KR20210060500A

KR20210060500A - 대류 가열 및 무-라벨 마이크로어레이를 사용하여 dna의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20210060500A
Application number: KR1020217009737A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 유 장; 드미트리 에이. 코다코프; 슈멩 장
Original assignee: 윌리엄 마쉬 라이스 유니버시티
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2019-09-13
Publication date: 2021-05-26
Also published as: US20220048033A1; EP3849707A1; WO2020056292A1; EP3849707A4; AU2023255013A1; JP2021536015A; AU2019338531A1; CA3112327A1; CN112996601A; CN112996601B

Abstract

본 개시는 샘플에서 핵산 표적의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치 및 방법을 기재한다. 본 개시 내용의 실시예는 칩의 로딩, 수직 위치결정 및 클램핑을 제공하도록 구성된 기계 시스템; 칩의 고유한 온도를 유지하도록 구성된 열 제어 시스템 및 광학 형광 이미징 시스템을 포함한다.

Description

대류 가열 및 무-라벨 마이크로어레이를 사용하여 DNA의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치 및 방법

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2018년 9월 14일에 출원된 미국 가 특허 출원 번호 제62/731,495호를 우선권 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.

본 발명은 국립 보건원과 국립 암 연구소가 수여하는 Grant No. R01 CA203964에 따라 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 가지고 있다.

본 개시는 대류 가열 및 무-라벨 마이크로어레이를 사용하여 DNA의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

정부 기관, 병원 및 의사 사무실, 민간 소비자로부터의 신속하고 다중 DNA 진단에 대한 시장 수요가 높다. 현재 상용 qPCR 시스템은 크고 고가이며, 당해 4-6개의 DNA 마커(4-6plex)의 동시 검출에 추가로 제한된다. 단일 DNA 샘플의 폐쇄 튜브 20-플렉스 분석을 허용하는 상용 qPCR 시스템의 두 가지 예는 Luminex xTag 및 Biofire FilmArray이다. 두 시스템 모두는 부피가 크고(> 20kg) 비싼(> $ 50,000)기구가 필요하며 현장 진료 응용에는 적합하지 않다. Alere i Influenza 분석과 같은 등온 DNA 증폭 방법은 크거나 복잡한 기구가 필요하지 않지만 3-플렉스로 제한된다. 최종적으로 차세대 시퀀싱(NGS)은 DNA에 대한 매우 높은 다중 분석이 허용하지만 노동 집약적인 라이브러리 준비 워크플로우(12 시간 이상)와 긴 시퀀싱 실행(24 시간 이상)을 필요로 한다. 이러한 노동력과 시간 집약적 특성으로 인해 현장 진료 응용에 대해서는 NGS가 실용적이지 않다. 증폭 능력 및 기구 경제성/휴대성에 기초한 상이한 플랫폼의 비교가 도 1에 도시된다. 본 발명과 관련된 실시예(아래에서 더 자세히 논의되는 "도넛 PCR" 플랫폼으로 설명됨)는 저렴하고 휴대 가능한 기구로 고도로 증폭된 DNA 테스트를 고유하게 허용한다.

국제 특허 출원 번호 PCT/US2017/02453호 및 PCT 특허 공보 WO 2017/172760호('760 공보)는 현장 진료 환경에서 고도로 증폭된 DNA 분석을 가능하게 하는 출원 중인 출원의 발명자들에 의해 개발된 시스템 및 방법을 개시한다. '760 공보에 개시된 시스템은 실시예의 원형 특성과 관련하여 "도넛 PCR 시스템"(또는 유사한 용어)으로 본원에서 지칭될 것이다. '760 공보는 도넛 PCR 소모가능 칩, 유체 반응 챔버의 내부 표면에 프로브를 공유 결합하는 방법, 증폭 프라이머를 포함하는 PCR 시약 및 검출 프로브 설계를 개시한다. '760 공보에서 PCR 증폭, 마이크로어레이 형광 이미징, 이미지 분석 및 데이터 해석을 수행하기 위해 여러 가지 상이한 기구가 사용된다. 또한 분석을 실행하려면 수 많은 수동 개입 단계가 필요했다. 여기에서는 모든 기계적, 열적, 광학적 및 사용자 인터페이스 구성요소를 통합하는 단일 통합 기구가 공개되어 DNA 샘플-인 응답 플랫폼이 가능하다.

도넛 PCR 시스템의 고도로 증폭되고 휴대성이 뛰어난 속성이 충족되지 않은 요구 사항을 고유하게 채우는 적어도 3개의 응용 영역: (1) 전염병의 가정 및 약국 기반 검출 및 하위 유형 지정, (2) 병원에서 획득 한 감염의 병원 병상 분석, (3) 현장 기반 농업 및 수의사 유전 프로파일링 및 질병 검출 응용이 있다.

전술된 바와 같이, '760 공보는 도넛 PCR 분석 및 소모가능 칩을 개시한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "칩"은 '760 공보에 기재된 바와 같이 대류 유동 유체 장치를 포함한다. 기구의 일부 필수 구성요소가 기재되어 있지만 '760 공보는 칩의 초기 로딩 이후에 수동 개입이 필요하지 않은 완전히 통합된 도넛 PCR기구를 기재하지 않는다. 특히, 우수한 열 접촉을 형성하기 위해 도넛 PCR 칩을 로딩하고 칩을 히터에 자동으로 클램핑하는데 필요한 기계적 구성요소에 대해서는 기재하지 않는다. 추가로 '760 공보는 형광 현미경 사용에 대해 기재하고 독립형 판독 장치에 필요한 광학 구성요소(필터, 렌즈, 거울)에 대해서는 기재하지 않는다. 결과적으로, 본 발명은 '760 공보에 비해 신규하고 진보성이 있다.

어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 바이오-라드 레이보레토리스(Bio-Rad Laboratories), 키아젠(Qiagen), 셉헤이드(Cepheid) 및 로쉐(Roche)와 같은 회사에서 다수의 PCR(qPCR) 기구가 발명하고 상용화되었다. 이러한 qPCR 기구는 모두 능동 냉각 메커니즘을 포함하며 전력 집약적이다. 추가로 이러한 qPCR 기구 중 어느 것도 높은 플렉스 판독을 달성하는 데 필요한 형광 스팟의 이미지 획득을 위해 픽셀 해상도가 100μm 미만인 카메라를 사용하지 않는다. 결과적으로, 본 발명은 과거의 qPCR기구에 비해 신규하고 진보성이 있다.

대류 PCR은 2002년 학술 문헌에 보고되었으며 상이한 온도에서 2개의 히터를 사용한다. 그러나 보고된 대류 PCR 기구는 고 플렉스 DNA 분석을 위해 마이크로어레이를 통합하지 않고 고 플렉스 판독을 달성하기 위해 필요한 형광 스팟의 이미지 획득을 위해 픽셀 해상도가 100 μm 미만인 카메라를 사용하는 보고된 대류 PCR 기구가 없다. 결과적으로, 본 발명은 과거의 대류 PCR 기구에 비해 신규하고 진보성이 있다.

마이크로어레이는 특정 프로브의 공간 분리를 사용하여 DNA 분석을 위한 고 플렉스 판독을 달성한다. 그러나 상업용 마이크로어레이는 활성 유체소자(예를 들어, 펌프) 및/또는 수동 세척을 사용하여 결합되지 않은 라벨링된 시약 또는 앰플리콘을 제거하여 개방형 시스템이 오염되기 쉽다. 대조적으로, 본 발명에서 도넛 PCR 칩에 내장된 마이크로어레이가 수직으로 장착되고 2개의 개별 히터를 사용하여 95℃ 및 60℃까지 차등 가열된다. 결과적으로, 본 발명은 과거의 마이크로어레이 기술에 비해 신규하고 진보성이 있다.

간략하게, 본 개시는 생물학적 샘플에서 핵산 표적의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치 및 방법을 제공한다. 본 개시 내용의 실시예는 칩의 로딩, 수직 위치결정 및 클램핑을 제공하도록 구성된 기계 시스템; 칩의 고유한 온도를 유지하도록 구성된 열 제어 시스템 및 광학 형광 이미징 시스템을 포함한다.

