JP2005195582A - 微細流体検出のための蛍光検出器 - Google Patents

Abstract

【課題】 微細流体チップの所定体積を有するマイクロチャンバ内で起こる反応をリアルタイムで検出することができる超小型蛍光検出器を提供する。
【解決手段】 所定の体積を有するマイクロチャンバを備える微細流体チップ内で反応するＰＣＲ増幅をリアルタイムで測定するために、励起光を発生する光源と、所定のスポットサイズを有する励起光を、マイクロチャンバに照射することが可能な第１の光学系機構と、第１の検出器及び所定のスポットサイズを有する励起光によりマイクロチャンバ内で誘導された蛍光ビームを第１の検出器に反射させる第２の光学系機構と、を含む。これにより、光源から発生される光が第１のミラーと対物レンズとの間でフォーカシングするように設計されることによって、対物レンズを通過した励起ビームのスポットサイズを広く形成して微細流体チップのマイクロチャンバの全体に励起光を照射することができ、より広い面積で蛍光ビームを検出することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、微細流体検出のための蛍光検出器に関する。より詳しくは、微細流体素子内で微細流体の反応をリアルタイムで検出することができる超小型蛍光検出器に関する。

微細流体チップは、フォトリソグラフィや高温−エンボッシング（ｈｏｔ−ｅｍｂｏｓｓｉｎｇ）、モールディングなどの微細加工技術によって形成された微細チャンネル構造に蓋をかぶせて微量の流体を保管するか或いは調節させるためのチップであり、消耗される試薬の量を減らして分析時間を短くすることができるという長所を有している。

特に、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）において、ＤＮＡ変性、アニーリング、及び延長反応の過程でそれぞれ異なる温度が要求されるときに、上記の反応は温度サイクルが反復されながら遂行される。この場合、反応体積を小さく反応面積を広くすることによって、マイクロチャンバ内の温度を早く変換させて、温度サイクルのサイクル時間を短縮することができる。

ＰＣＲ反応をリアルタイムで検出する方法として、あらゆる方法があるが、現在、蛍光検出法が使用されることが多い。また、蛍光検出法として、ダイを用いる方法と、ＴａｑＭａｎ（登録商標）方法など多様な方法が開発されている。ダイを用いる方法において、ＰＣＲ反応により二本鎖ＤＮＡに結合することによって蛍光を向上させるために、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどのダイを用いる。ＴａｑＭａｎ方法において、ＰＣＲ反応に使用されるプライマー以外に二つのプライマーの間に結合することができるＤＮＡシーケンスをプローブとして使用し、このプローブ両端において、蛍光端と発光抑制端とを結合させる。この際、ＤＮＡ合成に使用されるＴａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を使用してプローブを切断すれば、蛍光端と発光抑制端との間に結合されたＤＮＡが切断される。これにより、蛍光端と発光抑制端との結合が切断されるが、この際、発光する蛍光を分析する。

一方、このような蛍光検出法の一つとして、光ファイバを用いてチューブ内の蛍光を検出する方法がある（特許文献１）。この場合、多数のチューブ内における蛍光を一つの検出器によって検出することができるという点では有利であるものの、光ファイバに蛍光を励起させるための励起光を集光させるために、レーザのような干渉性に優れた光を発生する高価な光源を使用しなければならない。これにより、精密な光学装置が必要になって、コストが高くなるという短所がある。

一方、励起ブロックと検出ブロックとを分けて構成し、ＬＥＤ（Ｌｉｇｈｔ Ｅｍｉｔｔｉｎｇ Ｄｉｏｄｅ）を用いた励起ブロックに蛍光を励起させ、励起ブロックに対して垂直に位置する検出ブロックに蛍光信号を検出させる方法がある（特許文献２）。これによれば、モジュール化において有利であるという長所を有している。

