KR102472071B1 - 대류 유체 디바이스에서의 핵산의 표면-기반 검출 - Google Patents
대류 유체 디바이스에서의 핵산의 표면-기반 검출 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 핵산 서열의 대류-기반 PCR 및 비효소적 증폭을 수행하기 위한 방법, 조성물 및 디바이스를 제공한다. 이들 방법에 사용되는 기법 및 시약은 핵 시험 및 검정에 사용하기 위한, 개방 및 폐쇄 시스템에서의, 토홀드 프로브(toehold probe), 가닥 치환 반응, 레일리-베나드 대류(Rayleigh-Benard convection), 온도 구배, 멀티플렉스 증폭, 멀티플렉스 검출, 및 DNA 기능화를 포함한다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2016년 3월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/314,909호에 대한 우선권의 이득을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 과학적 연구 및 임상 연구 및 진단 응용을 위한 특정 핵산 서열의 검출 및 정량화를 위한 신규 시약, 기기, 및 방법을 기재한다.
대부분의 상업용 핵산 (NA) 검정은 분자 증폭 또는 신호 증폭을 위하여 효소의 사용을 필요로 한다. 효소, 예컨대 DNA 폴리머라제는 신속하고 특이적이도록 최적화되어 왔다. 자원-제한된 조건에서의 동결건조된 효소의 재구성은 저온 유통(cold chain)에 대한 필요성을 감소시킨다. 등온 핵산 증폭 검정, 예컨대 NEAR, LAMP 및 NASBA는 복잡한 온도 사이클링 장비 없이도 DNA/RNA 프로파일링을 가능하게 한다. 이러한 많은 진보에도 불구하고, 기존의 핵산 검출 기술은 여전히 병원체 바이오마커의 신속한 PoC (point of care, 포인트 오브 케어) 검출에 대한 과제에 직면하고 있는데, 이는, 모든 바람직한 특성 (예를 들어, 신속성, 고신뢰성, 및 화학물질/억제제에 대한 견뢰성)을 동시에 갖는 효소를 설계/발달시키는 것이 어렵기 때문이다.
다수의 기존 핵산 분석 기술은 무효소(enzyme-free)이며, 이에는 마이크로어레이, 형광 동소 혼성화 (FISH), 분지형 DNA 덴드리머 (Panomics), 및 형광 바코딩 (Nanostring)이 포함된다. 이들 접근법에서는, DNA 또는 RNA 표적 분자가 화학량론적으로 동원되거나 제한된 수의 형광기로 전환된다. 이것은 PCR과 다른데, PCR에서는 심지어 단일 핵산 분자가 끊임없이 증폭되어 임의대로 많은 수의 앰플리콘 분자를 생성한다. 결과적으로, 이들 접근법의 경우에는, 생물학적 샘플에 존재하는 소량의 DNA 또는 RNA 표적을 검출하고 분석하는 데 필요한 분자 감도를 달성하기 위하여 고가의 부피가 큰 장비가 필요한데, 이는 PoC 응용에 대한 그리고 제한된 자원 조건에서의 그들의 사용을 제약한다.
핵산 확인 기법의 다른 그룹은 용액-기반 무효소 DNA 증폭 접근법을 사용한다. 여기서는, 단일 가닥 DNA 표적 분자가 무제한 방식으로 미리 조립된 DNA 검출 복합체로부터 표적과 동일한 서열을 갖는 DNA 올리고뉴클레오티드를 촉매적으로 방출할 수 있다. 검출의 임상적으로 관련된 제한이 이러한 부류의 접근법에 대해 여전히 입증되어야 한다. 이러한 시스템에서는, 표적 서열의 검출의 부재 하에서 앰플리콘 분자의 방출을 초래하는 DNA "호흡(breathing)" 사건으로 인해 위양성(false positive) 증폭이 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 복수의 올리고뉴클레오티드 복합체들을 갖는 표면을 포함하는 디바이스가 제공되며, 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들 각각은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 표면에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티(linking moiety)를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열에 상보적이고 거기에 혼성화되고, 상기 제2 DNA 올리고뉴클레오티드는 형광 모이어티를 포함하지 않고 상기 표면에 비가역적으로 연결되지 않는다.
상기 제2 DNA 서열들 각각은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치될 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드들은 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 제2 올리고뉴클레오티드들 각각은 형광 켄처(quencher)를 포함할 수 있다. 상기 공간적으로 분리된 영역들 각각은 제4 DNA 서열 및 제5 DNA 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제4 DNA 서열은 상기 제3 DNA 서열에 상보적이다. 상기 제3 올리고뉴클레오티드들은 각각 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 연결 모이어티는 변형된(strained) 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이, 또는 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제4 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
다른 실시 형태에서, 유체 반응 챔버가 제공되며, 상기 유체 반응 챔버는
제1 표면,
상기 제1 표면과 접촉하지 않는 제2 표면 - 상기 제1 표면과 제2 표면은 서로 대면함 -,
상기 제1 표면 및 상기 제2 표면과 접촉하고 상기 반응 챔버의 외부 경계를 형성하는 재료, 및
상기 제1 표면 및 상기 제2 표면과 접촉하고 상기 반응 챔버의 내부 경계를 형성하는 재료를 포함하며,
상기 제1 표면은 복수의 올리고뉴클레오티드 복합체들을 포함하며, 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들은 각각 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 표면에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 DNA 서열은 상기 제1 DNA 서열에 상보적이고 거기에 혼성화되고, 상기 제2 DNA 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 표면에 비가역적으로 연결되지 않고, 선택적으로 형광 모이어티를 포함하지 않는다.
상기 제2 DNA 서열들 각각은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들 각각은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치될 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드들 각각은 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 제2 올리고뉴클레오티드들 각각은 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 공간적으로 분리된 영역들 각각은 제4 DNA 서열 및 제5 DNA 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제4 DNA 서열은 상기 제3 DNA 서열에 상보적이다. 상기 제3 올리고뉴클레오티드들은 각각 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 연결 모이어티는 변형된 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 상기 샘플을 전달하기 위하여 제1 포트를, 그리고 선택적으로, 샘플이 상기 제1 포트 내로 도입될 때 공기/유체가 빠져나갈 수 있게 하기 위하여 다른 제2 포트를 가질 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제4 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 제1 및 제2 표면과 접촉하고 상기 챔버의 내부 및 외부 경계를 형성하는 상기 재료들은 두께가 40 마이크로미터 (40 μm) 내지 2 밀리미터 (2 mm)일 수 있다.
상기 유체 반응 챔버는 원형, 난형(oval), 정사각형, 직사각형, 삼각형, 육각형, 팔각형, 마름모꼴 또는 사다리꼴, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 환상일 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 균일한 온도에 있지 않을 수 있으며, 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 상기 반응 챔버의 최저온 영역보다 적어도 10℃ 더 높을 수 있다. 상기 반응 챔버의 최저온 영역은 약 50℃ 내지 약 75℃일 수 있다. 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 약 80℃ 내지 약 100℃일 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 상기 유체 반응 챔버 내에 배치된 유체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유체 용액은 DNA 폴리머라제, dNTP, 및 PCR 완충액을 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 표적 핵산을 증폭시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 제16항에 따른 유체 반응 챔버를 제공하는 단계 - 상기 유체 반응 챔버는 제1 및 제2 열원과 작동가능한 관계에 있으며, 상기 제1 및 제2 열원은 상이한 제1 및 제2 열 레벨을 상기 환상 챔버에 인가할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 열 레벨은 동일하지 않음 -; (b) 표적 핵산 서열, DNA 폴리머라제, dNTP 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 완충액을 포함하는 유체를 상기 유체 반응 챔버 내로 도입하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 열 레벨을 상기 유체 반응 챔버에 인가하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 표적 핵산의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 제2 DNA 서열들 각각은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치될 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드들 각각은 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 제2 올리고뉴클레오티드들 각각은 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 공간적으로 분리된 영역들 각각은 제4 DNA 서열 및 제5 DNA 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 제4 DNA 서열은 상기 제3 DNA 서열에 상보적이다. 상기 제3 올리고뉴클레오티드들은 각각 형광 켄처 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 연결 모이어티는 변형된 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 원형, 난형, 정사각형, 삼각형, 직사각형, 육각형, 팔각형, 마름모꼴 또는 사다리꼴일 수 있다.
상기 유체 반응 챔버는 균일한 온도에 있지 않을 수 있으며, 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 상기 반응 챔버의 최저온 영역보다 적어도 10℃ 더 높을 수 있다. 상기 반응 챔버의 최저온 영역은 약 50℃ 내지 약 75℃일 수 있다. 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 약 80℃ 내지 약 100℃일 수 있다.
또 다른 추가의 실시 형태에서, 디바이스로서, 제1 표면 영역 및 제2 표면 영역을 포함하며,
상기 제1 표면 영역은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 제1 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열에 상보적이고,
상기 제2 표면 영역은 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제3 올리고뉴클레오티드는 제4 DNA 서열 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드를 상기 제2 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하며,
상기 제4 서열은 상기 제2 서열, 상기 제3 서열, 또는 적어도 상기 제2 서열의 6개의 연속 뉴클레오티드와 상기 제3 서열의 6개의 연속 뉴클레오티드의 조합에 상보적인, 디바이스가 제공되거나,
또는 디바이스로서, 제1 표면 영역 및 제2 표면 영역을 포함하며,
상기 제1 표면 영역은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 제1 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열에 상보적이고,
상기 제2 표면 영역은 제3 올리고뉴클레오티드 및 제4 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제3 올리고뉴클레오티드는 제4 DNA 서열 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드를 상기 제2 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제4 올리고뉴클레오티드는 제5 DNA 서열 및 제6 DNA 서열을 포함하며, 상기 제5 서열은 상기 제4 서열에 상보적이고,
상기 제2 서열은 상기 제5 서열에 상보적이거나 상기 제6 서열에 상보적인, 디바이스가 제공된다.
