KR100647289B1 - 마랑고니 대류를 이용한 ｐｃｒ 장치 및 이를 이용한ｐｃｒ 방법 - Google Patents

마랑고니 대류를 이용한 ｐｃｒ 장치 및 이를 이용한ｐｃｒ 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마랑고니 대류를 이용한 PCR 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 서로 대향하는 고온측벽과 저온측벽으로 이루어진 반응 챔버를 포함하는 PCR 장치에 관한 것이다.
기존 PCR 방식은 DNA 버퍼액이 담긴 챔버를 주기적으로 가열, 냉각하여 DNA 증폭하는 방식으로 온도 제어가 힘들고, 전력 소비가 많으며, 증폭 시간이 오래걸리는 단점이 있었으나, 본 발명에 따른 마랑고니 대류를 이용한 PCR 증폭기는 챔버의 양 벽의 온도가 일정하게 유지시키기만 하면 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면장력 유동에 의해 자동적으로 PCR 증폭이 이루어져 전력소비 절감, 온도제어 회로 간단화, 증폭 시간 단축의 효과가 있다.

Description

마랑고니 대류를 이용한 ＰＣＲ 장치 및 이를 이용한 ＰＣＲ 방법{PCR device using Marangoni convection and method using the device}
도 1은 종래의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 장치로서, 챔버 내에 PCR 유체 또는 생화학 유체를 가두어 놓고 온도를 제어(T1 ~ 94℃, T2 ~ 55℃, T3 ~ 72℃) 하여 PCR 반응을 일으키는 구조를 나타내는 도면이고,
도 2는 종래의 PCR 장치로서, 서로 다른 온도 구간이 있어서 PCR 유체 또는 생화학 유체를 지그재그 방향으로 연속적으로 흘려 보내어(continuous flow) PCR 반응을 일으키는 구조를 나타내는 도면이고,
도 3은 종래의 PCR 장치로서, 서로 다른 온도 구간이 있어서 PCR 유체 또는 생화학 유체를 동심원 방향으로 연속적으로 흘려 보내어(continuous flow) PCR 반응을 일으키는 구조를 나타내는 도면이고,
도 4은 종래의 PCR 장치로서, 밀폐된(closed or sealed) 용기에서 수직으로 배향된 고온플레이트와 저온플레이트 사이의 부력유동을 이용하여 PCR 반응을 일으키는 구조(Rayleigh-Benard Convection Cell)를 나타내는 도면이고,
도 5은 종래의 PCR 장치로서, 밀폐된(closed or sealed) 타원형 채널에서 고온 구간과 저온구간사이의 사이폰식 대류(convective siphon)를 이용하여 PCR 반응을 일으키는 구조를 나타내는 도면이고,
도 6은 본 발명의 마랑고니 대류를 이용한 PCR 장치의 개략도이다.
도 7은 계면에서의 표면장력구배에 의한 열모세관 유동 발생 원리도이다
도 8은 본 발명에서 수행되는 PCR 반응의 단계를 시간-온도 곡선으로 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 PCR 장치의 2차원 해석 결과를 나타낸 속도 및 온도 분포 단면도이다.
도 10은 본 발명의 PCR 장치의 3차원 해석 결과를 나타낸 속도 및 온도 분포 단면도이다.
도 11은 본 발명의 잉크젯 스파터의 바람직한 일례를 도시한 것이다.
본 발명은 마랑고니 대류를 이용한 PCR 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 서로 대향하는 고온측벽과 저온측벽으로 이루어진 개방된 반응 챔버를 포함하는 가열, 냉각 사이클링 제어가 필요 없는 신 방식 PCR 장치에 관한 것이다.
PCR (Polymerase Chain Reaction) 은 주기적인 가열/냉각 방법에 의하여 DNA 분자의 한 조각을 연쇄적으로 복제시켜 그 양을 기하급수적으로 증폭시키는 반응 기술이다. PCR 에서 1 사이클(cycle)의 복제반응을 수행하기 위해서는 반응물의 온도를 T1 (변성: denaturing) → T2 (어닐링: annealing) → T3 (연장: extension) 로 변화시켜야 한다.
