CN111684061A - 表达嵌合抗原受体的调节性t细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了调节性T(Treg)细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含：a)至少一个抗原结合结构域，b)跨膜结构域，和c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原。还公开了包含所述Treg细胞的组合物，以及激活的表达所述CAR的Treg的富集和分析的方法。
Description
技术领域
本发明涉及在免疫细胞中表达的，特别是在调节性T细胞中表达的嵌合抗原受体的领域。
背景技术
可以操纵常规T细胞(Tcon)以改善对病原体或肿瘤的识别和破坏。调节性T细胞(Treg)包含具有免疫抑制功能的T细胞的亚组。可以操纵Treg以预防或治疗自身免疫，移植排斥，过敏症和慢性炎性疾病。
嵌合抗原受体(CAR)作为用于产生抗原特异性调节性T细胞(Treg)的有前途的替代物而出现。除TCR以外，CAR是人工受体，其含有可以独立于MHC来结合表面抗原的抗体型特异性。CAR-T细胞对特定抗原的特异性识别是通过抗体衍生单链可变片段(scFv)来介导，该片段具有经由跨膜区与细胞内TCR衍生信号传导结构域偶联的细胞外间隔结构域(Gross等，1989；Kuwana等，1987)。在鼠模型中，对髓鞘碱性蛋白具有反应性的重定向CAR-Treg能够改善EAE(Mekala和Geiger，2005)，而且对2,4,6-三硝基苯酚(TNP)或癌胚抗原(CEA)具有特异性的CAR-Treg也被成功地重定向至结肠，在那里它们高度有效地抑制结肠炎及其相关结直肠癌的发展(Blat等，2014；Elinav等，2009；Elinav等，2008)。最近，人CAR-Treg被重定向至作为移植中常见的错配抗原的HLA-A2，并已显示出抑制异种GvHD(MacDonald等，2016；Noyan等，2017；Boardman等，2017)。此外，已证明CAR-Treg具有缓解过敏性气道炎症(Skuljec等，2017)并阻止中和针对小鼠中的VIII因子的免疫反应(Yoon等，2017)的潜力。McGovern等(2017,Frontiers in Immunology,Vol.8,Art.1517pp:l-6)回顾了表达CAR的Treg的最新技术水平。
据我们所知，到目前为止已在Treg中使用的CAR构建体具有CD28共刺激结构域。
作为体外产生抗原特异性Treg的前提，识别疾病相关靶抗原仍然是一个重大挑战。此外，由于缺少允许特异性识别Treg并测试其具体激活要求的标记物，对CAR-Treg功效的功能分析受到限制。这对于产生最佳Treg CAR构建体和产生优化的Treg移植物是重要的，其是最大的CAR相关Treg功能活性和最小的效应T细胞污染的原因。因此，对于可以与Tcon显著不同的CAR-Treg的激活和扩增的要求的了解仍然很少。
本领域中需要表达CAR的调节性T细胞，其可用于治疗受试者以防护或治疗各种各样的免疫相关疾病，例如自身免疫，移植排斥，过敏症或慢性炎性疾病。
本领域中还需要产生表达CAR的高度纯化和功能优化的调节性T细胞，其可用于治疗受试者以防护或治疗所述免疫相关疾病。
发明内容
对于治疗性应用而言，拥有纯Treg细胞群且能够评估CAR构建体对Treg功能的影响(其可能与对Tcon的要求不同)是至关重要的。但是，体外Treg群体通常被Tcon细胞污染，并且这两个群体不容易彼此分离。从包含激活的调节性T细胞和激活的常规T细胞的样品中识别并分离出真正的激活的Treg是分析特定CAR构建体对Treg的体外作用以及随后它们在体内的功能的要求。因此，定义最佳CAR介导的Treg功能活性的激活和产生优化的CAR Treg的条件的任务迄今为止尚未得到解决。
这样的识别和分离可以通过EP2306191B1中公开的方法来执行。
在本文中通过比较已知激活传统T细胞(Tcon)的不同信号传导结构域，我们示出了，令人惊讶地，使用CD137(4-1BB)共刺激结构域具有刺激和扩增人调节性T细胞的选择性优势。这对于优化过继性Treg疗法的Treg功能是重要的。
图4显示，令人惊讶地，当与具有CD28共刺激信号传导结构域的CAR(本文也称为“CD28 CAR”)相比，CAR包含CD137(4-1BB)共刺激信号传导结构域(本文中也称为“CD137CAR”)时，体外Treg通过CAR被更好地激活(如通过CAR配体(抗原)诱导的CD137的表达和扩增所示)，而在Tcon中相反。因此，CD137 CAR的使用允许Treg的最佳刺激，其可用于在CAR-配体(抗原)刺激后体外选择激活的Treg，以产生高度纯化的CAR-配体(抗原)反应性Treg。还预期与具有CD28 CAR的Treg相比，体内CD137 CAR被CAR配体(抗原)更好地激活和扩增，因为体内Treg功能严格地依赖于功能性抗原受体激活，其由所述CAR构建体模仿。本文公开的用CAR(具有CD137共刺激结构域的CAR)转导或转染Treg允许通过CAR有效地体外激活所述工程化Treg细胞，并为随后分选激活的表达CAR的Treg提供了手段。这允许产生纯的和功能性的Treg CAR群体，其有益于有需要的受试者的治疗用途，因为在体内由于较少的污染物，其将提供更好的安全性，且由于更好的CAR-配体(抗原)诱导的激活和扩增，其将提供改善的治疗活性。此外，在本发明的一个具体实施方式中，与不对这样的外部刺激物产生反应的CD28 CAR或具有其他信号传导结构域的CAR相比，CD137 CAR响应于作为外部刺激物施加于受试者的可溶性抗原如葡聚糖(dextran)而提供改善的体内Treg激活，这另外增强了转移的Treg的体内活性，因为其导致Treg的扩增，且增加的Treg活性也将导致与内源性TCR或Treg的改善的反应性。通过这种方式，CAR激活可用于增强Treg对内源性Treg抗原的天然调节或抑制活性，而无需知晓具体Treg抗原靶标。
本文公开的Treg非常适合于预防或治疗患有免疫介导的疾病，例如自身免疫，移植排斥，过敏症或慢性炎性疾病的受试者。
在本发明的一个实施方式中，在Treg中表达的CD137 CAR对外源可溶性抗原葡聚糖具有特异性。将葡聚糖施用于需要用对葡聚糖具有特异性的所述CAR治疗的受试者可以允许表达所述CAR的Treg细胞的受控和持续的免疫应答，以预防或治疗自身免疫，移植排斥，过敏症或慢性炎性疾病。
附图说明
图1：具有不同细胞内信号传导结构域的葡聚糖特异性CAR-Treg的产生。(A)具有不同信号传导结构域的CAR构建体的示意图。(B)显示了慢病毒转导后富集CD25的Treg上的LNGFR表达(n＝10-19，来自3-6个不同实验)。(C)显示了可溶性FITC葡聚糖的结合(n＝7-21，来自2-7个独立实验)。
图2：具有不同细胞内信号传导结构域的葡聚糖特异性CAR-Treg的激活。(A)在用珠结合的葡聚糖再刺激6h后分析CD137表达，减去未经刺激的样品的CD137表达(n＝7-26，进行2-8个不同的实验)。(B)在与可溶性葡聚糖一起孵育5分钟后分析LNGFR+和LNGFR-Treg中ZAP70的磷酸化(n＝7，进行2个独立实验)。
图3：具有不同细胞内信号传导结构域的葡聚糖特异性CAR-Treg的扩增。在(A，C)抗CD3/-CD28或(B，D)珠结合的葡聚糖的存在下扩增Treg。(A，B)d17时LNGFR+细胞的富集计算为d0时LNGFR-/LNGFR+Treg的比率×d17时LNGFR+/LNGFR-Treg的比率(n＝13-18，来自4-6个独立实验)。(C，D)汇集具有不同信号传导结构域的Treg，并通过qPCR定量不同信号传导结构域的相对表达(n＝7，进行3个不同的实验)。
图4：Treg和Tcon中不同细胞内信号传导结构域的比较。(A)显示了CAR-Treg和CAR-Tcon的葡聚糖结合。(B)用珠结合的葡聚糖刺激6h后CAR-Treg(CD137表达)和CAR-Tcon(CD154表达)的激活的分析；对于每个样品减去作为背景的在LNGFR-Treg上的表达，并且将CD137和CD154表达针对每种培养物中葡聚糖+细胞的百分比进行标准化。
图5：通过激活诱导的CD137表达来分离CAR-Treg。对未经刺激的LNGFR+Treg或用珠结合的葡聚糖刺激6h后的CD137+LNGFR+Treg进行分选，并在抗CD3/-28下(LNGFR+分选的)或在无进一步刺激(CD137+分选的)下扩增14天，然后在用珠结合的葡聚糖再刺激后染色(A)LNGFR，(B)葡聚糖，和(C)CD137表达(n＝12，对于LNGFR分选的进行4次独立实验；n＝15，对于CD137分选的进行5次不同实验)。
具体实施方式
在第一方面，本发明提供了一种调节性T(Treg)细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)至少一个抗原结合结构域，
b)跨膜结构域，
c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽(tagged polypeptide)的标签或可溶性抗原。
所述CAR，其中所述至少一个初级胞质信号传导结构域可以是CD3ζ。所述CAR，其中所述抗原结合结构域可以直接结合在靶细胞的细胞表面上表达的抗原。所述靶细胞可以是处于疾病状态的细胞，其表达疾病相关自体或同种异基因抗原。所述疾病可以是受试者的自身免疫性疾病，慢性炎性疾病，过敏症，移植排斥，GvHD，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的感染。
