cultura. Resumidamente, 0,05 x 106 Tregs foram semeadas em uma placa de fundo em U de 96 poços isoladamente ou na presença de grânulos revestidos com anti-CD28/anti-CD3 (em uma proporção de Treg para grânulos de 1:1), ou na presença de células B autólogas recentemente descongeladas ou células B Daudi CDl9+ (em uma proporção de Treg para células B de 1:1) em um volume final de 200 µL. Depois de 24h a 37° C, 5% de CO2, as células foram coradas para CD4 e CD69 e então analisadas usando a citometria de fluxo. O monitoramento da expressão espontânea de CD69 por células CAR Treg em comparação com as células Treg não-transduzidas permite a determinação da intensidade de sinalização tônica.

Análise de supressão de proliferação de células T

[00701] O ensaio de supressão foi realizado no dia 9 da cultura. Resumidamente, as Tregs foram recuperadas, contadas e ativadas quer através do TCR usando grânulos revestidos de anti-CD28/anti-CD3 (em uma proporção de 1:1 de Treg para grânulos), ou através do CAR usando células B autólogas recentemente descongeladas (em uma proporção de 1:1 de Treg para grânulos), ou mantidas sem ativação para avaliar a sua atividade supressora espontânea.

[00702] Em paralelo, Tconvs alogênicas (células T convencionais) foram descongeladas, coradas com Dye 450 e ativadas com grânulos revestidos com anti-CD28/anti-CD3 (em uma proporção de 3:1 de Tconv para grânulos). No dia seguinte, os grânulos foram removidas das Tconvs antes da co-cultura das mesmas com Tregs inativadas ou ativadas (não- transduzidas ou transduzidas).

[00703] No dia 3, as células foram colhidas e a proliferação de Tconvs foi avaliada por citometria de fluxo através da determinação da diluição do Dye 450. A porcentagem de inibição da proliferação de Tconv foi calculada como se segue: Resultados Eficiência de transdução e expressão de CAR na superfície celular

[00704] A eficiência de transdução foi determinada pela avaliação da porcentagem de células GFP positivas, e a expressão de CAR foi monitorada pela avaliação da proteína L recombinante, uma proteína de ligação de cadeia leve de imunoglobulina kappa para CD20-CAR (CD8TM/4-1BB e TNFR2) e IL-23R CAR (CD8TM/4-1BB e TNFR2), ou um anticorpo direcionado contra marcador HA para CD19-CAR (CD8TM/4-1BB e TNFR2).

[00705] Os resultados para a percentagem de eficiência de transdução e a percentagem de células transduzidas que expressaram o CAR na superfície celular são mostrados na Tabela 3 (a Figura 2 mostra um exemplo de dados brutos), como uma visão geral de todos os doadores testados neste Exemplo (n=5).

Tabela 3: Eficiência de transdução e expressão de CAR na superfície celular CD19-CAR CD19- CD20-CAR CD20- IL-23R-CAR IL-23R- Construções (CD8TM/ CAR (CD8TM/ CAR (CD8TM/ CAR de CAR 4-1BB) (TNFR2) 4-1BB) (TNFR2) 4-1BB) (TNFR2) 6 6 6 6 TU/mL para 5x10 2x10 2x10 5x10 transdução % de eficiência 71.4 ± 65.3 ± 66 ± 47.2 ± 62 ± 2,7 54.4 ± 7.7 de 2.4 2.0 0.1 4.1 transdução % de expressão

96.2 ± 46.8 ± 74.3 ± 74.1 ± de CAR na 98 ± 0.1 97.2 ± 1.4

0.15 2.5 8 8.9 superfície celular

47.9 ± 3.2 ± 92.5 ± 16.5 ± 191.1 ± 20.5 ± MFI do CAR

0.3 0.4 13.5 6.4 53.2 3.4

[00706] Como mostrado na Figura 2 e/ou na Tabela 3, as células transduzidas por CD19-CAR (CD8TM/4-1BB), CD20-CAR (CD8TM/4-1BB), e IL-23R-CAR (CD8TM/4-1 BB), mantiveram mais de 95 % do CAR na superfície celular, enquanto que as células transduzidas por CD19-CAR (TNFR2), CD20-CAR (TNFR2), e IL- 23R-CAR (TNFR2) expressaram 46% a 75% do CAR na superfície celular. Além disso, a intensidade média de fluorescência (MFI) representando o número de CARs por célula foi diminuída cerca de 15 vezes para CD19-CAR (TNFR2), cerca de 6 vezes para CD20-CAR (TNFR2) e cerca de 9 vezes para IL-23R-CAR (TNFR2). Este forte decréscimo da expressão de CAR na superfície celular não foi a consequência da eficiência de transdução mais baixa uma vez que a expressão de GFP foi comparável em todas as condições experimentais.

