JP2009171921A - 蛍光増幅核酸の検出装置及び検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】小型且つ安価な増幅核酸の検出装置及び該装置を用いる増幅核酸の簡便な検出方法を提供する。
【解決手段】表面２１に平面状の試料保持部２１０が設けられた透光性の基板２の温度を調節し、前記試料保持部２１０において、一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光標識核酸を増幅し、得られた蛍光増幅核酸中の蛍光物質を、前記基板２の裏面２２から励起し、前記蛍光物質の励起により生じた蛍光２０１を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は、蛍光増幅核酸の検出装置及び該装置を用いる蛍光増幅核酸の検出方法に関する。

ヒトゲノムの解読は、１９８０年代後半にその計画の議論が始まり、１９９０年頃から国際協力の下に進められてきた。そして２００３年には、最初のゴールである全ゲノムの構造決定がほぼ終わり、本格的なゲノム研究時代に突入した。ゲノム研究時代を迎え、タンパク質や糖の構造・機能解析や、疾患と関連したＳＮＰｓ解析等の研究の促進がはかられている。
前記ゲノム研究において、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の増幅という手法は重要であり、増幅方法としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が広く利用されている。ＰＣＲ法は、例えば、目的とするＤＮＡ領域をはさんで、プライマーを結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ反応でＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）断片を数十万倍にも増幅できる方法である。増幅されたＤＮＡは、ゲル電気泳動などによって分離し、定量できるが、作業が煩雑であり自動化が難しい。

そこで、リアルタイムＰＣＲ法を行うことで、定時的にＤＮＡの増幅量の測定を行う手法が用いられている（特許文献１参照）。リアルタイムＰＣＲ法は、サイクル毎に増幅量を確認し、増幅量に基づいて鋳型ＤＮＡの定量を行う方法であり、迅速性と定量性に優れている。
例えば、ＰＣＲ装置で核酸増幅量の定量モニタリングを行う装置において、ダイナミックレンジを拡大する露光時間が自動で選択可能であり、ドリフトを自動調整することで操作を簡略化したものが提案されている（特許文献２参照）。さらにこの装置では、テレセントリックな光学系と、定量対象の核酸溶液を保持する小ビンごとに対応してレンズを備えており、小ビンごとに焦点合わせが可能となっているなど、正確なデータを取得する為の機能を数多く備えている。
特表平８−５１０５６２号公報 特表２００３−５２４７５４号公報

一方、ゲノム研究の促進により、ＰＣＲ関連の装置の需要は高くなっており、様々な研究機関で設置されるようになってきている。しかし、リアルタイムＰＣＲ装置は、ＤＮＡ合成反応を行う際の温度制御手段をはじめ、増幅量を定量するための複雑な光学系やレーザー光源を必要とし、測定システムが大型且つ高価であり、通常のＰＣＲ装置と比較して普及率が低いのが現状である。
例えば、特許文献２で開示されている装置では、小ビンごとの焦点合わせは、常に小ビン中央になされており、小ビン中の核酸溶液が微量である場合には、小ビン中央の核酸溶液が不足するため、小ビンレンズ、視野レンズ、対物レンズ、プラテン等の光学系を、焦点が合うように再調整する必要があり、操作が煩雑であるという問題点があった。また、この装置において核酸溶液は、その液面が小ビンやプラテンの内壁に囲まれており、励起光を核酸溶液に正確に照射して焦点を合わせるためには、テレセントリックな光学系が必要となる。そして、テレセントリックな光学系が必要になると、装置が大型且つ高価になるという問題点があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、小型且つ安価な増幅核酸の検出装置及び該装置を用いる増幅核酸の簡便な検出方法を提供すること課題とする。

上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出装置であって、前記蛍光増幅核酸の溶液を保持する、平面状の試料保持部が表面に設けられた透光性の基板と、前記基板の温度を調節する温調手段と、前記基板の裏面から励起光を照射して前記蛍光物質を励起する励起手段と、蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とする蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項２に記載の発明は、前記基板表面に、試料保持部である第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項３に記載の発明は、前記基板において、さらに前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項４に記載の発明は、前記基板の表面側及び／又は裏面側のうち、励起光及び検出すべき蛍光を遮らない位置に、前記温調手段が配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項５に記載の発明は、前記基板の表面が、試料保持部及びその近傍を除いて、前記温調手段の基板と対向する面に、気密性部材を介して密着されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項６に記載の発明は、さらに、前記検出手段による検出結果に基づいて、前記蛍光増幅核酸の増幅量を算出する情報処理手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項７に記載の発明は、さらに、前記基板をその表面に対して平行な方向に移動させる移動手段を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。
請求項８に記載の発明は、前記温調手段、検出手段、情報処理手段及び移動手段が、これらを制御する制御手段と電気的に接続されていることを特徴とする請求項７に記載の蛍光増幅核酸の検出装置である。