상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 켄처를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 서열들은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치될 수 있다. 상기 연결 모이어티는 변형된 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 상기 샘플을 전달하기 위하여 제1 포트를, 그리고 선택적으로, 샘플이 상기 제1 포트 내로 도입될 때 공기/유체가 빠져나갈 수 있게 하기 위하여 다른 제2 포트를 가질 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제4 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제6 DNA 서열들 각각은 5 내지 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
또 다른 추가의 실시 형태에서, 유체 반응 챔버가 제공되며, 상기 유체 반응 챔버는
제1 표면,
상기 제1 표면과 접촉하지 않는 제2 표면 - 상기 제1 표면과 제2 표면은 서로 대면함 -,
상기 제1 표면 및 상기 제2 표면과 접촉하고 상기 반응 챔버의 외부 경계를 형성하는 재료, 및
상기 제1 표면 및 상기 제2 표면과 접촉하고 상기 반응 챔버의 내부 경계를 형성하는 재료를 포함하며,
(a) 상기 제1 표면은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 제1 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열에 상보적이고,
상기 제2 표면 영역은 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제3 올리고뉴클레오티드는 제4 DNA 서열 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드를 상기 제2 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하며,
상기 제4 서열은 상기 제2 서열, 상기 제3 서열, 또는 적어도 상기 제2 서열의 6개의 연속 뉴클레오티드와 상기 제3 서열의 6개의 연속 뉴클레오티드의 조합에 상보적이거나; 또는
(b) 상기 제1 표면 영역은 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 DNA 서열 및 상기 제1 올리고뉴클레오티드를 상기 제1 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하며, 상기 제2 서열은 상기 제1 서열에 상보적이고,
상기 제2 표면 영역은 제3 올리고뉴클레오티드 및 제4 올리고뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제3 올리고뉴클레오티드는 제4 DNA 서열 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드를 상기 제2 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티를 포함하고,
상기 제4 올리고뉴클레오티드는 제5 DNA 서열 및 제6 DNA 서열을 포함하며, 상기 제5 서열은 상기 제4 서열에 상보적이고,
상기 제2 서열은 상기 제5 서열에 상보적이거나 상기 제6 서열에 상보적이다.
상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 켄처를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 서열들 각각은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들 각각은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치될 수 있다. 상기 연결 모이어티는 변형된 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 상기 샘플을 전달하기 위하여 제1 포트를, 그리고 선택적으로, 샘플이 상기 제1 포트 내로 도입될 때 공기/유체가 빠져나갈 수 있게 하기 위하여 다른 제2 포트를 가질 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제4 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제6 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
상기 유체 반응 챔버는 원형, 난형, 정사각형, 삼각형, 직사각형, 육각형, 팔각형, 마름모꼴 또는 사다리꼴, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 환상일 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 균일한 온도에 있지 않을 수 있으며, 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 상기 반응 챔버의 최저온 영역보다 적어도 10℃ 더 높을 수 있다. 상기 반응 챔버의 최저온 영역은 약 10℃ 내지 약 50℃일 수 있다. 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 약 51℃ 내지 약 100℃일 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 상기 유체 반응 챔버 내에 배치된 유체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 유체는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 혼성화 완충액을 포함하며, 상기 유체는 비특이적 핵산 염색 염료를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 실시 형태는 표적 핵산을 증폭시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 (a) 제71항에 따른 유체 반응 챔버를 제공하는 단계 - 상기 유체 반응 챔버는 제1 및 제2 열원과 작동가능한 관계에 있으며, 상기 제1 및 제2 열원은 상이한 제1 및 제2 열 레벨을 상기 환상 챔버에 인가할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 열 레벨은 동일하지 않음 -; (b) 표적 핵산 서열을 포함하는 유체를 상기 유체 반응 챔버 내로 도입하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 열 레벨을 상기 유체 반응 챔버에 인가하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 상기 표적 핵산의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 모이어티를 포함할 수 있으며, 상기 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 형광 켄처를 포함할 수 있다. 상기 제2 DNA 서열들 각각은 동일할 수 있거나, 또는 동일하지 않을 수 있다. 상기 복수의 상기 올리고뉴클레오티드 복합체들 각각은 상기 표면 상의 공간적으로 분리된 영역들 내에 위치된다. 상기 연결 모이어티는 변형된 알킨을 포함한 알킨 기 또는 아지드 기를 포함할 수 있다.
상기 제1 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제3 DNA 서열들 각각은 약 15 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제5 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제4 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 상기 제6 DNA 서열들 각각은 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
상기 유체 반응 챔버는 원형, 난형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 육각형, 팔각형, 마름모꼴 또는 사다리꼴, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 환상일 수 있다. 상기 유체 반응 챔버는 균일한 온도에 있지 않을 수 있으며, 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 상기 반응 챔버의 최저온 영역보다 적어도 10℃ 더 높을 수 있다. 상기 반응 챔버의 최저온 영역은 약 10℃ 내지 약 50℃일 수 있다. 상기 반응 챔버의 최고온 영역은 약 51℃ 내지 약 100℃일 수 있다. 상기 유체는 비특이적 핵산 염색 염료를 추가로 포함한다.
다른 실시 형태는 반응 챔버를 포함하는 시스템을 포함하며, 상기 반응 챔버는 (a) 제1 영역 및 제2 영역 - 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드가 상기 제1 표면 영역에 기능화되고, 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드가 상기 제2 표면 영역에 기능화되고, 상기 제1 뉴클레오티드 서열과 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하지 않음 -; (b) 불균일한 온도에서 DNA 혼성화에 적합한 완충액 용액 - 상기 완충액 용액은 상기 제1 표면 영역 및 상기 제2 표면 영역과 접촉함 -; (c) 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드 - 상기 제3 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화됨 -; 및 (d) 제1 온도 구역 및 제2 온도 구역 - 상기 제1 온도 구역은 상기 제2 온도 구역의 온도보다 적어도 10℃ 더 높은 온도를 가짐 - 을 포함한다.
상기 제1 표면 영역은 제1 표면 상에 위치될 수 있고, 상기 제2 표면 영역은 제1 표면 상에 위치된다. 상기 제1 표면 영역은 제1 표면 상에 위치될 수 있고, 상기 제2 표면 영역은 제2 표면 상에 위치되며, 상기 제1 표면 및 상기 제2 표면은 상이한 표면이다. 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 상기 제3 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제1 뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다. 상기 제3 뉴클레오티드 서열은 제1 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제2 뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다.
상기 완충액 용액은 적어도 60 질량%의 물 및 적어도 1 mM 농도의 양이온을 포함할 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 길이 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 5개의 뉴클레오티드 내지 20,000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드 및 상기 제2 뉴클레오티드의 길이는 5개의 뉴클레오티드 내지 200개의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 제3 올리고뉴클레오티드의 길이는 5개의 뉴클레오티드 내지 20,000개의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있으며, DNA, RNA, 뉴클레오티드 유사체, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산을 포함할 수 있다.
상기 뉴클레오티드 유사체는 LNA, PNA, 모르폴리노-올리고뉴클레오티드, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 제1 올리고뉴클레오티드, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 및 상기 제3 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 화학적 모이어티로 작용화될 수 있으며, 상기 화학적 모이어티는 올리고뉴클레오티드의 검출을 가능하게 한다. 상기 화학적 모이어티는 TAMRA, ROX, HEX, 유기 형광단, 양자점, 나노입자, 메틸렌 블루, 전기화학적으로 활성인 분자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 완충액 용액은 검출가능한 분자를 포함할 수 있으며, 상기 검출가능한 분자는, 올리고뉴클레오티드에 비가역적으로 결합되어 있을 때, 용액 중에 유리되어 있을 때와 상이한 단위 신호를 나타내며, 예컨대 SybrGreen 염료, Syto 염료, 및 EvaGreen 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출가능한 분자이다. 상기 제1 표면 및 상기 제2 표면은 동일하거나 상이할 수 있으며, 이들은 유리, 석영, 플라스틱, 중합체, 금속, 복합 재료, 및 표면 자기-집합된 단층으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 중합체는 PDMS일 수 있다.
상기 제1 표면 영역은 상기 완충액 용액의 최대 온도보다 10℃ 낮은 온도를 포함할 수 있으며, 상기 제2 표면 영역은 상기 완충액 용액의 최대 온도보다 10℃ 낮은 온도를 포함할 수 있다. 상기 시스템은 상기 제1 표면 영역 및 상기 제2 표면 영역과 접촉 상태에 있는 적어도 하나의 가열/냉각 소자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적어도 하나의 가열/냉각 소자는 핫 플레이트, 가열 팬, IR-히터, 및 수조로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 핫 플레이트는 열-저항성 히터 및 펠티에(Peltier) 소자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 시스템은 주형-유도(template-directed) 방식으로 핵산을 변형시키는 효소를 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 여기서 상기 효소는 핵산 주형의 주형-유도 증폭을 촉진시킨다.
핵산 표적의 무효소 증폭 및 검출을 위한 방법은 (a) 샘플을 반응 챔버 내에서 조성물과 접촉시키는 단계 - 상기 조성물은
DNA 혼성화에 적합한 완충액 용액;
제1 표면 영역 및 제2 표면 영역 - 상기 완충액 용액은 상기 제1 표면 영역 및 상기 제2 표면 영역과 접촉함 -;
제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 - 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 표면 영역에 기능화됨 -;
제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드 - 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 표면 영역에 기능화됨 -; 및
제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드 - 상기 제3 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화됨 - 를 포함하며,
상기 제1 뉴클레오티드 서열 및 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하지 않으며, 상기 제3 뉴클레오티드는 상기 제1 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제1 뉴클레오티드 영역을 포함함 -;
(b) 상기 반응 챔버의 일부분을 차등 가열하는 단계 - 상기 챔버의 영역의 최대 온도는 상기 챔버의 최소 온도보다 적어도 10℃ 더 높음 -; 및 (c) 잠재적인 증폭을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 반응 챔버는 유리, 석영, 플라스틱, 중합체, 금속, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 재료를 포함할 수 있다. 상기 중합체는 PDMS일 수 있다. 상기 챔버의 영역의 최대 온도는 60℃ 내지 100℃일 수 있다. 상기 챔버의 최소 온도는 20℃ 내지 60℃일 수 있다. 상기 제1 표면 영역 및 상기 제2 표면 영역은 상기 챔버의 영역의 최대 온도의 10℃ 이내로 가열되지 않을 수 있다.