[00707] Além disso, como mostrado na Figura 3, Quadro A, as células transduzidas com CD20-CAR (CD8TM/4-1BB) expressaram uma proteína de 62 kD correspondendo ao CAR após a coloração com anticorpo CD3𝛇 e uma proteína de 82 kD para células transduzidas com CD20-CAR (TNFR2), enquanto que as células não-transduzidas foram marcadas apenas com uma banda em l6kD correspondente ao CD3𝛇 endógeno. De forma interessante, a quantificação da intensidade da banda revelou uma expressão mais baixa de CD20-CAR (TNFR2) comparada com CD20-CAR (CD8TM/4-1BB) (Figura 3, Quadro B) como observado usando a citometria de fluxo (Figura 2).

Resumidamente, os resultados demonstraram que o domínio intracelular de TNFR2 e o domínio transmembrana de TNFR2 levaram, surpreendentemente, a uma expressão global reduzida do CAR, especialmente na superfície celular.

Ativação específica ao CAR

[00708] Uma redução completa de sinalização tônica independente de antígeno é observada em células Treg transduzidas com CARs compreendendo domínios de TNFR2 para os três diferentes alvos de scFv (CD19, CD20 e IL-23R) em comparação com as construções clássicas 4-1BB/CD3𝛇 (Figura 4, Quadros A-C). Além disso, apesar de existir uma forte redução na expressão de CAR derivada de TNFR2 (CD19, CD20 ou IL-23 R) na superfície celular (Tabela 3), a ativação específica ao CAR é mantida.

[00709] Assim, estes resultados demonstram que a presença de um domínio transmembrana de TNFR2 e um domínio intracelular TNFR2 levou, surpreendentemente, a uma forte redução do fundo de ativação em células CAR Treg e consequentemente aumentou a proporção entre a ativação específica ao CAR e a sinalização tônica independente de ligante. Este fenómeno é independente do scFv de interesse uma vez que foram testados três scFvs diferentes e que se comportaram da mesma forma (CD19, CD20 e IL-23R).

Atividade supressora mediada por CAR

[00710] Para a construção de CD19-CAR abrigando domínios derivados de TNFR2, foi observado um desencadeamento específico ao CAR da atividade supressora comparável àquele da construção derivado de 4-1BB mesmo com uma diminuição em 15 vezes da expressão CAR na superfície celular (Figura 5, Quadro A).

[00711] Mais interessante, no caso das construções de CD20-CAR e IL-23R-CAR, enquanto a atividade supressora espontânea da construção derivado de 4-1BB foi muito forte para realçar uma atividade supressora mediada por CAR, a construção de CAR derivado de TNFR2 forneceu um fundo fortemente reduzido de atividade supressora que, pela primeira vez, permitiu a observação de uma atividade supressora específica mediada por CAR (Figura 5, Quadros B e 5C).

[00712] Em conclusão, a redução da sinalização tônica independente do ligante em um CAR derivado de TNFR2/CD3𝛇 permitiu a observação pela primeira vez, de atividade supressora mediada por CD20-CAR e IL-23R-CAR, enquanto que os mesmos scFvs fundidos a um domínio de 4-1BB/CD3𝛇 não tiveram atividade observável sobre o fundo.

Exemplo 2: Comparação de CD19-CARs derivados de TNFR2 Materiais e Métodos

[00713] Exceto as construções de CAR, os Materiais e Métodos são os mesmos que aqueles descritos no Exemplo 1.

Aqui, dois tipos de células foram transduzidas com construções de CAR: Tregs humanas e células Jurkat-Lucia- NFAT.

Construções de CAR usados para transdução

[00714] As construções de CAR usadas neste estudo são listados e descritos na Tabela 4 e na Figura 6.

Tabela 4: Construções de CD19-CAR Domínio de sinalização Nome do CAR scFv TM CD3𝛇 intracelular coestimulador CD19-CAR (CD8TM/4- FMC63 CD8 4-1BB SIM 1BB) CD19-CAR (TNFR2) FMC63 TNFR2 TNFR2 SIM CD19-CAR (TNFR2 Δ18) FMC63 TNFR2 TNFR2 Δ18 SIM CD19-CAR (TNFR2 Δ59) FMC63 TNFR2 TNFR2 Δ59 SIM CD19-CAR (TNFR2 Δ104) FMC63 TNFR2 TNFR2 Δ104 SIM CD19-CAR (TNFR2 Δ151) FMC63 TNFR2 TNFR2 Δ151 SIM CD19-CAR (sem domínio Sem domínio de FMC63 TNFR2 SIM de sinalização) sinalização CD19-CAR FMC63 CD8 TNFR2 SIM (CD8TM/TNFR2) CD19-CAR (Fusão 1+ Fusão 1 FMC63 TNFR2 SIM TNFR2) CD8/TNFR2

CD19-CAR (Fusão 2+ Fusão 2 FMC63 TNFR2 SIM TNFR2) CD8/TNFR2 CD19-CAR (Fusão 3 Fusão 3 FMC63 TNFR2 SIM +TNFR2) CD8/TNFR2

[00715] Os CARs anti-CD19 são compostos pela sequência líder de CD8 humano (aa1-22), o scFv FMC63 direcionado contra CD19 humano, um marcador de estreptavidina, e um ligante derivado de CD8 alfa humano (aa138-182)

[00716] Em alguns casos, o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 é um fragmento de domínio de TNFR2 onde os resíduos de aminoácidos 18, 59, 104 ou 151 foram removidos no C-terminal (Δ18, Δ59, Δ104 ou Δ151, respectivamente). O domínio de sinalização TNFR2 pode ser subdividido em 5 domínios, cada um dos quais é importante para a interação com diferentes moléculas de sinalização para desencadear uma variedade de vias de sinalização.