請求項９に記載の発明は、一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出方法であって、表面に平面状の試料保持部が設けられた透光性の基板の温度を調節し、前記試料保持部において蛍光標識核酸を増幅する工程と、得られた蛍光増幅核酸中の蛍光物質を、前記基板の裏面から励起する工程と、前記蛍光物質の励起により生じた蛍光を検出する工程と、を有することを特徴とする蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１０に記載の発明は、前記基板表面に第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とからなる前記試料保持部を設け、該試料保持部に前記蛍光増幅核酸の溶液を保持することを特徴とする請求項９に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１１に記載の発明は、前記試料保持部の蛍光増幅核酸の溶液を、該溶液よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上である非水溶性の液体で被覆することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１２に記載の発明は、前記基板の表面側及び／又は裏面側のうち、励起光及び検出すべき蛍光を遮らない位置から、前記基板の温度調節を行なうことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１３に記載の発明は、前記基板の表面を、試料保持部及びその近傍を除いて、基板の温度調節を行う温調手段の前記基板と対向する面に気密性部材を介して密着させ、前記蛍光増幅核酸の溶液を封止することを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１４に記載の発明は、前記蛍光を検出する工程に次いで、該検出結果に基づいて、前記蛍光増幅核酸の増幅量を算出する工程を有することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１５に記載の発明は、前記基板の温度調節を特定の温度サイクルで行うことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１６に記載の発明は、温度サイクルごとに、前記蛍光増幅核酸の増幅量を一回又は二回以上算出する工程を有することを特徴とする請求項１５に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１７に記載の発明は、前記蛍光を検出する工程において、前記基板をその表面に対して平行な方向に移動させ、該基板上のすべての蛍光を検出することを特徴とする請求項９〜１６のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。
請求項１８に記載の発明は、前記基板の温度調節及び移動、蛍光の検出、並びに前記蛍光増幅核酸の増幅量の算出を、これらを制御する制御手段を介して行うことを特徴とする請求項９〜１７のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法である。

本発明によれば、検出装置を小型化できると共に安価に作製できる。また、極微量の増幅核酸も簡便にかつ高精度に検出できる。

以下、図面を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
＜検出装置＞
本発明に係る蛍光増幅核酸の検出装置は、一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出装置であって、前記蛍光増幅核酸の溶液を保持する、平面状の試料保持部が表面に設けられた透光性の基板と、前記基板の温度を調節する温調手段と、前記基板の裏面から励起光を照射して前記蛍光物質を励起する励起手段と、蛍光を検出する検出手段と、を備えることを特徴とするものである。
ここで蛍光増幅核酸とは、通常、増幅対象である核酸を蛍光物質で標識しつつ増幅したものである。

蛍光物質としては、公知の如何なるものも使用でき特に限定されない。具体的には、フルオレセイン、ローダミン（ローダミングリーン、ＴＡＭＲＡ等）、アクリフラビン、アレクサ（アレクサ６４７等）、サイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）等が例示できる。
蛍光物質は一種を単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。二種以上を併用する場合には、その組み合わせ及び比率等は、目的に応じて適宜選択し得る。
また、増幅産物に導入する蛍光物質の量も、目的に応じて適宜選択し得る。

核酸の増幅には、ＰＣＲ法等、公知の手法を適用できる。
そして核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド等を指す。

蛍光増幅核酸の溶液としては、核酸増幅後の反応液が好適である。後記するように、本発明の検出装置は、核酸増幅を行いながら、得られた反応液中の増幅核酸をリアルタイムで検出するのに特に好適である。
また増幅方法の特性から、上記溶液は、通常水溶液である。

図１は、本発明に係る蛍光増幅核酸の検出装置１を例示する図であり、（ａ）は概略構成図、（ｂ）は基板、ステージ及び温調手段を拡大して示す拡大断面図である。
この検出装置１は、おもに核酸増幅に関わる構成、増幅核酸の検出に関わる構成、装置の制御及び情報処理に関わる構成とからなる。
まず、核酸増幅に関わる構成について説明する。
核酸増幅に関わる構成は、おもに基板２と、基板２を支持するステージ３と、基板２の温度を調節する温調手段４を含む。

基板２は透光性の材質からなる。透光性の材質とは、光の透過率が高く且つ自家蛍光の少ない材質を指し、具体的にはガラス類や透明な樹脂類が例示できる。なかでも好ましいものとしては、水板ガラス、白板ガラス、ハーフホワイトガラス等のガラス類が例示できる。
基板２はプレート状であることが好ましく、表面２１及び裏面２２が平滑なものが好ましい。ここで、基板の表面２１とは、後記する試料保持部が設けられている側の基板２の面を指し、基板の裏面２２とは、前記表面２１とは反対側の基板２の面を指す。
基板２の大きさは特に限定されず、例えば表面２１及び裏面２２の大きさは、目的に応じて適宜選択し得る。ただし、基板２の厚みは、光の透過率が良好であるという観点からは薄いほど好ましく、基板２の強度も考慮して取り扱いのし易さという観点からは、０．５〜２．０ｍｍであることが好ましい。

基板の表面２１には、蛍光増幅核酸の溶液を保持するための試料保持部２１０が設けられている。試料保持部２１０は、検出対象の蛍光増幅核酸を得るために、核酸増幅を行う部位でもある。
試料保持部２１０は平面状であり、スポットした溶液を保持できれば如何なる形態でも良く、基板表面２１の特定領域をそのまま試料保持部としても良いが、溶液を安定して保持できる形態とすることが好ましい。溶液を安定して保持するためには、試料保持部２１０を親水性としたものが例示できる。このような基板の一例として、溶液を保持した状態のものを図２に例示する。図２（ａ）は、基板２の斜視図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における基板２の断面図である。