상기 조성물은 상기 반응 챔버 내에 국소화될 수 있으며, 상기 제1 표면 영역은 제1 표면 상에 위치되고, 상기 제2 표면 영역은 상기 제1 표면에 위치된다. 상기 조성물은 상기 반응 챔버 내에 국소화될 수 있으며, 상기 제1 표면 영역은 제1 표면 상에 위치될 수 있고, 상기 제2 표면 영역은 제2 표면 상에 위치될 수 있으며, 상기 제1 표면 및 상기 제2 표면은 상이한 표면이다. 잠재적인 증폭의 검출은 포토다이오드, 광전자 증배관, 형광 현미경, CCD 카메라, 및 임의의 다른 광학 검출 디바이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 디바이스를 통한 형광 변화의 광학 검출을 추가로 포함할 수 있다. 잠재적인 증폭의 검출은 전기화학적 퍼텐쇼스탯(potentiostat)/갈바노스탯(galvanostat)을 통한 전기화학적 검출을 추가로 포함할 수 있다. 잠재적인 증폭의 검출은 석영 결정 미량천칭 기법을 사용하여 상기 제1 표면 영역의 질량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 추가의 실시 형태에서, 핵산 표적의 효소-의존적 증폭 및 검출을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 샘플을 반응 챔버 내에서 조성물과 접촉시키는 단계 - 상기 조성물은
DNA 혼성화에 적합한 완충액 용액;
표면 영역 - 상기 완충액 용액은 상기 표면 영역과 접촉함 -;
제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드 - 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 상기 표면 영역에 기능화됨 -;
제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드; 및 핵산을 주형-유도 방식으로 변형시키는 효소 - 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 상기 제1 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 뉴클레오티드 영역을 포함함 - 를 포함함;
(b) 상기 반응 챔버의 일부분을 차등 가열하는 단계 - 상기 챔버의 영역의 최대 온도는 상기 챔버의 최소 온도보다 적어도 10℃ 더 높음 -; 및 (c) 잠재적인 증폭을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 제1 올리고뉴클레오티드는 상기 제2 뉴클레오티드 서열에 상보적이지 않은 제2 뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다. 상기 효소는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소, 엔도뉴클레아제, 및 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 반응 챔버는 유리, 석영, 플라스틱, 중합체, 금속, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 재료를 포함할 수 있다. 상기 중합체는 PDMS일 수 있다.
상기 챔버의 영역의 최대 온도는 80℃ 내지 100℃일 수 있다. 상기 챔버의 최소 온도는 20℃ 내지 80℃일 수 있다. 상기 표면 영역은 상기 챔버의 영역의 최대 온도의 10℃ 이내로 가열되지 않을 수 있다. 잠재적인 증폭의 검출은 포토다이오드, 광전자 증배관, 형광 현미경, CCD 카메라, 및 임의의 다른 광학 검출 디바이스로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 디바이스를 통한 형광 변화의 광학 검출을 추가로 포함할 수 있다. 잠재적인 증폭의 검출은 전기화학적 퍼텐쇼스탯/갈바노스탯을 통한 전기화학적 검출을 추가로 포함할 수 있다. 잠재적인 증폭의 검출은 석영 결정 미량천칭 기법을 사용하여 상기 제1 표면 영역의 질량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 표면 올리고뉴클레오티드 기능화는 공유 고정화, 정전기 상호작용 또는 비공유 고정화, 예컨대 비오틴-아비딘 (또는 이들의 유사체)을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 화학적 및 물리적 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 검출 표적 분자는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, RNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 앰플리콘 검출 및 반응 모니터링은 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는 방법을 통해 이루어진다: 형광 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 포함함), UV 흡광도, 전기화학적 검출 (pH 변화 및 전하 이동을 포함함), 석영 결정 미량천칭 (QCM).
본 발명의 일 실시 형태에서, 제안된 접근법은 약물 저항성 또는 질병 예후를 나타낼 수 있는 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)를 포함한 핵산 서열 변이체를 구별하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 제안된 접근법은 특정 생물학적 샘플 내의 하나, 수 개, 또는 다수개의 표적 분자의 정량화에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "환상"은 상기에 논의된 바와 같이 챔버의 형상을 언급하는 데 사용될 수 있으며, 둥글거나 난형이거나 원판형이라는 그의 통상의 의미를 가질 수 있다. 그러나, 환상은 또한 이러한 맥락에서, 챔버가 시작과 끝이 없는 연속 회로를 구성하는 한, 다른 규칙적 또는 불규칙적 형상을 갖는 것으로 해석될 수 있다.
본 명세서에서 상세한 설명에 사용되는 바와 같이, 단수형 ("a" 또는 "an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 이들 단수형 단어 ("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구범위에서의 용어 "또는"의 사용은 양자택일만을 언급하거나 양자택일이 상호 배제되는 것으로 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용되지만, 본 명세서는 양자택일만을 그리고 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "다른"은 적어도 제2 또는 그 이상의 것을 의미할 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 디바이스에 대하여, 값을 결정하기 위하여 사용되는 방법에 대하여, 또는 연구 대상 사이에서 존재하는 것에 대하여 오차의 고유 변동을 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다. 그러한 고유 변동은 언급된 값의 ±10%의 변동일 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "비가역적 연결"은 의도된 응용의 통상의 상황 하에서 안정한 화학적 상호작용을 나타내는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서의 비가역적 연결은, 예를 들어 아지드-알킨 클릭 화학에 의한 공유 부착을 지칭할 수 있으며, 다른 실시 형태에서는 비오틴-아비딘 상호작용 또는 다른 비공유 긴 수명 상호작용을 지칭할 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "PCR 완충액"은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통한 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 증폭과 양립가능한 화학 조성 및 염분(salinity)을 갖는 수용액을 나타내는 데 사용된다. 완충액은 DNA 폴리머라제 그 자체, 프라이머 및/또는 dNTP와 함께 사용될 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "혼성화 완충액"은 상보적 DNA 올리고뉴클레오티드에 의한 DNA 혼성화 및 안정한 DNA 이중체의 형성과 양립가능한 화학 조성 및 염분을 갖는 수용액을 나타내는 데 사용된다. 모든 PCR 완충액은 혼성화 완충액으로 여겨질 수 있지만, 그 역으로도 성립하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점이 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시 형태를 나타내면서, 단지 예시로서 주어지는 것으로 이해되어야 하는데, 이는, 본 발명의 사상 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 소정의 태양을 추가로 보여주기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에서 제공된 구체적인 실시 형태의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 차등 온도의 히터들 상에 수직으로 장착된 유체 칩의 실시 형태의 개략도를 도시한다. 유체 칩은 DNA 올리고뉴클레오티드를 기능화하기 위한 표면을 갖는 반응 챔버를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이러한 칩은 핵산의 멀티플렉스 PCR-기반 검출을 수행하는 데 사용된다.
도 2는 상기 시스템의 실시 형태를 도시하는데, 여기서는 유체 칩이 차등 온도의 히터들 상에 수직으로 장착되어 있다. 수평으로 장착된 광원이 칩에 기능화된 DNA 상의 형광 모이어티를 여기시키며; 형광 신호는 도시된 검출기를 통해 정량화된다.
도 3은 유체 칩 (좌측), 히터들 상에 장착된 칩 (가운데) 및 히터들 상에 장착된 직사각형 챔버들을 갖는 칩 (우측)의 카메라 사진을 도시한다.
도 4는 검출 프로브의 일부를 형성하기 위하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유리 슬라이드를 기능화하기 위한 화학적 접근의 예를 도시한다. 이 과정은 2-단계 반응으로서, PDITC (p-페닐렌-다이아이소티오시아네이트) 활성화된 유리를 아지도-PEG-아민 (11-아지도-3,6,9-트라이옥사운데칸-1-아민)과 반응시킨 후, 구리-촉매 알킨-아지드 환화부가를 통해 알킨-작용화된 올리고뉴클레오티드와 접합시켜, 그 결과 친수성 PEG 링커를 통한 올리고뉴클레오티드 부착을 얻는다. 기능화된 표면의 친수성은 반응 성분들, 예컨대 표적 DNA, 프라이머 및 효소의 비특이적 흡수를 방지한다. 아지드-작용화된 표면과 변형된 사이클로알킨으로 개질된 올리고뉴클레오티드의 구리-무함유 반응이 또한 표면에 대한 올리고뉴클레오티드의 안정하고 고도로 특이적인 공유 부착을 가져온다.
도 5는 기능화된 프로브 구조의 예를 도시한다. 표면에 기능화된 올리고뉴클레오티드는 형광단으로 표지되고, 표면-기능화된 프로브에 혼성화된 올리고뉴클레오티드는 켄처로 표지된다. 검출 표적이 표면으로부터의 켄처-표지 올리고뉴클레오티드를 변위시킬 때, 표면의 형광 세기가 증가한다. 하단 패널은 표적 도입 전과 후의 형광 현미경 이미지를 도시하며; 여기서의 스폿 직경은 1 mm이다. 올리고뉴클레오티드는 하기와 같았다:
Alk-TMR-1 /5헥시닐/tttt/i6-TAMN/tggatgctgaatacttgtgataataca (서열 번호 1)
32-RQ ccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcca/3IAbRQSp/ (서열 번호 2)
54 tggatgctgaatacttgtgataatacacctctacgg (서열 번호 3)
도 6은 대류가 적용될 때의 유전 칩 내의 게놈 DNA (gDNA) 주형의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 대한 개략도를 도시하며; 서열 (10)은 정방향 프라이머를 나타내고, 서열 (11)은 역방향 프라이머를 나타낸다. 정방향 가닥 내의 도메인 10-15-16-17 및 역방향 가닥 내의 도메인 11-12-13-14를 포함하는 이중 가닥 앰플리콘이 고온인 95℃ 영역에서 변성되고, 이어서 60℃ 구역으로 대류에 의해 운반되며, 여기서 그것은 켄처-표지 올리고뉴클레오티드를 변위시켜, 상응하는 스폿에서 증가된 형광을 생성할 수 있다.
도 7은 대류 칩 내에서의 PCR 증폭의 결과를 도시한다. 좌측 패널은 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동을 도시한다. 레인(lane) 1은 대류 칩 내에서 30분 동안 증폭된 10 ng의 NA18562 gDNA 주형의 증폭 산물을 나타낸다. 프라이머 농도는, 정방향 프라이머의 경우 600 nM이고, 역방향 프라이머의 경우 200 nM이다. 레인 2는 프라이머, 폴리머라제, dNTP, 및 프로브 스폿은 갖지만, gDNA 입력은 갖지 않는 음성 대조군을 나타낸다. 래더(ladder)는 기준으로서의 50 bp 래더 (New England Biolabs)이다. 우측 패널은 증폭 반응을 통한 스폿 세기의 형광 시간 경과를 나타낸다. 이 실험을 위한 프로브 및 프라이머는 표적 rs7517833에 대해 설계하였다 (도 20 참조).