Adicionalmente, determinados domínios são descritos para modular a endocitose de TNFR2 (Ji et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32(9):2271-9 (2012). Para analisar se um determinado domínio é responsável pelo respectivo fenótipo, foram construídos vários mutantes de eliminação. As eliminações foram realizadas juntamente com os domínios intracelulares mapeados, eliminando os domínios de TNFR2 do C-terminal. Detalhadamente, o domínio V foi eliminado no construção TNFR2 Δ18; os domínios V e IV no TNFR2 Δ59; os domínios V, IV e III no TNFR2 Δ104, e os domínios V, IV, III e II no TNFR2 Δ151. As funções putativas dos domínios são listadas na Tabela 5.

Tabela 5: Domínios de TNFR2 Domínio Função putativa I Desconhecida II Ativação, localização de JNK III Ativação, localização de JNK; degradação de TRAF2 IV Ligação de TRAF1/2/3 Bmx, tirosina quinase/ ativação Akt/Contribuição ligação de

V Traf2/sinalização de NFkb

[00717] Para dissecar ainda mais a influência do domínio transmembrana de TNFR2, foi gerado uma construção abrigando um TM CD8 seguido por um domínio transmembrana de TNFR2, bem como construções tendo apenas o TM TNFR2 seguido por CD3z ou híbridos de membrana, consistindo em quantidades diferentes de aminoácidos derivados de CD8 e TNFR2.

[00718] As fusões de domínios transmembrana são compostas por uma parte do domínio transmembrana de CD8 alfa humano ou pelo domínio transmembrana de CD8 alfa humano inteiro fundido com uma parte do domínio transmembrana de TNFR2 humano. As sequências de aminoácidos de fusão usadas no Exemplo 2 são descritas na Tabela 6.

Tabela 6: Sequência de fusão transmembrana de CD19-CARs Nome da sequência de Sequência CD8 Sequência TNFR2 Fusão

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT CVIMTQV Fusão 1 (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO : 62) Fusão 2 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT VNCVIMTQV

(SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO : 63)

IYIWAPLAG TALGLLIIGVVNCVIMTQV Fusão 3 (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 64) Resultados Expressão de CD19-CAR na superfície celular de Tregs humanas

[00719] Os CD19-CARs compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 e opcionalmente um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 inteiro, ou fragmentos do mesmo, foram usados para determinar se o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 está envolvido na redução da expressão de CAR na superfície celular. Os CD19-CARs compreendendo um domínio transmembrana de CD8 e um domínio intracelular de 4-1BB foram usados como um controle.

[00720] Os CD19-CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 e opcionalmente um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio transmembrana fundido CD8/TNFR2 foram usados para determinar se o domínio transmembrana de TFNR2 está envolvido na redução da expressão de CAR na superfície celular. Os CD19-CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 e um domínio transmembrana CD8 foram usados como controle.

[00721] Como mostrado na Tabela 7, foi observada uma redução da expressão de CAR na superfície celular com CARS compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 bem como com CARs compreendendo um domínio intracelular TNFR2, enquanto que o mesmo não aconteceu com CARs compreendendo um domínio transmembrana de CD8 e um domínio intracelular de 4-1BB na ausência de quaisquer domínios de TNFR2.

Tabela 7: Expressão de CD19-CARs na superfície celular de Tregs humanas sem ativação Células Expressão de CAR na Construções de CAR transduzidas (% superfície % (MFI) GFP+) CD19-CAR (CD8TM/4-1BB) 52% 76% (33) CD19-CAR (TNFR2) 59% 22% (2) CD19-CAR (TNFR2 Δ18) 73% 30% (3) CD19-CAR (TNFR2 Δ59) 73% 25% (2) CD19-CAR (TNFR2 Δ104) 78% 23% (3) CD19-CAR (TNFR2 Δ151) 82% 52% (12) CD19-CAR (sem domínio de 84% 70% (17) sinalização) CD19-CAR (CD8TM/TNFR2) 74% 80% (25) CD19-CAR (Fusão 1+TNFR2) 73% 78% (19) CD19-CAR (Fusão 2+TNFR2) 64% 28% (2) CD19-CAR (Fusão 3+TNFR2) 70% 27% (2)

[00722] Globalmente, estes resultados demonstram que o domínio transmembrana de TNFR2 e o domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2 estão ambos envolvidos na expressão de CAR reduzida na superfície celular de Tregs humanas.

Ativação específica ao CD19-CAR em Tregs humanas

[00723] Os CD19-CARs compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 e, opcionalmente, um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 inteiro ou fragmentos do mesmo, foram usados para determinar se o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 está envolvido na ativação de CAR. Os CD19-CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4- 1BB e um domínio transmembrana CD8 foram usados como controle.

