CN115397395A - 生物工程去核细胞的方法和用途 - Google Patents

Abstract

提供了使用生物工程去核细胞治疗疾病的方法。本文还提供了包含去核细胞的组合物，其中所述去核细胞已负载有临床相关的生物分子。

Description

生物工程去核细胞的方法和用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年2月7日提交的美国临时申请序列号62/971,526；2020年3月24日提交的美国临时申请序列号62/993,967；以及2020年3月25日提交的美国申请序列号62/994,598的优先权，每项均通过引用全部并入本文。

联邦资助的研究或开发

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CA182495和CA097022资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。

背景技术

当前用于基于细胞的疗法的技术和工具通常易于产生不需要且危险的副作用，如不受控制的增殖，有限工程改造能力和抗DNA免疫应答。尽管基于细胞的治疗在解决人类疾病治疗中的关键需求方面具有巨大潜力，但临床成功往往面临障碍，如细胞异质性、有限的工程改造能力、不稳定的疗效、大规模制造中质量控制或再现性差以及患者安全问题。

发明概述

本公开至少部分基于生物工程改造去核细胞的产生，以改善治疗功能并产生可控和安全的细胞样实体。

如下文详述并在工作实施例中举例说明的，设计用于治疗用途的生物工程改造去核细胞的方法和细胞的用途提供了优于先前基于细胞的治疗的若干益处，包括例如安全性、确定的寿命、无核编码基因转移到宿主的风险以及有效递送治疗负荷。当前要求保护的公开内容的其他优势在本文描述。

本文提供了治疗对象疾病的方法，所述方法包括：给予所述对象治疗有效量的组合物，所述组合物包含经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞。在一些实施方式中，组合物还包含治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂包括小RNA、小分子药物、肽、病毒或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，治疗剂包括化疗剂。

本文提供了控制对象免疫活化的方法，所述方法包括：给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以活化免疫系统。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫活化蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白包括细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬-猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

本文提供了控制对象免疫识别的方法，所述方法包括：给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以逃避免疫系统的识别。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造，以耗竭去核细胞的免疫识别分子。在一些实施方式中，免疫识别分子包括HLA抗原、蛋白聚糖、糖部分、胚胎抗原或其组合。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫逃逸蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白包括细胞因子、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、IGF-2、VEGF、TNF-α、CD47、HLA-E、HLA-G、HLA-E/G、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD112R、CTLA-4、趋化因子、趋化因子配体1、C-C基序趋化因子受体7、NK抑制剂受体、HLA I类特异性抑制受体、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A、NKG2A、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)或其组合。

本文提供了识别对象中疾病状况存在的方法，所述方法包括：给予所述对象经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞，其中所述经遗传工程改造的去核细胞识别疾病状况的存在或位置。在一些实施方式中，外源蛋白是炎症归巢受体。在一些实施方式中，炎症归巢受体将去核细胞引导至受损和/或发炎组织。

在一些实施方式中，去核细胞来源于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和成体干细胞、间充质基质细胞(MSC)、可诱导多能干细胞或其组合。在一些实施方式中，去核细胞来源于间充质基质细胞(MSC)。

在一些实施方式中，外源DNA分子包括单链DNA，双链DNA，寡核苷酸，质粒，细菌DNA分子或DNA病毒或其组合。在一些实施方式中，外源RNA分子包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。在一些实施方式中，外源蛋白包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶或其组合。

在一些实施方式中，所述给药包括静脉给药、皮下给药、腹膜内给药、直肠给药、口腔给药或其组合。在一些实施方式中，给药包括瘤内给药。

在一些实施方式中，疾病包括炎症、感染、癌症、神经疾病、自身免疫病、心血管疾病、眼科疾病、骨骼疾病、代谢疾病或其组合。在一些实施方式中，癌症包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、间皮瘤、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其组合。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。本文描述了本发明中所用的方法和材料；也可以使用本领域已知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例都仅是说明性的，不构成限制。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献都通过引用其全文纳入本文。若有抵触，以本包括定义在内的本申请说明书为准。

从下文的详述、附图和所附权利要求中能够很容易地了解本发明的其它特征和优点。

附图简要说明

图1A是生物工程改造的去核细胞(例如胞质载体(Cargocyte))的治疗用途的工作流程示意图。

图1B和1C显示存活的hT-MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)相对于初始群体随时间变化的百分比的图。图1B，新分离的hT-MSC/胞质载体；图1C,hT-MSC/胞质载体冷冻保存1个月后解冻。

图1D显示MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)在Boyden室中向指定浓度的SDF-1α迁移2小时。柱状图表示迁移细胞与负载对照的比率。平均值±SEM；n＝10个来自3个生物重复的独立视野。

图1E显示通过流式细胞术分析的细胞的GFP的平均荧光强度(MFI)(左)或GFP阳性比率(右)的柱状图。

图1F是柱状图，显示了来自用Gluc mRNA转染48小时后细胞条件培养基中的Gaussia荧光素酶(Gluc)活性。RLU＝相对发光单位。

图1G是显示悬液中hT-MSC或工程改造的去核细胞(例如胞质载体)的平均直径的柱状图。

图2A是工程改造的去核细胞(例如胞质载体)在免疫健全小鼠中表达IL-12细胞因子并治疗三阴性乳腺癌(TNBC)的工作流程示意图。

图2B是柱状图，显示在瘤内注射后的指定时间点通过ELISA检测的已建立的E0771肿瘤中IL-12细胞因子的水平。PBS，载剂对照；MSC-IL-12/胞质载体-IL-12、hT MSC或用IL-12mRNA转染的胞质载体。

图2C显示如图2B所示处理的小鼠中与PBS组相比所指示的mRNA标志物的倍数变化(Log2)。在瘤内注射后48小时收集肿瘤并通过实时RT-PCR进行分析。

图2D是显示通过流式细胞术分析的收获肿瘤的柱状图。处理小鼠，收集肿瘤并通过流式细胞术进行分析。％CD8⁺T细胞,100×CD8⁺CD4^-CD3⁺CD45⁺/CD45⁺；％CD4⁺T细胞,100×CD8^-CD4⁺CD3⁺CD45⁺/CD45⁺；M1Φ/M2Φ,CD45⁺Ly6c^-F4/80⁺MHCII^高/CD45⁺Ly6c^-F4/80⁺MHC II^低；％Foxp3⁺Treg细胞,100×CD45.2⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺/CD45⁺；％NK细胞,100×CD45⁺CD3^-NK1.1⁺/CD45⁺；％CD45⁺细胞,100×CD45⁺/总细胞。

图2E显示向预先建立的E0771肿瘤内注射MSC-IL-12/胞质载体-IL-12和腹膜内注射抗PD-1抗体的时间线(上)和这些小鼠的Kaplan-Meier生存曲线(下)。

图2F显示图2E中存活并用E0771细胞再攻击的小鼠的肿瘤生长曲线。

图2G显示与模拟处理对照相比所指示的mRNA标志物(IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶1；PD-L1，程序性死亡配体1)的倍数变化(Log2)。对照hT-MSC、经辐照MSC(30Gy)和FACS分选的工程改造的去核细胞(例如胞质载体)用人干扰素γ(IFN-βγ)刺激6小时，并通过实时RT-PCR进行分析。

图3A是在小鼠模型中使用工程改造的去核细胞(例如胞质载体)治疗LPS诱导的急性耳炎的工作流程示意图。

图3B是柱状图，显示静脉注射后24小时从小鼠肺收获并用流式细胞术分析的1E5总细胞中的DiD⁺RFP⁺双阳性细胞的数量。

图3C是柱状图，显示注射后24小时从小鼠耳收集并通过流式细胞术检测的1E5总细胞中的DiD⁺F4/80^-细胞的数量。小鼠右耳注射LPS，左耳注射生理盐水，6小时后静脉注射DiD-标记的MSC或胞质载体。D1 MSC/胞质载体、小鼠D1 MSC/胞质载体；3D-MSC/胞质载体、3D培养的亲代MSC/胞质载体；3D-MSC^{Tri-E C19}，三重(CXCR4/CCR2/PSGL-1)工程改造的MSC克隆19；3D-胞质载体^{Tri-E C19}、3D-MSC^{Tri-E C18}衍生的胞质载体。

图3D是显示在注射后24小时通过ELISA从指示的小鼠耳中检测到的人IL-10蛋白水平的柱状图，其中如图3C所示处理的小鼠静脉注射指示的细胞或胞质载体(人IL-10mRNA转染后)。

图3E是来自如图3C中处理的小鼠耳的光学显微镜图像，在注射后48小时收获并处理用于苏木精和伊红染色。

图3F显示在LPS/盐水注射前和细胞/工程改造去核细胞(例如胞质载体)注射后48小时通过数字测微计测量的耳朵厚度变化。

图3G显示LPS处理的(右)和盐水处理的(左)耳朵之间指示的mRNA标志物倍数变化(Log2)的图，其中如图3F所示处理的小鼠在注射LPS后48小时收获耳朵并通过实时RT-PCR进行分析。

图4是用指示的亚细胞细胞器抗体(箭头)和DAPI染色的MSC或工程改造的去核细胞(例如胞质载体)的荧光图像。线粒体，抗AIF(凋亡诱导因子)；溶酶体，抗-LAMP1(溶酶体结合膜蛋白1)；高尔基体，抗-RCAS1(在SiSo细胞上表达的受体结合癌抗原)；内质网(ER)、抗-PDI(蛋白质二硫化物异构酶)；内体，抗-EEA1(早期内体抗原1)。箭头指向指示的细胞器。比例尺＝50μm。

图5A是柱状图，表示迁移的MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)相对于负载对照(接种在纤连蛋白涂覆板上的MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体))之比。

图5B柱状图，显示迁移的MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)与负载对照之间比率的条形图，其中MSC/胞质载体在Boyden室中朝PDGF-AB梯度迁移。

图5C是柱状图，显示迁移的MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)与负载对照之比。

图5D是柱状图，表示每个视野的附着细胞数，其中允许MSC和胞质载体在含0.25％BSA的无血清培养基中在纤连蛋白涂覆的24孔板上附着2小时(每孔2E4个细胞)。附着的细胞用结晶紫染色，并使用放大400倍的光学显微镜进行计数。

图6A是柱状图，显示在冷冻保存1个月后解冻的MSC/工程改造的去核细胞(例如胞质载体)的回收率(来自输入群体的活细胞百分比)。

图6B柱状图，显示迁移的MSC或工程改造的去核细胞(例如胞质载体)相对于负载对照的比率，其中回收的MSC/胞质载体在Boyden室中朝FBS梯度迁移。

图7A是体外合成的小鼠IL-12a和IL-12b mRNA的示意图设计。将Kozak序列添加到IL-12mRNA编码区的起始密码子(CDS)之前。将小鼠α球蛋白mRNA的5’UTR和3’UTR分别添加到CDS的5’和3'端。在mRNA的5’端添加人工5’帽，并工程改造假尿苷修饰以增加mRNA稳定性。

图7B显示IL-12转染的MSC(MSC-IL-12)、胞质载体(胞质载体-IL-12)或未转染的细胞(对照MSC)的条件培养基中分泌的IL-12浓度。

图7C显示了western印迹图像，其中小鼠脾细胞用指定条件培养基或重组小鼠IL-12(p70)蛋白(10ng/ml)处理30分钟。通过western印迹测定Stat4的磷酸化。

