KR20220140542A - 제핵 세포의 생체공학적 제조를 위한 방법 및 용도 - Google Patents

제핵 세포의 생체공학적 제조를 위한 방법 및 용도 Download PDF

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KR20220140542A
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리차드 클렘케
후아웨이 왕
윌리 파이
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

생체공학적 제핵 세포를 사용하여 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 제핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 제핵 세포는 임상적으로 관련된 생체분자로 로딩되어 있다.

Description

제핵 세포의 생체공학적 제조를 위한 방법 및 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 2월 7일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/971,526; 2020년 3월 24일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/993,967 및 2020년 3월 25일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/994,598를 우선권 주장하며, 이들 가출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구 또는 개발
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 승인 번호 CA182495, 및 CA097022 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
세포-기반 요법을 위한 현재의 기술 및 도구는 종종 원치 않는 위험한 부작용, 예컨대 비제어된 증식, 제한된 공학기술 능력, 및 항-DNA 면역 반응이 발생하기 쉽다. 세포-기반 요법은 인간 질환 치료에서 중대한 필요성을 해결하는 큰 잠재력을 갖고 있지만, 임상 성공은 종종 장애물, 세포 이질성, 제한된 공학기술 능력, 일관성 없는 효능, 대규모 제조에서의 열악한 품질 관리 또는 재현성, 및 환자안전성 문제에 직면한다.
본 개시내용은 치료 기능을 개선하고 제어가능하고 안전한 세포-유사 실체를 생성하기 위한 생체공학적(bioengineered) 제핵 세포의 생성을, 적어도 부분적으로 기반으로 한다.
하기에 자세히 기재되고 실시예에서 예시된 바와 같이, 치료 용도를 위해 설계된 제핵 세포를 생체공학적으로 제조하는 방법 및 상기 세포의 용도는, 예를 들어, 안전성, 규정된 수명, 핵-코딩된 유전자를 숙주에 전달한 위험 없음, 및 치료 카고(cargo)의 효과적인 전달을 포함한, 이전의 세포-기반 치료제에 비해 몇몇 이점을 제공한다. 현재 청구된 개시내용의 기타 이점이 본원에 기재되어 있다.
대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 소형 RNA, 소분자 약물, 펩티드, 바이러스, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 화학요법제를 포함한다.
대상체에게 면역계를 활성화하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 활성화를 통제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 활성화 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함한다.
대상체에게 면역계에 의한 인식을 회피하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 인식 활성화를 통제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 면역 인식 분자의 제핵 세포를 고갈시키도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 면역 인식 분자는 HLA 항원, 프로테오글리칸, 당 모이어티, 배아성 항원, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 회피 분자이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, IGF-2, VEGF, TNF-알파, CD47, HLA-E, HLA-G, HLA-E/G, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD112R, CTLA-4, 케모카인, 케모카인 리간드 1, C-C 모티프 케모카인 수용체 7, NK 억제제 수용체, HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 또는 그의 조합을 포함한다.
대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는 방법이며, 여기서 유전자 조작된 제핵 세포가 질환 상태의 존재 또는 위치를 확인하는 것인, 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 염증 귀소 수용체이다. 일부 실시양태에서, 염증 귀소 수용체는 제핵 세포를 손상된 및/또는 염증발생 조직으로 향하게 한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 섬유모세포, 및 성체 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도성 만능 줄기 세포, 또는 그의 조합으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 외인성 DNA 분자는 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자, DNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 RNA 분자는 메신저 RNA (mRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), RNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 효소, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여하는 것은 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 경구 투여, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여하는 것은 종양내 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 질환은 염증, 감염, 암, 신경계 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격계 질환, 대사 질환, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 백혈병, 중피종, 육종, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 또는 그의 조합을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 과학 기술 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 방법 및 물질은 본 발명에 사용하기 위해 본원에 기재되어 있다; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 사용될 수 있다. 물질, 방법, 및 예는 단지 예시이며 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 시퀀스, 데이터베이스 항목, 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌하는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면, 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1A는 생체공학적 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 치료 용도를 위한 작업흐름의 개략도이다.
도 1B 및 1C는 시간 경과에 따른 초기 집단에 대한 생존가능한 hT-MSC/조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 1B, 새로 단리된 hT-MSC/카고사이트; 도 1C, hT-MSC/카고사이트는 1개월 냉동보존 후 해동되었다.
도 1D는 2시간 동안 보이든(Boyden) 챔버에서 SDF-1α의 표시된 농도로 이동한 MSC/조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)를 나타내는 그래프이다. 막대 그래프는 로딩 대조군에 대한 이동된 세포의 비를 나타낸다. 평균 ± SEM; n= 3개의 생물학적 복제물로부터 10개의 독립적인 필드.
도 1E는 세포의 GFP (좌측) 또는 GFP 양성 비 (우측)의 평균 형광 강도 (MFI)를 나타내는 유세포 분석법에 의해 분석한 막대 차트이다.
도 1F는 우시아 루시페라제(Gaussia luciferase) (Gluc) mRNA로 형질감염 후 48시간에 세포로부터의 조건화 배지의 Gluc 활성을 나타내는 막대 그래프이다. RLU = 상대 발광 단위.
도 1G는 현탁액 중의 hT-MSC 또는 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 평균 직경을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2A는 면역적격 마우스에서 IL-12 시토카인을 발현하고 삼중-음성 유방암 (TNBC)을 치료하기 위한 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)에 대한 작업 흐름의 개략도이다.
도 2B는 종양내 주사 후 표시된 시점에서 ELISA에 의해 검출된 확립된 E0771 종양에서 IL-12 시토카인의 수준을 나타내는 막대 그래프이다. PBS, 비히클 대조군; MSC-IL-12/카고사이트-IL-12, hT-MSC 또는 IL-12 mRNA로 형질감염된 카고사이트.
도 2C는 도 2B에서와 같이 처리된 마우스에서 PBS 군과 비교하여 표시된 mRNA 마커의 변화 배수 (Log2)를 나타내는 그래프이다. 종양을 수확하고 종양내 주사 후 48시간에 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다.
도 2D는 유세포 분석법에 의해 분석된 수확된 종양을 나타내는 막대 그래프이다. 마우스를 처리하고 종양을 수확하고 유세포 분석법에 의해 분석하였다. %CD8+ T 세포, 100×CD8+CD4-CD3+CD45+/CD45+; %CD4+ T 세포, 100×CD8-CD4+CD3+CD45+/CD45+; M1Φ/M2Φ, CD45+Ly6c-F4/80+MHCIIhigh/CD45+Ly6c-F4/80+MHC IIlow; %Foxp3+ Treg 세포, 100×CD45.2+CD4+CD25+Foxp3+/CD45+; %NK 세포, 100×CD45+CD3- NK1.1+/CD45+; %CD45+ 세포, 100×CD45+/총 세포.
도 2E는 미리 확립된 E0771 종양에 대한 MSC-IL-12/카고사이트-IL-12의 종양내 주사 및 항-PD-1 항체의 복강내 주사 (상단) 및 이들 마우스에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 곡선 (하단)을 나타내는 그래프이다.
도 2F는 도 2E에서 생존하고 E0771 세포로 재-시험감염된 마우스에 대한 종양 성장 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 2G는 모의-처리된 대조군과 비교하여 표시된 mRNA 마커 (IDO1, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1; PD-L1, 프로그래밍된 사멸-리간드 1)의 변화 배수 (Log2)를 나타내는 그래프이다. 대조군 hT-MSC, 방사선조사된 MSC (30Gy), 및 FACS-분류된 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)를 인간 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 6시간 동안 자극하고, 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다.
도 3A는 마우스 모델에서 LPS-유도 급성 귀 염증을 치료하기 위해 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)를 사용하기 위한 작업흐름의 개략도이다.
도 3B는 정맥 주사 후 24시간에 마우스 폐로부터 수확하고 유세포 분석법에 의해 검출한 1E5 총 세포 중 DiD+RFP+ 이중-양성 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
도 3C는 주사 후 24시간에 마우스 귀로부터 수확되고 유세포 분석법에 의해 검출된 1E5 총 세포 중 DiD+F4/80- 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 마우스는 우측 귀에 LPS를 주사하고 좌측 귀에 식염수를 주입한 후에, DiD-표지된 MSC 또는 카고사이트를 6시간 후에 정맥내 주사하였다. D1 MSC/카고사이트, 마우스 D1 MSC/카고사이트; 3D-MSC/카고사이트, 3D-배양된 모 MSC/카고사이트; 3D-MSCTri-E C19, 삼중 (CXCR4/CCR2/PSGL-1) 조작된 MSC 클론 19; 3D-카고사이트Tri-E C19, 3D-MSCTri-E C19-유래 카고사이트.
도 3D는 주사 후 24시간에 표시된 마우스 귀로부터 ELISA에 의해 검출된 인간 IL-10 단백질의 수준을 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 도 3C에서와 같이 처리된 마우스는 인간 IL-10 mRNA 형질감염 후 표시된 세포 또는 카고사이트로 정맥내 주사되었다.
도 3E는 도 3C에서와 같이 처리되고 주사 후 48시간에 수확하고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해 프로세스된 마우스로부터의 귀의 광학 현미경 이미지이다.
도 3F는 LPS/식염수 주사 전에 및 세포/조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트) 주사 후 48시간에 디지털 마이크로미터에 의해 측정한 바와 같은 귀 두께의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3G는 LPS-처리 (우측) 및 식염수-처리 (좌측) 귀 사이의 표시된 mRNA 마커의 변화 배수 (Log2)를 나타내는 그래프이며, 여기서 도 3F에서와 같이 처리된 마우스는 LPS 주사 후 48시간에 실시간 RT-PCR에 의해 귀를 수확하고 분석하였다.
도 4는 표시된 세포내 소기관 항체 (화살표) 및 DAPI로 염색된 MSC 또는 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 형광 이미지이다. 미토콘드리아, 항-AIF (아폽토시스-유도 인자); 리소솜, 항-LAMP1 (리소솜-연관 막 단백질 1); 골지체, 항-RCAS1 (시소(SiSo) 세포 상에서 발현되는 수용체 결합 암 항원); 소포체 (ER), 항-PDI (단백질 디술피드 이소머라제); 엔도솜, 항 EEA1 (초기 엔도솜 항원 1). 화살표는 표시된 소기관을 가리킨다. 스케일 바= 50 μm.
도 5A는 로딩 대조군 (피브로넥틴-코팅된 플레이트 상에 시딩된 MSC/ 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트))에 대한 이동된 MSC/ 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 비를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5B는 로딩 대조군에 대한 이동된 MSC/ 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 비를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 MSC/카고사이트는 보이든 챔버에서 PDGF-AB 구배를 향해 이동한다.
도 5C는 로딩 대조군에 대한 이동된 MSC/ 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 비를 나타내는 막대 그래프이다.
도 5D는 0.25% BSA (웰당 2E4 세포)를 가진 무혈청 배지에서 MSC 및 카고사이트가 피브로넥틴 코팅된 24웰 플레이트에 2시간 동안 부착되도록 허용된 필드당 부착된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 부착된 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 400X 배율에서 광학 현미경을 사용하여 계수하였다.
도 6A는 냉동보존 1개월 후 해동된 MSC/ 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)에 대한 회수율 (입력 집단 중 생존가능한 세포의 백분율)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 6B는 로딩 대조군에 대한 이동된 MSC 또는 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 비를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 회수된 MSC 또는 카고사이트는 보이든 챔버에서 FBS 구배를 향해 이동한다.
도 7A는 시험관내에서 합성된 마우스 IL-12a 및 IL-12b mRNA의 개략 설계도이다. IL-12 mRNA 코딩 영역 (CDS)의 시작 코돈 앞에 코작(Kozak) 서열을 부가하였다. 마우스 알파 글로빈 mRNA의 5'UTR 및 3'UTR은 CDS의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. mRNA의 5' 말단에 인공 5'Cap이 부가되었고 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 슈도우리딘 변형이 조작되었다.
도 7B는 IL-12 형질감염된 MSC (MSC-IL-12), 카고사이트 (카고사이트-IL-12) 또는 형질감염되지 않은 세포 (대조군 MSC)의 조건화 배지에서 분비된 IL-12 농도를 나타내는 그래프이다.
도 7C는 마우스 비장세포를 표시된 조건화 배지 또는 재조합 마우스 IL-12 (p70) 단백질 (10 ng/ml)로 30분 동안 처리한 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다. Stat4의 인산화는 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다.
도 7D는 ELISA에 의해 결정된 바와 같은 마우스 혈장에서 분비된 IL-12 시토카인의 농도를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 마우스를 도 2B에서와 같이 처리하였다.
도 8A는 현탁물에서 표시된 MSC 또는 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 평균 직경을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8B는 세포가 개별 미세유체 협착을 통해 이동하는 데 필요한 평균 시간을 나타내는 막대 그래프이다. 한정된 (≤2 μm × 5 μm) 및 한정되지 않은 (15 μm ×5 μm) 협착 둘 다에 대한 데이터가 표시된다.
도 8C는 표시된 시점에서 LPS-처리 귀에서 표시된 mRNA 마커의 변화 배수 (Log2)를 나타내며 식염수-처리 귀 (대조군)로 정규화된 막대 그래프이며, 여기서 마우스 귀를 수확하고 LPS 주사 후 6시간 또는 24시간에 실시간 RT-PCR에 의해 분석하였다.
도 9A 및 9B는 로딩 대조군 (피브로넥틴 코팅된 플레이트에 시딩된 MSC 또는 카고사이트)에 대한 이동된 MSC/카고사이트 비를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 MSC/카고사이트는 보이든 챔버에서 2시간 동안 표시된 케모카인 구배를 향해 이동하였다.