或者，所述CAR的所述抗原结合结构域可以结合与靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签。然后，所述CAR的所述抗原结合结构域与靶细胞的表面上表达的抗原间接结合。这样的衔接体CAR方法例如在US9,233,125B2中公开。标签可以是半抗原，例如生物素或FITC。与在细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽可以是抗体或其抗原结合片段。
或者，并且优选的，所述CAR的抗原结合结构域可以对可溶性抗原具有特异性，从而在所述可溶性抗原与所述CAR的所述抗原结合结构域结合时允许所述Treg细胞的激活，优选没有所述Treg细胞与另外的细胞的结合。
所述可溶性抗原可以是不在受试者的血液或组织中天然存在的外源性抗原，所述受试者优选是向其施加表达所述CAR的所述Treg细胞的人。更优选地，不在表达所述CAR的所述Treg细胞向其施用的受试者的血液或组织中天然存在的所述外源抗原不具有结合所述CAR的抗原结合结构域之外的所述受试者中的另外的靶标的偏好。
所述外源可溶性抗原可以是非引起疾病的抗原，其当施用于所述受试者时，不对所述受试者引起伤害。
所述(外源)可溶性抗原可以是葡聚糖。
所述CAR的所述抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列。SEQID NO:1代表免疫球蛋白的重链的可变结构域(VH)，而SEQ ID NO:2代表免疫球蛋白的轻链的可变结构域(VL)。
或者，可以通过使用特定附着分子将抗原(单价或多价)附着于生物表面，例如细胞的表面或组织基质化合物。以这种方式，抗原可以体内定向至特定的表面、细胞类型或器官，并且与表面的附着也改善了CAR的交联。这导致局部化的和改善的Treg激活。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含
i)调节性T(Treg)细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)至少一个抗原结合结构域，
b)跨膜结构域，
c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中所述抗原结合结构域特异性结合与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原，
ii)所述标签多肽。
在另一方面，本发明提供了本文公开的表达CAR的Treg细胞，其用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病，过敏症，移植排斥，移植物抗宿主病，慢性炎性疾病，例如炎性肠病，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的慢性感染。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体。
本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体的所述组合物可以包含至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的Treg细胞。所述Treg细胞可以特征在于：在多克隆刺激5-7小时后，例如使用抗CD3/抗CD28分子或药理性T细胞激活剂，例如PMA/离子霉素，CD25+CD127-FoxP3+表型和/或>80％去甲基化TSDR(Treg Specific Demethylated Region)和/或CD137的表达和CD154表达的缺乏。
所述组合物，其中本文公开的表达CAR的Treg细胞的所述群体可以是可通过本文公开的富集激活的表达CAR的Treg细胞的方法获得的激活的Treg的群体。
所述组合物可以是药物组合物，其任选地包含药学可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了药物组合物的组合，其包含
a)本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体以及药学上可接受的载体，和
b)本文公开的可溶性抗原。
本文公开的表达CAR的Treg细胞的所述群体可包含至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的Treg细胞。所述Treg细胞可以特征在于：在多克隆刺激5-7小时后，例如使用抗CD3/抗CD28分子或药理性T细胞激活剂，例如PMA/离子霉素，CD25+CD127-FoxP3+表型和/或>80％去甲基TSDR和/或CD137的表达和CD154表达的缺乏。
所述药物组合物的组合，其用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病，过敏症，移植排斥，移植物抗宿主病，慢性炎性疾病，例如炎性肠病，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的慢性感染。
所述可溶性抗原可以是葡聚糖。
所述药物组合物的组合，其中本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体可以是可通过富集本文公开的激活的表达CAR的Treg细胞的方法获得的激活的Treg的群体。
在另一方面，本发明提供了一种富集激活的表达CAR的Treg细胞的方法，其中所述CAR包含：
i)至少一个抗原结合结构域，
ii)跨膜结构域，
iii)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原，所述方法包括：
a)提供包含调节性T细胞的样品，
b)遗传修饰所述样品的所述调节性T细胞以表达所述CAR，
c)通过与由所述CAR的所述抗原结合结构域结合的所述抗原接触6-16小时来激活所述遗传修饰的调节性T细胞，
d)通过以下分离步骤c)的激活Treg细胞，
α)使步骤c)的所述细胞与：
I)结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭；或
II)结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，和
β)使
I)步骤α)I)的所述细胞与结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体；或
II)步骤α)II)的所述细胞与结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体。
任选地，所述方法还可包括在步骤b)之后和步骤c)之前扩增所述遗传修饰的调节性T细胞的步骤。
所述方法的所述CAR和所述抗原可以具有上文已经描述和本文公开的CAR和抗原的特征和特性。上文公开的针对CAR的所有变体和实施方式和本文公开的抗原也可以适用于所述方法。
所述方法，其中针对调节性T细胞的标志物选自标志物CD25和GITR；且其中针对激活的调节性T细胞的标志物选自标志物CD137，潜在TGF-β(LAP)，GARP(LRRC32)和CD121a/b。
所述方法，其中结合CD154或针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子可以是抗体或其抗原结合片段。
所述方法，其中所述遗传修饰的调节性T细胞(步骤c)在抗CD3/-CD28和/或与本文所述的CAR的抗原结合域结合的抗原的存在下扩增，并添加适当的生长因子，例如IL-2。
所述方法，其中使用流式细胞仪或磁性细胞分选法进行分离(分离)。
所述方法，其中将结合CD154的分子和/或结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子偶联至荧光染料、半抗原和/或磁性颗粒。
所述方法，其中所提供的样品(步骤a)源自全血，PBMC，脐带血，淋巴结组织，骨髓或白细胞分离术。
所述方法，其中所述样品的所述调节性T细胞的遗传修饰以表达所述CAR(步骤b)可以通过本领域公知的方法(例如，基于病毒的系统，物理方法，生物方法，化学方法)进行。
Treg细胞的所述遗传修饰可以通过转导，转染或电穿孔进行。优选地，转导是通过慢病毒，γ-，α-逆转录病毒或腺病毒或通过核酸(DNA，mRNA，miRNA，antagomir，ODN)，蛋白质，位点特异性核酸酶(锌指核酸酶，TALEN，CRISPR)，自复制RNA病毒(例如马脑病病毒)或整合缺陷型慢病毒载体的电穿孔或转染进行。更优选地，Treg细胞的所述遗传修饰可以通过用慢病毒载体转导所述细胞来进行。
所述方法，其中激活的表达所述CAR的Treg细胞的富集群体包含至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的Treg细胞。所述Treg细胞的特征在于：在多克隆刺激5-7小时后，例如使用CD3/CD28或药理性T细胞激活剂，例如PMA/离子霉素，CD25+CD127-FoxP3+表型和/或>80％去甲基TSDR和/或CD137的表达和CD154表达的缺乏。
所述方法，其中所述方法可以在封闭系统中执行。
所述方法，其中所述方法是封闭系统中的自动化方法。
本发明还提供了在Treg细胞中表达的CD137 CAR从各种各样的CAR(至少两种)中选择那些CAR的用途，其允许通过使用包含CD137信号传导结构域，但在所述CAR的至少一个其他组分方面不同的至少两种CAR(CD137 CAR)来最好地激活Treg，并且比较它们激活表达所述CAR的Treg的能力，例如通过使所述表达CAR的Treg与CAR配体(抗原)接触并测量和比较诱导CD137表面表达或已知在Treg细胞激活后表达的另外的Treg激活标志物的程度。
