JP2021504331A - プロピオン酸血症の治療用のプロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ及びベータサブユニットをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年11月22日に出願された米国仮出願第62/590,199号、2018年1月8日に出願された米国仮出願第62/614,787号、2018年4月26日に出願された米国仮出願第62/663,024号、2018年7月3日に出願された米国仮出願第62/693,552号、及び2018年10月18日に出願された米国仮出願第62/747,356号の優先権を主張する。これら先行出願の内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、該対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血(乾燥血液スポットを含む)、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインのプロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照のプロピオン酸の血漿、血清、全血(乾燥血液スポットを含む)、尿、及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、C3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍もしくは少なくとも50倍低下させる。
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、該対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、C3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍もしくは少なくとも50倍低下させる。
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、該対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも8週間、もしくは少なくとも12週間、C3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、該対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍もしくは少なくとも50倍低下させる。
(ii)該プロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、該ヒト対象のベースラインのプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルもしくはPAを有する患者における参照のプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルと比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下し、
(iii)該プロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日以内に、正常なプロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下し、
(iv)該プロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、正常なプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下し、
(v)該C3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、該ヒト対象のベースラインの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニア、もしくはPAを有する患者における参照のC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下し、及び/または
(vi)該C3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日以内に、正常なC3、2−MC、3OHPA、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、尿、及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下する。
(i)該ヒト対象におけるPCC活性レベルは、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、もしくは少なくとも120時間、PAを有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加し、及び/または
(ii)該医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの単回投与が該ヒト対象に施された12時間後、該ヒト対象におけるPCC活性は、該対象のベースラインのPCC活性と比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、少なくとも500%、もしくは少なくとも600%増加する。
プロピオニルCoAカルボキシラーゼ(PCC、EC6.4.1.3)は、重炭酸塩によるプロピオニルCoAのカルボキシル化を触媒し、メチルマロニルCoAを産生する。メチルマロニルCoAはその後、トリカルボン酸回路(TCA)の中間体であるスクシニルCoAに変換される。細胞では、PCCは、PCCAがコードするプロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファサブユニット(OMIM 232000)6つと、PCCBがコードするプロピオニルCoAベータサブユニット(OMIM 232050)6つから構成されるヘテロ12量体として存在する。
本発明は、プロピオン酸血症(PA)の治療または予防に使用するmRNAを特徴とする。本発明での使用を特徴とするmRNAは、ヒト対象に投与され、インビボでヒトプロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)タンパク質またはヒトプロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)タンパク質をコードする。PCCAとPCCBは結合し、プロピオニルCoAカルボキシラーゼ(PCC)を形成する。従って、本発明は、ヒトPCCA(配列番号1)またはPCCB(配列番号15)、そのアイソフォーム、その機能的断片、及びPCCAまたはPCCBを含む融合タンパク質をコードする連結ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチド、例えば、mRNAに関する。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレームは、配列最適化される。特定の実施形態では、本発明は、ヒトPCCAまたはヒトPCCBのポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
(i)完全長PCCAまたはPCCBポリペプチド(例えば、野生型PCCAアイソフォーム1、2もしくは3、または野生型PCCBアイソフォーム1もしくは2と同じまたは本質的に同じ長さを有する)、
(ii)本明細書に記載のPCCAまたはPCCBの機能的断片(例えば、野生型PCCAまたはPCCBより短い切断型(例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失)配列であるが、PCC酵素活性をなお保持する)、
(iii)そのバリアント(例えば、1つ以上のアミノ酸が置き換えられた完全長もしくは切断型PCCAまたはPCCBタンパク質、例えば、参照アイソフォーム(例えば、当技術分野で既知の任意の天然もしくは人工バリアント)に対して該ポリペプチドのPCCAまたはPCCB活性のすべてもしくはほとんどを保持するバリアント)、あるいは
本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)はまた、コードされたポリペプチドの治療関連部位への輸送を容易にするさらなる特徴をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を支援する1つのかかる特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含めた様々な名称で知られている。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、本明細書に記載のPCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、目的のポリペプチドをコードする複数の核酸配列(例えば、ORF)を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、PCCAもしくはPCCBポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする単一のORFを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、複数のORF、例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチド(第一の目的のポリペプチド)をコードする第一のORF、機能的断片、またはそのバリアント、及び第二の目的のポリペプチドを発現する第二のORFを含み得る。いくつかの実施形態では、2つ以上の目的のポリペプチドは、遺伝子的に融合させることができ、すなわち、2つ以上のポリペプチドは、同一のORFによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、2つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー(例えば、G4S(配列番号86)ペプチドリンカーまたは当技術分野で既知の別のリンカー)をコードする核酸配列を含み得る。
ある特定の実施形態では、本開示のmRNAは、複数のPCCAもしくはPCCBドメイン(例えば、PCCAもしくはPCCB触媒ドメイン、PCCAもしくはPCCB4量体化ドメイン)または異種ドメインをコードし、本明細書では多量体構築物と呼ばれる。該多量体構築物のある特定の実施形態では、該mRNAはさらに、各ドメイン間に位置するリンカーをコードする。該リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。ある特定の実施形態では、該リンカーは、F2Aリンカー、P2Aリンカー、T2Aリンカー、E2Aリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。2Aペプチドと呼ばれるこの自己切断型ペプチドリンカーのファミリーは、当技術分野において記載されている(例えば、Kim,J.H.et al.(2011) PLoS ONE 6:e18556参照)。ある特定の実施形態では、該リンカーは、F2Aリンカーである。ある特定の実施形態では、該リンカーは、GGGS(配列番号86)リンカーである。ある特定の実施形態では、該リンカーは、(GGGS)n(配列番号190)リンカーであり、ここで、n=2、3、4、または5である。ある特定の実施形態では、該多量体構築物は、ドメイン−リンカー−ドメイン−リンカー−ドメイン、例えば、PCCAまたはPCCBドメイン−リンカー−PCCAまたはPCCBドメイン−リンカー−PCCAまたはPCCBドメインの構造を有する介在リンカーを備えた3つのドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、任意に、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(例えば、ORF)、5’−UTR、3’−UTR、任意に少なくとも1つのマイクロRNA結合部位を含む5’UTRまたは3’UTR、任意に、リンカー、ポリAテール、またはそれらの任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ORF(複数可)は配列最適化される。
(i)参照ヌクレオチド配列(例えば、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードするORF)の少なくとも1つのコドンを、ウリジン含量を増加もしくは減少させる代替コドンで置換し、ウリジン修飾配列を生成すること、
(ii)参照ヌクレオチド配列(例えば、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードするORF)の少なくとも1つのコドンを、同義コドンセットにてコドン頻度がより高い代替コドンで置換すること、
(iii)参照ヌクレオチド配列(例えば、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードするORF)の少なくとも1つのコドンを、G/C含量を増加させる代替コドンで置換すること、または
(iv)それらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のPCCAまたはPCCBポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、該ORFは配列最適化されている。
(i)本明細書に示す5’キャップ、例えば、キャップ1、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号3、配列番号64、または配列番号199、
(iii)PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号2、5〜14、16〜27、196、197、及び198に示すPCCAまたはPCCBをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(存在しない場合、3’UTRの5’末端)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号4、配列番号112、または配列番号178、ならびに
(vi)上記のポリAテール。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’から3’末端に以下を含む:
(i)本明細書に示す5’キャップ、例えば、キャップ1、
(ii)5’UTR、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号3、配列番号191、配列番号199、または配列番号206、
(iii)PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号2、5〜14、16〜27、196、197、及び198に示すPCCAまたはPCCBをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン(存在しない場合、3’UTRの5’末端)、
(v)3’UTR、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号4、配列番号111、配列番号150、配列番号175、配列番号177、配列番号178、配列番号207、または配列番号208、ならびに
(vi)上記のポリAテール。
ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルはN1−メチルプソイドウラシル(G5)である。ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは5−メトキシウラシル(G6)である。
本発明のいくつかの実施形態では、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、少なくとも1つの核酸配列の特性(例えば、ヌクレアーゼに曝露された際の安定性)または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されたかどうかを特定するために試験され得る。
本発明のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの所望の特性は、該核酸配列の固有特性である。例えば、該ヌクレオチド配列(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、インビボまたはインビトロ安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、該ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞における発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる分解を防ぐことによって、その血漿半減期を延長するように配列最適化される。
本発明のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示の配列最適化配列によってコードされるPCCAまたはPCCBポリペプチドの発現レベルである。タンパク質発現レベルは、1つ以上の発現系を用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、CHO細胞、HEK293細胞、Hepa1−6細胞、一次線維芽細胞で測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物から調製したインビトロ発現系、または精製された個々の成分の集合により調製したインビトロ発現系を用いて測定され得る。他の実施形態では、該タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サル等で測定される。
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、当該標的組織または細胞に有害な影響を与える可能性があり、タンパク質収量を低減し、もしくは発現産物の質を低下させ(例えば、タンパク質断片の存在もしくは発現タンパク質の封入体での沈殿に起因して)、または毒性を生じる。
場合によっては、PCCAもしくはPCCBポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を誘発する可能性があり、これは、(i)治療薬(例えば、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードするmRNA)、または(ii)かかる治療薬の発現産物(例えば、該mRNAによってコードされるPCCAもしくはPCCBポリペプチド)、または(iv)それらの組み合わせによって引き起こされ得る。従って、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸配列(例えば、mRNA)の配列最適化は、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはかかる核酸がコードするPCCAもしくはPCCBの発現産物によって誘発される免疫もしくは炎症反応を減少させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)は、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、化学的に修飾されたウラシル、例えば、プソイドウラシル、N1−メチルプソイドウラシル、5−メトキシウラシル等を含む。いくつかの実施形態では、該mRNAは、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするORFを含むウラシル修飾配列であり、該mRNAは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、化学的に修飾されたウラシル、例えば、プソイドウラシル、N1−メチルプソイドウラシル、または5−メトキシウラシルを含む。
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、mRNA)を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。該修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾、及び/または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが、化学的及び/または構造的に修飾される場合、該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、様々なシス作用性核酸構造によって提供される様々な機序によって制御及び調節され得る。例えば、ヘアピンまたは他の高次(例えば、偽結節)分子内mRNA二次構造を形成する天然に存在するシス作用性RNA要素は、ポリヌクレオチドに翻訳調節活性を提供することができ、該RNA要素は、特に該RNA要素が5’キャップ構造に近い5’UTRに位置する場合にポリヌクレオチドの翻訳開始に影響を与え、またはこれを調節する(Pelletier and Sonenberg(1985)Cell 40(3):515−526、Kozak(1986)Proc Natl Acad Sci 83:2850−2854)。