종래의 PCR 장치의 경우, 도 1과 같이 챔버 내에 PCR 유체　또는 생화학 유체를 가두어 놓고 온도를 정확히 제어하여 변성 (94℃) → 어닐링 (55℃) → 연장 (72℃) 를 반복하도록 하여 PCR 반응을 일으키는 구조였다. 이러한 장치는 구조가 복잡하지 않으며, 히터(heater)를 정확히 제어하면 되는 장점이 있으나, 생화학 유체를 둘러싸고 있는 동일한 챔버나 튜브에 대해 가열과 냉각을 반복하여야 하기 때문에 어쩔 수 없이 가열과 냉각시간이 지연되며, 아주 정확한 온도 제어를 위하여 복잡한 회로를 필요로 하는 단점이 있었다.
다른 종래의 PCR 장치의 경우, 도 2와 같이 PCR 유체 또는 생화학 유체가 서로 다른 온도 구간을 지그재그형으로 연속적으로 흘러가게 하여(continuous flow) PCR 반응을 일으키는 구조였다 (USP 5,270,183). 이러한 시스템은 온도를 정확히 제어하는 회로가 필요 없는 장점이 있으나, T3 구간에서 T1 구간으로 이동시 T2 구간을 어쩔 수 없이 흐르게 되어 정확한 온도 프로파일을 따라가게 하기 위하여 아주 긴 채널이 필요하게 되는 문제점이 있었다.
또 다른 종래의 PCR 장치의 경우, 도 3과 같이 도 2의 채널 방향을 변형시켜 PCR 유체 또는 생화학 유체가 서로 다른 온도 구간을 동심원방향으로 연속적으로 흘러가게 하여(continuous flow) PCR 반응을 일으키는 구조였다 (Proc. Miniaturized Total Analysis Systems (uTAS 2001), Luisiana State University, Steven A. Soper et al., pp. 459 - 461）. 이러한 장치는 도 2와 마찬가지로 온도를 제어하는 회로가 필요 없는 장점이 있으나, 매 사이클(cycle)을 돌 때마다 유로(flow path) 가 짧아지는 경향이 있어 온도 프로파일을 따라가기 위하여는 흐름 (flow) 의 속도를 정확히 제어해야 하는 문제점이 있었다.
또 다른 종래의 PCR 장치의 경우, 도 4와 같이 밀폐된(closed or sealed) 용기에서 수직으로 배향된 고온플레이트와 저온플레이트 사이의 부력유동을 이용하여 PCR 반응을 일으키는 구조(Rayleigh-Benard Convection Cell)였다 (Krishnan et al., SCIENCE vol. 298 25 October 2002). 그러나, Lap-on-a chip 같이 마이크로 시스템 내에 형성될 초소형 PCR 반응기에는 이러한 부력유동을 활용한 PCR 반응을 일으키기는 어렵다. 왜냐하면 수 cm 이하, 나아가 수 mm 이하의 작은 길이에서는 체적력인 부력의 세기가 길이의 세제곱에 비례해 감소하여, 충분한 부력유동을 얻기 힘들기 때문이다. 따라서 초소형 PCR 시스템에서는 부력유동 대신 표면장력을 이용하는 것이 본 발명의 원리이다.
또 다른 종래의 PCR 장치의 경우, 도 5와 같이 밀폐된(closed or sealed) 타원형 채널에서 고온 구간과 저온구간사이의 사이폰식 대류(convective siphon)를 이용하여 PCR 반응을 일으키는 구조였다 (USP 6,586,233). 그러나, 이 역시 밀도 차에 의한 자연대류를 이용하는 원리여서, 초소형 PCR 시스템같이 반응기의 사이즈가 작아질수록 구동력이 사이즈의 세제곱에 비례해 감소하므로 충분한 자연대류를 얻기 힘든 단점이 있다.