도 8은 유체 칩에서의 대류를 입증한다. 상단 좌측 패널은 칩을 가로지르는 온도 구배의 부재 하에서의 (두 히터 모두에 대해 60℃) 형광 트래킹 비드의 형광 이미지를 도시한다. 상단 우측 패널은 온도 구배가 적용될 때 (좌측 히터의 경우 95℃, 그리고 우측 히터의 경우 60℃) 형광 트래킹 비드의 시간-경과 (2초) 형광 이미지를 도시한다. 하단 패널은 챔버 두께를 기준으로 관찰된 평균 대류 속도를 요약한다.
도 9는 유체 칩 내의 다수의 앰플리콘들의 어레이-기반 판독에 대한 개략도를 도시한다. 우측 패널은 24개의 인쇄된 스폿을 갖는 칩의 형광 이미지를 나타낸다. M으로 마킹된 스폿은 켄처-표지 올리고뉴클레오티드가 결여되어 있는 양성 대조군 스폿이다. 다른 스폿들 각각은 특정 앰플리콘 서열에 특이적이다.
도 10은 대류 PCR의 전과 후의 유체 칩의 프로브 어레이 영역의 형광 이미지를 도시한다. 스폿 2, 3, 및 4에서의 프로브에 상응하는 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 10 ng의 gDNA 주형과 함께 도입하였다 (600 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머). 스폿 14의 높은 형광은 의도치 않은 것이며, 불량하게 기능화 또는 혼성화된 DNA 프로브 분자로부터 기인되었을 수 있다.
도 11은 대류 유체 칩에서의 9-플렉스 PCR 증폭에 대한 시간-경과 형광을 도시한다. 각각의 스폿의 형광 세기를 개별적으로 정량화하고, 백그라운드 형광 및 마커 스폿 M의 형광 세기에 기초하여 정규화하였다. 각각의 정방향 프라이머 농도는 200 nM이고, 각각의 역방향 프라이머 농도는 100 nM이고, gDNA 입력은 10 ng이다.
도 12는 인간, 마우스, 및 래트 DNA에 대한 프라이머에 상응하는 대류 유체 칩에서의 3-플렉스 PCR 증폭을 도시한다. 여기서, 한 행 내의 모든 스폿은 동일한 서열 동일성을 가지며 동일한 앰플리콘에 대해 보고한다. 상단 행은 양성 대조군 프로브이다. 반응 챔버 내에는 600 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 및 10 ng의 gDNA 주형이 존재하였다. 이 실험에서 사용된 서열들은 하기와 같았다:
프라이머
h_ppia_fp gttaacagattggaggtagtagcatttt (서열 번호 4)
h_ppia_rp tctatcaccaccccccaact (서열 번호 5)
r_b2m_fp caggtattttggggtatgattatggtt (서열 번호 6)
r_b2m_rp ccaacagaatttaccaggaaacaca (서열 번호 7)
m_gadph_fp caatacggccaaatctgaaagacaa (서열 번호 8)
m_gadph_rp ctgcaggttctccacacctat (서열 번호 9)
아암(arm)
h_ppia_arm
agcagtgcttgctgttccttagaattttgccttgtgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 10)
r_b2m_arm
ctggttcttactgcagggcgtgggaggagcgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 11)
m_gadph_arm
gatagcctggggctcactacagacccatgagggcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 12)
켄처
h_ppia_q /5IAbRQ/acaaggcaaaattctaaggaacagcaagcactgctgcacgatcaggggt (서열 번호 13)
r_b2m_q /gctcctcccacgccctgcagtaagaaccagaccccagcctttacac (서열 번호 14)
m_gadph_q /5IAbRQ/cctcatgggtctgtagtgagccccaggctatctcatgttcttcagagtgga (서열 번호 15)
앵커
/DBCO/tttttcctgacccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcgc/ATTO-550/ (서열 번호 16)
도 13a는, 2개의 표면 영역을 가지며, 각각의 표면 영역은 상이한 DNA 올리고뉴클레오티드 시약으로 기능화된 반응 챔버의 개략도를 도시한다. 도 1에서와는 달리, 올리고뉴클레오티드 시약들은 서열에 있어서 독립적이지 않고, 무효소 증폭에 대해 다소 타당하게 설계되어 있다. 도 13b는 2개의 표면 영역의 2가지의 가능한 실시 형태를 도시한다: 이들은 상이한 표면 상에 있거나, 또는 동일한 표면 상에 있지만, 원위적으로 위치되어 직접 상호작용을 방지한다.
도 14a는 제6 서열 (6) 및 제7 서열 (7)을 보유하는 표적 핵산 서열의 선형 증폭에 대한 기전을 도시한다. 표적 핵산 서열은 표면 영역 1로부터의 제2 서열 (2) 및 제3 서열 (3)을 보유하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 표면 영역 2로 촉매적으로 전달한다. 고온 구역 내에서의 이중 가닥 DNA 분자의 자발적 해리 (23:67)가 신속한 턴오버(turnover)를 가능하게 하는 데 중요하다. 도 14b는 도 14a에 기재된 과정의 네트(net) 반응뿐만 아니라, 실시간 판독을 가능하게 하는 형광 표지화 전략을 도시한다. 도 14c는 플립된(flipped) 5'/3' 배향에 의한 대안적인 구현을 도시한다 (절반 화살-머리는 문헌에서 통상적인 바와 같이 3' 말단을 나타낸다).
도 15는 표적 핵산 서열이 표면-결합된 올리고뉴클레오티드의 화학량론적 재배열을 유도하는 대조 실험에 대한 기전을 도시한다.
도 16은 다양한 농도의 표적 핵산이 도입될 때의 표면 영역 1의 시간-경과 형광을 도시한다. 선형 증폭 칩에서의 형광은 화학량론적 전환 칩에서보다 더 신속하게 감소되는데, 이는 무효소 DNA 증폭의 기전을 지지한다.
도 17은 표적 핵산 서열의 지수적 증폭에 대한 기전을 도시한다.
도 18은 삽입 염료, 예컨대 SybrGreen 또는 EvaGreen의 사용을 통한 무효소 증폭을 보고하는 시각적 표현을 도시한다. 표면 영역 1의 형광 세기는 반응 과정을 통해 감소될 것이며, 표면 영역 2의 형광 세기는 증가될 것이다.
도 19는 형광단-작용화된 올리고뉴클레오티드의 사용을 통한 무효소 증폭을 보고하는 시각적 표현을 도시한다. 표면 영역 1의 형광 세기는 반응 과정을 통해 증가될 것이며, 표면 영역 2의 형광 세기는 반응 과정을 통해 어두운 상태로 남아 있을 것이다.
도 20은 PCR 증폭/검출에 사용되는 프라이머 및 프로브 (앵커+아암+켄처)의 목록을 도시한다.
도 1은 차등 온도의 히터들 상에 수직으로 장착된 유체 칩의 실시 형태의 개략도를 도시한다. 유체 칩은 DNA 올리고뉴클레오티드를 기능화하기 위한 표면을 갖는 반응 챔버를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이러한 칩은 핵산의 멀티플렉스 PCR-기반 검출을 수행하는 데 사용된다.
도 2는 상기 시스템의 실시 형태를 도시하는데, 여기서는 유체 칩이 차등 온도의 히터들 상에 수직으로 장착되어 있다. 수평으로 장착된 광원이 칩에 기능화된 DNA 상의 형광 모이어티를 여기시키며; 형광 신호는 도시된 검출기를 통해 정량화된다.
도 3은 유체 칩 (좌측), 히터들 상에 장착된 칩 (가운데) 및 히터들 상에 장착된 직사각형 챔버들을 갖는 칩 (우측)의 카메라 사진을 도시한다.
도 4는 검출 프로브의 일부를 형성하기 위하여 DNA 올리고뉴클레오티드를 사용하여 유리 슬라이드를 기능화하기 위한 화학적 접근의 예를 도시한다. 이 과정은 2-단계 반응으로서, PDITC (p-페닐렌-다이아이소티오시아네이트) 활성화된 유리를 아지도-PEG-아민 (11-아지도-3,6,9-트라이옥사운데칸-1-아민)과 반응시킨 후, 구리-촉매 알킨-아지드 환화부가를 통해 알킨-작용화된 올리고뉴클레오티드와 접합시켜, 그 결과 친수성 PEG 링커를 통한 올리고뉴클레오티드 부착을 얻는다. 기능화된 표면의 친수성은 반응 성분들, 예컨대 표적 DNA, 프라이머 및 효소의 비특이적 흡수를 방지한다. 아지드-작용화된 표면과 변형된 사이클로알킨으로 개질된 올리고뉴클레오티드의 구리-무함유 반응이 또한 표면에 대한 올리고뉴클레오티드의 안정하고 고도로 특이적인 공유 부착을 가져온다.
도 5는 기능화된 프로브 구조의 예를 도시한다. 표면에 기능화된 올리고뉴클레오티드는 형광단으로 표지되고, 표면-기능화된 프로브에 혼성화된 올리고뉴클레오티드는 켄처로 표지된다. 검출 표적이 표면으로부터의 켄처-표지 올리고뉴클레오티드를 변위시킬 때, 표면의 형광 세기가 증가한다. 하단 패널은 표적 도입 전과 후의 형광 현미경 이미지를 도시하며; 여기서의 스폿 직경은 1 mm이다. 올리고뉴클레오티드는 하기와 같았다:
Alk-TMR-1 /5헥시닐/tttt/i6-TAMN/tggatgctgaatacttgtgataataca (서열 번호 1)
32-RQ ccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcca/3IAbRQSp/ (서열 번호 2)
54 tggatgctgaatacttgtgataatacacctctacgg (서열 번호 3)
도 6은 대류가 적용될 때의 유전 칩 내의 게놈 DNA (gDNA) 주형의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭에 대한 개략도를 도시하며; 서열 (10)은 정방향 프라이머를 나타내고, 서열 (11)은 역방향 프라이머를 나타낸다. 정방향 가닥 내의 도메인 10-15-16-17 및 역방향 가닥 내의 도메인 11-12-13-14를 포함하는 이중 가닥 앰플리콘이 고온인 95℃ 영역에서 변성되고, 이어서 60℃ 구역으로 대류에 의해 운반되며, 여기서 그것은 켄처-표지 올리고뉴클레오티드를 변위시켜, 상응하는 스폿에서 증가된 형광을 생성할 수 있다.
