CN113418898B - 一种pifo平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置。本发明包括LED，LED下方设有微流控芯片，微流控芯片下方设有光学滤镜组，光学滤镜组的下方设有微型光检测器。本发明适用于检测极限为～6200个miRNA拷贝的miRNA分析平台(PIFO平台)，该PIFO平台基于自由基聚合诱导的荧光关闭信号放大，并必须配备本发明装置，本发明装置用1μL血清样品可在45分钟内同时获得3种miRNA。

Description

一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置

技术领域

本发明涉及聚合放大生物传感技术，特别是一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)通常被称为“心脏病发作”，是由冠状动脉急性持续缺血缺氧引起的一种心肌损伤，是全球人类发病率和死亡率的主要原因，由于急性心肌梗死的快速发展，从就诊到治愈的前90分钟被认为是成功治疗急性心肌梗死的关键。迄今为止，血清中的高灵敏度心肌肌钙蛋白T(hs-cTnT)是急性心肌梗死诊断中最常用的生物标志物。然而，研究表明hs-cTnT只能在急性心肌梗死发病后2-4h显示明显升高的表达水平，并在24h内达到其最大浓度。因此，目前依赖hs-cTnT的诊断方法仍然缺乏早期心脏病发作的预警能力，这严重制约了急性心肌梗死的及时治疗。

miRNAs(miRNAs)一类具有17-25个核苷酸的非编码内源性核糖核酸，由于其调节基因表达的能力，参与了多种细胞过程。一些miRNAs与特定组织密切相关，例如miR-208a、miR-1、miR-499-5p和miR-133a在心脏中高度表达。更重要的是，这些miRNAs的表达水平在急性心肌梗死患者的血清样本中显著升高。使用大鼠急性心肌梗死模型的进一步详细研究证明，这些miRNAs可在1h内对急性心肌梗死作出反应，这比hs-cTnT早。这些独特的功能使miRNAs成为开发高级急性心肌梗死诊断的候选物，因为其在急性心肌梗死发病的初始阶段就做出反应。

聚合酶链式反应(PCR)被认为是寡核苷酸分析最敏感的工具，其理论检测限为单个分子，然而，其需要有经验的人员和复杂的设备来获得测试结果，工作繁琐需要几个小时，并且不适合于诸如急性心肌梗塞诊断的护理(PoC)情况，为了解决这些问题，已经开发了许多具有快速信号放大过程的小型化生物传感技术。由于聚合物和单体之间的巨大差异，包括溶解性、导电性、流变性和光学性质，基于聚合的放大已经引起了人们的极大关注。原子转移自由基聚合(ATRP)和可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)已被深入研究用于信号放大。由于它们能够生产具有明确结构和窄分子分布的聚合物，ATRP或RAFT放大生物传感技术可以成功地将核苷酸的检测限提高到aM水平。尽管灵敏度很高，但ATRP或RAFT诱导的信号放大过程很容易被氧终止，这会给生物传感系统带来干扰。此外，大多数ATRP和RAFT系统仅在45℃以上有效，信号放大步骤通常需要超过2h的反应时间。总的来说，一种新的聚合放大生物传感技术在环境中快速放大反应仍有很大的价值。

受周围环境中自由基聚合快速反应速率的启发，发明人开发了一种适用于急性心肌梗死诊断的技术，为实现该技术，提出了一种用在PIFO平台中的微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置。本发明适用于检测极限为～6200个miRNA拷贝的miRNA分析平台(PIFO平台)，该PIFO平台基于自由基聚合诱导的荧光关闭信号放大，并必须配备本发明装置，本发明装置用1μL血清样品可在45分钟内同时获得3种miRNA。

本发明的技术方案：一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，包括LED，LED下方设有微流控芯片，微流控芯片下方设有光学滤镜组，光学滤镜组的下方设有微型光检测器。

前述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置中，所述LED、微流控芯片、光学滤镜组和微型光检测器设于盒体中；所述LED设于盒体的上表面；所述微流控芯片的左部从盒体中伸出；所述光学滤镜组的后部从盒体中伸出。

前述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置中，所述微流控芯片包括其上设置的入口一和入口二，入口一和入口二经各经一微通道共同连接混合室一的入口端，混合室一的出口端连接清洁室，清洁室连接两条微通道，两条微通道共同连接出口一；所述清洁室连接一微通道，微通道连接混合室二的入口端和两条微通道，两条微通道共同连接入口三；所述混合室二的出口端连接混合室三的入口端和一微通道，微通道连接入口四；所述混合室三的出口端连接混合室四的入口端和两条微通道，其中一微通道接入口五，另一微通道连接入口六；所述混合室四的出口端连接检测室，检测室连接出口二；所述检测室设于LED和光学滤镜组之间。

