ES2618127T3 - Composiciones de dúplex de cebador de extremos cohesivos y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un sistema que comprende un ácido nucleico diana, una polimerasa, y un cebador parcialmente de doble hebra que comprende una primera y una segunda hebras de ácido nucleico dispuestas en (1) una región no específica de diana de doble hebra, (2) una región específica de diana de doble hebra, y (3) una región específica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de ácido nucleico, en el que la región no específica de diana de doble hebra tiene una energía libre estándar que está dentro del 10 % de la energía libre estándar para la región específica de diana de hebra individual unida al ácido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de ácido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al ácido nucleico diana.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de duplex de cebador de extremos cohesivos y metodos de uso Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad segun 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional estadounidense con numero de serie 61/407.291, presentada el 27 de octubre de 2010.
Campo de la invencion
Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a cebadores de acido nucleico parcialmente de doble hebra y a su uso, por ejemplo, en metodos de smtesis de acido nucleico.
Antecedentes de la invencion
Los acidos nucleicos son portadores de informacion vital en biologfa, y la deteccion, amplificacion e identificacion de acidos nucleicos han constituido la base de un amplio sector de la biotecnologfa. En particular, se han usado metodos tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al. Science 239, 487-491 (1988)) en todo el mundo como medio fiable de amplificacion de ADN, mientras que se han usado metodos de transcriptasa inversa para detectar con sonda el transcriptoma. El funcionamiento de ADN polimerasa, ARN polimerasa y transcriptasa inversa usa normalmente un fragmento de oligonucleotido corto conocido como cebador para dirigir la parte de una diana larga que va a replicarse o transcribirse.
Aunque la especificidad de la hibridacion de acidos nucleicos con frecuencia es suficiente para dirigir la actividad enzimatica para la mayor parte de secuencias diana, las dianas con secuencia repetitiva, estructura secundaria y alto contenido de G/C resultan diffciles de amplificar con alto rendimiento. Ademas, altos niveles de fondo de otros acidos nucleicos pueden conducir con frecuencia a una amplificacion incorrecta, tal como en el caso de amplificacion de genoma humano de una sola copia. Finalmente, puede ser diffcil conseguir la amplificacion multiplexada, tal como a partir de una combinacion de chips de ADN, debido al gran numero de reacciones de amplificacion ortogonal que deben producirse de forma simultanea. Existen problemas similares para la transcripcion y para la transcripcion inversa.
El documento US 6.033.851 se refiere a un metodo para suprimir la hibridacion no espedfica en un metodo de extension de cebador. La reaccion de extension de cebador para formar una hebra de acido nucleico complementaria con un molde de acido nucleico con el uso de un cebador segun el documento US 6.033.851 se caracteriza porque la reaccion entre el cebador y la hebra de molde se lleva a cabo en presencia de un acido nucleico o un derivado del mismo que es complementario con dicho cebador y tiene afinidad por dicho cebador que es equivalente a o menor que la de dicho cebador por la hebra de molde de acido nucleico.
La presente invencion se define, entre otros, por medio de los siguientes puntos:
1. Un sistema que comprende un acido nucleico diana, una polimerasa, y
un cebador parcialmente de doble hebra que comprende una primera y una segunda hebras de acido nucleico dispuestas en
(1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
(2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
(3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro de un 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
2. El sistema del punto 1, en el que el acido nucleico diana es de hebra individual, y opcionalmente en el que el acido nucleico diana es ADN o ARN.
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El sistema del punto 1 6 2, en el que el sistema comprende una pluralidad de diferentes cebadores parcialmente de doble hebra, opcionalmente en el que el sistema comprende al menos dos cebadores parcialmente de doble hebra que pueden usarse conjuntamente para amplificar una regi6n del acido nucleico diana, opcionalmente en el que el acido nucleico diana esta presente en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes diana, y opcionalmente en el que el acido nucleico diana esta presente como copia individual o en un bajo numero de copias en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes diana.
Un metodo de detecci6n de hibridaci6n de un cebador con un acido nucleico diana en una muestra, que comprende poner en contacto un cebador parcialmente de doble hebra con una muestra, y detectar la hibridaci6n del cebador con una diana en la muestra, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se compone de hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
(1) una regi6n no espedfica de diana de doble hebra,
(2) una regi6n espedfica de diana de doble hebra, y
(3) una regi6n espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
en el que la regi6n no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro de un 10 % de la energfa libre estandar para la regi6n espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
El metodo del punto 4, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se marca con un resto detectable, y opcionalmente en el que el resto detectable comprende un fluor6foro o un radiois6topo.
El metodo del punto 4 6 5, en el que el acido nucleico diana esta presente como una sola copia en la muestra.
Un metodo de extensi6n, de manera complementaria a la diana, de un cebador hibridado con un acido nucleico diana, que comprende hibridar una regi6n espedfica de diana de hebra individual de una primera hebra de un cebador parcialmente de doble hebra con un acido nucleico diana, disociando de ese modo la primera hebra del cebador de una segunda hebra del cebador, y extendiendo la primera hebra en su extremo 3', de manera complementaria a la diana, en presencia de una polimerasa, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se compone de hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
(1) una regi6n no espedfica de diana de doble hebra,
(2) una regi6n espedfica de diana de doble hebra, y
(3) una regi6n espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
en el que la regi6n no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro de un 10 % de la energfa libre estandar para la regi6n espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
Un metodo de realizaci6n de una reacci6n de smtesis de acido nucleico, que comprende llevar a cabo una reacci6n de smtesis de acido nucleico en presencia de un acido nucleico diana, una polimerasa y uno o mas cebadores parcialmente de doble hebra, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se compone de hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
(1) una regi6n no espedfica de diana de doble hebra,
(2) una regi6n espedfica de diana de doble hebra, y
(3) una regi6n espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
en el que la regi6n no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro de un 10 % de la energfa libre estandar para la regi6n espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
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9. El metodo del punto 8, en el que la reaccion de smtesis de acido nucleico es una reaccion de amplificacion de acido nucleico, una reaccion de transcripcion o una reaccion de transcripcion inversa.
10. El metodo del punto 9, en el que la reaccion de amplificacion de acido nucleico es la reaccion en cadena de polimerasa (PCR).
11. El metodo de uno cualquiera de los puntos 7-10, en el que se usan dos cebadores parcialmente de doble hebra.
12. Un metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado, que comprende amplificar multiples moleculas unicas de acido nucleico usando un cebador parcialmente de doble hebra que se compone de hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
(1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
(2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
(3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro de un 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida a un acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana, en el que la primera hebra de acido nucleico es mas larga que la segunda hebra de acido nucleico.
13. El metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun el punto 12, en el que la segunda hebra de acido nucleico del cebador parcialmente de doble hebra comprende un nucleotido no extensible en su extremo 3' y/o la primera hebra de acido nucleico del cebador parcialmente de doble hebra comprende un nucleotido no natural en el extremo 3' de su region no espedfica de diana, opcionalmente en el que el nucleotido no extensible del cebador parcialmente de doble hebra es un didesoxinucleotido, y opcionalmente en el que el nucleotido no natural del cebador parcialmente de doble hebra es iso-C, iso-G o desoxiuridina.
14. El metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun el punto 12 o el punto 13, en el que la region no espedfica de diana de doble hebra del cebador parcialmente de doble hebra tiene una longitud de 4-21 nucleotidos, y/o en el que la region espedfica de diana de hebra individual del cebador parcialmente de doble hebra tiene una longitud de 4-192 nucleotidos, preferiblemente una longitud de 4 - 20 nucleotidos.
15. El metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun uno cualquiera de los puntos 12-14, en el que las hebras de acido nucleico primera y segunda del cebador parcialmente de doble hebra se componen de ADN o ARN.
Sumario de la invencion
La hibridacion de acidos nucleicos es espedfica a nivel de un nucleotido individual. Por ejemplo, citosina se une preferentemente a guanina, y adenina se une preferentemente a timina o uracilo.
Sin embargo, para moleculas de acido nucleico que se componen de muchos nucleotidos, se reduce la especificidad de hibridacion, y acidos nucleicos con secuencias casi complementarias se uniran de forma casi tan fuerte como secuencias complementarias perfectas. Dada una mezcla heterogenea de acido nucleico diana de interes (“dianas”) y acidos nucleicos con secuencias que difieren de la diana, por ejemplo, en un nucleotido (“dianas falsas”), una parte significativa de cebadores complementarios a la diana se hibridaran mas bien con dianas falsas.
Dado que las dianas correctas se unen con una afinidad ligeramente mayor a un cebador que tiene una secuencia complementaria, proporcionando el tiempo suficiente, las dianas correctas desplazaran con el tiempo a las dianas falsas en la union a un cebador complementario. Sin embargo, este proceso es muy lento, y llevana meses a las concentraciones nanomolares tfpicas de muchos sistemas experimentales.
Con el fin de mitigar la tendencia de los cebadores complementarios a unirse a dianas falsas, a menudo es necesario hacer funcionar sistemas experimentales basados en cebador de acido nucleico cerca de la temperatura de fusion del complejo cebador/diana. Dado que esta temperatura de fusion es generalmente mucho mayor que la temperatura a la que funcionan de manera natural la mayor parte de los sistemas biologicos, este requisito de alta temperatura excluye que el sistema experimental funcione en condiciones biologicas normales. Adicionalmente, dado que la temperatura de fusion variara de una diana a otra, el estrecho intervalo de temperaturas requerido para
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dichos sistemas experimentales restringe el uso simultaneo de multiples cebadores para detectar una pluralidad de dianas.
Se proporcionan en el presente documento cebadores (por ejemplo, duplex de cebador y duplex de cebador de horquilla) que, en realizaciones, son capaces de unirse rapidamente a dianas de acido nucleico con alta especificidad en un amplio intervalo de temperaturas. Estos cebadores pueden usarse, por ejemplo, en reacciones de smtesis de acido nucleico (por ejemplo, PCR), analisis de micromatrices, metodos de formacion de imagenes y analisis de polimorfismos de nucleotidos individuales (SNP). Los cebadores tambien se pueden usar en ensayos de deteccion de acido nucleico en los que funcionan principalmente como “sondas”. Por consiguiente, independientemente de la aplicacion, los cebadores divulgados en el presente documento pueden denominarse en el presente documento de manera indistinta “sondas”. Independientemente de la aplicacion (o metodo de uso), los cebadores divulgados en el presente documento solucionan los problemas que con frecuencia se presentan cuando se requiere una hibridacion espedfica en presencia de dianas falsas, y mas particularmente cuando dichas dianas falsas estan presentes en exceso.
Los cebadores proporcionados en el presente documento presentan varias propiedades unicas que facilitan su uso en combinacion con enzimas que actuan sobre acidos nucleicos. En primer lugar, los cebadores estan disenados termodinamicamente para unirse con alta especificidad solo a sus dianas pretendidas, y muestran alta discriminacion frente a cambios incluso de un nucleotido individual. En segundo lugar, la especificidad de los cebadores permite PCR, transcripcion y transcripcion inversa de dianas tradicionalmente diffciles, tales como las que tienen una repeticion de secuencia significativa, estructura secundaria y/o alto contenido de G/C. El alto grado de especificidad que puede lograrse con estos cebadores permite ademas el procesado preciso incluso con altos niveles de fondo de acido nucleico tales como la amplificacion del genoma humano de copia individual. En tercer lugar, la naturaleza parcialmente de doble hebra de los cebadores significa que es improbable que interaccionen entre sf, y por consiguiente son propicios a reacciones de replicacion altamente multiplexadas, transcripcion y/o transcripcion inversa. Finalmente, la hibridacion de estos cebadores con dianas es relativamente robusta con respecto a la temperatura y salinidad, y por tanto los cebadores pueden tener una longitud significativamente mayor que los cebadores convencionales, lo que a su vez proporciona mayor especificidad y flexibilidad en cuanto al diseno de cebabores.
En algunas realizaciones, los cebadores de acido nucleico analizados en este caso se disenan de manera racional de modo que la energfa libre estandar para la hibridacion (por ejemplo, energfa libre estandar teorica) entre la molecula de acido nucleico diana espedfico y el cebador sea proxima a cero, mientras que la energfa libre estandar para la hibridacion entre una diana falsa (incluso una que difiere de la diana espedfica (real) unicamente en un nucleotido) y el cebador es lo suficientemente elevada como para hacer que su union resulte comparativamente desfavorable. Los inventores lograron esto disenando un cebador que tiene (a) una region espedfica de diana de hebra individual “de extremos cohesivos” (toehold), (b) una region espedfica de diana de doble hebra “de migracion de rama” (branch migration), y (c) una region no espedfica de diana de doble hebra de “equilibrio” (balance).
En algunos aspectos, el cebador puede comprender una sola hebra que se autohibrida para formar regiones de doble hebra. En algunas realizaciones, el cebador puede comprender dos hebras. Como ejemplo de esta ultima realizacion, el cebador comprende una primera hebra o hebra complementaria y una segunda hebra o hebra protectora. La hebra complementaria, como su nombre indica, es parcialmente complementaria a la diana de interes y se hibridara con la diana. Por otra parte, la hebra protectora esta disenada para no hibridarse con la diana y mas bien competir con la diana (o diana falsa) por la union del complemento.
La region “de extremos cohesivos” esta presente en la hebra complementaria, es complementaria a una secuencia diana y no es complementaria a una region protectora. La region de “equilibrio” de la hebra complementaria (es decir, la region de equilibrio complementaria) es complementaria a parte de la region protectora (es decir, a la region de equilibrio protectora) y no es complementaria a la secuencia diana. La energfa de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la diana coincide o casi coincide con la energfa de hibridacion de region de equilibrio complementaria con la region de equilibrio protectora (ajustando otras diversas consideraciones termodinamicas). La secuencia de la region de equilibrio se disena de manera racional para lograr esta coincidencia con las condiciones deseadas de temperatura y concentracion de cebador. Como resultado de ello, el equilibrio para la diana real y el cebador se aproxima rapidamente a un 50 % de diana:cebador:protector:cebador (o cualquier razon que se desee), mientras que el equilibrio para la diana falsa y el cebador favorece en gran medida la el protector:cebador. El abundante cebador libre en presencia de diana espedfica facilita su deteccion altamente sensible y espedfica.
En algunas realizaciones, los cebadores de acido nucleico comentados en este caso se disenan de modo que la energfa libre ajustada a la concentracion para la hibridacion entre la molecula de acido nucleico diana espedfica y el cebador sea proxima a cero, al tiempo que la energfa libre estandar ajustada a la concentracion para la hibridacion entre una diana falsa y el cebador sea lo suficientemente alta como para hacer que su union resulte comparativamente desfavorable. “Energfa libre ajustada a la concentracion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a AG0+ (An)R71n(c), donde R es la constante universal de los gases, T es la temperatura en Kelvin, c es la concentracion del cebador, y An es el cambio en el numero de moleculas en el transcurso de la reaccion (An = -1 para hibridacion convencional, An = 0 para hibridacion de cebador de doble hebra.
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Por tanto, aspectos divulgados en el presente documento proporcionan las composiciones de cebador que comprenden los cebadores, composiciones que comprenden las hebras complementaria y protectora (por ejemplo en estuches), metodos de preparacion de los cebadores, y metodos de uso de los cebadores en ensayos o reacciones que incluyen, sin limitacion, reacciones o ensayos de deteccion y/o smtesis de acido nucleico.
Por tanto, en un aspecto, se proporciona un cebador parcialmente de doble hebra que comprende (a) una primera hebra de acido nucleico (tambien denominada en el presente documento hebra complementaria) y segunda hebra de acido nucleico (tambien denominada en el presente documento hebra protectora), en el que las hebras primera y segunda cuando se hibridan entre sf se disponen en (1) una region no espedfica diana de doble hebra (de equilibrio), (2) una region espedfica de diana de doble hebra (de migracion de rama), y (3) una region espedfica de diana de hebra individual (de extremos cohesivos) a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico, en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar aproximadamente igual a la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida a un acido nucleico diana. El cebador parcialmente de doble hebra puede comprender una o mas regiones no espedficas de diana de doble hebra, una o mas regiones espedficas de diana de doble hebra y/o una o mas regiones espedficas de diana de hebra individual. En algunas realizaciones, el cebador parcialmente de doble hebra puede comprender una o dos regiones no espedficas de diana de doble hebra (de equilibrio), una o mas regiones espedficas de diana de doble hebra (de migracion de rama) y/o una o mas regiones espedficas de diana de hebra individual (de extremos cohesivos).
En algunas realizaciones, la segunda hebra de acido nucleico comprende un nucleotido no extensible en su extremo 3' y/o la primera hebra de acido nucleico comprende un nucleotido no natural en el extremo 3' de su region no espedfica de diana o en sus proximidades. En algunas realizaciones, el nucleotido no extensible es un nucleotido no natural o un didesoxinucleotido. En algunas realizaciones, el nucleotido no natural es iso-C, iso-G o desoxiuridina. Estos ejemplos no pretenden ser limitantes.
En algunas realizaciones, la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una longitud de aproximadamente 420 nucleotidos. La region no espedfica de diana de doble hebra puede tener una longitud mayor de 20 nucleotidos, tal como por ejemplo una longitud de 4-21 nucleotidos. En algunas realizaciones, puede tener una longitud de aproximadamente 12-192 nucleotidos.
En algunas realizaciones, la region espedfica de diana de hebra individual tiene una longitud de aproximadamente 4-20 nucleotidos. La region espedfica de diana de hebra individual puede tener una longitud mayor de 20 nucleotidos, tal como una longitud de por ejemplo 4-21 nucleotidos. En algunas realizaciones, puede tener una longitud de aproximadamente 12-192 nucleotidos.
En algunas realizaciones, la region no espedfica de diana de doble hebra y la region espedfica de diana de hebra individual tienen proporciones similares o identicas de nucleotidos A/T (y normalmente proporciones similares o identicas de nucleotidos G/C). En algunas realizaciones, las hebras de acido nucleico primera y segunda comprenden ADN o ARN o una combinacion de los mismos.
En otro aspecto, se proporciona un cebador de hebra individual que se autohibrida parcialmente para formar (1) una region no espedfica de diana de doble hebra, (2) una region espedfica de diana de doble hebra, (3) una region espedfica de diana de hebra individual, y (4) una region de bucle de horquilla, en el que la una o mas regiones no espedficas de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar ajustada a la concentracion aproximadamente igual a la energfa libre estandar ajustada a la concentracion de una o mas regiones espedficas de diana de hebra individual unidas a un acido nucleico diana.
