KR20220150637A - 현장진단용 미세유체 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 유전자 검출 방법 - Google Patents

현장진단용 미세유체 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 유전자 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층을 포함하는 기판, 및 개폐부를 포함하는 공기압 유입부, 공기압 유입부와 연통된 제 1 미세채널, 제 1 미세채널과 연통되고, 공중합체층과 대응되는 추출 챔버(Extraction chamber), 추출 챔버와 연통된 제 2 미세채널, 및 제 2 미세채널과 연통되고, 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 검출 챔버(Detection chamber)를 포함하고, 기판 상에 배치되는, 제 1 레이어(layer)를 포함하는 현장진단용 미세유체 칩, 이에 제조 방법 및 이를 이용한 유전자 검출 방법을 제공된다.

Description

현장진단용 미세유체 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 유전자 검출 방법{MICROFLUIDIC CHIP FOR POINT-OF-CARE, METHOD OF MANUFACTURING THEREOF AND METHOD FOR DETECTING GENE USING THE SAME}
본 발명은 결과를 가시적으로 확인할 수 있는 현장진단용 미세유체 칩에 관한 것이다.
분자 진단(Molecular Diagnosis)은 분자생물학적 기술을 이용하여 생체표지물질을 검출하여, 질병의 진단과 예후, 건강 상태 판정, 질병 치료 효과 판정 및 예방할 수 있는 방법이다.
이러한, 분자 진단 방법으로 종래에는 주로 특정 단백질의 유무를 항원-항체 반응을 통해 측정하는 것을 기초로 하는 면역화학적 진단 기술이 많이 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 면역 화학적 진단 방법은 표적 단백질이 감지 한계 이상의 농도로 존재하여야 표적단백질에 대한 측정이 가능하다는 한계를 가지고 있어, 진단의 정확성이 떨어진다.
이에, 유전자 증폭과정을 거치기 때문에 소량의 시료에 대해서도 매우 높은 민감도 및 특이성을 가지는 중합효소연쇄반응(PCR : Polymerase Chain Reaction) 기반의 분자 진단 방법이 더욱 각광을 받고 있다.
이러한, 분자진단방법은 체액으로부터 샘플을 채취, 채취된 샘플의 유전자 추출, 중합효소연쇄반응을 이용한 증폭 및 분석에 이르는 4가지 단계로 구성되며, 유전자 증폭과정을 거치기 때문에 극미량의 병원체에 대해서도 매우 높은 민감도 및 특이성을 갖는 정확한 진단이 가능하다.
그러나, 이러한 분자진단방법은 유전자 추출 과정에서 전기를 사용하는 고가의 대형 장비를 필요로 하며, 훈련된 인력과 오랜 시간이 요구되는 한계점을 가진다.
예를 들어, 표적 분자를 시료로부터 검출하기 위하여, 세포에서 핵산을 추출, 농축 및 정제 등의 복잡한 전처리 기술이 필수적으로 선행되어야 하며, 이러한 검출 과정에서 페놀, 클로로포름, 구아니디늄 티오시아네이트 등과 같은 독성 화학 물질의 용매를 이용하여 세포의 핵산을 용해시킴에 따라, 실험자의 안전을 위한 숙련된 기술이 요구된다. 나아가, 종래의 분자 진단의 과정은 샘플 오염의 가능성을 항상 내포하고 있음에 따라, 클린벤치와 같은 특정 작업 공간이 요구되어 공간적으로도 한계를 가지고 있다.
이에, 종래의 분자 진단 방법은, 소형화 및 단순한 과정이 요구되는 현장 진단의 적용에 어려울 수 있다.
결국, 전술한 한계점을 극복할 수 있는 간편하면서도 소형화된 유전자 분석에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 종래의 핵산 추출에서 원심 분리기를 이용하는 스핀 컬럼(spin column) 방식의 전처리 키트가 많이 이용되고 있으나, 키트를 이용하더라도 다양한 시약 및 소모품이 요구되며, 원심 분리 및 기타 장비등을 이용해야 한다. 따라서, 스핀 컬럼 방식은 장소 및 전문성이 요구되는 한계가 있다.
이에, 상기의 문제점들을 보완하기 위해 Lab-on-a-chip 상에서 전처리 및 진단을 한 번에 구현하고자 하는 다양한 시도들이 이루어지고 있다. 그러나, PCR을 위해서 제작한 칩에 맞춘 열순환 장비를 추가로 제작해야 한다는 점과 상용화된 분자진단 장비들과 호환성 및 범용성이 떨어지는 한계가 있다.