图7D是柱状图，显示通过ELISA测定的小鼠血浆中分泌的IL-12细胞因子浓度，其中小鼠如图2B所示进行处理。

图8A是柱状图，显示悬液中所指示的MSC或工程改造的去核细胞(例如胞质载体)的平均直径。

图8B是显示细胞迁移通过单个微流体收缩部(constriction)所需平均时间的柱状图。显示了受约束(≤2μm×5μm)和无约束(15μm×5μm)收缩部两者的数据。

图8C是柱状图，显示在指定时间点LPS处理的耳朵中指定mRNA标志物的倍数变化(Log2)，并对盐水处理的耳朵(对照)归一化，其中在注射LPS后6小时或24小时收获小鼠耳朵并通过实时RT-PCR进行分析。

图9A和9B是柱状图，表示迁移的MSC/胞质载体相对于负载对照(MSC或胞质载体接种到纤连蛋白涂覆的板上)的比率，其中MSC/胞质载体在Boyden室中朝向指示的趋化因子梯度迁移2小时。

图9C为柱状图，显示注射后24小时从小鼠耳中收获并通过流式细胞术检测的1E5总细胞中DiD+F4/80-MSC或胞质载体的平均数，其中小鼠接受治疗并静脉注射指定细胞。

图9D是柱状图，显示注射后24小时从小鼠肺收集并通过流式细胞术检测的1E5总细胞中的DiD⁺F4/80^-细胞的数量。D1 MSC/胞质载体、小鼠D1 MSC/胞质载体；3D-MSC/胞质载体、3D培养的亲代MSC/胞质载体；3D-MSC^{Tri-E C19}，三重(CXCR4/CCR2/PSGL-1)工程改造的MSC克隆19；3D-胞质载体^{Tri-E C19}、3D-MSC^{Tri-E C18}衍生的胞质载体。

图10显示使用软件LivingImage V4.1在不同时间点来自指定小鼠器官的生物发光成像信号强度(光子/秒/cm²/立体)的定量分析。

图11A显示使用软件LivingImage V4.1在不同时间点来自剥皮小鼠耳朵的生物发光成像信号强度(光子/秒/cm²/立体)的定量分析。

图11B是柱状图，显示萤火虫荧光素酶(Fluc)活性，所述萤火虫萤光素酶活性通过SpectraMax M2e在用Fluc mRNA转染后的指定时间点细胞的条件培养基测得。

图12A是体外合成的人IL-10mRNA的示意图设计。将Kozak序列添加到IL-12mRNA编码区的起始密码子(CDS)之前。将小鼠α球蛋白mRNA的5’UTR和3’UTR分别添加到CDS的5’和3'端。在mRNA的5’端添加人工5’帽，并工程改造假尿苷修饰以增加mRNA稳定性。

图12B显示IL-10转染的MSC(MSC-IL-10)、胞质载体(胞质载体-IL-10)或未转染的细胞(仅MSC)条件培养基或对照培养基中分泌的IL-10浓度。

图12C是western印迹图像，显示小鼠RAW巨噬细胞用指示的条件培养基或重组IL-10蛋白(1ng/ml)处理30分钟，用western印迹测定Stat3的磷酸化。

图12D是柱状图，显示IL-10mRNA转染后24小时D1 MSC或D1-胞质载体的条件培养基中分泌的IL-10浓度。

图12E是显示通过ELISA确定的小鼠血浆中分泌的IL-10细胞因子的浓度的柱状图。

图12F显示在IL-10mRNA转染的MSC(MSC-IL-10)和胞质载体(胞质载体-IL-10)、未转染细胞(仅hTMSC)的条件培养基中或对照培养基中通过ELISA测量的分泌IL-10浓度。

图13A显示存活的MSC或胞质载体相对于初始群体随时间变化的百分比。基于GFP表达，从去核MSC^H2B-GFP中分离出分选的MSC对照，FACS分选的MSC^H2B-GFP；胞质载体和核质体/MSC。

图13B是柱状图，表示迁移的MSC或胞质载体相对于负载对照的比率，其中MSC ^{H2B -GFP}或分选的胞质载体^H2B-GFP在Boyden室中向FBS梯度迁移。

图13C是柱状图，表示细胞迁移指数(迁移的胞质载体对负载对照)，其中MSC ^{H2B -GFP}或分选的胞质载体^H2B-GFP在Boyden室中向FBS梯度迁移。

图13D显示存活的hT-MSC/胞质载体相对于初始群体的百分比随时间变化的图，其中hT-MSC/胞质载体在冷冻保存1个月后解冻。

图13E是柱状图，显示在冷冻保存1个月后解冻的MSC/胞质载体的回收率(基于输入群体的活细胞百分比)。

图13F是柱状图，表示细胞迁移指数(迁移的MSC/胞质载体相对于负载对照)，其中回收的MSC或胞质载体在Boyden室中向FBS梯度迁移。

图14是柱状图，表示诱导迁移(具有趋化因子梯度)与背景迁移(不具有趋化因子梯度)的比率，其中MSC/胞质载体在Boyden室中朝指示的趋化因子密度迁移2小时。

图15A是E0771 TNBC存活实验的示意图：用IL-12mRNA(CA-IL-12)转染的胞质载体每2-3天注射一次到皮下(SQ)E0771肿瘤小鼠的瘤内(IT)。对照小鼠接受瘤内注射(IT)PBS。第三次给药24小时后，腹膜内(IP)给予抗PD-1或对照抗-IgG同种型。第二周，给予最终胞质载体IL-12或PBS剂量，翌日腹膜内(IP)给予抗PD-1或抗IgG。当肿瘤直径大于2cm时，测量肿瘤并对动物实施安乐死。

图15B是在存活实验的治疗阶段期间动物重量的倍数变化图。箭头＝瘤内给予CA-IL-12或PBS；三角箭头＝腹膜内给予抗PD-1或抗IgG。

图15C是显示通过ELISA分析指示的炎症细胞因子的表，其中将MSC或胞质载体静脉(IV)注射到小鼠中。静脉注射后2小时和24小时收集血清。

图15D是显示每侧(注射和对侧/未注射)肿瘤大小的倍数变化的图，其中在独立实验中，动物双侧注射E0771细胞，然后单侧瘤内注射3剂量的CA-IL-12或PBS。

图16A是表示SDF-1α处理前后LDV-FITC结合强度的MFI变化的柱状图。MFI比＝(MFI^{LDV-FITC+SDF-1α}–MFI^{未染色对照})/(MFI^LDVFITC–MFI^{未染色对照})。

图16B是表示每个视野的粘附细胞数的柱状图(放大100倍)。用10ng/ml TNF-α预处理TNF-α,HUVEC6小时。SDF-1α，500ng/ml SDF-2α；a-PSGL-1，10μg/ml抗PSGL-1抗体预处理；a-VLA-4，10μg/ml抗-VLA-4抗体预处理。

图16C是柱状图，表示诱导迁移(具有趋化因子梯度)与背景迁移(没有趋化因子梯度)的倍数变化，其中MSC/胞质载体在Boyden室中朝指示的趋化因子梯度迁移2小时。

图17A是柱状图，显示注射后16小时从小鼠胰脏收集并通过流式细胞术检测的1E5总细胞中的DiD⁺F4/80^-细胞的数量。

用指示处理静脉注射具有雨蛙素诱导AP的小鼠，注射后16小时收获小鼠组织。在BalB/c小鼠腹膜内(i.p.)注射雨蛙素诱导急性胰腺炎，然后静脉注射DiD标记的MSC或胞质载体。

图17B是柱状图，显示通过ELISA从指示治疗的小鼠胰腺检测到的人IL-10蛋白水平。

图17C是柱状图，显示通过实时RT-PCR在指示治疗的小鼠胰腺中检测到的Ccl2(上图)和TNF-α(下图)的相对mRNA表达。图显示了指示的mRNA标志物的倍数变化(Log2)，其对无雨蛙素治疗组归一化。

图17D是柱状图，显示在来自指示治疗的小鼠血清中检测到的脂肪酶活性(上图)和淀粉酶活性(下图)。

图17E是显示胰腺组织学分析的柱状图。水肿(上图)和坏死(下图)的严重程度使用既定标准从0到3分级。

图18A显示胰腺中所指示mRNA表达的倍数变化(Log2)。

图18B是柱状图，显示注射后16小时从小鼠肺或肝脏收获并通过流式细胞术检测的1E5总细胞中的DiD+F4/80-细胞的数量。

图18C是柱状图，显示IL-10mRNA转染后24小时转染的BM-MSC或BM-MSC的条件培养基中分泌的IL-10浓度。

图18D是柱状图，显示了仅用外泌体或负载IL-10mRNA的外泌体处理的HEK293细胞的条件培养基中处理24小时后分泌的IL-10浓度。

图18E是柱状图，显示通过ELISA从指示治疗的小鼠血浆或组织中检测到的人IL-10蛋白水平。

图18F是柱状图，显示了通过实时RT-PCR在指定治疗的小鼠胰腺中检测到的IL-6(上)和IL-1β(下)的相对mRNA表达。图显示了指示的mRNA标志物的倍数变化(Log2)，其对无雨蛙素治疗组归一化。

图18G是显示胰腺组织学分析的柱状图。炎症细胞浸润的严重程度使用既定标准从0到3分级。

具体实施方式

本公开描述了利用遗传工程改造的去核细胞进行基于细胞的治疗方法和用途。在实践中，可以对细胞进行遗传工程改造以改善治疗功能，并将其去核以产生可控和安全的细胞样实体(图1A)。此外，制造大量用于临床应用的治疗细胞限制了许多基于细胞的治疗，特别是在干细胞领域。因此，使用永生化细胞(如hT-MSC、病毒和癌基因)来提高生产能力具有重大的商业利益，因为它是稳健和有成本效益的。然而，永生化细胞可能导致癌症，因此对于治疗应用来说可能太危险。本公开允许将永生化细胞或甚至癌细胞用于治疗应用，因为它们在给药前通过去核而变得安全。

去核细胞

生物工程改造的去核细胞可以通过在去核后执行重要的细胞功能、具有明确寿命、表现出治疗功能以及适于多层工程化和大规模生产而设计用于治疗用途。如本文所用，“去核”是通过失活或去除细胞核使细胞处于非复制状态。在一些实施方式中，可以使用细胞松弛素处理细胞以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。然后可以通过在Ficoll梯度中进行高速离心从细胞体中物理提取核，以生成去核细胞。因为去核细胞和完整有核细胞在Ficoll梯度中沉积到不同的层，所以在一些实施方式中，可以容易地分离和制备去核细胞，用于治疗目的或与其他细胞(有核的或去核的)融合。在一些实施方式中，去核过程在临床上可规模化以处理数千万个细胞。

在一些实施方式中，去核细胞可用作疾病归巢载体，以递送临床相关的负载物/荷载物以治疗各种疾病(例如，本文所述的任何疾病)。在一些实施方式中，负载有负载物、荷载物或生物分子的去核细胞可称为“胞质载体”。在一些实施方式中，胞质载体可指设计用于治疗用途的生物工程化的去核细胞。在一些实施方式中，去核细胞具有显著治疗价值，因为它们是存活的，不分化为其他细胞类型，分泌生物活性蛋白，可以物理迁移/归巢3-4天，可以离体进行广泛的工程改造以进行特定的治疗性功能，并可以与相同或其他的细胞类型融合以转移所需自然的或工程改造的细胞功能。因此，去核细胞可以作为一种细胞载剂具有广泛的用途，以递送治疗性生物分子和靶向疾病的负载物，包括但不限于化疗药物(例如多柔比星)，基因，病毒，细菌，mRNA，shRNA，siRNA，肽，质粒和纳米颗粒。在一些实施方式中，去核细胞能够产生安全(例如无不需要的DNA转移到对象)和可控(例如细胞死亡精确发生在3-4日内)的基于细胞的运载体，其可以经遗传工程改造以向人或动物对象递送特定的抗疾病和促进健康的负载物。