도 7은 대류 칩 내에서의 PCR 증폭의 결과를 도시한다. 좌측 패널은 증폭 산물의 아가로스 겔 전기영동을 도시한다. 레인(lane) 1은 대류 칩 내에서 30분 동안 증폭된 10 ng의 NA18562 gDNA 주형의 증폭 산물을 나타낸다. 프라이머 농도는, 정방향 프라이머의 경우 600 nM이고, 역방향 프라이머의 경우 200 nM이다. 레인 2는 프라이머, 폴리머라제, dNTP, 및 프로브 스폿은 갖지만, gDNA 입력은 갖지 않는 음성 대조군을 나타낸다. 래더(ladder)는 기준으로서의 50 bp 래더 (New England Biolabs)이다. 우측 패널은 증폭 반응을 통한 스폿 세기의 형광 시간 경과를 나타낸다. 이 실험을 위한 프로브 및 프라이머는 표적 rs7517833에 대해 설계하였다 (도 20 참조).
도 8은 유체 칩에서의 대류를 입증한다. 상단 좌측 패널은 칩을 가로지르는 온도 구배의 부재 하에서의 (두 히터 모두에 대해 60℃) 형광 트래킹 비드의 형광 이미지를 도시한다. 상단 우측 패널은 온도 구배가 적용될 때 (좌측 히터의 경우 95℃, 그리고 우측 히터의 경우 60℃) 형광 트래킹 비드의 시간-경과 (2초) 형광 이미지를 도시한다. 하단 패널은 챔버 두께를 기준으로 관찰된 평균 대류 속도를 요약한다.
도 9는 유체 칩 내의 다수의 앰플리콘들의 어레이-기반 판독에 대한 개략도를 도시한다. 우측 패널은 24개의 인쇄된 스폿을 갖는 칩의 형광 이미지를 나타낸다. M으로 마킹된 스폿은 켄처-표지 올리고뉴클레오티드가 결여되어 있는 양성 대조군 스폿이다. 다른 스폿들 각각은 특정 앰플리콘 서열에 특이적이다.
도 10은 대류 PCR의 전과 후의 유체 칩의 프로브 어레이 영역의 형광 이미지를 도시한다. 스폿 2, 3, 및 4에서의 프로브에 상응하는 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 10 ng의 gDNA 주형과 함께 도입하였다 (600 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머). 스폿 14의 높은 형광은 의도치 않은 것이며, 불량하게 기능화 또는 혼성화된 DNA 프로브 분자로부터 기인되었을 수 있다.
도 11은 대류 유체 칩에서의 9-플렉스 PCR 증폭에 대한 시간-경과 형광을 도시한다. 각각의 스폿의 형광 세기를 개별적으로 정량화하고, 백그라운드 형광 및 마커 스폿 M의 형광 세기에 기초하여 정규화하였다. 각각의 정방향 프라이머 농도는 200 nM이고, 각각의 역방향 프라이머 농도는 100 nM이고, gDNA 입력은 10 ng이다.
도 12는 인간, 마우스, 및 래트 DNA에 대한 프라이머에 상응하는 대류 유체 칩에서의 3-플렉스 PCR 증폭을 도시한다. 여기서, 한 행 내의 모든 스폿은 동일한 서열 동일성을 가지며 동일한 앰플리콘에 대해 보고한다. 상단 행은 양성 대조군 프로브이다. 반응 챔버 내에는 600 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 및 10 ng의 gDNA 주형이 존재하였다. 이 실험에서 사용된 서열들은 하기와 같았다:
프라이머
h_ppia_fp gttaacagattggaggtagtagcatttt (서열 번호 4)
h_ppia_rp tctatcaccaccccccaact (서열 번호 5)
r_b2m_fp caggtattttggggtatgattatggtt (서열 번호 6)
r_b2m_rp ccaacagaatttaccaggaaacaca (서열 번호 7)
m_gadph_fp caatacggccaaatctgaaagacaa (서열 번호 8)
m_gadph_rp ctgcaggttctccacacctat (서열 번호 9)
아암(arm)
h_ppia_arm
agcagtgcttgctgttccttagaattttgccttgtgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 10)
r_b2m_arm
ctggttcttactgcagggcgtgggaggagcgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 11)
m_gadph_arm
gatagcctggggctcactacagacccatgagggcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (서열 번호 12)
켄처
h_ppia_q /5IAbRQ/acaaggcaaaattctaaggaacagcaagcactgctgcacgatcaggggt (서열 번호 13)
r_b2m_q /gctcctcccacgccctgcagtaagaaccagaccccagcctttacac (서열 번호 14)
m_gadph_q /5IAbRQ/cctcatgggtctgtagtgagccccaggctatctcatgttcttcagagtgga (서열 번호 15)
앵커
/DBCO/tttttcctgacccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcgc/ATTO-550/ (서열 번호 16)
도 13a는, 2개의 표면 영역을 가지며, 각각의 표면 영역은 상이한 DNA 올리고뉴클레오티드 시약으로 기능화된 반응 챔버의 개략도를 도시한다. 도 1에서와는 달리, 올리고뉴클레오티드 시약들은 서열에 있어서 독립적이지 않고, 무효소 증폭에 대해 다소 타당하게 설계되어 있다. 도 13b는 2개의 표면 영역의 2가지의 가능한 실시 형태를 도시한다: 이들은 상이한 표면 상에 있거나, 또는 동일한 표면 상에 있지만, 원위적으로 위치되어 직접 상호작용을 방지한다.
도 14a는 제6 서열 (6) 및 제7 서열 (7)을 보유하는 표적 핵산 서열의 선형 증폭에 대한 기전을 도시한다. 표적 핵산 서열은 표면 영역 1로부터의 제2 서열 (2) 및 제3 서열 (3)을 보유하는 다수의 올리고뉴클레오티드를 표면 영역 2로 촉매적으로 전달한다. 고온 구역 내에서의 이중 가닥 DNA 분자의 자발적 해리 (23:67)가 신속한 턴오버(turnover)를 가능하게 하는 데 중요하다. 도 14b는 도 14a에 기재된 과정의 네트(net) 반응뿐만 아니라, 실시간 판독을 가능하게 하는 형광 표지화 전략을 도시한다. 도 14c는 플립된(flipped) 5'/3' 배향에 의한 대안적인 구현을 도시한다 (절반 화살-머리는 문헌에서 통상적인 바와 같이 3' 말단을 나타낸다).
도 15는 표적 핵산 서열이 표면-결합된 올리고뉴클레오티드의 화학량론적 재배열을 유도하는 대조 실험에 대한 기전을 도시한다.
도 16은 다양한 농도의 표적 핵산이 도입될 때의 표면 영역 1의 시간-경과 형광을 도시한다. 선형 증폭 칩에서의 형광은 화학량론적 전환 칩에서보다 더 신속하게 감소되는데, 이는 무효소 DNA 증폭의 기전을 지지한다.
도 17은 표적 핵산 서열의 지수적 증폭에 대한 기전을 도시한다.
도 18은 삽입 염료, 예컨대 SybrGreen 또는 EvaGreen의 사용을 통한 무효소 증폭을 보고하는 시각적 표현을 도시한다. 표면 영역 1의 형광 세기는 반응 과정을 통해 감소될 것이며, 표면 영역 2의 형광 세기는 증가될 것이다.
도 19는 형광단-작용화된 올리고뉴클레오티드의 사용을 통한 무효소 증폭을 보고하는 시각적 표현을 도시한다. 표면 영역 1의 형광 세기는 반응 과정을 통해 증가될 것이며, 표면 영역 2의 형광 세기는 반응 과정을 통해 어두운 상태로 남아 있을 것이다.
도 20은 PCR 증폭/검출에 사용되는 프라이머 및 프로브 (앵커+아암+켄처)의 목록을 도시한다.
본 명세서에서, 본 발명자들은 DNA 증폭 검정을 위한 디바이스, 시스템, 및 방법을 제공한다. 본 발명은 위양성을 초래하는 의도치 않은 분자 사건을 방지하기 위하여 시약들의 고상 분리를 사용하고, 이중 가닥 앰플리콘의 자발적 해리를 가능하게 하기 위하여 대류 순환을 사용한다. 3가지 관련 종래 기술 및 본 발명과 비교한 그들의 제한이 하기에 기재되어 있다.
1.
대류 PCR
액체는, 불균일한 온도에서 유지되고 일정 부피 내에 국한되어 있을 때, 레일리-베나드 대류(Rayleigh-Benard convection flow)로서 알려진 과정을 통해 순환될 것이다 [1]. 레일리-베나드 대류는 분자 진단에 있어서 PCR에 필요한 온도 사이클링을 제공하기 위한 저가 디바이스를 생성하기 위하여 사용되어 왔다 (대류 PCR, cf-PCR) [2, 미국 특허 제6,586,233 B2호, 미국 특허 제8,735,103 B2호, 미국 특허 제8,187,813 B2호]. cf-PCR은 높게는 대략 95℃로 그리고 낮게는 대략 60℃ (어닐링/증폭 온도)로 유지되는 정적 온도 구배만을 단지 필요로 하는데, 이는 고에너지 소비 열 사이클링 기기에 대한 필요성을 없애준다.
cf-PCR은 특정 DNA 서열에 대한 싱글-플렉스 [3-5, 미국 특허 제8,187,813 B2호] 및 멀티플렉스 검출 둘 모두에 대해 입증되어 왔으며 [6]; 멀티플렉스 접근법은 종점 전기영동 결과 검사를 이용하였다. cf-PCR은 전통적인 qPCR 검정의 온도 균일성이 결여되어 있기 때문에, cf-PCR은 높은 서열 선택성을 필요로 하는 응용, 예컨대 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)의 검출 또는 프로파일링을 위한 응용에 있어서 어려움이 있으며, 이에 따라 SNV 특이적 cf-PCR은 아직까지 제시되어 있지 않다. cf-PCR의 실시간 검출이 비특이적 형광 염료 (SYBR 그린(Green) I) 검출 방법을 사용하여 용액상(solution phase)에서 유일하게 밝혀져 있다 [7]. 이러한 접근법은 cf-PCR이 멀티플렉스 환경에서 사용되는 것을 제약한다. 마찬가지로, 5'-뉴클레아제 검정 화학 또는 혼성화 프로브와 같은 서열 특이적 실시간 검출 방법의 응용은 형광단 스펙트럼 중첩으로 인해 5 내지 6개 이하의 표적의 동시 검출을 가능하게 할 것이다. 본 발명은, 본 발명이 후속 분석을 위한 오픈-튜브 단계를 필요로 하지 않고서 공간 분해된 멀티플렉스 판독치를 제공한다는 점에서 cf-PCR과 차별화된다. 추가적으로, 본 발명의 무효소 실시 형태에서는, 효소가 증폭에 필요하지 않다.