특정 실시예는 샘플에서 핵산 표적의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치를 포함하고, 상기 장치는 칩의 로딩, 수직 위치결정 및 클램핑을 제공하도록 구성된 기계 시스템; 칩의 제1 온도 및 칩의 제2 온도를 유지하도록 구성된 열 제어 시스템 - 제1 온도는 제2 온도와 구별됨 - ; 적어도 40 픽셀 x 40 픽셀의 어레이에서 공간 정보를 수집하도록 구성된 광학 형광 이미징 시스템; 기계 시스템, 열 제어 시스템 및 광학 형광 이미징 시스템에 전기 에너지를 제공하도록 구성된 전력 시스템; 기계 시스템, 열 제어 시스템, 전력 시스템 및 광학 이미징 시스템의 작동을 제어하도록 구성된 제어기; 및 사용자가 사용자 인터페이스 소프트웨어를 통해 제어 시스템을 작동할 수 있도록 구성된 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함한다.

특정 실시예에서, 칩은 10 mm 내지 320 mm의 높이, 10 mm 내지 320 mm의 폭 및 0.5 mm 내지 10 mm의 두께를 갖는다. 일부 실시예에서, GUI는 터치 스크린 인터페이스이다. 특정 실시예에서, 터치 스크린 인터페이스는 스마트폰 내에 통합된다. 특정 실시예에서, 기계 시스템은 칩 홀더, 프레임, 슬라이딩 구성요소 및 지지 구성요소를 포함한다. 특정 실시예에서, 칩 홀더는 삽입 슬롯, 위치결정 슬롯 및 동작 제어 세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 프레임은 기저, 주 구조 캐리어, 프레스 바 로케이터, 프레스 바 및 동작 제어 세트를 포함한다. 특정 실시예에서, 동작 제어 세트는 전동식 이동 구성요소 및 이의 홀더를 포함한다.

특정 실시예에서, 전동식 이동 구성요소는 선형 액추에이터 또는 스텝 모터를 포함한다. 특정 실시예에서, 슬라이딩 구성요소는 슬라이딩 플랫폼 및 슬라이딩 바를 포함한다. 일부 실시예에서, 지지 구성요소는 레일 스탠드를 포함한다. 특정 실시예에서, 열 제어 시스템은 복수의 온도 센서, 복수의 히트 블록 및 열원을 포함한다. 특정 실시예에서, 복수의 온도 센서는 저항 온도 감지기(RTD), 서미스터, 열전대 또는 IR 센서를 포함한다. 특정 실시예에서, 복수의 온도 센서들 중 온도 센서는 히트 블록 내로 내장된다. 일부 실시예에서, 복수의 온도 센서들 중 온도 센서는 복수의 히트 블록들 중 히트 블록의 표면에 결합된다. 특정 실시예에서, 복수의 히트 블록은 알루미늄, 스테인리스 스틸 또는 황동을 포함한다.

특정 실시예에서, 복수의 히트 블록은 챔버의 총 표면적의 50% 이상과 집합적으로 접촉한다. 특정 실시예에서, 열원은 접착 가요성 히터, 히트 프로브 또는 가열 와이어를 포함한다. 일부 실시예에서, 형광 이미징 시스템은 광원, 광학 모듈 및 적어도 40 x 40 픽셀의 검출기를 포함한다. 특정 실시예에서, 검출기는 카메라이다. 특정 실시예에서, 카메라는 과학용 카메라 또는 스마트폰 카메라를 포함한다. 특정 실시예에서, 광원은 아크 램프, 증기 램프, 발광 다이오드(LED) 또는 레이저를 포함한다. 일부 실시예에서, 광학 모듈은 여기 필터, 색선별 미러, 빔 스플리터, 방출 필터, 평면 미러, 대물 렌즈 및/또는 광학 렌즈를 포함한다. 특정 실시예에서, 기계 시스템은 하나 이상의 플라스틱을 포함한다. 특정 실시예에서, 기계 시스템은 폴리락트산(PLA), 폴리카보네이트 (PC), 아세토니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 또는 세라믹을 포함한다. 특정 실시예에서, 전력 시스템은 AC/DC 전원, MOSFET, 스위치, 증폭기, 다이오드, 트랜지스터 및 저항을 포함한다. 일부 실시예에서, 제어기는 마이크로제어기 및/또는 PID 제어기를 포함한다. 특정 실시예에서, 마이크로제어기는 라즈베리(Raspberry) Pi, 아르두이노(Arduino), 또는 게누이노(Genuino)를 포함한다.

특정 실시예는 본원에 기재된 바와 같이 장치(에를 들어, 청구항 제1항의 장치를 포함함)를 사용하여 칩 내에 샘플을 분석하는 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, 방법은 장치 내에 칩을 로딩하는 단계; 제1 히트 블록과 제2 히트 블록 사이에 칩을 클램핑하기 위해 기계 시스템을 작동시키는 단계; 제1 히트 블록을 제1 온도로 가열하는 단계; 제2 히트 블록을 제2 온도로 가열하는 단계 - 제2 온도는 제1 온도와 별개임 - ; 광원으로부터의 여기 광을 칩의 표면으로 지향시키는 단계; 칩으로부터 방출된 광을 검출하는 단계; 및 칩으로부터 방출된 광을 분석하는 단계를 포함한다.

일부 실시예는 칩으로부터 방출된 광의 분석을 문서화하기 위한 데이터 리포트를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시예는 제1 히트 블록과 제2 히트 블록 사이의 칩을 클램핑해제하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시예는 장치로부터 칩을 언로딩하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시예에서, 칩을 로딩하는 단계는 선형 운동을 위해 모터를 작동시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 칩을 로딩하는 단계는 칩을 장치로 끌어당기도록 구성된 메커니즘을 작동시키는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 칩을 클램핑하는 단계는 자동 잠금 모터, 캠-팔로워 조합 또는 스프링을 사용하여 메커니즘을 작동하는 단계를 포함한다.

특정 실시예에서, 제1 온도는 동작 중에 75℃ 내지 105℃로 유지된다. 특정 실시예에서, 제2 온도는 동작 중에 30℃ 내지 75℃로 유지된다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 온도는 온도 센서로부터의 피드백에 기초하여 열원 전력을 변경하는 마이크로제어기 프로그램에 의해 제어된다. 특정 실시예에서, 제1 및 제2 온도는 PID(Proportional-Integral-Derivative) 제어기에 의해 제어된다. 특정 실시예에서, 제1 온도 센서는 제1 히트 블록 내에 내장된다. 특정 실시예에서, 제2 온도 센서는 제2 히트 블록 내에 내장된다. 특정 실시예에서, 제1 온도 센서는 제1 히트 블록의 표면에 결합된다. 일부 실시예에서, 제2 온도 센서는 제2 히트 블록의 표면에 결합된다. 특정 실시예에서, 여기 광원은 30° 내지 90° 사이의 칩의 표면과 각을 형성한다. 특정 실시예에서, 칩으로부터 방출된 광을 검출하는 단계는 2분마다 1개 이상의 이미지 빈도로 이미지를 지속적으로 획득하기 위해 카메라를 작동시키는 단계를 포함한다.

임의의 본 발명의 방법, 조성물, 키트 및 시스템의 임의의 실시예는 기재된 단계 및/또는 특징을 포함/구비/수용/갖기 보다는 구성되거나 또는 실질적으로 구성될 수 있다. 따라서, 임의의 청구항에서, 용어 "~로 구성되는" 또는 "~로 실질적으로 구성되는"는 이와는 달리 개방형 연결 동사로 사용될 수 있는 것으로부터 주어진 청구항의 범위를 변경하기 위해 전술된 임의의 개방형 연결 동사로 대체될 수 있다.