En otro aspecto, se proporciona una composicion que comprende cualquiera de los cebadores anteriormente mencionados. La composicion puede comprender ademas un portador tal como un tampon, que comprende opcionalmente un conservante, una o mas sales, etc. La composicion tambien puede comprender un exceso de hebras protectoras de hebra individual, en el que cada hebra protectora comprende una region protectora de equilibrio y una region de migracion de rama protectora. Las hebras protectoras de hebra individual pueden comprender cada una de ellas un nucleotido no extensible y/o de origen no natural l, preferiblemente en su extremo 3'.
En otro aspecto, se proporciona un sistema que comprende un acido nucleico diana, una polimerasa, y cualquiera de los cebadores anteriores. En algunas realizaciones, el cebador es un cebador parcialmente de doble hebra que comprende una primera y una segunda hebras de acido nucleico dispuestas en (1) una region no espedfica de diana de doble hebra, (2) una region espedfica de diana de doble hebra y (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico.
En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es de hebra individual. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es ADN o ARN. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana comprende una secuencia repetitiva, estructura secundaria y/o alto contenido de GC. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana esta presente en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana esta presente como una copia individual o en un bajo numero de copias (por ejemplo, menos de 0,001 %, menos de 0,01 %, menos de
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0,1 % o menos de 1 %) en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes.
En algunas realizaciones, el sistema comprende una pluralidad de cualquiera de los cebadores anteriores tal como una pluralidad de diferentes cebadores parcialmente de doble hebra. En algunas realizaciones, el sistema comprende al menos dos de los cebadores anteriores, tales como al menos dos cebadores parcialmente de doble hebra, que pueden usarse conjuntamente para amplificar una region del acido nucleico diana.
En otro aspecto, se proporciona una composicion que comprende cualquiera de los sistemas anteriormente mencionados. La composicion puede comprender ademas un portador tal como un tampon, que comprende opcionalmente un conservante, una o mas sales, una o mas enzimas tales como una polimerasa, nucleotidos adecuados para la smtesis de acido nucleico, etc. La composicion tambien puede comprender un exceso de hebras protectoras de hebra individual, en el que cada hebra protectora comprende una region protectora de equilibrio y una region de migracion de rama protectora. Las hebras protectoras de hebra individual pueden comprender cada una de ellas un nucleotido no extensible y/o de origen no natural, preferiblemente en su extremo 3'.
En otro aspecto, se proporciona un metodo que comprende poner en contacto cualquiera de los cebadores anteriores, incluyendo cualquiera de los cebadores parcialmente de doble hebra anteriores con una muestra, y detectar la hibridacion del cebador con una diana en la muestra.
En algunas realizaciones, el cebador tal como el cebador parcialmente de doble hebra se marca con un resto detectable. En algunas realizaciones, el resto detectable comprende un fluoroforo o un radioisotopo.
La diana sera normalmente un acido nucleico. En algunas realizaciones, la diana es un acido nucleico de hebra individual. En algunas realizaciones, la diana es ADN o ARN. En algunas realizaciones, la diana es un acido nucleico que comprende secuencia repetitiva, estructura secundaria y/o alto contenido de GC. En algunas realizaciones, la diana esta presente en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes. En algunas realizaciones, la diana esta presente como copia individual o en un bajo numero de copias (por ejemplo, menos de 0,001 %, menos de 0,01 %, menos de 0,11 % % o menos de 11 % %) en una pluralidad de acidos nucleicos diferentes.
En algunas realizaciones, se realizan este y otros metodos descritos en el presente documento a una temperatura inferior a la temperatura de fusion del complejo hebra complementaria-diana. En algunas realizaciones, se llevan a cabo este y otros metodos descritos en el presente documento a una temperatura entre, e incluyendo, la temperatura ambiente hasta, e incluyendo, 50 °C, o hasta, e incluyendo, 40 °C, o hasta, e incluyendo, 30 °C. En algunas realizaciones, se llevan a cabo este y otros metodos descritos en el presente documento a aproximadamente 37 °C. En algunas realizaciones, se llevan a cabo este y otros metodos descritos en el presente documento con un exceso de hebra protectora que comprende una region protectora de equilibrio y una region de migracion de rama protectora y que es identica a la hebra protectora en el cebador parcialmente de doble hebra. En este y otros metodos descritos en el presente documento, el cebador puede ser cualquiera de los cebadores anteriores incluyendo los cebadores parcialmente de doble hebra.
En otro aspecto, se proporciona un metodo que comprende hibridar una region espedfica de diana de hebra individual (de extremos cohesivos) de una primera hebra (complementaria) de cualquiera de los cebadores parcialmente de doble hebra anteriores con un acido nucleico diana, disociando de ese modo la primera hebra del cebador de la segunda hebra (protectora) del cebador, y extendiendo la primera hebra en su extremo 3', de manera complementaria a la diana, en presencia de una polimerasa.
En otro aspecto, se proporciona un metodo que comprende realizar una reaccion de smtesis de acido nucleico en presencia de un acido nucleico diana, una polimerasa y uno o mas de los cebadores parcialmente de doble hebra anteriores.
En algunas realizaciones, la reaccion de smtesis de acido nucleico es una reaccion de amplificacion de acido nucleico. En algunas realizaciones, la reaccion de amplificacion de acido nucleico es la reaccion en cadena de polimerasa (PCR). En algunas realizaciones, la reaccion de smtesis de acido nucleico es una reaccion de transcripcion. En algunas realizaciones, la reaccion de transcripcion es una reaccion de transcripcion inversa.
En algunas realizaciones, se usan dos cebadores parcialmente de doble hebra.
En otro aspecto, se proporciona un metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado que comprende amplificar multiples moleculas de acido nucleico unico usando cualesquiera de los cebadores anteriores incluyendo el cebador parcialmente de doble hebra.
En otro aspecto, se proporciona un estuche que comprende uno o mas (incluyendo una pluralidad) de cualquiera de los cebadores parcialmente de doble hebra anteriores y uno o mas reactivos de smtesis de acido nucleico tales como enzimas, nucleotidos, sales, EDTA, un tampon, etc.
En algunas realizaciones, uno o mas reactivos de smtesis de acido nucleico se escogen entre el grupo que consiste en un tampon, nucleotidos y una polimerasa.
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En algunas realizaciones, el estuche comprende ademas un exceso de hebra protectora que es identica a la hebra protectora presente en el cebador.
En algunas realizaciones, el estuche comprende ademas instrucciones de uso.
En otro aspecto, se proporciona un estuche que comprende un primer acido nucleico de hebra individual (complementario) en un primer recipiente y un segundo acido nucleico de hebra individual (protector) que es complementary a una region del primer acido nucleico de hebra individual, en un segundo recipiente, en el que, cuando se hibridan los acidos nucleicos de hebra individual primero y segundo entre sf, se forma un acido nucleico parcialmente de doble hebra que comprende (1) una region no espedfica de diana de doble hebra, (2) una region espedfica de diana de doble hebra y (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye el primer acido nucleico, en el que el primer acido nucleico de hebra individual comprende un nucleotido no natural y/o el segundo acido nucleico de hebra individual comprende un nucleotido no extensible en su extremo 3'.
En algunas realizaciones, el estuche comprende ademas instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el estuche comprende ademas uno o mas reactivos de smtesis de acido nucleico tales como los citados con anterioridad. En algunas realizaciones, uno o mas reactivos de smtesis de acido nucleico se escogen entre el grupo que consiste en un tampon, nucleotidos y una polimerasa.
En algunas realizaciones, la hebra protectora se proporciona en el estuche en una cantidad (por ejemplo, una cantidad molar) que es mayor que la cantidad (por ejemplo, una cantidad molar) de hebra complementaria en el estuche.
En algunas realizaciones de los aspectos e invenciones anteriores, particularmente los relacionados con cebadores de doble hebra, la secuencia de nucleotidos del cebador se escoge de tal manera que:
Iag; - A(?J - AG3° I < AG" AC?;
f i donde: *•
es la energia libre estandar de hibridacion de la region de
A GJ
equilibrio protectora con la region de equilibrio complementaria; * es la energia libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la secuencia inmediatamente adyacente en la primera direccion a la secuencia
a g:
de acido nucleico diana, si hubiera alguna; extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; y
3 es la energia libre estandar de hibridacion de la region de
\c°
es de 3,5 kcal/mol.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende una hebra complementaria y una hebra protectora, en el que la hebra protectora comprende un acido nucleico que tiene: una region de migracion de rama protectora que tiene un primer extremo, un segundo extremo, y una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana que tiene un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo de la region de migracion de rama protectora y el primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana estan o ambos bien en 5' o bien en 3'; y una region de equilibrio protectora inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente adyacente al primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y el cebador complementario comprende un acido nucleico que tiene: una region de migracion de rama complementaria que tiene un primer extremo y un segundo extremo, y una secuencia que es complementaria con la region de migracion de rama protectora, en el que el primer extremo de la region de migracion de rama complementaria y el primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana estan ambos bien en 5' o bien en 3'; una region de extremos cohesivos que es: inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de migracion de rama complementaria; y complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que es inmediatamente adyacente al segundo extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana; y una region de equilibrio complementaria que: es inmediatamente adyacente al segundo extremo de la region de migracion de rama complementaria; es complementaria con la region de equilibrio protectora; y tiene una secuencia tal que:
Iag; - AGj - AG31 < AG" AC?;
f i donde: *•
es la energia libre estandar de hibridacion de la region de
AG,
equilibrio protectora con la region de equilibrio complementaria; * es la energia libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la secuencia inmediatamente adyacente en la primera direccion a la secuencia
ag:
de acido nucleico diana, si hubiera alguna; es la energia libre estandar de hibridacion de la region de
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AG°
extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; y ^ esde 3,5 kcal/mol.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende un acido nucleico que tiene una hebra protectora, una region de horquilla y una hebra complementaria, en el que: la hebra protectora comprende una region de migracion de rama protectora y una region de equilibrio protectora, en el que: la region de migracion de rama protectora tiene: un primer extremo; un segundo extremo; y una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana que tiene un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo de la region de migracion de rama protectora y el primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana estan ambos bien en 5' o bien en 3'; y la region de equilibrio protectora tiene: un primer extremo; un segundo extremo inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de migracion de rama protectora; y una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente adyacente al primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; la region de horquilla comprende: un primer extremo; y un segundo extremo inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de equilibrio protectora; y la hebra complementaria comprende una region de equilibrio complementaria, una region de migracion de rama complementaria, y una region de extremos cohesivos, en el que: la region de equilibrio complementaria tiene: un primer extremo; un segundo extremo inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de horquilla; y una secuencia que es complementaria a la region de equilibrio protectora; la region de migracion de rama complementaria tiene: un primer extremo; un segundo extremo inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de equilibrio complementaria; y una secuencia que es complementaria a la region de migracion de rama protectora, en el que el primer extremo de la region de migracion de rama complementaria y el primer extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana estan ambos bien en 5' o bien en3'; la region de extremos cohesivos es: inmediatamente adyacente al primer extremo de la region de migracion de rama complementaria; y complementarias a una segunda secuencia de acido nucleico diana que es inmediatamente adyacente al segundo extremo de la primera secuencia de acido nucleico diana; y la region de equilibrio complementaria tiene una secuencia tal que:
< AGZ, , , AG" , . ..
K donde: l 1 es la energia libre estandar de hibridacion
AC°
de la region de equilibrio protectora con la region de equilibrio complementaria; 2- es la energia libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la secuencia inmediatamente adyacente en la primera
direccion a la secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y es la energia libre estandar de
AG°
hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; 4 es la energia libre estandar de confinamiento de la region de horquilla; R es la constante de los gases ideales; T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de duplex de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el
AG°
sistema de duplex de cebador; y ^ es de 3,5 kcal/mol.
ag; - ag°2 - ag; + ag; + rt in (c)
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema que tiene, en el orden de 3' a 5', una primera hebra protectora, una primera region de horquilla, una hebra complementaria, una segunda region de horquilla y una segunda hebra protectora, en el que: la primera hebra protectora comprende: una primera region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana; y una primera region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora; y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; la primera region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio protectora; la hebra complementaria comprende: una primera region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora; una primera region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria; y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora; una region de extremos cohesivos que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria; y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos; y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria; tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; la segunda region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio complementaria; y la segunda hebra protectora comprende: una segunda region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria; y una segunda region de migracion de rama protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria; en el que la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio
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secuencias
tales
que:
R donde: es la energia libre
complementaria tienen
|ag; - ag; + ag; - ag; - ag; + ag; + ag; + rt in(Cj| < ag
estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio
AC°
complementaria; es la energia libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria
con la secuencia inmediatamente en 5’ con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera
alguna;
ag:
es la energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la
ag;
segunda secuencia de equilibrio complementaria; " 4 es la energia libre estandar de hibridacion de la segunda secuencia de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3’ con respecto a la tercera secuencia
AG<°
de acido nucleico diana, si hubiera alguna; IJV 5 es la energia libre estandar de hibridacion de la region de
AG°
extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; *
AG"
es la energia libre estandar de
confinamiento de la primera region de horquilla;
es la energia libre estandar de confinamiento de la segunda
region de horquilla; R es la constante de los gases ideales; T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de
AG°
duplex de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el sistema de duplex de cebador; y R es de 3,5 kcal/mol.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende un cebador de horquilla y una hebra protectora, en el que: el cebador de horquilla comprende un acido nucleico que tiene: una primera hebra protectora que tiene: una primera region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana; y una primera region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora; y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; una region de horquilla inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio protectora; una hebra complementaria que tiene: una primera region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora; una primera region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria; y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora; una region de extremos cohesivos que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria; y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos; y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria; tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y la region protectora comprende un acido nucleico que tiene: una segunda hebra protectora que tiene: una segunda region de equilibrio protectora que tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria; y una segunda region de migracion de rama protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria; en el que la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
ag; - ag; + ag; - ag; - ag; + ag; < ag; , AC o
donde: ^1 es la energia libre estandar de
AC°
hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria; 2 es la energia libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia
AG°
inmediatamente en 5’ con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; es la
energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de
AG°
equilibrio complementaria; 4 es la energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3’ con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana,
ag* 0
si hubiera alguna; J5 es la energia libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la
AG°
segunda secuencia de acido nucleico diana; 6 es la energia libre estandar de confinamiento de la region de
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horquilla; y
AG
o
R es de 3,5 kcal/mol.
En un aspecto adicional, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende una hebra protectora y un cebador de horquilla, en el que: la hebra protectora comprende un acido nucleico que tiene: una primera hebra protectora que tiene: una primera region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana; y una primera region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora; y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; el cebador de horquilla comprende un acido nucleico que tiene: una hebra complementaria que tiene: una primera region de equilibrio complementaria que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora; una primera region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria; y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora; una region de extremos cohesivos que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria; y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos; y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria; tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; una region de horquilla inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio complementaria; y una segunda hebra protectora que tiene: una segunda region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria; y una segunda region de migracion de rama protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria; en el que la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
a Gy - ag: + a g; - a g; - ag; + ag6° < a g°r ,
donde: ^1 es la energia libre estandar de
AC°
hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
es la energia libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia
inmediatamente en 5’ con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; es la
energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de
AG°
equilibrio complementaria; 4 es la energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3’ con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana,
AG0
si hubiera alguna; y J5 es la energia libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la
AG°
segunda secuencia de acido nucleico diana; ^6 es la energia libre estandar de confinamiento de la region de
AG°
horquilla; y R es de 3,5 kcal/mol.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende una primera hebra protectora, una hebra complementaria y una segunda hebra protectora, en el que: la primera hebra protectora comprende un acido nucleico que tiene: una primera region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana; y una primera region de equilibrio protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora; y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; la hebra complementaria comprende un acido nucleico que tiene: una primera region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora; una primera region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria; y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora; una region de extremos cohesivos que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria; y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos; y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana; una segunda region de equilibrio complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama
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complementaria; tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y la segunda hebra protectora comprende: una segunda region de equilibrio protectora que tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria; y una segunda region de migracion de rama protectora que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora; y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria; en el que la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
Iag; - ag: + ag; -ag; - ag5°-rt^A < ag°r, aG°
I “ 'I donde: es la energia libre estandar de
AC°
hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
es la energia libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia
inmediatamente en 5’ con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; es la
energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de
AG°
equilibrio complementaria; 4 es la energia libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3’ con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana,
ag* 0
si hubiera alguna; y J5 es la energia libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; R es la constante de los gases ideales; T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de duplex de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el sistema de duplex de
AG°
cebador; y R es de 3,5 kcal/mol.
En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un sistema de duplex de cebador que comprende, en el orden de 3' a 5', una primera hebra protectora, una primera region de horquilla, una hebra complementaria, una segunda region de horquilla y una segunda hebra protectora, en el que: la primera hebra protectora tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana; la primera region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera hebra protectora; la hebra complementaria comprende: una primera region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla; y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera hebra protectora; una region de extremos cohesivos que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria; y tiene una secuencia complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana; y una segunda region de migracion de rama complementaria que: esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos; y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico; la segunda region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria; y la segunda hebra protectora tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de la segunda region de migracion de rama complementaria.
AG°
En uno cualquiera de los aspectos anteriores, R puede ser de 2,0 kcal/mol, 1,0 kcal/mol o 0,5 kcal/mol; y/o c puede ser de aproximadamente 10 nM; y/o T puede ser de aproximadamente 293K o aproximadamente 338K; y/o la region de extremos cohesivos puede tener una longitud entre 4 y 20 nucleotidos, una longitud entre aproximadamente 4 y 15 nucleotidos, o una longitud entre aproximadamente 4 y 10 nucleotidos; y/o el primer extremo de la region de migracion de rama protectora puede estar en 5' o en 3'; y/o el sistema de duplex de cebador puede comprender ademas un colorante o grupo fluorescente funcionalizado; y/o el sistema de duplex de cebador puede inmovilizarse sobre un soporte solido; y/o la region de horquilla puede tener una longitud de no mas de 20 nucleotidos o una longitud de no mas de 10 nucleotidos; y/o la secuencia de la region de horquilla puede escogerse entre el grupo que consiste en una secuencia de poli-adenosina, una secuencia de poli-desoxiadenosina, una secuencia de poli-5'-metiluridina, una secuencia de poli-timidina, una secuencia de poli-guanosina, una secuencia de poli-desoxiguanosina, una secuencia de poli-citidina, una secuencia de poli-desoxicitidina, una secuencia de poli- uridina y una secuencia de poli-desoxiuridina; y/o la primera secuencia de acido nucleico diana y/o la segunda secuencia de acido nucleico diana pueden ser secuencias de origen natural en un organismo o un virus; y/o la primera secuencia de acido nucleico diana y/o la segunda secuencia de acido nucleico diana pueden ser secuencias que se producen de manera natural en un micro-ARN.