図２（ｂ）に示すように、基板の表面２１には、試料保持部となる第一親水性領域２１１と、該第一親水性領域２１１の周縁部を包囲する第一撥水性領域２１２とが設けられている。蛍光増幅核酸の溶液２０は第一親水性領域２１１上で安定して保持される。そして、第一撥水性領域２１２を設けることで、溶液２０の移動が抑制されるので、溶液２０がより安定して保持される。第一親水性領域２１１は、平面状であればその外形は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、図２に示すように略円形状が好ましい。第一撥水性領域２１２も平面状であることが好ましい。そしてその外形は特に限定されず、目的に応じて選択すれば良いが、リング状であることが好ましい。このようにすることで、溶液２０がより安定して保持される。

基板の表面２１においては、図２に示すように、第一撥水性領域２１２の外側周縁部を包囲する第二親水性領域２１３と、該第二親水性領域２１３の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域２１４とが設けられていることが好ましい。このようにすることで、保持された溶液２０の蒸発を防ぐために、被覆液２５で溶液２０を被覆した際に、被覆液２５も安定して保持できる。第二親水性領域２１３及び第二撥水性領域２１４は平面状であることが好ましい。そして、第二親水性領域２１３の外形は特に限定されないが、リング状であることが好ましい。このようにすることで、被覆液２５がより安定して保持される。また、第二撥水性領域２１４の外形はリング状でも良いし、その他の形状でも良く、特に限定されない。そして、第一親水性領域２１１、第一撥水性領域２１２及び第二親水性領域２１３は、同心状に設けられていることが好ましい。

被覆液２５としては、溶液２０の主溶媒である水の蒸発を抑制し、核酸増幅時における溶液２０の加温にも耐えるようにするという目的から、溶液２０よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上である非水溶性の液体を使用する。このような物性を有するものであれば如何なるものも使用し得るが、好ましい市販品として、各種ミネラルオイルやＡｄｖａｌｙｔｉｘ社製のシーリングソリューションが例示できる。溶液２０を直接被覆することで、マイクロタイタープレートやサンプルチューブを使用した場合のように、溶液２０近傍に多量の空気層が存在することがなく、例えばＰＣＲの熱サイクル中に溶液２０が蒸発することがなく、溶液２０の濃度変化が抑制されるので、安定して核酸増幅を行うことができる。
そして、基板の表面２１に、第二親水性領域２１３及び第二撥水性領域２１４を設けることで、上記のような物性を有する被覆液２５の移動が、第一撥水性領域２１２及び第二撥水性領域２１４により抑制される。

親水性領域及び撥水性領域の寸法は、目的に応じて適宜選択し得る。例えば、０．５〜３μＬ程度の極微量の溶液２０を保持する場合には、第一親水性領域２１１の直径Ｄ１は１ｍｍ〜３ｍｍとすることが好ましく、第一撥水性領域２１２の幅Ｌ１及び第二親水性領域２１３の幅Ｌ２は０．２ｍｍ〜１ｍｍとすることが好ましい。第二撥水性領域２１４の寸法は、基板２の大きさや試料保持部の数を考慮して、任意に選択し得る。例えば、図２に示すように、第二親水性領域２１３の外側全面を第二撥水性領域２１４としても良い。

親水性領域及び撥水性領域を有する基板２は、公知の方法で作製できる。具体的には、基板表面に親水処理及び撥水処理を施す方法、親水性基板表面に撥水処理を施す方法が例示できる。
親水処理としては、水酸基、アミノ基又はカルボキシ基等の親水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。撥水処理としては、アルキル基、アルケニル基、アルコキシ基又はアルケニルオキシ基等の低極性の官能基や、一つ以上の水素原子がフッ素原子で置換されたアルキル基又はアルコキシ基等の疎水性の官能基を基板表面に導入するものが例示できる。
このような、親水性領域及び撥水性領域を有する基板２としては市販品を使用しても良く、例えば、極微量の溶液２０を保持する目的においては、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ（登録商標）が好適である。

ステージ３は基板２を支持するものであり、図１においては、スタンド１６に着脱可能に固定されている。ステージ３は、蛍光増幅核酸中の蛍光物質の基板裏面２２からの励起と、蛍光物質の励起により生じた蛍光の検出を妨げないものであれば、その形状は特に限定されない。例えば、励起光６１と検出すべき蛍光２００及び２０１を遮らないように構成されたものが好ましく、具体的には図３に例示するものが挙げられる。図３（ａ）はステージ３の上面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における断面図はである。

ステージ３は、切欠３０が設けられた略四角形状の底板部３１と、該底板部３１上面にその三つの周縁部に沿って設けられたコ字状の外枠部３２とで構成され、底板部３１上面の露出面３１０上に基板２が支持されるようになっている。すなわち基板２は、その周縁部で露出面３１０に支持され、外枠部３２で移動が規制される。そして基板２は、露出面３１０上で、図３中の矢印方向に移動可能とされている。このようなステージ３で基板２を支持することにより、ステージの前記切欠３０を通じて、励起光６１の照射と蛍光２０１の検出が行われる。