청구항에서의 용어 "또는"의 사용은 양자택일만을 언급하거나 양자택일이 상호 배제되는 것으로 달리 명시적으로 나타내지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 데 사용되지만, 본 명세서는 양자택일만을 그리고 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다.

본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값을 결정하기 위하여 사용되는 장치 또는 방법에 대하여 오차의 표준 편차를 포함하는 값을 나타내는데 사용된다.

오랜 특허법에 따라, 청구항 또는 명세서에서 "포함하는"이라는 용어와 함께 사용될 때 "a"및 "an"이라는 용어는 특별히 언급하지 않는 한 하나 이상을 나타낸다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 요지 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 자명할 것이기 때문에, 본 발명의 특정 실시양태를 지시하더라도, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시의 수단으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 상세한 설명과 함께 이들 도면의 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 특허 또는 출원 파일에는 색상으로 실행된 하나 이상의 도면이 포함될 수 있다. 색상 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용 지불 시 특허청에 의해 제공된다.
도 1은 증폭 능력 및 기구 경제성 및 휴대성과 관련하여 다양한 플랫폼을 그래픽 비교를 도시한 도면이다.
도 2는 본 개시에 따른 모세관에서의 대류 흐름 및 칩에서의 흐름뿐만 아니라 관련 제조 및 작동 원리를 도시한 도면이다.
도 3은 본 개시에 따른 장치의 동작에 대한 워크플로우 다이어그램을 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 장치의 부분 분해도 및 프로토타입으로부터 결과를 이미징하고 프로토타입 장치의 사진을 도시하는 도면이다.
도 5는 본 개시에 따른 장치의 개념적 기능 흐름도를 도시한다.
도 6은 본 개시에 따른 장치의 칩 홀더 및 칩의 사시도 및 사진 표현을 도시하는 도면이다.
도 7은 본 개시에 따른 장치의 대안의 칩 홀더, 로딩 메커니즘 및 클램핑 메커니즘의 개략도를 도시한다.
도 8은 본 개시에 따른 장치의 조립된 프레임 및 개별 서브 프레임의 사시도를 도시한다.
도 9는 본 개시에 따른 장치의 조립된 프레임 및 프레스 바의 사시도를 도시한다.
도 10은 비클램핑된 위치와 램핑된 위치에 있는 본 발명에 따른 장치의 기계 시스템을 도시한다.
도 11은 본 개시에 따른 장치의 조립된 프레임에서 및 개별적으로 히트 블록의 직교 및 사시도를 도시한다.
도 12는 본 개시에 따른 장치의 열 제어 시스템 구성요소의 직교, 사시 및 사진 표현뿐만 아니라 히트 블록 온도의 응답 곡선을 도시한다.
도 13은 본 개시에 따른 장치의 형광 이미징 시스템의 개략도를 도시한다.

본 개시의 예시적인 실시예는 3개의 주요 구성요소를 포함한다:(1) 칩: 능동 냉각 또는 유체소자를 필요로 하지 않고 신뢰할 수 있는 대류 PCR을 위한 환형 반응 챔버, (2) 분석 및 판독: 폐쇄 튜브 방식으로 마이크로어레이 내에서 프로브의 공간 분리를 통하여 단일 형광 채널을 사용하여 50개 이상의 DNA 표적의 동시 검출 및 분석 및(3) 장치: 다중 증폭 및 실시간 판독을 구현하는 휴대가능하고 저렴한 기구.

대류 PCR의 원리는 온도 유발 밀도 차이(Rayleigh-Benard convection)의 결과로 수용액이 제어 가능하게 순환될 수 있다는 것이다. 요컨대, 용액이 더 고온일수록 밀도가 낮고 용액이 더 저온일수록 밀도가 높고 중력이 차등 가열 용액의 순환을 유도할 수 있다. 능동 냉각 또는 유체소자 구성요소가 필요하지 않기 때문에 대류 PCR 기구의 크기와 중량은 펠티어(Peltier) 시스템을 사용하는 종래의 PCR보다 상당히 작다.

대류 PCR은 우선 개념적으로 도입되었고 2002년에 도 2의 섹션(A)에 도시된 바와 같이 반응 챔버로 수직 모세관을 사용하여 실험적으로 입증되었다. 그러나, 이 반응 챔버는 순환 속도가 낮은 "데드 구역"을 가지고 있어서 비특이적 DNA 증폭 및 프라이머 이량체 형성을 야기한다. 모세관을 사용하는 대류 PCR의 이러한 상대적인 단점은 대류 PCR을 종래의 PCR에 대한 매력적이지 않은 대안으로 구성하여 상업적으로 채택되지 않았다. 대조적으로, 도 2의 섹션(B)에 도시된 설계된 환형 반응 챔버는 칩의 데드 구역을 제거하고 90℃ 및 60℃ 온도 구역을 통해 챔버 내 PCR 용액의 균일한 순환을 용이하게 한다. 섹션(B)에 도시된 도넛(Donut) PCR 유체 칩(100)은 진단-등급 DNA 분석을 위한 대류 PCR을 가능하게 하기 위해 모세관보다 더 균일한 온도 제어를 달성하도록 설계되었다. PCR 용액은 입구 포트를 통해 반응 챔버로 주입되고 다른 포트는 공기 우회를 허용한다. 중심의 내부 원형 인서트("아일랜드(island)")는 제어되지 않은 온도에서 PCR 혼합물이 장기간 머무를 수 있는 데드 공간(dead space)을 방지한다. 도넛 PCR 칩(100)의 제조 및 조립 공정은 도 2의 섹션(C)에 도시된다. 도넛 PCR 칩(100)과 함께 사용할 수 있는 무-라벨 마이크로어레이 기술의 개요는 도 2의 섹션(D)에 도시된다. 앰플리콘 및 dNTP는 언라벨링되고, 국부적인 형광 증가는 언라벨링된 앰플리콘에 의해 퀀처-라벨링된 올리고뉴클레오타이드의 변위를 통하여 달성된다. 따라서 이 기술은 개방 튜브 세척 단계를 방지한다. 도 2의 섹션(E)은 앰플리콘 혼합물에 혼성화 전에(위) 및 후에(아래) 무-라벨 마이크로어레이의 형광 이미지를 제공한다. 제이스 악시오 옵저버(Zeiss Axio Observer) 형광 현미경을 사용하여 취한 이미지가 여기에 제공된다.

종래의 정량 PCR(qPCR) 기구는 다양한 스펙트럼 파장을 사용하여 다양한 DNA 표적의 다중 분석을 수행한다. 그러나 비중첩 가시 파장 형광단의 개수는 5-6개로 제한된다. 감염성 질병 및 항생제 내성 프로파일링에서 농업 유전 프로파일링에 이르는 응용의 경우 종종 20개 초과의 상이한 표적이 검출되어야 한다. 예를 들어 각각 5개의 표적을 테스트하는 4개의 반응을 통해 샘플에서 20개의 상이한 DNA 표적을 프로파일링함으로써 샘플 분할을 수행할 수 있다. 그러나 실제로 이는 번거롭고 샘플이 제한될 때 감도를 희생한다. 마이크로어레이는 공간 분리를 사용하여 단일 형광 파장을 사용하여 높은 증폭을 달성하지만, 형광 배경을 억제하기 위해 노동 집약적이고 개방형 튜브 세척 단계를 필요로 한다. 복합 마이크로어레이 워크플로우는 종래의 마이크로어레이를 체외 진단(IVD) 사용에 적합하지 않게 구성한다. 대조적으로, 환형 도넛 PCR 칩의 내부 표면에 인쇄된 마이크로어레이는 무-라벨 마이크로어레이이며 과도한 앰플리콘 또는 반응 시약을 제거하기 위해 세척이 필요하지 않다.