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un metodo de deteccion de un acido nucleico diana en una muestra que comprende: poner en contacto un acido nucleico diana con un sistema de duplex de cebador de una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento; y detectar la formacion de un complejo entre el acido nucleico diana y al menos una parte del sistema de duplex de cebador. En algunas realizaciones, el sistema de duplex de cebador comprende ademas un colorante o grupo fluorescente funcionalizado. En algunas realizaciones, el sistema de duplex de cebador se inmoviliza sobre un soporte solido. En algunas realizaciones, la puesta en contacto se produce en una celula. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico de origen natural en un organismo o un virus. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un micro-ARN.
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En otro aspecto, se proporciona en el presente documento un metodo de amplificacion de una secuencia presente dentro de un acido nucleico diana que comprende: formar una disolucion que comprende: un acido nucleico diana; un sistema de duplex de cebador de una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento; y reactivos para llevar a cabo una reaccion de amplificacion; e incubar la disolucion en condiciones tales que se amplifique dicha secuencia presente dentro del acido nucleico diana. En algunas realizaciones, el acido nucleico diana es un acido nucleico de origen natural en un organismo o un virus.
Se explicaran estos y otros aspectos y realizaciones de la invencion con mayor detalle en el presente documento. Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4-8, 9A, y 9B representan sistemas de sonda de acido nucleico a modo de ejemplo.
Las figuras 10, 11, 12A, 12B, 13, y 14 representan metodos a modo de ejemplo de uso de sistemas de sonda de acido nucleico.
Las figuras 15A y 15B representan la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) altamente espedfica usando los duplex de cebador proporcionados en el presente documento.
Las figuras 16A-16D muestran demostraciones experimentales de hibridacion de cebador con discriminacion de nucleotido individual.
Las figuras 17A-17D muestran resultados experimentales adicionales y datos estadfsticos sobre las capacidades de discriminacion de una base individual de duplex de cebador.
Las figuras 18A-18B muestran resultados experimentales usando cebadores de duplex para mejorar el rendimiento de PCR de una diana cuasi-repetitiva.
Descripcion detallada de la invencion
Un reto importante en los ensayos de acido nucleico basados en sonda es que los acidos nucleicos que tienen secuencias similares a la de una diana se hibriden al complemento de la diana con fuerte termodinamica y cinetica rapida. Sin embargo, tal como se describe en el presente documento, la cinetica y termodinamica de las reacciones con desplazamiento de hebra pueden estar parcialmente desacopladas, de modo que reacciones que solo sean ligeramente favorables o incluso termodinamicamente desfavorables puedan tener, no obstante, una cinetica tan rapida como la hibridacion de dos hebras complementarias. Las composiciones y los metodos descritos en el presente documento se aprovechan de este mecanismo de desacoplamiento para proporcionar sistemas de sonda de acido nucleico con especificidad y cinetica mejoradas.
Se proporcionan en el presente documento sistemas de sonda de acido nucleico altamente espedficos y metodos de uso de dichos sistemas de sonda. En determinadas realizaciones, los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento comprenden sondas complementarias que tienen regiones complementarias a una secuencia diana que se protegen frente a la hibridacion con dianas falsas mediante regiones protectoras complementarias a una parte de las sondas complementarias. La energfa libre de la reaccion de union entre la diana y la sonda protegida se controla con precision mediante las bases disenadas de manera racional de una o mas regiones de equilibrio, que tienen secuencias que no corresponden a la secuencia de acido nucleico diana o su complemento. En determinadas realizaciones, una region protectora y una sonda complementaria forman regiones en una molecula individual de acido nucleico y estan separadas entre sf por una o mas horquillas de acido nucleico.
Los metodos y las composiciones descritos en el presente documento presentan varias propiedades unicas que facilitan su uso en ensayos de hibridacion. En primer lugar, los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento convierten de manera fiable pequenas diferencias de secuencia entre dianas y dianas falsas en grandes diferencias en cuanto a afinidad de union y velocidades de reaccion entre la hibridacion de la diana frente a la diana falsa con la sonda. En segundo lugar, los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento pueden disenarse para funcionar en cualquier intervalo amplio de temperaturas y concentraciones de sal, y por tanto pueden funcionar de manera fiable en muchas condiciones experimentales diferentes. En tercer lugar, el uso de los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento puede dar como resultado reacciones de hibridacion que sean cineticamente rapidas incluso a temperatura ambiente, lo que facilita el analisis rapido y de alto rendimiento de acidos nucleicos. En cuarto lugar, los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento se disenan de manera racional, y por tanto es improbable que interaccionen de manera desfavorable o inesperada con otras biomoleculas.
Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento composiciones de cebador, metodos de preparacion de dichas composiciones, y metodos de su uso. Las realizaciones descritas en el presente documento se basan en
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parte en el descubrimiento de que cebadores (pot ejemplo, un par de cebadores parcialmente hibridados, o un cebador de autohibridacion individual) que son parcialmente de doble hebra y parcialmente de hebra individual, cuando se usan en una reaccion de smtesis de acido nucleico por ejemplo, son capaces de discriminar entre dianas totalmente complementarias y las que tienen uno o mas apareamientos erroneos (es decir, las dianas falsas). Tal como se demuestra en el presente documento, los duplex de cebador descritos en el presente documento son superiores a los cebadores convencionales, por ejemplo, en las reacciones de PCR que usan las dianas falsas tales como las que tienen secuencias cuasi-repetitivas.
Los duplex de cebador en el presente documento comprenden una region de hebra individual denominada en el presente documento “de extremos cohesivos” a partir de la cual el duplex de cebador inicia la union a una diana, una “region de equilibrio” de doble hebra que se disocia espontaneamente de modo que una sola hebra de cebador no completa la hibridacion (a lo largo de la longitud completa del cebador) con la diana, y una region de migracion de rama de doble hebra, entre las regiones de extremos cohesivos y de equilibrio, que es totalmente complementaria a una secuencia de acido nucleico diana. Mecamsticamente, se cree que la hibridacion con una diana comienza en la region de extremos cohesivos y continua a lo largo de la longitud de la hebra complementaria hasta que el cebador ya no es “de doble hebra”. Esto tambien supone complementariedad entre la diana y la region de rama. Tal como se usa en el presente documento, una “region” o “dominio” de acido nucleico es un tramo consecutivo de nucleotidos de cualquier longitud. Cuando existen apareamientos erroneos de nucleotidos entre la “diana” y la hebra complementaria, el desplazamiento de la segunda hebra (es decir, la hebra protectora) es termodinamicamente desfavorable y se revierte la asociacion entre la hebra complementaria y la “diana”. Ha de entenderse que en esta ultima descripcion, la “diana” es en realidad una diana falsa puesto que comprende diferencias o apareamientos erroneos de nucleotidos con respecto a la hebra complementaria.
Dado que la energfa libre estandar favorece un apareamiento completo (totalmente complementario) entre la secuencia diana del acido nucleico y las regiones de migracion de rama mas la de extremos cohesivos del cebador mas que un apareamiento erroneo (por ejemplo, cambio de un nucleotido individual), la primera hebra (complementaria) del cebador se unira de manera estable a una diana en ausencia de un apareamiento erroneo pero no en presencia de un apareamiento erroneo. Si existe un apareamiento erroneo entre la primera hebra (complementaria) del cebador y la diana, el duplex de cebador prefiere volver a formarse mediante regiones de equilibrio de hebra individual recien expuestas. De este modo, se reduce la frecuencia de comienzo de una reaccion de smtesis de acido nucleico en una posicion incorrecta en una diana (o en una muestra, en este sentido). Este tipo de discriminacion normalmente no es posible usando los cebadores convencionales de hebra individual de la tecnica anterior dado que en esas reacciones no hay ninguna hebra de acido nucleico competitiva (tal como la hebra protectora) a la que preferina unirse una hebra de cebador con apareamiento erroneo. En algunas realizaciones, los cebadores descritos en el presente documento pueden ser significativamente mas largos que los cebadores convencionales (por ejemplo, los usados para amplificacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)) dado que los presentes cebadores se basan en la presencia de una hebra protectora competitiva para la especificidad mas que en la temperatura de fusion para discriminar entre secuencias complementarias y con apareamiento erroneo. Por consiguiente, los presentes cebadores se pueden escoger y usar de manera que sean independientes de la temperatura.
Los duplex de cebador descritos en el presente documento mejoran por tanto la especificidad, por ejemplo, de las reacciones de smtesis de acido nucleico y, en algunas realizaciones, permiten un mayor grado de formacion de estructuras multiplex de cebadores. Experimentos preliminares, cuyos resultados se proporcionan en el presente documento, muestran que el rendimiento de PCR de dianas cuasi-repetitivas puede mejorarse significativamente usando los duplex de cebador proporcionados en el presente documento en comparacion con los cebadores convencionales (por ejemplo, un 75 % frente a un 30 %). Los duplex de cebador descrito en el presente documento tambien proporcionan la deteccion y amplificacion espedficas de acido nucleico de una poblacion heterogenea de acidos nucleicos, tal como por ejemplo, detectar y amplificar un ADN bacteriano procedente de una muestra que comprende ADN humano, que tiene amplia aplicabilidad en la deteccion de organismos poco frecuentes tales como agentes de guerra biologica.
Duplex de cebador
Tal como se usa en el presente documento, los cebadores descritos en el presente documento pueden denominarse “duplex de cebador” para abarcar que pueden proporcionarse y/o existir en una conformacion en la que comprenden regiones de doble hebra. Por consiguiente, el termino “cebador” y la expresion “duplex de cebador” pueden usarse indistintamente.
Los duplex de cebador proporcionan especificidad y cinetica mejoradas con respecto a los cebadores existentes. Un “duplex de cebador” en el presente documento se refiere a un cebador que comprende una primera hebra (denominada en el presente documento “hebra complementaria”) y una segunda hebra (denominada en el presente documento “hebra protectora”) que complementa parcialmente a la primera hebra. En algunas realizaciones, la hebra complementaria y la hebra protectora son moleculas de acido nucleico de hebra individual independientes (Figuras lA y 1B). En otras realizaciones, la hebra complementaria y la hebra protectora estan conectadas entre sf y separadas por una region de horquilla para formar regiones contiguas de una molecula de acido nucleico individual
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(Figuras 2A y 2B). Tal como se usa en el presente documento, una “region de horquilla” es un bucle de hebra individual de nucleotidos que conecta dos regiones de doble hebra de un acido nucleico. La estructura general de duplex de cebador a modo de ejemplo se ilustra en las figuras y se describe en el presente documento. Ha de entenderse que, en la mayor parte de los casos, cuando se hace referencia a una region complementaria o una region protectora (o viceversa), cada region esta normalmente dentro de un “duplex de cebador” individual (o un sistema de cebador individual). Por ejemplo, una region de equilibrio complementaria en un cebador descrito en el presente documento es complementaria a una region de equilibrio protectora en el mismo cebador de tal manera que una region de equilibrio complementaria de un cebador descrito en el presente documento no se hibrida con una region de equilibrio protectora de un cebador independiente ffsicamente diferente.
En realizaciones en las que el cebador descrito en el presente documento consiste unicamente en una hebra individual, la “hebra” complementaria puede denominarse la region complementaria, y la “hebra” protectora puede denominarse la region protectora.
En determinadas realizaciones, la hebra (o region) complementaria comprende una region de extremos cohesivos, una region de migracion de rama complementaria y una region de equilibrio complementaria, mientras que la hebra (o region) protectora comprende una region de migracion de rama protectora y una region de equilibrio protectora. Tal como se usa en el presente documento, una “region” de acido nucleico es un tramo consecutivo de nucleotidos de cualquier longitud. Las regiones de extremos cohesivos y migracion de rama estan disenadas cada una para ser complementarias a, y por tanto “con apareamiento de bases” con (por ejemplo, se hibridan con), regiones adyacentes en un acido nucleico diana. Una region de una hebra complementaria que presenta apareamiento de bases con una region en un acido nucleico diana se denomina region “espedfica de diana”. Las regiones de equilibrio estan disenadas para no ser complementarias a, y por tanto no presentar apareamiento de bases con, un acido nucleico diana. Las regiones de equilibrio se denominan por tanto regiones “no espedficas de diana”. En determinados aspectos, cuando la hebra (o region) complementaria y la hebra (o region) protectora se hibridan entre sf (son de doble hebra), se forma un duplex de cebador. De este modo, en algunos aspectos, un duplex de cebador comprende una region de extremos cohesivos de hebra individual espedfica de diana, una region de migracion de rama de doble hebra espedfica de diana, y una region de equilibrio de doble hebra no espedfica de diana (Figuras 1A y 1B). En algunos casos, el duplex de cebador tambien puede comprender un bucle de horquilla, tal como se describe con mas detalle a continuacion.
Los duplex de cebador descritos en el presente documento pueden disenarse para hibridarse espedficamente con un acido nucleico diana. La eficacia de un cebador, por ejemplo, en una reaccion de amplificacion de acido nucleico, depende de la especificidad, eficiencia y fidelidad del cebador. Los cebadores de acido nucleico tfpicos se unen a menudo a dianas falsas con un perfil termodinamico y cinetico comparable al del mismo cebador que se une a su acido nucleico diana espedfico pretendido, excepto entre las temperaturas de fusion del duplex con apareamiento erroneo y el duplex perfectamente hibridado. Por consiguiente, pueden distinguirse los duplex perfectos y con apareamiento erroneo por sus temperaturas de fusion. Los cebadores descritos en el presente documento en cambio, distinguen entre las dianas falsas y correctas de manera relativamente independiente de la temperatura.
Una “diana falsa” en el presente documento se refiere a una molecula de acido nucleico que difiere de una molecula de acido nucleico diana en al menos un nucleotido dentro de la region que se hibrida con la hebra complementaria. Por ejemplo, TCGACGGGG es una diana falsa, si la diana es TCGAAGGGG. En determinadas realizaciones, una diana falsa comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4 o mas cambios de nucleotidos con relacion a la diana. La union del cebador a las dianas falsas reduce la fidelidad (exactitud) de, por ejemplo, la amplificacion de acido nucleico. Los duplex de cebador presentados en el presente documento se disenan para alterar la energfa libre estandar del desplazamiento de hebra con dianas falsas, permitiendo la discriminacion entre las dianas correctas y las dianas falsas, incluyendo las dianas falsas que difieren de una diana correcta unicamente en un nucleotido. Tal como se describe en el presente documento, la hebra protectora es responsable de alterar la energfa libre estandar para permitir que la hebra complementaria discrimine entre dianas correctas y falsas.
Los cebadores descritos en el presente documento se disenan de manera racional para facilitar reacciones con desplazamiento de hebra con cinetica y termodinamica ajustadas con precision de tal manera que la cinetica y termodinamica de reacciones con desplazamiento de hebra esten parcialmente desacopladas. Como resultado de este desacoplamiento, las reacciones que solo son ligeramente favorables o incluso desfavorables termodinamicamente pueden tener, no obstante, una cinetica tan rapida como la hibridacion de dos hebras complementarias.
Por ejemplo, a 37 °C y Na+ 1 M, la energfa libre estandar ajustada a la concentracion para la hibridacion de un cebador con una diana perfectamente complementaria (correcta o espedfica) (es decir, el 100% de apareamiento de nucleotidos) esta entre 1,9 kcal/mol y 6,6 kcal/mol mas favorable que la energfa libre estandar ajustada a la concentracion para la hibridacion del mismo cebador con una diana falsa para cada nucleotido en que difiere la diana falsa de la diana pretendida. En determinadas realizaciones, los presentes duplex de cebador usan reacciones con desplazamiento de hebra de intercambio de extremos cohesivos para traducir esta diferencia de 1,9 a 6,6 kcal/mol en la energfa libre estandar ajustada a la concentracion para una discriminacion optima entre la diana y las
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dianas falsas. Se describe un ejemplo de la termodinamica/cinetica de la union de duplex de cebador a un acido nucleico diana tal como sigue con referencia a las Figuras 3A y 3B.
Para los propositos de este ejemplo, el acido nucleico diana tiene al menos dos regiones, (1) y (2). En determinadas realizaciones, la region (1) puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 (incluyendo 14-200 o 20-200) nucleotidos, mientras que la region 2 puede ser mas pequena, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 nucleotidos. Tal como se usa en el presente documento, los terminos “nucleotido” y “bases” se usan indistintamente. La hebra protectora incluye una region de migracion de rama protectora adyacente a una region de equilibrio protectora (3). La region de migracion de rama protectora corresponde a la region diana 1, mientras que la region de equilibrio protectora (3) no corresponde a la region (1) ni a la region (2) ni a ninguna region inmediatamente en 5' con respecto a las regiones diana. Una secuencia, dominio o region de acido nucleico es “inmediatamente adyacente a”, “esta inmediatamente en 5'” o “inmediatamente en 3' con respecto a otra secuencia si las dos secuencias forman parte de la misma molecula de acido nucleico y si ninguna base separa las dos secuencias. La hebra complementaria incluye una region de equilibrio complementaria (3), una region de migracion de rama complementaria (!) y una region de extremos cohesivos (2). La region de equilibrio complementaria (3) es complementaria a la region de equilibrio protectora (3), la region de migracion de rama complementaria (1) es complementaria a la region de migracion de rama protectora y la region diana (1) (es decir, la region de migracion de rama protectora y la region diana (1) son de secuencia identica y estas se unen ambas a la region de migracion de rama complementaria (1), y la region de extremos cohesivos (2) es complementaria a la region diana (2).
En determinadas realizaciones, la region de equilibrio se disena de modo que su energia libre estandar ajustada a la
- (AG°)
''.inn x 3:3 ' ■
sea igual o aproximadamente igual a la energia libre estandar ajustada a la concentracion
concentracion
para la region de extremos cohesivos unida a la region diana (2)
10 nanomolar (nM) usado en una reaccion a 37 °C
(A G‘).
imagen1
En algunos casos, para un cebador
- (indicando las barras verticales el valor absoluto) deben ser cada uno menores de aproximadamente 11,3 kcal/mol para garantizar la disociacion de la hebra protectora completa de la diana.