[00724] Os CD19-CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 e opcionalmente um domínio transmembrana de TNFR2 ou um domínio transmembrana fundido de CD8/TNFR2 foram usados para determinar se o domínio transmembrana de TFNR2 está envolvido na ativação de CAR. Os CDl9-CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB e um domínio transmembrana CD8 foram usados como controle.

[00725] Como mostrado na Tabela 8, foi observada uma redução de sinalização tônica, avaliada pelo nível de expressão do marcador de ativação precoce CD69, com os CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 e domínios transmembrana de fusão de CD8/TNFR2, mas não foi observada com CARs compreendendo um domínio transmembrana CD8/domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB. Apesar de um baixo nível de expressão, os CARs derivados de TNFR2 foram eficientemente ativados com células Daudi CDl9+. Em células não-

transduzidas, o fundo de expressão de CD69 é de 9% na ausência ou de 32% na presença de células Daudi.

Tabela 8: Ativação de CD19-CARs em Tregs humanas %CD69+ pré/pós ligação de ligante Construções de CAR

CAR CD19-CAR (CD8TM/4-1BB) 20%/79% CD19-CAR (TNFR2) 12%/59% CD19-CAR (TNFR2 Δ18) 11%/59% CD19-CAR (TNFR2 Δ59) 16%/65% CD19-CAR (TNFR2 Δ104) 19%/81% CD19-CAR (TNFR2 Δ151) 23%/74% CD19-CAR (sem domínio de 20%/75% sinalização) CD19-CAR (CD8TM/TNFR2) 13%/70% CD19-CAR (Fusão 1+ TNFR2) 14%/70% CD19-CAR (Fusão 2+TNFR2) 8%/67% CD19-CAR (Fusão 3+TNFR2) 11%/61% Expressão de CD19-CAR na superfície celular de células T Jurkat

[00726] Tal como com as células Treg humanas, a expressão de CD19-CAR foi também analisada em células Jurkat-Lucia- NFAT usando as construções de CAR descritos na Tabela 5.

Esta linhagem de células repórter é derivada da célula Jurkat de linfócitos T humana imortalizada.

[00727] Como mostrado na Tabela 9, também foi observada uma redução da expressão de CAR na superfície celular em células T Jurkat com CARs compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 bem como com CARs compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador TNFR2, enquanto que o mesmo não aconteceu com CARs compreendendo uma construção de domínio transmembrana de CD8/domínio de sinalização intracelular coestimulador de 4-1BB.

Tabela 9: Expressão de CD19-CARs na superfície celular de células T Jurkat sem ativação Células Marcação de CAR entre Construções de CAR transduzidas (% células GFP+ % (MFI) GFP+) CD19-CAR (CD8TM/4-1BB) 88% 81% (104) CD19-CAR (TNFR2) 89% 31% (7) CD19-CAR (TNFR2 Δ19) 83% 20% (6) CD19-CAR (TNFR2 Δ59) 90% 34% (5) CD19-CAR (TNFR2 Δ104) 95% 29% (10) CD19-CAR (TNFR2 Δ151) 94% 52% (37) CD19-CAR (sem domínio de 95% 77% (53) sinalização) CD19-CAR (CD8TM/TNFR2) 80% 54% (51) CD19-CAR (Fusão 1+TNFR2) 77% 45% (34) CD19-CAR (Fusão 2+TNFR2) 75% 19% (6) CD19-CAR (Fusão 3+TNFR2) 72% 16% (5)

[00728] Estes resultados demonstram que o domínio transmembrana de TNFR2 e o domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 estão ambos envolvidos na expressão de CAR reduzida na superfície celular de células T Jurkat.

Construções de eliminação de TNFR-C-terminal exibem diferentes padrões de expressão na superfície e são funcionais na sinalização de CD3z em células Jurkat-NFAT

[00729] Para testar a integridade das construções de CD19-CAR criados, os níveis de expressão de superfície e a sinalização NFAT foram testados em uma linhagem de células T Jurkat NFAT-Lucia.

[00730] Foi observada uma forte redução da expressão de superfície celular com o CAR de TNFR2 completo em comparação com um CAR de CD8TM-41BB (Figura 7). Esta redução nos níveis de expressão foi parcialmente revogada quando o domínio TM TNFR2 foi substituído pelo domínio TM CD8. Além disso, a eliminação dos domínios V, IV e III de TNFR2 não alterou a expressão da superfície celular de forma detectável comparando com o domínio TNR2 completo. No entanto, após a eliminação dos domínios II e I, os níveis de expressão aumentaram até a metade dos níveis observados com a construção de 4-1BB. Ao mesmo tempo, todas as construções continuaram a exibir sinalização de NFAT dependente do alvo.

Estes resultados em conjunto indicam que os domínios I e II de TNFR2 contribuem para a redução da expressão na superfície celular nos CARs derivados de TNFR2, e que o efeito diminuído do mutante de eliminação não é devido a uma proteína não- dobrada, já que o CAR pode ainda apresentar sinalização de NFAT dependente de CD3z.