도 9C는 주사 후 24시간에 마우스 귀로부터 수확되고 유세포 분석법에 의해 검출된 1E5 총 세포 중 DiD+F4/80-MSC 또는 카고사이트의 평균 수를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 마우스를 표시된 세포로 처리하고 정맥내 주사하였다.
도 9D는 주사 후 24시간에 마우스 폐로부터 수확되고 유세포 분석법에 의해 검출된 1E5 총 세포 중 DiD+F4/80- 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다. D1 MSC/카고사이트, 마우스 D1 MSC/카고사이트; 3D-MSC/카고사이트, 3D-배양된 모 MSC/카고사이트; 3D-MSTri-E C19, 삼중 (CXCR4/CCR2/PSGL-1) 조작된 MSC 클론 19; 3D-카고사이트Tri-E C19, 3D-MSCTri-E C19 유래 카고사이트.
도 10은 소프트웨어 리밍이미지(LivingImage) V4.1을 사용하여 상이한 시점에서 표시된 마우스 기관으로부터 생물발광 이미징 신호 강도 (광자/초/cm2/스테라디안)의 정량적 분석을 나타내는 그래프이다.
도 11A는 소프트웨어 리밍이미지 V4.1을 사용하여 상이한 시점에서 박리된 마우스 귀로부터의 생물발광 이미지화 신호 강도 (광자/초/cm2/스테라디안)의 정량적 분석을 나타내는 그래프이다.
도 11B는 Fluc mRNA로 형질감염 후 표시된 시점에서 세포로부터의 조건화 배지의 스펙트라맥스(SpectraMax) M2e에 의해 측정된 반딧불이 루시페라제 (Fluc) 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 12A는 시험관내에서 합성된 인간 IL-10 mRNA의 개략도이다. IL-10 mRNA 코딩 영역 (CDS)의 시작 코돈 앞에 코작 서열을 부가하였다. 마우스 알파 글로빈 mRNA의 5'UTR 및 3'UTR은 CDS의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. mRNA의 5' 말단에 인공 5'Cap이 부가되었고 mRNA 안정성을 증가시키기 위해 슈도우리딘 변형이 조작되었다.
도 12B는 IL-10 형질감염된 MSC (MSC-IL-10), 카고사이트 (카고사이트-IL-10), 형질감염되지 않은 세포 (MSC 단독) 또는 대조군 배지의 조건화 배지에서 분비된 IL-10 농도를 나타내는 그래프이다.
도 12C는 마우스 RAW 대식세포 세포를 표시된 조건화 배지 또는 재조합 IL-10 단백질 (1 ng/ml)로 30분 동안 처리하고 Stat3의 인산화를 웨스턴 블롯에 의해 결정한 것을 나타내는 웨스턴 블롯 이미지이다.
도 12D는 IL-10 mRNA 형질감염 후 24시간에 D1 MSC 또는 D1 카고사이트의 조건화 배지에서 분비된 IL-10 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12E는 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 마우스 혈장에서 분비된 IL-10 시토카인의 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 12F는 IL-10 mRNA 형질감염된 MSC (MSC-IL-10) 및 카고사이트 (카고사이트-IL-10), 형질감염되지 않은 세포 (hTMSC 단독) 또는 대조군 배지의 조건화 배지에서 ELISA에 의해 측정된 분비된 IL-10 시토카인의 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13A는 시간 경과에 따른 초기 집단에 대한 생존가능한 MSC 또는 카고사이트의 백분율을 나타내는 그래프이다. 분류된 MSC 대조군, FACS 분류된 MSCH2B-GFP; 카고사이트 및 세포핵/MSC를 GFP 발현을 기반으로 하여 제핵된 MSCH2B-GFP로부터 분리되었다.
도 13B는 로딩 대조군에 대한 이동된 MSC 또는 카고사이트의 비를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 MSC H2B-GFP 또는 분류된 카고사이트 H2B-GFP는 보이든 챔버에서 FBS 구배를 향해 이동한다.
도 13C는 MSC H2B-GFP 또는 분류된 카고사이트 H2B-GFP가 보이든 챔버에서 FBS 구배를 향해 이동한 세포 이동 지수 (로딩 대조군에 대한 이동된 카고사이트)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 13D는 1개월 냉동보존 후 hT-MSC/카고사이트가 해동된 시간 경과에 따른 초기 집단에 대한 생존가능한 hT-MSC/카고사이트의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 13E는 냉동보존 1개월 후 해동된 MSC/카고사이트에 대한 회수율 (입력 집단 중 생존가능 세포 백분율)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13F는 회수된 MSC 또는 카고사이트가 보이든 챔버에서 FBS 구배를 향해 이동한 세포 이동 지수 (로딩 대조군에 대한 이동된 MSC/카고사이트)를 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 배경 이동 (케모카인 구배 없음)에 대한 유도된 이동 (케모카인 구배 사용)의 비를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 MSC/카고사이트는 2시간 동안 보이든 챔버에서 표시된 케모카인 구배를 향해 이동하였다.
도 15A는 E0771 TNBC 생존 실험의 개략도이다: IL-12 mRNA (CA-IL-12)로 형질감염된 카고사이트는 피하 (SQ) E0771 종양을 보유한 마우스에 2 내지 3일마다 종양내 (IT) 주사되었다. 대조군 마우스는 IT PBS를 받았다. 세 번째 용량 후 24시간에, 항-PD-1 또는 대조군 항-IgG 이소형을 복강내 (IP) 투여하였다. 그 다음 주에, 최종 카고사이트 IL-12 또는 PBS 용량을 IT로 투여한 후 그 다음날 항-PD-1 또는 항-IgG IP를 투여하였다. 종양을 측정하고 종양이 >2 cm 직경으로 성장했을 때 동물을 안락사시켰다.
도 15B는 생존 실험의 처리 단계 동안 동물 체중의 변화 배수의 그래프이다. 화살표 = IT CA-IL-12 또는 PBS의 투여; 화살촉 = IP 항-PD-1 또는 항--IgG 투여.
도 15C는 MSC 또는 카고사이트를 마우스에 정맥내 (IV) 주사한 ELISA에 의한 표시된 염증 시토카인의 분석을 나타내는 표이다. IV 주사 후 2시간 및 24시간에 혈청을 수집하였다.
도 15D는 별도의 실험에서 동물에 E0771 세포를 양측으로 주사한 다음에 3회 용량의 CA-IL-12 또는 PBS를 일측으로 IT 주사한, 각각의 측면 (주사 및 대측/비주사)에 대한 종양 크기의 변화 배수를 나타내는 그래프이다.
도 16A는 SDF-1α 처리 전후의 LDV-FITC 결합 강도의 MFI 변화를 나타내는 막대 그래프이다. MFI 비 = (MFILDV-FITC+ SDF-1α - MFI비염색 대조군)/ (MFILDVFITC - MFI비염색 대조군).
도 16B는 필드 (100X 배율)당 부착 세포 수를 나타내는 막대 그래프이다. TNF-α, 6시간 동안 10 ng/ml TNF-α로 전처리된 HUVEC. SDF-1α, 500 ng/ml SDF-1α; a-PSGL-1, 10 μg/ml 항-PSGL-1 항체 전처리; a-VLA-4, 10 μg/ml 항-VLA-4 항체 전처리.
도 16C는 배경 이동 (케모카인 구배 없음)에 대한 유도된 이동 (케모카인 구배 사용)의 변화 배수를 나타내는 막대 그래프이며, 여기서 MSC/카고사이트는 2시간 동안 보이든 챔버에서 표시된 케모카인 구배를 향해 이동하였다.
도 17A는 주사 후 16시간에 마우스 췌장으로부터 수확되고 유세포 분석법에 의해 검출된 1E5 총 세포 중 DiD+F4/80- 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다.
세룰레인-유도 AP를 가진 마우스는 마우스 조직이 주사 후 16시간에 수확된 표시된 처리로 정맥내 주사되었다. 급성 췌장염을 BalB/c 마우스에서 세룰레인의 복강내 (i.p.) 주사에 이어서, DiD-표지된 MSC 또는 카고사이트의 정맥내 주사에 의해 유도하였다.
도 17B는 표시된 처리로부터 마우스 췌장으로부터 ELISA에 의해 검출된 인간 IL-10 단백질의 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 17C는 표시된 처리로부터 마우스 췌장에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 Ccl2 (상단) 및 TNF-α (하단)의 상대적 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 그래프는 세룰레인 무처리군으로 정규화된 표시된 mRNA 마커의 변화 배수 (Log2)를 나타낸다.
도 17D는 표시된 처리로부터 마우스 혈청에서 검출된 리파제 활성 (상단) 및 아밀라제 활성 (하단)을 나타내는 막대 그래프이다.
도 17E는 췌장의 조직학적 분석을 나타내는 막대 그래프이다. 부종 (상단) 및 괴사 (하단)의 중증도는 확립된 기준을 사용하여 0에서 3까지 등급을 매겼다.
도 18A는 췌장에서 표시된 mRNA 발현의 변화 배수 (Log2)를 나타내는 그래프이다.
도 18B는 주사 후 16시간에 마우스 폐 또는 간으로부터 수확되고 유세포 분석법에 의해 검출된 1E5 총 세포 중 DiD+F4/80- 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다. 도 18C는 형질감염 후 24시간에 BM-MSC 또는 BM-MSC 형질감염된 IL-10 mRNA 형질감염의 조건화 배지에서 분비된 IL-10 농도를 나타내는 막대 그래프이다. 도 18D는 엑소솜 단독으로 또는 IL-10 mRNA가 로딩된 엑소솜으로 처리된 HEK293 세포의 조건화 배지에서 처리 후 24시간에 분비된 IL-10 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 18E는 표시된 처리로부터 마우스 혈장 또는 조직으로부터 ELISA에 의해 검출된 인간 IL-10 단백질의 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 18F는 표시된 처리로부터 마우스 췌장에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 IL-6 (상단) 및 IL-1β (하단)의 상대적 mRNA 발현을 나타내는 막대 그래프이다. 그래프는 세룰레인 무처리군으로 정규화된 표시된 mRNA 마커의 변화 배수 (Log2)를 나타낸다.
도 18G는 췌장의 조직학적 분석을 나타내는 막대 그래프이다. 염증 세포 침윤의 중증도는 확립된 기준을 사용하여 0에서 3까지 등급을 매겼다.
본 개시내용은 유전자 조작된 제핵 세포를 사용한 세포-기반 요법을 위한 방법 및 용도를 기재한다. 실제로, 세포는 치료 기능을 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있고 제어가능하고 안전한 세포-유사 실체를 생성하기 위해 제핵된다 (도 1A). 추가로, 임상 적용을 위해 상당한 수의 치료 세포를 제조하는 것은 특히 줄기 세포 분야에서 많은 세포-기반 요법으로 제한된다. 따라서, 불멸화 세포 (예를 들어, hT-MSC, 바이러스 및 종양유전자)를 사용하여 제조 능력을 증가시키는 데 상당한 상업적 관심이 있는데, 그 이유는 그것이 강력하고 비용-효율적이기 때문이다. 그러나, 불멸화 세포는 암을 야기할 수 있으므로, 치료 적용에는 너무 위험할 수 있다. 본 개시내용은 불멸화 세포 또는 심지어 암성 세포의 치료 적용을 위한 사용을 허용하는데, 그 이유는 이들 세포가 투여 전에 제핵에 의해 안전하게 되기 때문이다.