En algunas realizaciones, cuando el duplex de cebador interacciona con una molecula de acido nucleico diana (correcta) espedfica (Figura 3A), la disociacion de (3):(3) y la asociacion de (2):(2) se equilibran entre sf, y las termodinamicas de hibridacion de (1):(1) son identicas para el acido nucleico diana y para la hebra protectora que interacciona con la hebra complementaria. El cambio de energia libre total entre los dos estados es relativamente pequeno (por ejemplo, aproximadamente 1 kcal/mol), y la reaccion alcanza rapidamente (por ejemplo, menos de un minuto) un equilibrio de aproximadamente 50:50. En determinadas realizaciones, la region de equilibrio puede disenarse para tener una energia libre estandar muy proxima a la de la region de extremos cohesivos que se une a la region diana 2, de modo que el equilibrio sea, por ejemplo, de 60:40 o 70:30. En algunas realizaciones, el diseno de la region de equilibrio tambien puede tener en cuenta otros factores contribuyentes al cambio de energia libre durante la reaccion, tales como la hibridacion entre la region de equilibrio protectora y las secuencias diana aguas arriba (que en algunos casos es despreciable), el confinamiento de una horquilla (si esta presente), la temperatura de uso pretendida y la concentracion de cebador pretendida.
En algunas realizaciones, cuando el duplex de cebador interacciona con una molecula de acido nucleico diana falsa (Figura 3B), la disociacion de (3):(3) y la asociacion de (2m):(2) no se equilibran dado que la region diana falsa (2m) no es totalmente complementaria a la region de extremos cohesivos. Por consiguiente, el equilibrio se desplaza al estado en el que el duplex de cebador no se une a la diana falsa.
Explicado de otro modo, en algunos casos, la energia libre de la hebra complementaria unida a la hebra protectora
AG^ +
es
A G*
(ignorando la contribucion de la region de horquilla opcional y otras consideraciones), lo cual
AG*2 + AG*
equilibra la energia libre de la hebra complementaria unida a diana especifica, — ^ 1:! ’ En este
ejemplo, este se debe a que la region de equilibrio (3) del duplex de cebador se ha disenado para tener una energia libre estandar ajustada a la concentracion igual a (o aproximadamente igual a) la de la region diana (2). Cuando el duplex de cebador interacciona con una diana falsa que tiene un cambio de un nucleotido individual (base) en la
AG° + AG°
region diana (2m), la energia libre del sistema -m-2 1;i
y por tanto se ve desfavorecido en el equilibrio.
es menos negativa que la del duplex de cebador,
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “aproximadamente igual a” con referencia a la energia libre estandar significa que la primera energia libre a la que se hace referencia esta dentro de un 10 % de la segunda energia libre a la que se hace referencia. En algunas realizaciones, una primera energia libre que es aproximadamente igual a una segunda energia libre esta dentro de aproximadamente +3 kcal/mol a
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aproximadamente -3 kcal/mol de la segunda energfa libre. Ha de entenderse que las diferencias entre las energfas verdaderas primera y segunda pueden ser menores que o aproximadamente de 1 kcal/mol, ser menores que o aproximadamente de 2 kcal/mol, ser menores que o aproximadamente de 3 kcal/mol, ser menores que o aproximadamente de 3,5 kcal/mol, o mas, en algunas realizaciones.
Aunque la Figura 3B ilustra un cambio de un solo nucleotido correspondiente a la region (2)/(2m) de una molecula de acido nucleico diana, los presentes duplex de cebador tambien pueden discriminar entre una diana espedfica y una diana falsa que tiene un cambio de nucleotido en la region (1). Cuando la diana falsa tiene un cambio de una base individual en la region diana 1, entonces la energia libre estandar del duplex de cebador despues de la union se
ag*2
+ AG^
vuelve - donde IjtcI es la energia libre estandar de la
erroneo (1) que se une a la region complementaria Q) del duplex de cebador.
region diana con apareamiento Debido al cambio de una base
+ ag;,
individual, la energia libre del duplex de cebador es menos negativa que - - (energia libre de
cebador complementario unido al protector), de modo que se desplaza el equilibrio al estado en el que el duplex de cebador no se une a la region diana falsa. Las energfas libres estandar se pueden calcular teoricamente basandose en los conocimientos en la tecnica y las ensenanzas proporcionadas en el presente documento.
AG£
Hebras, regiones o dominios complementarios o protectores
Los dominios complementarios de los sistemas de sonda de acido nucleico descritos en el presente documento incluyen cada uno de ellos una pluralidad de regiones, incluyendo una region de extremos cohesivos y una o mas regiones diana complementarias. Tanto la region de extremos cohesivos como una o mas regiones diana complementarias tienen secuencias de acido nucleico que son complementarias a secuencias de acido nucleico del acido nucleico diana. Por tanto, la region de extremos cohesivos y la region diana complementaria son capaces de presentar apareamiento de bases y formar por tanto un complejo con una secuencia de un acido nucleico diana cuando el sistema de sonda de acido nucleico se pone en contacto con un acido nucleico diana en condiciones de hibridacion apropiadas. Los dominios complementarios tambien pueden incluir una o mas regiones de equilibrio complementarias. Una o mas regiones de equilibrio complementarias se disenan de manera racional. De este modo, las secuencias de una o mas regiones de equilibrio complementarias no se disenan para ser complementarias a una secuencia de acido nucleico diana.
Una region de extremos cohesivos es complementaria a (y por tanto se hibrida con) una secuencia en la molecula de acido nucleico diana; sin embargo, una region de extremos cohesivos no se hibrida con una hebra protectora. De este modo, cuando la hebra complementaria se hibrida con la molecula de acido nucleico diana, la region de extremos cohesivos tambien se hibrida con la molecula de acido nucleico diana, pero cuando la hebra complementaria se hibrida con la hebra protectora, la region de extremos cohesivos sigue siendo de hebra individual. Una region de extremos cohesivos puede situarse en el extremo 3' o el extremo 5' de la hebra complementaria (por ejemplo, es una extension del extremo 3' o el extremo 5' de la hebra complementaria).
En determinadas realizaciones, una region de extremos cohesivos tiene una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 20 nucleotidos, una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 15 nucleotidos, o una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 10 nucleotidos. En algunas realizaciones, una region de extremos cohesivos tiene una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, la region de extremos cohesivos tiene una longitud de mas de 20 nucleotidos, incluyendo por ejemplo menos de o aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 nucleotidos o mas.
La region de migracion de rama complementaria es complementaria a una secuencia en la molecula de acido nucleico diana y a la region de migracion de rama protectora. De este modo, cuando la hebra complementaria se hibrida con una molecula de acido nucleico diana, la region de migracion de rama complementaria se hibrida con el acido nucleico diana. Cuando la hebra complementaria se hibrida con su hebra protectora, la region de migracion de rama complementaria se hibrida con la region de migracion de rama protectora.
En determinadas realizaciones, una region de migracion de rama tiene una longitud de no mas de 200, 100, 75, 50, 40, 30, 25 o 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, una region de migracion de rama tiene una longitud de aproximadamente 10 nucleotidos a aproximadamente 200 nucleotidos. En determinadas realizaciones, una region de migracion de rama tiene una longitud de aproximadamente 10 nucleotidos a aproximadamente 150 nucleotidos, de aproximadamente 10 nucleotidos a aproximadamente 100 nucleotidos, o de aproximadamente 10 nucleotidos a aproximadamente 50 nucleotidos. En realizaciones particulares, una region de migracion de rama tiene una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,
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124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146,
147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169,
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Las regiones de equilibrio de una hebra complementaria y una hebra protectora son complementarias entre s^ (es decir, forman un acido nucleico de doble hebra) pero no son complementarias a la diana de interes (es decir, tampoco forman un acido nucleico de doble hebra con la diana). De este modo, cuando una hebra complementaria se hibrida con una molecula de acido nucleico diana, la region de equilibrio complementaria no se hibrida con la molecula de acido nucleico diana. Cuando la hebra complementaria se hibrida con su hebra protectora, la region de equilibrio complementaria se hibrida con la region de equilibrio protectora.
El diseno de la region de equilibrio depende del diseno de la region de extremos cohesivos. En algunas realizaciones, la region de equilibrio se disena de tal manera que el perfil termodinamico de la region de equilibrio sea comparable al de la region de extremos cohesivos. En algunas realizaciones, el perfil termodinamico se basa en un modelo teorico, usando por ejemplo, software Mfold disponible en el sitio web de informacion biologica de RPI. El numero y/o la naturaleza de los nucleotidos dentro de una region de equilibrio son comparables los de la region de extremos cohesivos. Por ejemplo, si una region de extremos cohesivos se compone de un 40 % de nucleotidos A y T y un 60 % de nucleotidos G y C, entonces la region de equilibrio tambien debe comprender un 40 % de nucleotidos A y T y un 60 % de nucleotidos G y C. En realizaciones, la region de equilibrio se disena de tal manera que no mas de tres nucleotidos consecutivos sean complementarios a una secuencia en el acido nucleico diana para evitar la union de la region de equilibrio al acido nucleico diana.
En algunas realizaciones, la longitud de una region de equilibrio es lo suficientemente corta de modo que la region complementaria y la protectora se disocian espontaneamente una de otra. En algunas realizaciones, una region de equilibrio tiene una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 20 nucleotidos, una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 15 nucleotidos, o una longitud de aproximadamente 4 nucleotidos a aproximadamente 10 nucleotidos. En algunas realizaciones, una region de equilibrio tiene una longitud de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleotidos. En algunas realizaciones, una region de equilibrio tiene mas de 20 nucleotidos, incluyendo por ejemplo menos de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 nucleotidos o mas. En algunas realizaciones, el numero de nucleotidos consecutivos que son complementarios a una secuencia de nucleotidos dentro del acido nucleico diana puede ser mayor de tres, siempre que la region de equilibrio no se una al acido nucleico diana.
En algunas realizaciones, por ejemplo aquellas en las que el duplex de cebador contiene dos hebras de acido nucleico independientes, el diseno de una region de equilibrio no depende de la concentracion del duplex de cebador ni de la temperatura a la que se forma/usa el duplex de cebador. En algunas realizaciones, se disena una region de equilibrio de tal manera que la energfa libre estandar para la reaccion en la que la hebra protectora se desplaza de la hebra complementaria por medio de la molecula de acido nucleico diana sea proxima a cero kcal/mol. Tal como se usa en el presente documento, “proxima a cero” significa que la energfa libre estandar para la reaccion este dentro de 3,5 kcal/mol a partir de0 kcal/mol. En determinadas realizaciones, la energfa libre estandar de esta reaccion por desplazamiento esta dentro de 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 kcal/mol de cero kcal/mol.
En otras realizaciones, por ejemplo aquellas en las que los duplex de cebador estan formados por una molecula individual de acido nucleico (por ejemplo, una region de horquilla que separa la hebra complementaria (o region o dominio) y la hebra protectora (o region o dominio)), el diseno de una region de equilibrio dependera de la concentracion de duplex de cebador asf como de la temperatura de reaccion. En tales realizaciones, se disena una region de equilibrio de modo que la energfa libre estandar para la reaccion en la que la hebra protectora se desplaza de la hebra complementaria por medio del acido nucleico diana mas R71n(c) sea proxima a cero kcal/mol, donde R es la constante universal de los gases (0,0019858775(34) kcal/mohK), T es la temperatura a la que se usa el duplex de cebador, y c es la concentracion a la que se usa el duplex de cebador. En algunas realizaciones, la temperatura a la que se usan los duplex de cebador es de aproximadamente 273K (0 °C), 277K, 283K, 288K, 293K, 298K, 303K, 308K, 313K, 318K, 323K, 328K, 333K, 338K, 343K, 348K, 353K, 358K o 363K (90 °C). En algunas realizaciones la concentracion (c) a la que se usan los duplex de cebador es de aproximadamente 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 30 nM, 35 nM,. 40 nM, 45 nM,. 50 nM, 55 nM, 60 nM, 65 nM, 70 nM, 75 nM, 80 nM, 85 nM, 90 nM, 95 nM, 100 nM, 125 nM, 150 nM, 175 nM, 200 nM, 225 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM o 1 mM. En determinadas realizaciones, la energfa libre estandar de esta reaccion por desplazamiento mas R7In(c) esta dentro de 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 kcal/mol de cero kcal/mol.
En algunas realizaciones, un duplex de cebador puede incluir una o mas regiones de horquilla que conectan la hebra complementaria a la hebra protectora. En determinadas realizaciones, la region de horquilla de un duplex de cebador puede tener cualquier longitud. En algunas realizaciones, la region de horquilla tiene una longitud de mas de 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 nucleotidos. En algunas realizaciones, la secuencia de la horquilla no es complementaria a una secuencia de la molecula de acido nucleico diana.
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En determinadas realizaciones, la region de horquilla tiene una secuencia de poli-mononucleotido, tal como una secuencia de poli-adenosina, una secuencia de poli-desoxiadenosina, una secuencia de poli-5'-metiluridina, una secuencia de poli-timidina, una secuencia de poli-guanosina, una secuencia de poli-desoxiguanosina, una secuencia de poli-citidina, una secuencia de poli-desoxicitidina, una secuencia de poliuridina o una secuencia de poli- desoxiuridina.
El duplex de cebador descrito en el presente documento puede estar en una de al menos dos orientaciones. Por ejemplo, en una orientacion, la region de extremos cohesivos esta ubicada en el extremo 5', inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama complementaria (es decir, sin nucleotidos participates entre las dos regiones), y la region de equilibrio complementaria esta ubicada en el extremo 3', inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama complementaria. En esta orientacion, la region de equilibrio protectora esta en el extremo 5' de la hebra protectora, inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama protectora (Figura 1A). En otra orientacion, la region de extremos cohesivos esta ubicada en el extremo 3', inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama complementaria, y la region de equilibrio complementaria esta ubicada en el extremo 5', inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama complementaria. En esta orientacion, la region de equilibrio protectora esta en el extremo 3' de la hebra protectora, inmediatamente adyacente a la region de migracion de rama protectora (Figura 1B).
Independientemente de la orientacion, la secuencia de la region de equilibrio complementaria es tal que:
\AG° - AG° - AG;\< AGcr
donde:
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de complementaria;
la region de equilibrio protectora con la region de equilibrio
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la secuencia inmediatamente adyacente en la primera direccion con respecto a la secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana; y
AG
o
a es de 3,5 kcal/mol.
En algunas realizaciones, un duplex de cebador comprende una hebra complementaria mas larga que la region protectora, de manera que la diferencia de longitud depende de la longitud de la region de extremos cohesivos de la hebra complementaria. Las longitudes de los cebadores se disenan de tal manera que la hibridacion del complemento con la diana de interes tenga una energfa libre estandar (AG0) proxima a cero. La liberacion de la hebra protectora (a partir del duplex de cebador) garantiza que esta reaccion de hibridacion sea entropicamente neutra y robusta con respecto a la concentracion. Como resultado de ello, en algunas realizaciones, esta reaccion a temperatura ambiente (por ejemplo, a aproximadamente 25 °C o aproximadamente 298K) iguala la especificidad de hibridacion lograda cerca de la temperatura de fusion en muchas condiciones.
Tal como se pretende en el presente documento, una AG° (cambio en la energfa libre estandar) “proxima a cero” se refiere a un valor absoluto (cantidad) de menos de o aproximadamente de 1 kcal/mol, menos de o aproximadamente 2 kcal/mol, menos de o aproximadamente 3 kcal/mol, o menos de o aproximadamente 3,5 kcal/mol. En algunas realizaciones, la energfa libre estandar de una region de equilibrio o region de extremos cohesivos es >-1 kcal/mol a < 1 kcal/mol >-3 kcal/mol a <3 kcal/mol o >-3,5 kcal/mol a <3,5 kcal/mol.
Los duplex de cebador se pueden preparar a una proporcion de hebra protectora con respecto a hebra complementaria de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la proporcion de hebra protectora con respecto a hebra complementaria es de aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1 o aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la proporcion de hebra protectora con respecto a hebra complementaria es de 2:1, 2,1:1, 2,2:1, 2,3:1, 2,4:1, 2,5:1, 2,6:1, 2,7:1, 2,8:1, 2,9:1, 3:1, 3,1:1, 3,2:1, 3,3:1, 3,4:1, 3,5:1, 3,6:1, 3,7:1, 3,8:1, 3,9:1, 4:1, 4,2:1, 4,3:1, 4,4:1, 4,5:1, 4,6:1, 4,7:1, 4,8:1, 4,9:1 o 5:1. Los duplex de cebador tambien pueden usarse junto con hebra protectora en exceso en cualquiera de los ensayos o las reacciones descritos en el presente documento. La hebra protectora puede estar en un exceso molar aproximadamente igual a o mas de 2, 5, 10, 20, 50, 100 o 500 veces con relacion al cebador.
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Sistemas de duplex de cebador de horquilla (por ejemplo, sistemas de hebra individual)
En determinadas realizaciones, un duplex de cebador incluye un solo acido nucleico que comprende una region o un dominio complementario, una region de horquilla y una region o un dominio protector. En algunas realizaciones, el dominio complementario se hibrida con el dominio protector, formando un duplex de cebador que tiene una region de bucle de horquilla participante. Como otros sistemas de cebador divulgados en el presente documento, tales sistemas de cebador de horquilla se disenan para hibridarse espedficamente con una molecula de acido nucleico diana. En el presente documento, un “sistema de duplex de cebador de horquilla” o un “sistema de horquilla” incluye una region de equilibrio complementaria, una region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos, una region de equilibrio protectora y una region de migracion de rama protectora. Tal como se describio anteriormente, una region de equilibrio complementaria es complementaria a una region de equilibrio protectora; una region de migracion de rama complementaria es complementaria a una region de migracion de rama protectora y una region diana de acido nucleico; y una region de extremos cohesivos es complementaria a una region diana de acido nucleico. Una region de migracion de rama protectora corresponde a una region diana de acido nucleico y es complementaria a una region de migracion de rama complementaria. Dado que los sistemas de duplex de cebador de horquillas descritos en el presente documento estan formados por una molecula individual de acido nucleico, el diseno de la region de equilibrio complementaria dependera de la temperatura y concentracion a las que va a usarse el sistema de cebador, tal como se describe en el presente documento. Ha de entenderse que aunque puede usarse la secuencia de la molecula de acido nucleico diana para describir las caractensticas de los sistemas de cebador, en algunas realizaciones, el propio acido nucleico diana puede ser o no un componente del sistema de cebador (por ejemplo, sistemas de doble hebra o de hebra individual).
Para los duplex de cebador que tienen una region de horquilla, puede considerarse la energfa libre estandar del confinamiento de la region de horquilla cuando se determina la energfa libre estandar para la reaccion en la que la hebra protectora se desplaza de la hebra complementaria por parte del acido nucleico diana. En la tabla 1 se proporcionan valores aproximados para la energfa libre estandar de confinamiento de horquilla para horquillas de diversos tamanos (de SantaLucia y Hicks, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 33:414-440, (2004)).