ステージで基板を支持する場合には、図３に例示するように、ステージに形成された凹部に基板を嵌合させて固定しても良いし、ステージの平面上に載置した基板に、ステージ上に別途設けたストッパを当接して固定しても良く、支持方法は特に限定されない。
また、図３中のステージ３としては、基板２を一枚支持するものを例示しているが、複数枚の基板２を同時に支持できるようにしたものでも良い。

ステージ３の材質は特に限定されず、例えば、金属、合金、樹脂等、公知の材質から適宜選択すれば良い。
また、ステージ３は、所望の材質を使用して公知の手法で一体成形、打ち抜き等により作製しても良いし、例えば、底板部３１と外枠部３２とを成形、打ち抜き等により別途作製し、これらを貼り合わせて作製しても良い。

温調手段４は、試料保持部に保持された溶液２０中でＰＣＲ等の核酸増幅を行う時に、基板２の温度を調節するものである。そして、図１においては、ステージ３と共にスタンド１６に着脱可能に固定されており、さらに基板表面２１に対して垂直な方向に移動可能とされ、基板２に接触できるようになっている。そして基板２の温度を調節する際は、通常は、基板２に直接接触させるか、又は熱伝導性の材質からなる介在物を介して間接的に基板２に接触させる。
温調手段４は、加温及び冷却が可能な公知のものから適宜選択して使用できるが、温度調節を迅速かつ高精度に行える観点から、ペルチェ素子を利用したものが好ましい。

温調手段４の形状は特に限定されず、その配置形態等に応じて任意に選択できるが、基板２に直接接触させる場合には該基板２との接触面積が、介在物を介して間接的に接触させる場合には該介在物との接触面積が、それぞれ大きいほど好ましい。このように接触面積を大きくすることで、基板２の温度調節を短時間で高精度に行うことができる。

温調手段４のうち基板２に接触して熱を伝導する部位の材質は、耐熱性で且つ熱伝導性の高いものが好ましく、アルミニウム、鉄、銅などの金属、ステンレスなどの合金、熱伝導性の各種樹脂類が例示できる。なかでも安定性、熱伝導性に優れることから、金属又は合金が好ましく、アルミニウムが特に好ましい。

温調手段４の配置位置は、前記蛍光物質の基板裏面２２からの励起と、蛍光物質の励起により生じた蛍光の検出を妨げないものであれば、特に限定されない。例えば、励起光６１と検出すべき蛍光２００及び２０１を遮らない位置に配置することが好ましく、さらに基板２又は前記介在物との接触面積を大きくするために、基板の表面２１側及び裏面２２側のいずれか一方又は双方に配置することがより好ましい。

図１（ｂ）に示す温調手段４は、基板の表面２１側に配置されている。
ここで温調手段４はプレート状であり、その基板２と対向する面４１を基板表面２１と接触させて配置した際に、溶液２０又は被覆液２５が温調手段４と接触しないように、試料保持部及びその近傍と一致する部位に、凹部４１０、４１０・・が複数個形成されている。すなわち、温調手段４を基板２と接触させて配置した時に、基板２上の溶液２０は被覆液２５の有無によらず、試料保持部ごとに基板２と温調手段４とで封止される。ここで「試料保持部及びその近傍」とは、基板表面２１のうち、被覆液２５が載せられている領域よりもわずかに大きい領域のことを指す。このようにすることで、例えば、核酸増幅時における溶液２０への汚染物質の混入が確実に防止され、隣接する溶液２０、２０・・間のコンタミネーションが確実に防止される。また、被覆液２５を使用した場合には、仮にその破裂や飛散が生じても、隣接する溶液２０、２０・・間のコンタミネーションが確実に防止される。さらに、温調手段４と基板２との接触面積を大きくできると共に、溶液２０からの放熱も抑制されるので、基板２の温度調節を短時間で高精度に行うことができる。したがって、核酸増幅をより高精度に行うことができる。
なおここでは、試料保持部一つごとに溶液２０を封止する例を示したが、これに限定されず、複数の試料保持部ごとにまとめて溶液２０、２０・・を封止するようにしても良く、その場合、凹部４１０、４１０・・は、封止単位に応じて、その大きさを大きくすれば良い。
凹部４１０の形状は特に限定されず、円柱状、角柱状等から任意に選択できる。

温調手段は基板の裏面２２側及び／又は側面２３側に配置されていても良い。
したがって、温調手段をステージ３と一体化させれば、装置の構造を簡略化できる点で好ましい。
温調手段をステージと一体化させたものとしては、図３に示したステージ３のうち、基板２との接触部位を温調手段としたものが例示できる。具体的には、底板部３１の一部（例えば、３１１ａ、３１１ｂ）又は全体を温調手段としても良いし、外枠部３２の一部（例えば、３２１ａ）又は全体を温調手段としても良い。あるいは、これらを組み合わせても良い。このようにすることで、基板２をその裏面２２側及び／又は側面２３側から温度調節できる。

温調手段は、基板の裏面２２側及び／又は側面２３側に加え、さらに表面２１側に配置されていても良い。
したがって、例えば図４において、上記と同様にステージ３を温調手段と一体化させても良い。

温調手段４は、図１に示すように、コンピュータ１５に電気的に接続されていることが好ましい。このように制御手段に接続することで、核酸増幅時における温度、時間、サイクル数などを自動で制御できる。これにより、膨大な数のサンプルも迅速に処理できる。