因此，在另一方面，本发明提供了在调节性T(Treg)细胞中表达的CAR用于分析Treg细胞的激活效率的用途，其中所述CAR包含：
a)至少一个抗原结合结构域，
b)跨膜结构域，
c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原。
在另一方面，本发明提供了一种用于分析(比较)至少两种Treg细胞的激活效率的方法，其中至少第一Treg细胞表达第一嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)至少一个抗原结合结构域，
b)跨膜结构域，
c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中至少第二Treg细胞表达第二CAR，其在所述第一CAR的至少一个结构域方面与所述第一CAR不同，但表达所述CD137的共刺激信号传导结构域，和
其中所述至少第一CAR和所述至少第二CAR的所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原，
所述方法包括：
a)提供包含调节性T细胞的样品，
b)遗传修饰所述至少第一Treg细胞以表达所述至少第一CAR，和遗传修饰所述至少第二Treg细胞以表达所述至少第二CAR，
c)通过与由所述至少第一CAR和所述至少第二CAR的抗原结合结构域结合的抗原接触6-16小时，激活所述遗传修饰的至少第一Treg细胞和至少第二Treg细胞，
d)测量所述至少第一Treg细胞和所述至少第二Treg细胞的Treg激活标志物的表达水平，其中不同的表达水平指示所述至少第一CAR和所述至少第二CAR在Treg细胞中的不同激活效率。
比较通过使CAR与它们的配体(抗原)接触而诱导的激活强度允许通过选择具有最强激活能力的CAR来优化用于Treg的CAR。
在比较Treg细胞中的至少两种CAR的激活效率的上下文中，本文所用的术语“CAR的结构域”是指可以在在功能性CAR中使用的任何结构域，这样的结构域可以是例如CAR的细胞外结构域，跨膜结构域和细胞内结构域。细胞外结构域可以是至少一个抗原结合结构域，诸如(G4/S)3的接头和/或诸如CD8铰链的间隔子/铰链。细胞内结构域可以是至少一个刺激性信号传导结构域，和/或至少一个共刺激信号传导结构域。彼此比较的至少两个CAR之间可存在的差异可包括CAR中可以是功能相关的结构域的修饰，即影响稳定性，表达水平，抗原结合或配体(抗原)诱导的CAR介导的信号传导级联反应，其最终影响CAR介导的Treg激活。术语“修饰”包括例如这样的结构域的全部或部分取代或缺失，该结构域在CAR内的定位，或者仅仅是该结构域的氨基酸序列的修饰，即这样的结构域的至少一个氨基酸的交换，插入，去除等。
术语“Treg激活”或“Treg细胞中的激活效率”是指抗原受体触发引起的Treg基因表达模式的改变或功能改变。体内需要Treg激活以允许Treg发挥其生理功能，例如抑制不适当的或病理性的免疫反应，例如过敏症，自身免疫，移植物抗宿主病和移植排斥，IBD和其他慢性炎性疾病。在本领域中已知有多种多样的参数和方法来测量Treg激活，例如激活标记物的表达。所述Treg激活标记物可以选自标记物CD137，潜在TGF-β(LAP)，GARP(LRRC32)，CD121a/b或IL-10。或功能测定，例如通过与激活的Treg共培养来抑制应答者T细胞增殖。Treg激活的一个特定参数是在刺激4-7小时后CD137的诱导，但是同时不存在CD154，这是高度特异性的Treg激活标记。这可以通过本领域专家已知的标准技术来测量，例如荧光抗体染色和流式细胞术。Treg激活的定量差异可以是单个细胞上表达的CD137的量，也可以是被诱导以表达该标记物的细胞的数量或比例。
所述方法的所述第一CAR和所述抗原可以具有上文已经描述和本文公开的CAR和抗原的特征和特性。上文公开的针对CAR的所有变体和实施方式和本文公开的抗原也可以适用于所述方法。
所述第二CAR可以是与所述第一CAR相比具有至少一个修饰的第一CAR的变体，其可以影响例如抗原结合特性和/或信号转导能力，从而导致所述第二CAR与所述第一CAR相比改变的Treg细胞激活特性。
所述第二CAR与所述第一CAR相比的修饰可以是例如不同的间隔区，对相同抗原具有特异性的不同抗原结合结构域，不同的跨膜结构域和/或不同的信号传导结构域。
所述方法，其中提供的样品(步骤a)可以源自全血，PBMC，脐带血，淋巴结组织，骨髓或白细胞分离术。
所述方法，其中所述样品的所述调节性T细胞的遗传修饰以表达所述CAR(步骤b)可以通过本领域公知的方法(例如，基于病毒的系统，物理方法，生物方法，化学方法)进行。
Treg细胞的所述遗传修饰可以通过转导，转染或电穿孔进行。优选地，转导是用慢病毒，γ-，α-逆转录病毒或腺病毒或通过核酸(DNA，mRNA，miRNA，antagomir，ODN)，蛋白质，位点特异性核酸酶(锌指核酸酶，TALEN，CRISPR)，自复制RNA病毒(例如马脑病病毒)或整合缺陷型慢病毒载体的电穿孔或转染进行。更优选地，Treg细胞的所述遗传修饰可以通过用慢病毒载体转导所述细胞来进行。
本发明还提供了一种测试各种各样抗原制剂以通过使所述抗原与CD137 CAR接触来诱导Treg激活的方法。例如，通过使抗原样品与表达具有抗原结合域的CAR的Treg接触，第一抗原样品与不同于第一抗原样品的至少第二抗原样品激活表达CD137 CAR的Treg的能力，和比较所述各种各样抗原样品诱导的Treg激活。
因此，在另一方面，本发明提供了一种用于分析(比较)第一抗原样品与不同于第一抗原样品的第二抗原样品激活Treg细胞中表达的CAR的激活效率的方法，所述CAR包含：
i)至少一个抗原结合结构域，
ii)跨膜结构域，
iii)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的所述第一抗原样品的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原，
所述方法包括：
a)提供包含调节性T细胞的样品
b)遗传修饰所述Treg细胞以表达所述CAR
c)通过使所述CAR的抗原结合结构域与所述第一抗原样品接触6-16小时来激活所述遗传修饰的Treg细胞，和通过使所述CAR的抗原结合结构域与所述第二抗原样品接触6-16小时来激活所述遗传修饰的Treg细胞，
d)测量与所述第一抗原样品接触的所述Treg细胞和与第二抗原样品接触的所述Treg细胞的Treg激活，其中不同的激活水平指示所述第一抗原样品和所述第二抗原样品激活在Treg细胞中表达的所述CAR的功能活性的不同效率。
所述第一抗原样品和所述第二抗原样品可以在例如抗原的形式上不同，例如可溶形式，单体相比于多聚抗原，附着至各种各样载体的抗原，例如大表面如培养皿，可变大小的微珠，例如50nm-50pm但不限于此，或生物相容的大分子基质，例如葡聚糖或其他多糖，或可以被CAR的相同抗原结合域结合但例如以不同亲和力结合或以在CAR中诱导的不同构象变化结合的不同抗原，等等。
可以通过本领域公知的方法(例如，包括逆转录病毒和慢病毒的基于病毒的系统，包括电穿孔的物理方法，生物方法，化学方法)将编码本文公开的CAR的DNA或RNA构建体(核酸分子)转染或转导到宿主细胞中。不管用于在宿主细胞中整合，优选稳定地整合编码本文公开的CAR的DNA的方法如何，结果是宿主细胞本文公开的表达CAR。
或者，核酸序列可以合成产生。
可以通过本领域众所周知的方法，例如，基于荧光的分离技术，如
或磁性细胞分离方法，例如
(Miltenyi Biotec GmbH)，在用于从非转染/转导的细胞产生这样的工程化细胞的转染/转导过程之后，分离(富集或分离)表达本文公开的抗原结合受体的工程化细胞。
通常，可以从受试者获得细胞，例如免疫细胞，优选T细胞，用于产生表达本文公开的抗原结合受体的工程化细胞。细胞，如免疫细胞，优选T细胞，可以从各种各样的来源获得，例如全血，外周血单核细胞(PBMC)，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织或其他含有T细胞的组织。对于这些细胞的富集，可以使用本领域中公知的方法，例如通过FicollTM或PERCOLLTM梯度离心，或正/负选择技术如荧光分选(例如FACSsort)或磁性分选(例如
)。
示例性地，例如用与对CD25具有特异性的抗体偶联的磁珠对受试者的血液或组织样品的Treg进行磁标记，洗涤，磁富集并收集。然后，可以将这些Treg工程化以在其细胞表面上表达本文公开的抗原结合受体。
在本发明的一个实施方式中，表达本文公开的抗原结合受体的分离的/富集的工程化细胞，例如免疫细胞，优选Treg细胞，可以在遗传修饰之前或之后被激活，并使用已知的方法扩增以增加工程化细胞的数量。例如，用Treg扩增试剂盒(Miltenyi Biotec)对Treg进行多克隆刺激，该试剂盒由在合适的生长因子例如IL-2存在下与CD3和CD28结合抗体缀合的微米级颗粒组成。优选地，所述工程化细胞例如免疫细胞，如T细胞的数量可以增加到治疗有效量。
本文公开的表达CAR的遗传修饰的Treg细胞可以在封闭系统中的自动化过程中产生。在本发明的一个实施方式中，用于产生本文公开的表达CAR的遗传修饰的Treg的方法可以包括例如以下步骤：
a)提供包含调节性T细胞的样品，
b)遗传修饰所述样品的所述调节性T细胞以表达所述CAR，