한편, 본 발명의 발명자들은, 상기와 같은 핵산 추출의 한계를 극복하기 위해, 보다 간편하여 누구나 다룰 수 있으며, 신속하게 핵산을 검출할 수 있는 방법의 필요성에 대하여 인지할 수 있었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 여러 장비가 요구되는 PCR 전처리 과정을 특별한 장비 및 시약이 없어도 수행할 수 있으며, 하나의 기판상에서 표적 유전자의 유무를 확인할 수 있는 현장진단용 미세유체 칩을 개발하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 발명자들은 화학 기상 증착법(chemical vapor depositon, CVD) 중 개시제를 이용한 화학 기상 증착 공법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)을 통하여, 핵산 추출을 위한 고분자 중합체가 기판 상에 증착이 가능하다는 것을 주목하였다.
이에, 본 발명의 발명자들은 양이온성 고분자 및 친수성 고분자로 이루어진 공중합체를 기판 상에 증착(deposition)할 경우, 독성 용매를 사용하거나 원심 분리와 같은 전처리 과정 없이도, 전술한 공중합체에 의하여 기판 상에 세포 내의 핵산이 추출 및 포획되어, 간편히 PCR에 대한 전처리 과정이 수행될 수 있다는 것을 발견하기에 이르렀다.
또한, 본 발명의 발명자들은 루프-매개 등온 증폭법 (Loop-mediated isothermal amplification assay, LAMP)에 주목하였다. 보다 구체적으로, 루프-매개 등온 증폭 방법은, 변성(denaturation). 접합(annealing) 및 신장(extension) 등의 세 가지 단계를 거치면서 온도의 변화를 주어야 하는 종래의 PCR 방법과 달리, 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하다. 예를 들어, 루프-매개 등온 증폭법은 약 60 내지 65 ℃정도 범위 내에서 한 가지 온도만 필요로 한다.
나아가, 종래의 PCR 방법은 1쌍의 프라이머만 사용되었으나, 루프-매개 등온 증폭법은 2 또는 3 쌍의 프라이머가 사용되어 보다 높은 특이도를 가질 수 있으며, 증폭 산물의 양 역시 종래의 PCR 방법보다 약 1,000배 정도 높을 수 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 루프-매개 등온 증폭법을 사용함으로써, PCR의 전처리 과정뿐만 아니라, 증폭과정 또한, 현장 진단에 적용될 수 있음을 인지하였으며, 더욱이, 본 발명의 발명자들은 이를 전술한 공중합체가 적용된 기판 상에 함께 적용할 경우, PCR에 대한 일련의 과정이 다양한 한계에 제약되지 않고, 수행될 수 있다는 것을 인지하였다.
결국, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 종래의 PCR과 달리, 비용, 인력, 시간 및 공간에 제약되지 않고, 간편하고 빠르게 표적 유전자를 검출할 수 있는 현장진단용 미세유체 칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층을 포함하는 기판, 및 개폐부를 포함하는 공기압 유입부, 공기압 유입부와 연통된 제 1 미세채널, 제 1 미세채널과 연통되고, 공중합체층과 대응되는 추출 챔버(Extraction chamber), 추출 챔버와 연통된 제 2 미세채널, 및 제 2 미세채널과 연통되고, 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 검출 챔버(Detection chamber)를 포함하고, 기판 상에 배치되는, 제 1 레이어(layer)를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩을 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 제 2 미세채널은, 개폐 밸브를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 제 1 레이어는, 제 1 미세채널과 연통된 용출 챔버(Elution chamber), 용출 챔버와 연통된 제 3 미세채널, 제 3 미세채널과 연통된 세척 챔버(Washig chamber), 및 세척 챔버와 검출 챔버와 연통된 제 4 미세채널을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 레이어 상에 배치되는 제 2 레이어를 더 포함하고, 제 2 레이어는, 추출 챔버 및 검출 챔버 중 적어도 하나와 대응되는 위치의 투입구를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 레이어는, 누름 영역, 및 누름 영역 하부에 제 2레이어의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간을 포함하는 펌핑부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 공간은, 누름 영역이 하강 압력을 받았을 경우, 공간 내의 유체가 하강 압력에 비례하여, 개폐 밸브를 개방시킬 수 있는 유체가 수용가능한 체적을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 개폐부는, 누름 영역에 대한 하강 압력이 없을 경우, 폐쇄되어 공기압 유입부에 체류하는 유체의 역류 및 누출을 차단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 기판은, 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 레이어 및 제 2 레이어는, 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 기판 상에, 특정 구조를 갖는 레이어를 형성할 수 있는 다양한 방법을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 레이어 및 제 2 레이어는, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxan, PDMS)로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 소프트리소그래피에 의하여 제 1 레이어 및 제 2 레이어를 형성할 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위는, 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS), 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-dimethylaminoethyl methacrylate, DMAEMA), 1-비닐피롤리돈(1-vinylpyrrolidinone, 1-VP), 다이에틸아미노에틸 아크릴레이트(dimethylaminoethyl acrylate, DEAEA), 다이메틸아미노에틸 아크릴레이트(2-dimethylamino ethylacrylate, DMAEA) 및 다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트 (diethylaminoethyl methacrylate, DEAMA) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 아민기를 포함할 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다. 