도넛 PCR 칩에서 다수의 DNA 표적의 다중 증폭 및 검출을 수행하기 위하여 우수한 열 접촉을 형성하기 위해 칩이 상이한 온도에서 2개의 히터에 단단히 장착될 필요가 있다. 과도한 배경 조명을 방지하기 위해 도넛 PCR 칩을 어두운 공간으로 이동하거나 또는 칩 로딩 도어가 밀봉되어야 한다. 도넛 PCR 칩은 또한 적절하게 선택되고 배치된 필터 및 광학 장치를 사용하여 적절한 파장, 강도 및 초점의 빛으로 조명될 필요가 있다. 카메라는 일정한 간격으로 마이크로어레이의 사진을 촬영한 다음 소프트웨어를 사용하여 이미지를 해석하여 밝은 스팟의 존재/부재를 요청한다. 본 발명의 예시적인 실시예는 전술된 각 공정을 달성하는 통합 장치를 제공한다.

이제 도 3을 참조하면, 샘플에서 핵산 표적의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치(200)의 개략도가 장치(200)와 함께 사용하기 위한 워크플로우 다이어그램의 개요와 함께 제공된다. 도 3에 도시된 바와 같이, 샘플(110)은 하나 이상의 PCR 시약과 혼합된 다음 이송 피펫을 통해 칩(100)에 로딩될 수 있다. 그 후 칩(100)(샘플(110) 포함)은 밀봉되고 분석을 위해 장치(200)에 삽입될 수 있다. 사용자는 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(210)를 통해 장치(200)의 동작을 제어할 수 있다. 특정 실시예에서, GUI(210)는 장치(200)에 무선으로 연결될 수 있고, 특정 실시예에서, GUI(210)는 모바일 장치(220)(예를 들어 스마트폰, 랩탑 컴퓨터, 태블릿 또는 다른 적절한 장치)에 통합될 수 있다. GUI(210)는 장치(200)를 통해 샘플(110)의 분석을 시작하고 이미지 결과를 디스플레이하는데 사용될 수 있다. 장치(220)는 의사, 간호사 또는 다른 의료 전문가에게 테스트 결과를 전송하는 데 사용될 수 있다.

이제 도 4를 참조하면, 장치(200)의 개요가 제공된다. 도 4의 섹션(A)은 조립된 구성요소의 3-D 다이어그램을 도시한다(외부 하우징 제외). 도 4의 섹션(B)은 장치(200)의 엔지니어링 프로토타입의 사진을 제공한다(재차 외부 하우징을 제외). 도 4의 섹션(C)은 섹션(B)에 도시된 장치(200)의 실시예에 의해 이미지화된, 도넛 PCR 칩(100)의 100-스팟 어레이의 형광 이미지를 도시한다. 장치(200)의 특정 실시예는 3-D 프린팅된 구조적 구성요소를 포함할 수 있다(얼티메이커(Ultimaker) 3과 같은 적합한 장치를 사용하여). 다른 구성요소는 기성품으로 널리 사용가능한 모듈을 포함할 수 있다. 섹션(B)에 도시된 실시예에서, 스마트폰은 카메라, 이미지 처리 장치, 사용자 인터페이스 및 무선 데이터 송신기로 제공된다. 도 4에 도시된 실시예는 벽에 전원이 공급되지만 또한 최대 60 분 작동하도록 구성되는 내부 전원 뱅크를 갖는다(예를 들어, 전체 샘플 분석 하나에 추가 시간이 필요할 수 있는 마진 추가).

도 5는 형광 이미징(210), 사용자 인터페이스(220), 기계(230) 및 열 제어부(240)의 4개의 주요 시스템에서 실행되는 단계를 포함하는 장치(200)에 의해 수행되는 분석의 개념도 또는 흐름도를 제공한다. 장치(200)를 작동하기 위한 일반적인 공정의 개요는 적절한 샘플, dNTP, DNA 중합효소 및 완충 시약이 로딩된 도넛 PCR 칩(100)과 함께 아래에 제공된다.

사용자는 초기에 장치(200)의 전원을 켤 수 있으므로 초기화 이전에 시스템 점검(제어기 연결 확인, 카메라 기능 및 광원 조명 확인 등)이 수행된다. 장치(200)의 초기화 동안, 열 제어 시스템이 켜진 뒤에, 히트 블록을 미리 결정된 온도로 가열하고 안정화된 온도에서 이 히트 블록을 유지하는 것이 활성화된다. 보다 상세한 온도 제어 방법 정보는 열 제어 시스템 섹션에서 추가로 설명된다. 히트 블록 공정과 함께 온도 기록도 동시에 시작될 수 있다. 열 제어 시스템은 실험이 완료될 때까지 지속적으로 작동할 수 있다. 시스템 초기화 공정은 형광 이미징 시스템을 켜고, 광원 에너지 전력을 체크하고, 카메라 초점을 확인하고, 초기화 이미지가 기록할 준비가 되었는지 확인하는 단계를 포함한다. 다음으로 시스템은 이동하는 기계 부분의 위치를 재설정한다. 예를 들어, 이는 히트 블록을 고정하는 프레임을 클램핑 해제된 위치로 이동하고, 칩 홀더를 언로딩/배출 위치로 설정하고, 칩을 로딩하기 위한 준비 단계를 포함할 수 있다.

장치(200)는 장치가 실험 또는 분석을 위한 준비가 되었음을 나타내는 디스플레이를 포함할 수 있다. 그 뒤, 사용자는 장치(200)에 로딩하기 위해 칩을 준비할 수 있다. 다음으로, 사용자는 칩을 삽입하고 로딩하여 칩이 로딩되고 위치되도록 허용한다. 장치(200)는 히트 블록이 칩을 클램핑하도록 구성될 수 있다. 그 뒤 장치(200)는 실험/분석을 시작할 준비가 되고 이를 카운트다운을 표시한다. 그 뒤, 장치(200)는 미리정해진 간격(예를 들어 매 45초마다)으로 하나의 이미지를 취하기 위해 카메라를 사용하여 형광 이미징 시스템 타이머를 시작/재설정한다. 각각의 미리정해진 간격 이후에 칩의 형광단을 여기시키기 위해 광원이 켜질 것이다. 특정 실시예에서, 여기 필터가 있는 레이저 또는 LED 광은 잠재적인 광원으로 간주될 수 있다.

장치(200)는 카메라를 사용하여 현재 칩의 형광 이미지를 캡처하고 저장할 수 있다. 다양한 유형의 형광단 및 기구 설계는 다양한 형광 필터 세트가 필요로 한다. 다음으로 광원 전원이 꺼질 수 있고 미리정해진 간격으로 다음 이미지가 취해질 수 있다. 이는 실험/분석이 완료될 때까지 반복될 수 있다. 실험이 완료되면 열 제어 시스템과 형광 이미징 시스템이 꺼질 것이다. 분석이 종료된 후에 칩이 자동으로 배출된다. 칩의 온도가 높기 때문에 사용자는 주의해야 한다. 그 뒤 기계 시스템의 히트 블록이 클램핑해제되고 칩이 배출될 수 있다. 장치(200)는 계속해서 이미지를 분석하고 데이터 보고서를 마무리할 수 있다. 사용자는 다음 실험을 계속하거나 또는 장치(200)의 전원을 끌 수 있다.

이제 도 6을 참조하면, 섹션(A)은 하나 이상의 칩(100)을 보유하도록 구성된 칩 홀더(205)의 3-D 다이어그램을 도시한다. 도 6의 섹션(B)은 홀더(205)에 로딩된 후 칩(100)의 위치를 나타내고, 섹션(C)은 언로딩된 위치(좌측) 및 로딩된 위치(우측)의 칩(100)을 예시한다. 도 6의 섹션(D)은 칩(100)이 로딩된 칩 홀더(205)(이 예에서 3-D 프린팅을 통해 제조됨)의 사진을 제공한다.

장치(200)는 칩 로딩 및 히트 블록 클램핑을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기능을 수행할 기계 시스템의 구성요소를 포함한다.