しかし、励起と検出とを９０℃の角度をもって行うためには、励起と検出とがひし形を呈するチューブの壁面側において行われるために、チューブは充分な壁面厚さを有することが必要となり、また試料の体積が２５μｌ以上にしなければならないという短所がある。
米国特許第５９２８９０７号明細書 米国特許第６３６９８９３号明細書

本発明の技術的課題は、所定体積を有し、微細流体チップ上に配置されるマイクロチャンバ内において生じる微細流体の反応をリアルタイムで検出することができる超小型蛍光検出器を提供することである。

本発明の一類型によると、所定の体積を有するマイクロチャンバを備える微細流体チップ内で反応するＰＣＲ増幅をリアルタイムで測定するための蛍光検出器であって、励起光を発生する光源と、所定のスポットサイズを有する励起光をマイクロチャンバに照射することが可能な第１の光学系機構と、第１の検出器と、所定のスポットサイズを有する励起光によりマイクロチャンバ内で誘導された蛍光ビームを第１の検出器に反射させる第２の光学系機構と、を含む蛍光検出器が提供される。

また、本発明の他の類型によると、第１の光学系機構は、励起光の短波長成分を透過させる第１のフィルターと、光源と第１のフィルターとの間に配置されて励起光を集光するための第１のレンズと、第１のフィルターを通過した励起光の所定成分の波長を透過させ、マイクロチャンバ内で誘導された蛍光ビームを反射させる第１のミラーと、第１のミラーを透過した前記励起光を所定のスポットサイズで照射可能な対物レンズと、を含む蛍光検出器が提供される。

また、本発明の他の類型によれば、励起光は、第１のレンズにより対物レンズの前方に焦点が結ばれるように集光されることを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、第２の光学系機構は、第１のミラーから反射された蛍光ビームを第１の検出器に反射するための第２のミラーと、蛍光ビームのうち長波長成分を透過させる第２のフィルターと、第２のフィルターを透過した蛍光ビームを第１の検出器に集束するための第２のレンズと、を含む蛍光検出器が提供される。

また、本発明の他の類型によれば、第１のミラーは第１及び第２の面を備え、第１の面に励起光を透過し、蛍光ビームを反射するコーティングが形成され、第２の面は励起光と蛍光ビームとを通すことが可能であることを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、第１のミラーは第１及び第２の面を備え、第１の面に励起光を透過するコーティングが形成され、第２の面には励起光を透過し蛍光ビームを反射するコーティングが形成されていることを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、第２のミラーは、蛍光ビームのうち第１の波長を有する蛍光ビームを反射し、第２の波長を有する蛍光ビームは透過することを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、マイクロチャンバ内においてＰＣＲ反応が発生され、当該ＰＣＲ反応の間、蛍光ビームを発生させるためのダイとしてＳＹＢＲグリーンＩが用いられることを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、ＳＹＢＲグリーンＩは、Ｂ−型肝炎ウイルスをエンコーディングしたＤＮＡのＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニタリングするために用いられることを特徴とする。

また、本発明の他の類型によれば、二つ以上の波長を有する蛍光ビームを発生するようにマイクロチャンバ内に少なくとも２以上のダイが用いられることを特徴とする。

前記のように構成された本発明の望ましい実施形態によると、光源から発生される光が第１のミラーと対物レンズとの間でフォーカシングするように設計されることによって、対物レンズを通過した励起ビームのスポットサイズを広く形成して微細流体チップのマイクロチャンバ全体に励起光を照射することができ、より広い面積で蛍光ビームを検出することができる。

従って、本発明の望ましい実施形態により蛍光検出器を構成すれば、励起光をマイクロチャンバに整列することが容易であり、その他の光学部品を調節するための機構的部品を不要にするので、蛍光検出器のコストを下げることができる。