이와 같이, 종래의 PCR 장치는 DNA 버퍼액이 담긴 챔버를 주기적으로 가열, 냉각하여 DNA 증폭하는 방식으로. 온도 제어가 힘들고, 전력 소비가 많으며, 증폭 시간이 오래걸리는 단점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 마랑고니 대류를 이용한 PCR 증폭기는 챔버의 양 벽의 온도가 일정하게 유지시키기만 하면 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면장력 유동에 의해 자동적으로 PCR 증폭이 이루어져서 전력소비 절감, 온도제어 회로 간단화, 증폭 시간 단축의 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 마랑고니 대류를 이용한 새로운 방식의 PCR 장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PCR 장치를 이용한 PCR 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PCR 장치의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PCR 장치를 포함하는 랩온어칩(Lab-on-a chip) 또는 잉크젯 스파터(Inkjet spotter)를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판(substrate); 상기 기판상에 세워진 고온 측벽(high temperature side wall); 상기 고온 측벽에 대향하여 기판상에 세워진 저온 측벽(low temperature side wall); 및 상기 기판, 고온 측벽과 저온 측벽으로 이루어지는 반응 챔버(reaction chamber)를 포함하고, 상기 반응 챔버에 담겨진 시료를 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면 장력 구배에 의한 마랑고니 대류(Marangoni convection)를 이용하여 고온 측벽과 저온 측벽 사이를 반복적으로 열순환 이동시키는 것을 특징으로 하는 PCR (polymerase chain reaction) 장치를 제공한다.
PCR(Polymerase chain reaction)이란 특정 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 합성효소에 의한 DNA 합성반응을 시험관내에서 반복하여, 특정 DNA 영역을 수십만배로 증폭하는 방법을 말한다. 일반적으로 PCR 공정의 한 사이클은 이중가닥 DNA를 단일가닥으로 분리(denaturation)하는 단계, 분리된 단일가닥 DNA에 표적 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머를 어닐링(annealing)시키는 단계, 프라이머를 연장하여 표적영역에 상보적인 서열을 합성(extension)하는 단계로 이루어진다
PCR 방법에서, 이중가닥 분리는 고온(heating)(90℃ 이상)에서 이루어지고, 프라이머 결합(50~60℃) 및 DNA 합성(70~75℃)은 상대적으로 저온(cooling)에서 이루어지므로, PCR공정을 연속적으로 수행하기 위해서는 일반적으로 열 순환기(thermal cycler)가 필요하다.
본 발명의 장치에 있어서, 마랑고니 대류(Marangoni convection)는 반응용액이 공기층과 맞닿는 계면에 온도 차이를 가하면 표면장력 구배에 의해 더운 곳에서 찬 곳으로 유동이 발생하는 것으로, 반응 용액내 온도차이에 의한 밀도구배에 의해 더운곳에서 찬곳으로 부력유동이 발생하는 레일레이-베나드 대류(Rayleigh-Benard Convection)와 구별된다.
본 발명은 마랑고니 대류(Marangoni convection) 원리를 PCR 증폭에 이용한 최초의 발명으로서, 본 발명은 계면(자유표면)이 존재하는 용기에서 표면장력 유동을 이용하는 PCR 증폭 장치이다. 따라서, 본 발명의 반응 챔버(reaction chamber) 는 공기층을 갖지 않는 밀폐형이 아닌 반응액과 공기층의 경계면인 계면을 갖는 개방형 반응 챔버(open reaction chamber)이다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 반응 챔버는 공기층과의 계면을 형성할 수 있는 한 반응 챔버를 뚜겅(cover)을 더 포함할 수 있다. 상기 뚜껑은 기판이나 측벽과 일체형일 수 있다.
본 발명의 장치에 있어서, 고온 측벽은 측벽 주변의 반응용액이 DNA 변성(denaturation)을 위한 온도가 되도록 설정되면 되고, 바람직하게는 히터(heater)에 의해 92 ~ 97℃의 온도, 더 바람직하게는 95℃로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 히터는 고온 측벽의 온도를 높이기 위한 어떤 히터도 가능하나, 바람직하게는 박막 저항성 히터(thin film resistive heater), 열교환기를 이용한 가열, 복사에 의한 가열, 뜨거운 공기를 불어주는 강제 가열 등 다양한 가열 방식이 적용가능하다. 더욱 바람직하게는, 상기 히터는 백금 박막 히터, 폴리실리콘 박막 히터, 및 TaAl 박막 히터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 히터는 측벽의 내부 또는 외부에 장착될 수 있으며, 온도 조절을 위한 센서와 함께 장착될 수 있다.