在一些实施方式中，去核细胞(例如胞质载体)被遗传工程改造并设计用于治疗用途。如本文所用，“经遗传工程改造”涉及细胞时是指包含核酸序列(例如DNA、RNA或mRNA)、外源DNA分子或外源RNA分子的细胞，所述核酸序列在类似条件下不存在于、或以不同水平存在于未工程改造的其他类似细胞中(例如，与来自成红细胞的RBC相比，去核细胞(例如胞质载体)可来自任何类型的有核细胞，包括但不限于iPSC(诱导型多能干细胞)、任何永生化细胞、干细胞、原代细胞)，或包含由所述核酸表达的多肽(例如外源蛋白或外源多肽)的细胞。在一些实施方式中，遗传工程改造的细胞已经通过引入外源核酸从其天然状态改变，或者是这种改变的细胞的子代。在一些实施方式中，遗传工程改造的细胞包括外源核酸(例如DNA、RNA或mRNA)。在一些实施方式中，去核细胞经工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源多肽或外源蛋白质或其组合中的至少一种(例如，一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种)。在一些实施方式中，去核细胞经工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源多肽或外源蛋白质或其组合中的至少两种(例如，三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种或更多种)。在一些实施方式中，外源DNA分子是单链DNA，双链DNA，寡核苷酸，质粒，细菌DNA分子或DNA病毒或其组合。在一些实施方式中，外源RNA分子是信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶或其组合。

在一些实施方式中，去核细胞可衍生自多种不同的细胞类型。在一些实施方式中，去核细胞可衍生自在其整个生命期间维持有核或不会自然去核的任何有核细胞类型。在一些实施方式中，去核细胞可衍生自正常细胞系。在一些实施方式中，去核细胞可衍生自癌细胞系。在一些实施方式中，去核细胞可衍生自从免疫系统获得的治疗细胞。例如，去核细胞可来源于间充质基质细胞(MSC)、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞、碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或成纤维细胞。在一些实施方式中，去核细胞来源于间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方式中，去核细胞来源于hTERT-永生化脂肪来源MSC(hT-MSC)，其中MSC在临床研究中具有经证明的治疗潜力，并且永生化表型提供具有一致特征的同质细胞群，这有利于进一步的生物工程改造。在一些实施方式中，去核细胞可衍生自成体干细胞和/或诱导型多能干细胞(iPSC)。

某些细胞类型没有细胞核，例如红细胞。此外，来自治疗细胞的外泌体和小细胞膜囊泡可以充当递送囊泡，但与本公开的去核细胞显著不同。本公开的去核细胞(例如胞质载体)不同于RBC、外泌体和小细胞膜囊泡。这些类型的递送囊泡不具有产生和分泌外源蛋白所需的细胞器(例如ER/高尔基体、线粒体、内体、溶酶体、细胞骨架等)。因此，本公开的去核细胞可以像有核细胞一样发挥功能并表现出关键的生物学功能，诸如粘附，隧穿纳米管形成，肌动蛋白介导的扩散(2D和3D)，迁移，化学引诱物梯度传感，线粒体转移，mRNA翻译，蛋白质合成和外泌体和其他生物活性分子的分泌。外泌体、小细胞膜囊泡、RBC或其它类似的仅递送囊泡可能不会表现出一种或多种这些功能。

在一些实施方式中，去核效率描述了通过本文所述或本领域已知的方法成功去核的群体中细胞的百分比。在一些实施方式中，细胞的去核效率可以超过95％(例如，96％、97％、98％、99％或100％)的效率。在一些实施方式中，回收率指的是输入群体中活细胞的百分比。在一些实施方式中，可以至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的回收率产生去核细胞。在一些实施方式中，hT-MSC实现了超过95％的去核效率。在一些实施方式中，本公开的方法产生80-90％的回收率。

如本文中所使用的，术语“基本相同”在本文中涉及细胞结构使用时，可指相对于参照细胞具有至少相同功能性亚细胞细胞器的细胞。例如，如果两个细胞包含相同的功能性亚细胞细胞器，则去核细胞可以表现出与亲代细胞基本相同的细胞结构。在一些实施方式中，去核细胞包含与亲代细胞相同的功能亚细胞细胞器，其中功能性亚细胞细胞器包括高尔基体、内质网、线粒体、溶酶体、核糖体、内体或其组合中的至少一种。

术语“基本相同”在本文中关于细胞功能使用时，可指相对于参照细胞表现出类似功能特性的细胞。例如，去核细胞可以保持相同的表面标志物蛋白表达。在一些实施方式中，去核细胞具有与亲代(例如有核)细胞类似的δ电位。在一些实施方式中，去核细胞膜受体与迁移和入侵机制是完全功能性的，表现出与亲代细胞类似的功能。在一些实施方式中，去核细胞主动产生和分泌与亲代细胞产生的胞外囊泡相同的胞外囊泡。

在一些实施方式中，去核细胞容易附着到具有组织良好的细胞骨架结构的组织培养板上。在一些实施方式中，去核细胞在去核后存活达72小时。在一些实施方式中，去核细胞可包含关键和功能性亚细胞细胞器，包括但不限于高尔基体、内质网(ER)、线粒体、溶酶体和内体(图4)。在一些实施方式中，去核细胞可保留表面标志物蛋白(例如CXCR4、CCR2、PSGL-1、CD44、CD90、CD105、CD106、CD166或Stro-1)表达至少48小时，并具有与亲代(有核)细胞类似的δ电位。在一些实施方式中，去核细胞在体外感测并向化学吸引剂迁移，并通过3D Matrigel包覆的膜向FBS梯度侵入(图5A-5D)，这表明去核细胞膜受体和迁移和侵入机制在去核细胞中完全起作用。在一些实施方式中，从去核细胞的条件培养基(CM)中分离的胞外囊泡(EV)可以通过电子显微镜检具有类似的特征形态、类似的大小分布和类似的产生量，如通过BCA测定所测量的。这表明去核细胞可以主动产生和分泌与亲代细胞产生的EV没有显著差异的EV。在一些实施方式中，去核细胞显示出以比亲代细胞更高的速率从冷冻保存中恢复，并且在解冻后维持活力和迁移能力(图6A和6B)，这有利于临床应用中的储存和递送物流。在一些实施方式中，去核细胞保持关键的细胞结构和功能，因此具有治疗应用的潜力。

在一些实施方式中，基于细胞的治疗使用正常或工程改造的有核细胞。在一些实施方式中，基于细胞的治疗在患者注射之前辐照细胞，以防止细胞增殖和诱导致死性DNA损伤。然而，这种方法诱导突变并产生显著数量的活性氧物质，其以不可逆地破坏细胞蛋白质和DNA，而这可能会将大量破坏/突变的DNA释放到对象的体内。如果这些产品整合到其他细胞中和/或诱导不想要的抗DNA免疫应答，则这些产品可能是危险的。辐照细胞也很危险，因为它们可以通过细胞间融合将突变的DNA和基因转移到宿主细胞。与细胞辐射相比，从细胞中移除整个细胞核是一种损伤较小且安全得多的限制细胞寿命的方法，可阻止将核DNA引入对象体内。此外，许多干细胞如间充质干细胞(MSC)对辐射诱导的死亡具有高度抗性，因此使用该方法不能保证安全。

在一些实施方式中，治疗性细胞可经工程改造以带有药物诱导的自杀开关以限制细胞寿命。然而，体内开关的活化需要对对象注射有效且潜在有害的并具有不希望的副作用的药物。虽然该方法在培养细胞中诱导自杀(＜95％)，但在转化为临床时，预期效率低下。此外，治疗细胞的死亡释放了大量DNA(例如，正常或基因改变的DNA)，这些DNA可能会整合到宿主细胞中或诱导危险的系统性抗DNA免疫应答。如果细胞发生突变并失去/失活自杀开关，它将成为不可控制的突变细胞。此外，这些细胞可以与对象的宿主细胞融合，因此转移突变DNA。这种融合细胞是危险的，因为并非所有宿主细胞都继承自杀基因，但在染色体重组和细胞杂交过程中可能会继承一些治疗细胞的基因/DNA。此外，出于同样的原因，带有自杀开关的治疗细胞不能在体外用作细胞融合伴侣。

限制治疗性细胞寿命的另一种方法是热诱导死亡。然而，这会导致严重损害，从而终止治疗用途所需的关键生物功能。与去核细胞不同，这些细胞仍然可以将DNA转移到对象，因为它们保留了细胞核和所有遗传物质。许多化学物质在治疗前抑制细胞增殖和/或导致细胞死亡，包括但不限于化疗药物或丝裂霉素C。然而，这些药物具有显著的脱靶效应，显著损害细胞，并且由于高毒性而不需要用于临床应用。许多抗增殖和死亡诱导药物不能有效抑制100％的细胞，如果细胞由于耐药性，并且与去核细胞不同，许多药物效应是可逆的。因此，该方法不适用于防止永生化或癌细胞的体内细胞生长

本公开提供了用于生产设计用于治疗用途的工程改造的去核细胞(例如胞质载体)的方法。在一些实施方式中，去核细胞以具有治疗功能的生物分子的自然或可诱导表达和/或摄取产生，包括但不限于DNA、RNA(例如mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质、质粒、病毒和小分子药物。在一些实施方式中，生物工程方法改善去核细胞功能。在一些实施方式中，亲代细胞(例如，有核细胞)在去核前(例如，去核之前)进行遗传工程改造。在一些实施方式中，亲代细胞在去核后(例如，去核之后)进行遗传工程改造。

在一些实施方式中，去核细胞(例如胞质载体)经工程改造以外源产生生物分子(分泌的、胞内的、天然的和可诱导的)，包括但不限于DNA/基因、RNA(例如mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质、和质粒、细菌、病毒、小分子药物、离子、细胞因子、生长因子和激素。在一些实施方式中，去核细胞产生治疗水平的生物活性蛋白或免疫刺激物。

在一些实施方式中，亲代细胞经遗传工程改造以在去核前外源产生生物分子(分泌的、胞内的、天然的和可诱导的)。在一些实施方式中，亲代细胞经遗传工程改造以产生外源生物分子，包括但不限于DNA/基因、RNA(例如mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质和质粒、细菌、病毒、小分子药物、离子、细胞因子、生长因子和激素。在一些实施方式中，亲代细胞经遗传工程改造以产生治疗水平的生物活性蛋白或免疫刺激物。在一些实施方式中，亲代细胞经遗传工程改造以产生肿瘤营养蛋白。

在一些实施方式中，去核细胞可用作递送治疗性生物物质(例如，治疗性货物)的载剂，包括但不限于DNA/基因、RNA(例如mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质、质粒、病毒和小分子药物。与有核细胞不同，去核细胞可以负载高剂量的DNA损伤/基因靶向剂，以作为癌症或其他疾病的治疗剂递送给患者。在一些实施方式中，DNA损伤/基因靶向剂包括但不限于DNA损伤化疗药物、DNA整合病毒、溶瘤病毒和基因治疗应用。