그러나, 바람직한, 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위는 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 중합체층은, 비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 비닐기를 포함하는 단량체는, 디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE), 에틸렌글리콜 디비닐에테르(ethylene glycol divinyl ether), 프로필렌글리콜 디비닐에테르(propylene glycol divinyl ether), 부틸렌글리콜 디비닐에테르(butylene glycol divinyl ether), 1,3-디에테닐옥시 에톡시벤젠(1,3-di(ethenyloxy ethoxy)benzene), 1-메틸-1,2-디에테닐옥시 에탄(1-methyl-1,2-diethenyloxy ethane) 및 1,7-디에테닐옥시 에톡시나프탈렌(1,7-di(ethenyloxy ethoxy) naphthalene) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 비닐기를 포함하는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 공중합체층은, 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)에 의하여 배치될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 공중합체층을 기판 상에 배치 및/또는 형성할 수 있는 다양한 방법을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 루프-매개 등온 증폭 혼합물은, DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 동일 기술 분야의 PCR 과정에서 사용될 수 있는 다양한 물질을 모두 포함할 수 있다. 나아가, 종래의 PCR 혼합물은 측정하고자 하는 물질에 따라, 자유롭게 디자인 및 선택하여 사용됨에 따라, 본 발명의 루프-매개 등온 증폭 혼합물 또한, 사용자가 측정하고자 하는 표적 물질에 따라, 자유롭게 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 지시약은, 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 현장진단용 미세유체 칩을 이용하는 유전자 검출 방법으로서, 시료를 추출 챔버 내로 주입시키는 단계, 핵산의 바인딩을 위하여, 추출 챔버 내로 주입된 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계, 누름 영역을 이용하여, 인큐베이팅이 끝난 시료를 검출 챔버 내로 주입시키는 단계, 핵산의 증폭을 위하여, 검출 챔버 내로 이동된 시료를 루프-매개 등온증폭(LAMP)시키는 단계, 및 루프-매개 등온증폭이 완료된 시료의 지시제 발색을 통하여, 시료 내의 표적 유전자에 대한 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법은 시료를 용출 챔버 내로 주입시키는 단계, 시료 내의 핵산의 용출을 위하여, 용출 챔버 내로 주입된 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계, 및 누름 영역을 이용하여, 인큐베이팅이 끝난 시료를 세척 챔버 내로 주입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판 상에 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 포함하는 공중합체층을 형성하는 단계, 및 공기압 유입부, 제 1 미세채널, 적어도 하나의 추출 챔버, 제 2 미세채널, 적어도 하나의 검출 챔버를 포함하는 제 1 레이어를 공중합체층과 추출 챔버가 대응되도록 기판상에 배치하는 단계를 포함하고, 검출 챔버는, 루프-매개 등온증폭 혼합물을 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 특징에 따르면, 공중합체층은, 비닐기를 포함하는 제 2 반복 단위를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 공중합체를 형성하는 단계는, 아민기를 포함하는 단량체, 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 주입하는 단계, 아민기를 포함하는 단량체, 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 기화시키는 단계, 아민기를 포함하는 단량체 및 비닐기를 포함하는 단량체가 라디칼 중합되어, 기판 상에 증착되도록 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 공중합체를 형성하는 단계는, 루프-매개 등온증폭 혼합물을 포함하는 검출층을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 제 1 레이어 상에 제 2 레이어를 배치하는 단계를 더 포함하고, 제 2 레이어는, 추출 챔버 및 검출 챔버 중 적어도 하나와 대응되는 위치의 투입구를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 투입구를 통하여 검출 챔버에 루프-매개 등온증폭 혼합물을 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 1 레이어 및 제 2 레이어는, 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제 2 레이어는, 누름 영역, 및 누름 영역 하부에 제 2 레이어의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간을 포함하는 펌핑부를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 루프-매개 등온증폭 혼합물은, DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 지시약은, 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은, 특정 고분자를 기판 상에 균일하게 증착시켜 핵산을 추출하기 위한 현장진단용 미세유체 칩으로서, 시료에 대한 핵산을 추출 및 정제하는 과정이 종래의 방법에 비하여 보다 안전할 수 있다.