本開示は、修飾を含む合成ポリヌクレオチド(例えば、RNA要素)を提供し、該修飾は、所望の翻訳調節活性を与える。いくつかの実施形態では、本開示は、5’非翻訳領域(UTR)、開始コドン、ポリペプチドをコードする完全オープンリーディングフレーム、3’UTR、及び少なくとも1つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、該少なくとも1つの修飾は、所望の翻訳調節活性、例えば、mRNA翻訳の翻訳忠実度を推進及び/または向上させる修飾を与える。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、シス作用性調節活性である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドンでの、または開始コドンの近位の43S転写開始前複合体(PIC)またはリボソームの滞留時間の延長である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドンでの、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該完全なオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチド量の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該PICまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実度の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該PICまたはリボソームによる開始コドンスキャンニング漏れの阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該PICまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドン以外のmRNA内の任意のコドンでのポリペプチド合成開始の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該完全なオープンリーディングフレーム以外のmRNA内の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、上述の翻訳調節活性の1つ以上の組み合わせである。
5’UTR−001(上流UTR)
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号3)、
5’UTR−002(上流UTR)
(GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号89)、
5’UTR−003(上流UTR)(WO2016/100812参照)、
5’UTR−004(上流UTR)
(GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC)(配列番号90)、
5’UTR−005(上流UTR)
(GGGAGAUCAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号89)、
5’UTR−006(上流UTR)(WO2016/100812参照)、
5’UTR−007(上流UTR)
(GGGAGACAAGCUUGGCAUUCCGGUACUGUUGGUAAAGCCACC)(配列番号90)、
5’UTR−008(上流UTR)
(GGGAAUUAACAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号93)、
5’UTR−009(上流UTR)
(GGGAAAUUAGACAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号94)、
5’UTR−010、上流
(GGGAAAUAAGAGAGUAAAGAACAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号95)、
5’UTR−011(上流UTR)
(GGGAAAAAAGAGAGAAAAGAAGACUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号96)、
5’UTR−012(上流UTR)
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAUAUAUAAGAGCCACC)(配列番号97)、
5’UTR−013(上流UTR)
(GGGAAAUAAGAGACAAAACAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号98)、
5’UTR−014(上流UTR)
(GGGAAAUUAGAGAGUAAAGAACAGUAAGUAGAAUUAAAAGAGCCACC)(配列番号99)、
5’UTR−015(上流UTR)
(GGGAAAUAAGAGAGAAUAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号100)、
5’UTR−016(上流UTR)
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAAUUAAGAGCCACC)(配列番号101)、
5’UTR−017(上流UTR)、または
(GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUUUAAGAGCCACC)(配列番号102)、
5’UTR−018(上流UTR)5’UTR
(UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号88)。
5’UTR−019
(GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC)(配列番号64)
5’UTR v1 A開始
(AGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC)(配列番号199)
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号104)、
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号105)、または
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号106)、
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号107)、
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号108)、
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号109)。
142−3p 3’UTR(miR142−3p結合部位を含むUTR)
(UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUUCCAUAAAGUAGGAAACACUACACUGAGUGGGCGGC)(配列番号110)、
3’UTR−018(配列番号150参照)、
3’UTR(miR142とmiR126結合部位のバリアント1)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号111)
3’UTR(miR142とmiR126結合部位のバリアント2)
(UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC)(配列番号112)、または
3’UTR(miR142−3p結合部位のバリアント3)
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号4)。
本発明のポリヌクレオチドは、調節要素、例えば、マイクロRNA(miRNA)結合部位、転写因子結合部位、構造化mRNA配列及び/またはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、かかる調節要素を含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと言われる。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、本発明のPCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、さらに3’UTRを含む。
本開示はまた、5’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)はさらに、ポリAテールを含む。さらなる実施形態では、安定化のため、該ポリAテールの末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリAテールは、デス−3’ヒドロキシルテールを含む。
本発明は、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似の、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
本発明は、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。該終止コドンは、DNAの場合にはTGA、TAA及びTAGから、RNAの場合にはUGA、UAA及びUAGから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、DNAの場合には終止コドンTGA、またはRNAの場合には終止コドンUGA、さらに1つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、該追加の終止コドンは、TAAでもUAAでもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、3つの連続した終止コドン、4つの終止コドン、またはそれ以上を含む。
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするmRNAヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、5’から3’末端に以下を含む:
(i)上記の5’キャップ、
(ii)5’UTR、例えば、上記の配列、
(iii)PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示のPCCAまたはPCCBをコードする配列最適化核酸配列、
(iv)少なくとも1つの終止コドン、
(v)3’UTR、例えば、上記の配列、及び
(vi)上記のポリAテール。
本開示は、本発明のポリヌクレオチド(例えば、PCCAもしくはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)またはその相補体の作製方法も提供する。
本明細書に開示の本発明のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、インビトロ転写(IVT)システムを用いて転写され得る。該システムは、通常、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸(NTP)、RNase阻害剤及びポリメラーゼを含む。該NTPは、天然及び非天然(修飾)NTPを含めた本明細書に記載のものから選択され得るが、これらに限定されない。該ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ及び変異型ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示のポリヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼから選択され得るがこれらに限定されない。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第US20130259923号を参照されたい。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置換増幅(SDA)、転写増幅法(TMA)とも呼ばれる核酸配列ベース増幅(NASBA)、及び/またはローリングサークル増幅(RCA)は、本発明のポリヌクレオチドの1つ以上の領域の製造に利用され得る。リガーゼによってポリヌクレオチドまたは核酸を組み立てることも広く使用されている。
単離された目的のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を合成するために標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む単一のDNAまたはRNAオリゴマーを合成することができる。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いでライゲートすることができる。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、通常、相補的アセンブリーのために5’または3’オーバーハングを含む。
本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野で既知の方法、例えば、これらに限定されないが、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、ポリTビーズ、LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)inc.,Vedbaek,Denmark)またはHPLC系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、及び疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)によって行われ得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)、それらの発現産物、ならびに分解産物及び代謝産物は、当技術分野で既知の方法に従って定量され得る。
本開示は、上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、さらに送達剤を含む。
a.脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療薬及び/または予防薬、例えば、mRNAを哺乳類の細胞または器官へ送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、ほとんどまたは全く免疫原性を有さない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)と比較して免疫原性が低い。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療薬または予防薬、例えば、mRNAを含む製剤は、参照脂質(例えば、MC3、KC2、またはDLinDMA)及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数が高い。
(a)PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
(b)送達剤
を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸(例えば、PCCAまたはPCCB mRNA)は、脂質ナノ粒子(LNP)に製剤化される。脂質ナノ粒子は、通常、イオン性カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びPEG脂質成分と目的の核酸のカーゴを含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般に知られている成分、組成物、及び方法を用いて生成され得る。例えば、PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/52117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575及びPCT/US2016/069491を参照されたい。これらのすべては、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、本開示のイオン性脂質は、式(I)の化合物:
もしくはそれらのN−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のうちの1つ以上でよく、式中、
R1は、C5−30アルキル、C5−20アルケニル、−R*YR”、−YR”、及び−R”M’R’からなる群から選択され、
R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、C2−14アルケニル、−R*YR”、−YR”、及び−R*OR”からなる群から選択されるか、またはR2及びR3は、それらが結合している原子と一緒になって、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
R4は、水素、C3−6炭素環、−(CH2)nQ、−(CH2)nCHQR、−CHQR、−CQ(R)2、及び非置換C1−6アルキルからなる群から選択され、ここで、Qは、炭素環、ヘテロ環、−OR、−O(CH2)nN(R)2、−C(O)OR、−OC(O)R、−CX3、−CX2H、−CXH2、−CN、−N(R)2、−C(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)C(O)N(R)2、−N(R)C(S)N(R)2、−N(R)R8、−N(R)S(O)2R8、−O(CH2)nOR、−N(R)C(=NR9)N(R)2、−N(R)C(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、−N(OR)C(O)R、−N(OR)S(O)2R、−N(OR)C(O)OR、−N(OR)C(O)N(R)2、−N(OR)C(S)N(R)2、−N(OR)C(=NR9)N(R)2、−N(OR)C(=CHR9)N(R)2、−C(=NR9)N(R)2、−C(=NR9)R、−C(O)N(R)OR、及び−C(R)N(R)2C(O)ORから選択され、各nは、独立して、1、2、3、4及び5から選択され、
各R5は、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
各R6は、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−N(R’)C(O)−、−C(O)−、−C(S)−、−C(S)S−、−SC(S)−、−CH(OH)−、−P(O)(OR’)O−、−S(O)2−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、M”は、結合、C1−13アルキルまたはC2−13アルケニルであり、
R7は、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
R8は、C3−6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
R9は、H、CN、NO2、C1−6アルキル、−OR、−S(O)2R、−S(O)2N(R)2、C2−6アルケニル、C3−6炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1−3アルキル、C2−3アルケニル、及びHからなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1−18アルキル、C2−18アルケニル、−R*YR”、−YR”、及びHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3−15アルキル及びC3−15アルケニルからなる群から選択され、
各R*は、独立して、C1−12アルキル及びC2−12アルケニルからなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3−6炭素環であり、
各Xは、独立して、F、Cl、Br、及びIからなる群から選択され、
mは、5、6、7、8、9、10、11、12、及び13から選択され、ここで、R4が、−(CH2)nQ、−(CH2)nCHQR、−CHQR、または−CQ(R)2の場合、(i)Qは、nが1、2、3、4もしくは5の場合に−N(R)2ではなく、または(ii)Qは、nが1もしくは2の場合に5、6、もしくは7員のヘテロシクロアルキルではない。