在一些实施方式中，治疗性去核细胞(天然或工程改造的细胞)可用作其他细胞(治疗性或天然)的融合伴侣，以增强和/或转移生物分子(分泌的、胞内的、天然的和可诱导的)，包括但不限于DNA/基因、RNA(mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质和质粒、细菌、病毒、小分子药物、离子、细胞因子、生长因子和激素。不同于有核细胞，去核细胞与相似或不同来源的相同或其他细胞类型的融合产生独特的细胞杂合体，其缺少有问题的核转移，同时保持理想的治疗特性，包括但不限于，细胞表面蛋白，信号转导分子，分泌的蛋白质，脂质和表观遗传变化。

在一些实施方式中，去核细胞可用作生物过程和疾病状态的生物传感器和信号转导指示器。在一些实施方式中，因为去核细胞不能经历DNA损伤诱导的凋亡性死亡，所以它们可以与凋亡诱导剂和/或DNA毒性/靶向剂组合用于治疗癌症和其他疾病。

去核细胞比其有核对应物小，并且出于该原因，其可以通过脉管和组织实质中的小孔更好地迁移。此外，去除大的致密细胞核减轻了一个主要的物理障碍，使细胞能够自由地穿过血管和薄壁组织中的小开口。因此，去核细胞改善了体内的生物分布和进入靶组织的运动。在一些实施方式中，去核细胞的直径至少为1μm。在一些实施方式中，去核细胞的直径大于1μm。在一些实施方式中，去核细胞直径为1-100μm(例如1-90μm,1-80μm,1-70μm,1-60μm,1-50μm,1-40μm,1-30μm,1-20μm,1-10μm,1-5μm,5-100μm,5-90μm,5-80μm,5-70μm,5-60μm,5-50μm,5-40μm,5-30μm,5-20μm,5-10μm,10-100μm,10-90μm,10-80μm,10-70μm,10-60μm,10-50μm,10-40μm,10-30μm,10-20μm,20-100μm,20-90μm,20-80μm,20-70μm,20-60μm,20-50μm,20-40μm,20-30μm,30-100μm,30-90μm,30-80μm,30-70μm,30-60μm,30-50μm,30-40μm,40-100μm,40-90μm,40-80μm,40-70μm,40-60μm,40-50μm,50-100μm,50-90μm,50-80μm,50-70μm,50-60μm,60-100μm,60-90μm,60-80μm,60-70μm,70-100μm,70-90μm,70-80μm,80-100μm,80-90μm,或90-100μm)。在一些实施方式中，一些去核细胞有利地可足够小以允许更好的生物分布或不太可能滞留在对象的肺中。

在一些实施方式中，遗传工程改造的去核细胞的确定寿命少于1小时到14天(例如，少于1小时、少于6小时、少于12小时、少于1天、少于2天、少于3天、少于4天、少于5天、少于6天、少于7天、少于8天、少于9天、少于10天、少于11天、少于13天、少于14天、1至14天、1至12天、1至10天、1至9天、1至8天、1至7天、1至6天、1至5天、1至4天、1至3天、1至2天、2至14天、2到12天、2至10天、2至9天、2至8天、2至7天、2至6天、2至5天、2至4天、2至3天、3至14天，3至12天、3至10天、3至9天，3至8天，3至7天，3至6天、3至5天、3至4天、4至14天、4至12天，4至10天，4至9天，4至8天、4至7天、4至6天、4至5天、5至14天、5至12天、5至10天、5至9天、5至8天、5至7天、5至6天、6至14天、6至12天、6至10天、6至9天、6至8天、6至7天，7至14天，7至12天，7至10天，7至9天、7至8天，8至14天、8至12天、8至10天、8至9天、9至14天、9至12天、9至10天、10至14天、10至12天，或12至14天)。在一些实施方式中，可以通过确定遗传工程改造的去核细胞群体的一部分(例如，群体的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％)被确定为死亡的平均时间来评估遗传工程改造的去核细胞群的寿命。可以通过本领域已知的任何方法确定细胞死亡。在一些实施方式中，可以通过确定形态学或功能性参数是否完整(例如通过台盼蓝染料排除，评估完整的细胞膜，评估对塑料的粘附性(例如，在粘附去核细胞中)，评估遗传工程改造的去核细胞迁移，使用细胞凋亡标志物的阴性染色等)来评估遗传工程改造的去核细胞的活力，例如在一个或多个时间点。在一些实施方式中，遗传工程改造的去核细胞寿命可与从其获得的细胞寿命相关。

在一些实施方式中，通过耗尽去核细胞的免疫识别分子，遗传工程改造的去核细胞已从其天然状态改变。例如，这些免疫识别分子可以是HLA抗原、蛋白聚糖、糖基、胚胎抗原或其组合。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫逃匿蛋白。免疫逃逸分子可以是由细胞表达的分子，其允许细胞避免先天免疫系统并逃逸免疫应答。在一些实施方式中，免疫逃逸分子是细胞因子、IL-10、CD47、HLA-E/G、PD-1、LAG-3、CTLA-4或其组合。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫活化蛋白。在一些实施方式中，免疫活化蛋白是细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

制备去核细胞的方法

在本文描述的任何方法、胞质和组合物的一些实施方式中，使用细胞松弛素B处理有核细胞(例如，真核细胞，哺乳动物细胞(例如，人细胞，犬细胞，猫细胞，马细胞，猪细胞，灵长类细胞，牛细胞，绵羊细胞，啮齿细胞(例如小鼠细胞，豚鼠细胞，仓鼠细胞或小鼠细胞))，免疫细胞或本文所述的任何有核细胞)，以软化皮质肌动蛋白细胞骨架。然后可以通过在Ficoll梯度中进行高速离心从细胞体中物理提取核，以生成去核细胞。在一些实施方式中，通过密度梯度离心去除核。如本文所使用的，术语“去核细胞”可指由细胞内部物质和细胞器组成的先前有核的细胞(例如，本文所述的任何细胞)。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有不同的膜结合的核的细胞。此类细胞可包括例如哺乳动物(例如啮齿动物、非人灵长类动物或人类)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施方式中，真核细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施方式中，真核细胞是高等真核生物，诸如哺乳动物，禽类，植物或昆虫细胞。在一些实施方式中，有核细胞是原代细胞。在一些实施方式中，有核细胞是免疫细胞(例如T细胞，B细胞，巨噬细胞，天然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，树突状细胞，单核细胞，骨髓来源的抑制细胞，嗜酸性粒细胞)。在一些实施方式中，有核细胞是吞噬细胞或白细胞。在一些实施方式中，有核细胞是干细胞(例如，成体干细胞、胚胎干细胞、诱导型多能干细胞(iPS))。在一些实施方式中，有核细胞是祖细胞。在一些实施方式中，有核细胞是细胞系。在一些实施方式中，有核细胞是悬浮细胞。在一些实施方式中，有核细胞是粘附细胞。在一些实施方式中，有核细胞是已经通过致癌基因的表达而永生化的细胞。在一些实施方式中，有核细胞是已经通过人端粒酶逆转录酶(hTERT)表达而永生化的细胞。在一些实施方式中，有核细胞是间充质基质细胞(MSC)。在一些实施方式中，有核细胞是hTERT-永生化脂肪衍生MSC(hTERT-MSC)。在一些实施方式中，有核细胞是患者衍生的细胞(例如，自体同源患者衍生的细胞或同种异体患者衍生的细胞)。

培养细胞(例如，本文所述任何细胞)的方法为本领域所熟知。细胞可以在这样的条件下体外维持，所述条件有利于特定生物学功能的生长，增殖，活力和分化。在一些实施方式中，有核细胞(例如，MSC)在3D悬滴(例如，3D MSC)中培养，然后去核以产生3D去核细胞。

在本文所提供的任何组合物和方法的一些实施方式中，将去核细胞冷冻以供以后使用。冷冻细胞的各种方法为本领域已知，包括但不限于，使用血清(例如，胎牛血清)和二甲基亚砜(DMSO)。在本文所提供的任何组合物和方法的一些实施方式中，使用前将去核细胞解冻。

将生物分子引入去核细胞的方法

本领域中已知可以用于将生物分子(例如，RNA分子(例如，mRNA，miRNA，siRNA，shRNA，lncRNA)、DNA分子(例如质粒)、蛋白质、肽引入去核细胞的各种方法。可用于将生物分子引入去核细胞的方法的非限制性例子包括：脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、慢病毒载体、电穿孔、微注射、脂质转染、转染、磷酸钙转染、基于树状物的转染，阳离子聚合物转染，细胞挤压，超声穿孔，光学转染，穿刺(impalection)，流体动力学递送，磁转染，纳米颗粒转染或其组合。在本文所提供的任何组合物和方法的一些实施方式中，将治疗性试剂、病毒，抗体，药物或纳米颗粒引入去核细胞中。

免疫逃逸

如本文所用，术语“免疫逃逸”或“逃逸免疫识别”指肿瘤形成和进展的基本过程。在肿瘤发展过程中，慢性炎症微环境降低抗肿瘤免疫反应，有利于肿瘤逃逸免疫消除。炎性免疫细胞包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、细胞毒性T(CD8)淋巴细胞(CTL)、Th(CD4)淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、调节性T(Treg)细胞和髓源性抑制细胞(MDSC)。其中，Treg细胞、MDSC和巨噬细胞主要参与转化生长因子β(TGF-β)、前列腺素E2、吲哚胺2,3-双加氧酶和白介素-10(IL-10)等关键分子的免疫抑制作用。据报道，几种生长因子，即TGF-β、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)、细胞因子(如IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)和肿瘤坏死因子α、趋化因子(如趋化因子(C-X-C基序)配体1和C-C基序趋化因子受体7)与肿瘤进展、侵袭和免疫逃逸密切相关。

此外，免疫逃逸通过选择免疫逃逸分子(例如肿瘤变体)而发生，该分子对主要由T细胞和自然杀伤(NK)细胞介导的免疫攻击具有抗性。例如，免疫逃逸分子可以是细胞因子(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)、TGF-β、IGF-2、VEGF、TNF-α、CD47、HLA-E、HLA-G、HLA-E/G、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD112R、CTLA-4、趋化因子(例如趋化因子配体1、C-C基序趋化因子受体7)或其任何组合。在一些实施方式中，免疫逃逸分子可以是NK抑制子受体(例如HLA I类特异性抑制受体，例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A或淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))。

生物工程改造的去核细胞的产生提供了改善治疗功能并产生可控和安全的细胞样实体。设计用于逃避免疫系统识别和进一步治疗用途的生物工程改造的去核细胞比以前基于细胞的治疗提供了若干益处，包括安全性、限定寿命、无核编码基因转移到宿主的风险以及有效递送治疗负载物。在一些实施方式中，可遗传工程改造去核细胞以表达细胞因子(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)、TGF-β、IGF-2、VEGF、TNF-α、CD47、HLA-E、HLA-G、HLA-E/G、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD112R、CTLA-4、趋化因子(例如趋化因子配体1、C-C基序趋化因子受体7)或其任何组合。在一些实施方式中，可遗传工程改造去核细胞以表达NK抑制子受体(例如HLA I类特异性抑制受体，例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A或淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))。

在一些实施方式中，在对象中控制免疫识别的方法包括给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以逃逸免疫系统的识别。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造，以耗竭去核细胞的免疫识别分子。在一些实施方式中，免疫识别分子包括但不限于HLA抗原、蛋白聚糖、糖部分、胚胎抗原或其组合。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫逃匿蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白包括细胞因子(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)、TGF-β、IGF-2、VEGF、TNF-α、CD47、HLA-E、HLA-G、HLA-E/G、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD112R、CTLA-4、趋化因子(例如趋化因子配体1、C-C基序趋化因子受体7)或其任何组合。在一些实施方式中，外源蛋白包括NK抑制子受体(例如HLA I类特异性抑制受体，例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A或淋巴细胞活化基因-3(LAG-3))。