Tamano de horquilla
AG° de confinamiento de horquilla
3 nt
3,5 kcal/mol
4 nt
3,5 kcal/mol
5 nt
3,3 kcal/mol
6 nt
4,0 kcal/mol
7 nt
4,2 kcal/mol
8 nt
4,3 kcal/mol
9 nt
4,5 kcal/mol
10 nt
4,6 kcal/mol
12 nt
5,0 kcal/mol
14 nt
5,1 kcal/mol
16 nt
5,3 kcal/mol
18 nt
5,5 kcal/mol
20 nt
5,7 kcal/mol
25 nt
6,1 kcal/mol
30 nt
6,3 kcal/mol
La energfa libre estandar del confinamiento de las regiones de horquilla que tienen longitudes no proporcionadas en la Tabla 1 (por ejemplo, una longitud de n) se puede estimar usando la siguiente ecuacion:
AG0(bucle - n) = AG0(bucle - x) + 2,44RT ln(n/x)
donde AG°(bucle - n) es la energfa libre estandar desconocida del confinamiento de una region de horquilla de n nucleotidos de longitud, AG°(bucle - x) es la energfa libre estandar conocida del confinamiento de una region de horquilla de n nucleotidos de longitud (por ejemplo, tal como se proporciona en la Tabla 1), R es la constante de los gases ideales, y T es la temperatura a la que va a usarse el duplex de cebador. Se proporciona informacion adicional sobre el calculo de energfas libres estandar de la region de confinamiento de horquilla en SantaLucia y Hicks, id.
Los sistemas de duplex de cebador de horquilla descritos en el presente documento pueden estar en una de al menos dos orientaciones. Por ejemplo, en una orientacion mostrada en la Figura 2a, la region de extremos cohesivos esta ubicada en el extremo 5' de la molecula de acido nucleico. El extremo 5' de la region de migracion de rama complementaria es inmediatamente adyacente al extremo 3' de la region de extremos cohesivos; el extremo 5' de la region de equilibrio complementaria es inmediatamente adyacente al extremo 3' de la region de migracion de rama complementaria; el extremo 5' de la region de horquilla es inmediatamente adyacente al extremo 3' de la region de equilibrio complementaria; el extremo 5' de la region de equilibrio protectora es inmediatamente adyacente
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al extremo 3' de la region de horquilla; y el extremo 5' de la region de migracion de rama protectora es inmediatamente adyacente al extremo 3' de la region de equilibrio protectora. En esta orientacion, cuando la molecula de acido nucleico se somete a condiciones que permiten la hibridacion, la region de horquilla forma un bucle que se extiende desde la region de equilibrio complementaria y la region de equilibrio protectora. En otra orientacion mostrada en la Figura 2B, la region de extremos cohesivos esta ubicada en el extremo 3' de la molecula de acido nucleico. El extremo 3' de la region de migracion de rama complementaria es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la region de extremos cohesivos; el extremo 3' de la region de equilibrio complementaria es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la region de migracion de rama complementaria; el extremo 3' de la region de horquilla es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la region de equilibrio complementaria; el extremo 3' de la region de equilibrio protectora es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la region de horquilla; y el extremo 3' de la region de migracion de rama protectora es inmediatamente adyacente al extremo 5' de la region de equilibrio protectora.
Independientemente de la orientacion, la region de equilibrio complementaria del sistema de duplex de cebador de horquilla tiene una secuencia tal que:
ag; - ag; - ag; + ag; + rt in (c)
< AG
o
R *
donde:
AG"3
v,i es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la region de equilibrio complementaria;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de equilibrio protectora con la secuencia inmediatamente adyacente en la primera direccion con respecto a la secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana;
AG
4 es la energfa libre estandar de confinamiento de la region de horquilla;
R es la constante de los gases ideales;
T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el sistema de cebador; y
AG
o
R es de 3,5 kcal/mol.
Otros sistemas de cebador
Se representan sistemas de cebador adicionales en las Figuras 4-7. Cada uno de estos sistemas de cebador incluye un dominio complementario y dos dominios protectores. El dominio complementario tiene una region individual de extremos cohesivos que esta flanqueada por dos regiones de migracion de rama complementarias y dos regiones de equilibrio complementarias. Cada uno de los dominios protectores incluye una region de migracion de rama protectora que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de una de las regiones de migracion de rama complementaria, y una region de equilibrio protectora que tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de una de las regiones de equilibrio complementarias. La diferencia entre los sistemas de cebador de las Figuras 4-7 esta en el numero y ubicacion de las regiones de horquilla, lo que afecta a su vez el diseno de las regiones de equilibrio complementarias. Como los demas sistemas de cebador divulgados en el presente documento, estos sistemas de cebador se disenan para hibridarse espedficamente con un acido nucleico diana. Aunque se usa la secuencia del acido nucleico diana para describir las caractensticas de un sistema de cebador, en algunas realizaciones, el acido nucleico diana no es un componente del sistema de cebador.
Tal como se representa en la Figura 4, un sistema de cebador puede tener, en el orden de 3' a 5', un primer dominio protector, una primera region de horquilla, un dominio complementario, una segunda region de horquilla y un segundo dominio protector.
En dichas realizaciones, el primer dominio protector incluye una primera region de migracion de rama protectora y
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una primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama protectora tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana. La primera region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
En esta realizacion, la primera region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio protectora.
El dominio complementario de tales acidos nucleicos diana comprende una primera region de equilibrio complementaria, una primera region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos, una segunda region de migracion de rama complementaria y una segunda region de equilibrio complementaria. La primera region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora. La region de extremos cohesivos esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es no complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
En dichas realizaciones, la segunda region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio complementaria.
En esta realizacion, el segundo dominio protector incluye una segunda region de equilibrio protectora y una segunda region de migracion de rama protectora. La segunda region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de horquilla y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria. La segunda region de migracion de rama protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria.
Segun esta realizacion, la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
imagen2
donde:
A(^°
I es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de equilibrio complementaria;
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
0
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana;
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AG°
es la energfa libre estandar de confinamiento de la primera region de horquilla;
A G°
es la energfa libre estandar de confinamiento de la segunda region de horquilla; R es la constante de los gases ideales;
T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el sistema de cebador; y
AC'0
es de 3,5 kcal/mol.
Tal como se representa en la Figura 5, en determinadas realizaciones, un sistema de cebador puede tener un cebador de horquilla y un protector, en el que el cebador de horquilla es un acido nucleico que incluye un primer dominio protector, una primera region de horquilla, un dominio complementario y el protector es un acido nucleico que incluye un segundo dominio protector.
En dichas realizaciones, el primer dominio protector incluye una primera region de migracion de rama protectora y una primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama protectora tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana. La primera region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
En esta realizacion, la region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio protectora.
El dominio complementario de tales acidos nucleicos diana comprende una primera region de equilibrio complementaria, una primera region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos, una segunda region de migracion de rama complementaria y una segunda region de equilibrio complementaria. La primera region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de horquilla y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora. La region de extremos cohesivos esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
En esta realizacion, el segundo dominio protector incluye una segunda region de equilibrio protectora y una segunda region de migracion de rama protectora. La segunda region de equilibrio protectora tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria. La segunda region de migracion de rama protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria.
Segun esta realizacion, la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
a Gy - ag: + a g; - a g; - ag; + a gi
< A G
Q
R »
donde:
AC0
v,i es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
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AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
AC°
es la ene^a libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de equilibrio complementaria;
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
0
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana;
AC°
es la energfa libre estandar de confinamiento de la region de horquilla; y
AC'0
es de 3,5 kcal/mol.
Tal como se representa en la Figura 6, en determinadas realizaciones un sistema de cebador puede tener un protector y un cebador de horquilla, en el que el protector es un acido nucleico que incluye un primer dominio protector y el cebador de horquilla es un acido nucleico que incluye un dominio complementario, la region de horquilla y un segundo dominio protector.
En tales realizaciones, el primer dominio protector incluye una primera region de migracion de rama protectora y una primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama protectora tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana. La primera region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
El dominio complementario de dichos acidos nucleicos diana comprende una primera region de equilibrio complementaria, una primera region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos, una segunda region de migracion de rama complementaria y una segunda region de equilibrio complementaria. La primera region de equilibrio complementaria tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora. La region de extremos cohesivos esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que no es complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
Segun dichas realizaciones, la region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio complementaria.
En esta realizacion el segundo dominio protector incluye una segunda region de equilibrio protectora y una segunda region de migracion de rama protectora. La segunda region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de horquilla y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria. La segunda region de migracion de rama protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria.
Segun esta realizacion, la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
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a Gy - ag: + a g; - a g; - ag; + ag6° < a g°r ,
donde:
v,i es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de equilibrio complementaria;
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y
0
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana;
AC°
es la energfa libre estandar de confinamiento de la region de horquilla; y
AC'0
es de 3,5 kcal/mol.
Tal como se representa en la Figura 7, en determinadas realizaciones un sistema de cebador puede tener una primera region protectora, un cebador complementario y un segundo protector, en el que el primer protector es un acido nucleico que incluye un primer dominio protector, el cebador complementario es un acido nucleico que incluye un dominio complementario, y el segundo protector es un acido nucleico que incluye un segundo dominio protector.
En dichas realizaciones, el primer dominio protector incluye una primera region de migracion de rama protectora y una primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama protectora tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana. La primera region de equilibrio protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama protectora y tiene una secuencia que no corresponde a la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
El dominio complementario de tales acidos nucleicos diana comprende una primera region de equilibrio complementaria, una primera region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos, una segunda region de migracion de rama complementaria y una segunda region de equilibrio complementaria. La primera region de equilibrio complementaria tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la primera region de equilibrio protectora. La primera region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de equilibrio complementaria y tiene una secuencia complementaria a una primera region de migracion de rama protectora. La region de extremos cohesivos esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico diana en el acido nucleico diana. La segunda region de equilibrio complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia que es no complementaria a una secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna, en el acido nucleico diana.
En esta realizacion, el segundo dominio protector incluye una segunda region de equilibrio protectora y una segunda region de migracion de rama protectora. La segunda region de equilibrio protectora tiene una secuencia complementaria a la segunda region de equilibrio complementaria. La segunda region de migracion de rama protectora esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de equilibrio protectora y tiene una secuencia complementaria a la segunda region de migracion de rama complementaria.
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Segun esta realizacion, la primera region de equilibrio complementaria y la segunda region de equilibrio complementaria tienen secuencias tales que:
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donde:
A(^°
v,i es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio protectora con la primera region de equilibrio complementaria;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la primera region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 5' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna;
AC°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio protectora con la segunda region de equilibrio complementaria;
AG°
es la energfa libre estandar de hibridacion de la segunda region de equilibrio complementaria con la secuencia inmediatamente en 3' con respecto a la tercera secuencia de acido nucleico diana, si hubiera alguna; y
0
es la energfa libre estandar de hibridacion de la region de extremos cohesivos con la segunda secuencia de acido nucleico diana;
R es la constante de los gases ideales;
T es la temperatura a la que va a usarse el sistema de cebador; c es la concentracion a la que va a usarse el sistema de cebador; y
AG
o
R es de 3,5 kcal/mol.
Sistemas de duplex de cebador que carecen de dominios de equilibrio
En algunas realizaciones, los sistemas de cebador pueden carecer de dominios de equilibrio. Dichos acidos nucleicos se hibridaran con un acido nucleico diana con cinetica rapida si el acido nucleico diana tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la region de extremos cohesivos del sistema de cebador, pero con cinetica lenta si el acido nucleico diana se muta de modo que no contenga una secuencia complementaria a la region de extremos cohesivos del sistema de cebador. Dichos sistemas de cebador son por tanto utiles, por ejemplo, para localizar diferencias y/o mutaciones en dianas de acido nucleico usando discriminacion cinetica.
Tal como se representa en la Figura 8, en determinadas realizaciones, un sistema de cebador puede incluir un acido nucleico que tenga, en el orden de 3' a 5', un primer dominio protector, una primera region de horquilla, un dominio complementario, una segunda region de horquilla y un segundo dominio protector. El primer dominio protector de dichos sistemas de cebador tiene una secuencia que corresponde a una primera secuencia de acido nucleico diana. La primera region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto al primer dominio protector. El dominio complementario tiene una primera region de migracion de rama complementaria, una region de extremos cohesivos y una segunda region de migracion de rama complementaria. La primera region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de horquilla y tiene una secuencia complementaria a la secuencia de migracion de rama del primer dominio protector. La region de extremos cohesivos esta inmediatamente en 5' con respecto a la primera region de migracion de rama complementaria y tiene una secuencia complementaria a una segunda secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la primera secuencia de acido nucleico diana en la molecula de acido nucleico diana. La segunda region de migracion de rama complementaria esta inmediatamente en 5' con respecto a la region de extremos cohesivos y tiene una secuencia complementaria a una tercera secuencia de acido nucleico diana que esta inmediatamente en 3' con respecto a la segunda secuencia de acido nucleico. La segunda region de horquilla esta inmediatamente en 5' con respecto a la segunda region de migracion de rama complementaria. El segundo dominio protector tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de la segunda region de migracion de rama complementaria.
Modificaciones de cebador en general
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Cada cebador descrito en el presente documento puede comprender ADN, ARN, o analogos de los mismos, y/o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, un cebador comprende uno o mas nucleotidos no naturales. La incorporacion de nucleotidos no naturales en los cebadores puede aumentar adicionalmente el rendimiento de los duplex de cebador. En particular, puede suceder que la hebra protectora, mientras que no se pretenda que sirva para iniciar la transcripcion, sea complementaria a otras regiones de la diana u otras moleculas de fondo, y pueda iniciar falsamente la replicacion/transcripcion. Para impedir esto, el uso de un nucleotido no natural o un didesoxinucleotido en el extremo 3' de la segunda hebra protectora puede servir para impedir el cebado no deseado por esa hebra. Los ejemplos de nucleotidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, iso-C, iso-G, desoxiuridina (vease tambien Krueger et al. Chem Biol. 16:242-48 (2009).
En algunas realizaciones, por ejemplo, en una reaccion en cadena de polimerasa (PCR) en la que se usa una funcion enzimatica cebada repetida, la hebra complementaria extendida puede convertirse en una diana para la hibridacion posterior del cebador. Para preservar la especificidad de hibridacion del cebador para tandas de amplificacion posteriores, no puede replicarse una region de equilibrio de un cebador. La introduccion de un nucleotido no natural en la interfaz entre las regiones de migracion de rama y de equilibrio de la hebra complementaria, por ejemplo, puede evitar que se replique la region de equilibrio.
En determinadas realizaciones, los cebadores descritos en el presente documento sirven como puntos de partida para extensiones de polimerasa. Para facilitar el analisis de los fragmentos amplificados (acido nucleico), tambien pueden usarse cebadores marcados en reacciones PCR. Los cebadores marcados son aquellos que se acoplan (o conjugan) a un resto detectable. Los ejemplos incluyen colorantes fluorescentes, marcadores radiactivos y metales identificables, secuencias de acido nucleico y proternas. Cuando se lleva a cabo una reaccion con cebadores marcados con fluorescencia, pueden generarse amplicones (productos de acido nucleico) con un marcador fluorescente.
Los cebadores descritos en el presente documento se pueden sintetizar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica (veanse, por ejemplo, Ogilvie et al. J. Amer. Chem. Soc. 99 (23): 7741-7743; Reese, C. B. Tetrahedron 34(21): 3143 (1978); Efimov et al. Nucleic Acids Res. 11(23): 8369-8387 (1983); Garegg et al. Tetrahedron Lett. 27(34): 4051 (1986); Beaucage et al. Tetrahedron 48(12): 2223 (1992); Efimov et al. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 26 (8-9): 1087-93 (2007).
Moleculas de acido nucleico diana
Una “diana” puede ser un acido nucleico de hebra individual (mc) o de doble hebra (bc). Los acidos nucleicos diana pueden ser, por ejemplo, ADN, ARN, o el producto de ADN de ARN sometido a transcripcion inversa. En algunas realizaciones, una diana puede ser una mezcla (quimera) de ADN y ARN. En otras realizaciones, una diana comprende analogos artificiales de acido nucleico, por ejemplo, acidos nucleicos peptfdicos (Nielsen et al. Science 254(5037): 1497-500 (1991)) o acidos nucleicos bloqueados (Alexei et al. Tetrahedron 54(14): 3607-30 (1998)). En algunas realizaciones, se puede producir una diana de manera natural (por ejemplo, ADN genomico) o puede ser sintetica (por ejemplo, a partir de una biblioteca genomica). Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de acido nucleico “de origen natural” es una secuencia que esta presente en moleculas de acido nucleico de organismos o virus que existen en la naturaleza en ausencia de intervencion humana. En algunas realizaciones, una diana es ADN genomico, ARN mensajero, ARN ribosomico, micro-ARN, pre-micro-ARN, pro-micro-ARN, ADN vmco, ARN vmco o ARN asociado a Piwi. En determinadas realizaciones, un acido nucleico diana es un acido nucleico de origen natural en un organismo o virus. En algunas realizaciones, un acido nucleico diana es el acido nucleico de un organismo o virus patogeno. En determinadas realizaciones, la presencia o ausencia de un acido nucleico diana en un sujeto es indicativa de que el sujeto tiene una enfermedad o un trastorno o esta predispuesto a adquirir una enfermedad o un trastorno. En determinadas realizaciones, la presencia o ausencia de un acido nucleico diana en un sujeto es indicativa de que el sujeto respondera bien o escasamente a un tratamiento, tal como un farmaco, para tratar una enfermedad o un trastorno.
El termino “polinucleotido” y las expresiones “acido nucleico” y “molecula de acido nucleico” se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimerica de nucleotidos de cualquier longitud, o bien desoxirribonucleotidos o bien ribonucleotidos, o analogos de los mismos. Los polinucleotidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier funcion. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleotidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento genico, loci (locus) definidos a partir del analisis de union, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomico, ribozimas, ADNc, polinucleotidos recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de acido nucleico y cebadores. Un polinucleotido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleotidos metilados y analogos de nucleotidos. Si estan presentes, las modificaciones a la estructura de nucleotidos pueden conferirse antes o despues del ensamblaje del polfmero. Un polinucleotido puede modificarse adicionalmente, tal como mediante conjugacion con un componente de marcaje. El termino polinucleotido “recombinante” significa un polinucleotido de origen genomico, ADNc, semisintetico o sintetico que, bien no se produce en la naturaleza o bien se une a otro polinucleotido en una configuracion no natural. La expresion “acido nucleico aislado” se refiere a un polinucleotido de origen natural o sintetico o alguna combinacion de los mismos, que (1) no se asocia con la celula en la que el “acido nucleico aislado” se encuentra en la naturaleza,
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y/o (2) esta operativamente unido a un polinucleotido al que no se une en la naturaleza.