제핵 세포
생체공학적 제핵 세포는 제핵 후 중요한 세포 기능을 수행하고, 규정된 수명을 갖고, 치료 기능을 나타내고, 다층화 공학 및 대규모 제조에 순응함으로써 치료 용도로 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "제핵"은 핵의 불활성화 또는 제거를 통해 세포를 비-복제 상태로 만드는 것이다. 일부 실시양태에서, 세포는 피질 액틴 세포골격을 연화시키기 위해 시토칼라신으로 처리될 수 있다. 이어서 핵은 제핵 세포를 생성하기 위해 피콜의 구배에서 고속 원심분리에 의해 세포체에서 물리적으로 추출된다. 제핵 세포와 무손상 유핵 세포는 피콜 구배에서 상이한 층으로 침강되기 때문에, 제핵 세포는 치료 목적 또는 다른 세포 (예를 들어, 유핵 또는 제핵 세포)와의 융합을 위해 쉽게 단리되고 준비될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 과정은 수천만 개의 세포를 처리하도록 임상적으로 확장성이 있다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 다양한 질환 (예를 들어, 본원에 기재된 질환 중 임의의 것)을 치료하기 위해 임상적으로 관련된 카고/페이로드를 전달하기 위한 질환-귀소 비히클로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카고, 페이로드, 또는 생체분자가 로딩된 제핵 세포는 "카고사이트"로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카고사이트는 치료 용도를 위해 설계된 생체공학적 제핵 세포를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 상당한 치료적 가치를 갖는데, 그 이유는 이들이 생존가능하고, 다른 세포 유형으로 분화하지 않고, 생물활성 단백질을 분비하고, 3-4일 동안 물리적으로 이동/귀소할 수 있고, 구체적 치료 기능을 수행하기 위해 생체외에서 광범위하게 조작될 수 있으며, 동일한 또는 다른 세포 유형에 융합되어 천연 또는 조작된 원하는 생성을 전달할 수 있기 때문이다. 따라서, 제핵 세포는 화학요법 약물 (예를 들어, 독소루비신), 유전자, 바이러스, 박테리아, mRNA, shRNA, siRNA, 펩티드, 플라스미드, 및 나노입자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 치료적 생체분자 및 질환-표적화 카고를 전달하기 위한 세포 비히클로서 넓은 유용성을 가진다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 유전자 조작되어 구체적 투병 및 건강 촉진 카고를 인간 또는 동물에게 전달될 수 있는 안전한 (예를 들어, 원치 않는 DNA가 대상체로 전달되지 않음), 제어가능한 (예를 들어, 세포 사멸이 정확히 3-4일 내에 발생함) 세포-기반 담체의 생성을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)는 치료 용도를 위해 유전자 조작되고 설계된다. 본원에 사용된 바와 같이, 세포와 관련하여 "유전자 조작된"은 비조작 유사한 조건 하에 달리 유사한 세포에 존재하지 않거나 상이한 수준으로 존재하는 핵산 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 mRNA)을 포함하는 세포 (예를 들어, 적혈구로부터 유래된 RBC와 비교하여, 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)는 iPSC (유도 만능 줄기 세포), 임의의 불멸화 세포, 줄기 세포, 원발성 세포 외인성 DNA 분자, 또는 외인성 RNA 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유형의 유핵 세포로부터 유래될 수 있음), 또는 상기 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드 (예를 들어, 외인성 단백질 또는 외인성 폴리펩티드)를 포함하는 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 외인성 핵산의 도입에 의해 그의 천연 상태로부터 변경되었거나, 이러한 변경된 세포의 자손이다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 세포는 외인성 핵산 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 mRNA)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 폴리펩티드, 또는 외인성 단백질, 또는 그의 조합 중 적어도 1종 (예를 들어, 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 또는 6종 이상)을 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 폴리펩티드, 또는 외인성 단백질, 또는 그의 조합 중 적어도 2종 이상 (예를 들어, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 또는 6종 이상)을 동시에 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 DNA 분자는 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자, DNA 바이러스, 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 외인성 RNA 분자는 메신저 RNA (mRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), RNA 바이러스, 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 효소, 또는 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 다양한 상이한 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 그의 수명 내내 핵을 유지하거나 자연적으로 제핵하지 않는 임의의 유핵 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 정상 세포주로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 암 세포주로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 면역계로부터 수득된 치료 세포로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 제핵 세포는 중간엽 기질 세포 (MSC), 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 림프구, 비만 세포, 호염기구, 호산구, 및/또는 섬유모세포로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 hTERT-불멸화 지방-유래 MSC (hT-MSC)로부터 유래되며, 여기서 MSC는 임상 연구에서 치료 잠재력을 입증하였으며 불멸화 표현형은 추가의 생체공학을 용이하게 하는 일관된 특성을 가진 균질한 세포 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 성체 줄기 세포 및/또는 유도성 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래될 수 있다.
일부 세포 유형은 핵, 예를 들어, 적혈구를 갖지 않는다. 추가로, 치료 세포로부터 유래된 엑소솜 및 소세포막 소포는 전달 소포로서 작용할 수 있으나, 본 개시내용의 제핵 세포와는 현저하게 상이하다. 본 개시내용의 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)는 RBC, 엑소솜 및 소세포막 소포와 상이하다. 이들 유형의 전달 소포는 외인성 단백질 (예를 들어, ER/골지체, 미토콘드리아, 엔도솜, 리소솜, 세포골격 등)을 생성하고 분비하는 데 필요한 세포 소기관을 갖지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 제핵 세포는 유핵 세포처럼 기능할 수 있고 중대한 생물학적 기능 예컨대 부착, 터널링 나노튜브 형성, 액틴-매개 확산 (2D 및 3D), 이동, 화학유인물질 구배 감지, 미토콘드리아 전달, mRNA 번역, 단백질 합성, 및 엑소솜 및 기타 생물활성 분자의 분비를 나타낼 수 있다. 이들 기능 중 하나 이상은 엑소솜, 소형 세포막 소포, RBC, 또는 기타 유사한 전달 전용 소포에 의해 나타나지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 제핵 효율은 본원에 기재되거나 달리 관련 기술분야에 공지된 방법을 통해 성공적으로 제핵된 집단 내 세포의 백분율을 기재한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제핵 효율은 95% 초과 (예를 들어, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 효율적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 회수율은 입력 집단 중 생존가능 세포의 백분율을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 회수율로 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, hT-MSC에 대해 95% 초과의 제핵 효율이 달성된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 80-90% 회수율을 산출한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 세포 구조와 관련하여 본원에 사용될 때 적어도 기능성 세포내 소기관을 공유하는 참조 세포에 대한 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 제핵 세포는 두 세포가 동일한 기능성 세포내 소기관을 포함하는 경우 모세포와 실질적으로 동일한 세포 구조를 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 모세포와 동일한 기능성 세포내 소기관을 함유하며, 여기서 기능성 세포내 소기관은 골지체, 소포체, 미토콘드리아, 리소솜, 리보솜, 엔도솜, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함한다.
세포 기능과 관련하여 본원에서 사용될 때 용어 "실질적으로 동일한"은 유사한 기능성 특성을 나타내는 참조 세포에 대한 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 제핵 세포는 동일한 표면 마커 단백질 발현을 유지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 모 (예를 들어, 유핵) 세포와 유사한 제타 전위를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포막 수용체 및 이동 및 침습 기구는 모세포와 유사한 기능을 나타내는 완전 기능성이다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 모세포에 의해 생성된 것들과 동일한 세포외 소포를 능동적으로 생성 및 분비한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 잘 조직화된 세포골격 구조를 가진 조직 배양 플레이트에 쉽게 부착된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 제핵 후 최대 72시간 동안 생존가능하다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 골지체, 소포체 (ER), 미토콘드리아, 리소솜, 및 엔도솜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 중요하고 기능성 세포내 소기관을 함유할 수 있다 (도 4). 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 48시간 동안 표면 마커 단백질 (예를 들어, CXCR4, CCR2, PSGL-1, CD44, CD90, CD105, CD106, CD166, 또는 Stro-1) 발현을 유지할 수 있고 모 (유핵) 세포와 유사한 제타 전위를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 시험관내에서 화학유인물질을 감지하고 이를 향해 이동하고, FBS 구배를 향해 3D 마트리겔(Matrigel)-코팅 막을 통해 침습하며 (도 5A-5D), 이는 제핵 세포막 수용체 및 이동 및 침습 기구가 제핵 세포에서 완전히 기능성임을 시사한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포의 조건화 배지 (CM)로부터 단리된 세포외 소포 (EV)는 전자 현미경법에 의해 유사한 특징적 형태, 유사한 크기 분포, 및 BCA 검정에 의해 측정된 바와 같이 생성된 유사한 양을 가질 수 있다. 이는 제핵 세포가 모세포에 의해 생성된 것들과 크게 상이하지 않은 EV를 능동적으로 생성하고 분비할 수 있음을 시사한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 모세포보다 더 높은 속도로 냉동보존으로부터 회수를 나타내고, 해동 후 생존력 및 이동 능력 둘 다를 유지하여 (도 6A 및 6B), 이는 임상 적용에서 저장 및 전달의 실행계획을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 중대한 세포 구조 및 기능을 유지하므로, 치료 적용 가능성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 세포-기반 치료제는 정상 또는 조작된 유핵 세포를 사용한다. 일부 실시양태에서, 세포-기반 요법은 세포 증식 및 유도된 치명적인 DNA-손상을 방지하기 위해 환자 주사 전에 세포를 방사선조사한다. 그러나, 이 접근법은 돌연변이를 유도하고 세포 단백질과 DNA를 비가역적으로 손상시키는 상당한 양의 활성 산소 종을 생성하여, 많은 양의 손상/돌연변이 DNA를 대상체의 신체에 방출할 수 있다. 이러한 제품은 다른 세포에 통합되고/거나 원치 않는 항-DNA 면역 반응을 유도하는 경우 위험할 수 있다. 방사선조사된 세포는 위험하며 그 이유는 이들 세포가 세포-세포 융합에 의해 돌연변이된 DNA와 유전자를 숙주 세포로 전달할 수 있기 때문이다. 세포 방사선조사와 비교하여, 세포에서 전체 제핵하는 것은 핵 DNA가 대상체에 도입되지 않도록 하는 세포 수명을 제한하는 덜 손상되고 상당히 더 안전한 방법이다. 더욱이, 중간엽 줄기 세포 (MSC)와 같은 많은 줄기 세포는 방사선-유도 사멸에 대한 내성이 높고, 따라서 이 방법을 사용하여 안전하게 만들 수 없다.
일부 실시양태에서, 치료 세포는 세포 수명을 제한하기 위해 약물-유도성 자살 스위치로 조작될 수 있다. 그러나, 생체내에서 스위치의 활성화는 원치 않는 부작용을 가진 강력하고 잠재적으로 유해한 약물을 대상체에 주입하여야 한다. 이 방법은 배양 세포에서 자살을 유도하지만 (<95%), 임상으로 번역될 때 비효율적일 것으로 예상된다. 게다가, 치료 세포의 사멸은 숙주 세포에 통합되거나 위험한 전신 항-DNA 면역 반응을 유도할 수 있는, 다량의 DNA (예를 들어, 정상 또는 유전적으로 변경된 DNA)를 방출하였다. 세포가 돌연변이가 되고 자살 스위치를 잃거나 불활성화하면, 이는 제어할 수 없는 돌연변이 세포가 된다. 게다가, 이들 세포는 대상체의 숙주 세포와 융합할 수 있으며, 따라서 돌연변이 DNA를 전달할 수 있다. 이러한 융합 세포는 위험하며 그 이유는 모든 숙주 세포가 자살 유전자를 상속하는 것은 아니나, 염색체 재조직화 및 세포 혼성화 동안 치료 세포의 유전자/DNA 중 일부를 상속할 수 있기 때문이다. 게다가, 동일한 이유로, 자살 스위치를 가진 치료 세포는 시험관내에서 세포 융합 파트너로서 사용할 수 없다.
치료 세포 수명을 제한하는 또 다른 방법은 열-유도 사멸이다. 그러나, 이는 치료 용도에 필요한 중요한 생물학적 기능을 종료시키는 심각한 손상을 야기한다. 제핵 세포와 달리, 이들 세포는 그의 핵 및 모든 유전 물질을 유지하고 있기 때문에 대상체에게 DNA를 여전히 전달할 수 있다. 화학요법 약물 또는 미토마이신 C를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 수많은 화학물질이 세포 증식을 억제하고/거나 치료 사용 전에 세포 사멸을 야기한다. 그러나, 이러한 약물은 세포를 상당히 손상시키는 상당한 오프-타겟 효과를 가지며, 높은 독성으로 인해 임상 적용에 바람직하지 않다. 많은 항증식제 및 사멸-유도제가 내성으로 인해 세포를 100% 효과적으로 억제하지는 못하며, 제핵 세포와 달리 많은 약물 효과를 회복할 수 있다. 따라서, 이 접근법은 생체내에서 불멸화/암 세포의 세포 성장을 방지하는 데 적합하지 않다.
본 개시내용은 치료 용도를 위해 설계된 조작된 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 DNA, RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질, 플라스미드, 바이러스 및 소분자 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 기능을 가진 생체분자의 천연 또는 유도성 발현 및/또는 흡수로 생성된다. 일부 실시양태에서, 생체공학 접근법은 제핵 세포 기능을 개선한다. 일부 실시양태에서, 모세포 (예를 들어, 유핵 세포)는 제핵 전에 (예를 들어, 제핵 전(pre-enucleation)) 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 모세포는 제핵 후에 (예를 들어, 제핵 후(post-enucleation)) 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)는 DNA/유전자, RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질, 및 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 소분자 약물, 이온, 시토카인, 성장 인자, 및 호르몬을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자 (분비, 세포내, 및 천연 및 유도성)를 외인성으로 생성하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 치료 수준의 생물활성 단백질 또는 면역 자극제를 생성한다.
일부 실시양태에서, 모세포는 제핵 전에 생체분자 (분비, 세포내, 천연 및 유도성)를 외인성으로 생성하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 모세포는 DNA/유전자, RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질, 및 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 소분자 약물, 이온, 시토카인, 성장 인자, 및 호르몬을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자를 외인성으로 생성하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 모세포는 생물활성 단백질 또는 면역 자극제의 치료 수준을 생성하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 모세포는 종양 영양 단백질을 생성하도록 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 DNA/유전자, RNA (예를 들어, mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질, 플라스미드, 바이러스, 및 소분자 약물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 치료 생물학적 제제 (예를 들어, 치료 카고)를 전달하기 위해 비히클로서 사용될 수 있다. 유핵 세포와 달리, 제핵 세포에는 암 또는 기타 질환에 대한 치료제로 환자에게 전달하기 위해 고용량의 DNA-손상/유전자 표적화제가 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, DNA-손상/유전자 표적화제는 DNA-손상 화학요법 약물, DNA-통합 바이러스, 종양용해성 바이러스, 및 유전자 요법 적용을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 치료적 제핵 세포 (천연 또는 조작)는 DNA/유전자, RNA (mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질, 및 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 소분자 약물, 이온, 시토카인, 성장 인자, 및 호르몬을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자 (분비, 세포내 및 천연 및 유도성)를 증진 및/또는 전달하기 위해 다른 세포 (치료 또는 천연)에 대한 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 유핵 세포와 달리, 제핵 세포를 유사하거나 상이한 기원의 동일하거나 또 다른 세포 유형에 융합하면 문제가 있는 핵 전달이 없는 고유한 세포 하이브리드를 생성하며, 한편 세포 표면 단백질, 신호 전달 분자, 분비 단백질, 및 후성 유전적 변화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 바람직한 치료 속성을 유지한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 생물학적 과정 및 질환 상태의 바이오센서 및 신호 전달 지표로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 DNA-손상-유도된 아폽토시스성 사멸을 겪을 수 없기 때문에, 이들은 암 및 기타 질환의 치료를 위해 아폽토시스-유도 및/또는 DNA 독성/표적화제와 조합하여 사용될 수 있다.