나아가, 핵산 추출 과정의 단계가 종래의 추출 방법에 비하여 축소됨으로써, 비전문가가 손쉽게 핵산을 추출할 수 있으며, 사람 개개인 별 핸들링에 의한 실험적 오차가 감소될 수 있는 효과가 있다.
더 나아가, 원심 분리 및 볼텍싱 등과 같은 실험 과정이 요구되지 않음에 따라, 어느 곳에서나 핵산 추출이 가능하여 실시간 현장진단 및 환경 모니터링 등과 같은 다양한 분야에서 보다 빠르게 진단될 수 있다.
관련하여, 일반 전처리 키트에 비해 공정 과정이 대폭 감소하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용하면 보다 간편하고 용이하게 PCR을 통한 진단을 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은, 지시약에 기초한 루프-매개 등온 증폭을 이용함에 따라, 온도를 조절하기 위한 대형의 온도 조절 장비 및, 증폭된 핵산을 확인하기 위한 형광 발현 확인용 현미경 등의 고가의 장비가 요구되지 않아, 보다 경제적일 수 있으며, 육안(가시적)으로 결과를 확인할 수 있음에 따라, 즉각적인 결과에 대한 판별이 가능하여, 별도의 장비가 구비되지 않은 임시의 선별 진료소에서도 진단이 가능할 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법에 대한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 분해 사시도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 공중합체층에 대한 단량체에 대한 예시도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 펌핑부에 대한 측면도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 상면도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 소형 온도 조절 장치의 예시도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법에 대한 순서도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 XPS 스펙트럼 결과이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 DNA 추출 및 포집 능력에 대한 결과이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 유체 이동 및 이에 따라 이동한 유체의 부피에 대한 결과이다.
도 11은 시료의 농도에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 발색 결과를 도시한 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 통한 병원체 검출 결과이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우, '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.
구성요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.
본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.
본 명세서의 해석의 명확함을 위해, 이하에서는 본 명세서에서 사용되는 용어들을 정의하기로 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, " 채널 "은 제 1 레이어에 형성된 미세채널을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 복수의 채널을 포함하며 각각의 채널들은 그 위치에 따라, 제 1 미세채널, 제 2 미세채널 등으로 분리되어 명명될 수 있지만, 각각의 채널들은 유체로 연통되는 하나의 채널로 나타날 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, " 분석 시료 "는 검출 대상물질을 포함하는 시료를 의미한다. 바람직하게, 분석 시료는 유체 시료일 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 식수 및 음식물 등과 같은 환경 시료 또한 포함될 수 있다. 나아가, 검출 대상물질은 세포 내에 존재하는 핵산일 수 있다. 그러나, 검출 대상물질은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 이용 목적에 따라 사용자에 의해 단백질 등으로 용이하게 선택될 수 있다.
더욱이, 분석 시료는, 선택적으로 그 종류에 따라 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 투입되기 전에 기계적 또는 비 기계적으로 용해 (lysis) 될 수 있다. 예를 들어, 세포 용해를 위한 기계적인 방법은, 초음파 분쇄기(sonicator), 압착기(presses) 및 고속 구슬 분쇄기(bead mills) 등에 의하여 수행될 수 있으며, 비 기계적인 방법은 리소자임(lysozyme)과 같은 효소를 이용하여, 세포벽을 용해시키거나, 동결(freezing), 삼투압 충격법(osmotic shock)을 통하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 핵산을 손상시키기 않으면서, 세포 벽을 파쇄하여 세포 내부 물질을 용출시킬 수 있는 다양한 방법이 전처리 과정으로서 모두 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, " 유체 "는 액체 또는 기체 또는 그들의 중간 상태를 의미할 수 있다. 이러한 유체는 자유로이 흐르는 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 유체의 분석 시료는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 시료 주입구로부터 검출 챔버의 방향으로 유동할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 핵산 "은 유기 염기(사이토신, 티미딘 및 우라실과 같은 치환된 피리미딘이거나, 아덴 및 구아닌과 같은 치환된 퓨린)에 연결된 당으로 이루어지는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산은 리보핵산(RNA), 디옥시리보핵산(DNA), 메틸포스포네이트 핵산, S-올리고, c-DNA, miRNA 및 압타머(aptamer) 등을 포함할 수 있으며, 천연적으로 발생하거나 인공적으로 합성된 것 모두를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 RNA 및 DNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 양이온성 폴리머 "는 수용액 상의 적정 pH에서 양성자화 성질을 가지는 폴리머 및 고체상에서 양성자 성질을 가지는 폴리머를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 단량체(monomer) "는 유기 고분자 박막 형성을 위해 사용될 수 있는 단위체를 의미한다. 