2.
마이크로어레이
마이크로어레이 기술은 생물학적 샘플의 멀티플렉스 스크린을 위한 주요 기법들 중 하나이다. 다수의 프로브 서열이 표면에 기능화되며, 특정 스폿의 형광 신호가 상응하는 서열의 정량적 판독치로서 취해진다. 이 기술은 다양한 유형의 생물학적 분석물, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 탄수화물 및 세포의 검출에 있어서 성공적으로 입증되어 왔다 [8-12]. 마이크로어레이 기술의 적용은 핵산 시험 분야에서 가장 광범위한 사용을 나타내고 있다. 마이크로어레이 기술은 전체 게놈 혼성화, 드 노보(de novo) 서열분석, 재서열분석, 비교 유전체학(comparative genomics), 전사체 혼성화 또는 단일 뉴클레오티드 변이의 확인에 대한 NA 마이크로어레이의 적용을 보여주어 왔다 [13-15]. 모든 상기 언급된 NA 응용은 혼성화를 위하여 대량의 NA 표적을 필요로 하며, 결과적으로 마이크로어레이는 전형적으로 PCR 증폭 산물에 대한 최종 판독으로서 사용된다. 마이크로어레이 판독은 전형적으로 느리며, 하룻밤 혼성화를 필요로 하며, 또한 오픈-튜브 과정으로 인해 앰플리콘 오염에 대한 위험이 있다.
3.
토홀드(toehold) 프로브 및 무효소 증폭
토홀드-매개 가닥 치환 반응 [19-21]은, 효소의 부재 하에서 일어나고 본 발명과 관련된 경쟁적 혼성화의 과정이다. 토홀드-매개 가닥 치환을 사용하여, 균질한 용액 중에서의 DNA 및 RNA 분석물 서열의 무효소 증폭이 입증되어 왔다 [22-27] (미국 특허 제8,043810 B2호, 미국 특허 제8,110,353 B2호). 본 발명의 무효소 증폭 실시 형태는, 열 대류가 이중 가닥 앰플리콘을 자발적으로 해리하는 데 사용되고, 반응성 시약들을 서로 격리시켜 위양성을 감소시키기 위하여 표면-기능화가 사용된다는 점에서 상이하다. 토홀드-매개 가닥 치환은 다른 서열로의 표적 분석물 서열의 화학량론적 전환을 위하여 표면 기능화된 DNA 올리고뉴클레오티드에 적용되어 왔다 (미국 특허 제8,630,809 B2호). 본 발명은 검출 표적의 증폭을 제공하는 데 있어서 상이하다.
4.
출원인의 기술
본 발명은 특이적 핵산 표적 서열의 증폭 및 검출을 위한 시약 및 디바이스를 기재한다. 본 발명은 위양성을 초래하는 의도치 않은 분자 사건을 방지하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 시약들의 고상 기능화 및 격리를 이용하고, 표적 재생을 위한 레일리-베나드 열 대류의 적용 및 DNA 표면 혼성화 동태의 촉진 (반응 혼합물의 더 효율적인 혼합)을 이용한다. 레일리-베나드 대류 체계(regime)는, 규정된 각도로 경사진 2개의 차등 제어되는 핫 플레이트 (도 1 내지 도 3) 사이에, 두께가 250 μm인 스페이서로서의 양면 접착 테이프에 의해 분리된 2개의 1 mm 두께의 백색-물유리 현미경 슬라이드로 이루어진 반응 챔버를 배치함으로써 실현될 수 있다. 스페이서의 형상은 반응 챔버의 형상을 결정하며, 대류 속도 및 궤도를 변경시키도록 변형될 수 있다. 유리가 칩 재료로서 선택되는데, 이는, 유리가 챔버를 가로질러 균일한 온도 구배의 유지를 촉진시키고, 합성 올리고뉴클레오티드에 의한 표면 기능화를 가능하게 하기 때문이다.
핫 플레이트는 2개의 상이한 온도 (각각 저온 히터 및 고온 히터)를 유지하도록 설정되며, 이는 액체 반응 혼합물로 충전된 반응 챔버를 가로질러 온도 구배를 야기한다. 챔버의 고온 부분 부근에 존재하는 액체는 더 높은 온도를 가지며, 이에 따라 더 낮은 온도를 갖는 챔버의 부분에 존재하는 액체보다 덜 밀집되어 있다. 국한된 부피 내에서의 액체 밀도의 그러한 분포는 부력과 중력 (각각 고온 히터 및 저온 히터 부근) 사이에 차이를 일으키며, 이는 다시 순환 안정-상태 대류의 구조를 가져온다.
액체 중에 용해된 모든 분자는 대류에 의해 끌려감으로써 온도 구역들 사이에서의 순환에 관여한다. 온도 구역들을 따라 이동하면서, 분자는 주기적인 온도 변동을 겪는다. 예를 들어, 순환 대류 중에 배치된 이중 가닥 DNA 분자는 가열 및 냉각의 다회 사이클을 겪는다. 고온 구역 내의 용액의 온도가 DNA 이중체를 용융시키기에 충분하고, 저온 구역의 온도가 이중 가닥 형태로 주어진 핵산을 유지하기에 유리하다면, 이러한 대류에서의 핵산의 순환은 반복가능한 변성 및 어닐링 사이클을 가져온다. ds-DNA 변성 및 어닐링의 다회 사이클의 관찰은 다양한 방법에 의해, 예를 들어 형광 현미경법을 사용하여, DNA 샘플과 함께 반응 혼합물 중에 들어 있는 비특이적 DNA 염색 염료의 세기를 기록함으로써 수행될 수 있다.
프로토타입 가열 기기는 알루미늄 플레이트에 글루잉된 2개의 저항 Kapton 포일 히터로 이루어지며, 최대 5개의 유체 칩에 대하여 차등 가열을 제공하도록 동시에 사용될 수 있다. 2개의 저-와트수 전력 공급장치가 히터에 전력을 공급한다. 제안된 증폭 시스템은 ±2℃의 범위에서 가열 요소 온도 오차에 대해 허용되며, 정확한 컴퓨터 제어 하드웨어를 필요로 하지 않는다.
5.
무효소 선형 증폭 실시 형태
본 발명은 표적 핵산의 무효소 증폭을 나타내는데, 여기서는 앰플리콘 농도가 시간 경과에 따라 선형으로 증가한다 (도 14a). 2개의 표면 영역은 2개의 DNA 올리고뉴클레오티드, 도너, D (도메인 1을 포함함) 및 억셉터, A (도메인 4-5를 포함함)로 비가역적으로 기능화된다. 표면 영역 1에 기능화된 도너 올리고뉴클레오티드는, 단일 가닥 도메인 2가 용액에 노출되고 토홀드 서열의 역할을 하는 방식으로, 도메인 4-5에 상보적인 도메인 2-3을 포함하는 단일 가닥 S와 초기에 혼성화된다. 억셉터 가닥은 표면 영역 2에 비가역적으로 기능화되고, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 초기에 나타낸다. 표면 영역 1 및 표면 영역 2는 35 oC로 유지된 온도 구역 (35 oC 구역) 내에 국소화되는데, 여기서는 D-S 이중체가 검출 검정의 시간 스케일에 걸쳐 고도로 안정하도록 설계된다. 표적 분자 T (도메인 6-7을 포함함)가 반응 용액 내에 도입되고, 대류에 의해 반응 챔버의 35 oC 구역에 전달될 것이다. 표적 T는 도메인 7 ("토홀드" 도메인)을 통해 신호 S에 결합하고, 토홀드-매개 가닥 치환 기전을 통해 표면으로부터의 도메인 3을 용액으로 변위시킨다. 이어서, 레일리-베나드 대류는 이중체를 챔버의 고온 구역 (85 oC로 유지됨)으로 운반하며, 여기서 이중체는 해리된다. 이어서, 2개의 단일 가닥 분자, 표적 가닥 T 및 단일 가닥 S는 챔버의 35 oC 구역 내로 다시 전달되며, 여기서 가닥 S는 표면 영역 2에 기능화된 억셉터 올리고뉴클레오티드 A에 결합한다. 동시에, 단일 가닥 표적 T가 표면 영역 1로부터의 다른 신호 S 분자를 촉매적으로 변위시킬 수 있게 함으로써, 촉매적 사이클을 완료한다. 이러한 촉발(trigger)은 신호 분자 S가 표면 영역 1로부터 표면 영역 2로 완전히 전달될 때까지 연속적으로 진행되어야 한다.
선형 증폭 계획은 올리고뉴클레오티드 반응물질의 고상 격리와 온도-구동 대류를 동시에 사용하는 것의 이득을 입증한다. 상이한 표면 영역들 상에의 올리고뉴클레오티드 시약들의 고정화는 표적 서열의 부재 하에서의 위양성 신호 분자 방출 (거짓 증폭)을 피할 수 있게 하면서, 한편 자발적 수송 및 개선된 물질 전달 이외에 열 대류가 표적-신호 복합체 (T-S)의 용융을 통한 표적 재생을 유도한다. 대조적으로, 전체 용액의 온도의 변화는 바람직하지 않은데, 이는, 표면으로부터의 모든 올리고뉴클레오티드의 자발적 해리로 이어질 것이기 때문이다.