もしくはそのN−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択され、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、水素、非置換C1−3アルキル、または−(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択される。例えば、mは、5、7、または9である。例えば、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、または−NHC(O)N(R)2である。例えば、Qは、−N(R)C(O)R、または−N(R)S(O)2Rである。
もしくはそのN−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、すべての可変要素は本明細書に定義する通りである。例えば、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、R4は、水素、非置換C1−3アルキル、または−(CH2)nQであり、ここで、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択される。例えば、mは、5、7、または9である。例えば、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、または−NHC(O)N(R)2である。例えば、Qは、−N(R)C(O)R、または−N(R)S(O)2Rである。
もしくはそのN−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択され、M1は、結合またはM’であり、R4は、水素、非置換C1−3アルキル、または−(CH2)nQ、であり、ここで、nは、2、3、または4であり、Qは、OH、−NHC(S)N(R)2、−NHC(O)N(R)2、−N(R)C(O)R、−N(R)S(O)2R、−N(R)R8、−NHC(=NR9)N(R)2、−NHC(=CHR9)N(R)2、−OC(O)N(R)2、−N(R)C(O)OR、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択される。
もしくはそれらのN−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Mは−C(O)O−または−OC(O)−であり、M”は、C1−6アルキルまたはC2−6アルケニルであり、R2及びR3は、独立して、C5−14アルキル及びC5−14アルケニルからなる群から選択され、nは、2、3、及び4から選択される。
もしくはそれらのN−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、nは、2、3、または4であり、m、R’、R”、及びR2〜R6は、本明細書に記載の通りである。例えば、R2及びR3の各々は、独立して、C5−14アルキル及びC5−14アルケニルからなる群から選択され得る。
もしくはそれらのN−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、lは、1、2、3、4、及び5から選択され、mは、5、6、7、8、及び9から選択され、M1は、結合またはM’であり、M及びM’は、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)−M”−C(O)O−、−C(O)N(R’)−、−P(O)(OR’)O−、−S−S−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、R2及びR3は、独立して、H、C1−14アルキル、及びC2−14アルケニルからなる群から選択される。例えば、M”は、C1−6アルキル(例えば、C1−4アルキル)またはC2−6アルケニル(例えば、C2−4アルケニル)である。例えば、R2及びR3は、独立して、C5−14アルキル及びC5−14アルケニルからなる群から選択される。
の化合物、またはその塩もしくは異性体の1つ以上でよく、式中、
Wは、
であり、
環Aは、
であり、
tは、1または2であり、
A1及びA2は、各々独立して、CHまたはNから選択され、
Zは、CH2であるかまたは存在せず、ここで、ZがCH2の場合、破線(1)及び(2)は、各々単結合を表し、Zが存在しない場合、破線(1)及び(2)は、両方とも存在せず、
R1、R2、R3、R4、及びR5は、独立して、C5−20アルキル、C5−20アルケニル、−R”MR’、−R*YR”、−YR”、及び−R*OR”からなる群から選択され、
RX1及びRX2は、各々独立して、HまたはC1−3アルキルであり、
各Mは、独立して、−C(O)O−、−OC(O)−、−OC(O)O−、−C(O)N(R’)−、−N(R’)C(O)−、−C(O)−、−C(S)−、−C(S)S−、−SC(S)−、−CH(OH)−、−P(O)(OR’)O−、−S(O)2−、−C(O)S−、−SC(O)−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
M*はC1−C6アルキルであり、
W1及びW2は、各々独立して、−O−及び−N(R6)−からなる群から選択され、
各R6は、独立して、H及びC1−5アルキルからなる群から選択され、
X1、X2、及びX3は、独立して、結合、−CH2−、−(CH2)2−、−CHR−、−CHY−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−(CH2)n−C(O)−、−C(O)−(CH2)n−、−(CH2)n−C(O)O−、−OC(O)−(CH2)n−、−(CH2)n−OC(O)−、−C(O)O−(CH2)n−、−CH(OH)−、−C(S)−、及び−CH(SH)−からなる群から選択され、
各Yは、独立して、C3−6炭素環であり、
各R*は、C1−12アルキル及びC2−12アルケニルからなる群から選択され、
各Rは、独立して、C1−3アルキル及びC3−6炭素環からなる群から選択され、
各R’は、独立して、C1−12アルキル、C2−12アルケニル、及びHからなる群から選択され、
各R”は、独立して、C3−12アルキル、C3−12アルケニル及び−R*MR’からなる群から選択され、
nは、1〜6の整数であり、
環Aが、
の場合、
i)X1、X2、及びX3のうちの少なくとも1つは、−CH2−ではなく、及び/または
ii)R1、R2、R3、R4、及びR5のうちの少なくとも1つは、−R”MR’である。
本明細書に開示の脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、1つ以上のリン脂質、例えば、1つ以上の飽和もしくは(ポリ)不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び1つ以上の脂肪酸部分を含む。
またはその塩であり、式中、
各R1は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または、任意に、2つのR1が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、3つのR1が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
のものであり、
L2の各例は、独立して、結合または任意に置換されるC1−6アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるC1−6アルキレンの1つのメチレン単位は、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で任意に置き換えられ、
R2の各例は、独立して、任意に置換されるC1−30アルキル、任意に置換されるC1−30アルケニル、または任意に置換されるC1−30アルキニルであり、任意に、ここで、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられ、
RNの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
pは1または2であり、
ただし、該化合物は、下記式のものではない:
式中、R2の各例は、独立して、非置換のアルキル、非置換のアルケニル、または非置換のアルキニルである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部(例えば、修飾されたコリン基)を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を備えたリン脂質は、修飾された4級アミンを備えたDSPC、またはそのアナログである。例えば、式(IV)の実施形態では、少なくとも1つのR1はメチルではない。ある特定の実施形態では、少なくとも1つのR1は、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、下記式のうちの1つ:
またはその塩のものであり、式中、
各tは、独立して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各uは、独立して、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
各vは、独立して、1、2、または3である。
ある特定の実施形態では、式(IV)の化合物は、式(IV−a):
またはその塩のものである。
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を備えたDSPC、またはそのアナログである。本明細書に記載の「修飾された尾部」とは、短縮されたまたは延長された脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖を有する尾部、置換が導入された脂肪族鎖を有する尾部、1つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖を有する尾部、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、(IV)の化合物は、式(IV−a)、またはその塩のものであり、ここで、R2の少なくとも1つの例は、R2の各例は、任意に置換されるC1−30アルキルであり、ここで、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、−C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、−NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、−S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、−N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、−N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられる。
またはその塩のものであり、式中、
各xは、独立して、0と30を含めた0〜30の整数であり、
Gの各例は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
のうちの1つまたはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、4級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない(例えば、nは2ではない)。従って、ある特定の実施形態では、有用なリン脂質。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)脂質を含み得る。
またはその塩であって、式中、
R3は−OROであり、
ROは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1と100を含めた1〜100の整数であり、
L1は、任意に置換されるC1−10アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるC1−10アルキレンの少なくとも1つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、−OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で置き換えられ、
Dは、クリックケミストリーによって得られる部分であるか、または生理的条件下で切断可能な部分であり、
mは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、
Aは、式:
のものであり、
L2の各例は、独立して、結合または任意に置換されるC1−6アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるC1−6アルキレンの1つのメチレン単位は、任意に、O、N(RN)、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、またはNRNC(O)N(RN)で置き換えられ、
R2の各例は、独立して、任意に置換されるC1−30アルキル、任意に置換されるC1−30アルケニル、または任意に置換されるC1−30アルキニルであり、任意に、ここで、R2の1つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、C(O)N(RN)、NRNC(O)、−NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、−C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、−S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられ、
RNの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Bは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
pは1または2である。
またはその塩のものである。
またはその塩であって、式中、
R3は−OROであり、
ROは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
rは、1と100を含めた1〜100の整数であり、
R5は、任意に置換されるC10−40アルキル、任意に置換されるC10−40アルケニル、または任意に置換されるC10−40アルキニルであり、任意に、R5の1つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、N(RN)、O、S、C(O)、−C(O)N(RN)、NRNC(O)、NRNC(O)N(RN)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)N(RN)、−NRNC(O)O、C(O)S、SC(O)、C(=NRN)、C(=NRN)N(RN)、NRNC(=NRN)、NRNC(=NRN)N(RN)、C(S)、C(S)N(RN)、NRNC(S)、NRNC(S)N(RN)、S(O)、OS(O)、S(O)O、OS(O)O、OS(O)2、−S(O)2O、OS(O)2O、N(RN)S(O)、S(O)N(RN)、N(RN)S(O)N(RN)、OS(O)N(RN)、N(RN)S(O)O、S(O)2、N(RN)S(O)2、S(O)2N(RN)、N(RN)S(O)2N(RN)、OS(O)2N(RN)、またはN(RN)S(O)2Oで置き換えられ、
RNの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
、
DOPEを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式VIIを有する化合物を含むPEG脂質を含む。
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて1つ以上の成分を含み得る。例えば、該脂質組成物は、1つ以上の透過性促進分子、炭水化物、ポリマー、表面変質剤(例えば、界面活性剤)、または他の成分を含み得る。例えば、透過性促進分子は、米国特許出願公開第2005/0222064号に記載の分子であり得る。炭水化物としては、単糖(例えば、グルコース)及び多糖(例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及びアナログ)を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化される。従って、本開示は、(i)本明細書に記載の化合物等の送達剤を含む脂質組成物、及び(ii)PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物もまた提供する。かかるナノ粒子組成物では、本明細書に開示の脂質組成物は、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
a.リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、該ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを高めることができ、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができるため、ポリヌクレオチド指向タンパク質産生の効力を高めるために使用され得る。該リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、該ポリヌクレオチドの安定性を高めるためにも使用され得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、リピドイドとともに製剤化され得る。これらリピドイドを含めて複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製するため、局所及び/または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされたタンパク質の産生によって判断される該ポリヌクレオチドの効率的な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路が挙げられるがこれらに限定されない様々な手段で投与され得る。