Un acido nucleico tambien puede englobar ADN y ARN de hebra individual o doble, as^ como todas y cada una de las formas de acido nucleico alternativo que contienen cadenas principales, bases y azucares modificados. Por tanto, se entendera que la expresion “acido nucleico” incluye, pero no se limita a, ADN o ARN de hebra individual o doble (y formas de los mismos que pueden ser parcialmente de hebra individual o parcialmente de doble hebra), ADNc, aptameros, acidos nucleicos peptfdicos (“PNA”), ADN 2'-5' (un material sintetico con una cadena principal acortada que tiene un espaciado de bases que concuerda con la conformacion A de ADN; el ADN 2'-5' no se hibrida normalmente con ADN en la forma B, pero se hibrida facilmente con ARN), y acidos nucleicos bloqueados (“LNA”). Los analogos de acido nucleico incluyen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades similares o mejoradas de union, hibridacion de apareamiento de bases. Las formas “analogas” de purinas y pirimidinas se conocen bien en la tecnica, e incluyen, pero no se limitan a, aziridinilcitosina, 4-acetilcitosina, 5- fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, inosina, N6- isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2- metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, ester metilico del acido uracil-5-oxiacetico, seudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, acido uracil-5-oxiacetico y 2,6-diaminopurina. Los analogos de cadena principal de ADN proporcionados en el presente documento incluyen fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquilfosfotriester, sulfamato, 3'-tioacetal, metilen(metilimino), 3'-N- carbamato, morfolinocarbamato, y acidos nucleicos peptfdicos (PNA), uniones metilfosfonato o uniones alternas metilfosfonato y fosfodiester (Strauss-Soukup, 1997, Biochemistry 36:8692-8698), y uniones bencilfosfonato, tal como se comenta en la patente de EE.UU. N.° 6.664.057; vease tambien OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES, A PRACTICAL APPROACH, editado por F. Eckstein, IRL Press en Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volumen 600, Eds. Baserga y Denhardt (NYAS 1992); Milligan, 1993, J. Med. Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los acidos nucleicos del presente documento pueden extraerse a partir de celulas o se pueden preparar de manera sintetica segun cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica; por ejemplo, los acidos nucleicos pueden sintetizarse qmmicamente o transcribirse o someterse a transcripcion inversa a partir de ADNc o ARNm, entre otras fuentes.
Tal como se usa en el presente documento, dos acidos nucleicos o regiones de acido nucleico “se corresponded’ entre sf en caso de que ambas sean complementarias con respecto a la misma secuencia de acido nucleico. Dos acidos nucleicos o regiones de acido nucleico son “complementarias” entre sf en caso de presentar apareamiento de bases entre sf para formar una molecula de acido nucleico de doble hebra.
Los acidos nucleicos diana utilizados en el presente documento pueden ser cualquier acido nucleico, por ejemplo, acidos nucleicos humanos, acidos nucleicos bacterianos o acidos nucleicos vdicos. Una muestra de acido nucleico diana puede ser, por ejemplo, una muestra de acido nucleico de una o mas celulas, tejidos o fluidos corporales. Las muestras diana pueden proceder de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, eucariotas, plantas, animales, vertebrados, peces, mairnferos, humanos, animales no humanos, bacterias, microbios, virus, fuentes biologicas, suero, plasma, sangre, orina, semen, lfquido linfatico, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido amniotico, biopsias, biopsias por puncion con aguja, canceres, tumores, tejidos, celulas, lisados celulares, lisados celulares en bruto, lisados tisulares, celulas en cultivo tisular, frotis bucales, enjuagues bucales, deposiciones, tejido momificado, fuentes forenses, autopsias, fuentes arqueologicas, infecciones, infecciones hospitalarias, fuentes de produccion, preparaciones farmacologicas, producciones de moleculas biologicas, preparaciones de protemas, preparaciones de ifpidos, preparaciones de hidratos de carbono, objetos inanimados, aire, suelo, savia, metal, fosiles, materiales de excavacion, y/o otros materiales y fuentes terrestres o extraterrestres. La muestra tambien puede contener mezclas de un material de una fuente o diferentes fuentes. Por ejemplo, pueden amplificarse acidos nucleicos de una bacteria o virus infectivo junto con acidos nucleicos humanos cuando se amplifican acidos nucleicos de dichas celulas o tejidos infectados usando los metodos divulgados. Los tipos de muestras diana utiles incluyen muestras de eucariotas, muestras de plantas, muestras de animales, muestras de vertebrados, muestras de peces, muestras de mamnferos, muestras humanas, muestras no humanas, muestras bacterianas, muestras microbianas, muestras vmcas, muestras biologicas, muestras de suero, muestras de plasma, muestras de sangre, muestras de orina, muestras de semen, muestras de lfquido linfatico, muestras de lfquido cefalorraqrndeo, muestras de lfquido amniotico, muestras de biopsia, muestras de biopsia por puncion con aguja, muestras de cancer, muestras de tumor, muestras de tejido, muestras de celulas, muestras de lisado celular, muestras de lisado celular en bruto, muestras de lisado tisular, muestras de celulas en cultivo tisular, muestras de frotis bucal, muestras de enjuague bucal, muestras de deposiciones, muestras de tejido momificado, muestras de autopsia, muestras arqueologicas, muestras de infeccion, muestras de infeccion hospitalaria, muestras de produccion, muestras de preparacion farmacologica, muestras de produccion de moleculas biologicas, muestras de preparacion de protemas, muestras de preparacion de lfpidos, muestras de preparacion de hidratos de carbono, muestras de objeto inanimado, muestras de aire, muestras de suelo, muestras de savia, muestras de metal, muestras de fosiles, muestras de material de excavacion y/u otras muestras terrestres o extraterrestres.
En algunas realizaciones, los acidos nucleicos diana utilizados en el presente documento comprenden una
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secuencia repetitiva, estructura secundaria y/o un alto contenido de G/C.
En determinadas realizaciones, una molecula de acido nucleico diana de interes tiene una longitud de aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000.000 nucleotidos (nt). En algunas realizaciones, la diana tiene una longitud de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000, de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000, o de aproximadamente 100.000 a aproximadamente 1.000.000 nucleotidos. En algunas realizaciones, la diana tiene una longitud de aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 4.000, aproximadamente 5.000,
aproximadamente 6.000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 50.000, aproximadamente 90.000, aproximadamente 400.000, aproximadamente 800.000
aproximadamente 7.000, aproximadamente 20.000, aproximadamente 60.000, aproximadamente 100.000, aproximadamente 500.000, aproximadamente 900.000
aproximadamente 8.000, aproximadamente 30.000, aproximadamente 70.000, aproximadamente 200.000, aproximadamente 600.000,
aproximadamente 9000, aproximadamente 40.000, aproximadamente 80.000, aproximadamente 300.000, aproximadamente 700.000,
o aproximadamente 1.000.000 nucleotidos. Ha de
entenderse que el acido nucleico diana puede proporcionarse en el contexto de un acido nucleico mas largo (por ejemplo, tal como una secuencia de codificacion o un gen dentro de un cromosoma o un fragmento de cromosoma).
En determinadas realizaciones, una diana de interes es lineal, mientras que en otras realizaciones, una diana es circular (por ejemplo, ADN de plasmido, ADN mitocondrial o ADN plastfdico).
Sistemas cebador-diana combinados
En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento sistemas cebador-diana. Un sistema cebador- diana comprende una o mas dianas de acido nucleico, una polimerasa y uno o mas cebadores (por ejemplo, duplex de cebador y/o duplex de cebador de horquilla). El termino “cebador” engloba uno cualquiera de los cebadores o sistemas de cebador descritos en el presente documento (por ejemplo, cebadores de hebra individual, duplex de cebador de doble hebra y duplex de cebador de horquilla). En determinadas realizaciones, los sistemas cebador- diana descritos en el presente documento comprenden una pluralidad de diferentes cebadores. En algunas realizaciones, un sistema cebador-diana puede comprender al menos dos cebadores, que pueden usarse para identificar y, por ejemplo amplificar, una molecula de acido nucleico diana. Una molecula de acido nucleico diana puede estar presente entre una pluralidad de moleculas de acido nucleico que no sean diana, por ejemplo, como una copia individual o en un bajo numero de copias. Uno cualquiera de los sistemas cebador-diana descritos en el presente documento puede comprender condiciones similares a las usadas en reacciones de secuenciacion o amplificacion de acido nucleico (por ejemplo, reactivos, temperatura de reaccion similares, etc.).
Metodos de uso
Los sistemas de cebador descritos en el presente documento son capaces de discriminar una diana espedfica de dianas falsas bien a traves de un mecanismo termodinamico o bien a traves de un mecanismo cinetico. En la distincion de la diana frente a dianas falsas usando un mecanismo termodinamico (descrito a continuacion), se ejecuta la reaccion por desplazamiento de hebra hasta que se completa y se distingue la diana de las dianas falsas basandose en diferencias de afinidad de union en equilibrio. Para distinguir la diana de dianas falsas usando un mecanismo cinetico (descrito a continuacion), la reaccion por desplazamiento de hebra se detiene antes de alcanzar el equilibrio, y se usa la tasa diferencial para completar la reaccion con objeto de distinguir las dianas de las dianas falsas.
Separacion termodinamica
La estrategia general para el mecanismo tanto termodinamico como cinetico consiste en usar reacciones de desplazamiento de hebra de intercambio de extremos cohesivos. En general, el intercambio de extremos cohesivos implica la extension de un complemento de la diana con una region adicional que no es complementaria a la diana, y la pre-hibridacion de una hebra protectora con esta hebra complementaria extendida y un gran numero de bases adyacentes a la region extendida, pero no con una region de extremos cohesivos de hebra individual.
La Figura 9 representa una implementacion de intercambio de extremos cohesivos. En esta implementacion, se usa un sistema de duplex de cebador de doble hebra (tal como se describio anteriormente y se representa en la Figura 1A) para distinguir entre un acido nucleico diana y una diana falsa. La region de migracion de rama complementaria y la region de extremos cohesivos de la hebra complementaria tienen secuencias que corresponden a una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana, respectivamente. Se diseno una region de equilibrio complementaria para que tuviese la misma longitud y distribucion de bases de nucleotido que la region de extremos cohesivos. De este modo, la energfa libre estandar de la reaccion por desplazamiento de hebra mostrada en la Figura 9A entre la diana verdadera y el complemento protegido es de aproximadamente AG0 = 0 kcal/mol.
La reaccion por desplazamiento de hebra puede escribirse como:
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Diana + complemento protector <» Diana / complemento + protector
AG0 esta relacionada con la constante de equilibrio Keq mediante la siguiente relacion:
AG0 = R71n(Keq).
Para una reaccion con AG° = 0, la constante de equilibrio (Keq) es 1. La constante de equilibrio tambien esta relacionada con el equilibrio; para esta reaccion, Keq = [TC] [P] / [T] [PC] = 1. Para un ensayo en el que [PC] y [P] estan en exceso con respecto a [T], [TC] / [T] = 1, lo que significa que exactamente la mitad de todas las moleculas diana se hibridan en el equilibrio. En el ejemplo mostrado en la Figura 9A, AG° = +0,1 kcal/mol, lo que corresponde a Keq = 0,85, lo que significa que el 46 % de las moleculas diana se hibridan en el equilibrio.
La hebra protectora cambia de manera correspondiente la energfa libre estandar de la reaccion de desplazamiento de hebra con dianas falsas. En el ejemplo mostrado en la Figura 9B, la diana falsa difiere de la diana verdadera en una base individual, lo que da como resultado que la reaccion de desplazamiento de hebra con el mismo sistema de cebador de acido nucleico de doble hebra que tiene un valor de AG° de +3,7 kcal/mol, que corresponde a Keq = 1,9 * 10-3 En el equilibrio, unicamente el 0,19 % de la diana falsa se hibrida con el complemento. Por tanto, el sistema de cebador de acido nucleico a modo de ejemplo representado en la Figura 8 se une preferentemente a su diana frente a una diana falsa que unicamente tiene un apareamiento erroneo de un solo nucleotido en mas de 200 veces.
La Figura 10 es un diagrama de la afinidad de union en equilibrio en funcion de la energfa libre estandar de la reaccion. Cuando la energfa libre estandar de la reaccion es muy negativa (como en el caso en una reaccion de hibridacion pura), tanto la diana como las dianas falsas se unen de manera muy fuerte, y es diffcil para distinguir entre las dos, lo que conduce a falsos positivos. Por otra parte, cuando la energfa libre estandar de la reaccion es muy positiva, el cebador se une a la diana de manera muy debil, lo que conduce a falsos negativos. El diseno de un sistema de duplex de cebador para que tenga una energfa libre estandar casi cero da como resultado una discriminacion optima entre dianas y dianas falsas, minimizando de ese modo los falsos positivos y falsos negativos.
Separacion cinetica
La separacion cinetica se basa en la cinetica diferencial de intercambio de extremos cohesivos. La cinetica de la reaccion de intercambio de extremos cohesivos depende de las intensidades de union de las regiones de extremos cohesivos. Cada kcal/mol de diferencia en la energfa de union de extremos cohesivos puede afectar a la cinetica en un factor de 5,4 (Figura 11), de modo que el apareamiento erroneo de +3,6 kcal/mol mostrado en la Figura 9B producina una ralentizacion cinetica de 434.
A diferencia de en la discriminacion termodinamica, la discriminacion cinetica se produce unicamente cuando el apareamiento erroneo esta en la region de extremos cohesivos. Es improbable que las dianas falsas que difieren de la diana verdadera en una posicion complementaria a la region de migracion de rama complementaria produzcan una cinetica de reaccion significativamente diferente. Como consecuencia, son utiles metodos que usan el mecanismo cinetico de distincion de diana con respecto a diana falsa junto con separacion termodinamica como medio de identificacion precisa de las ubicaciones de apareamientos erroneos de diana/cebador.
Significativamente, pueden usarse sistemas de duplex de cebador que carecen de regiones de equilibrio complementarias, tales como los sistemas de cebador representados en la Figura 8, en metodos que aprovechan el mecanismo cinetico para identificar con precision la ubicacion de apareamientos erroneos de diana/cebador.
Micromatrices
A menudo se usan de micromatrices de acido nucleico para la deteccion de acido nucleicos de alto rendimiento, pero a menudo son incapaces de distinguir entre secuencias de acido nucleico estrechamente relacionadas. En algunas realizaciones, los sistemas de duplex de cebador descritos en el presente documento pueden usarse en micromatrices de acido nucleico para mejorar, por ejemplo, la especificidad de analisis de las micromatrices. En algun caso, pueden realizarse ensayos de micromatrices usando metodos bien conocidos en la tecnica, con la excepcion de que los sistemas de duplex de cebador descritos en el presente documento pueden usarse en lugar de los cebadores de acido nucleico convencionales.
Por ejemplo, tal como se representa en la Figura 12A, en determinadas realizaciones, un sistema de duplex de cebador de horquilla puede sintetizarse o inmovilizarse directamente en un chip de micromatriz usando tecnicas convencionales. En otras realizaciones, puede usarse un sistema de duplex de cebador de doble hebra en una micromatriz de acido nucleico. En alguna realizacion, pueden sintetizarse estructuras de horquilla que incluyen dos bases fotoescindibles en posiciones predefinidas como en la Figura 12A. La exposicion posterior a luz escinde la horquilla, produciendo los complejos de doble hebra funcionalizados en la superficie del alineamiento (Figura 12B). Tambien pueden usarse otros metodos, tales como el uso de enzimas de corte o restriccion, para preparar
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complejos de doble hebra.
Reacciones de smtesis de acido nucleico, incluyendo reacciones de amplificacion
Los sistemas y duplex de cebador divulgados en el presente documento pueden usarse en algunas realizaciones para mejorar la especificidad de una reaccion de amplificacion basada en cebador, incluyendo la reaccion en cadena de polimerasa (PCR), amplificacion por desplazamiento de hebra o amplificacion mediada por transcripcion, sustituyendo los cebadores de acido nucleico por un sistema de duplex de cebador descrito en el presente documento en una reaccion de amplificacion basada en cebador conocida en la tecnica.
Por ejemplo, tal como se representa en la Figura 13, usando como cebadores de PCR los sistemas de duplex de cebador de horquilla del tipo representado en la Figura 4, es posible mejorar la especificidad de PCR para una variedad de aplicaciones (por ejemplo, biotecnologicas). En este ejemplo, se amplifica una secuencia de acido nucleico diana formando una disolucion que comprende un sistema de duplex de cebador con el acido nucleico diana y reactivos convencionales para realizar una reaccion de amplificacion e incubando la disolucion en condiciones tales que se produzca una reaccion de amplificacion. En determinadas realizaciones, se incorporan bases no naturales en un sistema de duplex de cebador de horquilla para impedir la replicacion de la propia horquilla.
En algunas realizaciones, los duplex de cebador descritos en el presente documento pueden adaptarse para su uso en la amplificacion de acidos nucleicos diana que normalmente requieren amplificacion mediante uno cualquiera o mas de los siguientes metodos de PCR: PCR espedfica de alelo, PCR de ensamblaje, PCR asimetrica, amplificacion dependiente de helicasa, PCR espedfica de intersecuencias (ISSR), PCR inversa, PCR mediada por union, PCR espedfica de metilacion (MSP), PCR de minicebadores, PCR multiplex, PCR anidada, PCR de extension por solapamiento, PCR cuantitativa (Q-PCR), PCR con transcripcion inversa (RT-PCR), PCR en fase solida, PCR termica de entrelazado asimetrico (TAIL-PCR), o PCR touchdown (con rampa decreciente de temperatura). En algunos casos, los duplex de cebador y los metodos descritos en el presente documento se pueden usar o adaptar para su uso en uno cualquiera de los metodos de PCR anteriores o pueden sustituir (usarse en lugar de) a uno cualquiera de los metodos de PCR anteriores. A continuacion se presenta una breve descripcion de cada uno de los metodos de PCR anteriores.
La PCR espedfica de alelo es una tecnica de diagnostico o clonacion basada en polimorfismos de nucleotido individual (SNP) (diferencias de base individual en el ADN). Requiere normalmente el conocimiento previo de una secuencia de ADN, incluyendo diferencias entre alelos.
La PCR de ensamblaje o ensamblaje dclico de polimerasa (PCA) es una smtesis artificial de secuencias de ADN largas realizando PCR en una combinacion de oligonucleotidos largos con segmentos solapantes cortos. Los oligonucleotidos se alternan entre direcciones sentido y antisentido, y los segmentos solapantes determinan el orden de los fragmentos de PCR, generando de ese modo selectivamente el producto de ADN largo final (Stemmer et al. Gene 164(1): 49-53 (1995)).