본 발명의 장치에 있어서, 저온 측벽은 측벽 주변의 반응용액이 어닐링(annealing)을 위한 온도가 되도록 설정되면 되고, 바람직하게는 쿨러(cooler) 에 의해 44 ~ 56℃의 온도, 더 바람직하게는 50℃로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 쿨러는 저온 측벽의 온도를 낮추기 위한 냉각 팬, 열교환기 등과 같은 어떤 쿨러도 가능하나, 바람직하게는 펠티어 소자인 것을 특징으로 한다. 상기 쿨러는 측벽의 내부 또는 외부에 장착될 수 있으며, 온도 조절을 위한 센서와 함께 장착될 수 있다.
본 발명의 장치에 있어서, 고온 측벽 부근에서 샘플의 DNA 변성(denaturation)이 일어나고 마랑고니 대류(Marangoni convection)에 의해 반응 용액 상층이 저온 측벽 부근으로 빠르게 이동하여 어닐링(annealing)이 일어나고, 반응 용액 하층이 저온측벽에서 고온 측벽으로 서서히 이동하면서 연장(extension: synthesis of new DNA strands) 반응이 일어난다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 고온 측벽과 저온 측벽사이의 폭이 2mm - 3 cm인 것을 특징으로 한다. 종래 부력유동을 이용한 PCR 장치의 경우 부력은 부피(L3)에 비례하여 크기가 작아질 수록 추진력(driving force)이 훨씬 작아지나, 본 발명의 장치는 면적(L2)에 비례하는 표면장력을 이용하여 크기가 작아지더라도 충분한 추진력(driving force)이 존재하게 된다. 따라서, 본 발명의 PCR 장치는 초소형 DNA 검출장치인 DNA chip 또는 Lap-on-a chip 등에 사용될 수 있다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 반응 챔버는 유리, 석영, 실리콘, 플라스틱, 폴리머, 세라믹 또는 금속으로 만들어진 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 반도체 제조공정으로 잘 알려진 광석판인쇄술(photolithography)을 이용하여 실리콘 웨이퍼에 식각(eching)으로 반응 챔버를 만드는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 장치에 있어서, 상기 반응 챔버는 하나의 광학적 검출 창(optical detection window)을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 광학적 검출 창을 통하여 종래의 PCR 검출 방법을 이용하여 PCR 반응을 실시간(real-time)으로 광학적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 PCR 장치의 반응챔버에 시료를 투입하는 단계, 상기 고온 측벽과 저온 측벽에 각각 일정한 온도를 유지시키는 단계, 및 상기 반응 챔버에 담겨진 시료를 마랑고니 대류(Marangoni convection)를 이용하여 고온 측벽과 저온 측벽 사이를 반복적으로 열순환 이동시키는 단계를 포함하는 PCR (polymerase chain reaction) 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 시료는 PCR 반응에 통상적으로 사용되는 주형(template) DNA, 올리고뉴클레오티드 프라이머(primers), 4종류의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 열안정성(thermostable) DNA 폴리머라제, 및 반응버퍼를 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 고온 측벽과 저온측벽은 샘플의 DNA 변성(denaturation)과 어닐링(annealing)에 필요한 온도로 설정되며, 바람직하게는 고온 측벽은 92 ~ 97℃의 온도로, 저온 측벽은 48 ~ 54℃의 온도로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 있어서, 시료는 형광물질을 포함하여 핵산의 증폭량을 실시간(real-time)으로 검출하는 것을 특징으로 한다. 