以下、添付した図面に基づき本発明の望ましい実施形態における微細流体チップ及び微細流体チップを用いて微細流体の反応を検出するための蛍光検出器を詳細に説明する。

図１に示すように、微細流体チップ１００は、試料流入口１０６と試料排出口１０８とがそれぞれに形成された上部基板１１０及び下部基板１１２を含む。反応温度を調節するため下部基板１１２にはマイクロヒータ１０２が結合される。また、上部基板１１０又は下部基板１１２において、マイクロチャンバ１０５、および試料流入口１０６と試料排出口１０８とを連結するマイクロチャンネル１０３が、フォトリソグラフィ、高温−エンボッシング、又はプラスチックモールドのような方法により形成される。

上部基板１１０と下部基板１１２とは、内部に流体が保管可能なように、アノーディックボンディングや熱的ボンディング、接着剤を用いたボンディングなどにより接合される。微細流体チップ１００は、シリコン表面に金属をパターニングしたマイクロヒータ１０２を下部基板１１２に接触させて、温度を制御することができる。温度伝達が容易なように、下部基板１１２は、シリコン、メタル、又は熱伝導率の高いプラスチック材質を使用して形成されることが望ましい。また、上部基板１１０は、蛍光検出が容易なように、ガラス透明なプラスチックなどの透明な材質によって形成されることが望ましい。

微細流体チップ１００の中央部分に形成されるマイクロチャンバ１０５の幅は、流入する試料が検出される体積を最大化させるために、試料流入口１０６および試料排出口１０８の幅より広くなっている。本発明の望ましい実施形態において、微細流体チップ１００の中央部分に形成されるマイクロチャンバ１０５の幅は１ｍｍ以上に製作される。

図２は、本発明の望ましい実施形態における蛍光検出器を説明するための概略図である。

図２に示す本発明の望ましい実施形態における蛍光検出器２００は、例えば発光ダイオードである光源２０２と、第１及び第２のレンズ２０４、２３６と、第１及び第２のフィルター２０６、２３４と、第１及び第２のミラー２０８、２３２と、対物レンズ２１０と、微細流体チップ２２０と、活性領域２４２を有するフォトダイオード２４０と、を含む。

光源２０２から発生された光は、第１のレンズ２０４により対物レンズ２１０の前方に焦点Ｆが結ばれるように集光され、光源２０２から発生した光から蛍光に干渉を与え得る長波長成分を除去するために第１のレンズ２０４と焦点Ｆとの間に第１のフィルター２０６が配置される。本発明の望ましい実施形態による第１のフィルター２０６は、励起ビーム通過フィルターと称され、短波長を通過させるフィルターやバンドパスフィルターが適用されている。

第１のフィルター２０６を通過した光のうち所定の波長成分を有する光のみが、第１のフィルター２０６と対物レンズ２１０との間に配置された第１のミラー２０８によって、対物レンズ２１０を透過され、残りの波長成分を有する光は、第２のミラー２３２へ反射される。これにより、残りの波長成分を有する励起ビームは、微細流体チップ２２０に入射されない。本発明の望ましい実施形態で、第１のミラー２０８は、ダイクロイックミラーにより形成される。

第１のミラー２０８を透過した励起ビームは、対物レンズ２１０により所定のスポットサイズで微細流体チップ２２０のマイクロチャンバ２２５に照射される。

本発明の望ましい実施形態において、微細流体チップ２２０のマイクロチャンバ２２５内に発生するＰＣＲの蛍光信号の検出について、下記の通り実施した。

＜実施例１＞
ターゲットＤＮＡの初期濃度からＢ−型肝炎ウイルスをエンコーディングしたＤＮＡのＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニタリングするために、蛍光ビームを検出するＰＣＲのマスタ混合物の組成は、下記表１の通りである。

表１に基づいて準備されたＰＣＲ溶液中１μｌを、図１に示した微細流体チップ１００の試料流入口１０６に注入することによりマイクロチャンネル１０３を通じてマイクロチャンバ１０５内に試料が流入される。