단일 가닥 S를 형광 염료로 표지하는 것은 선형 증폭 과정의 실시간 모니터링을 위한 한 가지 접근법을 나타낸다. 표면 영역 1로부터 등록된 형광의 세기의 감소뿐만 아니라, 표면 영역 2로부터 등록된 형광의 세기의 증가는 어떻게 반응 증폭 반응이 진행되는지를 효과적으로 반영할 수 있다.
6.
화학량론적 검출 실시 형태
무효소 증폭 방법이 다회의 턴오버를 나타내는 것을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 대류 디바이스를 사용하여 상응하는 화학량론적 검출 시스템을 구성하였다 (도 15). 화학량론적 시스템은 또한 도너, 즉 도메인 11-12를 포함하는 Ds 가닥 및 억셉터, 즉 도메인 16을 포함하는 As 가닥으로 기능화된 2개의 표면 영역을 포함한다. Ds 가닥은 도메인 14-15를 포함하는 가교(bridge) 올리고뉴클레오티드 Bs 및 도메인 13을 포함하는 신호 올리고뉴클레오티드 Ss로 이루어진 신호 복합체와 혼성화된다. Bs 가닥의 도메인 14와 As 가닥은 동일한 서열을 갖는다. 반응에 도입된 도메인 17-18을 포함하는 표적 분자 T가 도너 Ds의 토홀드 도메인 11에 결합되고, 이어서 신호 복합체를 용액 내로 변위시킨다. 이 과정 동안에, 표적 T는 도너 Ds와 결합하고 챔버의 고온 구역에서 재생될 수 없게 하여, 표면 영역 1로부터의 다른 신호 복합체의 방출을 촉발한다. 변위된 신호 복합체는 대류에 의해 85 oC 구역 내로 전달되며, 여기서 그것은 해리된다. 해리 후에, 신호 분자 Ss는 35 oC 구역에 다시 전달되고, 표면 영역 2에 기능화된 억셉터 올리고뉴클레오티드 As에 의해 포획된다. 따라서, 포획된 단일 가닥 Ss의 양은 시스템 내로 도입된 표적 T의 양과 동일하다.
화학량론적 검출 시스템의 실시간 관찰이 또한 형광 염료에 의한 단일 가닥 Ss의 단순 표지화 및 표면 영역 2의 형광 세기의 변화의 기록을 통해 수행될 수 있다. 도 16은, 검출 표적의 동일한 초기 양을 가정하여, 선형 증폭 및 화학량론적 검출 시스템에 대하여 표면 영역 1 상에서의 형광의 시간-기반 감소를 도시한다. 형광 신호의 감소는, 각각의 표적 분자가 표면 1로부터의 다수의 신호 분자를 표면 2에 촉매적으로 전달하고 있는 설계된 기전을 지지하는 선형 증폭 검정에서보다 선형 증폭 시스템에서 더 빠르다.
7.
무효소 지수적 증폭 실시 형태
도 17은 검출 표적이 앰플리콘 산물의 방출을 촉발하고, 시약들이 소비될 때까지 앰플리콘 산물의 농도가 시간에 따라 지수적으로 증가하는 본 발명의 실시 형태를 도시한다 (도 17). 이 시스템에서는, 2개의 표면 영역이 부분 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 복합체로 기능화된다: 표면 영역 1은, 표면에 비가역적으로 부착되고, 도메인 3이 단일 가닥을 유지하고 토홀드 서열로서 작용하는 방식으로 도메인 3-2를 포함하는 올리고뉴클레오티드 S1과 혼성화된 단일 도메인 올리고뉴클레오티드 1로 이루어진 복합체를 갖는다. 표면 영역 2는 표면 영역 1을 거울상으로 반영하여 표면에 기능화된 올리고뉴클레오티드 시약의 유사한 구조를 갖는다: 도메인 4를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 표면에 비가역적으로 기능화되고, 도메인 6-5를 포함하는 올리고뉴클레오티드 S2와 혼성화되며, 이때 도메인 6이 단일 가닥 토홀드를 나타낸다. 반응 혼합물 내로의 도메인 7 및 도메인 8 (각각 도메인 6 및 도메인 5와 서열이 동일함)을 포함하는 표적 가닥 T의 주입은 이중 가닥 앰플리콘 형태로의 표면 영역 1로부터의 올리고뉴클레오티드 S1의 방출을 가져온다.
대류는 이중체를 85℃ 구역에 운반하며, 여기서 이중체는 용융된다. 이제, 2개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드, 즉 초기 표적 T와 방출된 가닥 S1이 35℃ 구역에 다시 유입되며, 여기서 이들 각각은 표면으로부터의 올리고뉴클레오티드 종의 새로운 방출을 촉발한다. 상세하게는, 표적 올리고뉴클레오티드 T는 표면 영역 1로부터 제2 가닥 S1을 촉매적으로 방출하면서, 한편 초기에 방출된 가닥 S1은 제2 표면 영역으로부터의 가닥 S2의 방출을 촉발한다. 따라서, 매 대류 사이클마다의 종료 시점에서, 용액 중에 존재하는 올리고뉴클레오티드 종의 양은 2배가 되며, 그 결과 용액상에서의 앰플리콘 종의 지수적 축적을 가져온다.
8.
대안적인 검출 방법
도 14b는 반응 진행을 검정하기 위한 하나의 가능한 검출 기전을 제시한다. 형광 현미경법을 또한 이용하는 대안적인 판독 접근법이 가능하다. 서열-비특이적 삽입 핵산 염색 염료, 예컨대 SybrGreen 및 Syto 염료가, 축적된 이중 가닥 산물의 총량을 지시하는 데 사용될 수 있다 (도 18). 표면 영역 2 상에 고정화된 억셉터 가닥 A (도메인 4-5)는 반응의 출발 시점에서 단일 가닥 형태이기 때문에, 삽입 염료는 가닥 A에 대해 저친화성을 가질 것이다. 반응 과정 동안에, 더욱 더 많은 가닥 S (도메인 2-3)가 표면 기능화된 가닥 A (도메인 4-5)와 혼성화될 것이다. 새로 형성된 복합체 A-S는 이제 염료로 효율적으로 염색될 것이며, 이는 표면 영역 2의 형광의 증가를 야기할 것이다. 반대 상황이 표면 영역 1 상에서 잠재적으로 관찰될 수 있다.
FRET-기반 검출 기법의 적용이 지수적 증폭의 실시예에 예시되어 있다 (도 19). 예를 들어, 형광 염료로 비가역적으로 표지된, 표면 고정화된 가닥 (도메인 1이 표지된 것으로 도시되어 있음)이, 표적이 첨가되기 전에, 켄처 기능화된 단일 가닥 (도메인 2-3을 갖는 가닥이 형광 켄처로 도시되어 있음)으로 효율적으로 켄칭될 수 있다. 표적의 첨가는 표면으로부터의 단일 가닥의 지수적 방출을 가져오고 표면 및 고정화된 가닥을 환하게 형성할 것이다.
9.
대류 PCR의 실시간 검출
본 명세서에서 청구된 조성물의 다른 응용은 본 조성물이 용액 중에서 진행되는 효소적 핵산 증폭 과정의 표면-기반 실시간 모니터링을 위한 효율적인 수단으로서 사용될 수 있다는 것이다. 표면 기능화된 프로브를 사용한 대류-기반 PCR의 실시간 모니터링에 대해 보고된 예는 없다.
도 6은 온도-구동 대류에서 수행되는 PCR 반응의 실시간 모니터링을 위하여 청구된 조성물을 이용하는 접근법을 도시한다. 초기에, 60℃ 구역에 존재하는 표면 영역 1이 도메인 1 및 형광 염료를 포함하는 앵커 올리고뉴클레오티드로 기능화된다. 도메인 3-2를 포함하는 아암 올리고뉴클레오티드가 그의 2 도메인을 통해 앵커 올리고뉴클레오티드에 혼성화된다. 앵커-아암 올리고뉴클레오티드 복합체는 다시 도메인 4 및 도메인 5 및 형광 켄처를 포함하는 켄처 올리고뉴클레오티드와 그의 도메인 4를 통해 혼성화되고; 도메인 5는 단일 가닥이다. 반응 용액은 올리고뉴클레오티드 프라이머 (도메인 10 및 도메인 11)의 효소적 증폭을 위한 시약, 예컨대 DNA 폴리머라제, 데옥시뉴클레오티드 트라이포스페이트, 2가 이온 (Mg2+)의 혼합물을 포함한다. 표적 분자 (gDNA)의 주입 후에, 그것은 95℃에서 자발적으로 용융된다. 이어서, 용융된 gDNA가 대류에 의해 60℃ 구역 내로 전달되고, 여기서 프라이머들이 그들의 특이적 표적 서열에 어닐링되고, DNA 폴리머라제에 의해 증폭되는데, 이는 정방향 가닥 내에 도메인 10-15-16-17을 그리고 역방향 가닥 내에 도메인 11-12-13-14를 포함하는 이중 가닥 앰플리콘 분자의 형성으로 이어진다. 앰플리콘 분자는 95℃에서 용융되고, 60℃ 구역에 다시 유입되고, 여기서 정방향 가닥 10-15-16-17은 표면 기능화된 복합체 앵커-아암으로부터의 켄처 올리고뉴클레오티드를 치환하여, 표면 영역 1로부터 기록된 형광 신호의 증가를 가져온다.
10.
다수의 표적 서열의 동시 모니터링
본 명세서에서 제안된 조성물 및 방법은 다수의 핵산 표적 서열의 증폭 (무효소 또는 효소-기반)의 동시 모니터링을 가능하게 한다. 상이한 표면 영역들에서의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브들의 공간적 패턴화는 어레이- 또는 카메라-기반 판독이 각각의 표적 증폭 반응의 앰플리콘 농도에 대한 독립적인 정보를 제공할 수 있게 한다.
11.
예시적인 올리고뉴클레오티드
하기 올리고뉴클레오티드 서열은 예로서 그러나 제한 없이 제공된다:
선형 증폭 시스템 올리고뉴클레오티드
1 /5헥시닐/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT (서열 번호 17)
2-3 /56-TAMN/TGGATGCTG-AATACTTGTGATAATACACCTCTACGG (서열 번호 18)
4-5 /5헥시닐/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA (서열 번호 19)
6-7 CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA (서열 번호 20)
화학량론적 검출 시스템 올리고뉴클레오티드
11-12 /5헥시닐/TTTTTTGTCAACC-ATCATCGTTCGTACCACAGTGTTCAG (서열 번호 21)
13 /56-TAMN/TGGATGCTGAATACTTGTGATAATACACCTCTACGG (서열 번호 22)
14-15 CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCA-CTGAACACTGTGGTACGAACGATGA (서열 번호 23)
16 /5헥시닐/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCA (서열 번호 24)
17-18 CTGAACACTGTGGTACGAACGATGAT-GGTTGACA (서열 번호 25)
12.