제핵 세포는 그의 유핵 대응물보다 작고 이러한 이유로 혈관계와 조직 실질의 작은 개구부를 통해 더 잘 이동할 수 있다. 게다가, 크고 조밀한 핵을 제거하면 주요 물리적 장벽이 완화되어 세포가 혈관 및 조직 실질의 작은 개구부를 통해 자유롭게 이동할 수 있게 한다. 따라서, 제핵 세포는 개선된 체내 생체-분포 및 표적 조직으로의 이동을 가졌다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 직경이 적어도 1 μm이다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 직경이 1 μm 초과이다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 직경이 1-100 μm이다 (예를 들어, 1- 90 μm, 1-80 μm, 1-70 μm, 1-60 μm, 1-50 μm, 1-40 μm, 1-30 μm, 1-20 μm, 1-10 μm, 1-5 μm, 5-100 μm, 5- 90 μm, 5-80 μm, 5-70 μm, 5-60 μm, 5-50 μm, 5-40 μm, 5-30 μm, 5-20 μm, 5-10 μm, 10-100 μm, 10-90 μm, 10-80 μm, 10-70 μm, 10-60 μm, 10-50 μm, 10-40 μm, 10-30 μm, 10-20 μm, 20-100 μm, 20-90 μm, 20-80 μm, 20-70 μm, 20-60 μm, 20-50 μm, 20-40 μm, 20-30 μm, 30-100 μm, 30-90 μm, 30-80 μm, 30-70 μm, 30-60 μm, 30-50 μm, 30-40 μm, 40-100 μm, 40-90 μm, 40-80 μm, 40-70 μm, 40-60 μm, 40-50 μm, 50-100 μm, 50-90 μm, 50-80 μm, 50-70 μm, 50-60 μm, 60-100 μm, 60-90 μm, 60-80 μm, 60-70 μm, 70-100 μm, 70-90 μm, 70-80 μm, 80-100 μm, 80-90 μm, 또는 90-100 μm). 일부 실시양태에서, 일부 제핵 세포는 유리하게는 더 나은 생체분포를 허용하거나 대상체의 폐에 포획될 가능성이 덜할 만큼 충분히 작을 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 조작된 제핵 세포는 1시간 미만 내지 14일 (예를 들어, 1시간 미만, 6시간 미만, 12시간 미만, 1일 미만, 2일 미만, 3일 미만, 4일 미만, 5일 미만, 6일 미만, 7일 미만, 8일 미만, 9일 미만, 10일 미만, 11일 미만, 13일 미만, 14일 미만, 1 내지 14일, 1 내지 12일, 1 내지 10일, 1 내지 9일, 1 내지 8일, 1 내지 7일, 1 내지 6일, 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 1 내지 2일, 2 내지 14일, 2 내지 12일, 2 내지 10일, 2 내지 9일, 2 내지 8일, 2 내지 7일, 2 내지 6일, 2 내지 5일, 2 내지 4일, 2 내지 3일, 3 내지 14일, 3 내지 12일, 3 내지 10일, 3 내지 9일, 3 내지 8일, 3 내지 7일, 3 내지 6일, 3 내지 5일, 3 내지 4일, 4 내지 14일, 4 내지 12일, 4 내지 10일, 4 내지 9일, 4 내지 8일, 4 내지 7일, 4 내지 6일, 4 내지 5일, 5 내지 14일, 5 내지 12일, 5 내지 10일, 5 내지 9일, 5 내지 8일, 5 내지 7일, 5 내지 6일, 6 내지 14일, 6 내지 12일, 6 내지 10일, 6 내지 9일, 6 내지 8일, 6 내지 7일, 7 내지 14일, 7 내지 12일, 7 내지 10일, 7 내지 9일, 7 내지 8일, 8 내지 14일, 8 내지 12일, 8 내지 10일, 8 내지 9일, 9 내지 14일, 9 내지 12일, 9 내지 10일, 10 내지 14일, 10 내지 12일, 또는 12 내지 14일)의 규정된 수명을 갖는다. 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 제핵 세포 집단의 수명은 유전자 조작된 제핵 세포 집단의 일부 (예를 들어, 집단의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98%)가 사멸한 것으로 결정되는 평균 시간을 결정함으로써 평가될 수 있다. 세포 사멸은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 하나 이상의 시점에서 유전자 조작된 제핵 세포의 생존력은 형태학적 또는 기능성 파라미터가 무손상인지 여부를 결정함으로써 평가될 수 있다 (예를 들어, 트립판-블루 염료 배제, 무손상 세포막에 대한 평가, 플라스틱에 대한 부착 (예를 들어, 부착성 제핵 세포에서) 평가, 유전자 조작된 제핵 세포 이동 평가, 아폽토시스성 마커를 사용한 음성 염색 등). 일부 실시양태에서, 유전자 조작된 제핵 세포의 수명은 그것이 수득된 세포의 수명과 관련될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유전자 조작된 제핵 세포는 면역 인식 분자의 제핵 세포를 고갈시킴으로써 그의 천연 상태로부터 변경되었다. 예를 들어, 이들 면역 인식 분자는 HLA 항원, 프로테오글리칸, 당 모이어티, 배아성 항원, 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 회피 분자이다. 면역 회피 분자는 세포에 의해 발현되는 분자일 수 있으며, 이는 세포가 선천적 면역계을 회피하고 면역 반응을 회피하도록 한다. 일부 실시양태에서, 면역 회피 분자는 시토카인, IL-10, CD47, HLA-E/G, PD-1, LAG-3, CTLA-4, 또는 그의 조합이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 활성화 단백질이다. 일부 실시양태에서, 면역 활성화 단백질은 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합이다.
제핵 세포를 제조하는 방법
본원에 기재된 방법 및 조성물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 유핵 세포 (예를 들어, 진핵 세포, 포유동물 세포 (예를 들어, 인간 세포, 개 세포, 고양이 세포, 말 세포, 돼지 세포, 영장류 세포, 설치류 세포 (예를 들어, 마우스 세포, 기니피그 세포, 햄스터 세포, 또는 마우스 세포), 면역 세포, 또는 본원에 기재된 임의의 유핵 세포)는 피질 액틴 세포골격을 연화시키기 위해 시토칼라신으로 처리된다. 이어서, 핵은 제핵 세포를 생성하기 위해 피콜의 구배에서 고속 원심분리에 의해 세포체로부터 물리적으로 추출된다. 일부 실시양태에서, 핵은 밀도 구배 원심분리에 의해 제거된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "제핵 세포"는 세포의 내부 덩어리와 세포 소기관으로 이루어진 이전에 유핵 세포 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 세포)를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "진핵 세포"는 별개의, 막-결합 핵을 갖는 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 예를 들어 포유동물 (예를 들어, 설치류, 비인간 영장류, 또는 인간), 곤충, 진균, 또는 식물 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 효모세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 실시양태에서, 진핵 세포는 고등 진핵생물, 예컨대 포유동물, 조류, 식물, 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 원발성 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, 대식세포, 자연 살해 세포, 호중구, 비만 세포, 호염기구, 수지상 세포, 단핵구, 골수양-유래 억제제 세포, 호산구)이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 식세포 또는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도성 만능 줄기 세포 (iPS))이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 전구 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 세포주이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 현탁 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 부착 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 종양유전자의 발현에 의해 불멸화된 세포이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT)의 발현에 의해 불멸화된다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 세포는 중간엽 기질 세포 (MSC)이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 hTERT-불멸화 지방-유래 MSC (hTERT-MSC)이다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포는 환자 유래 세포 (예를 들어, 자가 환자-유래 세포, 또는 동종이형 환자-유래 세포)이다.
세포 (예를 들어, 본원에 기재된 세포 중 임의의 것)를 배양하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 세포는 성장, 증식, 생존력, 및 분화에 유리한 조건 하에 시험관내에서 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유핵 세포 (예를 들어, MSC)는 3D-현적 (예를 들어, 3D MSC)에서 배양된 다음에 제핵되어 3D 제핵 세포를 생성한다.
본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 추후 사용을 위해 동결된다. 혈청 (예를 들어, 소 태아 혈청) 및 디메틸 술폭시드 (DMSO)의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 세포 동결 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 사용 전에 해동된다.
제핵 세포 내로 생체분자를 도입하는 방법
생체분자 (예를 들어, RNA 분자 (예를 들어, mRNA, miRNA, siRNA, shRNA, lncRNA), DNA 분자 (예를 들어, 플라스미드), 단백질, 펩티드를 제핵 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 제핵 세포 내로 생체분자를 도입하는 데 사용할 수 있는 방법의 비제한적 예는 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 렌티바이러스 벡터, 전기천공, 미세주사, 리포펙션, 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 덴드리머-기반 형질감염, 양이온성 중합체 형질감염, 세포 스퀴징, 초음파천공, 광학 형질감염, 임펠렉션, 유체역학적 전달, 마그네토펙션, 나노입자 형질감염, 또는 그의 조합을 포함한다. 본원에 제공된 조성물 및 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 치료제, 바이러스, 항체, 또는 나노입자가 제핵 세포 내로 도입된다.
면역 회피
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 회피" 또는 "면역 인식을 회피하기 위해"는 종양 형성 및 진행의 근본적인 과정을 지칭한다. 종양 발달 동안, 만성 염증성 미세환경은 항종양 면역 반응을 감소시키고 면역 제거로부터 종양의 탈출을 조력한다. 염증성 면역 세포는 종양-연관 대식세포 (TAM), 세포독성 T (CD8) 림프구 (CTL), Th (CD4) 림프구, 자연 살해 (NK) 세포, 조절 T (Treg) 세포 및 골수양-유래 억제 세포 (MDSC)를 포함한다. 그 중, Treg 세포, MDSC 및 대식세포는 주로 핵심 분자, 예컨대 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 프로스타글란딘 E2, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 및 인터루킨-10 (IL-10)의 면역억제 작용에 관여한다. 몇몇성장 인자, 즉 TGF-β, 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF-2) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) 및 종양-괴사 인자 알파, 케모카인 (예를 들어, 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 및 C-C 모티프 케모카인 수용체 7)은 종양 진행, 침입 및 면역 회피에 밀접하게 관련되는 것으로 보고되었다.
추가로, 면역 회피는 주로 T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포에 의해 매개되는 면역 공격에 내성이 되는 면역 회피 분자 (예를 들어, 종양 변이체)의 선택을 통해 발생한다. 예를 들어, 면역 회피 분자는 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10), TGF-β, IGF-2, VEGF, TNF-알파, CD47, HLA-E, HLA-G, HLA-E/G, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD112R, CTLA-4, 케모카인 (예를 들어, 케모카인 리간드 1, C-C 모티프 케모카인 수용체 7), 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 회피 분자는 NK 억제제 수용체 (예를 들어, HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체, 예를 들어, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 또는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3))일 수 있다.
생체공학적 제핵 세포의 생성은 치료 기능을 개선하고 제어가능하고 안전한 세포-유사 실체를 생성한다. 면역계의 인식 및 추가 치료 용도를 회피하도록 설계된 생체공학적 제핵 세포는 예를 들어 안전성, 규정된 수명, 핵-코딩된 유전자를 숙주에 전달한 위험 없음, 및 치료 카고의 효과적인 전달을 포함한, 이전의 세포-기반 치료제에 비해 몇몇 이점을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10), TGF-β, IGF-2, VEGF, TNF-알파, CD47, HLA-E, HLA-G, HLA-E/G, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD112R, CTLA-4, 케모카인 (예를 들어, 케모카인 리간드 1, C-C 모티프 케모카인 수용체 7), 또는 그의 임의의 조합을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 NK 억제제 수용체 (예를 들어, HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체, 예를 들어, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 또는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3))를 발현하도록 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 인식을 통제하는 방법은 대상체에게 면역계에 의한 인식을 회피하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 면역 인식 분자의 제핵 세포를 고갈시키도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 면역 인식 분자는 HLA 항원, 프로테오글리칸, 당 모이어티, 배아성 항원, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 회피 분자이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10), TGF-β, IGF-2, VEGF, TNF-알파, CD47, HLA-E, HLA-G, HLA-E/G, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD112R, CTLA-4, 케모카인 (예를 들어, 케모카인 리간드 1, C-C 모티프 케모카인 수용체 7), 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 NK 억제제 수용체 (예를 들어, HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체, 예를 들어, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 또는 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3))를 포함한다.
면역 활성화
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역 활성화"는 백혈구 (예를 들어, 대식세포, 호중구, NK 세포) 및 면역계에 관여하는 다른 세포 유형의 전이를 지칭한다. 면역계의 활성화는 침습하는 병원체에 대한 병리학적으로 적절한 반응이다. 면역 활성화는 침습하는 병원체를 제어하고 청소하는 데 유익한 역할을 제공한다. 또한, 면역계의 감시 및 활성은 병원체 복제 및 확산을 제어하고 억제하는 데 기여한다. 추가로, 암 면역 요법은 면역계 및 그의 구성요소를 사용하여 면역 활성화를 통해 항종양 반응을 시작한다. 면역 활성화 단백질은 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, CD70, GITRL, LIGHT, CD30L, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
면역 활성화 및 추가 치료 용도를 위해 설계된 생체공학적 제핵 세포는 이전의 세포-기반 치료제에 비해 몇몇 이점을 제공하며, 추가로 병원체 및 암에 대한 면역 반응에서 선천적 면역 신호전달의 활성화 및 조절에 대한 더 나은 이해를 허용한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, CD70, GITRL, LIGHT, CD30L, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 활성화를 통제하는 방법은 대상체에게 면역계를 활성화하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 대상체에서 면역 반응을 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 활성화 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함한다.