또한, 단량체는 화학 기상 증착법에서 휘발성을 가지며, 개시제에 의해 활성화될 수 있는 물질로서, 감압 및 승온 상태에서 기화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 개시제(initiator) " 본 발명의 공정에서 단량체들이 고분자를 형성할 수 있도록 첫 반응의 활성화를 유도하는 물질을 의미한다. 개시제는 단량체가 열분해되는 온도보다 낮은 온도에서 열분해되어 유리 라디칼(free radical)을 형성할 수 있는 물질이 바람직하다. 개시제의 열분해에 의해 유리 라디칼이 형성되면 유리 라디칼이 단량체를 활성화시켜 이후 주변 단량체들의 중합을 유도하게 되고, 이 반응이 계속되어 유기 고분자 박막을 형성하게 된다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서 사용되는 개시제는 BPO(tert-butyl peroxide), TBPOB(t-butyl peroxybenzoate) 및 벤조페논(Benzophenone) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 유리 라디칼을 형성할 수 있는 다양한 개시제가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 용해 완충액 (lysis buffer) "은 25 ℃에서 약 6 내지 9 pH값을 유지할 수 있는 용액을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 완충액은 전형적으로 효소 활성의 기능과 조화되고, 생물학적 분자의 정상적인 생리적 및 생화학적 기능을 유지할 수 있도록 생리학적으로 조화가능한(physiologically compatible) 완충액을 의미할 수 있다. 용해 완충액은 염이나 pH 버퍼 등을 사용하지 않고 정제수가 이용될 수 있다. 이하에서 설명되는 용해 완충액은 모두 정제수만이 사용되었다. 그러나 이에 제한되지 않고, 용해 완충액에 사용될 수 있는 성분으로는 4- (2- 하이드록시에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES), 3-(N-모르폴리노)-프로판설폰산(3-morpholino propanesulfonic acid, MOPS), N-트리스-(히드록시메틸)-메틸글리신산(N-Tris-(Hydroxymethyl)-Methyl Glycine, Tricine), 트리스-(히드록시메틸)-메틸아민산(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, Tris), 피페라진-N,N’-비스(2-에탄술폰산)( piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid), PIPES), 아세테이트 및 포스페이트 함유 버퍼(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4 및 NaH2PO4) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 나아가, 용해 완충액은 프로테나아제 K, 트립신, 키모트립신, 엘라스타아제 및 스트렙토그리신 등과 같이 핵산 추출을 위하여 사용되는 프로테아제를 더 포함할 수 있다. 또한, 용해 완충액 내 버퍼 성분의 농도는 3 내지 30 mM 범위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 프라이머 (primer) "는 상보적 스트랜드의 합성이 폴리머라아제에 의하여 촉매화되는 조건 하에 있는 경우, 상보적 스트랜드를 따라 핵산의 합성 또는 복제 초기 지점으로 작용할 수 있는 합성 또는 천연 올리고뉴클레오티드를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 삽입 염료 (intercalating dye) "는 증폭 과정에서 핵산, 특히 DNA 이중 스트랜드의 주된 홈(major groove)에 결합하는 성질을 갖는 염료를 의미할 수 있으며, 증폭이 완료된 후 삽입 염료의 형광 검출에 따른 강도(intensity)를 측정함으로써 증폭 정도를 확인할 수 있다. 이때, 삽입 염료로는 STYBR green, Pico green, Hoechst 시리즈, BOBO, TOTO, YOYO, JOJO, POPO, LOLO, PO-PRO, BO-PRO, YO-PRO, TO-PRO, JO-PRO, LO- PRO 및 SYTO 시리즈 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 프로브 (probe) "는 실시간 PCR(real-time PCR) 등의 전기 화학적 검출 방식에서 이용되는 전자 방출능을 갖는 인터칼레이터(intercalator)를 의미할 수 있다. 이때, 인터칼레이터는 이중 스트랜드의 핵산에 끼어들 수 있는 임의의 물질로서, 스트렙마이신 설페이트, 젠타마이신 설페이트, 다우노루비신 하이드로크로라이신, 노갈라마이신, 독소루비신, 헤다마이신, 미토산트론, 틸로론, 퀴나크린 및 아크리딘오렌지 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 프로브 즉, TaqMan 프로브 등의 형광을 이용한 검출 방법은 5’-말단은 형광체(FAM, JOE, TET, HEX, VIC 등)로, 3’-말단은 소광제(TAMRA, DABCYL, ROX, BHQ 등)로 수식한 올리고뉴클레오타이드를 증폭 용액에 첨가하는 방법이다. TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서는 주형 핵산에 특이적으로 혼성화되지만 프로브 상의 소광제에 의하여 형광 발색이 억제된다. 연장 반응 시, Taq DNA 중합효소가 갖는 5’ → 3’ 핵산말단분해효소 (exonuclease)의 활성으로 주형에 혼성화된 TaqMan 프로브가 분해됨에 따라 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 소광제에 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.