c)任选地使遗传修饰的调节性T细胞扩增，
d)通过与CAR配体接触6-16小时来激活所述扩增的遗传修饰的调节性T细胞，
e)通过以下分离步骤d)的激活的Treg细胞，
α)使步骤d)的所述细胞与：
I)结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭；或
II)结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物如CD137的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，和
β)使
I)步骤α)I)的所述细胞与结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物如CD137的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体；或
II)步骤α)II)的所述细胞与结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体。
所有或一些这些步骤可以在封闭系统中自动执行，优选在封闭无菌系统中执行。
该方法特别适合于制备遗传修饰的Treg细胞，其中富集的Treg细胞通过使用病毒和/或非病毒载体来遗传修饰。
这些步骤中的任何一个都可以重复、省略或以不同的顺序发生。
作为用于细胞修饰的封闭系统，可以使用完全自动化的细胞处理装置CliniMACS
和相关联的管路套件(Miltenyi Biotec GmbH，德国)(W02009/072003)。这种封闭系统满足几乎所有类型的细胞产品的GMP级处理要求，并且可以允许降低洁净室要求，改善技术转让并协调细胞制造工艺。
在本发明的一个实施方式中，本文公开的表达CAR的工程化Treg可以用于治疗患有失调如自身免疫，移植排斥，过敏症或慢性炎性疾病的受试者。
可以从受试者分离Treg，优选可以使用人或已建立的免疫细胞系。该受试者可以患有所述失调或可以是健康受试者。这些Treg细胞在体外被遗传修饰以本文公开的表达CAR。这些工程化Treg细胞可以在体外被激活并扩增成治疗有效的本文公开的表达CAR的细胞群，并且它们可以在修饰之前或之后通过本文公开的方法进一步富集至更高纯度。在细胞疗法中，在第二药物组合物即具有Treg细胞的外部刺激的功能的可溶性抗原之外，这些工程化Treg细胞可以作为药物组合物(或本文公开的表达CAR的治疗有效细胞群的制剂)输注到有需要的受体中。受体中输注的Treg细胞可以能够在治疗下抑制受试者的炎性免疫反应或至少减少所述失调的作用和/或症状。受体可以是从其获得所述细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，也可以是来自同一物种的另一受试者(同种异基因细胞疗法)。
可以使用本领域技术人员已知的技术配制本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体以施用于受试者。
本文公开的包含治疗有效的表达CAR的Treg细胞的群体的制剂可以包含药学上可接受的赋形剂(载体或稀释剂)。取决于例如本文公开的CAR的抗原结合结构域的性质，制剂中包含的赋形剂将具有不同的目的。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水，缓冲盐水，右旋糖，注射用水，甘油，乙醇及其组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。
本文公开的表达CAR的Treg细胞的治疗有效群体的制剂可以包括一个本文公开的表达CAR的Treg细胞的群体，或一个以上的本文公开的表达CAR的细胞的群体。本文公开的表达CAR的Treg细胞的不同群体可以例如基于所使用的CAR的抗原结合结构域的身份和/或激活结构域的身份而变化。
可以使用技术人员已知的方式和技术将包含本文公开的表达CAR的Treg细胞的治疗有效群体的制剂施用于受试者。示例性模式包括但不限于静脉内注射。其他模式包括但不限于瘤内，皮内，皮下(s.c，s.q.，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m.)，腹膜内(i.p.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液区域)，颅内，脊柱内和鞘内(脊液)。
施用于受试者的包含本文公开的表达CAR的Treg细胞的治疗有效群体的制剂包含有效治疗特定适应症或失调的一定数量的本文公开的表达CAR的Treg细胞。
通常，可以施用包含约1×104至约1×1010个本文公开的表达CAR的Treg细胞的制剂。在大多数情况下，该制剂可包含约1×105至约1×109个本文公开的表达CAR的Treg细胞，约5×105至约5×108个本文公开的表达CAR的Treg细胞或约1×106约1×107个本文公开的表达CAR的Treg细胞。然而，向受试者施用的本文公开的表达CAR的Treg细胞的数量可以在宽泛的限度之间变化，取决于失调的位置，来源，性质，程度和严重度，待治疗个体的年龄和状况，等等。医生可以最终确定要使用的适当剂量。
可以使用熟练技术人员已知的技术配制可溶性抗原，例如葡聚糖，以施用于受试者。可溶性抗原例如葡聚糖的制剂可以包含药学上可接受的赋形剂(载体或稀释剂)。制剂中包含的赋形剂将具有不同的目的，取决于例如可溶性抗原的性质和施用方式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水，缓冲盐水，右旋糖，注射用水，甘油，乙醇及其组合，稳定剂，增溶剂和表面活性剂，缓冲剂和防腐剂，张度剂，填充剂和润滑剂。
可溶性抗原的制剂可包括一种类型的可溶性抗原，或多于一种类型的可溶性抗原。
可以使用技术人员已知的方式和技术将可溶性抗原例如葡聚糖施用于受试者。示例性方式包括但不限于静脉内，腹膜内和肿瘤内注射。其他模式包括但不限于皮内，皮下(s.c，s.q.，sub-Q，Hypo)，肌内(i.m.)，动脉内，髓内，心内，关节内(关节)，滑膜内(关节液区域)，颅内，脊髓内和鞘内(脊髓液)。
包含可溶性抗原例如葡聚糖的制剂以有效治疗特定适应症或失调的量施用于受试者。通常，可以将包含至少约1μg/kg至约100mg/kg体重的可溶性抗原例如葡聚糖的制剂施用于需要治疗的受试者。在大多数情况下，考虑到施用途径，症状等，剂量可为每天或每周或每月约100μg/kg至约10mg/kg体重的可溶性抗原，例如葡聚糖。施用于受试者的制剂中的可溶性抗原例如葡聚糖的量可以在宽泛限度之间变化，取决于失调的位置，来源，性质，程度和严重度，待治疗个体的年龄和状况等。医生可以最终确定要使用的适当剂量。
本文定义的关于本发明的一个方面，例如本发明的第一方面的所有定义、特性和实施方式，在作必要的变通后，也适用于本文公开的本发明的其他方面的上下文。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
通常，CAR可以包含包含抗原结合结构域的细胞外结构域(细胞外部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(细胞内信号传导结构域)。细胞外结构域可以通过接头连接至跨膜结构域。细胞外结构域还可包含信号肽。在本发明的一些实施方式中，CAR的抗原结合结构域结合与多肽(“半抗原化”或“标签化”多肽)偶联的半抗原，其中所述多肽可结合疾病相关抗原，例如自身抗原，或衍生自无害外源物质(例如微生物群)，空气传播颗粒(例如植物花粉，真菌孢子)的抗原。如例如在US9233125B2中公开的，这样的CAR也可以被称为“抗标签(anti-tag)”CAR。在本发明的其他实施方式中，CAR的细胞外部分可包含接头/标记表位(LLE)结合结构域作为与是TCBM的一部分的接头/标记表位(LLE)结合的抗原结合结构域。如在欧洲专利申请EP16196487.9中公开的，这样的CAR可以被称为抗LLE CAR。这两种类型的CAR都是通用和/或适应性CAR。半抗原和LLE都是直接或间接偶联至多肽(标签化多肽)的“标签”，其中所述多肽可以结合疾病相关抗原，例如在靶细胞的(细胞)表面上表达的自身抗原，或衍生自无害外源物质(例如微生物群)，空气传播颗粒(例如植物花粉，丝状孢子)的抗原。在本发明的其他实施方式中，CAR的抗原结合结构域与本文公开的可溶性抗原结合。
“信号肽”是指指导蛋白质在细胞内运输和定位例如到某个细胞器(例如内质网)和/或细胞表面的肽序列。
通常，“抗原结合结构域”是指CAR的与抗原例如可溶抗原特异性结合的区域。本发明的CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域。通常，CAR上的靶向区域位于细胞外。抗原结合结构域可包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可包括例如全长重链，Fab片段，单链Fv(scFv)片段，二价单链抗体或双抗体。任何与给定抗原特异性结合的分子，例如来自天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域，都可以用作抗原结合结构域。抗原结合结构域通常是scFv。通常，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scFv。这样的接头可以是例如“(G4/S)3-接头”。
在某些情况下，抗原结合结构域衍生自将在其中使用CAR的同一物种是有益的。例如，当计划将其治疗性地用于人时，对于CAR的抗原结合结构域可以有益的是包含人或人源化抗体或其抗原结合片段。人或人源化抗体或其抗原结合片段可以通过本领域众所周知的多种多样方法来制备。