조합 요법을 포함한 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 제핵 세포 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 다양한 질환을 치료하기 위해 임상적으로 관련된 카고/페이로드를 전달하기 위한 질환-귀소 비히킬로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 질환을 치료하거나 진단하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 1종 이상의 제핵 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 회피 분자이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역 회피 분자, 예를 들어, 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10), CD47, HLA-E/G, PD-1, LAG-3, CTLA-4, PD-L1, TIGIT, CD112R, 및 NK 억제제 수용체, 예컨대 HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체 (예를 들어, 살해 세포 면역글로빈-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 및 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3)), 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 면역 활성화 단백질이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 면역 활성화 단백질, 예를 들어, 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 완충제, 희석제, 가용화제, 유화제, 보존제, 보조제, 부형제, 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 제약 조성물은 멸균 주사가능한 형태 (예를 들어, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사에 적합한 액체 투여 형태로 제공된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비경구 비히클과 함께 제제화된다. 예를 들어, 이러한 비히클은 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 인간 혈청 알부민을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 리포솜 및 비수성 비히클 예컨대 고정유가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제는 공지된 또는 적합한 기술에 의해 멸균된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 원하는 특정한 투여 형태에 적합화된 바와 같은, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 기타 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 추가 요법 (예를 들어, 화학요법 (예를 들어, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 시클로포스파미드), 세포-기반 요법, 방사선 요법, 면역요법, 소분자, 억제 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, miRNA, siRNA, lncRNA), 엑소솜-기반 요법, 유전자 요법 또는 수술)과 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 요법은 면역 체크포인트 억제제가 투여되는 면역 체크포인트 차단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, TIM-3 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, B7 억제제, CD137 억제제, 또는 CTLA-4 억제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 또는 세미플리맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 PD-1 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 더발루맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 PD-L1 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 렐라틀리맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 LAG-3 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 이필리무맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CTLA-4 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가 요법과 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가 요법과 별도로 투여된다.
본원에 제공된 조성물 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가 요법 (예를 들어, 화학요법 (예를 들어, 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 시클로포스파미드), 세포-기반 요법, 방사선 요법, 면역요법, 소분자, 억제 핵산 (예를 들어, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, miRNA, siRNA, lncRNA) 또는 수술)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가 요법은 면역 체크포인트 억제제가 투여되는 면역 체크포인트 차단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, TIM-3 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, B7 억제제, CD137 억제제, 또는 CTLA-4 억제제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 조성물은 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 또는 세미플리맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 PD-1 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 더발루맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 PD-L1 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 렐라틀리맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 LAG-3 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 이필리무맙을 포함하나 이에 제한되지는 않는 CTLA-4 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 1종 이상의 추가의 치료 활성 물질을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제핵 세포의 하나의 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 실질적으로 모든 제핵 세포는 동일한 분자, 예컨대 동일한 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 폴리펩티드, 또는 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포의 하나의 집단은 하나의 생체분자 (예를 들어, 카고)를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포의 하나의 집단은 2개 이상의 생체분자 (예를 들어, 2개의 생체분자, 3개의 생체분자, 4개의 생체분자, 또는 5개의 생체분자)를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포의 하나의 집단은 2개의 생체분자를 발현하도록 조작되며, 여기서 2개의 생체분자를 발현하기 위해 도입된 2개의 외인성 분자는 동일한 유형의 분자일 수 있다. 예를 들어, 2개의 생체분자를 발현하도록 조작된 제핵 세포의 하나의 집단은 2개의 상이한 외인성 DNA 분자로 로딩될 수 있다. 제핵 세포의 하나의 집단이 2개 이상의 생체분자를 발현하도록 조작된 실시양태에서, 페이로드를 발현하기 위해 도입된 각각의 외인성 분자는 상이할 수 있다. 예를 들어, 2개의 생체분자를 발현하도록 조작된 제핵 세포의 하나의 집단에서, 하나의 생체분자를 발현하는 한 분자는 외인성 DNA 분자일 수 있고, 제2의 생체분자를 발현하는 제2의 분자는 외인성 RNA 분자일 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제핵 세포의 상이한 집단을 포함할 수 있고, 여기서 각각의 집단은 상이한 외인성 분자 (예를 들어, 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 폴리펩티드, 또는 외인성 단백질, 또는 그의 조합)를 발현하도록 조작된다. 예를 들어, 제약 조성물은 시토카인 (예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10)을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 한 집단 및 체크포인트 억제제 (PD-1 억제제, PD-L1 억제제, TIM-3 억제제, LAG-3 억제제, TIGIT 억제제, CD47 억제제, B7 억제제, CD137 억제제, 또는 CTLA-4 억제제)를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 제2 집단을 포함할 수 있다. 추가의 예는 IL-12를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 하나의 집단, 및 PD-1 억제제를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 제2 집단을 포함하는 제약 조성물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가 예는 CXCR4를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 한 집단, CCR2를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 제2 집단, 및 PGSL-1/FUT-7을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포의 제3 집단을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제핵 세포의 상이한 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 제핵 세포의 한 집단은 하나의 생체분자를 발현하도록 조작되고, 제핵 세포의 제2 집단은 2개 이상의 생체분자를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제핵 세포의 2개 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 집단은 2개 이상의 생체분자를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, 조합 요법은, 조성물이 하나 이상의 생체분자를 발현하도록 조작된 제핵 세포의 하나 이상의 집단(들)을 포함하든, 또는 조성물이 하나 이상의 생체분자를 발현하도록 조작된 제핵 세포의 하나 이상의 집단(들) 및 별도의 치료제를 추가로 포함하든, 치료제로서의 상승작용을 나타낸다. 일부 맥락에서 상승작용은 생체분자 및/또는 요법의 조합이 각각의 생체분자 및/또는 요법 단독에 대한 반응을 기반으로 예상되는 것보다 더 유익한 효과 (예를 들어, 더 강하고, 더 오래 지속되고, 더 나은 내약성 등)를 생성함을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포 및 체크포인트 억제제가 투여되는 조합 요법은 질환 치료의 상승 효과를 생성할 수 있다. 예를 들어, IL-12를 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포가 PD-1 체크포인트 억제제와 함께 투여되는 경우, 마우스 모델에서 종양 성장을 상당히 감소시키고 생존을 개선시키는 것으로 나타났다 (예를 들어, 도 2E-2F 및 도 15A-15D).
질환 진단으로서 사용하는 방법
본 개시내용은 DNA/유전자, RNA (mRNA, shRNA, siRNA, miRNA), 나노입자, 펩티드, 단백질 및 플라스미드, 박테리아, 바이러스, 소분자 약물, 이온, 시토카인, 성장 인자, 및 호르몬을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자 (분비, 세포내, 및 천연 및 유도성)를 증진 및/또는 전달하기 위한 제핵 세포 (천연 또는 조작된)의 사용 방법을 제공한다.
제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)는 직경이 더 작지만 경질의 핵이 없으며 유핵 모세포보다 모세관 또는 간질 공간과 같은 작은 협착부를 더 효과적으로 통과할 것으로 예상된다. 예를 들어, 제핵 세포는 유핵 모세포보다 미세혈관을 더 잘 통과하는 것으로 나타났으며, 따라서 손상되거나 염증발생 조직으로의 생체내 귀소를 더 용이하게 한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 "염증 귀소 수용체"를 발현하도록 유전자 조작되며, 여기서 본원의 "염증 귀소 수용체"는 혈관에서 내피 세포에 결합하는 백혈구 상의 부착 분자를 지칭한다. 염증 귀소 수용체는 백혈구가 신체의 조직 염증 부위로 가이드하기 위해 백혈구에 의해 사용된다. 림프구 (예를 들어, 귀소 수용체) 및 내피 세포 (예를 들어, 혈관 어드레신) 상에 이들 다양한 조직-특이적 부착 분자는 특수화된 면역 반응의 발달에 기여한다. 일부 실시양태에서, 염증 귀소 수용체는 α4β7, VCAM-1, CD34, GLYCAM-1, LFA-1, CD44 및 그의 조합이다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 "반딧불이 루시페라제"를 발현하도록 유전자 조작되며, 여기서 "반딧불이 루시페라제"는 유전자 조절 및 기능을 연구하기 위한 발광 효소 및 생물발광 리포터를 지칭한다. 이는 포유동물 세포 또는 조직에서 내인성 루시페라제 활성의 부재로 인해 매우 민감한 유전자 리포터이다. 반딧불이 루시페라제는 62,000 달톤 단백질이며, 이는 단량체로서 활성이며 그의 활성을 위한 후속 처리를 필요로 하지 않는다. 상기 효소는 ATP-의존성 D-루시페린 산화를 옥시루시페린으로 촉매하여, 560 nm를 중심으로 발광을 생성한다. 반응으로부터 방출되는 빛은 루시페라제 효소 분자의 수에 정비례한다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 염증 귀소 수용체만을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 반딧불이 루시페라제만을 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 실시양태에서, 제핵 세포는 염증 귀소 수용체 및 반딧불이 루시페라제 둘 다를 발현하도록 유전자 조작된다.
일부 실시양태에서, 제핵 세포는 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것에 의해 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는데 사용되며, 여기서 유전자 조작된 제핵 세포가 질환 상태의 존재 또는 위치를 확인한다. 일부 실시양태에서, 외인성 단백질은 염증 귀소 수용체이다. 일부 실시양태에서, 염증 귀소 수용체는 제핵 세포를 손상된 및/또는 염증발생 조직으로 향하게 한다.
치료 방법
본 방법은 대상체에서 질환 (예를 들어, 암 (예를 들어, 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 고형암, 백혈병), 감염 (예를 들어, 바이러스 감염, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)-감염, 중증 급성 호흡기 증후군 또는 COVID-19 감염 (코로나바이러스 감염)이나 이에 제한되지는 않음, 기생충 감염, 예컨대 샤가스병(Chagas disease)이나 이에 제한되지는 않음, 또는 박테리아 감염, 예컨대 결핵이나 이에 제한되지는 않음), 신경계 질환 (예를 들어, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병), 자가면역 질환 (예를 들어, 당뇨병, 크론병, 다발성 경화증, 겸상 적혈구 빈혈), 심혈관 질환 (예를 들어, 급성 심근경색증, 심부전, 난치성 협심증), 안과 질환, 골격계 질환, 대사 질환 (예를 들어, 페닐케톤뇨증, 글리코겐 저장 결핍 1A형, 고셔병(Gaucher disease)))을 치료하거나 진단하기 위한 제핵 세포의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이러한 제핵 세포 치료를 필요로 하거나 이를 필요로 하는 것으로 결정되었다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그), 개과 (예를 들어, 개), 고양이과 (예를 들어, 고양이), 말(equine) (예를 들어, 말), 양, 소, 돼지, 영장류, 예를 들어 유인원(simian) (예를 들어, 원숭이), 유인원(ape) (예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이), 또는 인간일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 치료하는 것은 질환의 위험이 있는 대상체에서 질환의 징후 또는 증상의 발생을 감소시키거나 예방하는 것 (또는 위험을 감소시키는 것)을 의미하는 "예방적 치료", 및 질환의 징후 또는 증상을 감소시키는 것, 질환의 진행을 감소시키는 것, 질환의 중증도, 질환으로 진단된 대상체에서의 재발을 감소시키는 것을 의미하는 "치료적 치료"를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다"는 질환의 적어도 하나의 임상 파라미터를 개선하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여", "투여하는" 및 그의 변형은 조성물 또는 작용제를 대상체로 도입하는 것을 의미하고 조성물 또는 작용제의 공동 및 순차적 도입을 포함한다. 대상체로의 조성물 또는 작용제의 도입은 경구, 폐, 비강, 비경구 (정맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장, 림프내 또는 국소를 포함한, 임의의 적합한 경로에 의한다. 투여는 자기-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 그의 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물 또는 작용제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 조성물을 투여한다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다.
본원에 제공된 방법 중 임의의 것의 일부 실시양태에서, 조성물은 일정 시간의 기간 동안 (예를 들어, 2일마다, 1주 2회, 1주 1회, 매주, 매월 3회, 매월 2회, 매월 1회, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다, 7개월마다, 8개월마다, 9개월마다, 10개월마다, 11개월, 1년에 1회) 적어도 1회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60 ,70 80, 90, 100회) 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 소형 RNA, 소분자 약물, 펩티드, 바이러스, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 화학요법제를 포함한다.
다수의 실시양태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
예시적인 실시양태:
실시양태 1. 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 것
을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 제핵 세포가 2종 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는 것인 방법.
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 제핵 세포가 3종 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는 것인 방법.
실시양태 4. 실시양태 1에 있어서, 제핵 세포가 4개 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는 것인 방법.
실시양태 5. 실시양태 1에 있어서, 제핵 세포가 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 섬유모세포, 및 성체 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도성 만능 줄기 세포, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
실시양태 6. 실시양태 1에 있어서, 제핵 세포가 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 유래되는 것인 방법.