장치(200)에서 칩 홀더(205)의 기능은 도넛 PCR 칩(100)을 삽입하고 칩이 미리결정된 위치로 수직 이동하도록 유도하는 것이다. 칩 홀더는 삽입 슬롯(206), 위치결정 슬롯(207) 및 동작 제어 세트(208)의 세 가지 주요 부분을 포함한다. 삽입 슬롯(206)은 칩 삽입을 위해 기구 표면 외부로 압출된다. 칩(100)은 동작 제어 세트(208)의 안내와 함께 수직으로 상하로 이동하도록 칩(100)을 지지하는 삽입 슬롯(206)에 삽입되고, 칩(100)은 위치결정 슬롯(207)에 정확하게 위치된다.

위치결정 슬롯(207)의 측면에 있는 2개의 수직 바는 가이드 레일(209)로서 작용하고 칩(100)을 수직으로 상하로 이동시키기 위한 안내부로서 사용된다. 동작 제어 세트(208)는 이동 구성요소(211) 및 그 고정부(213)의 두 부분을 포함한다. 특정 실시예에서, 이동 구성요소(211)는 선형 동작 모터, 예를 들어 선형 액추에이터 또는 스텝 모터를 이용한다. 동작 제어 세트(208)의 고정부(213)는 고정을 위해 및 칩(100) 이동 동안 이동 구성요소(211)의 안정화를 보장하기 위해 사용된다. 삽입 슬롯(206), 위치결정 슬롯(207), 가이드 레일(209) 및 고정부(213)는 통합 칩 홀더(205)를 집합적으로 형성한다. 예시적인 실시예에서, 동작 제어 세트(208)의 이동 구성요소(211)는 칩 홀더(205)에 조립된다. 전체 칩 홀더(205) 및 이동 구성요소(211)를 조립한 후 이들은 장치(200) 내부에 고정될 것이다. 칩(100)의 수직 이동 공정은 동작 제어 세트(208)에 의해 유도되고 지시되며, 여기서 도넛 PCR 칩(100)은 수직으로 이동되는 대상이다.

실험 전에, 칩 홀더(205)는 언로딩된 위치로 재설정되고, 이동 구성요소(211)(예를 들어, 선형 액추에이터)는 도 6의 섹션(C)의 좌측 도면에 도시된 바와 같이 연장될 것이다. 칩(100)을 삽입한 후, 칩(100)이 위치결정 슬롯(207)에 정확히 위치될 때까지 칩은 단축된 선형 액추에이터와 함께 수직으로 아래로 이동할 것이다. 이때 칩(100)의 상부 에지와 하부 에지는 삽입 슬롯(206)(칩(100)의 하부 에지의 일부)과 위치결정 슬롯(207) 내에 끼워맞춤되고 도 6의 섹션(D) 및 섹션(C)의 우측 도면에 도시된 바와 같이 수직으로 유지된다. 실험 후, 이동 구성요소(211)는 연장되고, 칩(100)을 배출하기 위해 칩(100)이 위로 이동하도록 지시한다.

다른 실시예(미도시)에서 칩 홀더는 상이한 유형의 설비를 수용하기 위해 상이한 형상을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 칩 홀더는 칩 자체만을 이동시키는 대신에 수직으로 상하로 이동할 수 있다.

실험 또는 분석이 수행되기 전에, 칩 홀더(205)는 이동 구성요소(211)에 의해 구동될 것이며, 칩 삽입을 위해 삽입 슬롯(206)을 장치(200) 외부로 가압할 것이다. 칩(100)을 삽입한 후, 칩(100)은 위치결정 슬롯(207)의 바닥에 직접 접촉할 것이고, 칩의 상부 에지는 삽입 슬롯(206)과 평행할 것이다. 이동 구성요소(211)는 전체 칩 홀더(205)를 아래로 이동하도록 구동한 뒤에 장치(200)로 삽입 슬롯(206)의 일부를 당겨서 칩 로딩 공정을 완료한다.

실험 후, 이동 구성요소(211)는 기구(200)의 표면으로부터 삽입 슬롯(206)을 제거하기 위해 칩(100)을 지지하는 칩 홀더(205)와 함께 상향으로 이동하고 그 뒤에 칩(100)은 제거될 수 있다.

도 7의 섹션(A)은 칩(100)을 보유하도록 구성된 칩 홀더(205)에 대한 대안의 설계를 도시한다. 도 7의 섹션(B)은 칩 홀더(205)를 로딩하도록 구성된 로딩 메커니즘(215)에 대해 4개의 상이한 구성을 제공한다. 각 실시예는 히터를 포함하지만, 칩 홀더(205)를 히터 사이의 위치로 및 이 위치로부터 외부로 이동시키기 위한 상이한 구성요소를 포함한다. 제1 실시예는 리드스크류 및 리드 너트를 갖는 스테퍼 모터를 포함한다. 제2 실시예는 칩 홀더에 결합된 팔로워를 상승 및 하강시키기 위해 수평 축을 중심으로 회전하는 캠을 갖는 스테퍼 모터를 포함한다. 제3 실시예는 칩 홀더에 결합된 팔로워를 상승 및 하강시키기 위해 수직 축을 중심으로 회전하는 캠을 갖는 스테퍼 모터를 포함한다. 제4 실시예는 칩 홀더(205)와 결합하고 이를 상승 및 하강시키도록 구성된 롤러 기어 및 롤러에 결합된 모터를 포함한다. 도 7의 섹션(C)은 칩 홀더 및 칩의 각 측면에 히터를 클램핑하도록 구성된 클램핑 메커니즘(225)의 3개의 상이한 실시예를 도시한다. 각 실시예는 구성요소의 이동을 제어하도록 구성된 스테퍼 모터 및 히터와 접촉하도록 구성된 클램프 블록을 포함한다. 제1 실시예는 스테퍼 모터에 결합된 캠 및 클램프 블록에 결합된 팔로워를 포함한다. 이 실시예는 또한 가이드 레일상의 복수의 스프링을 포함하며, 여기서 스프링은 클램프 블록에 히터를 향해 힘을 가하도록 편향된다(예를 들어, 클램핑된 위치를 향해 편향된 스프링). 캠이 회전함에 따라 이는 팔로어와 결합되고 스프링 력을 상쇄하여 클램프 블록이 히터에서 이격되도록 할 수 있다(예를 들어 클램핑해제 위치).

도 7의 섹션(C)의 제2 실시예는 전술한 실시예와 유사한 구성을 갖는 클램핑 메커니즘(225)을 도시한다. 그러나, 캠 대신에, 이 실시예는 클램프 블록을 히터을 향하여 및 히터로부터 이격되게 이동시키기 위해 리드스크류 및 리드 너트 배열을 이용한다. 도 7의 섹션(C)에 도시된 제3 실시예는 스테퍼 모터 및 힌지 메커니즘 주위로 피벗회전 클램프 블록과 결합하는 캠을 갖는 클램핑 메커니즘(225)을 도시한다. 이 실시예는 또한 피벗팅 클램프 블록을 히터를 향해 편향시키도록 구성된 토션 스프링을 포함한다.

이제 도 8 및 도 9를 참조하면, 개별 및 조립된 프레임의 사시도가 도시된다. 프레임의 주요 기능은 히트 블록을 수직으로 고정하는 데 있다. 여기에 도시된 프레임의 두 부분, 여기에서는 프레임 알파 및 프레임 베타로 지칭되는 두 부분이 제공된다.