如本文所用，“间隔子(spacer)”或“铰链”是指在抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水性区域。本发明的CAR可以包含细胞外间隔域，但是省去这种间隔子也是可能的。间隔子可以包括例如抗体的Fc片段或其片段，抗体的铰链区或其片段，抗体的CH2或CH3区，辅助蛋白，人工间隔子序列或其组合。间隔子的一个突出例子是CD8alpha铰链。CAR的跨膜结构域可以源自这样的结构域的任何期望的天然或合成来源。当来源是天然的时，该结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜结构域可以衍生自例如CD8α或CD28。当关键信号传导和抗原识别模块(结构域)位于两个(或更多个)多肽上时，则CAR可具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异二聚结构域，分开的关键信号传导和抗原识别模块使得能够小分子依赖性地、可滴定地和可逆地控制CAR细胞表达(Wu等，2015，Science，350：293-303)。
CAR的胞质信号传导结构域(或细胞内信号传导结构域)负责激活表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。“效应子功能”是指细胞的专门化功能，例如在Treg中，效应子功能可以是抑制活性或调节活性，包括分泌免疫抑制细胞因子，例如IL-10，IL-35，TGF-β，或表达抑制分子。如TIGIT，CTLA4，竞争性细胞因子受体如IL-2受体。细胞内信号传导结构域是指蛋白质的一部分，其转导效应子功能信号并指导表达CAR的细胞执行专门化功能。细胞内信号传导结构域可以包括给定蛋白质的细胞内信号传导结构域的足以转导启动或阻断免疫细胞效应子功能的信号的任何完整、突变或截短的部分。
用于CAR的细胞内信号传导结构域的突出例子包括T细胞受体(TCR)的胞质信号传导序列以及在抗原受体参与后启动信号转导的共受体。
通常，T细胞激活可以通过两类不同的胞质信号传导序列来介导，首先是通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列，初级胞质信号传导结构域)，其次是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列，共刺激信号传导结构域)。因此，CAR的细胞内信号传导结构域可包含一个或多个初级胞质信号传导结构域和/或一个或多个次级胞质信号传导结构域。
以刺激方式起作用的初级胞质信号传导结构域可包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)。
经常在CAR中使用的包含ITAM的初级胞质信号传导结构域的实例是衍生自TCRζ(CD3ζ)，FcRgamma，FcRbeta，CD3gamma，CD3delta，CD3epsilon，CD5，CD22，CD79a，CD79b和CD66d的那些。最突出的是衍生自CD3ζ的序列。
可以将CAR的胞质结构域设计成包含CD3ζ信号传导结构域自身或与任何其他期望的胞质结构域组合。CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区(结构域)。共刺激信号传导区是指CAR的一部分，其包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是淋巴细胞有效应答抗原所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子的实例是CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以用或未用接头以随机或指定顺序彼此连接。短寡肽或多肽接头，其长度优选为2至10个氨基酸，可以形成该连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸对。
举例来说，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实例中，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。在另一个实例中，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域，CD28的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。
如本文所用，术语“CD137 CAR”是指在至少初级胞质信号传导结构域之外，CAR还包含至少CD137共刺激信号传导结构域。如本文所用，术语“CD28 CAR”是指在至少初级胞质信号传导结构域之外，CAR还包含至少CD28共刺激信号传导结构域。如前所述，CAR的细胞外部分或跨膜结构域或胞质结构域还可出于分开CAR的关键信号传导和抗原识别模块的目的而包含异二聚结构域。
可以进一步修饰CAR以在编码CAR的核酸的水平上包括一个或多个通过自杀开关消除CAR-T细胞或Treg细胞的操作元件。自杀开关可包括例如凋亡诱导信号传导级联反应或诱导细胞死亡的药物。在一个实施方式中，表达和编码CAR的核酸可以被进一步修饰以表达酶，例如胸苷激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)。
本发明的CAR可以被设计为以任何顺序和/或组合包含本文所述的上述结构域的任何部分或部分，从而产生功能性CAR，即介导免疫效应细胞的免疫效应应答的CAR，所述免疫效应细胞表达所述CAR但包含至少CD137共刺激结构域。
如本文所用，术语“抗体”以最广义使用，以涵盖各种各样形式的抗体结构，包括但不限于单克隆和多克隆抗体(包括全长抗体)，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，抗体片段，即特异性识别(即结合)靶抗原的抗体、免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体的抗原结合片段。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选其可变结构域，或至少其抗原结合位点(“抗体的抗原结合片段”)。抗体片段的实例包括Fab(片段抗原结合)，scFv(单链可变片段)，单结构域抗体，双抗体，dsFv，Fab'，双抗体，单链抗体分子，和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“抗原”旨在包括结合或引起一种或多种抗体的产生的物质，并且可以包括但不限于蛋白质，肽，多肽，寡肽，脂质，碳水化合物例如葡聚糖，半抗原及其组合，例如糖基化蛋白质或糖脂。
术语抗原可以指在靶细胞的细胞表面上表达的抗原。但是该术语还可以指，例如在可以用本文公开的表达CAR的工程化Treg治疗的受试者中，不在细胞表面上表达或存在的抗原。则该抗原在本文中称为“可溶性抗原”。本文所用的术语“可溶性抗原”和“游离抗原”可以互换使用，是指可以被本文公开的CAR的抗原结合结构域结合的可溶性抗原不是天然表达或存在于受试者(优选人)的细胞的表面上，当将表达所述CAR的Treg施用于所述受试者时。优选地，可溶性抗原不存在于向其施用表达所述CAR的所述Treg细胞的受试者的血液或组织中。更优选地，除了与所述CAR的抗原结合结构域结合之外，其也不具有与受试者中的另外的分子结合的特异性亲和力或偏好。优选地，所述可溶性抗原可以是外源抗原。所述外源抗原可以施用于还接受或已接受表达所述CAR的Treg的受试者用于治疗本文公开的失调，它是与本文公开的CAR的抗原结合结构域结合的外部刺激物(外部刺激物)，可以随后激活表达所述CAR的Treg细胞。所述外源可溶性抗原可以是非引起疾病的抗原，其当施用于所述受试者时，不对受试者引起伤害。外源可溶性抗原可以是例如大分子，例如多肽或多糖，其优选在本文公开的待治疗的受试者中不天然存在。
可溶性抗原，优选外源性可溶性抗原，可以选自大分子，例如蛋白质，多糖，寡核苷酸或多核苷酸，聚乙二醇或任何其他可施用于人的生物相容性聚合物化合物或所述分子的衍生物，例如与较大的大分子结合的小分子“半抗原”。可溶性抗原可以以允许激活CAR的形式施用，其通常通过交联来实现，即，所用的大分子可以包含一个以上的拷贝，理想地，被CAR的抗原结合结构域结合的多个拷贝的实际结构域。这样的多价分子可以诱导交联和CAR激活。优选地，对(外源)可溶性抗原的唯一要求是其可以在本文公开的治疗的受试者的循环系统中循环，例如血液系统或淋巴系统和/或组织，并且不是所述受试者的细胞的表面的一部分，结果是当将所述Treg细胞施加于所述受试者时，(外源)可溶性抗原可以仅被由Treg细胞表达的本文公开的CAR的抗原结合结构域结合。因此，(外源)可溶性抗原也可以固定在结构如珠子(纳珠，微珠)上，其允许固定在这样的结构上的抗原在循环系统例如所述受试者的血液系统中循环。在本发明的含义中，这些也可以是(外源)可溶性抗原。
优选的可溶性抗原是葡聚糖(葡聚糖分子)。可以将所述葡聚糖施用于需要用表达所述CAR的Treg治疗的受试者，作为游离葡聚糖分子或固定在颗粒如微珠或纳珠上。