続いて、微細流体チップ１００のマイクロチャンバ１０５に蛍光検出器を整列させた後、図４Ａに示す温度プロファイルを用いてマイクロヒータ１０２を加熱し、下記の表２に記載されたＰＣＲ温度条件に従って熱周期を変化させながら実験を進めた。

図４Ｂは、ＤＮＡ増幅反応の間、本発明の望ましい実施形態による蛍光検出器を用いて蛍光信号をリアルタイムで検出した結果を説明するための図である。

図４Ｂにおいて、ＤＮＡプラスミドが複製される数に依存する温度サイクルの間、リアルタイムでフォトダイオードによって測定された蛍光ビームの値が示されている。すなわち、アニーリング区間で８秒間経過後に５秒間蛍光ビームを連続測定してＰＣＲ周期数について表示している。

図４Ｂによれば、ＰＣＲ反応の間、ＤＮＡ量が幾何級数的に増加するが、蛍光ビームは、検出限界以下では、検出されず直線に放出され、そして、蛍光ビームは、検出限界以上にＤＮＡが増幅されれば、周期に依存して幾何級数的に増加して、検出され始めることが分かる。

そして、反応するｄＮＴＰの濃度が落ちる特定周期以後には、反応速度が減速し始めながら、蛍光ビーム増加率が低下してＰＣＲ反応の典型的なＳ字曲線を示す。ＤＮＡプラスミドの複製数が増加することに応じて、幾何級数的に増加し始める周期が短くなることが分かる。

＜実施例２＞
ＳＹＢＲグリーンＩを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を検出するときには、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡが所望の部位であるか否かを確認するためにＤＮＡ変性を生じさせるメルティングカーブを描く必要がある。

図５は、微細流体チップ内において温度が上昇することによって生じるＤＮＡメルティングに伴う蛍光の減少量を、蛍光検出器で測定した結果を説明するための図である。

図５に示すように、温度が上昇する間、リアルタイムで蛍光を検出したときに、温度に依存して増幅されたＤＮＡの２本鎖がほどけて一本鎖になっていくことが把握される。従って、こうした信号を分析して得ることができる情報は、ＤＮＡのメルティング温度であり、これよりＰＣＲで増幅されたＤＮＡの２本鎖の長さが分かる。

下記の表３は、メルティングカーブを得るために実験した条件を示したものである。

再び、図２を参照すれば、本発明の望ましい実施形態によると、マイクロチャンバ２２５内の試料は、光源２０２から発生された励起光により蛍光を発し、この蛍光ビームは、対物レンズ２１０に入射された後、対物レンズ２１０によって集束されて選択される。この際、選択された蛍光ビームは、第１のミラー２０８により第２のミラー２３２へ反射された後、再び第２のミラー２３２により第２のフィルター２３４に反射される。

本発明の望ましい実施形態によると、第２のフィルター２３４は、蛍光ビーム透過フィルターであって蛍光ビームのうち長波長成分を通過させるフィルター又はバンドパスフィルターを使用した。

その後、第２のレンズ２３６は、第２のフィルター２３４を透過した蛍光ビームをフォトダイオード２４０の活性領域２４２に集束させることにより電気的信号を検出する。

図３は、本発明の望ましい他の実施形態による蛍光検出器を説明するための概略図を示す。

図３に示す本発明の望ましい他の実施形態による蛍光検出器３００は、光源３０２と、第１〜第３のレンズ３０４、３３６、３３８と、第１〜第３のフィルター３０６、３０７、３０９と、第１及び第２のミラー３０８、３１１と、第１及び第２のフォトダイオード３４０、３４４と、対物レンズ３１０及び微細流体チップ３２０と、を含む。

図２を参照して説明した蛍光検出器２００が一つの蛍光ビームを検出するように設計される一方、図３に示した蛍光検出器３００は、同時に２本以上の蛍光ビームを検出することができるように構成されるという点で相違する。