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 외인성 DNA 분자가 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자, DNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 외인성 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), RNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 9. 실시양태 1에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 효소, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 10. 실시양태 1에 있어서, 조성물의 제핵 세포가 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 선택되는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 1 내지 10에 있어서, 제핵 세포가 치료제를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 치료제가 소형 RNA, 소분자 약물, 펩티드, 바이러스, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함하는 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 11에 있어서, 치료제가 화학요법제를 포함하는 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 1 내지 13에 있어서, 투여하는 것이 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 경구 투여, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 1 내지 14에 있어서, 조성물이 비표적 조직에서 최소 축적을 나타내는 것인 방법.
실시양태 16. 실시양태 1 내지 15에 있어서, 투여하는 것이 질환 부위 내에 있는 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 1 내지 16에 있어서, 질환이 염증, 감염, 암, 신경계 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격계 질환, 대사 질환, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 18. 실시양태 1 내지 17에 있어서, 질환이 염증을 포함하는 것인 방법.
실시양태 19. 실시양태 1 내지 18에 있어서, 질환이 암을 포함하는 것인 방법.
실시양태 20. 실시양태 19에 있어서, 암이 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 백혈병, 중피종, 육종, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 21. 실시양태 1 내지 20에 있어서, 투여하는 것이 종양내 투여를 포함하는 것인 방법.
실시양태 22. 실시양태 1 내지 21에 있어서, 암 진행을 억제하는 방법.
실시양태 23. 실시양태 1 내지 22에 있어서, 종양 성장을 감소시키는 방법.
실시양태 24. 실시양태 1 내지 23에 있어서, 완전한 종양 퇴축을 생성하는 방법.
실시양태 25. 실시양태 1 내지 24에 있어서, 대상체의 생존가능성을 향상시키는 방법.
실시양태 26. 실시양태 1 내지 25에 있어서, 전신 항종양 면역 반응을 생성하는 것인 방법.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26에 있어서, 제핵 세포의 조성물이 90% 초과 순도인 방법.
실시양태 28. 실시양태 1 내지 27에 있어서, 제핵 세포의 조성물이 95% 초과 순도인 방법.
실시양태 29. 실시양태 1 내지 28에 있어서, 조성물이 98% 초과 순도인 방법.
실시양태 30. 실시양태 1 내지 29에 있어서, 조성물이 99% 초과 순도인 방법.
실시양태 31. 유핵 세포를 제핵하는 단계; 및
제핵 세포 내로 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 외인성 펩티드 및/또는 치료제를 도입하는 단계를 포함하는, 제핵 세포를 유전자 조작하는 방법이며, 여기서 유전자 조작된 제핵 세포가 생체내에서 모세포의 기능성 번역 및 분비 기구를 유지하는 것인, 제핵 세포를 유전자 조작하는 방법.
실시양태 32. 실시양태 31에 있어서, 도입 단계가 유핵 세포의 제핵 전에 발생하는 것인 방법.
실시양태 33. 실시양태 31에 있어서, 도입 단계가 유핵 세포의 제핵 후에 발생하는 것인 방법.
실시양태 34. 실시양태 31 내지 33의 방법에 있어서, 상기 제핵 단계가 95% 초과 효율적인 것인 방법.
실시양태 35. 실시양태 31 내지 34에 있어서, 적어도 80%의 회수율을 갖는 방법.
실시양태 36. 실시양태 31 내지 35의 방법에 있어서, 적어도 85% 회수율을 갖는 방법.
실시양태 37. 실시양태 31 내지 36에 있어서, 도입 단계가 바이러스 형질도입을 포함하는 것인 방법.
실시양태 38. 실시양태 31 내지 37에 있어서, 도입 단계가 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 리포펙션, 렌티바이러스 벡터, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
실시양태 39. 실시양태 31 내지 38에 있어서, 외인성 DNA 분자가 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자, DNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 40. 실시양태 31 내지 38에 있어서, 외인성 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), RNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 41. 실시양태 31 내지 38에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 효소, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 42. 실시양태 31 내지 41에 있어서, 유전자 조작된 제핵 세포를 냉동보존하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 43. 실시양태 42에 있어서, 유전자 조작된 제핵 세포가 모세포와 비교하여 냉동보존으로부터 회수될 가능성이 더 큰 것인 방법.
실시양태 44. 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 외인성 펩티드, 또는 치료제 중 적어도 1종을 제핵 세포 내로 도입함으로써 생성된 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 2종 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 46. 실시양태 44에 있어서, 3종 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 47. 실시양태 44에 있어서, 4종 이상의 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드, 또는 그의 조합을 발현하도록 조작되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 48. 실시양태 44에 있어서, 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 유래되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 49. 실시양태 48에 있어서, hTERT-불멸화 지방-유래 MSC (hT-MSC)로부터 유래되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 50. 실시양태 49에 있어서, 모 hT-MSC 세포와 비교하여 유사한 세포외 소포 (EV)를 분비하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 51. 실시양태 44에 있어서, 도입 단계가 바이러스 형질도입을 포함하는 것인, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 52. 실시양태 44에 있어서, 도입 단계가 리포솜 매개 전달, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 기반 벡터, 리포펙션, 렌티바이러스 벡터, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 53. 실시양태 44에 있어서, 모세포와 실질적으로 동일한 세포 구조를 나타내는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 54. 실시양태 53에 있어서, 기능성 세포내 소기관을 함유하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 55. 실시양태 54에 있어서, 상기 기능성 세포내 소기관은 골지체, 소포체, 미토콘드리아, 리소솜, 엔도솜, 리보솜, 또는 그의 조합 중 적어도 하나를 포함하는, 유전자 조작된 제핵 세포
실시양태 56. 실시양태 44에 있어서, 모세포와 실질적으로 동일한 세포 기능을 나타내는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 57. 실시양태 56에 있어서, 모세포의 제타 전위와 실질적으로 동일한 제타 전위를 갖는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 58. 실시양태 56에 있어서, 기능성 막 수용체를 함유하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 59. 실시양태 56에 있어서, 기능성 이동 및 침습 기구를 포함하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 60. 실시양태 56에 있어서, 모세포에 의해 생성된 세포외 소포와 실질적으로 동일한 세포외 소포를 능동적으로 생성 및 분비할 수 있는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 61. 실시양태 44 내지 60에 있어서, 생체내에서 치료적 생물활성 단백질을 생성하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 62. 실시양태 44 내지 61에 있어서, 세포 표면 단백질을 발현하도록 조작되는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 63. 실시양태 44에 있어서, 세포 표면 단백질이 CXCR4, CCR2, PSGL-1, CD44, CD90, CD105, CD106, CD166, Stro-1, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 64. 실시양태 44 내지 63에 있어서, 유전자 조작된 제핵 세포의 직경이 모세포의 직경보다 작은 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 65. 실시양태 44 내지 64에 있어서, 유전자 조작된 제핵 세포의 직경이 약 1 마이크로미터 내지 100 마이크로미터인 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 66. 실시양태 44 내지 65에 있어서, 현적 세포 배양에서 배양된 세포로부터 유래된, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 67. 실시양태 44 내지 66에 있어서, 제핵 후 최대 72시간 동안 생존가능한, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 68. 실시양태 44 내지 67에 있어서, 적어도 48시간 동안 MSC 표면 마커 단백질 발현을 유지하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 69. 실시양태 44 내지 68에 있어서, 세포외 신호에 반응하는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 70. 실시양태 69에 있어서, 세포외 신호가 케모카인인 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 71. 실시양태 44 내지 70에 있어서, 주화성 능력이 있는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 72. 실시양태 44 내지 71에 있어서, 단백질 분비 능력이 있는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 73. 실시양태 44 내지 72에 있어서, 귀소 능력이 있는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 74. 실시양태 44 내지 73에 있어서, 생체내 표적 부위에서 표적 생성물 전달 능력이 있는, 유전자 조작된 제핵 세포.
실시양태 75. 대상체에게 면역계에 의한 인식을 회피하고/거나 면역계를 활성화하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것
을 포함하는, 대상체에서 면역 인식 및/또는 활성화를 통제하는 방법.
실시양태 76. 실시양태 75에 있어서, 제핵 세포가 대상체에서 면역 인식을 회피하는 것인 방법.
실시양태 77. 실시양태 76에 있어서, 제핵 세포가 면역 인식 분자의 제핵 세포를 고갈시키도록 유전자 조작된 것인 방법.
실시양태 78. 실시양태 77에 있어서, 면역 인식 분자가 HLA 항원, 프로테오글리칸, 당 모이어티, 배아성 항원, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 79. 실시양태 76에 있어서, 제핵 세포가 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 것인 방법.
실시양태 80. 실시양태 79에 있어서, 외인성 단백질이 세포 표면 단백질인 방법.
실시양태 81. 실시양태 80에 있어서, 외인성 단백질이 면역 회피 분자인 방법.
실시양태 82. 실시양태 79-81에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, IL-10, CD47, HLA-E/G, PD-1, LAG-3, CTLA-4, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 83. 실시양태 75에 있어서, 제핵 세포가 대상체에서 면역 반응을 활성화시키는 방법.
실시양태 84. 실시양태 83에 있어서, 제핵 세포가 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 것인 방법.
실시양태 85. 실시양태 84에 있어서, 외인성 단백질이 세포 표면 단백질인 방법.
실시양태 86. 실시양태 85에 있어서, 외인성 단백질이 면역 활성화 단백질인 방법.
실시양태 87. 실시양태 84-86에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 88. 실시양태 75-87에 있어서, 대상체에서 질환을 치료하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시양태 89. 실시양태 88에 있어서, 질환이 염증 장애 및/또는 암을 포함하는 방법.
실시양태 90. 실시양태 89에 있어서, 암이 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 백혈병, 중피종, 육종, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 91. 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는 방법이며,
여기서 유전자 조작된 제핵 세포가 질환 상태의 존재 또는 위치를 확인하는 것인, 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는 방법.
실시양태 92. 실시양태 91에 있어서, 외인성 단백질이 염증 귀소 수용체인 방법.
실시양태 93. 실시양태 92에 있어서, 염증 귀소 수용체가 제핵 세포를 손상된 및/또는 염증발생 조직으로 향하게 하는 것인 방법.
실시양태 94. 실시양태 91-93에 있어서, 제핵 세포가 반딧불이 루시페라제를 추가로 포함하는 것인 방법.
실시양태 95. 실시양태 94에 있어서, 반딧불이 루시페라제가 검출가능한 광을 방출하는 것인 방법.
실시양태 96. 실시양태 91-95에 있어서, 질환이 염증, 감염, 암, 신경계 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격계 질환, 대사 질환, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시양태 97. 실시양태 96에 있어서, 질환이 암을 포함하는 것인 방법.
실시양태 98. 실시양태 97에 있어서, 암이 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 백혈병, 중피종, 육종, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
실시예
본 개시내용은 본 개시내용의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 기재된다.
실시예 1 - 제핵 세포를 유전자 조작
첫째, 모세포 (예를 들어, 유핵 세포)를 MSC의 제핵 전에 유전자 조작하였다. CXCR4와 같은 G-단백질 결합 수용체는 세포외 자극을 세포내 신호로 변환하고 중요한 세포 기능을 조절한다. hT-MSC는 렌티바이러스 감염 및 약물 선택을 통해 안정적인 CXCR4 발현 (MSCCXCR4)으로 조작되었다. 제핵 후, MSCCXCR4로부터 유래된 제핵 세포는 최대 48시간 동안 유세포 분석법에 의해 CXCR4의 안정적인 표면 발현을 나타내고, 제핵 후 최대 72시간 동안 생존가능한 것으로 나타났으며 (도 1B 및 1C), 현탁액 중 hT-MSC보다 상당히 작다 (도 1G). 중요하게는, 제핵 세포CXCR4가 용량-의존적 방식으로 동족 리간드 SDF-1α의 케모카인 구배에 반응하고 그로 향해 이동하였으며 (도 1D), 이는 제핵 세포 CXCR4 의 막-발현 수용체 및 하류 신호전달 경로가 완전히 기능성임을 나타낸다. 다음으로, 제핵 세포는 시험관내에서 합성된 인공 mRNA로 제핵 세포를 효율적으로 형질감염시키는 방법을 개발함으로써 제핵 후 유전자 조작되었다. GFP mRNA로 형질감염시킨 후, 에피-형광 이미지 및 유세포 분석법 분석은 제핵 세포가 hT-MSC에 필적하는 세포질 GFP 단백질을 발현함을 나타낸다 (도 1E). 특히, 외인성 가우시아 루시페라제 (Gluc) mRNA로 형질감염된 제핵 세포는 모세포와 유사한 수준으로 조건화 배지 (CM)에서 활성 Gluc를 분비하였다 (도 1F). 이것은 제핵 세포가 외인성 mRNA를 번역하고 기능성 단백질을 분비할 수 있음을 나타내며, 이는 기능성 mRNA 번역 및 단백질 분비 기구를 입증한다. 종합하면, 제핵 세포는 치료 플랫폼으로 맞춤화할 수 있는 다양한 제핵 전 및 제핵 후 조작 능력을 제공한다.