Ativação específica a CD19-CAR em células T Jurkat

[00731] A ativação específica a CD19-CAR foi também analisada em células Jurkat-Lucia-NFAT através da medição da ativação de NFAT após o engajamento do ligante CAR após a incubação com células Daudi CDl9+.

[00732] Como mostrado na Tabela 10, apesar de existir um baixo nível de expressão, todos os CARs derivados de TNFR2 são eficientemente ativados com células Daudi CDl9+.

Tabela 10: ativação de CD19-CARs de células Jurkat-Lucia-

NFAT Ativação de NFAT pós ligação de Construções de CAR ligante CAR (unidades de luz padronizadas) CD19-CAR (CD8TM /4-1BB) 100 CD19-CAR (TNFR2) 73 CD19-CAR (TNFR2 Δ19) 72 CD19-CAR (TNFR2 Δ59) 73 CD19-CAR (TNFR2 Δ104) 114 CD19-CAR (TNFR2 Δ151) 103 CD19-CAR (sem domínio de 96 sinalização) CD19-CAR (CD8TM/ TNFR2) 101 CD19-CAR (Fusão 1+ TNFR2) 74 CD19-CAR (Fusão 2+TNFR2) 51 CD19-CAR (Fusão 3+TNFR2) 64 Exemplo 3: Avaliação de CARs anti-CD20 abrigando diferentes domínios de sinalização transmembrana e intracelular derivados de diversos receptores TNFR (4-1BB, TNFR1 e TNFR2)

Materiais e Métodos

[00733] Os Materiais e Métodos usados foram os mesmos que aqueles descritos no Exemplo 1.

Resultados Nível de expressão de CARs anti-CD20 abrigando domínios intracelulares de TNFR diferentes

[00734] Anteriormente, e no presente estudo, foi observada uma diminuição na expressão de CAR anti-CD20 para a construção abrigando um domínio intracelular e um domínio transmembrana de TNFR2, em comparação com a construção abrigando um domínio intracelular de 4-1BB (Figura 8). Neste estudo, foram concebidos novos CARs abrigando domínios de sinalização derivados de TNFR usando os domínios transmembrana e intracelular de TNFR1 humano (as sequências de nucleotídeos e aminoácidos do CAR CD20 (TNFR1TM-TNFR1- CD3z)-P2A-GFP são as SEQ ID NOs: 108 e 109, respectivamente).

Como mostrado na Figura 8, estes novos CARs também são expressos em um baixo nível sobre a superfície celular, em comparação com o CAR derivado de 4-lBB. No entanto, o CAR compreendendo a sequência derivada de TNFR1 é tóxico e impacta fortemente a sobrevivência de Tregs FoxP3 (63% de sobrevivência). Além disso, as células vivas/apoptóticas expressam o CAR derivado de TNFR1 com um padrão difuso (Figura 8, quadro inferior esquerdo).

Sinalização tônica independente de ligante e capacidade de ativação de CARs anti-CD20 abrigando domínios intracelulares de TNFR diferentes

[00735] Ao monitorar a expressão do marcador CD69 em células CAR-Treg inativas, foi observada previamente a forte sinalização tônica independente de ligante com a construção de CAR anti-CD20 abrigando um domínio intracelular de 4-1BB.

Em contraste, esta sinalização tônica foi fortemente reduzida para o CAR anti-CD20 abrigando um domínio transmembrana e domínio intracelular de TNFR2. O presente estudo mostra que entre todos os CARs derivados de TNFR (Figura 9), apenas o CAR derivado de TNFR2 foi capaz de reduzir fortemente a sinalização tônica (15% contra os 11% do controle), enquanto que as construções abrigando as sequências de 4-1BB e TNFR1 têm uma sinalização tônica de cerca de 40% e 32%, respectivamente. Este resultado realça a capacidade de CARs derivados de TNFR2 para diminuir especificamente a sinalização tônica independente do ligante.

[00736] Para avaliar a ativação de CAR, as células CAR- Treg foram incubadas durante 24 horas com células B autólogas expressando o ligante de CAR CD20. Como mostrado na Figura 9, a ativação de CAR mais potente é observada para os CARs derivados de TNFR2 (2,5 vezes) enquanto todos os outros CAR- Tregs são fracamente ativados (abaixo de 1,8 vezes).

[00737] A atividade supressora de células CAR-Treg foi avaliada pelo monitoramento da proliferação de células Tconv co-cultivadas com CAR-Tregs na ausência ou presença de células B (células B) (Figura 10). Mais uma vez, a atividade supressora espontânea da construção clássica de CAR anti- CD20 (CD8 TM/4-1BB) foi muito forte para realçar uma atividade supressora mediada por CAR. Em contraste, o CAR anti-CD20 derivado de TNFR2 permitiu a observação de uma atividade supressora mediada por CAR. O CAR anti-CD20 derivado de TNFR1 exibiu atividade supressora muito fraca.

[00738] Para melhor definir e comparar a potência de CAR dos vários CARs derivados de TNFR, a capacidade de suprimir a proliferação de Tconv foi representada como uma função do número absoluto de células CAR-Treg presentes na co-cultura.