例えば、本発明の望ましい実施形態において、Ｂ−型肝炎のウイルス遺伝因子をエンコーディングしたＤＮＡを検出するためにＳＹＢＲグリーンＩダイを使用したが、その他の遺伝形質をエンコーディングしたものを検出するためにダイとしてＦＡＭ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＴＡＭＲＡ（ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などを同時に使用する場合に、蛍光検出器３００を適用することができる。

より詳しく説明すれば、本発明の望ましい他の実施形態による第１のミラー３０８は、二つ以上のダイを使用することによって発生される相異なる波長を有する蛍光ビームを全て第２のミラー３１１に反射させる。

第２のミラー３１１は、第１の波長の蛍光ビームを第２のフィルター３０７及び第２のレンズ３３６を経由して第１のフォトダイオード３４０の活性領域３４２に入射させる。

一方、第２の波長の蛍光ビームは、第２のミラー３１１を透過した後、第３のフィルター３０９を通過する。その後、第３のフィルター３０９を通過した第２の波長の蛍光ビームは、第３のレンズ３３８により、第２のフォトダイオード３４４の活性領域３４６に入射される。これにより、蛍光検出器３００は、２本以上の蛍光ビームを検出することができる。

本発明の望ましい実施形態において、４７０ｎｍ程度をピーク波長とする青色ＬＥＤを光源３０２として使用し、励起ビームパスフィルターとしての第１のフィルター３０６は、短い波長の光を透過させる短波長パスフィルターとして短波長を有する光を透過するダイクロイックフィルターを使用した。

この際、ダイクロイックフィルターは、透過させてはならない長波長の光を０〜１％程度の透過率で透過するので、背面光信号を減らすために２枚以上を使用することもできる。

また、放射光パスフィルターの場合には、フィルターを透過してフォトダイオードに到達する励起光が検出されることによって引き起される背面光信号の増加を減じるために、長波長の光を透過する一あるいは二枚のダイクロイックフィルターを使用することができ、さらに長波長の光を透過する色ガラスフィルターを追加的に使用することもできる。

本発明の望ましい実施形態において、第１のミラーは、第１及び第２の面を備えている。第１の面には、励起光を透過させて蛍光ビームを反射させるコーティングが形成され、第２の面は、励起光と蛍光ビームとを通す。しかしながら、第１の面に励起光を透過させるコーティングが形成され、第２の面に励起光を透過させて蛍光ビームを反射させるコーティングが形成されるように、第１のミラーを変形することができる。

本発明は、図面に示された実施形態を参考に説明されたが、これは、例示的なことに過ぎず、当業者なら、これより多様な変形及び均等な他実施形態に改変可能であるという点を理解できるであろう。従って、本発明の真の技術的保護範囲は、詳細な説明の範囲内で決められるのではなく、特許請求範囲で決められるものである。

本発明は、微細流体素子内で微細流体の反応をリアルタイムで検出することができる超小型蛍光検出器に係り、例えば、ＰＣＲ反応をリアルタイムで検出する方法に効果的に適用可能である。

本発明の望ましい実施形態による微細流体検出のための蛍光検出器に使用される微細流体チップを説明するための斜視図である。 本発明の望ましい実施形態における蛍光検出器を説明するための概略図である。 本発明の望ましい他の実施形態による蛍光検出器を説明するための概略図である。 ＤＮＡ増幅反応をリアルタイムで観察するための装置で時間による反応温度プロファイルを説明するための図である。 ＤＮＡ増幅反応の間、本発明の望ましい実施形態による蛍光検出器を用いて蛍光信号をリアルタイムで検出した結果を説明するための図である。 微細流体チップ内において温度が上昇することによって生じるＤＮＡメルティングに伴う蛍光の減少量を蛍光検出器で測定した結果を説明するための図である。