도 8의 섹션(A)은 서브 프레임(410)(또한 프레임 알파로 지칭됨)의 사시도를 제공하지만, 도 8의 섹션(B)은 서브 프레임(420)(또한 프레임 베타로 지칭됨)의 사시도를 제공한다. 도 8의 섹션(C)은 프레임(450)을 형성하기 위해 서브 프레임(410)에 근접하게 위치된 서브 프레임(420)을 도시한다. 두 프레임은 3개의 주 구성요소: 기저, 메인 구조 캐리어 및 프레스 바를 포함한다. 기저는 전체 프레임과 슬라이딩 플랫폼 사이의 연결 및 고정에 사용된다. 도 8의 섹션(A)은 기저(411) 및 주 구조 캐리어(412)를 갖는 서브 프레임(410)을 도시하고 있지만, 도 8의 섹션(B)은 기저(421) 및 주 구조 캐리어(422)를 갖는 서브 프레임(420)을 도시한다. 도 9의 섹션(A)은 서브 프레임(410)과 함께 사용하기 위한 프레스 바(413 및 414)뿐만 아니라 서브 프레임(420)과 함께 사용하기 위한 프레스 바(423 및 424)를 도시한다. 추가로, 도 9의 섹션(A)은 프레스 바(413 및 414)에 결합된 히트 블록(415 및 416)과 프레스 바(423 및 424)에 결합된 히트 블록(425 및 426)을 도시한다. 도 9의 섹션(B)은 하위 구성요소가 조립된 프레임(450)을 도시한다. 명확성을 위해 모든 개별 구성요소가 섹션(B)에 라벨링되지 않는다.

주 구조 캐리어(412 및 422)는 프레임(450)에서 주요 역할을 하고, 이의 주요 기능은 클로(417 및 427)(도 8의 섹션(A 및 B)에 라벨링됨)에 프레스 바(413, 414, 423 및 424)를 고정하는 것이다. 특정 실시예에서, 제조 중에 기저(411 및 421) 및 구조 캐리어(412 및 422)는 각각 단일 부분으로 제조될 수 있다. 각 구성요소는 이의 형상 및 형태를 유지하기 위해 강성 재료로 제조될 수 있다. 3-D 프린트 프로토타이핑에서, 폴리락트산(PLA) 재료 및 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 재료 등이 적합한 재료일 수 있다.

프레스 바(413, 414, 423 및 424)의 기능은 히트 블록(415, 416, 425 및 426)을 고정하는 것이다. 도 9에 도시된 바와 같이, 프레스 바(413, 414, 423 및 424)의 형상은 평평한 U 자형이다. 프레스 바는 고온에서 이의 형상을 유지해야 하며 내열 재료가 제안된다. 특정 실시예에서, 폴리카보네이트(PC) 또는 세라믹 재료가 프레스 바에 사용될 수 있다.

프레스 바(413, 414, 423 및 424)를 프레임(450)에 결합한 후(서브 프레임(410 및 420)을 통해), 히트 블록(415, 416, 425 및 426)이 수직으로 직립 위치될 것이다. 서브 프레임(410)은 전방 2개의 히트 블록(415 및 416)을 조립하고, 서브 프레임(420)은 후방 2개의 히트 블록(425 및 426)을 조립할 것이다. 서브 프레임(410, 420)(또한 프레임 알파 및 프레임 베타로 지칭됨)의 구성(예를 들어, 형상 및 치수)은 2개의 완전히 조립된 서브 프레임의 중첩을 용이하게 하기 위해 상이하다. 도 8에 도시된 바와 같이, 선형 액추에이터(430)는 서브 프레임(410)과 서브 프레임(420) 사이에 결합된다. 선형 액추에이터(430)가 연장될 때, 히트 블록(425, 426)은 히트 블록이 칩(100)과 완전히 결합되거나 또는 이를 클램핑할 때까지 히트 블록(415 및 416)에 더 근접하게 이동할 것이다. 선형 액추에이터(430)가 짧아질 때, 히트 블록(425, 426)은 히트 블록이 칩(100)을 성공적으로 칩을 결합해제 또는 클램핑해제할 때까지 히트 블록(415 및 416)으로부터 이격되게 이동할 것이다.

도 10은 칩(100)의 수직 로딩 및 클램핑을 제공하도록 구성된 기계 시스템(500)의 개요를 제공한다. 도 10의 섹션(A)은 클램핑해제된 위치에 기계 시스템(500)의 측면도를 도시한다. 이 도면에서, 선형 액추에이터(430)는 후퇴 위치에 있고 서브 프레임(420)은 선형 액추에이터(430)를 향해 이동된다.

도 10의 섹션(B)은 클램핑된 위치에 있는 기계 시스템(500)의 측면도를 도시한다. 이 도면에서, 선형 액추에이터(430)는 연장된 위치에 있고 서브 프레임(420)은 선형 액추에이터(430)로부터 칩(100)을 향하여 이동한다.

도 10의 섹션(C)은 클램핑된 위치에 있는 기계 시스템(500)의 사시도를 제공하는 반면, 섹션(D)은 로딩된 도넛 PCR 칩(100)이 있는 기계 시스템(500)의 사진을 제공한다. 명확성을 위해, 도 10에서의 모든 구성요소가 도면부호로 라벨링되지 않는다.

서브 프레임(410 및 420)은 프레임의 전방 및 후방 이동을 용이하게 하기 위해 슬라이딩 구성요소(460)로 지지될 수 있다. 특정 실시예에서, 상업적으로 이용 가능한 선형 베어링 플랫폼(구성요소 번호 SC8UU로 식별됨)이 슬라이딩 구성요소에 대해 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 슬라이딩 구성요소는 슬라이딩 플랫폼, 슬라이딩 바 및 클램프 스탠드를 포함할 수 있다. 슬라이딩 플랫폼의 표면은 수평이며 프레임 기저(411, 421)에 결합된다. 슬라이딩 플랫폼은 슬라이딩 바에 결합되며 슬라이딩 바를 따라 전후로 이동할 수 있다.

예시적인 실시예에서, 슬라이딩 플랫폼 설계는 마찰을 최소화하는 기능을 유지하는 한 맞춤구성될 수 있다. 일 실시예에서, 슬라이딩 바는 직경이 8mm인 스테인리스 스틸 표면 표면 글레이징된 실린더이다. 특정 실시예에서, 2개의 슬라이딩 바가 플랫폼에 사용될 수 있다. 슬라이딩 바는 상업적으로 입수가능한 다수의 제품으로부터 선택될 수 있고 임의의 다양한 치수 및 재료일 수 있다. 클램프 스탠드는 슬라이딩 바를 고정하고 위치결정하는 데 사용된다. 특정 실시예에서, 3세트의 클램프 스탠드가 사용될 수 있으며, 각 세트는 2개의 클램프 스탠드를 포함한다. 하나의 세트의 클램프 스탠드는 클램핑 공정 중에 도넛 PCR 칩(100)이 파손되는 것을 방지하기 위해 과도한 움직임을 방지하는 목적으로 두 세트의 슬라이딩 플랫폼들 사이에 파티션 및 버퍼를 형성한다.

본 발명의 예시적인 실시예는 또한 히트 블록(415, 416, 425 및 426)을 통해 칩(100)의 2개의 상이한 온도를 유지하도록 구성된 열 제어 시스템을 포함한다. 이제 도 11의 섹션(A)를 참조하면, 전면 및 후면도는 히트 블록(415 및 416)에 대해 제공된다. 도 11에 도시된 바와 같이, 히트 블록(416)은 블록(416)의 하나의 에지에 근접한 테이퍼진 구멍(418)을 포함한다. 아래에서 더 설명되는 바와 같이, 테이퍼진 구멍(418)은 형광 이미징을 허용한다. 테이퍼진 구멍(418)의 중심은 히트 블록(416)이 클램핑된 위치에 있을 때 로딩된 도넛 PCR 칩(100) 상의 무-라벨 마이크로어레이의 위치에 대응한다. 도시된 실시예에서, 히트 블록(415 및 425)은 동작 중에 95 ℃로 설정되고, 히트 블록(416 및 426)은 동작 중에 60 ℃로 설정된다.