図１（ｂ）に例示したように、温調手段４を基板の表面２１側に配置する場合には、温調手段４を基板２に接触させて温度調節する際に、これらの接触面の間に気密性部材を介して密着させると良い。このような例を図４に例示する。図４は、基板２、気密性部材５及び温調手段４の配置形態を例示する図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における断面図である。
このようにすることで、温調手段４と基板２との間の密着性を一層向上させることができ、溶液２０を一層確実に封止できる。
気密性部材５の材質としては、シリコンゴム、エラストマー、グリース等、公知の気密性材料が例示でき、これらの中から目的に応じて適宜選択できる。
なおここでは図示を省略するが、このような気密性部材は、前記ステージ３と基板２との接触面の間に介在させて、密着させても良い。このようにすることで、ステージ３へ基板２を安定して固定できる。また、ステージ３が温調手段と一体化されている場合には、ステージ３から基板２への熱伝導率が向上するので、基板２の温度調節を効率的に行うことができる。

本発明において、基板２は、その配置位置を移動可能とされていることが好ましく、ステージ３に支持された状態のまま移動可能とされていることがより好ましい。すなわち、ステージ３が移動可能とされていることがより好ましい。移動方向は基板表面２１に対して垂直な方向及び平行な方向のいずれか一方又は双方であり、少なくとも基板表面２１に対して平行な方向に移動可能とされていることが好ましい。
例えば、基板２を画像撮影する際に、撮影可能な範囲が狭くて基板２上のすべての蛍光像を一度に撮影できない場合には、複数回に分けて画像撮影する必要がある。このような場合でも、基板２がその表面２１に対して平行な方向に移動可能であれば、焦点調整を行うことなく、すべての蛍光像を容易に撮影できる。

また、温調手段４も、その配置位置を移動可能とされていることが好ましく、ステージ３と連動して移動可能とされていることがより好ましく、ステージ３と一体に移動可能とされていることが特に好ましい。ここで、「温調手段４がステージ３と連動して移動可能」とは、「ステージ３の移動と共に温調手段４が移動可能であり、ステージ３の移動方向と温調手段４の移動方向は必ずしも一致しない」ことを指す。一方、「温調手段４がステージ３と一体に移動可能」とは、「ステージ３の移動と共に温調手段４が移動可能であり、ステージ３の移動方向と温調手段４の移動方向が一致する」ことを指す。例えば、温調手段４がステージ３と一体化されている場合は、後者に該当する。
温調手段４がステージ３と連動して又は一体に移動可能とされていることで、移動時の操作を簡略化でき、温調手段４がステージ３と一体に移動可能とされていることで、さらに移動後の配置位置の調整を温調手段４とステージ３とで別々に行う必要がなく、操作を一層簡略化できる。

また、温調手段をステージとは別途に設ける場合には、温調手段はステージに対して配置位置が移動可能とされていることが好ましい。このようにすることで、ステージへの基板の着脱を容易に行うことができる。

温調手段４は、基板２に接触して熱を伝導する部位を、所望の形状に成形すること以外は、公知の加温冷却装置等と同様に作製できる。

基板２、ステージ３、温調手段４を移動させる移動手段は、公知の如何なるものでも良く、目的に応じて選択すれば良い。温調手段がステージに一体化されている場合には、言うまでもなく移動手段は一つのみを備えれば良い。

移動手段は、後記するように、コンピュータ１５に電気的に接続されていることが好ましい。このように制御手段に接続することで、蛍光検出時の基板２、ステージ３、温調手段４等の配置位置や、移動の時期及び時間等を自動で制御できる。これにより、膨大な数のサンプルも迅速に処理できる。

次に、増幅核酸の検出に関わる構成について説明する。
増幅核酸の検出に関わる構成は、図１に示すように、おもに光源６、励起フィルタ７、ダイクロイックミラー８、対物レンズ９、発光フィルタ１０、結像レンズ１１、反射鏡１２、検出手段１３、暗箱１４を含む。これらは、通常の蛍光検出装置において使用されるもので良い。

光源６としては、例えば、ハロゲンランプ、キセノンランプが使用できる。

励起フィルタ７は、光源６からの照射光６０のうち、励起対象の蛍光物質を励起できる特定範囲の波長の光のみを透過させて励起光６１とするものであり、蛍光物質の種類に応じて選択すれば良い。そして、反射光や迷光から生じるゴースト像の発生を防止するために、蛍光物質を励起する波長範囲以外の光を精度良く減衰させるものが好ましく、例えば、蛍光物質としてサイバーグリーンを使用する場合には、４８８nm近傍を中心とする波長帯域の光を透過させるものが好ましい。

ダイクロイックミラー８は、励起光６１を反射してこれを蛍光物質に導くと共に、蛍光物質が発した蛍光２００を透過させてこれを発光フィルタ１０に導く。ここでは、ダイクロイックミラーとして、励起光６１を反射し蛍光２００を透過させるものを例示しているが、検出装置の光学構成に応じて、例えば、励起光６１を透過させ蛍光２００を反射するものを使用しても良い。

対物レンズ９は、ダイクロイックミラー８で反射された励起光６１を通過させ、基板２にその裏面２２から励起光６１を照射する。そして、蛍光物質が発した蛍光２００を通過させる。