符号の説明

１００ 微細流体チップ、
１０２ マイクロヒータ、
１０３ マイクロチャンネル、
１０５ マイクロチャンバ、
１０６ 試料流入口、
１０８ 試料排出口、
１１０ 上部基板、
１１２ 下部基板。

Claims (13)

1. 所定の体積を有するマイクロチャンバを備える微細流体チップ内で反応するＰＣＲ増幅をリアルタイムで測定するための蛍光検出器であって、
   励起光を発生する光源と、
   所定のスポットサイズを有する前記励起光を前記マイクロチャンバに照射することが可能な第１の光学系機構と、
   第１の検出器と、
   前記所定のスポットサイズを有する前記励起光により前記マイクロチャンバ内で誘導された蛍光ビームを前記第１の検出器に反射させる第２の光学系機構と、を含むことを特徴とする微細流体検出のための蛍光検出器。
2. 前記第１の光学系機構は、
   前記励起光の短波長成分を透過させる第１のフィルターと、
   前記光源と前記第１のフィルターとの間に配置されて前記励起光を集光するための第１のレンズと、
   前記第１のフィルターを通過した前記励起光の所定成分の波長を透過させ、前記マイクロチャンバ内で誘導された蛍光ビームを反射させる第１のミラーと、
   前記第１のミラーを透過した前記励起光を前記所定のスポットサイズで照射可能な対物レンズと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
3. 前記励起光は、前記第１のレンズにより前記対物レンズの前方に焦点が結ばれるように集光されることを特徴とする請求項２に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
4. 前記第１のミラーは第１及び第２の面を備え、前記第１の面には前記励起光を透過し、前記蛍光ビームを反射するコーティングが形成され、前記第２の面は前記励起光と前記蛍光ビームとを通すことが可能であることを特徴とする請求項２に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
5. 前記第１のミラーは第１及び第２の面を備え、前記第１の面には前記励起光を透過するコーティングが形成され、前記第２の面には前記励起光を透過し前記蛍光ビームを反射するコーティングが形成されていることを特徴とする請求項２に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
6. 前記第２の光学系機構は、
   前記第１のミラーから反射された前記蛍光ビームを前記第１の検出器に反射するための第２のミラーと、
   前記蛍光ビームのうち長波長成分を透過させる第２のフィルターと、
   前記第２のフィルターを透過した前記蛍光ビームを前記第１の検出器に集束するための第２のレンズと、を含むことを特徴とする請求項２に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
7. 前記第２のミラーは、前記蛍光ビームのうち第１の波長を有する蛍光ビームを反射し、第２の波長を有する蛍光ビームは透過することを特徴とする請求項６に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
8. 第２の検出器と、
   前記第２の波長を有する前記蛍光ビームのうち長波長成分を透過させる第３のフィルターと、
   前記第２のミラーから透過された前記第２の波長を有する前記蛍光ビームを前記第２の検出器に集束するための第３のレンズと、を含むことを特徴とする請求項７に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
9. 二つ以上の波長を有する前記蛍光ビームを発生するように前記マイクロチャンバ内に少なくとも二つ以上のダイが用いられることを特徴とする請求項７に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
10. 前記二つ以上のダイは、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＦＡＭ、又はＴＡＭＲＡの中から選択されることを特徴とする請求項９に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
11. 前記マイクロチャンバ内においてＰＣＲ反応が発生され、当該ＰＣＲ反応の間、前記蛍光ビームを発生させるためのダイとしてインターカレーティングエージェント又はＴａｑＭａｎ（登録商標）が用いられることを特徴とする請求項１に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
12. 前記インターカレーティングエージェントＳＹＢＲグリーンＩであることを特徴とする請求項１１に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。
13. 前記ＳＹＢＲグリーンＩは、Ｂ−型肝炎ウイルスをエンコーディングしたＤＮＡのＰＣＲ増幅をリアルタイムでモニタリングするために用いられることを特徴とする請求項１２に記載の微細流体検出のための蛍光検出器。

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