도 12는 본 발명에 따른 열 제어 시스템의 예시적인 실시예의 상이한 양태를 도시한다. 섹션(A)은 히트 블록에 부착된 열원(431)의 3-D 다이어그램의 개략적인 사시도를 도시하고, 섹션(B)은 히터 블록에 결합된 접착 가요성 히터로 구성된 열원(431)의 사진을 제공한다(예를 들어, 블록(426)). 도 12의 섹션(C)은 도넛 PCR 칩 챔버 아래의 히트 블록(425 및 426)에 내장된 온도 센서(432)의 부분 단면도를 도시한다. 도 12의 섹션(D)은 칩(100) 옆에 및 히트 블록(425 및 426)의 표면 상에 부착된 온도 센서(432)를 도시한다. 도 12의 섹션(E)은 열전대 및 서미스터로 구성된 온도 센서(432)의 사진을 제공한다. 또한, 도 12의 섹션(E)은 표면 접착 RTD 센서를 포함한 다양한 온도 센서를 도시한다. 도 12의 섹션(F)은 열 제어 보드(610)의 프로토타입을 포함하는 열 제어 시스템(600)의 사진을 제공한다. 도 12의 섹션(G)은 시간(초)에 대한 섭씨 온도로 측정된 히트 블록 온도의 반응 곡선을 도시한다.

특정 예시적인 실시예에서, 히트 블록은 글레이징된 표면을 가진 가열 전도성 보드이다. 특정 실시예에서, 히트 블록은 도넛 PCR 칩의 적어도 절반을 덮을 수 있는 폭과 길이를 나타내야 한다. 히트 블록의 원리는 가열된 히트 블록의 글레이징된 표면에 칩을 클램핑함으로써 칩을 미리결정된 온도로 가열하는 것이다. 도면에 도시된 특정 실시예에서 총 4개의 개별 히트 블록이 사용된다. 기구 동작 중에 2개의 히트 블록은 95℃의 온도를 유지하고 2개는 60℃ 온도를 유지한다.

안정적인 온도 제어에 사용되는 총 히트 블록의 개수는 변화할 수 있다. 예를 들어, 도 11에서, 온도를 유지하기 위한 양호한 피드백 제어 루프가 주어지면 히터(415 및 416)만을 사용하는 것으로 충분할 수 있다. 도면에 도시된 실시예에서, 4개의 히트 블록이 온도 견고성 및 내결함성을 위해 사용된다. 히트 블록에 사용되는 재료는 알루미늄, 스테인리스 스틸 또는 황동 또는 열 전도를 위한 다른 적합한 재료일 수 있다. 히트 블록의 두께는 원하는 온도와 열원의 특성에 따라 조절될 수 있다. 도면에 도시된 예시적인 실시예에서, 3mm 두께의 알루미늄 보드가 히트 블록에 사용된다.

예시적인 실시예에서, 온도 센서는 도 12의 섹션(C, D)에 도시된 바와 같이 히트 블록의 표면에 조립될 수 있거나 또는 히트 블록에 내장될 수 있다. 도시된 실시예에서, 온도 센서는 도넛 PCR 칩 온도의 가장 정확한 온도 판독을 달성하기 위해 히트 블록이 도넛 PCR 칩과 접촉하는 위치의 히트 블록에 내장된다(참조: 도 12의 섹션(C)). 예시적인 실시예에서, 온도 센서는 응답 시간 ≤1 초 및 정확도 ≤ 1.5℃로 20℃ 내지 105℃의 온도를 정확하게 측정할 수 있다. 도면에 도시된 실시예는 OMEGA 열전대 타입-T를 사용했다. 실험적으로 다른 유형의 열전대가 유사한 결과를 달성하는 것이 관찰되었다. 대안으로 저항 온도 검출기(RTD) 또는 서미스터가 대신 사용될 수 있다. 내장된 온도 센서 전략을 적용하는 경우 히트 블록의 형상이 온도 센서의 형상을 허용하는 것으로 주지된다.

본 개시 내용의 예시적인 실시예는 또한 히트 블록에 열을 제공하는 열원을 포함한다. 도시된 실시예는 Kapton 폴리이미드 접착 가요성 히터를 포함한다. 이 히터는 히트 블록 표면에 부착되지만 도넛 PCR 칩과 직접 접촉하지는 않는다. 히터는 열원에 공급되는 전력을 변경하여 온도를 유지한다. 대안으로, 가열 와이어를 수용하는 임의의 가열 플레이트가 히트 블록 또는 히터를 대체할 수 있다. 특히, 열원은 전기 에너지를 열로 변환하여 히트 블록의 신속한 가열을 제공할 수 있지만 급속 냉각을 제공할 수는 없다.

예시적인 실시예는 열 제어기의 중심 양태로서 온도 센서 피드백 루프를 추가로 포함한다. 열 제어기는 온도 센서로부터 온도를 판독하고, (1) 원하는 온도로 신속하게 가열을 구현하고 (2) 환경으로 인한 잠재적인 변동에도 불구하고 온도를 정확하게 유지하기 위해 히트 블록에 대한 전원에 대한 안내부를 제공한다. 예시적인 실시예는 증폭기 모듈을 통해 열전대의 온도를 정확하게 판독하고 열원의 전력을 제어하기 위해 Arduino 마이크로제어기를 사용할 수 있다. 대안으로 일반 PID(비례 적분 미분) 제어기가 동일한 기능을 달성할 수 있다.

본 발명의 예시적인 실시예는 또한 적어도 40 픽셀 x 40 픽셀의 어레이에서 공간 정보를 수집하도록 구성된 광학 형광 이미징 시스템을 포함한다. 이제 도 13을 참조하면, 예시적인 광학 형광 이미징 시스템의 개요가 도시된다. 도 13의 섹션(A)은 종래의 또는 전형적인 형광 현미경 배열을 포함하는 시스템(700)을 도시하는 반면, 섹션(B)은 프로토타입 기구에 사용되는 광학 시스템(800)의 개략도를 도시한다.

도넛 PCR 칩(100)의 형광 이미징은 광원(710), 칩(100)의 적절한 영역으로 빛을 유도하고 포커싱하는 광학 모듈(720), 다른 파장의 배경 신호를 감소시키기 위한 방출 필터(730) 및 광 검출기 어레이(740) 또는 이미지 획득을 위한 카메라를 필요로 한다.

도 13의 섹션(A)에 도시된 실시예에서, 시스템(700)은 또한 더 짧은 파장의 광을 반사시키면서 더 긴 파장의 광은 통과시키는 고역 통과 미러인 색선별 미러(750)를 포함한다. 따라서 여기 광은 표본에 반사되어 대물 렌즈를 통과한 다음 형광단을 여기시킨다. 방출된 광자는 대략 20nm만큼 적색 편이되고 색선별 미러(750)을 통과할 것이다. 신호 대 잡음비를 개선하기 위해, 방출 필터(730)가 적용되어 다른 파장의 배경 광을 차단한다. 마지막으로, 방출 광은 더 나은 증폭 및 포커싱을 위해 접안 렌즈(760)를 통과한다.

상기에서 형광 현미경에 사용되는 형광 이미징의 표준 방법을 설명한다. 도 13의 섹션(B)은 더 휴대 가능하고 스마트폰 카메라와 호환되는 시스템(800)의 단순화된 대안 설계를 나타낸다. 시스템(800)은 단지 하나의 방출 필터(830)와 하나의 녹색 광 레이저(532nm)(810)를 사용한다. 도시된 실시예에서, 녹색 레이저(810)는 코히어런트 광원으로 제공되고 칩 표면에 대해 45 ℃ 각도를 지시한다. DNA 마이크로어레이는 방출 필터(830)을 통해 명확하게 시각화될 수 있다. 레이저 대신 대안의 광원(예를 들어, 발광 다이오드(LED) 또는 아크 램프)이 사용될 수 있지만 추가 여기 필터가 필요하며 포커싱할 필요가 있다.

이제 도 13의 섹션(A)를 참조하면, 광학 렌즈(760)는 배율을 제공하기 위해 사용된다. 과학용 카메라 또는 휴대폰 카메라는 특수 소프트웨어에 의한 다운스트림 이미지 처리를 위해 선명한 마이크로어레이 이미지를 생성할 수 있다. 도 2의 섹션(E)에 도시된 이미지는 표준 필터 세트가 있는 과학용 카메라를 사용하여 취해진다. 도 4의 섹션(C)의 이미지는 도 12의 섹션(B)에 도시된 셋업을 사용하여 iPhone 6s를 사용하여 취해진다. 대안적으로, 광 검출기의 적절하게 배치된 어레이는 마이크로어레이 스팟 밝기에 대한 관련 정보를 제공하는 기능을 할 수도 있다.