前述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置中，所述清洁室连接的三条微通道、混合室二的出口端连接的微通道和混合室三的出口端连接的两条微通道上均设有调节阀。

前述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置中，所述光学滤镜组上设有三个带通滤光片；所述三个带通滤光片的中心波长分别为450nm、520nm和590nm。

前述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置中，所述LED的光源的中心波长为365nm。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:

本发明适用于检测极限为～6200个miRNA拷贝的miRNA分析平台(PIFO平台)，该PIFO平台基于自由基聚合诱导的荧光关闭信号放大，并必须配备本发明装置，本发明装置用1μL血清样品可在45分钟内同时获得3种miRNA。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是本发明在俯视方向的透视结构示意图；

图3是LED下方结构的爆炸图。

附图标记为：1-LED；2-微流控芯片；3-光学滤镜组；4-微型光检测器；5-盒体；6-入口一；7-入口二；8-混合室一；9-清洁室；10-出口一；11-混合室二；12-入口三；13-混合室三；14-入口四；15-混合室四；16-入口五；17-入口六；18-检测室；19-出口二；20-调节阀；21-带通滤光片；22-光线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，构成如图1-3所示，包括LED1，LED1下方设有微流控芯片2，微流控芯片2下方设有光学滤镜组3，光学滤镜组3的下方设有微型光检测器4。

所述LED1、微流控芯片2、光学滤镜组3和微型光检测器4设于盒体5中；所述LED1设于盒体5的上表面；所述微流控芯片2的左部从盒体5中伸出；所述光学滤镜组3的后部从盒体5中伸出。

所述微流控芯片2包括其上设置的入口一6和入口二7，入口一6和入口二7经各经一微通道共同连接混合室一8的入口端，混合室一8的出口端连接清洁室9，清洁室9连接两条微通道，两条微通道共同连接出口一10；所述清洁室9连接一微通道，微通道连接混合室二11的入口端和两条微通道，两条微通道共同连接入口三12；所述混合室二11的出口端连接混合室三13的入口端和一微通道，微通道连接入口四14；所述混合室三13的出口端连接混合室四15的入口端和两条微通道，其中一微通道接入口五16，另一微通道连接入口六17；所述混合室四15的出口端连接检测室18，检测室18连接出口二19；所述检测室18设于LED1和光学滤镜组3之间。

所述清洁室9连接的三条微通道、混合室二11的出口端连接的微通道和混合室三13的出口端连接的两条微通道上均设有调节阀20。

所述光学滤镜组3上设有三个带通滤光片21；所述三个带通滤光片21的中心波长分别为450nm、520nm和590nm。

所述LED1的光源的中心波长为365nm。

本发明的研发应用涉及过程和工作原理都在下方说明：

为解决背景技术中的问题，发明人受周围环境中自由基聚合快速反应速率的启发，发明人开发了一种适用于急性心肌梗死诊断的技术。

具体的在一种适用于急性心肌梗死诊断的技术的第一部分中，目标miRNAs序列与生物流体中的其他内容物磁性分离，并被转导至链末端带有丙烯酸的DNA转导序列。在第二部分中，丙烯酸化的DNA(DNAtr)通过DNA碱基配对被捕获到荧光标记的牛血清白蛋白表面。然后，以过硫酸铵(APS)为自由基供体，N，N′-亚甲基双(丙烯酰胺)(BISAM)为单体对牛血清白蛋白溶液进行处理，可在10分钟内形成聚合物交联网络(PCN)。在聚合过程中，荧光团标记的牛血清白蛋白将通过DNA末端的丙烯酸酯部分共价包裹在PCN中，这将进一步导致荧光团在牛血清白蛋白表面的显著猝灭。这样过程即为聚合引发的荧光熄灭(PIFO)，此外，为PIFO设计了本发明装置，本装置利用具有不同发射峰的荧光团可以产生多参数荧光淬灭信号。该PIFO平台可实现临床样本中miRNAs的高通量分析，在开发护理诊断平台方面具有巨大潜力。

具体的该技术包括下面几个部分：

1、DNA序列修饰

用于信号转导的100μL 5’端带有伯胺部分的DNA寡核苷酸(10μM)与10μL BISAM(10％)和10μL TEA(10％)混合，并在37℃下剧烈摇动孵育48h，通过氮杂迈克尔加成反应得到DNA-BISAM。所得的DNA-BISAM在37℃下与10μL PEI(10％)反应48h，得到DNA-PEI。在37℃下，将DNA-PEI与10μL BISAM(10％)反应48h，最终得到脱氧核糖核酸转移酶(DNAtr)。为了分析DNAZ转导过程，用荧光团代替BISAM，用同样的方法与DNA-PEI反应，称为脱氧核糖核酸探针DNAtrf。每一步后，用阿米康超离心过滤器纯化寡核苷酸。