いくつかの実施形態における、注射(例えば、筋肉内または皮下注射)用の本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を下げ、それにより、組織透過性を上げる(Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。代替的に、該ヒアルロニダーゼは、筋肉内または皮下投与されたポリヌクレオチドに曝露される細胞数を増加させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、ナノ粒子模倣体内に封入及び/またはナノ粒子模倣体に吸収される。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、プリオン及び細胞等であるがこれらに限定されない生物または粒子の送達機能を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン粒子に封入され得る(例えば、国際公開第WO2012006376号ならびに米国公開第US20130171241号及び第US20130195968号参照。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる)。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を、送達用の自己組織化ナノ粒子、または両親媒性高分子(AM)中に含む。AMは、ポリ(エチレングリコール)に共有結合したアルキル化糖骨格を有する生体適合性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中、該AMは自己組織化してミセルを形成する。核酸の自己組織化ナノ粒子は、国際出願第PCT/US2014/027077号に記載されており、AM及びAMの形成方法は、米国公開第US20130217753号に記載されている。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)及びカチオンまたはアニオン、例えば、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+及びそれらの組み合わせを含む。例示的な製剤は、ポリマー及び、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第6,265,389号及び第6,555,525号に記載の金属カチオンと複合化したポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組み合わせを含み得る。カチオン性ナノ粒子中またはカチオン性ナノ粒子を含む1つ以上のデポー中のポリヌクレオチドを送達することで、長時間作用型デポーとして作用すること及び/またはヌクレアーゼによる分解速度を低下させることにより、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質との製剤である本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び1つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の作製方法の非限定的な例は、米国特許第8,501,824号に記載されている。該アミノ酸脂質製剤は、当該ポリヌクレオチドに結合しかつこれを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの放出は、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第7,098,032号、第6,897,196号、第6,426,086号、第7,138,382号、第5,563,250号、及び第5,505,931号に記載の酸に不安定なリンカーによってもたらされ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を高分子電解質間複合体に含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが1つ以上のアニオン性分子と複合化された場合に形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間複合体ならびに高分子電解質間複合体の作製方法の非限定的な例は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第8,524,368号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を結晶性ポリマー系に含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び/または結晶性部分を含む末端単位を備えたポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第8,524,259号(参照することにより全体として本明細書に組み込まれる)に記載されている。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)ならびに天然及び/または合成ポリマーを含む。該ポリマーとしては、ポリエテン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l−リジン)(PLL)、PEGグラフトPLL、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分岐ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、マルチブロックコポリマー、ポリ[α−(4−アミノブチル)−L−グリコール酸](PAGA)、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート(polypropylfumerate)、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルソエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含み、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させるための、及び/または該ポリヌクレオチドの生体内分布を変更(例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的化することによって)するための、及び/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるためのペプチド及び/またはタンパク質とともに製剤化される(例えば、国際公開第WO2012110636号及び第WO2013123298号)。いくつかの実施形態では、該ペプチドは、米国公開第US20130129726号、第US20130137644号及び第US20130164219号に記載のものであり得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド(例えば、PCCAまたはPCCBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)を含み、該ポリヌクレオチドは、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または、融合タンパク質(例えば、標的化基及び治療用タンパク質もしくはペプチドを有する)を一緒に産生する2つのコード領域を含む。該コンジュゲートは、該ナノ粒子を組織もしくは生物のニューロンに選択的に誘導するか、または血液脳関門の通過を支援するペプチドであり得る。
本開示は、反復投与された生物活性剤等の活性薬剤に対するABCの影響を低減するための化合物、組成物及びそれらの使用方法を提供する。容易に分かるように、投与された活性薬剤に対するABCの影響を低減または完全に除去することで、その半減期を延長し、ひいてはその有効性を高める。
LNPを含めた本明細書に提供する様々な化合物及び組成物は、インビボ投与に際してABC活性を促進しない。これらのLNPは、多くのアッセイ、例えば、これらに限定されないが、下記のもののいずれか、及び実施例の方法のサブセクションを含めた実施例のセクションに開示のアッセイのいずれかを通して特徴づけられ及び/または特定され得る。
本開示で提供するある特定の組成物は、B細胞、例えば、B1aもしくはB1b細胞(CD19+CD5+)及び/または従来のB細胞(CD19+CD5−)を活性化しない。B1a細胞、B1b細胞、または従来のB細胞の活性化は、多くの方法で測定される場合があり、そのいくつかを以下に示す。B細胞集団は、脾細胞または末梢血単球細胞(PBMC)の分画B細胞集団または未分画集団として提供され得る。後者の場合、該細胞集団を、最適なLNPと一定期間インキュベートし、その後、さらなる分析用に採取してもよい。代替的に、上清を採取して分析してもよい。
B1a細胞、B1b細胞、または従来のB細胞の活性化は、CD86等の後期活性化マーカーを含めたB細胞活性化マーカーの発現の増加として示され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画B細胞は、脾細胞集団として、またはPBMC集団として提供され、最適なLNPとともに特定の期間インキュベートされ、その後基準のB細胞マーカー、例えば、CD19について、及び活性化マーカー、例えば、CD86について染色され、例えば、フローサイトメトリーを用いて分析される。適切な陰性対照は、同じ集団を培地とともにインキュベートし、その後同じ染色及び可視化ステップを行うことを含む。該陰性対照と比較した試験集団のCD86発現の増加は、B細胞の活性化を示す。
B細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイでも評価され得る。例えば、活性化は、目的のLNPによる曝露後の、IL−6及び/またはTNF−アルファ等のサイトカインの産生及び/または分泌を通して評価され得る。
目的のLNPを評価するため、及びさらにかかるLNPを特徴づけるため、LNPのB細胞との会合または結合を用いてもよい。会合/結合及び/または取り込み/内在化は、検出可能に標識化された、例えば、蛍光標識されたLNPを用い、様々なインキュベーション時間の後にB細胞内またはB細胞上のかかるLNPの位置を追跡することによって評価され得る。
本明細書では、治療薬等の薬剤を封入し得るLNPを、ABCを促進することなくヒト対象に送達する方法も提供する。
本発明はさらに、LNPの投与と関連する用量制限毒性の基礎にある機序の解明に部分的に基づいている。かかる毒性には、急性か慢性にかかわらず、凝固障害、播種性血管内凝固症候群(DIC、消費性凝固障害とも呼ばれる)、及び/または血管内血栓が含まれ得る。ある場合には、LNPと関連する用量制限毒性は、急性期反応(APR)または補体活性化関連の仮性アレルギー(CARPA)である。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、PCC関連の疾患、障害または状態の治療及び/または予防のための調製、製造及び治療的使用に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、代謝性アシドーシス(例えば、血液及び組織のアシドーシス)、高アンモニア血症、及び/または高グリシン血症の治療及び/または予防に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、プロピオニルCoA及び/または分岐鎖アミノ酸異化の代謝産物の蓄積、例えば、組織(例えば、肝臓)、全血(例えば、乾燥血液スポット)、血漿、血清、RBC、尿、及び/または他の液体における蓄積を治療及び/または予防するために使用される。
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類等)またはヒト対象におけるプロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)タンパク質及び/またはプロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)の発現レベル(複数可)の測定、特定及び/または観察を特徴とする。動物としては、正常、健康または野生型動物、ならびにPAの理解及びその治療に使用するための動物モデルが挙げられる。例示的な動物モデルとしては、げっ歯類モデル、例えば、PCCAマウスとも呼ばれるPCCA欠損マウス(ヌルまたは低形成)が挙げられる。
PA患者では、PCC酵素活性が、正常な生理的活性レベルと比較して低下している。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物(例えば、げっ歯類、霊長類等)またはヒト対象におけるPCCAまたはPCCBタンパク質の活性レベル(複数可)(すなわち、酵素活性レベル(複数可))の測定、特定及び/または観察を特徴とする。活性レベルは、生体サンプル中の酵素活性レベルを特定するための当技術分野で承認されている任意の方法で測定または特定され得る。本明細書で使用される、「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、好ましくは、サンプルの体積、質量もしくは重量、またはサンプル中の総タンパク質当たりの酵素活性を意味する。例示的な実施形態では、該「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、液体(例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿等)の1ミリリットル当たりの単位を単位として記載されるか、または、サンプル中の組織の重量当たりの単位もしくはタンパク質(例えば、総タンパク質)の重量当たりの単位を単位として記載される。酵素活性の単位(「U」)は、単位時間当たりに加水分解される基質の重量または質量を単位として記載され得る。本発明のある特定の実施形態では、U/ml血漿またはU/mgタンパク質(組織)を単位として記載されるPCC活性を特徴とし、ここで、単位(「U」)は、1時間当たりに加水分解されるnmolの基質(すなわち、nmol/時間)を単位として記載される。
本発明のさらなる態様は、あるサンプルにおいて特定されるバイオマーカーのレベル(複数可)を、例えば、同じ患者由来、別の患者由来、対照由来及び/または同じもしくは異なる時点由来の別のサンプルにおける同じもしくは別のバイオマーカーのレベル(例えば、参照レベル)と比較して、及び/または生理的レベル、及び/またはレベルの上昇、及び/または超生理学的なレベル、及び/または対照のレベルと比較して特定することを特徴とする。当業者であれば、バイオマーカーの生理的レベル、例えば、正常もしくは野生型動物、正常もしくは健常な対象等におけるレベル、特に、健康及び/または正常に機能する対象に特有のレベル(複数可)に詳しいであろう。本明細書で使用される、「レベルの上昇」という句は、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健常な対象、例えば、ヒト対象において通常見られるより多い量を意味する。本明細書で使用される、「超生理学的」という用語は、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健常な対象、例えば、ヒト対象において通常見られるより多い量を意味し、任意に、有意に上昇した生理反応を生成する。本明細書で使用される、「比較して(comparing)」または「比較して(compared to)」という用語は、好ましくは、例えば、バイオマーカー(複数可)のレベルの2つ以上の値の数学的比較を意味する。従って、当業者には、少なくとも2つのかかる値を互いに比較した場合、該値の1つが別の値または値の群より高いか、低いか、または同一であるかどうかが容易に分かるであろう。例えば、対照値と比較するという観点から、比較して(comparing)または比較して(comparison to)は、例えば、投与前の当該対象(例えば、PAの患者)または正常もしくは健常な対象における参照の血液(例えば、乾燥血液スポット)、血清、血漿、尿及び/または組織(例えば、肝臓)のプロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、プロピオニルグリシン、グリシン、乳酸またはアンモニアレベルと比較してであり得る。
本発明のある特定の態様は、上記に開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤に関する。
(i)PCCAまたはPCCBポリペプチド(例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント)をコードする配列最適化ヌクレオチド配列(例えば、ORF)を含むポリヌクレオチド(例えば、RNA、例えば、mRNA)であって、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、N1−メチルプソイドウラシルまたは5−メトキシウラシルを含み(例えば、該ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%はN1−メチルプソイドウラシルまたは5−メトキシウラシルである)、さらに、miRNA結合部位、例えば、miR−142に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR−142−3pまたはmiR−142−5p結合部位)及び/またはmiR−126に結合するmiRNA結合部位(例えば、miR−126−3pまたはmiR−126−5p結合部位)を含む該ポリヌクレオチド、ならびに
(ii)例えば、式(I)を有する化合物、例えば、化合物1〜232のいずれか、例えば、化合物II、式(III)、(IV)、(V)、もしくは(VI)を有する化合物、例えば、化合物233〜342のいずれか、例えば、化合物VI、または式(VIII)を有する化合物、例えば、化合物419〜428のいずれか、例えば、化合物I、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物II、化合物VI、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、モル比約50:10:38.5:1.5で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物II、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、モル比約47.5:10.5:39.0:3.0で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物VI、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、モル比約50:10:38.5:1.5で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物VI、DSPC、コレステロール、及び化合物IまたはPEG−DMGを、例えば、モル比約47.5:10.5:39.0:3.0で含む。
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、治療効果のある結果をもたらす任意の経路で投与され得る。これらとしては、経腸(腸へ)、胃腸、硬膜外(epidural)(硬膜へ)、経口(口腔を介して)、経皮、硬膜外(peridural)、脳内(大脳へ)、脳室内(脳室へ)、皮膚上(皮膚への塗布)、皮内、(皮膚自体に)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈へ)、静脈内ボーラス、静脈点滴、動脈内(動脈へ)、筋肉内(筋肉へ)、心臓内(心臓へ)、骨内注入(骨髄へ)、髄腔内(脊髄へ)、腹腔内(腹膜への注入または注射)、膀胱内注入、硝子体内(目を通して)、海綿体内注射(病的腔へ)腔内(陰茎の基部へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚を通した拡散)、経粘膜(粘膜を通した拡散)、経膣、吹送(吸引)、舌下、唇下、浣腸、点眼薬(結膜上)、点耳薬、耳介(耳の中または耳を介して)、頬側(頬に向けて)、結膜、皮膚、歯科(歯(複数可)へ)、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸透、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内(軟骨の中)、尾内(馬尾内)、大槽内(大槽の中)、角膜内(角膜の中)、歯の歯冠内、冠動脈内(冠状動脈の中)、海綿体内(陰茎海綿体の拡張可能な空間内)、椎間板内(椎間板の中)、導管内(腺管の中)、十二指腸内(十二指腸の中)、硬膜内(硬膜の中または下)、表皮内(表皮へ)、食道内(食道へ)、胃内(胃の中)、歯肉内(歯肉の中)、回腸内(小腸の遠位部の中)、病変内(局所病変の中または局所病変に直接導入される)、管腔内(管の内腔の中)、リンパ内(リンパの中)、髄内(骨の髄腔の中)、髄膜内(髄膜の中)、眼内(眼の中)、卵巣内(卵巣の中)、心膜内(心膜の中)、胸膜内(胸膜の中)、前立腺内(前立腺の中)、肺内(肺またはその気管支の中)、洞内(副鼻腔または眼窩周囲洞の中)、脊髄内(脊柱の中)、滑膜内(関節の滑液腔の中)、腱内(腱の中)、精巣内(精巣の中)、髄腔内(脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液の中)、胸腔内(胸部の中)、管内(器官の細管の中)、鼓室内(中耳の中)、血管内(血管(複数可)の中)、心室内(心室の中)、イオン導入(可溶性塩のイオンが体の組織に移動する電流による)、洗浄法(開放創または体腔を浸すまたは洗い流すこと)、喉頭(喉頭に直接)、経鼻胃(鼻を通して胃の中)、閉鎖包帯法(局所経路投与後、当該領域を閉塞する包帯で覆う)、眼科(外眼部へ)、口腔咽頭(口腔及び咽頭へ直接)、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器(局所的または全身的効果のために経口または経鼻で吸入することによる気道の中)、眼球後方(橋後方または眼球後方)、心筋内(心筋に入る)、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤(胎盤を介してまたは横断して)、経気管(気管の壁を介して)、鼓室内(鼓室を横切ってまたは介して)、尿管(尿管へ)、尿道(尿道へ)、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁かん流、心臓かん流、フォトフェレシスまたは脊柱が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過できるように投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路用の製剤は、少なくとも1つの不活性成分を含み得る。
a.キット
本発明は、特許請求にかかる本発明のヌクレオチドを都合よく及び/または効果的に使用するための様々なキットを提供する。通常、キットは、使用者が、ヒト対象(複数可)の複数の処置を実施できるようにするのに十分な、及び/または複数の実験を実施できるようにするのに十分な量及び/または数の成分を含む。
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができる装置を提供する。これらの装置は、それを必要とする対象、例えば、ヒト患者に対して、即座に送達することが可能な製剤にポリヌクレオチドを合成するための試薬を安定な製剤で含む。