본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험없이 구성되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 선호되는 실시예의 관점에서 설명되었지만, 본원에 기술된 방법, 단계 또는 방법의 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 더욱 구체적으로, 화학적으로 그리고 생리학적으로 모두 관련이 있는 특정한 제제는 동일 또는 유사한 결과가 달성되는 한 본 명세서에 개시된 제제를 대체할 수 있다는 점이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환 및 변경이 첨부되는 청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 요지, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

V. 참고 문헌

이하의 참고 문헌은, 본 명세서에 기재된 것에 대해서 상보적인 예시적인 절차 또는 기타 상세를 제공하는 정도로, 참고로 본 명세서에 구체적으로 편입된다:

PCT 특허 공보 제WO 2017/172760호

Claims

샘플에서 핵산 표적의 다중 증폭 및 검출을 위한 장치로서, 상기 장치는
칩의 로딩, 수직 위치결정 및 클램핑을 제공하도록 구성된 기계 시스템;
칩의 제1 온도 및 칩의 제2 온도를 유지하도록 구성된 열 제어 시스템 - 제1 온도는 제2 온도와 구별됨 - ;
적어도 40 픽셀 x 40 픽셀의 어레이에서 공간 정보를 수집하도록 구성된 광학 형광 이미징 시스템;
기계 시스템, 열 제어 시스템 및 광학 형광 이미징 시스템에 전기 에너지를 제공하도록 구성된 전력 시스템;
기계 시스템, 열 제어 시스템, 전력 시스템 및 광학 이미징 시스템의 작동을 제어하도록 구성된 제어기; 및
사용자가 사용자 인터페이스 소프트웨어를 통해 제어 시스템을 작동할 수 있도록 구성된 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함하는 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 칩은 10 mm 내지 320 mm의 높이, 10 mm 내지 320 mm의 폭 및 0.5 mm 내지 10 mm의 두께를 갖는 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, GUI는 터치 스크린 인터페이스인 장치.
제3항에 있어서, 터치 스크린 인터페이스는 스마트폰 내에 통합되는 장치.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 기계 시스템은 칩 홀더, 프레임, 슬라이딩 구성요소 및 지지 구성요소를 포함하는 장치.
제5항에 있어서, 칩 홀더는 삽입 슬롯, 위치결정 슬롯 및 동작 제어 세트를 포함하는 장치.
제5항에 있어서, 프레임은 기저, 주 구조 캐리어, 프레스 바 로케이터, 프레스 바 및 동작 제어 세트를 포함하는 장치.
제7항에 있어서, 동작 제어 세트는 전동식 이동 구성요소 및 이의 홀더를 포함하는 장치.
제8항에 있어서, 전동식 이동 구성요소는 선형 액추에이터 또는 스텝 모터를 포함하는 장치.
제5항에 있어서, 슬라이딩 구성요소는 슬라이딩 플랫폼 및 슬라이딩 바를 포함하는 장치.
제5항에 있어서, 지지 구성요소는 레일 스탠드를 포함하는 장치.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 열 제어 시스템은 복수의 온도 센서, 복수의 히트 블록 및 열원을 포함하는 장치.
제12항에 있어서, 복수의 온도 센서는 저항 온도 감지기(RTD), 서미스터, 열전대 또는 IR 센서를 포함하는 장치.
제12항에 있어서, 복수의 온도 센서들 중 온도 센서는 히트 블록 내로 내장되는 장치.
제12항에 있어서, 복수의 온도 센서들 중 온도 센서는 복수의 히트 블록들 중 히트 블록의 표면에 결합되는 장치.
제12항에 있어서, 복수의 히트 블록은 알루미늄, 스테인리스 스틸 또는 황동을 포함하는 장치.
제12항에 있어서, 복수의 히트 블록은 챔버의 총 표면적의 50% 이상과 집합적으로 접촉하는 장치.
제12항에 있어서, 열원은 접착 가요성 히터, 히트 프로브 또는 가열 와이어를 포함하는 장치.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 이미징 시스템은 광원, 광학 모듈 및 적어도 40 x 40 픽셀의 검출기를 포함하는 장치.
제19항에 있어서, 검출기는 카메라인 장치.
제20항에 있어서, 카메라는 과학용 카메라 또는 스마트폰 카메라를 포함하는 장치.
제19항에 있어서, 광원은 아크 램프, 증기 램프, 발광 다이오드(LED) 또는 레이저를 포함하는 장치.
제19항에 있어서, 광학 모듈은 여기 필터, 색선별 미러, 빔 스플리터, 방출 필터, 평면 미러, 대물 렌즈 및/또는 광학 렌즈를 포함하는 장치.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 기계 시스템은 하나 이상의 플라스틱을 포함하는 장치.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 기계 시스템은 폴리락트산(PLA), 폴리카보네이트 (PC), 아세토니트릴 부타디엔 스티렌(ABS) 또는 세라믹을 포함하는 장치.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 전력 시스템은 AC/DC 전원, MOSFET, 스위치, 증폭기, 다이오드, 트랜지스터 및 저항을 포함하는 장치.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제어기는 마이크로제어기 및/또는 PID 제어기를 포함하는 장치.
제27항에 있어서, 마이크로제어기는 라즈베리(Raspberry) Pi, Arduino, 또는 Genuino를 포함하는 장치.
제1항의 장치를 사용하여 칩 내의 샘플을 분석하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
장치 내에 칩을 로딩하는 단계;
제1 히트 블록과 제2 히트 블록 사이에 칩을 클램핑하기 위해 기계 시스템을 작동시키는 단계;
제1 히트 블록을 제1 온도로 가열하는 단계;
제2 히트 블록을 제2 온도로 가열하는 단계 - 제2 온도는 제1 온도와 별개임 - ;
광원으로부터의 여기 광을 칩의 표면으로 지향시키는 단계;
칩으로부터 방출된 광을 검출하는 단계; 및
칩으로부터 방출된 광을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 칩으로부터 방출된 광의 분석을 문서화하기 위한 데이터 리포트를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 제1 히트 블록과 제2 히트 블록 사이의 칩을 클램핑해제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 장치로부터 칩을 언로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 칩을 로딩하는 단계는 선형 운동을 위해 모터를 작동시키는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 칩을 로딩하는 단계는 칩을 장치로 끌어당기도록 구성된 메커니즘을 작동시키는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 칩을 클램핑하는 단계는 자동 잠금 모터, 캠-팔로워 조합 또는 스프링을 사용하여 메커니즘을 작동하는 단계를 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 제1 온도는 동작 중에 75℃ 내지 105℃로 유지되는 방법.
제29항에 있어서, 제2 온도는 동작 중에 30℃ 내지 75℃로 유지되는 방법.
제29항에 있어서, 제1 및 제2 온도는 온도 센서로부터의 피드백에 기초하여 열원 전력을 변경하는 마이크로제어기 프로그램에 의해 제어되는 방법.
제29항에 있어서, 제1 및 제2 온도는 PID(Proportional-Integral-Derivative) 제어기에 의해 제어되는 방법.
제29항에 있어서, 제1 온도 센서는 제1 히트 블록 내에 내장되는 방법.
제29항에 있어서, 제2 온도 센서는 제2 히트 블록 내에 내장되는 방법.
제29항에 있어서, 제1 온도 센서는 제1 히트 블록의 표면에 결합되는 방법.
제42항에 있어서, 제2 온도 센서는 제2 히트 블록의 표면에 결합되는 방법.
제29항에 있어서, 여기 광원은 30° 내지 90° 사이의 칩의 표면과 각을 형성하는 방법.
제29항에 있어서, 칩으로부터 방출된 광을 검출하는 단계는 2분마다 1개 이상의 이미지 빈도로 이미지를 지속적으로 획득하기 위해 카메라를 작동시키는 단계를 포함하는 방법.