2、MNP表面修饰

对于聚乙二醇二甲基醚(PEGDA)修饰的MNP(MNP-PEGDA)，将100μL PEGDA(0.1M)和100μL TEA(10％)加入到1毫升MNP-NH2(0.5mg.mL^-1)溶液中，并在37℃孵育48h。然后，将3个靶标miRNA的DNAbp(10μM，每个100μL)进一步添加到1mL MNP-PEGDA溶液(0.5mg.mL^-1)中，并在37℃孵育48h以获得DNAbp包被的MNP(MNP-DNAbp)。最后，将相应的DNAtr序列(100μL，20微米)于1毫升MNP-DNAbp溶液(0.5mg.mL^-1)在25℃孵育过夜，以获得准备用于靶miRNAs分离和转导的MNP(MNPtr)。在每一步之后，通过离心来纯化MNP。

3、BSA表面修饰

荧光团和用于信号放大的DNAtr互补序列被修饰到牛血清白蛋白表面。在典型的一步，DNAtr的互补序列与大量过量的BISAM反应，得到在5’端带有丙烯酸酯部分的DNAtrbp。然后，1毫升BSA(0.5mg.mL^-1溶于1％TEA溶液)与DNAtrbp在37℃下反应48小时，BSA的剩余伯胺基团在25℃下与10mg FITC反应过夜，用于信号放大(BSAam)。

4、实验开发

miRNAs实验包括信号转导和信号放大，如miR-208及其相应的MNPtr、DNAact和BSAam用于优化检测性能。

在miRNAs分离和转导步骤中，在25℃下，10μL miR-208a溶液与含有10mg.mL^{- 1}BISAM的10μL MNPtr溶液(0.5mg mL-1)孵育30分钟，然后，MNPtr捕获通过磁棒从混合物中分离出的的miR-208a，并用H2O反复洗涤。将捕获在MNPtr表面的纯化miRNA重新分散在含有1μM激活DNA序列(DNAact)的10μL溶液中，并在25℃下孵育30分钟，以通过竞争性DNA置换从MNP表面释放DNAtr。

在信号放大步骤中，将释放的DNAtr与2.5μL BSAam溶液在25℃下孵育30分钟。然后，将包含2％TEA的25μL BISAM(1mg.mL^-1)和25μLAPS(10mg.mL^-1)添加到混合物中，并孵育10分钟以至PCN进行信号放大。

对于实验的分析，将加扰的DNA序列(DNAscr)用作对照，并且

对DNAscr采用相同的步骤。PIFO的测量值定义为ΔF，并计算如下：

ΔF＝1–F_sample/F_scr

其中，F_sample是经靶miRNAs处理的BSAam溶液的荧光强度，F_scr是经DNAscr处理的BSAam溶液的荧光强度。

5.微流控芯片制作

标准的软光刻技术被用于微流控芯片的制造。SU-8(负性光刻胶)制造技术用于模具准备。将光致抗蚀剂旋涂到硅晶片上，并分别在65℃和95℃下烘烤。暴露于紫外线后，对微流体模具进行构图并进行化学显影。为了制备微通道，将聚二甲基硅氧烷(PDMS)与交联剂以10：1的比例混合，然后浇铸到SU-8模具上。在65℃固化4小时后，从SU-8模具中去除PDMS层。使用打孔机打出入口孔，通过等离子处理将PDMS和玻璃粘合。阀门位置组装并被塑料螺钉堵住。

此部分，涉及本装置中微型光检测器4的制作。

6、设备集成

为了在护理情况下实现微流控芯片的应用，从而涉及了本发明装置，本装置中主要包含LED1、微流控芯片2、光学滤镜组3、微型光检测器4和盒体5这几个组件。

其中，盒体5是由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)树脂通过激光切割机(Speedy100R，Trotec)制造的。

LED1是定制的LED光源(Chaoziran S&T)是使用中心波长为365nm的LED定制的。

光学滤镜组3上使用三个中心波长分别为450nm，520nm和590nm的带通滤光片21分别测量AMCA，FITC和RDMB。微型光电检测器购自基恩士公司，可分别检测三种光强度。