カテーテル及びルーメンを用いる方法及び装置を使用して、本発明のポリヌクレオチドを、単回、複数回、または分割投与スケジュールで投与することができる。かかる方法及び装置は、国際出願公開第WO2013151666号に記載されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
電流を利用する方法及び装置を使用して、本発明のポリヌクレオチドを、本明細書に教示の単回、複数回、または分割投与レジメンに従って送達することができる。かかる方法及び装置は、国際出願公開第WO2013151666号に記載されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
本開示をさらに容易に理解できるようにするため、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書で別段の定めのない限り、以下の用語の各々は、以下に示す意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通して示される。
当業者は、日常の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明に従う特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
A.三リン酸経路
キメラポリヌクレオチドの2つの領域または部分は、三リン酸化学種を用いて結合または連結することができる。本方法によれば、100ヌクレオチド以下の第一の領域または部分は、5’一リン酸及び末端3’desOHまたはブロックされたOHで化学的に合成することができる。該領域が80ヌクレオチドを超える場合、結合用に2本の鎖として合成することができる。
該キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作製することができる。かかるセグメントは以下のものを含む:
(a)通常の3’OHを含む、キャップされ、保護された5’セグメント(SEG.1)
(b)ポリペプチドのコード領域を含むことができ、通常の3’OHを含む5’三リン酸セグメント(SEG.2)
(c)コルジセピンを含むか、または3’OHを含まないキメラポリヌクレオチドの3’末端(例えば、テール)用の5’一リン酸セグメント(SEG.3)。
cDNAの調製用のPCR手順は、Kapa Biosystems(Woburn,MA)製2xKAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを用いて行うことができる。このシステムは、2xKAPA ReadyMix12.5μl、フォワードプライマー(10μM)0.75μl、リバースプライマー(10μM)0.75μl、鋳型cDNA−100ng、及びdH2O希釈25.0μlまでを含む。このPCR反応条件は次の通りであり得る:95℃で5分間及び98℃で20秒間を25サイクル、その後58℃で15秒間、その後72℃で45秒間、その後72℃で5分間、次に4℃で終了まで。
インビトロ転写反応では、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成することができる。かかる均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。投入するヌクレオチド三リン酸(NTP)ミックスは、天然及び非天然のNTPを用いて作製することができる。
1 鋳型cDNA−1.0μg
2 10×転写緩衝液(400mM トリス−HCl pH8.0、190mM MgCl2、50mM DTT、10mMスペルミジン)−2.0μl
3 カスタムNTP(各25mM)−7.2μl
4 RNase阻害剤−20U
5 T7RNAポリメラーゼ−3000U
6 dH2O−20μlまで。及び
7 37℃で3時間〜5時間インキュベーション。
ポリヌクレオチドのキャッピングは、IVT RNA60μg〜180μg及びdH2O 72μlまでを含む混合物を用いて行うことができる。この混合物を65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性することができ、その後ただちに氷に移すことができる。
cDNAにポリTがない場合、最終産物のクリーンアップ前にポリAテール付加を実施する必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μl)、RNase阻害剤(20U)、10xテール付加緩衝液(0.5M トリス−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μl)、20mM ATP(6.0μl)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH2Oを123.5μlまでを混合すること、及び37℃で30分間インキュベートすることにより行うことができる。ポリAテールがすでに転写物にある場合、このテール付加反応を省略して直接AmbionのMEGACLEAR(商標)キット(Austin,TX)でのクリーンアップに進むことができる(500μgまで)。ポリAポリメラーゼは、場合によっては、酵母で発現される組み換え酵素である。
ポリヌクレオチドの5’−キャッピングは、5’−グアノシンキャップ構造を生成する以下の化学的RNAキャップアナログを用いて、製造者のプロトコルに従い、インビトロ転写反応の過程で同時に完了することができる:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ]、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。修飾RNAの5’−キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて、転写後に「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)を生成して完了することができる。キャップ1構造は、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素及び2’−Oメチル−トランスフェラーゼの両方を用いて生成することができる。キャップ2構造は、キャップ1構造から、5’末端から3番目のヌクレオチドを2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて2’−O−メチル化することにより生成することができる。キャップ3構造は、キャップ2構造から、5’末端から3番目のヌクレオチドを2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて2’−O−メチル化することにより生成することができる。酵素は組み換え供給源から得ることができる。
A.タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、及び36時間後、培地に分泌されたタンパク質の量をELISAでアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、翻訳的に能力がより高いキャップ構造の合成ポリヌクレオチドに相当する。
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を用いて純度を比較することができる。電気泳動による単一の統合されたバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは筋状のバンドを有するポリヌクレオチドと比較して高純度の生成物に相当する。単一のHPLCピークを有する合成ポリヌクレオチドもまた、より高純度の生成物に相当する。より高効率のキャッピング反応により、より高純度のポリヌクレオチド集団が提供される。
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、及び36時間後、培地に分泌された炎症性サイトカイン、例えば、TNF−アルファ及びINF−ベータの量をELISAでアッセイすることができる。より高レベルの炎症性サイトカインを培地に分泌するポリヌクレオチドは、免疫を活性化するキャップ構造を含むポリヌクレオチドに相当する。
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理の後、LC−MSによってキャッピング反応効率を分析することができる。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、遊離のヌクレオチド及びLC−MSで検出可能なキャップされた5’−5−三リン酸キャップ構造の混合物が得られる。LC−MSスペクトルでのキャップされた生成物の量は、該反応物の合計ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に相当する。キャッピング反応効率がより高いキャップ構造は、LC−MSに従うより多量のキャップされた生成物を有する。
個々のポリヌクレオチド(200〜400ng、体積20μl中)または逆転写PCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA)のウェルにロードし、12〜15分間、製造業者のプロトコルに従って実行することができる。
修飾ポリヌクレオチドを含むTE緩衝液(1μl)をNanodropのUV吸光度の読み取りに使用し、化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収量を定量することができる。
ポリヌクレオチドは、細胞への添加の前、インビトロ実験用に、ポリヌクレオチドをリピドイドと設定された比で混合することにより製剤化することができる。インビボ製剤は、全身の循環を促進するために追加の成分を加えることが必要な場合がある。これらリピドイドがインビボでの作用に適した粒子を形成する能力を調べるため、siRNA−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを出発点として使用することができる。粒子の生成後、ポリヌクレオチドを加え、複合体と一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを用いて測定することができる。
A.エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルを調製し、1、2、3、または4つの質量分析装置を用いたエレクトロスプレーイオン化(ESI)用の製造業者のプロトコルに従って分析することができる。生体サンプルは、タンデム型ESI質量分析システムを用いて分析することもできる。
対象に投与される1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルを調製し、マトリクス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)用の製造業者のプロトコルに従って分析することができる。
1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルをトリプシン酵素で処理し、その中に含まれるタンパク質を消化することができる。得られたペプチドを液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析(LC/MS/MS)で分析することができる。これらのペプチドを質量分析計で断片化して診断パターンを得ることができ、これをコンピュータアルゴリズムによりタンパク質配列データベースに一致させることができる。消化サンプルを希釈し、所与のタンパク質について1ng以下の出発物質を得ることができる。単純緩衝液のバックグラウンド(例えば、水または揮発性塩)を含む生体サンプルは、直接の溶液中消化に適しており、より複雑なバックグラウンド(例えば、界面活性剤、非揮発性塩、グリセロール)は、サンプルの分析を容易にするためにさらなるクリーンアップステップを必要とする。
PCCAポリペプチド、すなわち、配列番号1、またはPCCBポリペプチド、すなわち、配列番号15をコードする配列最適化ポリヌクレオチドを実施例1〜11に記載の通りに合成し、特徴づけた。ヒトPCCAアイソフォーム1及びヒトPCCBアイソフォーム1をコードするmRNAを、以下に記載の実施例用に調製し、実施例1〜11に記載の通りに合成し、特徴づけた。
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号4)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
UCAAGCUUUUGGACCCUCGUACAGAAGCUAAUACGACUCACUAUAGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号88)
3’UTR:
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCAUGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号150)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号178)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC(配列番号64)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号112)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号3)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号112)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
AGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号199)
3’UTR:
UGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号4)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
AGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号199)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号178)
別の例示的な構築物では、5’UTR及び3’UTR配列は、以下の通りである:
5’UTR:
AGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC(配列番号199)
3’UTR:
UGAUAAUAGUCCAUAAAGUAGGAAACACUACAGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGC(配列番号112)
PCCA及びPCCBの発現を、マウス及びヒト供給源の両方に由来する様々な細胞株で特徴づける。細胞を標準的な条件で培養し、その細胞を溶解緩衝液に入れることにより細胞抽出物を得る。比較のため、適切な対照も調製する。PCCA及びPCCBの発現を分析するため、溶解物サンプルをこの試験細胞から調製し、ドデシル硫酸リチウムのサンプルローディング緩衝液と混合し、標準的なウェスタンブロット分析に供する。PCCAの検出に使用する抗体は、市販の抗PCCA抗体である。市販の抗PCCB抗体をPCCBの検出に使用する。ロード対照の検出に使用する抗体は、抗クエン酸シンターゼ(ウサギポリクローナル、ab96600、Abcam)である。内因性PCCAまたはPCCBの局在を調べるため、免疫蛍光分析を細胞で行う。PCCA発現は市販の抗PCCA抗体を用いて検出し、PCCB発現は、市販の抗PCCB抗体を用いて検出する。特定のオルガネラの位置は、既存の市販製品で検出することができる。例えば、ミトコンドリアはMitotrackerを用いて検出することができ、核は、DAPIで染色することができる。画像解析は、Zeiss ELYRAイメージングシステムで行われる。
マウスまたはヒト肝細胞株でのヒトPCCA及びPCCBのインビトロ発現を測定するため、Hepa1−6細胞(ATCC(登録商標)HB−8064(商標))、PCCA欠損Hep3B細胞、PCCB欠損Hep3B細胞、または患者の線維芽細胞を用いる。細胞を6ウェルプレート(BD Biosciences,San Jose,USA)に、トランスフェクションの1日前に播種する。野生型もしくは配列最適化ヒトPCCA及びPCCB、またはGFP対照を含むmRNA製剤を、ウェルあたり1または2μgのmRNA及び3または6μlのLipofectamin MessagerMaxを含むOPTI−MEM100μLを用いてトランスフェクトし、インキュベートする。
インビトロPCC活性のアッセイを、PCCAまたはPCCB配列を含むmRNAの導入後に外因的に発現されるPCCAまたはPCCBが活性であるかどうかを特定するために行う。
Hepa1−6細胞、PCCA欠損またはPCCB欠損症患者の線維芽細胞を、ヒトPCCAもしくはPCCB、またはGFP対照を含むmRNA製剤でトランスフェクトする。細胞を、Lipofectamin−MessagerMaxでトランスフェクトし、上記の実施例14に記載の通りに溶解する。適切な対照もまた調製する。
外因性PCCA及びPCCBが機能的PCC複合体を形成することができるかどうかを評価するため、インビトロ活性アッセイをトランスフェクトされたHepa1−6細胞、PCCA欠損またはPCCB欠損症患者の線維芽細胞溶解物を酵素活性の供給源として使用して行った。初めに、溶解物をPCC基質、ATP、プロピオニルCoA、及び14C放射性同位体標識重炭酸ナトリウムと混合する。この反応混合物を37Cで15分間、Thermo−mixerでインキュベートした。この反応を5%TCAとボルテックスすることで停止した。これらの反応管を次に13,000gで5分間遠心し、その上清を採取し、Microbeta2シンチレーションカウンターを製造業者の推奨通りに用いてPCCタンパク質複合体の活性に由来する放射性同位体標識酵素反応生成物であるメチルマロニルCoAを定量した。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAまたはPCCBをコードする連結されたヌクレオチドの少なくとも第一の領域を含むことができ、これは、上記実施例に従って構築、発現、及び特徴づけすることができる。同様に、このポリヌクレオチド配列は、活性が増加または低下したPCCAまたはPCCBの発現をもたらす1つ以上の突然変異を含み得る。さらに、PCCAまたはPCCBをコードするこのポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードする構築物の一部であり得る。
A.ナノ粒子組成物の製造
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば、一方がポリヌクレオチドを含み、他方が脂質成分を有する2つの流体流のマイクロ流体工学及びT字形接合部での混合で作製することができる。
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を用いて、ナノ粒子組成物の粒径、多分散性指数(PDI)及びゼータ電位を、粒径の特定においては1×PBS、及びゼータ電位の特定においては15mMのPBSで特定することができる。
PCCA含有mRNAがインビボでPCCA発現を促進する能力を評価するため、ヒトPCCAをコードするmRNAをプロピオン酸血症(PA)の動物モデルに導入する。
Pcca−/−(A138T)低形成マウスから採取した乾燥血液スポット(DBS)におけるPAマーカーであるC3/C2及び2−MCのレベルを、ヒトPCCAをコードする1−メチル−プソイドウリジン修飾mRNAまたは野生型ヒトPCCA mRNAの2回の1mg/kgでの投与の、−4(投与の4日前)、2、7、10、14、21、及び24日後に測定した。注射に用いるこれらの修飾PCCA mRNA構築物は、配列番号38及び57〜59で表される。このmRNAをマウスへの送達用に脂質ナノ粒子(MC3)に製剤化した。PBSまたはGFPをコードする対照mRNAもまたPcca−/−(A138T)低形成マウスに注射した。ヒトPCCAをコードするmRNAを、最初の注射の22日後に1mg/kgで2回目のIV注射をした。24日目に採血し、また、組織を収穫した。C3/C2及び2−MCの血中レベルをLC−MS/MSを用いて各時点について測定した。