다음으로, 제핵 세포는 생체내에서 치료 수준의 생물학적 제제를 생성하도록 조작되었다. 여기에서, 제핵 세포가 종양 미세 환경에서 생물활성 단백질을 생성할 수 있는지 시험하였다. hT-MSC 및 제핵 세포를 마우스 IL-12 (mIL-12) mRNA (MSC-IL-12 및 카고사이트-IL-12)로 형질감염시켰다 (도 7A). 제핵 세포-IL-12는 24시간당 20 ng/25,000개 제핵 세포에 해당하는 ELISA에 의해 분석한 바와 같이 최대 72시간 동안 CM에서 mIL-12를 분비하였다 (도 7B). CM으로 생체외 처리된 마우스 비장세포는 Stat4 인산화를 나타내며, 이는 카고사이트-IL-12가 생물학적으로 활성인 mIL-12를 분비함을 나타낸다 (도 7C). 카고사이트-IL-12 생체내 치료 기능을 시험하기 위해, 예후가 불량한 삼중 음성 (ER-, PR-, HER2/neu-) 유방암 (TNBC)을 재현하는 마우스 모델을 사용하였다 (도 2A). E0771 (마우스 TNBC) 세포를 면역적격, 동계 C57BL/6J 마우스에 피하 (SQ) 주사한다. 종양이 14일에 걸쳐 발생한 다음에 카고사이트-IL-12 또는 MSC-IL-12를 종양내 주사하였다. 카고사이트-IL-12는 종양 미세환경 내에서 생물활성 mIL-12를 쉽게 분비하였고 (도 2B), IL-12의 공지된 하류 인자 예컨대 IFN-γ, PD-L1, 및 CXCL9를 유도하였고 (도 2C), 종양 부위에 핵심 면역 이펙터 세포를 모집하였다 (도 2D). 처리된 동물에서 어떤 건강에 유해한 문제도 언급되지 않았으며, 이는 혈장에서 검출된 최소 수준의 mIL-12에 의해 추가로 뒷받침되었고 (도 7D), 혈액학에 의한 기관 기능장애의 어떤 적응증도 없었다. 이러한 연구결과를 기반으로 하여, 카고사이트-IL-12를 단독으로 사용하거나 면역 체크포인트 차단과 함께 사용할 때 암 진행을 억제하고 동물 생존을 개선하는 능력이 결정되었다. 항-PD-1 항체 (aPD-1)를 종양내 계내 백신접종과 조합하여 사용한 최근 임상 시험과 일치하여 (도 15A), 전기천공법에 의해 전달된 IL-12 플라스미드 (NCT03567720), aPD-1 단독으로 처리된 E0771 종양은 종양 진행에 영향을 미치지 않았으며, 한편 카고사이트-IL-12에 이어서 aPD-1로 처리된 종양은 종양 성장을 상당히 감소시켰고, 동물 생존을 개선시켰으며 (도 2E), 이는 aPD-1과 조합된 MSC-IL-12에 필적하였다. 특히, 조합된 카고사이트-IL-12 및 aPD-1로 처리된 동물의 40%는 나머지 실험 (>175일) 동안 완전한 종양 퇴축 (촉지할 수 있는 종양 없음)을 가졌다 (도 2E). 이들 동물들에게 대측성 옆구리에 SQ E0771 세포를 재-시험감염시켰을 때, 종양은 다시 성장하지 못했으며, 이는 조합 요법이 내구성 있고 전신적인 항종양 면역 반응을 생성했음을 나타낸다 (도 2F). 또한, 카고사이트-IL-12의 주사는 동물 건강에 부정적인 영향을 미치지 않았으며 카고사이트-IL-12 및 PD-1로 처리된 동물에서 어떤 유의한 체중 변화도 관찰되지 않은 것으로 나타났다 (도 15B). 카고사이트-IL-12가 IV 주사되었을 때, 급성기 면역 마커의 변화는 최소한 이거나 검출할 수 없었으며 (도 15C), 이는 카고사이트-IL-12가 최소한의 면역원임을 나타낸다. 마지막으로, 양측 E0771 TNBC 모델에서, 종양에 카고사이트-IL-12 또는 PBS (대조군) 3회 용량을 일측으로 주사하고 시간 경과에 따른 양측 종양 크기를 측정하였다. 중요하게는, 카고사이트-IL-12의 일측 주사는 대조군과 비교하여 두 종양 모두에서 종양 성장을 감소시켰고 (도 15D) CD8+ T 세포의 종양 침윤을 증가시켰으며, 단일 부위에 카고사이트-IL-12 주사가 전신 항종양 반응을 유도하여 원거리 부위 (대측성 종양)에서 종양 성장을 제한할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 제핵 세포는 면역조절 생물학적 제제를 종양 부위에 효과적으로 전달하고 TNBC로 치유된 주목할만한 수의 동물에서 전신 항종양 면역을 유도한다.
MSC와 같은 유핵 세포는 치료 생물학적 제제를 전달하도록 조작되었지만, 생체내 제핵 세포 거동은 더 제어가능하고 예측가능하며 그 이유는 이들이 증식하거나 조직에 생착할 수 없고 질환 미세환경에서 활성화될 수 있는 전사 기구를 갖지 않기 때문이다. IL-12를 전달하는 경우에, IFN-γ는 세포 비히클 상에서 PD-L1 및 IDO1과 같은 바람직하지 않은 면역억제 인자의 유전자 전사를 상당히 활성화시킬 수 있는 주요 하류 이펙터이다. 시험관내에서 인간 IFN-γ로 자극되었을 때, hT-MSC 및 방사선조사된 hT-MSC 둘 다는 PD-LI 및 IDO1 mRNA를 극적으로 증가시켰으며, 한편 유전자 조작된 제핵 세포는 그렇지 않았다 (도 2G). 종합하면, 제핵 세포는 유해 부작용 없이 국소 투여를 통해 면역조절 시토카인을 이환 조직에 효과적으로 전달하도록 생체공학적으로 제조될 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 더 양호한 안전성 프로파일을 나타낸다.
실시예 2 - 유전자 조작된 제핵 세포의 생체내 귀소 능력
첫째, 제핵 세포는 작고 경질의 핵이 없기 때문에(도 8A), 제핵 세포는 유핵 모세포보다 모세관 또는 간질 공간과 같은 작은 협착부를 더 효과적으로 통과할 것으로 예상되었다. 이것은 라이프액트(LifeAct)-RFP-표지된 hT-MSC 및 제핵 세포가 간질 기공을 모방하는 한정된 3D-협착부를 통해 FBS 구배를 따라 이동하도록 허용된 미세유체 장치를 사용하여 시험하였다. 이동은 세포가 개별 협착부를 통해 이동하는 데 필요한 시간을 기록하기 위해 시간-경과 공초점 현미경법에 의해 이미지하였다. 예측한 바와 같이, 제핵 세포는 협착부를 효율적으로 통과하였으며, 한편 hT-MSC는 종종 강직성 핵으로 인해 한정된 협착부에 포획되었다 (도 8B). 이 결과는 생체내에서 라이프액트-RFP 및 필수 염료 DiD로 이중 표지된 hT-MSC 또는 제핵 세포를 마우스에 정맥내 주사함으로써 확인되었다. 주사 후 24시간에 유세포 분석법에 의해, 모세포와 비교하여 폐 조직에서 검출된 제핵 세포가 상당히 더 적었다 (도 3B). 그러나, 폐 포획을 훨씬 추가로 감소시키기 위해, MSC를 현적 배양하여 이전에 보고된 바와 같이 전통적인 2D-배양 MSC보다 작고 감소된 폐 포획을 나타내는 3D-배양 MSC를 생성하였다 (도 3B). 3D-배양된 MSC가 제핵되었을 때, 생성된 3D-카고사이트는 가장 작았고 가장 적은 폐 트래핑을 가졌다 (도 3B, 도 8A 및 도 9D). 이들 연구결과에 기초하여, 후속 생체내 귀소 검정의 대부분은 3D-hT-MSC 및 3D-카고사이트를 사용하였다. 종합적으로, 우리의 결과는 제핵 세포가 모세포보다 미세혈관을 더 잘 통과함을 나타내며, 이는 생체내 귀소를 더 용이하게 할 수 있다.
다음으로, 제핵 세포는 특이적 케모카인 수용체 및 이환 조직에 상응하는 부착 분자로 설계 및 조작되었으며, 이는 생체내 표적 부위로 귀소하는 제핵 세포를 증가시키는 것으로 가정되었다. 급성 염증 마우스 모델이 사용되었으며, 여기서 박테리아-유래 지질다당류 (LPS)는 급성, 국소 염증을 유도하기 위해 귓바퀴에 피내 (i.d.) 주사하였다. 식염수를 대조군으로서 대측성 귀에 피내 주사하였다. 이 모델을 사용하면 동일한 동물 내에서 염증발생 대측성 조직과 염증이 없는 대측성 조직 사이의 치료 세포 귀소를 정량적으로 검사할 수 있다. SDF-1α, Ccl2, 및 P-셀렉틴 (E-셀렉틴 제외)을 대조군과 비교하여 염증발생 귀에서, LPS 주사 후 6시간부터 상향조절되는 것으로 밝혀졌다 (도 8C). 이어서 hT-MSC는 SDF-1α에 결합하는 CXCR4 (MSCCXCR4), Ccl2에 결합하는 CCR2 (MSCCCR2), 또는 P- 및 E-셀렉틴에 결합하는 푸코실트랜스퍼라제 7과 함께 내피 부착 분자 PSGL-1 (FUT-7, PSGL-1의 기능성 변형의 경우) (MSCPSGL-1)을 안정적으로 발현하도록 조작되었다. 이들 조작된 MSC 각각을 제핵하여 상응하는 제핵 세포 (카고사이트CXCR4, 카고사이트CCR2, 및 카고사이트PSGL-1)를 생성하였다. 유세포 분석법은 조작된 제핵 세포가 제핵 후 적어도 48시간 동안 CXCR4, CCR2 또는 PSGL-1의 안정적인 표면 발현을 유지함을 나타냈다. 기능적으로, 카고사이트PSGL-1은 제핵 후 48시간까지 그의 수용체 P-/E-셀렉틴에 대한 결합을 증가시킨 것으로 나타났다. 카고사이트CXCR4가 SDF-1α에 강력하게 반응한 것처럼 (도 1D), 카고사이트CCR2는 비조작 제핵 세포와 비교하여 Ccl2에 대해 극적인 주화성을 나타냈다 (도 9A). 마지막으로, 상이한 약물 선택 하에 3개의 개별 DNA-통합 렌티바이러스를 사용하여, hT-MSC를 조작하여 CCR2, CXCR4, 및 PSGL-1/FUT-7을 동시에 발현한 다음에, FACS를 분류하여 모든 3개 마커의 높은 발현을 가진 세포를 풍부하게 하였다 (MSCTri-E로 명명됨). MSCTri-E-유래 카고사이트Tri-E는 Ccl2 및 SDF-1α 구배 (도 9B, 도 16A-16C)를 향한 강력한 이동을 나타냈으며, 이는 조작된 수용체의 공동-발현이 기능적으로 서로 간섭하지 않으면서 이동을 개선하였음을 나타낸다.
또한, 제핵 세포는 그의 선천 종양 영양 특성과 조합된 백혈구 귀소 분자로 조작되었으며, 이는 종양으로 귀소하는 제핵 세포를 상당히 개선하는 것으로 가정되었다. CCP 카고사이트가 E0771 뮤린 BC 조건화 배지 (CM)에 의해 생성된 케모카인으로 귀소할 수 있는 지를 결정하였다. E0771 세포는 시험관내 및 생체내 종양내 SDF-1α 및 CCL2를 생성하는 확립된 뮤린 BC 계통이다. 조작된 제핵 세포는 E0771 CM으로 이동하며, 이는 CXCR4 및 CCR2 화학유인물질 수용체를 사용한 유전자 조작을 상당히 증진시켰다 (도 14).
이어서 조작 전략이 생체내 귀소를 개선하는지 시험하였다. 3D-배양된 MSC를 DiD로 표지하고 피내 LPS 주사 후 6시간에 마우스에 정맥내 주사하였다 (도 3A). 마우스 조직을 정맥내 주사 후 24시간에 수확하고 DiD+F4/80- 세포에 대해 유세포 분석법에 의해 분석하였으며, 이는 마우스 대식세포에 비특이적 DiD 혼입 가능성을 배제한다. CCR2, CXCR4, 또는 PSGL-1의 개별 발현은 비조작 hT-MSC와 비교하여 염증발생 귀에 특이적으로 세포 귀소를 개선하였으며, 이는 이들 단백질이 생체내에서 기능하고 귀소에 기여함을 나타낸다. 특히, 모든 3가지 표면 단백질을 동시에 발현하는 MSCTri-E는 가장 큰 귀소를 나타냈고 (도 9C), 이는 조작의 다중 층이 조합되어 우수한 생체내 귀소를 달성할 수 있음을 시사한다. 조작된 세포의 일관성 및 균질성을 추가로 증가시키기 위해, FACS를 사용하여 MSCTri-E를 분류하여 모든 3개의 마커의 높은 발현을 가진 19개의 단일 세포 MSCTri-E 클론을 확립하고, 표면 발현, 성장 속도, 및 세포 크기를 기반으로 한 후속 생체내 실험을 위해 클론 19 (MSCTri-E C19)를 선택하였다. 3D-MSCTri-E C19를 제핵하여 3D-카고사이트Tri-E C19를 생성하였으며, 이는 비조작된 3D-카고사이트 (도 3C)와 비교하여 염증발생 귀에 대한 우수한 귀소를 나타냈다. 조작된 3D-카고사이트 및 비조작된 3D-카고사이트 둘 다 유사한 낮은 폐 포획 (도 9D)을 가졌으나 조작된 제핵 세포만이 귀에 대한 귀소를 상당히 개선했기 때문에, 우리의 결과는 3D-카고사이트Tri-E C19 상의 조작된 표면 단백질이 생체내 귀소가 상당히 개선하였음을 시사한다. 게다가, 3D-카고사이트Tri-E C19는 내인성 귀소 능력을 갖는 BALB/c 마우스로부터의 동계 MSC 계통인 마우스 D1 MSC 또는 제핵 세포 (도 3C)와 비교하여 상당히 양호한 귀소를 나타냈다. 이 결과는 반딧불이 루시페라제를 사용한 생물발광 검정에 의해 독립적으로 확인되었으며, 3D-카고사이트Tri-E C19가 정맥내 주사 후 2시간 만에 3D-MSCTri-E C19와 비교하여 폐 체류가 감소했으나 염증발생 귀로의 귀소가 극적으로 증가했음을 나타냈으며, 이는 다른 기관에서 최소한의 축적으로 지정된 질환 조직으로 조작된 카고사이트의 특정 귀소를 나타낸다 (도 10, 도 11A 및 11B). 중요하게는, 인간 미토콘드리아 및 핵에 대한 구체적 항체로 면역염색함으로써, 정맥내 주사된 3D-카고사이트Tri-E C19는 혈관 내강 외부와 귀 결합 조직 내에서 검출되었으며, 이는 제핵 세포가 귀 혈관계에 수동적으로 포획된 것이 아니라 조직으로 유출될 수 있었음을 나타낸다. 종합하며, 이들 데이터는 처음으로 제핵 세포가 전신 투여 후 지정된 이환 조직에 특이적으로 귀소하도록 광범위하게 조작될 수 있음을 나타낸다. 제핵 세포는 또한 폐에서 감소된 포획으로 인해 모세포보다 더 양호한 귀소 효율을 나타낸다.