증폭용 시료는 플라스미드 DNA를 사용하며, 출발시료에 프라이머, dNDP, 염, DNA중합효소가 들어있는 완충액을 첨가하여 구동액 만든다. 마랑고니 PCR 반응을 이용해 증폭된 DNA형광을 검출하면 뚜렷한 증폭 DNA의 밴드가 나타나게된다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포토리소그래피 공정을 포함하는 PCR 장치 제조 방법을 제공한다. 제 1 기판을 포토리소그래피 공정을 통하여 상면에 유로와 PCR 챔버의 패턴을 형성한다. 제 1 기판의 경우는 실리콘, 유리 및 폴리카보네이트, 폴리다이메칠실록산, 폴리메칠메타아크릴레이트 등을 이용한다. 습식식각 혹은 반응성이온에칭(RIE)와 같은 건식식각 방법을 이용하여 원하는 두께만큼 기판을 에칭한다. 때에 따라서는 유로와 쳄버의 깊이를 달리 하기 위하여 포토공정과 에칭공정을 수 회 반복할 수 있다. PCR 챔버 의 DNA 반응액의 증발을 방지하기 위한 커버인 제 2 기판은 DNA 챔버 위 부분은 wetting을 방지하기 위한 소수성 처리를 한다. 제 1기판에 포토리소그래피 공정을 통하여 시료의 주입구와 출구 패턴를 형성한 다음 샌드블라스트를 이용하여 주입구와 출구를 가공한다. 제 2 기판에 임의의 전극구조가 요구되는 경우 포토공정을 이용하여 전극패턴을 형성 후 리프트오프방법을 이용하여 전극구조를 형성한다. 제 1 기판과 제 2 기판을 양극접합, 불소접합, 열접합, 폴리머필름접합과 같은 다양한 방법을 이용하여 접합한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판 위에 형성된 본 발명에 따른 PCR 장치 및 이와 유동적으로 연결된 전기영동(electrophoresis) 수행부를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 제공한다.
본 발명의 랩온어칩에서, 칩에 주입된 샘플은 PCR 증폭장치를 거치면서 DNA양이 증폭되며, 전기영동 수행부을 거치면서 그 분자량이나 전하량에 따라 DNA가 분리되어 최종적으로 표적 DNA를 검출할 수 있다.
본 발명의 랩온어칩에서, 상기 기판은 유리, 석영, 실리콘, 플라스틱, 폴리머, 세라믹 또는 금속인 것이 바람직하며, 상기 전기영동 수행부는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)을 수행하는 멀티채널인 것이 바람직하며, 상기 PCR 증폭장치와 전기영동 수행부는 기판상에 광석판인쇄술(photolithography)을 이용하여 만드는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기판 위에 형성된 본 발명에 따른 PCR 장치 및 이와 유동적으로 연결된 리스트릭터(restrictor), 토출 챔버, 토출 구동 요소 및 노즐을 포함하는 잉크젯 스팟터(Inkjet Spotter)를 제공한다
본 발명의 잉크젯 스포터는 PCR 장치를 제외하면 DNA 마이크로 어레이 제조에 사용되는 일반적인 잉크젯 스포터를 사용할 수 있으며, 사용가능한 토출 구동 요소는 Thermal (US4438191, HP), Piezo (US5748214, EPSON), 전기장 방식(US4752783, Fuji Xerox) 등 제한이 없다.
이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
도 6은 본 발명의 마랑고니 대류를 이용한 PCR 장치의 개략도이다. 본 발명의 PCR 장치는 기판(10); 상기 기판상에 세워진 고온 측벽(1); 상기 고온 측벽에 대향하여 기판상에 세워진 저온 측벽(2); 및 상기 기판, 고온 측벽과 저온 측벽으로 이루어지는 반응 챔버(3)를 포함하며, 상기 반응 챔버에 담겨진 시료는 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면 장력 구배에 의한 마랑고니 대류(Marangoni convection)에 의하여 고온 측벽과 저온 측벽 사이를 화살표 방향으로 반복적으로 열순환 이동된다. 즉, 높은 온도의 벽면과 낮은 온도의 벽면사이에 계면을 형성하면, 뜨거운 벽에서 차가운 벽쪽으로 마랑고니 유동이 발생하고, 이 유동에 의한 용액의 순환으로 자동적으로 PCR 증폭을 수행한다. 본 발명의 PCR 장치는 반응챔버를 덮는 뚜껑(20)을 더 포함할 수 있다.