特に急性の代謝代償不全過程で尿素生成の二次性の阻害に起因してPA患者で蓄積する疾患関連の代謝産物であるアンモニアのレベルを、Pcca−/−(A138T)低形成マウスの血漿において、1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA1mg/kgまたはGFPをコードする対照mRNAの単回IV注射の21日後に測定した。注射に使用した修飾PCCA構築物は、配列番号38及び57〜62で表される。このmRNAをマウスへの送達用に脂質ナノ粒子(MC3)に製剤化した。アンモニアのレベルを、臨床分析機器を用いて測定した(Pesh−Imam et al,Clin.Chem.,1978, 24(11):2044−2046参照。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる)。アンモニアアッセイの定量の下限(LLOQ)は23.4μmol/Lであった。溶血した血漿サンプルは分析から除いた。図2Aに示す通り、PCCA mRNA構築物のいくつかは、アンモニアのレベルを、単回IV投与の21日後に、対照mRNAまたはPBS単独に対して、野生型アンモニアレベルの範囲内に低減した。
PCCB遺伝子の発現に関して低形成のマウスモデルを用いる。低形成pccb変異型マウスは、プロピオン酸血症の症状を示すことが予想され、C3、3HP及び2−メチルクエン酸の上昇を示す。ヒトPCCB及び/またはPCCAをコードする修飾mRNAを、この変異型マウスモデルに静脈注射し、PCCB及びPCCA発現ならびにPCC活性を調べる。PAのバイオマーカー(2−MC、C3/C2、及び3−HP)のレベルもまた、低形成pccbマウスで調べる。
インビボでPCC活性を効果的に増加させることができるPCCA mRNAの用量を決定するため、1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)0.5mg/kgまたは2mg/kgのいずれかの単回IV尾静脈注射を野生型CD−1マウスに施した。このmRNAは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子(化合物II/PEG−DMG)に製剤化した。PCC活性を、mRNA投与の24時間、48時間、72時間、または96時間後に実施例15に記載の通りにMicrobeta2シンチレーションカウンターを用い、このマウスから採取した肝臓溶解物から単離したミトコンドリア画分で評価した。ミトコンドリア基質タンパク質5μgをPCC反応にロードした。対照マウスにはPBSまたはルシフェラーゼ構築物を投与した。図3は、PCCA mRNAの0.5mg/kg単回投与は、PCCA mRNAの2mg/kg単回投与より高いPCC活性を、投与後24時間及び48時間で生じたことを示す。PCC活性は時間とともに増加し、mRNA投与後72時間で最大レベルに達した。
1−メチル−プソイドウリジン修飾mRNA構築物がPCCAを発現し、PCC活性を増加させる能力をインビボで調べるため、各構築物(PCCA_11〜PCCA_20及びPCCA−014、それぞれ、配列番号28〜38で表される)0.5mg/kgの単回IV尾静脈注射を野生型FVBマウスに施した。このmRNAは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子(化合物II/PEG−DMG)に製剤化した。PCCA発現を、このマウスから採取した肝臓溶解物から単離したミトコンドリア画分のキャピラリー電気泳動により特定した。PCC活性は、mRNA投与の72時間後に実施例15に記載の通りにMicrobeta2シンチレーションカウンターを用い、マウス肝臓ミトコンドリア画分で評価した。ミトコンドリア基質タンパク質5μgをPCC反応にロードした。対照マウスにはルシフェラーゼ構築物を投与したか、または未処理のままにした。図4は、PCCA mRNA構築物が、単回投与の72時間後に対照に対してPCC活性を増加させたことを示す。図5は、PCCAをコードするmRNAが、マウスでの単回投与後にPCCAの発現を増加させることができることを示す。PCCA_16、PCCA_18、及びPCCA_20構築物等、より高レベルでPCC活性を増加させたmRNA構築物(図4参照)のいくつかは、インビボでより高いPCCA発現レベルを生じた(図5参照)。PCCA_18をその後のインビボ試験での使用に選択した。
PCC活性を、1μgもしくは2μgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)、またはGFP対照によるトランスフェクションの24時間または48時間後、GM371 PCCA欠損症患者の線維芽細胞で測定した。PCC活性は実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質30μgをPCC反応にロードした。図6は、PCCA mRNAがPCCA欠損症患者の線維芽細胞でPCC活性を増加させたことを示す。
PCC活性を、1μg、2μgもしくは3μgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCBをコードするmRNA(PCCB−014、配列番号49)、またはGFP対照によるトランスフェクションの24時間または48時間後、GM1298 PCCB欠損症患者の線維芽細胞(Coriell Institute)で測定した。PCC活性は実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質30μgをPCC反応にロードした。図9は、PCCB mRNAがPCCB欠損症患者の線維芽細胞でPCC活性を増加させたことを示す。
PCC活性を、1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)及びヒトPCCBをコードするRNA(PCCB−014、配列番号49)による、異なるPCCA:PCCB mRNAモル比(A:B比)でのトランスフェクションの24時間または40時間後のGM371 PCCA欠損症患者の線維芽細胞で測定した。GFP mRNAでのトランスフェクションを対照として使用した。各比群の全mRNAをPCCA mRNA1μg(モル量)と等しくした。PCC活性を実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質およそ25μgをPCC反応にロードした。図12Aは、PCCA:PCCBモル比1:1(A:B比1:1)が、トランスフェクションの24及び40時間後の両方でPCCA欠損症患者の線維芽細胞において最も高くPCC活性を増加させたことを示す。
PCC活性を、1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)及びヒトPCCBをコードするmRNA(PCCB−014、配列番号49)による、異なるPCCA:PCCB mRNAモル比(A:B比)でのトランスフェクションの24時間後のGM1298 PCCB欠損症患者の線維芽細胞で測定した。GFP mRNAでのトランスフェクションを対照として使用した。各比群の全mRNAをPCCA mRNA1μg(モル量)、またはPCCA mRNA2μg(モル量)と等しくした。PCC活性を実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質およそ26μgをPCC反応にロードした。図12Bは、PCCA:PCCBモル比1:1(A:B比1:1)が、トランスフェクションの24時間後にPCCB欠損症患者の線維芽細胞において最も高くPCC活性を増加させたことを示す。
PCC活性を、PCCA欠損PA患者(GM371 PCCA欠損症患者の線維芽細胞、Coriell Institute)及びPCCB欠損PA患者(GM1298 PCCB欠損症患者の線維芽細胞、Coriell Institute)から単離したヒト線維芽細胞(3〜4×105/ウェル、条件当たりn=2)において、0.5または1μgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA_18、配列番号35)単独、ヒトPCCBをコードするmRNA(PCCB_18、配列番号46)単独、またはヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA_18、配列番号35)及びPCCBをコードするmRNA(PCCB_18、配列番号46)のモル比1:1によるトランスフェクション(リポフェクタミンによる)の24時間後に測定した。対照細胞は、GFPをコードするmRNA1μgでトランスフェクトした。PCC活性をこれらのトランスフェクトした細胞溶解物で、実施例15に記載の通りに放射活性アッセイを用いて測定した。簡潔には、溶解物をPCC基質、ATP、プロピオニルCoA、及び14C放射性同位体標識重炭酸ナトリウムと混合した。この反応混合物を37℃で15分間インキュベートし、次いで5%TCAを添加して反応を停止させ、その後13,000gで5分間遠心分離した。上清を採取し、Microbeta2シンチレーションカウンターを用いて放射性同位体標識酵素反応生成物であるメチルマロニルCoAを定量した。図13Aは、PCCA及びPCCBをコードするmRNAのモル比1:1での共トランスフェクションが、PCCA欠損及びPCCB欠損の線維芽細胞の両方で、PCCAまたはPCCBを単独でコードするmRNAのトランスフェクションと比較して高いレベル(5〜25倍)でPCC酵素活性を増加させたことを示す。これらのデータは、両方のサブタイプ(PCCA欠損及びPCCB欠損)において、機能的PCC酵素の産生が、PCCA及びPCCB mRNAの両方のトランスフェクションに起因して、PCCA mRNA単独及びPCCB mRNA単独でのトランスフェクションと比較して増加することを示唆している。
PCC活性を、1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)及びヒトPCCBをコードするmRNA(PCCB−014、配列番号49)による、異なるPCCA:PCCB mRNAモル比(A:B比)でのトランスフェクションの24時間または40時間後のHepa1−6肝細胞(ATCC(登録商標)HB−8064(商標))で測定した。GFP mRNAでのトランスフェクションを対照として使用した。各比群の全mRNAをPCCA mRNA1μg(モル量)と等しくした。場合によっては、各比群の全mRNAをPCCA mRNA2μg(「2倍用量」)と等しくした。PCC活性を実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質およそ25μgをPCC反応にロードした。図14は、PCCA:PCCBモル比1:1(A:B比1:1)が、トランスフェクションの24及び40時間後の両方でHepa1−6肝細胞において最も高くPCC活性を増加させたことを示す。
PCC活性を、Hepa1−6細胞において、1μg、2μg、3μg、または4μgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)、またはGFP対照によるトランスフェクションの24時間、48時間または72時間後に測定した。PCC活性を実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質30μgをPCC反応にロードした。図15は、PCCA mRNA単独では、調べた条件のほとんどでHepa1−6肝細胞のPCC活性を有意に増加させることはなかったことを示す。
PCC活性を、Hepa1−6細胞において、1μgまたは3μgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCBをコードするmRNA(PCCB−014、配列番号49)、またはGFP対照によるトランスフェクションの24時間後に測定した。さらに、0.5μgのヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA−014、配列番号38)及び0.5μgのPCCBをコードするmRNA(PCCB−014、配列番号49)を細胞にトランスフェクトした。PCC活性を実施例15に記載の通りに評価した。タンパク質30μgをPCC反応にロードした。図18は、PCCB mRNAを単独でトランスフェクトした場合にはPCC活性の有意な増加がなかったが、PCCA及びPCCBを一緒にトランスフェクトした場合には、PCC活性が顕著に増加したことを示す。
PCCA及びPCCB mRNAの共投与が用量依存的にPCC活性を増加させることができるかどうかを特定するため、0.25mg/kg、0.5mg/kgまたは1mg/kgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードする(PCCA_18、配列番号35)及びヒトPCCBをコードする(PCCB_18、配列番号46)PCCA及びPCCB mRNAをモル比1:1で雄のPcca−/−(A138T)低形成マウスに単回IVボーラス尾静脈注射により投与した。これらのmRNAは、マウス(n=4/群)への送達用に脂質ナノ粒子(化合物II/PEG−DMG)に製剤化した。対照として、ルシフェラーゼをコードするmRNA1mg/kgをPcca−/−(A138T)低形成マウスまたは野生型FVBマウス(n=4)に単回IV尾静脈注射により注射した。mRNA投与の3日前にマウスから採血した。マウスをIV注射の2日後に屠殺し、このマウスから採取した肝臓溶解物から単離したミトコンドリア画分にて、肝臓のPCC活性を、Microbeta2シンチレーションカウンターを用いて実施例15に記載の通りに評価した。Pcca−/−(A138T)及びWTマウスの肝臓から単離したミトコンドリア画分におけるPCCA及びPCCBのタンパク質発現は、キャピラリー電気泳動を用いて評価し、クエン酸シンターゼのタンパク質レベルに正規化した。
6ヶ月間の反復投与試験を行い、PCCA及びPCCB mRNAの反復IV投与がPAの生化学的異常、成長、及び心臓質量の症状を改善することができるかどうか評価した。Pcca−/−(A138T)低形成マウス(雌)に、0.5mg/kgまたは1mg/kgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードする(PCCA_18、配列番号35)及びヒトPCCBをコードする(PCCB_18、配列番号46)PCCA及びPCCB mRNA、または1mg/kgのルシフェラーゼをコードするmRNAを対照として注射した。マウスに、以下の通り、IV尾静脈注射により、mRNAを6回投与した:0日目に1回目の投与、49日目に2回目の投与、77日目に3回目の投与、107日目に4回目の投与、135日目に5回目の投与、及び163日目に6回目の投与。マウスを、1回目の投与の4日前に採血し、最後の6回目の投与が施されてから48時間後に試験のため屠殺した。これらのmRNAは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子(化合物II/PEG−DMG)に製剤化した。PAのバイオマーカーであるC3/C2カルニチン比、2−MC、及び3−HPのレベルを165日間にわたってマウスから採取した血液でLC−MS/MSを用いて測定した(n=6/群)。定量の下限(LLOQ)は、2−MCならびにC3及びC2カルニチンについては0.5μMであり、3−HPについては25μMであった。3HPについては、LLOQ未満の値は25μMとして報告し、PCCA及びPCCB mRNAで処理したマウスの多くが血漿3HPに関して<LLOQであった。野生型のレベルは、n=6WT FVBマウスに基づいて、2MC及び3HPについてはLLOQ未満であり、C3/C2カルニチン比については0.06±0.02であった。表7は、試験デザインの要約を示す。
*ヒトPCCA+PCCB mRNAに起因する単回投与後の生化学的反応(血漿2MC、C3/C2カルニチン比及び3HPレベル)の持続期間を評価するための適応デザイン。2回目の投与は、血漿バイオマーカーレベルが基底の処理前レベルに回復した後に施した。本試験におけるその後の投与間隔は、1回目の投与後に観察される生化学的反応の持続時間を基に選択した。Pcca−/−(A138T)マウスの採血スケジュール:1回目の注射の3日前、6時間及び2、7、10、14、21、28、35、42、49日後、2回目〜5回目の投与の各注射の1、2、3、4週間後、及び6回目の注射の2日後。
mRNAでコードされたヒトPCCA及びPCCBタンパク質の薬物動態(PK)及び肝臓におけるPCC酵素活性ならびに薬力学的(PD)反応を特徴づける試験を行った。Pcca−/−(A138T)低形成マウス(雄雌混合)に、1mg/kgの1−メチル−プソイドウリジンで修飾された、ヒトPCCAをコードする(PCCA_18、配列番号35)及びヒトPCCBをコードする(PCCB_18、配列番号46)PCCA及びPCCB mRNA、または1mg/kgのルシフェラーゼをコードするmRNAを対照として、IV尾静脈注射により注射した。以前の試験では、PBSと比較して、ルシフェラーゼmRNAを含むLNPを投与したPcca−/−(A138T)マウスでは、肝臓のPCCA及びPCCBタンパク質レベルならびにPCC酵素活性に差が示されなかった(データは示さず)。これらのmRNAは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子(化合物II/PEG−DMG)に製剤化した。マウスを、mRNAの単回注射後6時間、24時間、48時間、7日、14日、21日または28日で屠殺した(時点当たりn=3〜4匹)。各時点について、肝臓のPCC活性を、実施例15に記載の通りにMicrobeta2シンチレーションカウンターを用い、肝臓溶解物から単離したミトコンドリア画分で測定した。血漿のPAバイオマーカー(2−MC、C3/C2比、3−HP、及びアンモニア)も測定した。2−MC、C3/C2カルニチン比、及び3−HPの血漿レベルは、各時点でLC−MS/MSを用いて測定した。定量の下限(LLOQ)は2−MCならびにC3及びC2カルニチンについては0.5μMであり、3−HPについては25μMであった。ヒトPCCA及びPCCBタンパク質の絶対的定量もまたLC−MS/MSで測定した。ホモジナイズしたマウス肝臓に、ヒト野生型PCCA(AQAVHPGYGFLSENK、これは、ヒトPCCA A138T変異体を認識しない)及びPCCB(TVGIVGNQPK)に特異的な同位体標識したシグネチャーペプチド(天然のリジンのC及びN原子を13C及び15N同位体で置き換えたもの、Thermo Scientific Pierce)を内部標準として添加した。対照ルシフェラーゼmRNAを投与したマウスを用いて、肝臓におけるベースラインのPCCA及びPCCBタンパク質レベルならびにPCC酵素活性を評価した。
PCCのホロ酵素は、ヒトでは分子量およそ800kDaのアルファ(6)ベータ(6)12量体である。1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードする(PCCA_18、配列番号35)及びヒトPCCBをコードする(PCCB_18、配列番号46)PCCA及びPCCB mRNAが、適切な分子量のPCC12量体を形成するPCCA及びPCCBタンパク質を発現することができるかどうかを特定するため、Pcca−/−(A138T)低形成マウスに、ヒトPCCA及びPCCBをコードするmRNAの単回1mg/kg用量を、尾静脈注射により注射した。肝臓溶解物のミトコンドリア画分を注射の2日後のマウスから単離し、500ulループのSuperose 6カラム(GE Healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質を分離する。画分を次いでプールし、タンパク質を濃縮する。プールした画分におけるPCCA及びPCCBの発現ならびにPCC複合体の濃縮を実施例13に記載の通りにキャピラリー電気泳動を用いて評価し、PCC活性を実施例15に記載の通りに評価する。PCC複合体の形成もまた、ブルーネイティブポリアクリルアミドゲルに続いてウェスタンブロッティングによって評価することができる(参照することにより全体として本明細書に組み込まれるJiang et al.,J.Biol.Chem.,2005, 280(30):27719−27に記載の通り)。PCCA及びPCCB mRNAの共注射が、ミトコンドリアで分子量およそ800kDaのPCC複合体の形成をもたらすこと、すなわち、mRNAによって発現されるヒトPCCA及びPCCBが12量体をマウスで形成することができることが示される。
心筋症は、プロピオン酸血症のヒト患者で認められ、Pcca−/−(A138T)低形成マウスは、野生型マウスに対して肥大した心臓を有する(Guenzel et al.,Mol.Ther.,1316−1323, 2013、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。実施例33、図22Cも参照のこと)。心臓の重量をPcca−/−(A138T)低形成マウスで評価し(年齢及び性別適合野生型マウスと比較して)、これら低形成マウスが心筋症を有するかどうかを特定する。心臓の重量(体重に対して正規化)の増加及び心臓肥大が検出された場合、Pcca−/−(A138T)低形成マウスに、複数回(例えば、0.5mg/kgまたは1mg/kgで)の1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCA及びヒトPCCBをコードするPCCA及びPCCB mRNA、またはルシフェラーゼをコードするmRNAを対照として、実施例31に記載の通りに一定期間投与し、心筋症がPCCA及びPCCB mRNAを投与することで改善され得るかどうかを特定する。