発光フィルタ１０は、蛍光２００の特定範囲の波長の光のみを透過させ検出すべき蛍光２０１とするものであり、蛍光物質の種類に応じて選択すれば良い。そして、反射光や迷光から生じるゴースト像の発生を防止するために、目的とする波長範囲以外の蛍光を精度良く減衰させるものが好ましく、例えば、蛍光物質としてサイバーグリーンを使用する場合には、５２２nm近傍を中心とする波長帯域の光を透過させるものが好ましい。

前記のように蛍光物質としてサイバーグリーンを使用する場合には、ダイクロイックミラー８は、４８８ｎｍと５２２ｎｍの中間程度の波長、例えば、５００ｎｍ近傍の波長で、透過及び反射の切り替えを行うと良い。

検出手段１３は、結像レンズ１１及び反射鏡１２を介して蛍光２０１を撮影するものであり、ＣＣＤカメラ等、画像撮影機能を有するものであればいずれでも良い。
また、検出手段１３は、図１に示すように、コンピュータ１５に電気的に接続されていることが好ましい。このように制御手段に接続することで、例えば、検出時の撮影回数、撮影タイミング、露光時間等を自動で制御できる。これにより、膨大な数のサンプルも迅速に処理できる。また、このように情報処理手段に接続することで、蛍光の検出結果に基づいて、蛍光増幅核酸の増幅量を自動で算出できる。これにより、検出結果から得られる膨大な量の情報を迅速に処理でき、所望の情報を効率的且つ高精度に入手できる。

本発明においては、図１に示すように、暗箱１４を設けることが好ましい。このようにすることで、正確に特定範囲の波長の励起光６１を照射でき、蛍光検出を高精度に行なうことができる。また、暗箱１４を使用する代わりに、蛍光検出を暗室内で行っても良いし、暗幕を使用して蛍光検出を行っても良い。

本発明においては、励起フィルタ７に代わり、励起光を透過させるダイクロイックミラーを使用しても良いし、発光フィルタ１０に代わり、蛍光を透過させるダイクロイックミラーを使用しても良い。
また、図１では図示を省略しているが、例えば、照明用や撮影用の光学系（光学レンズ等）を検出装置に追加しても良い。

上記のように、コンピュータ１５は、装置の制御及び情報処理に関わる構成である。
蛍光の検出に際しては、核酸増幅時における温度、時間、サイクル数等の増幅条件；蛍光検出時における基板２、ステージ３、温調手段４等の配置位置や、移動の時期及び時間等の装置の配置条件；検出時における検出手段１３の撮影回数、撮影タイミング、露光時間等の検出条件；蛍光増幅核酸の増幅量算出時における算出条件等を設定しておくことで、蛍光増幅核酸の検出及び定量を自動で行うことができる。

なお、本発明の検出装置においては、本発明の効果を損なわない範囲において、上記構成の一部を削除又は変更しても良いことは、言うまでも無い。

本発明の検出装置１においては、基板２平面上で保持された溶液２０中の蛍光増幅核酸を検出できるので、テレセントリックな光学系を備えなくても高精度に増幅核酸を検出できる。また、基板２と溶液２０との接触面で焦点調整を行うので、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にでき、溶液２０ごとに焦点調整を行う必要がない。したがって、装置の小型化と安価な作製が可能である。

＜検出方法＞
本発明に係る蛍光増幅核酸の検出方法は、一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出方法であって、表面に平面状の試料保持部が設けられた透光性の基板の温度を調節し、前記試料保持部において蛍光標識核酸を増幅する工程と、得られた蛍光増幅核酸中の蛍光物質を、前記基板の裏面から励起する工程と、前記蛍光物質の励起により生じた蛍光を検出する工程と、を有することを特徴とするものである。
本発明の検出方法においては、上記本発明の検出装置を使用することにより、核酸増幅を検出装置の試料保持部で行いながら、得られた反応液中の蛍光増幅核酸をリアルタイムで検出できる。

本発明の検出方法においては、核酸増幅は、前記基板を使用してその試料保持部で行うこと以外は公知の方法で行うことができる。例えば、基板の温度調節を特定の温度サイクルで行うことができるので、ＰＣＲ法等の核酸増幅法も容易に適用できる。
また蛍光の検出も、前記基板を使用して、蛍光物質の励起を該基板の裏面から行うこと以外は、公知の方法で行うことができる。
なお、本発明において「蛍光物質を基板の裏面から励起する」ためには、基板の裏面側から蛍光物質に励起光を照射すれば良く、必ずしも光源や励起フィルタ等の励起手段を基板の裏面側に配置する必要性はない。例えば、励起手段を基板の表面側に配置し、照射した励起光を、反射鏡等を用いて導くことで基板の裏面側から蛍光物質に照射しても良い。

試料保持部に保持する蛍光増幅核酸の溶液の量は、目的に応じて設定すれば良いが、試料保持部の平面上に溶液を保持するので、極微量としても高精度に蛍光増幅核酸を検出できる。例えば、図２に示すような基板を使用する場合には、溶液の量は０．１〜５μＬであることが好ましく、０．２〜３μＬであることがより好ましく、０．５〜２μＬであることが特に好ましい。
また被覆液の量は、蛍光増幅核酸の溶液を被覆できる範囲で選択すれば良いが、例えば、蛍光増幅核酸の溶液の量が上記範囲である場合には、１〜１０μＬであることが好ましく、２〜８μＬであることがより好ましく、４〜６μＬであることが特に好ましい。