마랑고니 유동은 계면에서 95도의 뜨거운 쪽에서 50도 정도의 차가운 쪽으로 일어난다. 94도의 뜨거운 벽면 주위에서 변성이 일어나고, 계면을 따라 이동하면서, 55도 정도의 차가운 벽 쪽에서 어닐링이 된다. 72도 정도로 유지되거나, 또는 단열상태인 용기 밑바닥을 지나면서 연장이 이루어지게 된다. 이러한 열 사이클링이 한번 순환되는데 걸리는 전체 시간은 최소 5초 정도이하로도 줄일 수 있다. 하지만 지나치게 짧은 순환 주기에서는 충분한 DNA 증폭이 이루어지기 힘들 기 때문에 5초 이상 30초 정도의 순환 주기가 적당하다. 이러한 순환 주기는 반응기의 크기와 계면 활성제 또는 전기장을 이용해 반응액의 표면장력을 조절함으로써 변경가능하다.
도 7은 계면에서의 표면장력구배에 의한 열모세관 유동 발생 원리도이다. 마랑고니 대류(Marangoni convection)는 표면장력 s가 온도의 함수인 것을 이용한다. 반응용액이 공기층과 맞닿는 계면을 따라 온도 차이를 가하면 뜨거운 곳에서는 표면장력이 감소하고, 차가운 곳에서는 표면장력이 증가하기 때문에, 표면장력 구배에 의해 더운 곳에서 찬 곳으로 유동이 발생하는 원리를 보여주고 있다. 이 마랑 고니 표면장력 유동에 의해, 용기내부에서 순환하는 유동이 발생한다.
도 8은 본 발명에서 수행되는 PCR 반응의 단계를 시간-온도 곡선으로 나타낸 그래프이며 해석 결과로부터 도출한 것이다. 즉 반응기를 순환하는 DNA 용액의 시간에 따른 온도 변화이다. 본 발명의 PCR 장치에서, 고온 측벽(1) 부근에서 샘플이 약 94℃로 유지되어 DNA 변성(denaturation)이 일어나고 마랑고니 대류(Marangoni convection)에 의해 반응 용액 상층이 저온 측벽(2) 부근으로 빠르게 이동하여 온도가 약 55℃로 떨어지면서 어닐링(annealing)이 일어나고, 반응 용액 하층이 저온측벽에서 고온 측벽으로 서서히 이동하면서 약 72℃ 정도에서 연장(extension) 반응이 일어난다. 이러한 PCR 반응의 한 온도 순환 사이클이 돌아가는데 걸리는 시간은 약 8초에 불과하다.
본 발명의 PCR 장치의 제조방법은 다음과 같다.
우선 제 1 기판을 포토리소그래피 공정을 통하여 상면에 유로와 PCR 챔버의 패턴을 형성한다. 제 1 기판의 경우는 실리콘, 유리 및 폴리카보네이트, 폴리다이메칠실록산, 폴리메칠메타아크릴레이트 등을 이용한다. 습식식각 혹은 반응성이온에칭(RIE)와 같은 건식식각 방법을 이용하여 원하는 두께만큼 기판을 에칭한다. 때에 따라서는 유로와 쳄버의 깊이를 달리 하기 위하여 포토공정과 에칭공정을 수 회 반복할 수 있다. 최종 에칭공정 후에 실리콘 기판의 경우는 습식산화법을 이용하여 DNA 흡착 방지막과 전기절연막 겸용으로 이용되는 수 백 nm 정도의 실리콘 산화막을 증착한다. 포토리소그래피 공정을 이용하여 제 1 기판 하면에 전극패턴을 형성한 다음 박막 히터로 쓰일 백금, TaAl, 폴리실리콘과 같은 박막을 입힌 후 리 프트오프 방식으로 최종 전극을 구현한다. PCR 챔버 의 DNA 반응액의 증발을 방지하기 위한 커버인 제 2 기판은 DNA 챔버 위 부분은 wetting을 방지하기 위한 소수성 처리를 한다. 제 1기판에 포토리소그래피 공정을 통하여 시료의 주입구와 출구 패턴를 형성한 다음 샌드블라스트를 이용하여 주입구와 출구를 가공한다. 제 2 기판에 임의의 전극구조가 요구되는 경우 포토공정을 이용하여 전극패턴을 형성 후 리프트오프방법을 이용하여 전극구조를 형성한다. 제 1 기판과 제 2 기판을 양극접합, 불소접합, 열접합, 폴리머필름접합과 같은 다양한 방법을 이용하여 접합한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시 예 1: 2차원 해석
표면 유동의 상용 전문 수치해석 툴인 FLOW3D (www.flow3d.com)울 사용하여 마랑고니 PCR 챕버내의 열-유동장을 해석하였다. Flow3D는 표면이 존재하는 열-유동 해석 툴로서, 지난 20년간 전세계에서 신뢰성을 검증 받은 상용 툴이어서 선택하였다. 앵쪽 측벽의 온도는 각각 95도 및 50도로 유지되도록 제어된다고 가정하였다. 버퍼액의 열전도도는 0.656 W/m K, 비열은 4187 J/kg K, 표면장력은 72 dyne/cm , 접촉각은 소수성 처리를 가정하여 90도로 정하였다. 온도에 따른 표면장력 계수는 버퍼 액인 물에 해당하는 0.16 dyne/cm K 이다.