肝臓組織像をPcca−/−(A138T)低形成マウスにおいてヘマトキシリン及びエオシン(H&E)染色により特定する(年齢適合野生型マウスと比較する)。肝臓病変が検出された場合、Pcca−/−(A138T)低形成マウスに、複数回の1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCA及びヒトPCCBをコードするPCCA及びPCCB mRNA、またはルシフェラーゼをコードするmRNAを対照として一定期間投与し、肝臓病変がPCCA及びPCCB mRNAを投与することで改善され得るかどうかを特定する。Pcca−/−(A138T)低形成マウスの肝臓は、これらマウスにおいてALT/ASTレベルに有意差がないことが認められた(データは示さず)ことから、野生型マウスの肝臓と有意差がないことが予想される。
PCCA及びPCCBタンパク質の細胞内共局在化を、合計25ngの1−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトPCCAをコードするmRNA(PCCA_18、配列番号35)及びPCCBをコードするmRNA(PCCB_18、配列番号46)、またはルシフェラーゼ対照でのトランスフェクションの24時間後にGM371 PCCA欠損症患者の線維芽細胞(96ウェルプレートで9,000細胞/ウェル)で調べた。市販の抗PCCAモノクローナル抗体(Santa Cruz #sc−393527)及び抗PCCBポリクローナル抗体(Novus #NBP1−85886)を用いてmRNAによって発現されるPCCA及びPCCBを免疫蛍光顕微鏡検査法を用いて検出した。Mitotracker Redを用いてミトコンドリアの同一性を確認し、DAPIを用いて核を染色した。画像解析は、Zeiss ELYRAイメージングシステムで行った。図24Aに示す通り、投与したmRNAから翻訳されたPCCA及びPCCBは、PCCA欠損症患者の線維芽細胞のミトコンドリアとともに共局在し、mRNAによりコードされたタンパク質が細胞の適切な細胞内部分に局在することを示した。これらの結果は、mRNAによって発現されたPCCA及びPCCBが細胞で複合体を形成することも示唆した。ルシフェラーゼをコードするmRNAでトランスフェクトした陰性対照細胞ではPAACの染色もPCCBの染色も存在しなかった。図24Bは、ルシフェラーゼmRNAをトランスフェクトしたPCCA欠損症患者の線維芽細胞において顕著なルシフェラーゼ発現が存在したことを示す。
1ヶ月間の薬理学的研究を行い、ヒトPCCA mRNA(SE_PCCA_018、配列番号203)及びPCCB mRNA(SE_PCCB_018、配列番号204)を2つの異なる脂質ナノ粒子(LNP)で製剤化することの効果を評価した。これらのmRNAをモル比1:1で、化合物II/PEG−DMGまたは化合物II/化合物Iのいずれかに製剤化し、Pcca−/−(A138T)マウス(n=6/群)に、2回の0.5mg/kg用量を、0日目及び28日目に静脈注射した。対照マウスには、トリス−スクロース緩衝液を0日目及び28日目に注射した。血漿を、注射の前、ならびに1回目のIV投与後2、8、14、21及び28日目、ならびに2回目のIV投与の2日後に採取した。血漿2−MC、C3/C2カルニチン比及び3−HP濃度を各時点でLC−MS/MSで定量した。肝臓のPCC活性は、2回目の投与の2日後、屠殺時に測定した。データは平均±SDで示す。LLOQは、血漿2−MC、C3及びC2カルニチンについて0.5μMであった。3HPのLLOQは希釈なしまたは1:2希釈のサンプルについて25または50μMであった。3−HPについては、LLOQ未満の値を、希釈なしまたは1:2希釈のサンプルに対して、それぞれ、25または50μM(すなわち、LLOQ)として報告した。野生型のバイオマーカーレベルは、n=6野生型マウスに基づいて、血漿2MC及び3HPについてはLLOQ未満であり、血漿C3/C2カルニチン比については0.04±0.005であった。
Claims (97)
- プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNAを含む医薬組成物であって、それを必要とするヒト対象に対して単回静脈内投与として施された場合、十分に、
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、前記対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血、及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓のプロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させる、前記組成物。 - プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNAを含む医薬組成物であって、それを必要とするヒト対象に対して単回静脈内投与として施された場合、十分に、
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、前記対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血、及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓のプロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させる、前記組成物。 - プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNA、及びプロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むmRNAを含む医薬組成物であって、それを必要とするヒト対象に対して単回静脈内投与として施された場合、十分に、
(i)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、正常なPCC活性レベルの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%以内に増加させ、
(ii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、肝臓組織におけるPCC活性レベルを、前記対象のベースラインのPCC活性レベルもしくはプロピオン酸血症(PA)を有するヒト対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加させ、
(iii)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血、及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(iv)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオニル−L−カルニチン(C3)、2−メチルクエン酸(2−MC)、3−ヒドロキシプロピオン酸(3OHPA)、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿レベルもしくはPAを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下させ、
(v)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、プロピオン酸の血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血及び/または肝臓のプロピオン酸レベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、全血及び/または肝臓プロピオン酸レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させ、及び/または
(vi)投与後少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、もしくは少なくとも4週間、C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、及び/または尿レベルを、前記対象のベースラインの血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルもしくはPAを有する患者における参照の血漿、血清、及び/または尿のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアレベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍低下させる、前記組成物。 - さらに送達剤を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記送達剤が脂質ナノ粒子を含み、前記脂質ナノ粒子が、
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、または
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物Iを含む、請求項4に記載の医薬組成物。 - 前記PCCAポリペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含み、前記PCCBポリペプチドが、配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ORFが、配列番号2、5〜14、16〜27、196、197、及び198からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、マイクロRNA(miR)結合部位を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNAが、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはTLR7及び/またはTLR8を発現しかつ炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する細胞で発現される、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−126、miR−142、miR−144、miR−146、miR−150、miR−155、miR−16、miR−21、miR−223、miR−24、miR−27、miR−26a、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロRNA用である、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR126−3p、miR−142−3p、miR−142−5p、miR−155、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロRNA用である、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−142−3p結合部位である、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記マイクロRNA結合部位が、前記mRNAの3’UTRに位置する、請求項8〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、配列番号4、配列番号112、または配列番号178の3’UTR配列と、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一である核酸配列を含む3’UTRを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、配列番号3、配列番号64、または配列番号199の5’UTR配列と、少なくとも90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一である核酸配列を含む5’UTRを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、5’末端キャップを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、キャップ2、キャップ4、5’メチルGキャップ、またはそのアナログを含む、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、ポリA領域を含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ポリA領域が、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約100ヌクレオチドの長さである、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記ポリA領域が、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120ヌクレオチドの長さを有する、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行請求項のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル(ψ)、N1−メチルプソイドウラシル(m1ψ)、1−エチルプソイドウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
- 前記ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、N1−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される、請求項21または22に記載の医薬組成物。
- 前記グアニンの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が化学的に修飾される、請求項21または22に記載の医薬組成物。
- 前記シトシンの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が化学的に修飾される、請求項21〜24のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記アデニンの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が化学的に修飾される、請求項21〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト対象が、プロピオン酸血症(PA)を有する、請求項1〜26のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト対象が、タンパク質の食事制限中である、請求項1〜27のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ヒト対象が、タンパク質の食事制限中ではない、請求項1〜27のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- (i)5’UTR、
(ii)ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号2及び5〜14からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する前記ORF、
(iii)終止コドン、ならびに
(iv)3’UTR
を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含むポリヌクレオチド。 - 前記ORFが、配列番号2及び5〜14からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項30に記載のポリヌクレオチド。
- 前記PCCAポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸からなる、請求項30または31に記載のポリヌクレオチド。
- (i)5’UTR、
(ii)ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号16〜27、196、197、及び198からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の配列同一性を有する前記ORF、
(iii)終止コドン、ならびに
(iv)3’UTR
を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を含むポリヌクレオチド。 - 前記ORFが、配列番号16〜27、196、197、及び198からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項33に記載のポリヌクレオチド。
- 前記PCCBポリペプチドが、配列番号15のアミノ酸からなる、請求項33または34に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、マイクロRNA(miR)結合部位を含む、請求項30〜35のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNAが、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはTLR7及び/またはTLR8を発現しかつ炎症性サイトカイン及び/またはケモカインを分泌する細胞で発現される、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−126、miR−142、miR−144、miR−146、miR−150、miR−155、miR−16、miR−21、miR−223、miR−24、miR−27、miR−26a、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロRNA用である、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR126−3p、miR−142−3p、miR−142−5p、miR−155、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロRNA用である、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、miR−142−3p結合部位である、請求項36に記載のポリヌクレオチド。
- 前記マイクロRNA結合部位が、前記mRNAの3’UTRに位置する、請求項36〜40のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記3’UTRが、配列番号4、配列番号112、または配列番号178の3’UTRと、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一である核酸配列を含む、請求項30〜41のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’UTRが、配列番号3、配列番号64、または配列番号199の5’UTRと、少なくとも90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%同一である核酸配列を含む、請求項30〜42のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、5’末端キャップを含む、請求項30〜43のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、キャップ2、キャップ4、5’メチルGキャップ、またはそのアナログを含む、請求項44に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、ポリA領域を含む、請求項30〜45のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約100ヌクレオチドの長さである、請求項46に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120ヌクレオチドの長さを有する、請求項46に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項30〜48のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル(ψ)、N1−メチルプソイドウラシル(m1ψ)、1−エチルプソイドウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項49に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ウラシルの少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約99%、または100%が、N1−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される、請求項49または50に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号28〜38、63、65、及び203からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項30〜32または36〜51のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号39〜50、66、67、200〜202、204、及び205からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項33〜47のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- (i)5’末端キャップ、