나아가, 프로브는 증폭 용액에 첨가하여 사용되는데, 증폭에 앞서 첨가할 경우에는 프라이머가 핵산과 결합함에 있어서 프로브와 경쟁적 관계를 형성할 수 있다. 보다 구체적으로, 프로브와 표적 핵산의 혼성화에 의하여 비특이적(non-specific) 결합이 증가할 수 있다. 따라서 과량으로 사용할 경우에는 증폭 반응의 저해제로 작용될 수 있다. 반면, 프로브의 양이 일정 수준 미만인 경우에는 증폭된핵산에 비하여 불충분한 형광특성으로 인하여 원하는 검출 효과를 기대하기 어렵게 된다. 결국, 증폭 방식을 고려하여 프로브의 사용량, 기타 반응 조건을 실험적으로 적절히 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 문제 가능성을 해소하기 위하여, 예를 들면, 증폭 반응 시간을 증가시킴으로써 프로브 첨가가 증폭 반응에 미치는 영향을 억제하면서 프로브의 최대 한계 사용량을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 형광 (fluorescence) "은 전자기적 여기에 의하여 짧은 시간 동안 생성되는 발광 타입을 의미할 수 있다. 보다 구체적으로, 형광은 특정 물질이 짧은 파장에서 광 에너지를 흡수한 후에 보다 긴 파장에서 광 에너지를 방출할 때 생성되는 현상을 의미할 수 있으며, 흡수와 방출 간의 시간 길이는 통상적으로 비교적 짧은데, 예를 들어 약 10-9 내지 10-8 초 범위 내의 수준일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) "은 가열 및 냉각이 교대로 이루어지는 사이클 프로세스 또는 일정한 온도에서 이루어지는 프로세스에 의하여 하나의 최초 주형으로부터 다량의 동일한 DNA 스트랜드가 형성되는 반응을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 증폭 (amplification) "은 주형(template)으로서 핵산 분자 중 적어도 하나를 이용하여 핵산 분자에 대한 복수의 복제물 또는 핵산 분자에 상보적인 복수의 복제물을 형성하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 고정 (immobilization) "은 임의의 물질 또는 생활성제가 튜브의 벽면에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 방식에 의하여 부착되는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 기재 또는 기판 "은 표면 위에 특정 물질이 부착(고정), 코팅(도포) 및 증착 가능한 표면을 제공할 수 있는 구조 또는 구조물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 상에 " 및 " 위에 "라는 표현은, 상대적인 위치 개념을 언급하기 위하여 사용되는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 언급된 층에 다른 구성 요소 또는 층이 직접적으로 존재하는 경우뿐만 아니라, 그 사이에 다른층(중간층) 및 다른 구성요소가 개재되거나 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 " 약 " 은 문맥으로부터 달리 언급되거나 달리 명백하지 않는 한 언급된 참조 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만 내에 해당하는 값의 범위를 나타낼 수 있으나, 바람직하게는 ± 10%일 수 있다.
현장진단용 미세유체 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 유전자 검출 방법
이하에서는, 도 1 내지 7을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩 및 이의 제조 방법에 대하여 설명한다.
먼저, 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법에 대한 순서도이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 기판 상에 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 포함하는 공중합체층을 형성하는 단계(S110), 및 공기압 유입부, 제 1 미세채널, 적어도 하나의 추출 챔버, 제 2 미세채널, 적어도 하나의 검출 챔버를 포함하는 제 1 레이어를 공중합체층과 추출 챔버가 대응되도록 기판 상에 배치하는 단계(S120)을 포함한다.
이때, 검출 챔버는, DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약 중 적어도 하나를 포함하는 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, LAMP 혼합물은 공중합체층을 형성하는 단계(S110)에서 기판 상에 건조되어 검출층(detection layer)으로 형성되거나, 전술한 공중합체층을 형성하는 단계(S110) 및 기판 상에 배치하는 단계(S120) 이후, 액상의 형태로 검출 챔버 내로 주입되어 액상 형태로 사용되거나, 이후, 검출 챔버 내에서 건조 과정을 거쳐 건조되어 사용될 수 있다.