葡聚糖(dextran)是一种复杂的支链葡聚糖(glucan)(由许多葡萄糖分子构成的多糖)，其包含不同长度(3至2000千道尔顿)的链。任何长度的葡聚糖，例如3至2000kDa，都可以用于本文公开的应用。优选地，所使用的葡聚糖可以超过5、10、20、100或200kDa。在本发明的一些实施方式中，所使用的葡聚糖可以是60至200kDa的葡聚糖。如本文所用，可溶性葡聚糖可呈现出针对本文公开的结合葡聚糖的CAR的许多抗原。对于抗葡聚糖CAR，葡聚糖可以是多抗原而不是单抗原。
所述葡聚糖可以是未结合的葡聚糖，即游离葡聚糖，可溶性葡聚糖或与胶体纳米颗粒或微粒缀合的葡聚糖。可以将所述葡聚糖施用于有需要的患者，该患者具有本文公开的Treg细胞以在可控条件下激活所述Treg细胞。
所述葡聚糖也可以作为药物组合物的一部分施用于受试者(例如Deltadex；在NaCl中为10％的葡聚糖40；每kg体重或更低输注例如1.5g葡聚糖)。或者，可以将葡聚糖偶联至抗体或另外的附着结构，其允许葡聚糖特异性地靶向体内的细胞或组织基质表面，例如细胞外基质附着肽。
Treg(本文也称为“调节性T细胞”或“Treg细胞”)在本文中定义为Foxp3+CD4+T细胞，其通常也表达CD25且缺乏CD127的表达。Treg的特征还在于在激活时选择性表达CD137，但缺乏CD154表达，以及在激活的4-8小时时间窗内缺乏效应细胞因子表达，例如IL-2-IFN-γ，IL-17，IL-4等。Treg的特征还在于特定DNA区域的选择性去甲基化，例如在foxp3基因区域内(Treg特异性去甲基化区域，TSDR；也参见Huehn,J.,等,2009,Nat Rev Immunol 9,83-9)，但也在于在其他区域如CD25，CTLA4，FANK1，CD137，CD154基因区域中的其他特定甲基化模式。它们代表具有高度免疫抑制功能的独立T细胞谱系，其是维持对抗自身抗原和无害外来抗原的耐受性所需的。如本文所定义的Tcon细胞包含不是Treg的所有CD4+T细胞。
如本文所用，术语“靶细胞”是指可以在其细胞表面上表达应被本文公开的CAR直接或间接(例如经由标签化多肽)识别(结合)的抗原的细胞。
所述靶细胞可以是处于引起受试者的自身免疫，移植排斥，过敏症和慢性炎性疾病的疾病状态的细胞。
自身免疫是指免疫细胞针对自身，导致可引起自身免疫疾病的针对内源性结构的免疫反应的状态。移植排斥是指产生针对被宿主的免疫系统识别为外来物的移植组织，导致移植组织排斥的免疫反应。
过敏症是指例如在吸入，摄入或皮肤接触时，产生针对与受试者接触的可例如源自环境或食物的无害外来抗原的不适当的免疫反应。
慢性炎性疾病是指针对残留在系统中的抗原产生免疫反应。实例包括针对在例如炎症性肠病期间的细菌，在慢性感染期间的病毒或在自身免疫反应期间的内源性结构的免疫反应。实例还可以包括由于针对外来抗原的过敏反应而导致的慢性炎症。自身免疫性疾病是由自身免疫性引起的状况，导致可影响多个不同器官系统的病理。实例包括受试者的类风湿性关节炎，多发性硬化症，视神经脊髓炎，全身性红斑狼疮，1型糖尿病，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的慢性感染，这是指引起疾病的因素如病毒、细菌或寄生虫在其复制后入侵受试者。
可以分离和/或纯化本文公开的CAR(多肽)，编码CAR的核酸分子，重组表达载体，表达CAR的细胞和表达CAR的细胞的群体。术语“分离的”是指从自然状态改变或移除。例如，分离的细胞群是指这样的细胞的富集和与通常以其天然存在状态与所述分离的细胞相关联的其他细胞分离。分离的细胞群是指基本上纯化的细胞群，其是比自然界中发现的更均匀的细胞群。优选地，富集的细胞群包含至少约90％的所选细胞类型。在特定方面，细胞群包含至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或甚至100％的所选细胞类型。
例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，而与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质也可以存在于非天然环境中，例如在宿主细胞中。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如小鼠，大鼠，牛，猪，山羊，鸡，狗，猴或人。优选地，受试者是人。该受试者可以是患有失调如自身免疫疾病，过敏症，移植排斥或慢性炎症的病症的受试者(患者)，但是该受试者也可以是健康受试者。
如本文所用，术语“自体的”是指源自相同受试者，随后将其重新引入该受试者的任何材料。
如本文所用，术语“同种异基因的”是指源自与重新引入该材料的受试者相同物种的不同受试者的任何材料。
术语“治疗有效量”或“治疗有效群体”是指在受试者中提供治疗益处的细胞群的量。
涉及抗体的抗原结合结构域或其抗原结合片段的术语“特异性结合”或“特异于”，例如在本文公开的CAR中使用，是指识别并结合至特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域也可以与来自另外的物种的抗原结合。这种跨物种反应性对于许多抗体是典型的，因此与该抗原结合域是特异性的定义不矛盾。特异性结合抗原的抗原结合结构域还可以结合该抗原的不同等位基因形式(等位基因变体，剪接变体，同工型等)或来自同一基因家族的该抗原的同源变体。这种交叉反应性对于许多抗体是典型的，因此与该抗原结合结构域是特异性的定义不矛盾。
本文所用的术语“工程化细胞”和“遗传修饰的细胞”可以互换使用。该术语意指包含和/或表达外来基因或核酸序列，其进而修饰细胞或其后代的基因型和/或表型。特别地，该术语是指可以通过本领域熟知的重组方法来操纵细胞，优选免疫细胞，以稳定或瞬时表达天然状态下这些细胞中不表达的肽或蛋白质。例如，将免疫细胞工程化为在其细胞表面上表达人工构建体，例如嵌合抗原受体。
术语“失调”是指受试者中的功能异常或紊乱，例如癌症，自身免疫疾病，或者由病毒，细菌，寄生虫或其他引起的感染。
如本文所用，术语“治疗”失调(的治疗)是指降低受试者经历的疾病或失调的至少一种体征或症状的频率或严重性。免疫疗法是定义为“通过诱导，增强或抑制免疫反应来治疗疾病”的医学术语。被设计为引起或放大免疫应答的免疫疗法被分类为激活免疫疗法，而减少或抑制免疫应答的免疫疗法则被分类为抑制免疫疗法。癌症免疫疗法作为激活免疫疗法试图刺激免疫系统以排斥并破坏肿瘤。过继性细胞转移利用基于细胞的细胞毒性反应来攻击癌细胞。对患者的癌症具有天然或基因工程化反应性的免疫细胞(例如T细胞)在体外产生，然后转移回癌症患者中。
本文所用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列在细胞中的转录和/或翻译。
序列表方案中给出的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列是本文公开的CAR的部分序列。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的所述序列也可以包含该等序列的变体，其使一些氨基酸被缺失，添加或替换，同时仍保留本文所述的预期功能。因此，该定义中包括的是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的氨基酸序列的变体，例如与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2基本上相似的氨基酸序列，在氨基酸序列水平上分别具有至少70％或至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％或99％的序列同一性。通常，在该定义中包括不导致序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的预期功能的有意改变的所有氨基酸变化。在本发明的上下文中，可以使用成对比对，使用本领域众所周知的氨基酸序列的比对程序来确定“序列同一性”。
“循环系统”是受试者的器官系统，其允许血液循环以及向和从体内细胞输送养分(例如氨基酸和电解质)，氧气，二氧化碳，激素和血细胞，以提供营养并有助于抵抗疾病，稳定温度和pH，和维持体内平衡。循环系统包括两个独立的系统：分配血液的心血管系统和循环淋巴的淋巴系统。
如本文所使用的术语“自动化方法”或“自动化过程”是指通过使用设备和/或计算机和计算机软件来自动化，否则操作者会或可以手动执行的任何过程。已经被自动化的方法(过程)需要更少的人工干预和更少的人类时间来交付。在某些情况下，如果在没有任何人工支持或干预的情况下执行方法的至少一个步骤，则该方法是自动化的。优选地，如果方法的所有步骤均在没有人工支持或干预的情况下执行，则该方法为自动化的。
如本文所用，术语“颗粒”是指固相，例如胶体颗粒，微球，纳米颗粒或珠。产生这种颗粒的方法在本领域中是众所周知的。颗粒可以是磁性颗粒。在用于本发明之前，颗粒可以处于溶液或悬浮液中，或者可以处于冻干状态。然后将冻干的颗粒在便利的缓冲液中重构，然后与涉及本发明的待处理样品接触。
一种特别有效的分选技术是磁性细胞分选。磁性分离细胞的方法可从多家供应商商购。在用于富集、分选和/或检测包含细胞的生物样品中的细胞的优选实施方式中，例如Treg细胞和其他(免疫细胞)单克隆抗体或其抗原结合片段通过例如多糖与具有有机涂层的胶体超顺磁性微粒结合使用(磁激活细胞分选(
)技术(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany))。