免疫活化

如本文所用，术语“免疫活化”是指白细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞)和免疫系统中涉及的其他细胞类型的转变。免疫系统的活化是对入侵病原体的病理学适当反应。免疫活化在控制和清除入侵病原体方面提供了有益的作用。此外，免疫系统的监测和活性有助于控制和抑制病原体复制和传播。此外，癌症免疫治疗使用免疫系统及其组成部分通过免疫活化产生抗肿瘤反应。免疫活化蛋白可包括但不限于细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬-猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、CD70、GITRL、LIGHT、CD30L、B7家族成员或其组合。

设计用于免疫活化和进一步治疗用途的生物工程改造的去核细胞提供了优于先前基于细胞的治疗的若干益处，并进一步允许更好地理解病原体和癌症免疫应答中先天免疫信号转导的活化和调节。在一些实施方式中，可以遗传工程改造去核细胞以表达细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬-猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、CD70、GITRL、LIGHT、CD30L、B7家族成员或其组合。

在一些实施方式中，在对象中控制免疫活化的方法包括给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以逃逸免疫系统的活化。在一些实施方式中，去核细胞活化对象的免疫应答。在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫活化蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白包括细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬-猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

组合物，包括组合治疗

在一些实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包括去核细胞和药学上可接受的运载体。在一些实施方式中，组合物可用作疾病归巢载体，以递送临床相关的负载物/荷载物以治疗各种疾病。在一些实施方式中，所述组合物可用于治疗或诊断疾病。

在一些实施方式中，所述组合物包括一个或多个经遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白的去核细胞。在一些实施方式中，外源蛋白是细胞表面蛋白。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫逃匿蛋白。在一些实施方式中，所述组合物包括免疫逃逸分子，例如细胞因子(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)、CD47、HLA-E/G、PD-1、LAG-3、CTLA-4、PD-L1、TIGIT、CD112R和NK抑制子受体，例如HLAI类特异性抑制受体(例如，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A和淋巴细胞活化基因-3(LAG-2))，或其组合。在一些实施方式中，外源蛋白是免疫活化蛋白。在一些实施方式中，组合物包括免疫活化蛋白，例如细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬-猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

在一些实施方式中，药物组合物可包含缓冲剂、稀释剂、溶解剂、乳化剂、防腐剂、佐剂、赋形剂或以上所述的任意组合。在一些实施方式中，组合物可配制用于胃肠外给药。例如，本文所述药物组合物可以无菌注射形式(例如适合皮下注射或静脉输液的形式)提供。例如，在一些实施方式中，药物组合物可以适合注射的液体形式提供。

在一些实施方式中，药物组合物用药学上可接受的胃肠外载体配制。例如，这些载剂可包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和人血清白蛋白。还可用脂质体和非水性载剂如非挥发油。在一些实施方式中，制剂用已知或合适的技术稳定化。在一些实施方式中，药物组合物可另外包含药学上可接受的赋形剂，其可包括适合所需特定剂型的任一和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘结剂、润滑剂等。

在本文所提供的任一方法的一些实施方式中，药物组合物与一种或多种其他疗法(例如化疗(例如，化疗剂(例如，多柔比星，紫杉醇，环磷酰胺)，基于细胞的疗法，放疗，免疫疗法，小分子，抑制性核酸(例如反义RNA，反义DNA，miRNA，siRNA，lncRNA)，基于外泌体的治疗、基因治疗或手术)一起给予。在一些实施方式中，所述一种或多种其它治疗包括免疫检查点阻断，其中施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括但不限于PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂，TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、B7抑制剂、CD137抑制剂或CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括PD-1抑制剂，包括但不限于派姆单抗、尼莫单抗或西米单抗。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括PD-L1抑制剂，包括但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括LAG-3抑制剂，包括但不限于瑞拉特利单抗。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括CTLA-4抑制剂，包括但不限于伊匹单抗。在一些实施方式中，包括去核细胞的组合物与一种或多种其它疗法同时施用。在一些实施方式中，包括去核细胞的组合物与一种或多种其它疗法分开施用。

在本文所提供的任一组合物的一些实施方式中，组合物还包括一种或多种其他疗法(例如化疗(例如，化疗剂(例如，多柔比星，紫杉醇，环磷酰胺)，基于细胞的疗法，放疗，免疫疗法，小分子，抑制性核酸(例如反义RNA，反义DNA，miRNA，siRNA，lncRNA)或手术。在一些实施方式中，所述一种或多种其它治疗包括免疫检查点阻断，其中施用免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂可包括但不限于PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂，TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、B7抑制剂、CD137抑制剂或CTLA-4抑制剂。在一些实施方式中，组合物还可包括PD-1抑制剂，包括但不限于派姆单抗、尼莫单抗或西米单抗。在一些实施方式中，组合物还可包括PD-L1抑制剂，包括但不限于阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗。在一些实施方式中，组合物还可包括LAG-3抑制剂，包括但不限于瑞拉特利单抗。在一些实施方式中，组合物还可包括CTLA-4抑制剂，包括但不限于伊匹单抗。在一些实施方式中，组合物还可含有一种或多种其他治疗活性物质。

在一些实施方式中，药物组合物可包括一个去核细胞群体，其中基本上所有的去核细胞都经过遗传工程改造以表达相同的分子，例如相同的外源DNA分子、外源RNA分子、外源多肽或外源蛋白。在一些实施方式中，一个去核细胞群体经工程改造以表达一个生物分子(例如，负载物)。在一些实施方式中，一个去核细胞群体经工程改造以表达两个或多个生物分子(例如，两个生物分子、三个生物分子，四个生物分子或五个生物分子)。在一些实施方式中，一个去核细胞群经工程改造以表达两个生物分子，其中被引入以表达两种生物分子的两种外源分子可以是相同类型的分子。例如，设计成表达两种生物分子的一组去核细胞可以负载两种不同的外源DNA分子。在一些实施方式中，一个去核细胞群经工程改造以表达两个或多个生物分子，其中每个被引入以表达荷载物的外源生物分子可以是不同的。例如，在一群经工程改造以表达两种生物分子的去核细胞中，其中表达一种生物分子的一种分子可以是外源DNA分子，而表达第二生物分子的第二种分子可能是外源RNA分子。

在一些实施方式中，药物组合物可包括一群去核细胞，其中基本上每群去核细胞都经过遗传工程改造以表达不同外源分子(例如外源DNA分子、外源RNA分子、外源多肽或外源蛋白或其组合)。例如，药物组合物可包括经遗传工程改造以表达细胞因子(例如，IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10)的去核细胞群体，和第二群经遗传工程改造以表达检查点抑制剂(PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、TIM-3抑制剂、LAG-3抑制剂，TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、B7抑制剂、CD137抑制剂或CTLA-4抑制剂)的去核细胞。其他实例包括但不限于药物组合物，其包括经遗传工程改造以表达IL-12的一群去核细胞和经遗传工程表达PD-1抑制剂的第二群去核细胞。另一个实例包括药物组合物，该药物组合物包括经遗传工程改造以表达CXCR4的一群去核细胞、经遗传工程改造表达CCR2的第二群去核细胞和经遗传工程改造表达PGSL-1/FUT-7的第三群去核细胞。在一些实施方式中，药物组合物可包括不同群体的去核细胞，其中一群去核细胞经过遗传工程改造以表达一种生物分子，第二群去核细胞经遗传工程改造表达二种或更多种生物分子。在一些实施方式中，药物组合物可包括不两群去核细胞，其中每群去核细胞经过工程改造以表达两种或更多种生物分子。

在一些实施方式中，组合治疗，无论所述组合物包括一个或多个经工程改造以表达一种或多种生物分子的去核细胞群，还是其中所述组合物包含经工程改造以表达多于一种生物分子的一个或多个去核细胞群并进一步包括分开的治疗手段，都表现出作为治疗手段的协同作用。在某些情况下，协同作用可能意味着生物分子和/或疗法的组合产生了比基于对每种生物分子和(或)单独疗法的反应预期更有利的效果(例如，更强、更持久、更好的耐受性等)。在一些实施方式中，其中给予去核细胞和检查点抑制剂的组合治疗可产生治疗疾病的协同效应。例如，当将PD-1检查点抑制剂给予遗传工程改造表达IL-12的去核细胞时，已显示显著减少肿瘤生长并改善小鼠模型中的存活率(例如，图2E-2F和图15A-15D)。

作为疾病诊断使用的方法

本发明提供了去核细胞(天然或工程改造的细胞)用于增强和/或转移生物分子(分泌的、胞内的、天然的和可诱导的)的使用方法，包括但不限于DNA/基因、RNA(mRNA、shRNA、siRNA、miRNA)、纳米颗粒、肽、蛋白质和质粒、细菌、病毒、小分子药物、离子、细胞因子、生长因子和激素。

去核细胞(例如胞质载体)直径较小，但缺乏刚性核，并且预期比有核亲代细胞更有效地通过小收缩部，如毛细血管或间隙空间。例如，已证明去核细胞比有核亲代细胞更好地穿过微血管，因此能更好地促进体内归巢至受损或发炎组织。

在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达“炎症归巢受体”，其中本文中的“炎症归巢受体”指白细胞上的粘附分子，其结合血管中的内皮细胞。白细胞利用炎症归巢受体将其引导至体内组织炎症部位。淋巴细胞(如归巢受体)和内皮细胞(如血管地址素)上的这些不同组织特异性粘附分子有助于特异性免疫反应的发展。在一些实施方式中，炎症归巢受体是α4β7、VCAM-1、CD34、GLYCAM-1、LFA-1、CD44及其组合。

在一些实施方式中，对去核细胞进行遗传工程改造以表达“萤火虫荧光素酶”，其中本文中的“萤火虫荧光素酶”指用于研究基因调节和功能的发光酶和生物发光报告物。由于哺乳动物细胞或组织中缺乏内源性荧光素酶活性，它是一种非常敏感的遗传报告物。萤火虫荧光素酶是一种62000道尔顿的蛋白质，其作为单体具有活性，不需要后续加工。该酶催化ATP依赖性D-荧光素氧化为氧化荧光素，产生560nm中心的发光。反应发出的光与荧光素酶分子的数量成正比。

在一些实施方式中，去核细胞经遗传工程改造以仅表达炎症归巢受体。在一些实施方式中，去核细胞经遗传工程改造以仅表达萤火虫荧光素酶。在一些实施方式中，去核细胞经遗传工程改造以表达炎症归巢受体和萤火虫荧光素酶。

在一些实施方式中，用去核细胞鉴定对象中疾病状态的存在，通过给予所述对象经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞，其中所述经遗传工程改造的去核细胞识别疾病状况的存在或位置。在一些实施方式中，外源蛋白是炎症归巢受体。在一些实施方式中，炎症归巢受体将去核细胞引导至受损和/或发炎组织。