먼저, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)는 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)에 의하여 공중합체층을 형성 및/또는 배치할 수 있다. 기상 증착 공정은 고순도의 코팅층 형성, 계면 특성의 제어 용이성 등과 같은 장점을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 기상 증착 방법은 외부와 차단된 챔버 안에 기재를 넣고 증기 즉, 코팅하고자 하는 고분자의 단량체가 포함된 가스를 공급한 뒤, 에너지에 의한 라디칼 중합반응(radical polymerization)을 일으켜, 기재의 성질은 변화시키지 않고, 기재 상에 고분자를 박막으로 형성하는 방법이다. 이때, 라디칼 중합반응은 열, 플라즈마, 빛 또는 임의의 에너지를 공급하여 기체 분자를 이온화 하거나 높은 에너지 상태로 여기(Excite)시켜서, 자발적으로 화학 반응을 일으킬 수 있는 상태로 활성화시킨뒤, 단량체가 고분자로 형성하는 반응을 의미할 수 있다.
또한, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)에서 공중합체층의 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 위하여, 아민기를 포함하는 단량체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 단량체는 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS), 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-dimethylaminoethyl methacrylate, DMAEMA), 1-비닐피롤리돈(1-vinylpyrrolidinone, 1-VP), 다이에틸아미노에틸 아크릴레이트(dimethylaminoethyl acrylate, DEAEA), 다이메틸아미노에틸 아크릴레이트(2-dimethylamino ethylacrylate, DMAEA) 및 다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트 (diethylaminoethyl methacrylate, DEAMA) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS)일 수 있다.
또한, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)에서 공중합체층은 전술한 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위의 연쇄적인 결합을 위하여, 가교제가 사용될 수 있으며, 이에 따라, 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위뿐만 아니라, 비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위가 포함될 수 있다.
예를 들어, 비닐기를 포함하는 단량체는 디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE), 에틸렌글리콜 디비닐에테르(ethylene glycol divinyl ether), 프로필렌글리콜 디비닐에테르(propylene glycol divinyl ether), 부틸렌글리콜 디비닐에테르(butylene glycol divinyl ether), 1,3-디에테닐옥시 에톡시벤젠(1,3-di(ethenyloxy ethoxy)benzene), 1-메틸-1,2-디에테닐옥시 에탄(1-methyl-1,2-diethenyloxy ethane) 및 1,7-디에테닐옥시 에톡시나프탈렌(1,7-di(ethenyloxy ethoxy) naphthalene) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게, 디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE)일 수 있다.
이에, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)에서는 아민기를 포함하는 단량체, 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 주입하는 단계, 아민기를 포함하는 단량체, 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 기화시키는 단계, 아민기를 포함하는 단량체 및 비닐기를 포함하는 단량체가 라디칼 중합되어, 기판 상에 증착되도록 가열하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)는 다양한 형상 및 재질의 기재에 대하여 적용될 수 있으며, 비교적 저온(예를 들면, 약 200℃이하, 바람직하게는 100℃이하, 더 바람직하게는 50℃이하의 온도)에서 수행이 가능함에 따라, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)의 기판의 온도는 25 내지 40 ℃일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 기판의 재질 및 크기에 따라 다양한 온도로 설정될 수 있다.
또한, 공중합체층을 형성하는 단계(S110)는 내부압력이 100 내지 300 mbar일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 고분자를 증착하고자 하는 기 재에 따라 다양하게 설정될 수 있다.
나아가, 주입하는 단계에서의 아민기를 포함하는 단량체의 온도는 40 내지 50 ℃이고, 비닐기를 포함하는 단량체의 온도는 70 내지 80 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 단량체의 종류에 따라 다양하게 설정될 수 있다.
또한, 주입하는 단계에서의 아민기를 포함하는 단량체 대 비닐기를 포함하는 단량체의 몰비는, 1:1 내지 1:2일 수 있으며, 아민기를 포함하는 포함하는 단량체 대 개시제의 몰비는, 3:0.5 내지 3:3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직한 아민기를 포함하는 포함하는 단량체 대 개시제의 몰비는 3:2일 수 있다.
나아가, 가열하는 단계는 필라멘트 및 자외선에 의하여 가열될 수 있으며, 필라멘트의 온도는 120 내지 150 ℃이고, 자외선의 세기는 300 내지 500 μW/cm2일 수 있다. 즉, 중합 반응에 사용된 구동력이 빛 에너지이며, 이러한 필라멘트의 온도에서는 모노머에 대한 화학적 손상이 없기 때문에, 고분자 코팅 층 역시 단량체가 갖고 있는 다양한 관능성 그룹을 그대로 유지한 채, 고분자 코팅 층으로 전환시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 가열하는 단계에서는 필라멘트 및 자외선를 통하여 고온을 발생시키고, 발생된 고온으로 인하여 개시제가 분화되어 자유 라디칼을 생성하고, 이에 따라, 단량체가 활성화되어, 단량체들간의 결합 즉, 중합반응이 일어나 공중합체가 형성될 수 있다.