La PCR asimetrica amplifica preferentemente una hebra de ADN en un ADN diana de doble hebra. Se puede usar en la deteccion con sonda de hibridacion y secuenciacion cuando se requiere la amplificacion unicamente de una de las dos hebras complementarias (Innis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(24): 9436-40 (1988)).
La amplificacion dependiente de helicasa es similar a la PCR tradicional, pero normalmente usa una temperatura constante en lugar del funcionamiento dclico a traves de ciclos de desnaturalizacion e hibridacion/extension. La ADN helicasa, una enzima que desenrolla el ADN, se usa en lugar de la desnaturalizacion termica (Vincent et al. EMBO Reports 5(8): 795-800 (2004)).
La PCR espedfica de intersecuencias (ISSR) es un metodo de PCR para el analisis de la huella de ADN que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella unica de longitudes de fragmentos amplificados (Zietkiewicz et al. Genomics 20(2): 176-83 (1994)).
La PCR inversa se usa comunmente para identificar las secuencias flanqueantes alrededor de insertos genomicos. Implica una serie de digestiones ADN y auto-union, lo que da como resultado secuencias conocidas en ambos extremos de la secuencia desconocida (Ochman et al. Genetics 120 (3): 621-623 (1988)).
La PCR mediada por union usa pequenos agentes de union de ADN ligados al ADN de interes y multiples cebadores que se hibridan con los agentes de union de ADN; se ha usado para la secuenciacion de ADN, paseo genomico y analisis de la huella de ADN (Mueller et al. Science 246(4931): 780-786 (1988)).
La PCR espedfica de metilacion (MSP) se usa para detectar la metilacion de islas de CpG en ADN genomico. En primer lugar se trata ADN con bisulfito de sodio, que convierte bases de citosina no metiladas en uracilo, que lo reconocen los cebadores como timina.
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La PCR de minicebadores usa una polimerasa termoestable (S-Tbr) y se usa para amplificar secuencias de ADN conservadas, tales como el gen de ARNr 16S (o 18S eucariota) (Isenbarger et al. Applied and Environmental Microbiology 74(3): 840-9. (2008)).
La PCR multiplex selecciona como diana multiples genes a la vez, adquiriendo informacion adicional a partir de una ejecucion de una prueba individual, lo que, en caso contrario requerina para llevarse a efecto, los reactivos varias veces y mas tiempo.
La PCR anidada aumenta la especificidad de amplificacion de ADN, reduciendo el fondo debido a la amplificacion no espedfica de ADN. Se usan dos conjuntos de cebadores en dos PCR sucesivas. En la primera reaccion, se usa un par de cebadores para generar productos de ADN, que ademas de la diana pretendida, pueden consistir todavfa en fragmentos de ADN amplificados de manera no espedfica. El/los producto(s) se usa(n) entonces en una segunda PCR con un conjunto de cebadores cuyos sitios de union son completa o parcialmente diferentes de y estan ubicados en 3' con respecto a cada uno de los cebadores usados en la primera reaccion.
La PCR de extension por solapamiento o corte y empalme mediante extension por solapamiento (SOE) es una tecnica de ingeniena genetica que se usa para someter conjuntamente a corte y empalme dos o mas fragmentos de ADN que contienen secuencias complementarias. Se usa para unir trozos de aDn que contienen genes, secuencias reguladoras o mutaciones; la tecnica permite la creacion de montajes de ADN largos y espedficos.
La PCR cuantitativa (Q-PCR) se usa para medir la cantidad de un producto de PCR (comunmente en tiempo real). Mide cuantitativamente cantidades iniciales de ADN, ADNc o ARN. Q-PCR se usa comunmente para determinar si una secuencia de ADN esta presente en una muestra y el numero de sus copias en la muestra.
La PCR con transcripcion inversa (RT-PCR) se usa para amplificar ADN a partir de ARN. La transcriptasa inversa transcribe de manera inversa ARN para dar ADNc, que se amplifica entonces mediante PCR. La RT-PCR se usa ampliamente en la obtencion de perfiles de expresion, para determinar la expresion de un gen o para identificar la secuencia de un transcrito de ARN, incluyendo sitios de inicio y de terminacion de la transcripcion. Si se conoce la secuencia de ADN genomico de un gen, se puede usar la RT-PCR establecer el mapa de la ubicacion de exones e intrones en el gen. El extremo 5' de un gen (correspondiente al sitio de inicio de la transcripcion) se identifica normalmente mediante RACE-PCR (Amplificacion Rapida de Extremos de ADNc).
La PCR en fase solida engloba multiples significados, incluyendo amplificacion de colonias (en la que se derivan colonias de PCR en una matriz de gel, por ejemplo), PCR de puente (los cebadores se unen covalentemente a una superficie de soporte solido), PCR en fase solida convencional (en la que se aplica PCR asimetrica en presencia de un soporte solido que porta el cebador con secuencia que coincide con uno de los cebadores acuosos) y PCR en fase solida mejorada (en la que puede mejorarse la PCR en fase solida convencional empleando una alta temperatura de fusion (Tf) y un cebador de soporte solido anidado con la aplicacion opcional de una “etapa” termico para favorecer el cebado del soporte solido).
La PCR termica de entrelazado asimetrico (TAIL-PCR) se usa para el aislamiento de una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida. Dentro de la secuencia conocida, la TAIL-PCR usa un par anidado de cebadores con diferentes temperaturas de hibridacion; se usa un cebador degenerado para amplificar en la otra direccion desde la secuencia desconocida (Liu et al. Genomics 25 (3): 674-81. (1995)).
La PCR touchdown (PCR de disminucion progresiva (step-down)) es una variante de PCR que tiene como objetivo reducir el fondo no espedfico disminuyendo gradualmente la temperatura de hibridacion a medida que avanzan los ciclos de PCR. La temperatura de hibridacion en los ciclos iniciales esta habitualmente unos cuantos grados (3-5 °C) por encima de la Tf de los cebadores usados, mientras que en los ultimos ciclos, esta unos cuantos grados (3-5 °C) por encima de la Tf del cebador. Las temperaturas elevadas proporcionan mayor especificidad para la union al cebador, y las temperaturas bajas permiten una amplificacion mas eficaz de los productos espedficos formados durante los ciclos iniciales.
La temperatura de las disoluciones de reaccion se puede ciclar secuencialmente entre un estado de desnaturalizacion, un estado de hibridacion y un estado de extension para un numero predeterminado de ciclos. Las temperaturas y los tiempos reales pueden depender de enzima, cebador y diana.
Para cualquier reaccion dada, los estados de desnaturalizacion pueden oscilar en determinadas realizaciones desde aproximadamente 75 °C hasta aproximadamente 100 °C. La temperatura y el tiempo de hibridacion pueden influir en la especificidad y eficiencia de la union al cebador en un locus particular dentro de un acido nucleico diana y pueden ser importantes para reacciones de PCR particulares.
Para cualquier reaccion dada, los estados de hibridacion pueden oscilar en determinadas realizaciones desde aproximadamente 20 °C hasta aproximadamente 75 °C. En algunas realizaciones, el estado de hibridacion puede realizarse a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 35 °C, o de aproximadamente 35 °C a aproximadamente
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40 °C, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 45 °C, de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C. En determinadas realizaciones, el estado de hibridacion puede realizarse a temperatura ambiente (por ejemplo,
20 °C o 25 °C). En algunas realizaciones, el estado de hibridacion puede realizarse a una temperatura de 20 °C,
21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C, 41 °C, 42 °C, 43 °C, 44 °C, 45 °C, 46 °C, 47 °C, 48 °C, 49 °C o 50 °C.
La temperatura y el tiempo de extension pueden tener un impacto sobre el rendimiento de producto alelico y se entiende que son una propiedad inherente de la enzima objeto de estudio. Para una enzima dada, los estados de extension pueden oscilar en determinadas realizaciones desde aproximadamente 60 °C hasta aproximadamente 75 °C.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, se puede utilizar cualquier ADN o ARN polimerasa (enzima que cataliza la polimerizacion de nucleotidos en una hebra de acido nucleico), incluyendo polimerasas termoestables y transcriptasa inversas (RTasas). Los ejemplos incluyen pol I de Bacillus stearotermophilus, pol I de Thermus aquaticus (Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei (Pwo), Thermus flavus (Tfl), Thermus thermophilus (Tth), Thermus litoris (Tli) y Thermotoga maritime (Tma). Estas enzimas, versiones modificadas de estas enzimas, y combinacion de enzimas, estan disponibles comercialmente de proveedores que incluyen Roche, Invitrogen, Qiagen, Stratagene y Applied Biosystems. Las enzimas representativas incluyen PHUSION® (New England Biolabs, Ipswich, MA), Hot MasterTaq™ (Eppendorf), PHUSION® Mpx (Finnzymes), PyroStart® (Fermentas), KOD (EMD Biosciences), Z-Taq (TAKArA) y CS3Ac/LA (KlenTaq, Universidad City, Mo).
Las sales y los tampones incluyen aquellos con los que estan familiarizados los expertos en la tecnica, incluyendo los que comprenden MgCh y Tris-HCl y KCl, respectivamente. Los tampones pueden contener aditivos tales como tensioactivos, dimetilsulfoxido (DMSO), glicerol, albumina serica bovina (BSA) y polietilenglicol (PEG), asf como otros con los que estan familiarizados los expertos en la tecnica. Los nucleotidos son generalmente trifosfatos de desoxirribonucleosido, tales como desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxicitidina trifosfato (dCTP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP), y desoxitimidina trifosfato (dTTP), y tambien se anaden a una reaccion en cantidad adecuada para la amplificacion del acido nucleico diana.
Tambien se proporcionan en el presente documento metodos que comprenden (1) hibridar una hebra complementaria de un duplex de cebador con un acido nucleico diana, disociando de ese modo la hebra complementaria de su hebra protectora, y (2) extender la hebra complementaria en su extremo 3', de manera complementaria a la diana, en presencia de una polimerasa.
Tambien se proporcionan en el presente documento metodos que comprenden realizar una reaccion de smtesis de acido nucleico en presencia de un acido nucleico diana, una polimerasa y uno o mas de los duplex de cebador de una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento.
Una “reaccion de smtesis de acido nucleico” se refiere a cualquier reaccion en la que se sintetiza un acido nucleico. Los ejemplos incluyen reacciones de amplificacion de acido nucleico tales como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) o una variacion de la misma (descrita en otra parte en el presente documento), una reaccion de transcripcion, una reaccion de transcripcion inversa, secuenciacion mediante smtesis, u otras reacciones de extension del cebador (vease tambien, Lizardi et al. Nat. Genet. 19: 225-32 (1998).
En algunos casos, se proporciona un metodo que comprende (1) sintetizar una hebra complementaria que tiene una region de equilibrio no espedfica de diana, una region de migracion de rama espedfica de diana, y una region de extremos cohesivos espedfica de diana; (2) sintetizar una hebra protectora que tiene una region de equilibrio complementaria a la hebra complementaria y una region de migracion de rama complementaria a la hebra complementaria; e (3) hibridar la hebra complementaria con la hebra protectora para formar un duplex de cebador.
En algunos casos, se proporciona un metodo que comprende (1) proporcionar una hebra complementaria que tiene una region de equilibrio no espedfica de diana, una region de migracion de rama espedfica de diana y una region de extremos cohesivos espedfica de diana; (2) proporcionar una hebra protectora que tiene una region de equilibrio complementaria a la hebra complementaria y una region de migracion de rama complementaria a la hebra complementaria; y (3) combinar la hebra complementaria con la hebra protectora para formar un duplex de cebador.
En algunos casos, se proporciona un metodo que comprende (1) proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico que comprenden un acido nucleico diana; (2) proporcionar al menos un duplex de cebador que tiene (i) una region de equilibrio, (ii) una region de migracion de rama complementaria al acido nucleico diana y (iii) una region de extremos cohesivos; y (3) combinar en una reaccion individual la pluralidad de acidos nucleicos diana, al menos un duplex de cebador y una polimerasa en condiciones adecuadas para la hibridacion de acidos nucleicos.
Tambien se proporcionan en el presente documento metodos de amplificacion de al menos un acido nucleico diana de interes, que comprende (1) proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico que comprenden al menos un acido nucleico diana, (2) proporcionar al menos un duplex de cebador que tiene (i) una region de equilibrio, (ii) una region de migracion de rama y (iii) una region de extremos cohesivos; y (3) combinar en una
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reaccion individual la pluralidad de moleculas diana de acido nucleico, al menos un duplex de cebador y una polimerasa en condiciones adecuadas para la amplificacion del al menos un acido nucleico diana. En determinadas realizaciones, se amplifican multiples acidos nucleicos diana unicos en una sola reaccion o en multiples reacciones, por ejemplo, en una o mas reacciones de amplificacion de PCR multiplexada. En algunas realizaciones, se amplifican de aproximadamente 10 a 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10.000, o de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 100.000 dianas de acido nucleico. El numero de diferentes duplex de cebador en una reaccion dependera del numero de dianas deseadas.
En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento metodos de discriminacion frente a moleculas falsas de acido nucleico que tienen uno o mas cambios de nucleotidos con relacion a una molecula de acido nucleico diana, que comprenden (1) proporcionar una pluralidad de moleculas de acido nucleico que comprenden al menos un acido nucleico diana, (2) proporcionar al menos un duplex de cebador que tiene (i) una region de equilibrio, (ii) una region de migracion de rama y (iii) una region de extremos cohesivos; y (3) combinar en una reaccion individual la pluralidad de moleculas diana de acido nucleico, al menos un duplex de cebador y una polimerasa en condiciones adecuadas para la amplificacion de la al menos una molecula de acido nucleico diana.
Uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento puede comprender ademas proporcionar o combinar en una reaccion individual uno o mas de los siguientes reactivos: tampon (por ejemplo, KCl, MgCh, Tris- HCl), dNTP (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP, dTTP a concentraciones, por ejemplo, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 |iM), polimerasa (por ejemplo, a concentraciones de aproximadamente 0,5-2,0 unidades por 50 |il de reaccion) y/o agua. La concentracion de cada hebra de un duplex de cebador en una sola reaccion vana dependiendo de, por ejemplo, la concentracion de acido nucleico diana. En algunas realizaciones se pueden usar de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pg de diana vmca o plasmido, o se pueden usar de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng de diana genomica. En dichos casos, la concentracion cada cebador (la primera hebra y la segunda hebra) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 |iM a aproximadamente 1 |iM. En realizaciones particulares, la concentracion de cada cebador es de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 |iM.
En una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, una sola reaccion puede someterse a cambios dclicos de temperatura de tal manera que una estructura de ADNbc experimente multiples tandas de desnaturalizacion, hibridacion con cebador posterior y extension basada en polimerasa, por ejemplo, de manera similar a las condiciones usadas para PCR convencional. En algunas realizaciones, el intervalo de temperatura para una etapa de desnaturalizacion es de aproximadamente 90 a aproximadamente 95 °C. En determinadas realizaciones, se requiere una etapa de desnaturalizacion inicial de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos antes de los ciclos; la cantidad exacta de tiempo puede depender del contenido de GC del acido nucleico diana de interes. En determinadas realizaciones, la etapa de desnaturalizacion durante una reaccion de ciclado es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 segundos. En algunas realizaciones, el intervalo de temperatura para una etapa de hibridacion es de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 60 °C. En algunas realizaciones, la etapa de hibridacion es de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C. En realizaciones particulares, la etapa de hibridacion es a temperatura ambiente (a aproximadamente 20 °C o aproximadamente 25 °C). En determinadas realizaciones, la etapa de hibridacion durante una reaccion de ciclado es de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 segundos. En algunas realizaciones, el intervalo de temperatura para una etapa de extension es de aproximadamente 70 °C a aproximadamente 75 °C. En determinadas realizaciones, la etapa de extension durante una reaccion de ciclado es de aproximadamente 45 a aproximadamente 60 segundos. La temperatura, el tiempo de cada etapa y el numero de ciclos de una reaccion de ciclado pueden depender de la longitud del/de los acido(s) nucleico(s) diana de interes asf como de la polimerasa que se use. Una diana mas larga puede requerir, por ejemplo, tiempos de extension mas largos. En la Tabla 2 se expone un ejemplo de condiciones de ciclado para una diana de 500 nucleotidos.
Tabla 2
1 ciclo
98 °C 2 minutos
25 ciclos
98 °C 15 segundos
30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C o 60 °C 15 segundos
72 °C 45 segundos
1 ciclo
72 °C 5 minutos
1 ciclo
4 °C indefinido
En una cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, una reaccion individual (por ejemplo, amplificacion de acido nucleico) puede transcurrir a temperatura ambiente (por ejemplo, a aproximadamente 20 °C o aproximadamente 25 °C). En determinadas realizaciones, una reaccion individual avanza a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora.
En uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, la segunda hebra protectora de un duplex de
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cebador puede proporcionarse en exceso con respecto a la primera hebra complementaria o en exceso con respecto al duplex de cebador hibridado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la segunda hebra se proporciona a una concentracion de aproximadamente 1x a aproximadamente 10x (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x o 10x) la concentracion de la primera hebra, o de aproximadamente 1x a aproximadamente 10x (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x o 10x) la concentracion del duplex de cebador hibridado. En algunas realizaciones, la primera hebra se proporciona a una concentracion de aproximadamente 0,05 |iM a aproximadamente 1 |iM, mientras que la segunda hebra se proporciona a una concentracion de aproximadamente 0,10 |iM a aproximadamente 2 |iM, o de aproximadamente 0,15 |iM a aproximadamente 3 |iM, de aproximadamente 0,2 |iM a aproximadamente 4 |iM o de aproximadamente 0,25 |iM a aproximadamente 5 |iM.
Uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento puede comprender un metodo escogido entre: PCR espedfica de alelo, PCR de ensamblaje, PCR asimetrica, amplificacion dependiente de helicasa, PCR espedfica de intersecuencias (ISSR), PCR inversa, PCR mediada por union, PCR espedfica de metilacion (MSP), PCR de minicebadores, PCR multiplex, PCR anidada, PCR de extension por solapamiento, PCR cuantitativa (Q- PCR), PCR con transcripcion inversa (RT-PCR), PCR en fase solida, PCR termica con entrelazado asimetrico (TAIL- PCR) y PCR touchdown.
En uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, el rendimiento de acido nucleico diana amplificado puede ser de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 100%. En algunas realizaciones, el rendimiento es de al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o al menos el 100 %.
En uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, el producto de acido nucleico amplificado se puede purificar. Los metodos de purificacion de acido nucleico los conocen bien los expertos en la tecnica e incluyen, extraccion con fenol, isotiocianato de guanidinio, precipitacion con alcohol, DEAE (intercambio ionico), cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), cloruro de cesio, extraccion de agarosa, sflice, y otros metodos de purificacion basados en columna.