治疗方法

本发明方法包括使用去核细胞治疗或诊断疾病(例如，癌症(例如，多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、实体癌、白血病)、感染(例如，病毒感染，例如但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、严重急性呼吸综合征或新冠肺炎感染(冠状病毒感染)、寄生虫感染(例如但不限于锥虫病)或细菌感染，例如但不局限于结核病)、神经系统疾病(例如帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病)、自身免疫病(例如糖尿病、克罗恩病、多发性硬化、镰状细胞贫血)，心血管疾病(如急性心肌梗死、心力衰竭、难治性心绞痛)、眼科疾病、骨骼疾病、代谢疾病(如苯丙酮尿症、糖原存储不足1A型、戈谢病)。在一些实施方式中，对象需要，或已被确定需要例如去核细胞治疗。如本文所用，术语“对象”指任何哺乳动物。在一些实施方式中，对象可以是啮齿动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠)，犬(例如，狗)，猫科动物(例如，猫)，马科(例如，马)，羊，牛，猪，灵长类动物(例如，猿猴(例如，猴子)，猿类(例如，大猩猩，黑猩猩，猩猩，长臂猿)或人。如本文所用，治疗包括“预防性治疗”和“治疗性治疗”，所述“预防性治疗”是指降低处于患病风险的对象中疾病的征兆或症状的发生率或预防疾病的征兆或症状(或降低其风险)，所述“治疗性治疗”是指在经诊断患有疾病的对象中减少疾病的迹象或症状，降低疾病的进展，减少疾病的严重性，复发。如本文所用，术语“治疗”是指缓解疾病的至少一种临床参数。

本文所用术语“给予”或“施用”及其变体表示对对象引入组合物或药剂，并包括同时或依次引入组合物或药剂。通过任何合适的途径将组合物或药剂引入对象，包括口腔、经肺、鼻内、胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内或局部。给予包括自我给予和由他人给予。合适的给药途径允许组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入对象静脉来给予组合物。可以通过任何合适的途径进行给药。

在本文提供的任何方法的一些实施方式中，在一段时间内给予组合物至少一次(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100次)(例如，每2天，每周两次，每周一次，每周，每月三次，每月两次，每月一次，每2个月，每3个月，每4个月，每5个月，每6个月，每7个月，每8个月，每9个月，每10个月，每11个月，每年一次)。

在一些实施方式中，用去核细胞治疗对象中疾病的方法包括给予所述对象治疗有效量的组合物，其包括经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞。在一些实施方式中，组合物还包含治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂包括小RNA、小分子药物、肽、病毒或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，治疗剂包括化疗剂。

描述了许多实施方式。然而，应理解，可进行各种改进而不背离本发明的精神和范围。

示例性实施方式：

实施方式1.治疗对象中的疾病的方法，该方法包括：

给予所述对象治疗有效量的组合物，所述组合物包含经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞。

实施方式2.如实施方式1的方法，其中所述去核细胞经工程改造以表达两种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式3.如实施方式1的方法，其中所述去核细胞经工程改造以表达三种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式4.如实施方式1的方法，其中所述去核细胞经工程改造以表达四种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式5.如实施方式1所述的方法，其中去核细胞来源于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和成体干细胞、间充质基质细胞(MSC)、可诱导多能干细胞或其组合。

实施方式6.如实施方式1所述的方法，其中所述去核细胞来源于间充质基质细胞(MSC)。

实施方式7.如实施方式1所述的方法，其中外源DNA分子包括单链DNA，双链DNA，寡核苷酸，质粒，细菌DNA分子或DNA病毒或其组合。

实施方式8.如实施方式1所述的方法，其中外源RNA分子包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。

实施方式9.如实施方式1所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶或其组合。

实施方式10.如实施方式1的方法，其中使用荧光活化细胞分选(FACS)选择组合物的去核细胞。

实施方式11.如实施方式1-10的方法，其中所述去核细胞还包括治疗剂。

实施方式12.如实施方式11所述的方法，其中所述治疗剂包括小RNA、小分子药物、肽、病毒或其组合中的至少一种。

实施方式13.如实施方式11所述的方法，其中所述治疗剂包括化疗剂。

实施方式14.如实施方式1-13所述的方法，其中所述给药包括静脉给药、皮下给药、腹膜内给药、直肠给药、口腔给药或其组合。

实施方式15.如实施方式1-14的方法，其中所述组合物在非靶组织中表现出最小累积。

实施方式16.如实施方式1-15的方法，其中所述给药在疾病部位内。

实施方式17.如实施方式1-16中任一项所述的方法，其中所述疾病包括炎症、感染、癌症、神经疾病、自身免疫病、心血管病、眼科疾病、骨骼疾病、代谢疾病或其组合。

实施方式18.如实施方式1-17的方法，其中所述疾病包括炎症。

实施方式19.如实施方式1-18的方法，其中所述疾病包括癌症。

实施方式20.如实施方式19所述的方法，其中所述癌症包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、间皮瘤、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其组合。

实施方式21.如实施方式1-20的方法，其中所述给药包括瘤内给药。

实施方式22.如实施方式1-21的方法，其中所述方法抑制癌症进展。

实施方式23.如实施方式1-22的方法，其中所述方法减少肿瘤生长。

实施方式24.如实施方式1-23的方法，其中所述方法产生完全肿瘤消退。

实施方式25.如实施方式1-24的方法，其中所述方法提高了对象存活的可能性。

实施方式26.如实施方式1-25的方法，其中所述方法产生系统性抗肿瘤免疫应答。

实施方式27.如实施方式1-26的方法，其中所述去核细胞的组合物纯度超过90％。

实施方式28.如实施方式1-27的方法，其中所述组合物的纯度超过95％。

实施方式29.如实施方式1-28的方法，其中所述组合物的纯度超过98％。

实施方式30.如实施方式1-29的方法，其中所述组合物的纯度超过99％。

实施方式31.一种遗传工程改造去核细胞的方法，所述方法包括：

将有核细胞去核；和

将外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质、外源肽和/或治疗剂引入所述去核细胞，其中所述遗传工程改造的去核细胞在体内保留亲代细胞的功能翻译和分泌机制。

实施方式32.如实施方式31的方法，其中所述引入步骤发生在所述有核细胞的去核之前。

实施方式33.如实施方式31的方法，其中所述引入步骤发生在所述有核细胞的去核之后。

实施方式34.如实施方式31-33的方法，其中所述去核步骤的效率超过95％。

实施方式35.如实施方式31-34的方法，其中所述方法具有至少80％的回收率。

实施方式36.如实施方式31-35的方法，其中所述方法具有至少85％的回收率。

实施方式37.如实施方式31-36的方法，其中所述引入步骤包括病毒转导。

实施方式38.如实施方式31-37的方法，其中所述引入步骤包括使用脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质体转染、慢病毒载体或其组合中的至少一种。

实施方式39.如实施方式31-38所述的方法，其中外源DNA分子包括单链DNA，双链DNA，寡核苷酸，质粒，细菌DNA分子或DNA病毒或其组合。

实施方式40.如实施方式31-38所述的方法，其中外源RNA分子包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。

实施方式41.如实施方式31-38所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶或其组合。

实施方式42.如实施方式31-41所述的方法，还包括冷冻保存所述遗传工程改造的去核细胞。

实施方式43.如实施方式42的方法，其中与亲代细胞相比，遗传工程改造的去核细胞更有可能从冷冻保存中恢复。

实施方式44.通过将外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质、外源肽或治疗剂中的至少一种引入去核细胞而产生的遗传工程改造的去核细胞。

实施方式45.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，所述去核细胞被工程改造以表达两种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式46.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，所述去核细胞被工程改造以表达三种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式47.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，所述去核细胞被工程改造以表达四种或更多种外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽或其组合。

实施方式48.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，其中所述去核细胞来源于间充质基质细胞(MSC)。

实施方式49.如实施方式48的遗传工程改造的去核细胞，其中所述去核细胞来源于hTERT永生化脂肪来源MSC(hT-MSC)。

实施方式50.如实施方式49的遗传工程改造的去核细胞，其中所述去核细胞分泌与亲代hT-MSC细胞类似的胞外小泡(EV)。

实施方式51.如实施方式44的遗传工程改造的无核细胞，其中所述引入步骤包括病毒转导。

实施方式52.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，其中所述引入步骤包括脂质体介导的转移、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、基于逆转录病毒的载体、脂质体转染、慢病毒载体或其组合中的至少一种。

实施方式53.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，其表现出与亲代细胞基本相同的细胞结构。

实施方式54.如实施方式53的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核的细胞包含功能性亚细胞细胞器。

实施方式55.如实施方式54的遗传工程改造的去核细胞，其中所述功能性亚细胞细胞器包括高尔基体、内质网、线粒体、溶酶体、内质体、核糖体或其组合中的至少一种。

实施方式56.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，其表现出与亲代细胞基本相同的细胞结构。

实施方式57.如实施方式56的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核的细胞具有与亲代细胞基本相同的zeta电位。

实施方式58.如实施方式56的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核的细胞包含功能性膜受体。

实施方式59.如实施方式56的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞包含功能性迁移和入侵机制。

实施方式60.如实施方式56的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞可主动产生和分泌与亲代细胞产生的胞外小泡基本相同的胞外小泡。

实施方式61.如实施方式44-60的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞在体内产生治疗性生物活性蛋白。

实施方式62.如实施方式44-61的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞经工程改造以表达细胞表面蛋白。

实施方式63.如实施方式44的遗传工程改造的去核细胞，其中所述细胞表面蛋白包括CXCR4、CCR2、PSGL-1、CD44、CD90、CD105、CD106、CD166、Stro-1或其组合。

实施方式64.如实施方式44-63的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传工程改造的去核细胞的直径小于亲代细胞的直径。

实施方式65.如实施方式44-64的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传工程改造的去核细胞直径为约1微米至100微米。

实施方式66.如实施方式44-65的遗传工程改造的去核细胞，其来源于悬滴细胞培养中培养的细胞。

实施方式67.如实施方式44-66的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞在去核后可存活达72小时。

实施方式68.如实施方式44-67的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞保持MSC表面标志物蛋白表达至少48小时。

实施方式69.如实施方式44-68的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞响应细胞外信号。

实施方式70.如实施方式69的遗传工程改造的去核细胞，其中所述胞外信号是趋化因子。

实施方式71.如实施方式44-70的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞能够趋化。

实施方式72.如实施方式44-71的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞能够分泌蛋白。

实施方式73.如实施方式44-72的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞能够归巢。

实施方式74.如实施方式44-73的遗传工程改造的去核细胞，其中所述遗传去核细胞能够在体内靶位点递送靶产物。

实施方式75.一种控制对象免疫识别和/或活化的方法，所述方法包括：

给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以逃逸免疫系统的识别和/或活化免疫系统。

实施方式76.如实施方式75的方法，其中所述去核细胞逃逸对象的免疫识别。

实施方式77.如实施方式76所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以耗竭所述去细胞的免疫识别分子。

实施方式78.如实施方式77所述的方法，其中所述免疫识别分子包括HLA抗原、蛋白聚糖、糖基、胚胎抗原或其组合。

实施方式79.如实施方式76所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。

实施方式80.如实施方式79所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面蛋白。

实施方式81.如实施方式80所述的方法，其中所述外源蛋白是免疫逃逸分子。

实施方式82.如实施方式79-81的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、IL-10、CD47、HLA-E/G、PD-1、LAG-3、CTLA-4或其组合。

实施方式83.如实施方式75的方法，其中所述去核细胞活化对象中的免疫应答。

实施方式84.如实施方式83所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。

实施方式85.如实施方式84所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面蛋白。

实施方式86.如实施方式85所述的方法，其中所述外源蛋白是免疫活化蛋白。

实施方式87.如实施方式84-86中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

实施方式88.如实施方式75-87的方法，进一步包括治疗对象中的疾病。

实施方式89.如实施方式88的方法，其中所述疾病包括炎症疾病和/或癌症。

实施方式90.如实施方式89所述的方法，其中所述癌症包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、间皮瘤、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其组合。