참고문헌
하기 참고문헌들은, 그들이 본 명세서에 기재된 것들에 대해 보완하는 예시적인 절차상 또는 다른 세부사항을 제공하는 범위에서, 구체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
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<400> 2
ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catcca 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 3
tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 4
gttaacagat tggaggtagt agcatttt 28
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 5
tctatcacca ccccccaact 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 6
caggtatttt ggggtatgat tatggtt 27
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 7
ccaacagaat ttaccaggaa acaca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 8
caatacggcc aaatctgaaa gacaa 25
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 9
ctgcaggttc tccacaccta t 21
<210> 10
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 10
agcagtgctt gctgttcctt agaattttgc cttgtgcgat gctgaatact tgtgataata 60
cacctctacg ggtcagg 77
<210> 11
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 11
ctggttctta ctgcagggcg tgggaggagc gcgatgctga atacttgtga taatacacct 60
ctacgggtca gg 72
<210> 12
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 12
gatagcctgg ggctcactac agacccatga gggcgatgct gaatacttgt gataatacac 60
ctctacgggt cagg 74
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 13
acaaggcaaa attctaagga acagcaagca ctgctgcacg atcaggggt 49
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 14
gctcctccca cgccctgcag taagaaccag accccagcct ttacac 46
<210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 15
cctcatgggt ctgtagtgag ccccaggcta tctcatgttc ttcagagtgg a 51
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 16
tttttcctga cccgtagagg tgtattatca caagtattca gcatcgc 47
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 17
tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta tt 32
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 18
tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 19
tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta ttcagcatcc a 41
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 20
ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catcca 36
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 21
ttttttgtca accatcatcg ttcgtaccac agtgttcag 39
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 22
tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36
<210> 23
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 23
ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catccactga acactgtggt acgaacgatg 60
a 61
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 24
tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta ttcagcatcc a 41
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 25
ctgaacactg tggtacgaac gatgatggtt gaca 34
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 26
ccaggggctg tgcagaatgg a 21
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 27
tctaaaaata gagcatgaaa tggctcc 27
<210> 28
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 28
gaggtcatgt gcatttaaag ttgggttc 28
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 29
gcacgccccc ggc 13
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 30
ggcagctctg gagggcgc 18
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 31
actaacctgt taacttcgag ctga 24
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 32
cctgaggtgg gcactggact g 21
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 33
gtatggtttt gcttaatttc cctaacac 28
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 34
cttcagcaca aactccttct aagcaga 27
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 35
gttcgcaggg tttcacaaaa atag 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 36
gagccctact tttgaatccc caggta 26
<210> 37
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 37
ctgaagcatc ttagtgcttt taaattatag aatta 35
<210> 38
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 38
accacttaag atttgatttt tatcattaat tgtgatgc 38
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 39
gtatcagagc caagttcaat aagcatt 27
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 40
ggaaatgagg ttgggaccaa aagaaga 27
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 41
atcacctccc ccagatcact 20
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 42
actgcctgct tgtcaacagc tatc 24
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 43
acttccatgt tttaaagcat ctacgg 26
<210> 44
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44
tgccacagcc agaaatcagc gcacggcgcg atgctgaata cttgtgataa tacacctcta 60
cgggtcagg 69
<210> 45
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45
gagtctctta ggaccccagg gttctaaggc ccgcgatgct gaatacttgt gataatacac 60
ctctacgggt cagg 74
<210> 46
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46
ggtgggaagg agggagcacg ggcttccgcg atgctgaata cttgtgataa tacacctcta 60
cgggtcagg 69
<210> 47
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 47
cagggttttc tctgattcgt gtgcttctct cccagcgatg ctgaatactt gtgataatac 60
acctctacgg gtcagg 76
<210> 48
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
cctccccaca agtgtatgag ggtggctgct gcgatgctga atacttgtga taatacacct 60
ctacgggtca gg 72
<210> 49
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
gcaaggaata acccctgtca aaccatcaga aagaagcgcg atgctgaata cttgtgataa 60
tacacctcta cgggtcagg 79
<210> 50
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
cagaaattgt actagatgct gaggactaaa gatacttaag tatcttatcg cgatgctgaa 60
tacttgtgat aatacacctc tacgggtcag g 91
<210> 51
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
tcttccctct tgctttgtca atcagttctc agtagcagcg atgctgaata cttgtgataa 60
tacacctcta cgggtcagg 79
<210> 52
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
gggctcaaaa gatggccagc agaagaagca tagtgcgatg ctgaatactt gtgataatac 60
acctctacgg gtcagg 76
<210> 53
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
aaaacaaggc agtcacaaag gctagcacta ccattggcga tgctgaatac ttgtgataat 60
acacctctac gggtcagg 78
<210> 54
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
aatgtctagc ccatagtgga tgccctgtta gtggtgcgat gctgaatact tgtgataata 60
cacctctacg ggtcagg 77
<210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
gccgtgcgct gatttctggc tgtggcagaa gagatgccta caa 43
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
gggccttaga accctggggt cctaagagac tcatcctgaa gccaag 46
<210> 57
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
ggaagcccgt gctccctcct tcccaccaca catggcacaa a 41
<210> 58
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
tgggagagaa gcacacgaat cagagaaaac cctgcaggga cagca 45
<210> 59
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
agcagccacc ctcatacact tgtggggagg gagcctccag c 41
<210> 60
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
gcttctttct gatggtttga caggggttat tccttgcaaa caaaacagac caaaa 55
<210> 61
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
gataagatac ttaagtatct ttagtcctca gcatctagta caatttctgg ttctttgtat 60
gcagt 65
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
tgctactgag aactgattga caaagcaaga gggaagacct ttctgaggcc 50
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 63
actatgcttc ttctgctggc catcttttga gcccacaggc agggaa 46
<210> 64
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 64
caatggtagt gctagccttt gtgactgcct tgttttgggc tgccatg 47
<210> 65
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 65
accactaaca gggcatccac tatgggctag acattgtcct aagcacttca 50
<210> 66
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
tttttcctga cccgtagagg tgtattatca caagtattca gcatcgc 47
Claims (110)
- 유체 반응 챔버로서,
제1 표면; 및
제1 표면과 접촉하지 않는 제2 표면을 포함하고, 여기서 상기 제1 및 제2 표면은 서로 대면하는, 유체 반응 챔버:
여기서 제1 표면은 복수의 올리고뉴클레오티드 복합체를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드 복합체는 제1 표면 영역에서 공간적으로 분리된 곳에 위치하며, 올리고뉴클레오티드 복합체 각각은:
제1 올리고뉴클레오티드를 제1 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티(linking moiety) 및 제1 DNA 서열을 포함하는, 제1 올리고뉴클레오티드; 및
제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열을 포함하는, 제2 올리고뉴클레오티드로서, 제2 서열은 제1 서열에 상보적인, 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하고,
제2 표면 영역은 복수의 올리고뉴클레오티드 복합체를 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드 복합체는 제2 표면 영역에서 공간적으로 분리된 곳에 위치하며, 올리고뉴클레오티드 복합체 각각은:
제3 올리고뉴클레오티드를 제2 표면 영역에 비가역적으로 연결시키기 위한 연결 모이어티 및 제4 DNA 서열을 포함하는, 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서
제4 서열은 제2 서열, 제3 서열, 또는 적어도 제2 서열의 연속되는 6개의 뉴클레오티드 및 제3 서열의 연속되는 6개의 뉴클레오티드의 조합에 상보적이다. - 제1항에 있어서, 유체 반응 챔버가 제5 DNA 서열 및 제6 DNA 서열을 포함하는, 제4 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함하되, 제5 서열이 제4 서열에 상보적이고, 제2 서열이 제5 서열과 상보적이거나 제6 서열과 상보적인, 유체 반응 챔버.
- 제1항에 있어서, 유체 반응 챔버 내에 배치된 유체를 추가로 포함하며, 상기 유체는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드, 혼성화 완충액, 및 선택적으로 비특이적 핵산 염색 염료를 포함하는, 유체 반응 챔버.
- 표적 핵산을 증폭시키는 방법으로서,
(a) (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유체 반응 챔버, 및 (ii) 제1 및 제2 열원을 제공하는 단계로서, 상기 제1 및 제2 열원은 상이한 제1 및 제2 열 레벨(heat level)을 인가하여 상기 유체 반응 챔버의 제1 영역에서 제2 영역으로 온도 구배를 생성할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 열 레벨은 동일하지 않은, 단계;
(b) 표적 핵산 서열을 포함하는 유체를 상기 유체 반응 챔버 내로 도입하는 단계; 및
(c) 제1 및 제2 열 레벨을 상기 유체 반응 챔버에 인가하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 형광 모이어티를 포함하는, 유체 반응 챔버.
- 제1항에 있어서, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드가 형광 켄처를 포함하는, 유체 반응 챔버.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열 각각이 동일한, 유체 반응 챔버.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 DNA 서열 각각이 동일하지 않은, 유체 반응 챔버.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 및/또는 제3 올리고뉴클레오티드 각각이 5개 내지 120개 뉴클레오티드의 길이를 갖는, 유체 반응 챔버.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 반응 챔버는 균일한 온도에 있지 않으며, 반응 챔버의 가장 따뜻한 영역은 반응 챔버의 가장 차가운 영역보다 적어도 10℃ 더 높은, 유체 반응 챔버.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유체 반응 챔버 내에 배치된 유체를 추가로 포함하며, 상기 유체 용액은 DNA 폴리머라제, dNTP, 및 PCR 완충액을 포함하는, 유체 반응 챔버.
- 제4항에 있어서, 상기 표적 핵산의 증폭을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 유체 반응 챔버가 상기 유체 반응 챔버 내에 배치된 유체를 추가로 포함하되, 상기 유체 용액이 DNA 폴리머라제, dNTP, 및 PCR 완충액을 포함하는, 방법.
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