(ii)配列番号3、配列番号64、または配列番号199の核酸配列を含む5’UTR、
(iii)ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号2及び5〜14からなる群から選択される配列を含む前記ORF、
(iv)配列番号4、配列番号112、または配列番号178の核酸配列を含む3’UTR、ならびに
(v)ポリA領域
を含むmRNAを含むポリヌクレオチド。 - (i)5’末端キャップ、
(ii)配列番号3、配列番号64、または配列番号199の核酸配列を含む5’UTR、
(iii)ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)であって、配列番号16〜27、196、197、及び198からなる群から選択される配列を含む前記ORF、
(iv)配列番号4、配列番号112、または配列番号178の核酸配列を含む3’UTR、ならびに
(v)ポリA領域
を含むmRNAを含むポリヌクレオチド。 - 前記5’末端キャップが、キャップ0、キャップ1、ARCA、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’−フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、2−アジドグアノシン、キャップ2、キャップ4、5’メチルGキャップ、またはそのアナログを含む、請求項54または55に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、少なくとも約10、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、または少なくとも約90ヌクレオチドの長さである、請求項54〜56のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、約10〜約200、約20〜約180、約50〜約160、約70〜約140、または約80〜約120ヌクレオチドの長さを有する、請求項54〜56のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項54〜58のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル(ψ)、N1−メチルプソイドウラシル(m1ψ)、1−エチルプソイドウラシル、2−チオウラシル(s2U)、4’−チオウラシル、5−メチルシトシン、5−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号28〜38、63、65、及び203からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項54に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号39〜50、66、67、200〜202、204、及び205からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項55に記載のポリヌクレオチド。
- 前記5’末端キャップが、キャップ1を含み、前記ポリヌクレオチドのウラシルのすべてがN1−メチルプソイドウラシルである、請求項61または62に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリA領域が、100ヌクレオチドの長さである、請求項63に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項30〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、及び送達剤を含む、医薬組成物。
- 第一のポリヌクレオチドが、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むものであり、第二のポリヌクレオチドが、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含むものである、請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチド、及び送達剤を含む、医薬組成物。
- 前記送達剤が脂質ナノ粒子を含み、前記脂質ナノ粒子が、
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)コレステロール、及び(iii)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物VI、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)PEG−DMGもしくは化合物I、
(i)化合物II、(ii)コレステロール、及び(iii)化合物I、または
(i)化合物II、(ii)DSPCもしくはDOPE、(iii)コレステロール、及び(iv)化合物Iを含む、請求項65または66に記載の医薬組成物。 - プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)ポリペプチドを、それを必要とするヒト対象において発現する方法であって、前記対象に対して、請求項1、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項30〜32、36〜52、54、56〜61、63、もしくは64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)ポリペプチドを、それを必要とするヒト対象において発現する方法であって、前記対象に対して、請求項2、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項33〜51、53、55〜60、もしくは62〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオニルCoAカルボキシラーゼアルファ(PCCA)ポリペプチド及びプロピオニルCoAカルボキシラーゼベータ(PCCB)ポリペプチドを、それを必要とするヒト対象において発現する方法であって、前記対象に対して、請求項1〜29もしくは65〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの有効量を投与することを含む前記方法であり、ここで、前記第一のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、前記方法。
- ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチド、及びヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、請求項70に記載の方法。
- 第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物を投与することを含む請求項70に記載の方法であって、前記第一の医薬組成物が、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチドを含み、前記第二の医薬組成物が、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む、前記方法。
- プロピオン酸血症(PA)の治療、予防、または発症及び/または進行の遅延の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項30〜32、36〜52、54、56〜61、63、もしくは64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオン酸血症(PA)の治療、予防、または発症及び/または進行の遅延の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項2、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項33〜51、53、55〜60、もしくは62〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオン酸血症(PA)の治療、予防、または発症及び/または進行の遅延の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1〜29もしくは65〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの有効量を投与することを含む前記方法であり、ここで、前記第一のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、前記方法。
- ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチド、及びヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、請求項75に記載の方法。
- 第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物を投与することを含む請求項75に記載の方法であって、前記第一の医薬組成物が、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチドを含み、前記第二の医薬組成物が、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む、前記方法。
- プロピオン酸の血中レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項30〜32、36〜52、54、56〜61、63、もしくは64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオン酸の血中レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項2、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項33〜51、53、55〜60、もしくは62〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- プロピオン酸の血中レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1〜29もしくは65〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの有効量を投与することを含む前記方法であり、ここで、前記第一のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、前記方法。
- ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチド、及びヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、請求項80に記載の方法。
- 第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物を投与することを含む請求項80に記載の方法であって、前記第一の医薬組成物が、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチドを含み、前記第二の医薬組成物が、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む、前記方法。
- C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項30〜32、36〜52、54、56〜61、63、もしくは64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項2、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項33〜51、53、55〜60、もしくは62〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1〜29もしくは65〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの有効量を投与することを含む前記方法であり、ここで、前記第一のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、前記方法。
- ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチド、及びヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、請求項85に記載の方法。
- 第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物を投与することを含む請求項85に記載の方法であって、前記第一の医薬組成物が、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチドを含み、前記第二の医薬組成物が、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む、前記方法。
- 請求項68〜87のいずれか1項に記載の方法であって、
(i)前記プロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、前記対象のベースラインのプロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルもしくはPAを有する患者における参照のプロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下し、
(ii)前記プロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、前記対象のベースラインのプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルもしくはPAを有する患者における参照のプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルと比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下し、
(iii)前記プロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日以内で、正常なプロピオン酸の血中及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下し、
(iv)前記プロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、正常なプロピオン酸の血漿、血清、及び/または尿レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下し、
(v)前記C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日間、前記対象のベースラインの血漿、血清、全血及び/または肝臓のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニア、もしくはPAを有する患者における参照のC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、もしくは少なくとも100%低下し、及び/または
(vi)前記C3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、少なくとも120時間、6日、1週間、8日、9日、10日、11日、12日、14日、18日、もしくは21日以内に、正常なC3、2−MC、3OHPA、及び/またはアンモニアの血漿、血清、全血、及び/または肝臓レベルと比較して、少なくとも10倍以内、少なくとも5倍以内、少なくとも2倍以内、もしくは少なくとも1.5倍以内に低下する、前記方法。 - PCC活性の増加の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項30〜32、36〜52、54、56〜61、63、もしくは64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- PCC活性の増加の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項2、4〜29、65、もしくは67のいずれか1項に記載の医薬組成物、または請求項33〜51、53、55〜60、もしくは62〜64のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
- PCC活性の増加の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項1〜29もしくは65〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物または請求項30〜64のいずれか1項に記載の2つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つの有効量を投与することを含む前記方法であり、ここで、前記第一のポリヌクレオチドは、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含み、前記第二のポリヌクレオチドは、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む、前記方法。
- ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチド、及びヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、請求項91に記載の方法。
- 第一の医薬組成物及び第二の医薬組成物を投与することを含む請求項91に記載の方法であって、前記第一の医薬組成物が、ヒトPCCAポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第一のポリヌクレオチドを含み、前記第二の医薬組成物が、ヒトPCCBポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む第二のポリヌクレオチドを含む、前記方法。
- 請求項68〜93のいずれか1項に記載の方法であって、
(i)前記対象におけるPCC活性レベルが、単回投与後少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、もしくは少なくとも120時間、PAを有する対象における参照PCC活性レベルと比較して、少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、もしくは少なくとも50倍増加し、及び/または
(ii)前記医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの単回投与が前記対象に施された12時間後、前記対象におけるPCC活性が、前記対象のベースラインのPCC活性と比較して、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも300%、少なくとも400%、少なくとも500%、もしくは少なくとも600%増加する、前記方法。 - 前記PCC活性が、前記対象の肝臓または血中で増加する、請求項89〜94のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象への前記投与が、約1週間に1回、約2週間に1回、または約1ヶ月に1回である、請求項68〜95のいずれか1項に記載の方法。
- 前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが静脈内投与される、請求項68〜96のいずれか1項に記載の方法。
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