도 9는 폭 4mm 크기의 2차원 용기에서의 마랑고니 유동 해석 결과를 예시하 고 있다. x, z 방향으로 각각 40, 30 개의 격자계에서 얻은 결과이다. 이 경우는 반응기의 폭에 비해 길이가 아주 길어, 벽의 영향을 무시할 수 있는 경우에 해당한다. 온도 구배는 폭 방향으로만 존재한다. 계면에서의 최고 속도는 약 4-5cm/s이며, 약 8초 정도에 뜨거운 벽에서 출발한 용액이 다시 돌아오므로, 8초의 짧은 시간에 PCR 1회 증폭 가능하다. 도 8은 PCR 각 단계에서의 온도와 시간 프로파일을 보여주고 있다. 약 1초 정도의 변성, 약 2초 정도의 어닐링, 약 2초 정도의 연장 단계가 있으며, 각 단계 단계마다 과도기적인 구간이 존재하면, 이 모두를 포함하면 약 8초 정도에 한 사이클의 PCR 증폭이 이루어진다.
실시 예 2 : 3차원 해석
표면 유동의 상용 전문 수치해석 툴인 FLOW3D (www.flow3d.com)울 사용하여 마랑고니 PCR 챕버내의 열-유동장을 해석하였다. x,y,z 방향으로 25x25x20 개의 격자계에서 해석을 수행하였다. 2차원 계산과 동일한 경계조건, 물성치를 사용하였다.
도 10는 폭 4mm 크기의 2차원 용기에서의 마랑고니 유동 해석 결과를 예시하고 있다. 실제 PCR 반응기는 길이와 폭이 비슷하기 때문에 때문에, 폭 4mm, 길이 4 mm 높이 2mm 크기의 직육면체 3차원 용기에서의 마랑고니 유동 해석결과를 예시하고 있다. 온도 구배는 폭 방향으로만 존재하고, 길이 방향의 양 벽면은 단열 조건이다. 3차원 구조물 해석에도 2차원 유동과 큰 차이 없이 최고 계면 속도 4-5 cm/s의 마랑고니 유동을 확인하였다. 약 8-10초 정도의 시간에 PCR 1회 증폭 가능. 30회 수행에 약 4-5 분밖에 소요되지 않는다. 기존 주기적 온도 제어 방식은 냉각시간만 15초 이상 소요로 30회 수행에 30분 이상 시간이 걸리는 단점을 획기적으로 개선시킬 수 있다.