实施方式91.一种鉴定对象中疾病状况的存在的方法，所述方法包括：

给予对象经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞，

其中所述经遗传工程改造的去核细胞识别疾病状况的存在或位置。

实施方式92.如实施方式91所述的方法，其中所述外源蛋白是炎症归巢受体。

实施方式93.如实施方式92所述的方法，其中所述炎症归巢受体将所述去核细胞引导至受损和/或发炎组织。

实施方式94.如实施方式91-93的方法，其中所述去核细胞进一步包括萤火虫荧光素酶。

实施方式95.如实施方式94的方法，其中所述萤火虫荧光素酶发射可检测光。

实施方式96.如实施方式91-95中任一项所述的方法，其中所述疾病包括炎症、感染、癌症、神经疾病、自身免疫病、心血管病、眼科疾病、骨骼疾病、代谢疾病或其组合。

实施方式97.如实施方式96的方法，其中所述疾病包括癌症。

实施方式98.如实施方式97所述的方法，其中所述癌症包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、间皮瘤、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其组合。

实施例

本公开在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制本公开的范围。

实施例1-遗传工程改造去核细胞

首先，在MSC去核之前，亲代细胞(例如有核细胞)被遗传工程改造。G蛋白偶联受体如CXCR4将胞外刺激转化为胞内信号并调节重要的细胞功能。通过慢病毒感染和药物筛选，用稳定的CXCR4表达(MSC^CXCR4)工程改造hT MSC。去核后，来自MSC^CXCR4的去核细胞通过流式细胞术显示CXCR4的稳定表面表达达48小时，在去核后长达72小时内显示有活力(图1B和1C)，并且显著小于悬浮的hT-MSC(图1G)。重要的是，去核细胞^CXCR4以剂量依赖性的方式响应并向同源配体SDF-1α的趋化因子梯度迁移(图1D)，表明去核细胞^CXCR4中的膜表达受体和下游信号转导通路具有完整功能。接下来，通过开发一种利用体外合成的人工mRNA高效转染去核细胞的方法，对去核细胞进行去核后遗传工程改造。GFP mRNA转染后，epi-荧光图像和流式细胞术分析显示，去核细胞表达与hT-MSC相当的胞质GFP蛋白(图1E)。值得注意的是，用外源性Gaussia荧光素酶(Gluc)mRNA转染的去核细胞在条件培养基(CM)中以类似于亲代细胞的水平分泌活性Gluc(图1F)。这表明去核细胞可翻译外源mRNA并分泌功能性蛋白，证明了它们的功能性mRNA翻译和蛋白质分泌机制。综上所述，去核细胞提供了多功能的去核前后工程改造性能，可定制为治疗平台。

接下来，对去核细胞进行工程改造，以在体内产生治疗水平的生物质。在这里，我们测试了去核细胞是否能在肿瘤微环境中产生生物活性蛋白。用小鼠IL-12(mIL-12)mRNA(MSC-IL-12和胞质载体IL-12)转染hT-MSC和去核细胞(图7A)。经ELISA分析，去核细胞-IL-12在CM中分泌mIL-12达72小时，相当于每24小时20ng/25,000个去核细胞(图7B)。用CM体外处理的小鼠脾细胞显示Stat4磷酸化，表明胞质载体-IL-12分泌生物活性的mIL-12(图7C)。为了测试胞质载体-IL-12的体内治疗功能，使用了一种小鼠模型，该模型重现了三阴性(ER-、PR-、HER2/neu-)乳腺癌(TNBC)，其预后较差(图2A)。将E0771(小鼠TNBC)细胞皮下(SQ)注射到免疫健全的同基因C57BL/6J小鼠中。肿瘤在14天内发展，然后瘤内注射胞质载体-IL-12或MSC-IL-12。胞质载体-IL-12容易在肿瘤微环境中分泌生物活性mIL-12(图2B)，诱导IL-12的已知下游因子如IFN-γ、PD-L1和CXCL9的转录(图2C)，并将关键免疫效应细胞募集到肿瘤部位(图2D)。在治疗动物中未发现不良健康问题，血浆中检测到的极低水平mIL-12(图7D)进一步证明了这一点，并且血液学未显示器官功能障碍。基于这些发现，确定了胞质载体-IL-12单独使用或与免疫检查点阻断联合使用时抑制癌症进展和提高动物存活率的能力。与最近使用抗PD-1抗体(aPD-1)与通过电穿孔瘤内原位接种的IL-12质粒(NCT03567720)组合的临床试验一致，单独用aPD-2治疗E0771肿瘤不影响肿瘤进展，而用胞质载体IL-12治疗随后用aPD-1治疗肿瘤显著降低了肿瘤生长并改善了动物存活率(图2E)，其与MSC-IL-12联合aPD-1相当。值得注意的是，40％的用胞质载体-IL-12和aPD-1联合治疗的动物在实验剩余时间(>175天)肿瘤完全消退(无明显肿瘤)(图2E)。当这些动物在对侧侧翼用SQ E0771细胞再次攻击时，肿瘤未能再次生长，表明联合治疗产生了持久的全身抗肿瘤免疫应答(图2F)。研究还表明，注射胞质载体-IL-12不会对动物健康产生负面影响，并且在使用胞质载体-IL-12和PD-1治疗的动物中未观察到显著的体重变化(图15B)。当静脉注射胞质载体-IL-12时，急性期免疫标志物的变化最小，甚至无法检测(图15C)，表明胞质载体-IL-12中的免疫原性最小。最后，在双侧E0771 TNBC模型中，单侧向肿瘤注射3剂胞质载体IL-12或PBS(对照组)，并随时间测量双侧肿瘤大小。重要的是，与对照组相比，胞质载体-IL-12的单侧注射降低了两种肿瘤中的肿瘤生长(图15D)，并增加了CD8+T细胞的肿瘤浸润，这表明在单个部位注射胞质载体-IL-12可诱导系统性抗肿瘤反应，以限制远端部位(对侧肿瘤)的肿瘤生长。因此，去核细胞有效将免疫调节生物制剂递送至肿瘤部位，并诱导系统性抗肿瘤免疫，大量动物被TNBC治愈。

虽然有核细胞(如MSC)已被设计用于递送治疗性生物制剂，但体内去核细胞行为更可控和可预测，因为它们不能增殖或植入组织，并且不具有可在疾病微环境中活化的转录机制。在递送IL-12的情况下，IFN-γ是一种主要的下游效应物，可显著活化细胞载剂上不期望的免疫抑制因子(如PD-L1和IDO1)的基因转录。当体外用人IFN-γ刺激时，hT-MSC和经辐照的hT-MSC均产生显著增加的PD-LI和IDO1 mRNA，而遗传工程改造的去核细胞无此情况(图2G)。综上所述，研究表明，去核细胞可以经生物工程改造，通过局部给药有效地将免疫调节性细胞因子递送至疾病组织而无不良副作用，这表明了更好的安全性。

实施例2–遗传工程改造的去核细胞的体内归巢能力

首先，由于去核细胞较小且缺乏刚性核(图8A)，因此期望去核细胞比有核亲代细胞更有效地通过小收缩部，例如毛细血管或间质空间。这使用微流体装置进行了测试，其中允许LifeAct-RFP标记的hT-MSC和去核细胞沿着FBS梯度迁移通过模拟间质孔的受限3D收缩部。延时共焦显微镜显示了迁移，记录了细胞迁移通过单个收缩部所需的时间。正如所预测的，去核细胞有效地通过收缩部，而hT-MSC由于刚性核而常常滞留在受限的收缩部中(图8B)。通过静脉注射小鼠hT-MSC或用LifeAct-RFP和活性染料DiD双重标记的去核细胞，在体内证实了这一结果。通过注射后24小时的流式细胞术分析，与亲代细胞相比，在肺组织中检测到的去核细胞明显较少(图3B)。然而，为了进一步减少肺滞留，MSC以悬滴方式培养，以产生比传统2D培养的MSC更小的3D培养的MSC，并显示出如先前报道的肺滞留减少(图3B)。当3D培养的MSC去核时，所得的3D-胞质载体最小并且具有最小的肺捕获(图3B、图8A和图9D)。基于这些发现，大多数随后的体内归巢分析使用3D-hT-MSC和3-胞质载体。总之，我们的结果表明，去核细胞能比亲代细胞更好地通过微血管，这可能有助于更好地体内归巢。

接下来，用与患病组织相对应的特异性趋化因子受体和粘附分子设计和工程化改造去核细胞，这被假设为增加体内去核细胞归巢到靶位点。使用急性炎症小鼠模型，其中将细菌源性脂多糖(LPS)皮内(i.d.)注射到耳廓中以诱导急性局部炎症。生理盐水作为对照皮内注入对侧耳。该模型允许定量检查同一动物内炎症和非炎症对侧组织之间的治疗性细胞归巢。发现与对照组相比，炎症耳中SDF-1α,Ccl2和P-选择素而非E-选择素在LPS注射后6小时开始上调(图8C)。然后，hT-MSC经工程改造以稳定表达CXCR4(MSC^CXCR4)以结合SDF-1α，CCR2(MSC^CCR2)以结合Ccl2，或内皮粘附分子PSGL-1与岩藻糖基转移酶7(FUT-7，用于PSGL-2的功能修饰)(MSC^PSGL-3)以结合P-和E-选择素。将这些工程改造的MSC中的每一个去核以产生相应的去核细胞(胞质载体^CXCR4、胞质载体^CCR2和胞质载体^PSGL-1)。流式细胞术显示，工程改造的去核细胞在去核后至少48小时内保持CXCR4、CCR2或PSGL-1的稳定表面表达。在功能上，胞质载体^PSGL-1在去核后48小时内与其受体P-/E-选择素的结合增加。正如胞质载体^CXCR4对SDF-1α反应强烈(图1D)，与非工程改造的去核细胞相比，胞质载体^CCR2对Ccl2表现出显著的趋化性(图9A)。最后，在不同的药物选择下，使用3种单独的DNA整合慢病毒，将hT-MSC工程改造以同时表达CCR2、CXCR4和PSGL-1/FUT-7，然后分选FACS以富集所有3种标志物高表达的细胞(命名为MSC^Tri-E)。MSC^Tri-E衍生的胞质载体^Tri-E显示出向Ccl2和SDF-1α梯度的显著迁移(图9B、图16A-16C)，表明工程改造的受体的共表达改善了迁移，而没有相互功能干扰。

此外，将去核细胞工程改造成具有白细胞归巢分子结合其固有的肿瘤营养特性，这假设为显著改善去核细胞归巢到肿瘤。确定CCP胞质载体是否可归巢到由E0771小鼠BC条件培养基(CM)产生的趋化因子。E0771细胞是已建立的在体外和体内在肿瘤内产生SDF-1aα和CCL2的小鼠BC品系。工程改造的去核细胞向E0771CM迁移，这通过使用CXCR4和CCR2化学引诱剂受体的遗传工程改造显著增强(图14)。