Como mostrado na Figura 11, o CAR derivado de TNFR1 foi altamente ineficiente (14750 CAR-Tregs para desencadear 50% de supressão).

[00739] Estes resultados demonstram que, entre os diferentes candidatos de TNFR humano, o uso de domínios transmembrana e domínios de sinalização intracelular coestimuladores de TNFR2 em CARs é a combinação ideal para a concepção de CAR-Tregs com sinalização tônica independente de ligante muito baixa e ativação de Treg dependente de CAR e atividade supressora ideal.

Exemplo 4: Marcadores/fenótipo de Treg

Materiais e Métodos

[00740] Os Materiais e Métodos usados foram os mesmos que aqueles descritos no Exemplo 1.

Resultados Fenótipo CAR-Treg anti-IL-23R em cultura

[00741] Os resultados para o fenótipo CAR-Treg IL-23R no dia 9 são apresentados na tabela seguinte (Tabela 11). Os resultados são expressos como percentagem de células positivas para cada marcador.

Tabela 11: Fenótipo de CAR-Treg IL-23R no Dia 9 Tregs Transdução CD4 CD25 FoxP3 Helios CD62L CD127 GFP 85,8 96,2 93,9 72,2 89,5 3,7 1132 CAR 47,62 95,5 81,9 18,2 75,9 23,9 (4-1BB/CD3z) GFP 65,6 95,0 87,9 68,3 89,5 3,6 1133 CAR 57,7 97,8 89,2 59,8 71,2 15,2 (4-1BB/CD3z) GFP 94,48 97,8 94,8 55,1 93,9 3,1 1137

CAR 94,25 98,5 96,3 66,6 93,3 3,3 (TNFR2/CD3z) GFP 90,53 97,6 94,9 51,4 95,4 2,1 1139

CAR 92,73 97,8 95,3 54,5 94,1 2,8 (TNFR2/CD3z) GFP 93.9 94.8 85.8 30.6 82.6 11

CAR

88.7 96.0 64.8 34.6 76.4 22 1142 (4-1BB/CD3z)

CAR

93.7 65.6 74.9 38.0 79.5 14.5 (TNFR2/CD3z)

GFP 93.2 96.4 78.0 31.8 96.6 10.8

CAR

86.7 95.9 50.8 23.7 70.7 25.9 1144 (4-1BB/CD3z)

CAR

92.7 96.0 62.5 31.1 89.0 10.7 (TNFR2/CD3z) GFP 89,4 95 95,3 63,4 3,7

CAR 81,1 94,1 95,1 60,4 5,1 1148 (4-1BB/CD3z)

CAR 90 94,7 95,0 64,6 4,2 (TNFR2/CD3z)

ND GFP 89,5 95,2 95,1 66,3 3,4

CAR 73,3 93,3 92,8 66,0 9,8 1149 (4-1BB/CD3z)

CAR 91,2 95,5 92,5 61,2 5,7 (TNFR2/CD3z)

[00742] É interessante observar que as Tregs transduzidas com CAR IL-23R (4-lBB/CD3z), que é altamente expresso na superfície celular, demonstraram uma perda de estabilidade realçada por diminuições em FoxP3, Helios e CD62L (negrito) e um aumento em CD127 (negrito). No entanto, as Tregs transduzidas com CAR IL-23R (TNFR2/CD3z), que mostra uma diminuição de 9 vezes na expressão de superfície celular (191,1 ± 53,2 para o CAR derivado de 4-lBB contra 20,5 ± 3,4 para o CAR derivado de TNFR2; ver Tabela 3), destacam um fenótipo de Treg robusto após 9 dias em cultura.

Fenótipo CAR-Treg anti-CD20 em cultura

[00743] Os resultados para o fenótipo CAR-Treg anti-CD20 no dia 15 são apresentados na tabela seguinte (Tabela 12).

Os resultados são expressos como porcentagem ou fluorescência média de células positivas para cada marcador.

Tabela 12: Fenótipo CAR-Treg anti-CD20 CD127 % % CTLA-4+ CD25 % FoxP3 MFI % Helios+ (em pop (em pop Dia 15 (n=3) (em pop (em pop (em pop CD4+ CD4+ CD4+) CD4+) FoxP3+) CD25+) CD25+)

79.5 ± 11.5 ± 75.4 ± UT 0.8 ± 0.1 62.1 ± 4.4

6.4 1.5 7.3

80.6 ± 11.1 ± 74.7 ± GFP 0.9 ± 0.1 61.3 ± 2.7

3.8 1.3 9.1

69.9 ± 10.9 ± 60.4 ± 4-1BB 0.9 ± 0.1 67.2 ± 1.2

4.9 1.0 5.3

72.9 ± 11.3 ± 63.0 ± TNFR2 0.8 ± 0.0 72.9 ± 2.4

2.5 1.3 5.4

[00744] É interessante observar que o fenótipo Treg não é estatisticamente diferente entre as construções de CAR- Treg diferentes e o controle transduzido apenas com GFP.