另一种分选技术使用流式细胞术。流式细胞术是通过将例如细胞悬浮在流体流中并使它们通过电子检测设备，例如在细胞分选和生物标志物检测中使用的基于激光或阻抗的生物物理技术。它允许同时对多达每秒数千个颗粒的物理和化学特性进行多参数分析。荧光激活细胞分选(FACS)是流式细胞仪的一种特殊类型。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特性，将生物细胞的异质混合物分选到两个或更多个容器中，一次一个细胞的方法。
如本文所用，在细胞分离，纯化或富集的上下文中，术语“耗竭”，“耗竭”等具有本领域的正常含义，并且是指从包含Treg和其他(免疫)细胞的样品去除规定细胞(例如，CD154+细胞)。耗竭方法是本领域众所周知的，并在本文中进行了描述，包括例如FACS或MACS分选，其中群体中的规定细胞(例如CD154+细胞)被标记并从细胞群中移出，从而形成新群，其中不存在该规定细胞或该规定细胞以低于起始群中的比例存在。将认识到“耗竭”不需要该规定细胞被完全去除或新群完全没有该规定细胞。通常，从群体中耗竭规定细胞意味着使这样的细胞的代表(测量为群体中的所有细胞的百分比)减少至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约98％或至少约99％。
如本文所用，在细胞分离、纯化或富集的上下文中，术语“阳性选择”具有本领域的正常含义，并且是指从包含Treg和任选地其他(免疫)细胞的样品中富集规定细胞(例如，CD137+细胞)。用于阳性选择的方法是本领域众所周知的，并在本文中进行了描述，包括例如FACS或MACS分选，其中群体中的规定细胞(例如CD137+细胞)被标记并从细胞群中分离，分离的细胞产生新群，其中规定细胞以比起始群体中更高的比例存在。
实施方式
在本发明的一个实施方式中，产生表达CAR的Treg，所述CAR包含CD3ζ和CD137信号传导结构域以及对外源抗原例如葡聚糖具有特异性的抗原结合结构域。可以通过本领域众所周知的方法(例如，基于病毒的系统，物理方法，生物方法，化学方法)将编码所述CAR的DNA构建体转染或转导到Treg细胞中。无论用于在所述Treg细胞中整合，优选稳定整合编码所述CAR的所述核酸的方法如何，结果是所述Treg细胞表达所述CAR。通过将葡聚糖添加到在细胞培养物中或在其所施用的受试者的血液中循环的细胞，可以在体外和体内激活这些Treg细胞。
在本发明的另一个实施方式中，在通过用相应的抗原例如葡聚糖进行抗原特异性激活后，通过磁性或荧光分选来分离表达与或不与CD154组合的CD137的细胞，分离本发明的表达CAR的Treg。
在本发明的一个实施方式中，Treg可以从多种多样的来源获得，例如外周血单核细胞(PMBC)，骨髓，淋巴结组织，脐带血或胸腺组织。为了富集这些细胞，可以使用本领域众所周知的方法，例如通过FicollTM或PERCOLLTM梯度进行离心，或正/负选择技术，例如荧光分选(例如，FACSsort)或磁分选(例如，
)。
在一个实施方式中，具有受试者的给定来源的Treg被磁性标记，例如用与对CD4和/或CD25和/或CD127和/或CD154和/或CD137具有特异性的抗体偶联的磁珠，洗涤，磁性富集并收集。然后，可以将这些Treg细胞工程化以在其细胞表面表达CD137-CD3ζ-CAR。
在本发明的另一个实施方式中，在转染/转导过程后，通过本领域众所周知的方法，例如基于荧光的分离技术如
或磁性细胞分离方法如
分离本发明的表达CAR的工程化Treg。
在本发明的一个实施方式中，在存在外源抗原(例如葡聚糖)或用抗CD3/抗CD28进行的多克隆刺激的情况下扩增表达CD137-CD3ζ-CAR的工程化Treg，以增加工程化Treg的数量并提高表达CD137-CD3ζ-CAR的Treg的纯度。优选地，所述工程化Treg的量被增加至治疗有效量。
在本发明的一个实施方式中，对具有高纯度(例如，＞80％FoxP3表达)的Treg进行基因工程化以表达CD137-CD3ζ-CAR。
在本发明的一个实施方式中，通过与其他标志物例如CD25，CD127，CD154组合的CD137的表达来分离具有高纯度(例如＞80％FoxP3表达)的Treg。
在本发明的一个实施方式中，CD137-CD3ζ-CAR用于治疗患有炎性疾病或自身免疫性疾病例如炎性肠病，类风湿性关节炎，多发性硬化或移植排斥或移植物抗宿主病(GvHD)的受试者。
在本发明的一个实施方式中，CD137-CD3ζ-CAR通过局部位置或全身性施用可溶性或珠固定化形式的外源抗原(例如葡聚糖)来激活，优选在患有炎性疾病或自身免疫性疾病例如IBD，类风湿性关节炎，MS，移植排斥，GvHD的患者中。
实施例
实施例1：具有不同细胞内信号传导结构域的葡聚糖特异性CAR-Treg的产生。
该CAR构建体含有特异性结合片段，该特异性结合片段衍生自对外源抗原(例如葡聚糖)具有特异性的抗体。铰链区可以衍生自例如IgG结构域，CD8a CD8a或CD28，并且可以包含允许检测CAR的表位/标签。跨膜结构域可以衍生自例如CD8a或CD28，随后是包含CD3ζ和CD137的1-3个信号传导结构域，例如如图1A所示。Treg被基因工程化以表达CD137-CD3ζ-CAR，其可以通过LNGFR的表达来确定(图1B)。CD137-CD3ζ-CAR的抗原结合可通过与可以加上标记(例如，荧光地)的各自抗原一起孵育来确定，如图1C中葡聚糖所示。
实施例2：具有不同细胞内信号传导结构域的CAR-Treg的激活。
对外源抗原(例如葡聚糖)具有特异性的CAR-Treg可以被它们各自的抗原激活，并且激活可以通过CD137表达来分析。在用珠结合的葡聚糖刺激后，CAR-Treg激活如图2A所示。CD137-CD3ζ-CAR在诱导CAR-Treg中的CD137表达的方面更为有效(图2A)。通过ZAP70的磷酸化分析了具有相同特异性的其他测试的CAR构建体的功能性。在具有例如CD28-CD3ζ信号传导的CAR-Treg中检测到磷酸化ZAP70(图2B)，但只有CD137-CD3ζ-CAR诱导的Treg激活(图2A)。
实施例3：具有不同细胞内信号传导结构域的葡聚糖特异性CAR-Treg的扩增。
对外源抗原(例如葡聚糖)具有特异性的CAR-Treg可以在抗CD3/-CD28(图3A，C)或它们各自的抗原(例如珠结合的葡聚糖(图3B，D))存在下扩增。只有具有CD137-CD3ζ-CAR的CAR-Treg扩增，从而显示了CD137-CD3ζ-CAR的卓越功能性。
实施例4：Treg和Tcon中的不同细胞内信号传导结构域的比较。
生成CAR-Treg和CAR-Tcon，其表达具有与CD3ζ组合的不同共刺激结构域的抗葡聚糖CAR。葡聚糖结合在构建体之间相似(图4A)，但是不同的信号传导结构域对Treg和Tcon激活具有不同影响。Treg激活通过CD137表达来分析，Tcon激活通过CD154表达来分析。用CD137-CD3ζ最有效地激活CAR-Treg，而用CD28-CD3ζ最有效地激活CAR-Tcon(图4B)。
实施例5：抗原特异性CAR-Treg的分离。
用葡聚糖刺激6小时后，通过LNGFR表达或通过CD137表达分离具有CD137-CD3ζCAR的CAR-Treg。两种分选策略之间的转基因(图5A)和受体表达(图5B)相似，但是当CAR-Treg通过CD137表达来分选时，抗原特异性再刺激是高度有效率的(图5C)。
方法
CAR构造
所有CAR结构体均包含AC146衍生的scFv，CD8跨膜结构域，XS IgG4铰链和P2A连接的ΔLNGFR，用于检测转染和转导的细胞。慢病毒上清液是通过将HEK293T细胞与表达载体和包装质粒共转染而产生的。转染前一天，将3×106个HEK293T细胞在完全DMEM(cDMEM)中接种在10cm细胞培养皿中，该完全DMEM由DMEM(
)，+10％FCS+100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素+50μM2-巯基乙醇组成(均为Thermo Fisher Scientific，Schwerte，德国)。用在补充有2,5M CaCl2的ddH2O中稀释的0.84μg pMDG-2.VSV-G，5,16μg pCMVΔR8.74和3,35μg Dextran-CAR质粒瞬时转染细胞。充气时，将2ml的2×HBS缓冲液(在ddH2O中的136,89mMNaCl，4,96mM KCl，1,76mM Na2HPO4、20,98mM HEPES，pH＝6,75-6,76)缓慢添加到溶液中，并向该等细胞滴加2ml的转染溶液。4小时后除去含有转染溶液的培养基，并在加入新鲜的cDMEM之前，用预加温的PBS洗涤细胞两次。48小时后，收获慢病毒上清液，过滤(0.45μm)，直接使用或在-80℃下保存至多6个月。
Treg分离与转导
来自健康供体的白细胞分离术产物获自德国柏林的Charité大学医院，具有根据道德准则的知情同意书。PBMC通过Ficoll-Paque(GE Healthcare Life Sciences，Freiburg，德国)梯度离心获得。根据制造商的建议，使用CD25微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)从PBMC中分离出CD25+Treg。将Treg在由TexMACS培养基(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)+5％(v/v)人AB血清(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)+100U/ml IL-2+100nmol雷帕霉素(两者均为Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(