실시예 3: 마랑고니 PCR DNA 증폭기능을 갖는 Inkjet Spotter
본 발명의 마랑고니 PCR 장치를 장착한 잉크젯 스파터를 제조한다. 도 11은본 발명의 잉크젯 스파터의 바람직한 일례(thermal 방식)를 도시한 것이다. 본 발명의 잉크젯 스파터는 크게 일반적인 스팟터(200)과 마랑고니 PCR 장치(100)를 포함하며, 구체적으로 기판(210)위에 세워진 고온측벽(1)과 저온측벽(2)으로 구성된 마랑고니 PCR 장치(100)와 이와 마이크로 채널(230)로 연결된 스팟터(200)로 구성된다. 상기 스팟터(200)는 복수의 토출 챔버로 DNA 용액을 공급하는 Manifold(252), 토출 챔버로 연결되는 입구 역할을 하는 Restictor(253), 토출 직전 DNA 용액이 저장되는 토출 챔버(254), 토출 구동역할을 하는 박막 Heater(251), 증폭된 DNA 반응액이 토출되는 Nozzle(250)로 구성된다. 본 발명의 잉크젯 스포터는 마랑고니 대류를 이용해 PCR 증폭된 DNA 용액을 잉크젯 스포터를 이용해 원하는 양 만큼, 원하는 위치에 스포팅 할 수 있다. 본 발명의 잉크젯 스포터의 토출 구동방식은 Thermal, Piezo, 전기장 방식 등 제한이 없다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 기존 PCR 방식은 DNA 버퍼액이 담긴 챔버를 주기적으로 가열, 냉각하여 DNA 증폭하는 방식으로 온도 제어가 힘들고, 전력 소비가 많으며, 증폭 시간이 오래걸리는 단점이 있었으나, 본 발명의 마랑고니 대류를 이용한 PCR 증폭기는 챔버의 양 벽의 온도가 일정하게 유지시키기만 하면 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면장력 유동에 의해 자동적으로 PCR 증폭이 이루어져 전력소비 절감, 온도제어 회로 간단화, 증폭 시간 단축의 효과가 있다.

Claims (15)

  1. 기판(substrate);
    상기 기판상에 세워진 고온 측벽(high temperature side wall);
    상기 고온 측벽에 대향하여 기판상에 세워진 저온 측벽(low temperature side wall); 및
    상기 기판, 고온 측벽과 저온 측벽으로 이루어지는 반응 챔버(reaction chamber)를 포함하고,
    상기 반응 챔버에 담겨진 시료를 계면의 온도 차이에 의해 발생하는 표면 장력 구배에 의한 마랑고니 대류(Marangoni convection)를 이용하여 고온 측벽과 저온 측벽 사이를 반복적으로 열순환 이동시키는 것을 특징으로 하는 PCR (polymerase chain reaction) 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 반응 챔버를 덮는 뚜겅(cover)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 고온 측벽은 히터(heater)에 의해 92 ~ 97℃의 온도로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 히터는 백금 박막 히터, 폴리실리콘 박막 히터, 및 TaAl 박막 히터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  5. 제 1항에 있어서, 저온 측벽은 쿨러(cooler)에 의해 44 ~ 56℃의 온도로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 쿨러는 냉가팬, 열교환기, 펠티에 소자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 고온 측벽과 저온측벽사이의 폭이 2mm ~ 3 cm 인 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 반응 챔버는 유리, 석영, 실리콘, 플라스틱, 폴리머, 세라믹 또는 금속으로 만들어진 것을 특징으로 하는 PCR 장치
  9. 제 1항에 있어서, 상기 반응 챔버는 하나의 광학적 검출 창(optical detection window)을 가지는 것을 특징으로 하는 PCR 장치.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 따른 PCR 장치의 반응챔버에 시료를 투입하는 단계, 상기 고온 측벽과 저온 측벽에 각각 일정한 온도를 유지시키는 단계, 및 상기 반응 챔버에 담겨진 시료를 마랑고니 대류(Marangoni convection)를 이용하여 고온 측벽과 저온 측벽 사이를 반복적으로 열순환 이동시키는 단계를 포함하는 PCR (polymerase chain reaction) 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 고온 측벽은 92 ~ 97℃의 온도로, 저온 측벽은 48 ~ 54℃의 온도로 일정하게 유지되는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 시료는 형광물질을 포함하여 핵산의 증폭량을 실시간(real-time)으로 검출하는 것을 특징으로 하는 PCR 방법.
  13. 삭제
  14. 기판 위에 형성된 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 따른 PCR 장치 및 이와 유동적으로 연결된 전기영동(electrophoresis) 수행부를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip).
  15. 기판 위에 형성된 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 따른 PCR 장치 및 이와 유동적으로 연결된 리스트릭터(restrictor), 토출 챔버, 토출 구동 요소 및 노즐을 포함하는 잉크젯 스팟터(Inkjet Spotter).
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