Exemplo 5: uso in vivo de CAR-Tregs Materiais e Métodos GvHD

[00745] Um dia antes da injeção de PBMC HLA-A2+ humanas, um total de 23 camundongos NSG (8 semanas) foi condicionado com injeção IP de Bussulfano 30 mg/kg para favorecer o enxerto de células humanas. Um dia depois (no dia 0), os camundongos foram injetados IV com PBMCs HLA-A*02+ humanas (5x106 PBMCs por camundongo) e CAR-Tregs HLA-A2 humanas foram injetadas em uma proporção de 1:1 PBMC:CAR-Treg. Três vezes por semana, os camundongos foram pesados (BW) e o escore GvHD foi avaliado. Amostras de sangue foram coletadas a cada semana. No momento do sacrifício, o baço e o pulmão também foram analisados. As Tregs humanas foram isoladas de voluntários saudáveis negativos para HLA-A2 e transduzidas como descrito anteriormente.

Resultados

[00746] As Tregs de CAR compreendendo domínios de sinalização de CD28, TNFR2 ou TNFR2+4-1BB foram testadas quanto a sua atividade in vivo em um modelo de camundongo GvHD. Três construções de CAR diferentes (Figura 12) foram transduzidos em Tregs humanas de CD4+CD25+CD127low, CD45RA+ como descrito anteriormente.

[00747] A eficiência de transdução foi avaliada pela porcentagem de expressão de células positivas para GFP e a expressão de CAR foi monitorada usando Dextramer®. Como mostrado na Figura 13, as Tregs foram transduzidas a 27%, 56% e 34% com CARs de CD28 ou TNFR2 ou TNFR2+4-1BB HLA*A2, respectivamente.

[00748] As três CAR-Tregs HLA*A2 diferentes exibiram um fenótipo de Treg robusto de CD4+ CD45RA+ FoxP3+ CTLA-4+ (Figura 14).

[00749] As CAR-Tregs HLA*A2 foram injetadas em camundongos NSG em uma proporção de 1:1 (PBMC:CAR-Tregs). As CAR-Tregs HLA*A2 compreendendo domínios de sinalização de TNFR2, TNFR2+4-1BB ou CD28 foram todas capazes de controlar a GvHD (Figura 15).

Tabela 13: Sequências

SID1 Tipo2 Descrição 1-2 aa scFvs anti-CD19 3-6 aa scFvs anti-CD20 7 aa anti-desmo 3 (domínios 1-4) 8-11 aa Ligantes 12 nt Ligante 13 aa Domínio de dobradiça KIR2DS2 14 aa Domínio de dobradiça CD8 15 nt Domínio de dobradiça CD8 16 aa Domínio de dobradiça IgG4 17 nt Domínio de dobradiça IgG4 18 aa Domínio de dobradiça IgD 19 nt Domínio de dobradiça IgD 20 aa Domínio de dobradiça CD28 21 nt Domínio de dobradiça CD28 22 aa Domínio transmembrana TNFR2 23 nt Domínio transmembrana TNFR2 24 aa Domínio transmembrana CD8 25 nt Domínio transmembrana CD8 26 aa Domínio transmembrana CD28 27 nt Domínio transmembrana CD28 28-31 aa Domínios de sinalização intracelular CD3 zeta 32-33 nt Domínios de sinalização intracelular CD3 zeta 34 aa Domínio intracelular TNFR2 35 nt Domínio intracelular TNFR2 36 aa Domínio intracelular 4-1BB 37 nt Domínio intracelular 4-1BB 38 aa Domínio intracelular CD27 39 nt Domínio intracelular CD27 40 aa Domínio intracelular CD28 41 nt Domínio intracelular CD28 42 aa Sequência líder CD8 43-44 aa MARCADORES 45 aa MARCADOR P2A 46 aa MARCADOR GFP 47 aa Marcador de streptavidina 48 aa CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2-3z 49 aa CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2Δ18-3z 50 aa CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2Δ59-3z 51 aa CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2Δ104-3z 52 aa CD8 H-TNFR2 TM-3z 1 SID: SEQ ID NO: 2 aa: aminoácido, nt: nucleotídeo

53 aa CD8 H-3z-TNFR2 TM 54 aa CD8 H-CD8 TM- TNFR2-3z 55 aa CD8 H-FUNDIDO 1 TM- TNFR2-3z 56 aa CD8 H-FUNDIDO 2 TM- TNFR2-3z 57 aa CD8 H-FUNDIDO 3 TM- TNFR2-3z 58 aa Motivo LAGLIDADG 59 aa Fusão 1 - SEQ CD8 60 aa Fusão 2 - SEQ CD8 61 aa Fusão 3 - SEQ CD8 62 aa Fusão 1 - SEQ TNFR2 63 aa Fusão 2 - SEQ TNFR2 64 aa Fusão 3 - SEQ TNFR2 65-67 aa scFvs anti-IL-23R 68- aa scFvs anti-HLA-A2 107 108 nt CAR CD20 (TNFR1TM-TNFR1-CD3z)-P2A-

GFP 109 aa CAR CD20 (TNFR1TM-TNFR1-CD3z)-P2A-

GFP 110 aa CD8 H-TNFR2 TM-TNFR2Δ151-3z 111- aa ligantes 117

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que (i) o domínio transmembrana compreende um domínio transmembrana do receptor de fator de necrose tumoral humano 2 (TNFR2) ou um fragmento ou variante do mesmo, ou (ii) o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, ou (iii) tanto (i) quanto (ii).