Thermo FisherScientific，Schwerte，德国)组成的“Treg扩增培养基”中，在球与细胞比率为4:1的Treg扩增珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国))的存在下培养。CD4+Tcon在TexMACS培养基(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)+5％(v/v)人AB血清(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)+200U/ml IL-2中，在30ng/ml抗CD3和lμg/ml抗CD28的存在下激活。在第3天，将培养基更换为补充有4μg/ml硫酸鱼精蛋白的相应慢病毒上清液，并且将细胞在800g和32℃下在纤维连接蛋白(retronectin)包被的96孔板上旋转接种90分钟。离心后，除去病毒上清液，并将新鲜的培养基加入细胞中。在转导后的第2天或第3天通过在细胞表面上对LNGFR染色，评估转导效率。Treg和Tcon扩增10-12天，每2-3天更换培养基。细胞在RPMI-1640(
Thermo Fisher Scientific，Schwerte，德国)+5％(v/v)人AB血清(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)+100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素(
Thermo Fisher Scientific，Schwerte，德国)中静置2天而不刺激，之后用Treg扩增珠(珠与细胞的比率为4:1，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)，可溶性FITC葡聚糖(MW：2,000,000，2μg/ml，Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)，珠结合的葡聚糖(1:100；PBS中的葡聚糖包被的微珠，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)或10ng/ml PMA和500ng/ml离子霉素(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)再刺激6小时。
流式细胞术
根据制造商的建议，将细胞与以下抗体以不同组合进行染色：CD4-PE-Vio770，CD4-APC-Vio-770，CD4-FITC，CD4-VioBlue(VIT4)，CD25-VioBright FITC(4E3)，CD127-FITC，CD127-PE-Vio770(MB15-18C9)，CD271(LNGFR)-PE，CD271(LNGFR)-PE-Vio770(ME20.4-1.H4)，CD137-PE(4B4-1)，CD154-APC，CD154-VioBlue(5C8)(均为MiltenyiBiotech，Bergisch Gladbach，德国)，Viobility405/520Fixable Dye(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，德国)或碘化丙锭(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)被用于排除死细胞。对于CAR表面表达的染色，将Treg与2μg/ml FITC标记的葡聚糖(MW：2,000,000，Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)一起在4℃下孵育10分钟，同时标记其他表面分子。所有数据均在FACS Canto/LSRII(BD，海德堡，德国)或MACS QuantAnalyzer(MiltenyiBiotec，Bergisch Gladbach，德国)上获取，FACS分选在Aria I，Aria II或Influx细胞分选仪(BD，Heidelberg，德国)上进行。使用FlowJo(TreeStar，Inc，Ashland，OR，EISA)进行数据分析。
基因表达的定量
通过定量实时PCR分析具有不同信号传导结构域的Dex-CAR构建体的竞争性扩增。根据制造商的说明，使用Zymo Research Quick-DNATM Miniprep试剂盒(Zymo Research，Freiburg，德国)分离DNA，并使用1×
Green PCR Master Mix(Thermo FisherScientific，Schwerte，德国)和分别500nMol正向和反向引物(TIB MOLBIOL，柏林)分析基因表达。基因表达在StepOneTM Real-Time PCR System(Thermo Fisher Scientific，Schwerte)上分析，并根据GAPDH的表达进行标准化。
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Claims (14)
1.一种调节性T(Treg)细胞，其表达嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
a)至少一个抗原结合结构域，
b)跨膜结构域，
c)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，
其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原。
2.根据权利要求1所述的Treg细胞，其中所述至少一个初级胞质信号传导结构域是CD3ζ。
3.根据权利要求1或2所述的Treg细胞，其中所述CAR的所述抗原结合结构域具有针对可溶性抗原的特异性，从而当所述可溶性抗原与所述CAR的所述抗原结合结构域结合时允许所述Treg细胞的激活。
4.根据权利要求3所述的Treg细胞，其中所述可溶性抗原是外源性抗原，所述外源性抗原不是天然存在于所述Treg细胞所施用的受试者的血液或组织中。
5.根据权利要求3或4所述的Treg细胞，其中所述可溶性抗原是葡聚糖。
6.根据权利要求5所述的Treg细胞，其中所述CAR的所述抗原结合结构域包含SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的表达CAR的Treg细胞，其用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病，过敏症，移植排斥，移植物抗宿主病，慢性炎性疾病，例如炎性肠病，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的慢性感染。
8.一种组合物，其包含根据权利要求1至7所述的表达CAR的Treg细胞的群体。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述根据权利要求1至7所述的表达CAR的Treg细胞的群体是可通过根据权利要求13或14所述的方法获得的激活的Treg细胞的群体。
10.药物组合物的组合，其包含
a)根据权利要求1至7所述的表达CAR的Treg细胞的群体以及药学上可接受的载体，和
b)根据权利要求3至6所述的可溶性抗原。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述可溶性抗原是葡聚糖。
12.根据权利要求10或11所述的组合物，其用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病，过敏症，移植排斥，移植物抗宿主病，慢性炎性疾病，例如炎性肠病，或者由病毒、细菌、寄生虫引起的慢性感染。
13.一种富集激活的表达CAR的Treg细胞的方法，其中所述CAR包含：
i)至少一个抗原结合结构域，
ii)跨膜结构域，
iii)胞质信号传导结构域，其包含至少一个初级胞质信号传导结构域和至少CD137的共刺激信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合在靶细胞的表面上表达的抗原或与在靶细胞的表面上表达的抗原结合的标签化多肽的标签或可溶性抗原，所述方法包括：
a)提供包含调节性T细胞的样品，
b)遗传修饰所述样品的所述调节性T细胞以表达所述CAR，
c)通过与由所述CAR的所述抗原结合结构域结合的所述抗原接触6-16小时来激活所述遗传修饰的调节性T细胞，
d)通过以下分离步骤c)的激活Treg细胞，
α)使步骤c)的所述细胞与：
I)结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭；或
II)结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，和
β)使
I)步骤α)I)的所述细胞与结合针对调节性T细胞或针对激活的调节性T细胞的标志物的分子接触，且阳性选择与所述结合分子结合的所述细胞，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体；或
II)步骤α)II)的所述细胞与结合CD154的分子接触，且使CD154+T细胞耗竭，从而获得激活的表达所述CAR的调节性T细胞的群体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述CAR的所述抗原结合结构域具有针对可溶性抗原的特异性，并且其中所述可溶性抗原是葡聚糖。
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