核酸増幅は、先に述べたように、気密性部材を用いるなどして溶液を封止して温度調節することにより、より高精度に行うことができる。

本発明の検出方法においては、蛍光を検出する工程に次いで、該検出結果に基づいて、蛍光増幅核酸の増幅量を算出する工程を有することが好ましい。
蛍光増幅核酸は、溶液中の蛍光物質を励起することにより生じた蛍光を検出することで、検出できる。したがって、その時の蛍光強度から、蛍光増幅核酸の増幅量を算出できる。

基板の温度調節を特定の温度サイクルで行う場合には、温度サイクルごとに、蛍光増幅核酸の増幅量を一回又は二回以上算出することが好ましい。このように増幅核酸をリアルタイムで定量することにより、鋳型として使用した核酸の増幅反応前の量を迅速且つ高精度に定量できる。
蛍光増幅核酸の増幅量を算出する回数は、状況に応じて選択すれば良い。

本発明の検出装置が、基板を移動させる移動手段を備えている場合には、基板を移動させながら蛍光を検出すると、効率的な検出が可能となる場合がある。例えば、上記のように、基板上のすべての蛍光像を一度に撮影できない場合には、基板をその表面に対して平行な方向に移動させながら複数回に分けて画像撮影でき、撮影時ごとに焦点調整を行う必要がないので、基板上のすべての蛍光像を容易に撮影できる。

次に、図１に示す検出装置を使用した場合の本発明の検出方法について、具体的に説明する。
光源６からの照射光６０は、励起フィルタ７によって、特定範囲の波長の光のみが透過して励起光６１となり、ダイクロイックミラー８によって反射され、対物レンズ９を通過して、基板の裏面２２から蛍光物質に照射される。
励起光６１の照射により生じた蛍光２００は、対物レンズ９、ダイクロイックミラー８を通過し、発光フィルタ１０によって、蛍光２００の特定範囲の波長の光のみが透過して、検出すべき蛍光２０１となる。蛍光２０１は結像レンズ１１、反射鏡１２を通過して、検出手段１３によって撮影される。

本発明の検出方法においては、基板２と溶液２０との接触面で焦点調整を行うので、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にできる。よって、検出操作の簡略化が可能であり、検出に供する溶液量も極微量にできるので、極微量の蛍光増幅核酸も高精度に検出できる。
以上のように、本発明によれば、極微量の蛍光増幅核酸を、省スペースで低コスト且つ簡便に、しかも高精度に検出できる。

以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
図１に示す検出装置を使用して、ＲＮＡのＰＣＲ増幅を行い、蛍光増幅ＲＮＡをリアルタイムで検出した。
＜１．操作手順＞
（１）以下に示す組成の、ＲＮＡ濃度が異なる５種類の核酸増幅用溶液１μｌを、図２に示す構成のＡｍｐｌｉＧｒｉｄ・ＡＧ４８０（商品名、Ａｄｖａｌｙｔｉｘ社製、以下、基板と略記する）の各試料保持部に分注した。各核酸増幅用溶液中の最終ＲＮＡ濃度はそれぞれ、 １００ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、１００ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌである。
（核酸増幅用溶液）
（ａ）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）；０．５μｌ
（ｂ）２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）； １２．５μｌ
（ｃ）ＧＡＰＤＨ ｕｐｐｅｒ ｐｒｉｍｅｒ；０．５μｌ
（ｄ）ＧＡＰＤＨ ｌｏｗｅｒ ｐｒｉｍｅｒ；０．５μｌ
（ｅ）Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ；７．０μｌ
（ｆ）ＲＮＡ（１６ｎｇ／μｌ、１．６ｎｇ／μｌ、１６０ｐｇ／μｌ、１６ｐｇ／μｌ、１．６ｐｇ／μｌ）；４．０μｌ
（ａ）〜（ｆ）計；２５．０μｌ

（２）次いで、核酸増幅用溶液の蒸発を防ぐために、前記基板付属のシーリングソリューション５μｌを用いて、核酸増幅用溶液をそれぞれ被覆した。
（３）（２）で調製した基板を測定装置のステージ上に載置し、手動にて温度制御部を基板上に設置した。

（４）以下の加温冷却サイクルをコンピュータに入力し、核酸増幅反応を行った。
（加温冷却サイクル）
５５℃／３０分 → ９４℃／２分 → （９４℃／１５秒 → ５５℃／３０秒 → ６８℃／３０秒）×５０サイクル → ２５℃

（５）（４）の核酸増幅反応中の各サイクル６８℃の工程にて、基板裏面に励起光を照射して、ＣＣＤカメラにて基板上の全反応領域を一度に撮影した。本実施例では、蛍光物質としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いているので、ＧＦＰ領域の励起光を照射した。
（６）（５）で得られた撮影画像における各反応領域の蛍光強度を、カイネティックコンピュータを用いて算出した。算出結果を図５に示す。