2. CAR, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um domínio de dobradiça extracelular.

3. CAR, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio de dobradiça compreende uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano.

4. CAR, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o domínio de dobradiça compreende a sequência de SEQ ID NO: 14 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO:

14.

5. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular primário de célula imune.

6. CAR, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular primário de células T de CD3 humano.

7. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano, opcionalmente compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31 ou uma sequência com pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 28, 29, 30 ou 31.

8. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende: um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano, um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio intracelular que compreende um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

9. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende: um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano, um domínio transmembrana, e um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

10. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende: um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 ou CD28 humano, um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio intracelular compreendendo um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano ou um fragmento ou variante do mesmo, e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

11. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende pelo menos oito aminoácido contíguos da SEQ ID NO: 22 ou de uma sequência com pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO: 22.

12. CAR, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende pelo menos oito resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 22 em combinação com resíduos de aminoácidos de um domínio transmembrana de uma proteína que não é TNFR2.

13. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana compreende a sequência de aminoácidos de VNCVIMTQV (SEQ ID NO: 63).

14. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio intracelular compreende pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34 ou de uma sequência com pelo menos cerca de 70% de identidade com a SEQ ID NO:

34.

15. CAR, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito domínio intracelular compreende pelo menos 30 resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 34 em combinação com resíduos de aminoácidos de um domínio de sinalização intracelular coestimulador de uma proteína que não é TNFR2.

16. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito domínio de sinalização intracelular compreende os resíduos 1-70, 1-115, ou 1-156 da SEQ ID NO: 34.

17. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende: um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça extracelular compreendendo uma região de dobradiça de CD8 da SEQ ID NO: 14, um domínio transmembrana compreendendo um domínio transmembrana de TNFR2 da SEQ ID NO: 22, e um domínio intracelular compreendendo: a) um domínio de sinalização intracelular de CD3 zeta humano primário da SEQ ID NO: 28, 29, 30, ou 31, e b) um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 da SEQ ID NO: 34.

18. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação extracelular é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

19. CAR, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação extracelular é um fragmento variável de cadeia única (scFv).

20. CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação extracelular se liga especificamente a (a) um autoantígeno, em que o autoantígeno é opcionalmente o receptor de IL-23 (IL-23R); (b) um antígeno de células B, opcionalmente selecionado a partir de CD19 e CD20; ou (c) uma molécula de HLA classe I ou classe II alogênica, em que a molécula de classe I é opcionalmente HLA-A2.

21. Sequência de ácidos nucleicos caracterizada pelo fato de que codifica o CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

22. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos conforme definida na reivindicação 21.

23. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de ácidos nucleicos conforme definida na reivindicação 21 ou o vetor conforme definido na reivindicação 22.

24. População de células imunes caracterizada pelo fato de que expressa o CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

25. População de células imunes, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que as células imunes são selecionadas do grupo que consiste em células T, células exterminadoras naturais (NK), células T αβ, células T , células duplamente negativas (DN), células imunes regulatórias, células T regulatórias (Treg) , células imunes efetoras, células T efetoras, células B, e células derivadas de mieloides, e qualquer combinação das mesmas, em que as células imunes são opcionalmente células humanas.

26. População de células imunes, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a população compreende células Treg, em que as células Treg são opcionalmente células humanas.

27. População de células imunes, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a população compreende células Treg humanas que expressam um CAR compreendendo: um domínio de ligação extracelular, um domínio de dobradiça compreendendo uma região de dobradiça de CD8 humano, um domínio transmembrana de TNFR2 humano, e um domínio intracelular que compreende um domínio de sinalização intracelular coestimulador de TNFR2 humano e um domínio de sinalização intracelular primário de CD3 zeta humano.

28. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma célula imune que expressa o CAR conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma célula hospedeira conforme definida na reivindicação 23, ou uma população de células imunes conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 27, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

29. Método para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica conforme definida na reivindicação

28.

30. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma população de células imunes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano que necessite do mesmo.

31. Uso de um receptor de antígeno quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma população de células imunes, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de ser para fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo humano que necessite do mesmo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 29, CAR ou população de células imunes para uso de acordo com a reivindicação 30, ou uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica, uma condição de transplante de órgão, um câncer e uma doença infecciosa.

33. Método, de acordo com a reivindicação 29, CAR ou população de células imunes para uso de acordo com a reivindicação 30, ou uso de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano necessita de imunossupressão e o CAR é expresso em células Treg no indivíduo humano.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CAR ou população de células imunes para uso de acordo com a reivindicação 33, ou uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença alérgica ou uma condição de transplante de órgão.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CAR ou população de células imunes para uso de acordo com a reivindicação 34, ou uso de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a condição de transplante de órgão é rejeição de enxerto ou doença de enxerto contra hospedeiro.

36. Receptor de antígeno quimérico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma população de células imunes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.