所得产品的尺寸为30mm(宽)×80mm(长)×40mm(高)。且该系统通过光谱仪和高精度光电探测器进行了校准。

7、微流体分析操作

本装置的操作和工作原理，简言之为：

1μL血清样品和包含1mg.mL^-1BISAM的1μL MNPtr溶液(流速：2μL.mins^-1)分别通过入口一6和入口二7加到微流体通道中。将混合物在混合室一8中充分混合，并温育10分钟以捕获靶miRNA。然后，捕获到miRNA的MNPtr溶液在磁场作用下沉淀到清洁室9的底部，并用H₂O洗涤，以通过出口一10除去血清中其他存在的生物聚合物。撤去磁场后，0.5μLH₂O和0.5μLDNAact(1μM)分别通过入口一6和入口三12装入(流速：2μL.mins^-1)微通道中。将混合物混合并在混合室二11中孵育10分钟以释放DNAtr。之后，加入0.25μLBSAam溶液(0.05mg.mL^-1)通过入口四14装入，并在混合室三13中与DNAtr反应10分钟。最后，将2.5μL APS溶液(10mg.mL^-1)和2.5μLBISAM溶液(1mg.mL^-1，包含将2％TEA)以高流速(20μLmins^-1)分别通过入口五16和入口六17泵入微通道，并与DNAtr捕获的BSAam在混合室四15中反应5分钟。通过检测室18内的荧光传感器记录混合物的荧光强度。在此过程中，调节阀20的打开/关闭状态以控制反应混合物的位置，并且将H₂O注入到微通道中以提出反应混合物。

8、临床样本处理

将新鲜采集的临床血液样本保存在无RNAase的离心管中1h，以便在室温下进行血液凝结。然后，将血样在4℃下进行3000g离心处理5分钟和12000g离心处理10分钟。收集的血清样品用0.22μm的过滤器(Millipore)过滤，并在使用前保存在-80℃中。

对于每个血清样品，将1μL生物流体进行我们的miRNA微流体分析。并将相同的步骤应用于DNAscr溶液作为对照。AMI的临床诊断是根据AMI诊断的通用指南独立进行的，该指南基于临床测试结果，包括急性缺血性胸痛，hs-cTnT水平，心电图和冠状动脉造影。

9、结论

发明人为解决背景技术中的问题，开发了检测极限为～6200个miRNA拷贝的miRNA分析平台。该PIFO平台基于自由基聚合诱导的荧光关闭信号放大，并必须配备本发明装置，本发明装置用1μL血清样品可在45分钟内同时获得3种miRNA。

利用PIFO，发明人开发了一种用于AMI诊断的高精度平台，其混合AUC为0.938。更重要的是，PIFO在hs-cTnT阴性血清样品中还显示出0.889的混合AUC。

这进一步证明了这种快速且高通量的平台不仅是PoC情况下准确AMI诊断工具的有希望的候选者，而且还能够发现对疾病预后具有高度特异性的miRNA特征。

Claims (5)

1.一种PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，其特征在于：包括LED（1），LED（1）下方设有微流控芯片（2），微流控芯片（2）下方设有光学滤镜组（3），光学滤镜组（3）的下方设有微型光检测器（4）；所述微流控芯片（2）包括其上设置的入口一（6）和入口二（7），入口一（6）和入口二（7）经各经一微通道共同连接混合室一（8）的入口端，混合室一（8）的出口端连接清洁室（9），清洁室（9）连接两条微通道，两条微通道共同连接出口一（10）；所述清洁室（9）连接一微通道，微通道连接混合室二（11）的入口端和两条微通道，两条微通道共同连接入口三（12）；所述混合室二（11）的出口端连接混合室三（13）的入口端和一微通道，微通道连接入口四（14）；所述混合室三（13）的出口端连接混合室四（15）的入口端和两条微通道，其中一微通道接入口五（16），另一微通道连接入口六（17）；所述混合室四（15）的出口端连接检测室（18），检测室（18）连接出口二（19）；所述检测室（18）设于LED（1）和光学滤镜组（3）之间。

2.根据权利要求1所述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，其特征在于：所述LED（1）、微流控芯片（2）、光学滤镜组（3）和微型光检测器（4）设于盒体（5）中；所述LED（1）设于盒体（5）的上表面；所述微流控芯片（2）的左部从盒体（5）中伸出；所述光学滤镜组（3）的后部从盒体（5）中伸出。

3.根据权利要求1所述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，其特征在于：所述清洁室（9）连接的三条微通道、混合室二（11）的出口端连接的微通道和混合室三（13）的出口端连接的两条微通道上均设有调节阀（20）。

4.根据权利要求1所述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，其特征在于：所述光学滤镜组（3）上设有三个带通滤光片（21）；所述三个带通滤光片（21）的中心波长分别为450 nm、520 nm和590 nm。

5.根据权利要求1所述的PIFO平台的由微流控芯片和荧光传感器组成的集成装置，其特征在于：所述LED（1）的光源的中心波长为365nm。

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