En uno cualquiera de los metodos descritos en el presente documento, un acido nucleico diana amplificado purificado puede tener una pureza de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 100%. En algunas realizaciones, la pureza es de al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % puro.
Formacion de imagenes
Los sistemas y duplex de cebador descritos en el presente documento tambien pueden usarse para mejorar la especificidad de ensayos de formacion de imagenes in situ. Las interacciones no espedficas entre ARN biologicos y cebadores marcados con fluoroforo son frecuentemente una fuente de ruido de fondo. De este modo, tal como se representa en la Figura 14, el uso de sistemas de cebador de acido nucleico marcados con fluoroforo descritos en el presente documento en lugar de los cebadores convencionales, en algunas realizaciones, mejora en gran medida el rendimiento de las tecnicas existentes de formacion de imagenes in situ. Particularmente, marcando la hebra o el dominio complementario con un fluoroforo y la hebra el o dominio protector con un agente de inactivacion, el sistema de duplex de cebador solo producira una senal detectable cuando se una a la diana.
Deteccion de polimorfismos de nucleotido individual (SNP)
La deteccion exacta de la ubicacion e identidad de polimorfismos de nucleotido individual(SNP) es de gran interes para los fines tanto investigadores como terapeuticos. Por tanto, los metodos de discriminacion cinetica descritos en el presente documento son utiles para la identificacion apropiada de SNP.
Estuches
Se proporcionan en el presente documento estuches que comprenden (1) al menos una hebra complementaria que tiene una region de equilibrio, una region de migracion de rama y una region de extremos cohesivos, y (2) al menos una hebra protectora que tiene una region de equilibrio y una region de migracion de rama.
Se proporcionan en el presente documento estuches que comprenden al menos un duplex de cebador que comprende (1) al menos una hebra o region complementaria que tiene una region de equilibrio, una region de migracion de rama y una region de extremos cohesivos, y (2) al menos una hebra o region protectora que tiene una region de equilibrio y una region de migracion de rama.
Uno cualquiera de los estuches descritos en el presente documento puede comprender ademas una polimerasa. Uno cualquiera de los estuches proporcionados en el presente documento puede comprender ademas uno o mas agentes escogidos entre tampon (por ejemplo, KCl, MgCh, Tris-HCl), dNTP (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
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y agua. Uno cualquiera de los estuches proporcionados en el presente documento puede comprender una hebra protectora en exceso molar con respecto al cebador. Uno cualquiera de los estuches proporcionados en el presente documento puede comprender ademas instrucciones o indicaciones para obtener instrucciones (por ejemplo, de un sitio web) para usar los componentes de los estuches. Uno cualquiera de los estuches proporcionados en el presente documento puede comprender ademas al menos un tubo, pocillo, camara o similar.
Uno cualquiera de los cebadores o sistemas de cebador descritos en el presente documento puede proporcionarse en forma de un estuche o estar presente dentro de un estuche.
Ejemplos
Segun la invencion, las limitaciones anteriores de PCR, transcripcion y transcripcion inversa pueden solucionarse a traves del uso de duplex de cebador altamente espedficos. Los experimentos descritos en el presente documento demuestran que los duplex de cebador pueden discriminar de manera fiable frente a dianas con cambios de base individual (Figura 16) tanto para dianas como cebadores de ADN y ARN (Figura 17). La diana verdadera se hibrida con los cebadores 7/5 con un rendimiento de aproximadamente el 50 %, pero incluso un gran exceso (200x) de dianas con un cambio de base individual es insuficiente para hibridar de forma significativa. Se disenaron los duplex de cebador y se sometieron a ensayo para multiples dianas diferentes, y cada duplex de cebador logro factores de discriminacion elevados frente a cambios de nucleotido individual (Figura 17). Cuantitativamente, la discriminacion media en el rendimiento de hibridacion a una diana falsa con un cambio de nucleotido individual es de 26.
Se usaron los duplex de cebador para PCR en una demostracion de prueba de principio (Figuras 18A y 18B). Se diseno un acido nucleico diana semi-repetitivo, que es diffcil de amplificar mediante PCR tradicional (PCR sin el uso de los presentes duplex de cebador). Se calculo el rendimiento de cebadores de 21 nucleotidos convencionales y los duplex de cebador. Se determinaron muchos programas de ciclado termico diferentes para investigar el intervalo de funcion. Basandose en la longitud y el contenido de nucleotidos de los duplex de cebador, las condiciones de PCR convencionales predecinan que la temperatura de hibridacion de los cebadores sena de 55 °C. Sorprendentemente, como ejemplo, incluso en las condiciones mas desfavorables para la hibridacion de duplex de cebador (35 °C y 40 °C), la fraccion (50,2 %) de producto de longitud correcta amplificado usando los duplex de cebador fue mayor que la fraccion (31,0 %) de producto de longitud correcta amplificado usando los cebadores convencionales en sus condiciones de PCR mas favorables (45 °C). Ademas, en este experimento particular, se disenaron arbitrariamente los duplex de cebador (region de extremos cohesivos de 7 nucleotidos y region de equilibrio de 5 nucleotidos), y no se optimizaron para el desempeno de rendimiento de PCR. Por tanto, es probable que pueda lograrse una especificidad de PCR incluso mayor a traves de la optimizacion de los presentes duplex de cebador.
La Figura 15 muestra PCR altamente espedfica usando los duplex de cebador proporcionados en el presente documento. En la Figura 5A, el cebador “PC” se compone de una hebra complementaria “C” y una hebra protectora “P”. Cuando PC se une a la diana pretendida en la posicion correcta “X”, el oligonucleotido protector de hebra individual “P” se libera como producto residual inerte, y la diana cebada se alarga por medio de la ADN polimerasa. En la Figura 5B, cuando el cebador PC se une a una diana no deseada o a la diana correcta en una posicion incorrecta (en cualquier caso, indicada como “Y”), el desplazamiento de la region protectora de la hebra complementaria “C” es termodinamicamente desfavorable, y cineticamente revierte de forma rapida. Por consiguiente, se espera que se reduzca significativamente la amplificacion fuera de diana (por ejemplo, amplificacion de Y en vez de X).
La Figura 16 muestra una demostracion experimental de hibridacion de cebador con discriminacion de nucleotido individual. En la Figura 16A, la diana de ADN sintetico corto “X” o la diana falsa “Y” se hacen reaccionar con el cebador. (La cola de poli-T en la hebra protectora “P” sirve para distinguir productos de reactantes en un gel). Se muestran en recuadros rojos las posiciones de cambios de una sola base para la diana falsa Y. La Figura 16B muestra los resultados de gel de poliacrilamida nativo. Se preparo el cebador “PC” a una proporcion de 2:1 de protector P con respecto a complemento C, y se hibrido a una concentracion de 1 |iM de PC. Se anadieron bien la diana correcta o bien las diana falsa para lograr concentraciones finales de diana 200 nM (X o Y), PC 100 nM y P 100 nM. En algunas realizaciones, una reaccion puede tener un exceso de cebador protector (P). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la hebra protectora se proporciona a una concentracion de aproximadamente 1x a aproximadamente 10x (por ejemplo, 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x o 10x) de la hebra complementaria. Todas las reacciones transcurrieron a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 hora. Como ejemplo, la designacion “7/4” indica un cebador que presenta 7 nucleotidos de nucleotidos de hebra individual (como proyeccion en 3') para iniciar la hibridacion con la diana, y el protector disocia espontaneamente para que se liberen 4 nucleotidos. La Figura 16C es un diagrama de rendimientos de hibridacion deducidos a partir de los datos mostrados en la Figura 16B. “La hibridacion del cebador con la diana correcta X se muestra como diagrama “X”, mientras que los diagramas “de puntos” restantes muestran la hibridacion con las dianas falsas Y. Los cebadores 7/4, 7/5 y 7/6 discriminan todos en cuanto a sus rendimientos de hibridacion (%) entre las dianas correcta y falsa. La diana 7/0 no lo hace. En la Figura 16D, el factor de discriminacion (Q) es una medicion cuantitativa de la especificidad del cebador, y se calcula como el rendimiento de hibridacion (%) de la diana correcta dividido entre el rendimiento de hibridacion (%) de la diana falsa. En 16E, hay poca hibridacion del cebador 7/5 a una diana falsa Y incluso cuando dicha diana esta presente en un gran exceso (es decir, 200 veces).
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La Figura 17 muestra resultados experimentales adicionales y datos estad^sticos sobre las capacidades de discriminacion de base individual de los duplex de cebador. La Figura 17A muestra que se construyeron cuatro dianas y conjuntos de cebadores adicionales y se sometieron a ensayo: dos basados en secuencias de microARN de origen natural y dos disenados para presentar intencionadamente una estructura secundaria significativa. La Figura 17B muestra un histograma de los factores de discriminacion (Q) logrados por los cebadores 7/5 para cada diana. Debido a las limitaciones del aparato de exploracion de geles, no fue posible medir de manera fiable los factores de discriminacion por encima de 100, y estos se agruparon todos como “+100.” La Figura 17C muestra una diana de ARN y un cebador. La secuencia diana es un oligonucleotido de ARN sintetico con secuencia identica al microARN de let7 g humano. La Figura 17D muestra resultados de PAGE nativa. Se preparo el cebador PC a una razon de 2:1 de protector P con respecto a complemento C, y se hibrido a una concentracion de 3 |iM. Se anadieron bien la diana correcta o bien la diana falsa para lograr concentraciones finales de X o Y de 2 |iM, PC de 1 |iM y P de 1 |iM. La diana correcta se une satisfactoriamente al cebador; el rendimiento de hibridacion de dianas con apareamientos erroneos de nucleotido individual es bajo.
La Figura 18 muestra los resultados experimentales usando cebadores de duplex para mejorar el rendimiento de PCR de una diana cuasi repetitiva. La Figura 18A muestra una diana de PCR cuasi repetitiva (168 nt) con la que los cebadores de PCR tradicionales tienen problemas para amplificarla con alto rendimiento. En este caso, a* es la diana correcta para X1. Los sitios restantes marcados como a*m1 (que es X1-m17G), a*m2 (que es X1-m9T) y a*m3 (que es X1-m11G) no son las dianas correctas. De manera similar, b* es la diana correcta para X2, y b*m1 (que es X2-m3T), b*m2 (que es X2-m11C) y b*m3 (que es X2-m18T) no son las dianas correctas. De este modo, los sitios de union mas externos son los sitios de union perfectos para los cebadores, pero tambien hay 3 sitios adicionales de union a cebador con apareamiento erroneo de base individual entre los sitios perfectos. Los duplex de cebador se unen mediante 7 nucleotidos a la diana, y el protector debe disociarse espontaneamente para que se liberen 5 nucleotidos. Se diseno el duplex de cebador de modo que su extremo 3' no pudiera extenderse por medio de la polimerasa. Se diseno la region de extremos cohesivos de la hebra complementaria en el extremo 3', en vez de en el extremo 5' como en disenos previos. En la Figura 18B, los duplex de cebador muestran un rendimiento significativamente mayor de producto de longitud correcta, en comparacion con los cebadores convencionales. Cada carril se marca con los cebadores usados asf como el programa de ciclado termico (por ejemplo, “98-40-72” indica desnaturalizacion a 98 °C, hibridacion a 40 °C y alargamiento a 72 °C). El carril mas a la izquierda muestra la referencia de oligonucleotido sintetico. Los numeros mas bajos marcados como “% correcto” indican la intensidad relativa de la banda correspondiente al producto de longitud correcta en comparacion con la intensidad integrada de todas las bandas en el carril. El producto de PCR del duplex de cebador aparece como 10 nucleotidos mas largo que la referencia y el producto de pCr convencional debido a los 5 nucleotidos de las proyecciones (region de extremos cohesivos) en cada cebador.
Equivalentes
Los expertos en la tecnica reconoceran o seran capaces de determinar, usando solo experimentacion de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas descritas en el presente documento.
Los artfculos “un(o)” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento.
Se consideran conformes las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o mas miembros de un grupo si uno, mas de uno, o todos los miembros del grupo estan presentes en, se emplean en, o son relevantes para un producto o procedimiento dado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente a partir del contexto. La invencion incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo esta presente en, se emplea en, o es relevante para un producto o procedimiento dado. La invencion incluye realizaciones en las que mas de uno, o todos los miembros del grupo estan presentes en, se emplean en, o son relevantes para un producto o procedimiento dado. Ademas, ha de entenderse que la invencion engloba todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o mas limitaciones, elementos, clausulas, terminos descriptivos, etc., de una o mas de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicacion. Por ejemplo, cualquier reivindicacion que depende de otra reivindicacion puede modificarse para incluir una o mas limitaciones que se encuentran en cualquier otra reivindicacion que depende de la misma reivindicacion de base.
Cuando se presentan elementos como listas, por ejemplo, en el formato de grupos de Markush, ha de entenderse que tambien se divulga cada subgrupo de los elementos, y cualquier(cualesquiera) elemento(s) puede(n) eliminarse del grupo. Ha de entenderse que, en general, cuando se hace referencia a que la invencion, o aspectos de la invencion, comprende(n) elementos, caractensticas particulares, determinadas realizaciones de la invencion o aspectos de la invencion consisten, o consisten esencialmente en, tales elementos y/o caractensticas. Con propositos de simplicidad, esas realizaciones no se han expuesto espedficamente de manera textual en el presente documento. Tambien se observa que el termino “comprender” pretende ser abierto y permite la inclusion de elementos o etapas adicionales.
Cuando se facilitan intervalos, estan incluidos los extremos. Ademas, ha de entenderse que a menos que se indique

Claims (12)

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    65
    1. Un sistema que comprende un acido nucleico diana, una polimerasa, y
    un cebador parcialmente de doble hebra que comprende una primera y una segunda hebras de acido nucleico dispuestas en
    (1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
    (2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
    (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
    en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro del 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
  2. 2. El sistema segun la reivindicacion 1, en el que el acido nucleico diana es de hebra individual, y opcionalmente en el que el acido nucleico diana es ADN o ARN.
  3. 3. El sistema segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el sistema comprende una pluralidad de diferentes cebadores parcialmente de doble hebra, opcionalmente en el que el sistema comprende al menos dos cebadores parcialmente de doble hebra que pueden usarse conjuntamente para amplificar una region del acido nucleico diana, opcionalmente en el que el acido nucleico diana esta presente en una pluralidad de acidos nucleicos diana diferentes, y opcionalmente en el que el acido nucleico diana esta presente como una copia individual o en un bajo numero de copias en una pluralidad de acidos nucleicos diana diferentes.
  4. 4. Un metodo de deteccion de hibridacion de un cebador con un acido nucleico diana en una muestra, que comprende poner en contacto un cebador parcialmente de doble hebra con una muestra, y detectar la hibridacion del cebador con una diana en la muestra, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se compone de hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
    (1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
    (2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
    (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
    en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro del 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
  5. 5. El metodo segun la reivindicacion 4, en el que el cebador parcialmente de doble hebra se marca con un resto detectable, y opcionalmente en el que el resto detectable comprende un fluoroforo o un radioisotopo.
  6. 6. El metodo segun la reivindicacion 4 o 5, en el que el acido nucleico diana esta presente como una copia individual en la muestra.
  7. 7. Un metodo de extension de manera complementaria a la diana de un cebador hibridado con un acido nucleico diana, que comprende hibridar una region espedfica de diana de hebra individual de una primera hebra de un cebador parcialmente de doble hebra con un acido nucleico diana, disociando de ese modo la primera hebra del cebador de una segunda hebra del cebador, y de extension de la primera hebra en su extremo 3', de manera complementaria a la diana, en presencia de una polimerasa, en el que el cebador parcialmente de doble hebra comprende hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
    (1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
    (2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
    10 8.
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    (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
    en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro del 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
    Un metodo para llevar a cabo una reaccion de smtesis de acido nucleico, que comprende llevar a cabo una reaccion de smtesis de acido nucleico en presencia de un acido nucleico diana, una polimerasa y uno o mas cebadores parcialmente de doble hebra, en el que el cebador parcialmente de doble hebra comprende hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
    (1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
    (2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
    (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
    en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro del 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida al acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana.
    El metodo segun la reivindicacion 8, en el que la reaccion de smtesis de acido nucleico es una reaccion de amplificacion de acido nucleico, una reaccion de transcripcion o una reaccion de transcripcion inversa.
    El metodo segun la reivindicacion 9, en el que la reaccion de amplificacion de acido nucleico es la reaccion en cadena de polimerasa (PCR).
    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en el que se usan dos cebadores parcialmente de doble hebra.
    Un metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado que comprende amplificar multiples moleculas de acido nucleico unicas usando un cebador parcialmente de doble hebra que comprende hebras de acido nucleico primera y segunda dispuestas en
    (1) una region no espedfica de diana de doble hebra,
    (2) una region espedfica de diana de doble hebra, y
    (3) una region espedfica de diana de hebra individual a la que contribuye la primera hebra de acido nucleico,
    en el que la region no espedfica de diana de doble hebra tiene una energfa libre estandar que esta dentro del 10 % de la energfa libre estandar para la region espedfica de diana de hebra individual unida a un acido nucleico diana, en el que las secuencias de la primera hebra de acido nucleico que contribuyen a las regiones (2) y (3) son complementarias a y se unen al acido nucleico diana, en el que la primera hebra de acido nucleico es mas larga que la segunda hebra de acido nucleico.
    El metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun la reivindicacion 12, en el que la segunda hebra de acido nucleico del cebador parcialmente de doble hebra comprende un nucleotido no extensible en su extremo 3' y/o la primera hebra de acido nucleico del cebador parcialmente de doble hebra comprende un nucleotido no natural en el extremo 3' de su region no espedfica de diana, opcionalmente en el que el nucleotido no extensible del cebador parcialmente de doble hebra es un didesoxinucleotido, y opcionalmente en el que el nucleotido no natural del cebador parcialmente de doble hebra es iso-C, iso-G o desoxiuridina.
    El metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun la reivindicacion 12 o la reivindicacion 13, en el que la region no espedfica de diana de doble hebra del cebador parcialmente de doble hebra tiene una longitud de 4-21 nucleotidos, y/o en el que la region espedfica de diana de hebra individual del cebador parcialmente de doble hebra tiene una longitud de 4192 nucleotidos, preferiblemente una longitud de 4 - 20 nucleotidos.
    Metodo de realizacion de una reaccion de amplificacion de acido nucleico multiplexado segun una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que las hebras de acido nucleico primera y segunda del cebador parcialmente de doble hebra se componen de ADN o ARN.
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