다음으로, 염증발생 조직을 치료하기 위해 항염증 생물학적 제제를 전달하는 생체공학적 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)의 능력을 조사하였다. IL-10은 강력한 항염증성 시토카인이나, 임상 적용에는 보다 효율적이고 구체적인 전달 방법이 필요하다. 인간 IL-10 mRNA로 형질감염된 제핵 세포 (카고사이트-IL-10)는 형질감염된 모세포 (MSC-IL-10)와 유사하게 시험관내에서 최대 72시간 동안 IL-10을 생성하였으며, 한편 비조작 hT-MSC는 검출가능한 IL-10을 분비하지 않았다 (도 12A 및 12B). 기능적으로, MSC-IL-10 및 카고사이트-IL-10으로부터의 CM은 시험관내에서 마우스 RAW 대식세포에서 Stat3 인산화를 활성화시켰으며, 이는 분비된 hIL-10이 마우스 세포에서 생물학적으로 활성임을 나타낸다 (도 12C). 시험관내 hIL-10 분비 수준은 모든 유형의 세포와 제핵 세포 사이에서 필적할만하였으며 (도 12D 및 12F), 3D-카고사이트Tri-E C19의 주사는 귀에서 가장 높은 수준의 hIL-10을 발생시켰으며 (도 3D), 이는 귀에 대한 우수한 귀소가 의도된 부위에 효과적인 전달을 허용했기 때문일 수 있다. 이들 동물로부터의 모든 대측성 (대조군) 귀는 거의 검출할 수 없는 hIL-10을 갖고 (도 3D), 이는 염증발생 귀에 hIL-10의 전달이 특이적임을 시사한다.
이어서 염증발생 조직에서 조작된 제핵 세포의 치료 효능을 조사하였다. 조직학적으로, PBS-처리 마우스로부터의 염증발생 귀는 중등도의 양의 혼합 백혈구와 함께 중증 출혈 및 부종을 나타냈으며, 한편 3D-카고사이트Tri-E IL-10으로 처리된 마우스는 최소한의 출혈 및 부종 및 경미한 양의 혼합 백혈구를 나타냈다 (도 3E). 이 귀 염증 모델에서, 증가된 체액 및 세포 침윤은 염증 정도의 마커로 측정될 수 있는 귓바퀴의 두께 증가에 상응한다. 식염수-주사 대조군 귀의 두께는 정적이었고 모든 군 걸쳐 필적할만하였으며, 조작된 MSC 및 제핵 세포-처리 동물 둘 다가 대조군 마우스와 비교하여 염증발생 귀가 상당히 더 얇았다 (도 3F). 게다가, 염증 마커 IL-6, IL-1β 및 TNF-α의 발현은 PBS-처리된 마우스와 비교하여 3D-카고사이트Tri-E C19 IL-10으로 처리된 마우스의 귀에서 상당히 하향조절되었다 (도 3G). 따라서, 크기가 작고 귀소 수용체와 내피 부착 분자를 발현하는 생체공학적 제핵 세포는 지정된 염증발생 조직에 특이적으로 귀소될 수 있으며 효과적으로 항염증성 시토카인을 전달하여, 생체내 염증을 전반적으로 감소시킬 수 있다.
마지막으로, 마우스 모델에서 조작된 인간 MSC-유래 제핵 세포는 승인된 수의병리학자 (C.N.A.)의 임상 관찰 및 조직의 육안 검사에 의해 결정된 바와 같이, 종양내 또는 정맥내 투여 후, 300마리 초과의 마우스에서 건강에 어떠한 명백한 부정적인 영향도 초래하지 않은 것으로 나타났다. 생체공학적 제핵 세포 (예를 들어, 카고사이트)를 정맥내 주사한 BALB/c 마우스는 주사 후 4시간 또는 24시간에 염증유발성 시토카인 IL-6, IL-1β, TNF-α 및 IFN-γ의 혈장 농도에 어떤 유의한 변화도 없었다. 게다가, 임상 사용을 위한 프로토타입으로서, 본 발명자들은 세포 핵을 히스톤(Histone) 2B-GFP로 표지하고 FACS를 통해 생존력 또는 이동 능력의 손실 없이, 순도 99.999%의 카고사이트를 생성하였다 (도 13A-13F). 이들 결과를 기반으로 하여, 제핵 세포는 안전하고 효과적인 치료 플랫폼이 될 가능성을 가진다.
추가로, 급성 췌장염 (AP)의 질환 모델에서 생체공학적 제핵 세포의 치료 전달을 시험하였다. AP는 현재 효과적인 치료법이 없는 상당한 이환율 및 사망률을 보이는 중증 질환이다. 세룰레인은 전임상 마우스 모델에서 외분비 췌장 분비를 자극하고 AP를 유도할 수 있는 호르몬 콜레시스토키닌 (CCK)의 데카펩티드 유사체이다. 이전 연구는 전임상 AP 모델에서 고용량의 항염증성 시토카인 IL-10의 빈번한 전시 투여가 염증을 크게 약화시키고 질환을 완화할 수 있음을 시사하였다. 그러나, 반복적인 고용량의 IL-10은 임상 적용에서 비용-효율적이지 않고 빈혈과 같은 원치 않는 중증 합병증을 야기할 수 있으며, 이는 구체적이고 효율적인 전달 비히클이 필요할 수 있음을 시사한다. 세룰레인-유도된 AP의 초기 단계에서, Ccl2 및 SDF-1α와 같은 케모카인, 및 E-/P-셀렉틴 및 Vcam1과 같은 부착 분자는 모두 염증발생 마우스 췌장에서 상당히 상향조절되며 (도 18A), 이는 생체공학적 카고사이트Tri-E C19가 염증발생 췌장에 IL-10을 특이적으로 전달하는 이상적인 전달 비히클일 수 있음을 시사한다. AP 마우스에서 카고사이트 및 모 MSC의 귀소는 비브란트(Vybrant)-DiD 표지 및 FACS 분석에 의해 평가되었다. 비조작된 3D-카고사이트와 비교하여, 3D-카고사이트Tri-EC19는 염증발생 췌장에 더 효율적으로 (>11배) 귀소하였다 (도 17A). 3D-카고사이트Tri-E C19는 또한 모 3D-MSCTri-E C19와 비교하여 염증발생 췌장에 대한 귀소에서 >2배 증가 및 감소된 폐 포획을 가졌다 (도 17A 및 도 18B). 무처리 건강한 췌장에서, 3D-카고사이트Tri-E C19와 3D-MSCTri-E C19 둘 다 최소 축적을 가졌다. 중요하게는, 모 3D-MSCTri-E C19와 비교하여, 3D-카고사이트Tri-E C19는 또한 염증발생 췌장에 IL-10 단백질을 더 효율적으로 (> 2배) 전달했으며 (도 17B), 이는 염증성 유전자 마커, Ccl2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 감소된 발현과 상관관계가 있었다 (도 17C 및 도 18F). 3D-카고사이트Tri-E C19 IL-10의 주입은 또한 췌장 손상의 중증도와 상관관계가 있는 리파제 및 아밀라제의 혈청 수준을 상당히 감소시켰다 (도 17D). 그리고 조직학적 분석은 손상된 췌장에서 감소된 선포 세포 괴사, 더 낮은 간질 부종, 및 더 적은 염증성 세포 침윤을 나타냈다 (도 17E 및 도 18G). 특히, 3D-카고사이트Tri-E C19 또는 IL-10이 없는 3D-MSCTri-E C19는 세룰레인-유도 췌장염에 유의한 영향을 미치지 않았다 (도 17B-17E). 종합하면, 이들 결과는 생체공학적 카고사이트Tri-E C19가 생물활성 항염증 시토카인 IL-10을 염증발생 췌장에 효율적으로 전달할 수 있음을 입증하며, 이는 확립된 임상적으로 관련된 AP 모델에서 상기 질환을 크게 개선한다. 예상대로, 단일 용량 (8 μg/kg 체중)의 재조합 hIL-10 단백질로 정맥내 주사된 동물은 모든 염증 및 AP 마커에 최소한의 영향을 미쳤는데, 아마도 순환 중인 IL-10 단백질의 짧은 반감기 때문일 것이다 (도 17B-17E). 또한, 인지된 치료 전달 플랫폼과의 비교로서, 상업적으로 이용가능한 골수-유래 원발성 MSC (BM-MSC) 및 정제된 BM-MSC-유래 엑소솜 (B-엑소솜)은 AP 모델에서 IL-10 mRNA로 로딩되었다. BM-MSCs+IL-10의 주입은 혈청 및 폐에서 IL-10의 수준을 상당히 증가시켰지만 (도 18E), 염증발생 췌장에서 검출된 실제 IL-10 수준은 무시할 수 있었고 (도 17B), 이는 BM-MSC가 귀소 및 염증발생 췌장에 IL-10을 전달하는 데 비효율적임을 시사한다. 유사하게, IL-10 mRNA가 로딩된 B-엑소솜을 주사한 동물은 염증발생 췌장에서 어떤 검출가능한 IL-10도 나타내지 않았고 혈청 IL-10 수준의 약간의 증가만을 나타냈다 (도 17B).
기타 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위의 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 설명하고자 하는 것이며 이를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 기타 측면, 이점, 및 수정은 하기 청구범위 내에 있다.

Claims (28)

  1. 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 질환을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 치료제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 치료제가 소형 RNA, 소분자 약물, 펩티드, 바이러스, 또는 그의 조합 중 적어도 1종을 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 치료제가 화학요법제를 포함하는 것인 방법.
  5. 대상체에게 면역계를 활성화하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 면역 활성화를 통제하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제핵 세포가 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 외인성 단백질이 세포 표면 단백질인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 외인성 단백질이 면역 활성화 단백질인 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, IL-12, 칼레티쿨린, 포스파티딜리신, 포식작용 피식자-결합 도메인, 아넥신 1, OX40/OC40L, 4-1BB, B7 패밀리 구성원, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  10. 대상체에게 면역계에 의한 인식을 회피하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것
    을 포함하는, 대상체에서 면역 인식을 통제하는 방법
  11. 제10항에 있어서, 제핵 세포가 면역 인식 분자의 제핵 세포를 고갈시키도록 유전자 조작된 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 면역 인식 분자가 HLA 항원, 프로테오글리칸, 당 모이어티, 배아성 항원, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 제핵 세포가 적어도 1종의 외인성 단백질을 발현하도록 유전자 조작된 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 외인성 단백질이 세포 표면 단백질인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 외인성 단백질이 면역 회피 분자인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, IGF-2, VEGF, TNF-알파, CD47, HLA-E, HLA-G, HLA-E/G, PD-1, PD-L1, TIGIT, CD112R, CTLA-4, 케모카인, 케모카인 리간드 1, C-C 모티프 케모카인 수용체 7, NK 억제제 수용체, HLA-클래스 I-특이적 억제성 수용체, 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), NKG2A, 림프구 활성화 유전자-3 (LAG-3), 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  17. 대상체에게 외인성 DNA 분자, 외인성 RNA 분자, 외인성 단백질, 또는 외인성 펩티드 중 적어도 1종을 발현하도록 유전자 조작된 제핵 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 상태의 존재를 확인하는 방법이며,
    여기서 유전자 조작된 제핵 세포가 질환 상태의 존재 또는 위치를 확인하는 것인 방법,
  18. 제17항에 있어서, 외인성 단백질이 염증 귀소 수용체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 염증 귀소 수용체가 제핵 세포를 손상된 및/또는 염증발생 조직으로 향하게 하는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제핵 세포가 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 섬유모세포, 및 성체 줄기 세포, 중간엽 기질 세포 (MSC), 유도성 만능 줄기 세포, 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 제핵 세포가 중간엽 기질 세포 (MSC)로부터 유래되는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 DNA 분자가 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 박테리아 DNA 분자, DNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 RNA 분자가 메신저 RNA (mRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 마이크로RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), RNA 바이러스, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 단백질이 시토카인, 성장 인자, 호르몬, 항체, 효소, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 투여하는 것이 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 경구 투여, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 투여하는 것이 종양내 투여를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 염증, 감염, 암, 신경계 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 안과 질환, 골격계 질환, 대사 질환, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 암이 다발성 골수종, 교모세포종, 림프종, 백혈병, 중피종, 육종, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 결장암, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
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