然后测试工程改造策略是否改善了体内归巢。3D培养的MSC用DiD标记，并在LPS皮内注射后6小时静脉注射到小鼠中(图3A)。在静脉注射后24小时收获小鼠组织，并通过流式细胞术分析DiD⁺F4/80^-细胞，这排除了非特异性DiD掺入小鼠巨噬细胞的可能性。与非工程改造的hT-MSC相比，CCR2、CXCR4或PSGL-1的独立表达改善了细胞对发炎耳的特异性归巢，表明这些蛋白在体内具有功能并有助于归巢。值得注意的是，同时表达所有3种表面蛋白的MSC^Tri-E显示出最大的归巢(图9C)，表明可以结合多层工程改造以实现优异的体内归巢。为了进一步提高工程改造细胞的一致性和同质性，使用FACS对MSC^Tri-E进行分选，以建立19个具有所有3种标志物高表达的单细胞MSC^Tri-E克隆，并用于随后的基于表面表达、生长速率和细胞大小选择克隆19(MSC^{Tri-E C19})的体内实验。3D-MSC^Tri-EC19去核以生成3D-胞质载体^{Tri-E C19}，与非工程改造的3D-胞质载体相比，其显示了对发炎耳的优异归巢(图3C)。由于工程改造和非工程改造的3D-胞质载体具有类似的低肺捕获(图9D)，但只有工程改造的去核细胞显著改善了向耳的归巢，我们的结果表明3D-胞质载体^{Tri-E C19}上工程改造的表面蛋白显著改善了体内归巢。此外，与小鼠D1 MSC或去核细胞相比，3D-胞质载体^{Tri-E C19}也显示出明显更好的归巢(图3C)，D1 MSC是来自BALB/c小鼠的同基因MSC系，具有内源性归巢能力。该结果通过使用萤火虫荧光素酶的生物发光分析独立地证实，该分析显示3D-胞质载体^{Tri-E C19}与3D-MSC^{Tri-E C19}相比在静脉注射后2小时就降低了肺滞留，这表明工程改造的胞质载体以在其他器官中最小的聚积特异性归巢到指定的疾病组织(图10、图11A和11B)。重要的是，通过用针对人类线粒体和细胞核的特异性抗体进行免疫染色，在血管腔外和耳结缔组织内检测到静脉注射的3D-胞质载体^{Tri-E C19}，表明去核细胞不是被动地捕获在耳血管系统中，而是能够外渗到组织中。总之，这些数据首次表明，在系统给药后，去核细胞可以被广泛工程改造，特异性地定位于指定的患病组织。去核细胞也表现出比亲代细胞更好的归巢效率，因为减少了在肺中的滞留。

接下来，研究了生物工程改造的去核细胞(如胞质载体)递送抗炎生物制剂治疗炎症组织的能力。IL-10是一种有效的抗炎细胞因子，但临床应用需要更有效和特异的递送方法。用人IL-10mRNA转染的去核细胞(胞质载体-IL-10)在体外产生IL-10达72小时，类似于转染的亲代细胞(MSC-IL-10)，而非工程改造的hT-MSC不分泌可检测的IL-10(图12A和12B)。功能上，来自MSC-IL-10和胞质载体-IL-10的CM在体外活化小鼠RAW巨噬细胞中的Stat3磷酸化，表明分泌的hIL-10在小鼠细胞上具有生物学活性(图12C)。虽然在所有类型的细胞和无核细胞之间，体外的hIL-10分泌水平是可比较的(图12D和12F)，但3D-胞质载体^{Tri-E C19}的注射导致耳中hIL-1的最高水平(图3D)，这可能是因为它们对耳朵的优异归巢能有效递送到预期部位。这些动物的所有对侧(对照)耳几乎检测不到hIL-10(图3D)，这表明hIL-10向发炎耳的传递是特异性的。

然后对炎症组织中的工程改造的去核细胞的疗效进行了检查。组织学上，PBS处理小鼠的发炎耳朵显示出严重出血和水肿，混合白细胞数量适中，而3D-胞质载体^{Tri-E IL-10}处理的小鼠出血和水肿最小，混合白细胞量较少(图3E)。在这种耳部炎症模型中，液体和细胞浸润的增加对应于耳廓厚度的增加，耳廓厚度可以作为炎症程度的标志物进行测量。虽然盐水注射的对照耳厚度在所有组中都是稳定和可比较的，但与对照小鼠相比，工程改造的MSC和去核细胞处理的动物具有明显更薄的发炎耳(图3F)。此外，炎症标志物IL-6、IL-1β和TNF-α的表达与PBS处理的小鼠相比，用3D-胞质载体^{Tri-E C19}IL-10处理的小鼠耳中的表达显著下调(图3G)。因此，小尺寸和表达归巢受体和内皮粘附分子的生物工程改造的去核细胞可以特异性归巢到指定炎症组织，并有效地传递抗炎细胞因子，整体上减少体内炎症。

最后，通过临床观察和委员会认证兽医病理学家(C.N.A.)对组织的总体检查，表明小鼠模型中的工程改造的人MSC衍生的去核细胞在瘤内或静脉内给药后对300多只小鼠没有产生任何明显的负面健康影响。静脉注射生物工程改造的去核细胞(如胞质载体)的BALB/c小鼠的促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的血浆浓度在注射后4小时或24小时没有显著变化。此外，作为临床使用的原型，我们用组蛋白2B-GFP标记细胞核，并通过FACS产生纯度为99.999％的胞质载体，而不损失活力或迁移能力(图13A-13F)。基于这些结果，去核细胞有可能成为安全有效的治疗平台。

此外，对急性胰腺炎(AP)疾病模型中生物工程改造的去核细胞的治疗递送进行了测试。AP是一种严重的疾病，发病率和死亡率都很高，目前缺乏有效的治疗。雨蛙素是胆囊收缩素(CCK)的十肽类似物，可刺激胰腺外分泌，并在临床前小鼠模型中诱导AP。先前的研究表明，在临床前AP模型中频繁全身给予高剂量的抗炎细胞因子IL-10可以大大减轻炎症并减轻疾病。然而，重复高剂量的IL-10在临床应用中不具成本效益，也可能导致不希望的严重并发症如贫血，这表明可能需要一种特异和有效的载剂。在雨蛙素诱导的AP早期阶段，趋化因子如Ccl2和SDF-1α以及粘附分子如E-/P-选择素和Vcam1在炎症小鼠胰腺中均显著上调(图18A)，表明生物工程改造的胞质载体^{Tri-E C19}可能是将IL-10特异性递送至炎症胰腺的理想递送载剂。通过Vybrant-DiD标记和FACS分析评估AP小鼠中胞质载体和亲代MSC的归巢。与非工程改造的3D-胞质载体相比，3D-胞质载体^Tri-EC19更有效地(>11倍)归巢至炎症胰腺(图17A)。与亲代3D-MSCTri-E C19相比，3D-胞质载体Tri-E C19在归巢至炎症胰腺和减少肺捕获方面也增加了超过2倍(图17A和图18B)。在健康的未治疗胰腺中，3D-胞质载体Tri-E C19和3D-MSCTri-E C18的聚积最小。重要的是，与亲代3D-MSCTri-E C19相比，3D-胞质载体Tri-E C19也更有效地将IL-10蛋白(>2倍)递送至炎症胰腺(图17B)，这与炎症基因标志物Ccl2、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达降低相关(图17C和图18F)。3D-胞质载体Tri-E C19IL-10的输注也显著降低了血清脂肪酶和淀粉酶水平(图17D)，这与胰腺损伤的严重程度相关。组织学分析显示受损胰腺中腺泡细胞坏死减少，间质水肿减少，炎性细胞浸润减少(图17E和图18G)。值得注意的是，不含IL-10的3D-胞质载体Tri-E C19或3D-MSCTri-E C19不会显著影响雨蛙素诱导的胰腺炎(图17B-17E)。总之，这些结果表明，生物工程改造的胞质载体Tri-E C19可以有效地将生物活性抗炎细胞因子IL-10递送至炎症胰腺，这在已建立的临床相关AP模型中大大改善了疾病。正如预期的那样，静脉注射单剂量(8μg/kg体重)重组hIL-10蛋白的动物对所有炎症和AP标志物的影响最小，可能是由于IL-10蛋白在循环中的半衰期较短(图17B-17E)。此外，与公认的治疗递送平台相比，在AP模型中，市售骨髓来源的原代MSC(BM-MSC)和纯化的BM-MSC来源的外泌体(B-外泌体)负载有IL-10mRNA。虽然输注BM-MSC+IL-10显著增加了血清和肺中IL-10的水平(图18E)，但在炎症胰腺中检测到的实际IL-10水平可忽略不计(图17B)，这表明BM-MSC在归巢和向炎症胰腺输送IL-10方面效率低下。类似地，注射负载IL-10mRNA的B-外泌体的动物在炎症胰腺中没有检测到IL-10，血清IL-10水平仅轻微增加(图17B)。

其他实施方式

应理解，虽然本发明已经结合具体实施方式进行了描述，但前述描述旨在说明而不是限制由所附权利要求书的范围所限定的本发明的范围。其它方面、优点和改进均在权利要求书的范围内。

Claims (28)

1.治疗对象中的疾病的方法，该方法包括：

给予所述对象治疗有效量的组合物，所述组合物包含经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含治疗剂。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂包括小RNA、小分子药物、肽、病毒或其组合中的至少一种。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂包括化疗剂。

5.一种控制对象免疫活化的方法，所述方法包括：

给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以活化免疫系统。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面蛋白。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述外源蛋白是免疫活化蛋白。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、IL-12、钙网蛋白、磷脂酰赖氨酸、吞噬猎物结合结构域、膜联蛋白1、OX40/OC40L、4-1BB、B7家族成员或其组合。

10.一种控制对象免疫识别的方法，所述方法包括：

给予所述对象去核细胞，其中所述去核细胞经遗传工程改造以逃逸免疫系统的识别。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以耗竭所述去细胞的免疫识别分子。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述免疫识别分子包括HLA抗原、蛋白聚糖、糖部分、胚胎抗原或其组合。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述去核细胞经遗传工程改造以表达至少一种外源蛋白。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述外源蛋白是细胞表面蛋白。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述外源蛋白是免疫逃逸分子。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TGF-β、IGF-2、VEGF、TNF-α、CD47、HLA-E、HLA-G、HLA-E/G、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD112R、CTLA-4、趋化因子、趋化因子配体1、C-C基序趋化因子受体7、NK抑制剂受体、HLA I类特异性抑制受体、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、NKG2A、NKG2A、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)或其组合。

17.一种鉴定对象中疾病状况的存在的方法，所述方法包括：

给予对象经遗传工程改造以表达外源DNA分子、外源RNA分子、外源蛋白质或外源肽中的至少一种的去核细胞，

其中所述经遗传工程改造的去核细胞识别疾病状况的存在或位置。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述外源蛋白是炎症归巢受体。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述炎症归巢受体将所述去核细胞引导至受损和/或发炎组织。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述去核细胞来源于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和成体干细胞、间充质基质细胞(MSC)、可诱导多能干细胞或其组合。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述去核细胞来源于间充质基质细胞(MSC)。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述外源DNA分子包括单链DNA、双链DNA、寡核苷酸、质粒、细菌DNA分子、DNA病毒或其组合。

23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述外源RNA分子包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、RNA病毒或其组合。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述外源蛋白包括细胞因子、生长因子、激素、抗体、酶或其组合。

25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述给药包括静脉给药、皮下给药、腹膜内给药、直肠给药、口腔给药或其组合。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述给药包括瘤内给药。

27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述疾病包括炎症、感染、癌症、神经疾病、自身免疫病、心血管病、眼科疾病、骨骼疾病、代谢疾病或其组合。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症包括多发性骨髓瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、白血病、间皮瘤、肉瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌或其组合。

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