＜２．結果＞
図５から明らかなように、ＲＮＡ濃度と核酸増幅速度は比例していることが確認された。

このように、本発明によれば、基板平面上で保持された溶液中の蛍光増幅核酸を検出するので、テレセントリックな光学系を備えなくても高精度に増幅核酸を検出できる。また、基板と溶液との接触面で焦点調整を行うので、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にでき、溶液ごとに焦点調整を行う必要がない。したがって、検出装置を小型化できると共に安価に作製できる。さらに、焦点位置を溶液量に影響されることなく一定にできるので、検出操作の簡略化が可能であり、検出に供する溶液量も極微量とすることが可能である。したがって、極微量の蛍光増幅核酸も高精度に検出できる。

本発明は、核酸の増幅反応を必要とするゲノム研究に利用可能である。

本発明に係る蛍光増幅核酸の検出装置を例示する図であり、（ａ）は概略構成図、（ｂ）は基板、ステージ及び温調手段を拡大して示す拡大断面図である。 溶液を保持した状態の本発明における基板を例示する図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＩＩ−ＩＩ線における断面図である。 本発明におけるステージを例示する図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ−ＩＩＩ線における断面図である。 本発明における基板、気密性部材及び温調手段の配置形態を例示する図であり、（ａ）は上面図、（ｂ）は（ａ）のＩＶ−ＩＶ線における断面図である。 実施例における蛍光強度の算出結果を示すグラフである。

符号の説明

１・・・検出装置，２・・・基板、２０・・・蛍光増幅核酸溶液、２１・・・基板表面、２２・・・基板裏面、２００，２０１・・・蛍光、２１０・・・試料保持部、２１１・・・第一親水性領域、２１２・・・第一撥水性領域、２１３・・・第二親水性領域、２１４・・・第二撥水性領域、２５・・・被覆液、３・・・ステージ、４・・・温調手段、５・・・気密性部材、６・・・光源、６１・・・励起光、１３・・・検出手段、１５・・・制御手段

Claims (18)

1. 一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出装置であって、
   前記蛍光増幅核酸の溶液を保持する、平面状の試料保持部が表面に設けられた透光性の基板と、
   前記基板の温度を調節する温調手段と、
   前記基板の裏面から励起光を照射して前記蛍光物質を励起する励起手段と、
   蛍光を検出する検出手段と、
   を備えることを特徴とする蛍光増幅核酸の検出装置。
2. 前記基板表面に、試料保持部である第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
3. 前記基板において、さらに前記第一撥水性領域の外側周縁部を包囲する第二親水性領域と、該第二親水性領域の外側周縁部を包囲する第二撥水性領域とが設けられていることを特徴とする請求項２に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
4. 前記基板の表面側及び／又は裏面側のうち、励起光及び検出すべき蛍光を遮らない位置に、前記温調手段が配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
5. 前記基板の表面が、試料保持部及びその近傍を除いて、前記温調手段の基板と対向する面に、気密性部材を介して密着されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
6. さらに、前記検出手段による検出結果に基づいて、前記蛍光増幅核酸の増幅量を算出する情報処理手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
7. さらに、前記基板をその表面に対して平行な方向に移動させる移動手段を備えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
8. 前記温調手段、検出手段、情報処理手段及び移動手段が、これらを制御する制御手段と電気的に接続されていることを特徴とする請求項７に記載の蛍光増幅核酸の検出装置。
9. 一種又は二種以上の蛍光物質で標識された増幅産物である蛍光増幅核酸の検出方法であって、
   表面に平面状の試料保持部が設けられた透光性の基板の温度を調節し、前記試料保持部において蛍光標識核酸を増幅する工程と、
   得られた蛍光増幅核酸中の蛍光物質を、前記基板の裏面から励起する工程と、
   前記蛍光物質の励起により生じた蛍光を検出する工程と、
   を有することを特徴とする蛍光増幅核酸の検出方法。
10. 前記基板表面に第一親水性領域と、該第一親水性領域周縁部を包囲する第一撥水性領域とからなる前記試料保持部を設け、該試料保持部に前記蛍光増幅核酸の溶液を保持することを特徴とする請求項９に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
11. 前記試料保持部の蛍光増幅核酸の溶液を、該溶液よりも比重が小さく且つ沸点が１００℃以上である非水溶性の液体で被覆することを特徴とする請求項１０に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
12. 前記基板の表面側及び／又は裏面側のうち、励起光及び検出すべき蛍光を遮らない位置から、前記基板の温度調節を行なうことを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
13. 前記基板の表面を、試料保持部及びその近傍を除いて、基板の温度調節を行う温調手段の前記基板と対向する面に気密性部材を介して密着させ、前記蛍光増幅核酸の溶液を封止することを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
14. 前記蛍光を検出する工程に次いで、該検出結果に基づいて、前記蛍光増幅核酸の増幅量を算出する工程を有することを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
15. 前記基板の温度調節を特定の温度サイクルで行うことを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
16. 温度サイクルごとに、前記蛍光増幅核酸の増幅量を一回又は二回以上算出する工程を有することを特徴とする請求項１５に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
17. 前記蛍光を検出する工程において、前記基板をその表面に対して平行な方向に移動させ、該基板上のすべての蛍光を検出することを特徴とする請求項９〜１６のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。
18. 前記基板の温度調節及び移動、蛍光の検出、並びに前記蛍光増幅核酸の増幅量の算出を、これらを制御する制御手段を介して行うことを特徴とする請求項９〜１７のいずれか一項に記載の蛍光増幅核酸の検出方法。

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