더 나아가, 가열하는 단계는, 5 내지 10분동안 수행됨에 따라, 특정 프로브를 도포하고 주입하는 종래의 미세유체 칩의 생산 과정 보다 빠르게 미세유체 칩을 생산할 수 있다.
결국, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 기상 증착 방법을 이용하여 기재 상에 고분자를 합성하는 방법이기 때문에, 다양한 기재 즉, 기판에 다양한 작용기를 가진 단량체를 적용할 수 있다는 장점이 있으며, 여러 특성을 갖는 단량체를 원하는 비율로 공중합시킬 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 기상에서 진행되는 건식 공정임에 따라, 잔여물로 인한 오염이 존재하지 않으며 기판 손상이 없다는 장점이 있다. 또한, 기상 증착 방법은 기판의 화학적 특성과 관계없이 단량체의 흡착을 온도를 통해 조절하므로 다양한 기판에 표면 전처리 없이 고분자 코팅이 가능할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 공중합체층을 형성하는 단계(110)를 포함함에 따라, 다양한 기재 상에 핵산을 포획할 수 있는 다양한 고분자를 증착할 수 있다.
그 다음, 기판 상에 배치하는 단계(S120)에서 제 1 레이어는, 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성될 수 있다. 보다 구체적으로, 소프트 리소그래피는 빛이나 큰 에너지의 입자를 사용하지 않고, 유연한 고분자 스탬프에 유기물을 묻혀 반복적으로 패턴이나 구조물을 제조하는 기술이다. 그러나, 제 1 레이어 및 후술될 제 2 레이어의 형성 방법은 몰드를 이용한 소프트리소그래피 방법에 제한되는 것은 아니며, 다양한 방법이 사용되어 형성될 수 있다.
이때, 본 발명의 제 1 레이어는 스탬프에 사용되는 유기물로서, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxan, PDMS)가 사용될 수 있다. 이러한, PDMS는 기질의 상대적으로 넓은 영역 또는 평탄하지 않은 표면에 안정적으로 점착할 수 있으며, 계면자유에너지(interfacial free energy)가 낮아서 PDMS로 다른 고분자를 몰딩하는 경우, 접착이 잘 일어나지 않는다. 또한, PDMS는 균질, 등방성이고, 광학적으로는 300 nm 두께까지는 투명하여 광학 장치를 만드는데 이용할 수 있으며, 매우 내구성이 강한 엘라스토머로서 이는 실험에서 몰딩한 PDMS 스탬프로 수 백번, 몇 달 동안이나 사용해도 눈에 띄는 분해가 일어나지 않은 것으로 알 수 있다. 또한, PDMS의 표면특성은 자기조립박막(self-assembly monolayers; SAMs)의 형성에 의해 생기는 플라즈마의 조절에 의해서 쉽게 개질될 수 있고, 이는 물질 간 적절한 계면 상호작용에 의해서 계면 에너지값이 넓은 영역에 걸쳐 나타날 수 있다. 이에, PDMS는 나노 스케일의 패턴을 구현할 수 있으며, 이에 따라, 본 발명의 제 1 레이어는 다른 패턴을 통하여 형성된 기재보다 정교하고 세밀한 구조를 가질 수 있다.
이에, 기판 상에 배치하는 단계(S120)는 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 미리 형성된 제 1 레이어를, 기판 상에 배치하거나, 일정 모양의 양각 또는 음각으로 형성된 스탬프에 PDMS를 묻혀 기판 상에 제 1 레이어 층의 패턴을 형성하는 단계일 수 있다.
예를 들어, 스탬프를 이용하여 기판 상에, 바로 제 1 레이어를 형성할 경우, 기판 상에 배치하는 단계(S120)는 표면에 PDMS가 묻혀진 양각 또는 음각으로 형성된 소프트 몰드를 소프트 몰드에서 추출 챔버에 해당하는 부분이 기판 상의 공중합체층과 대응되도록 위치시키는 단계 및 PDMS가 묻혀진 소프트 몰드를 기판 상부에 찍어서, PDMS로 구성된 미세 패턴 즉, 기압 유입부, 제 1 미세채널, 적어도 하나의 추출 챔버, 제 2 미세채널, 적어도 하나의 검출 챔버를 포함하는 제 1 레이어를 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
그러나, 전술한 패턴 형식의 방법은, 패턴을 형성한 뒤, 이의 안정적인 배치를 위하여, 광 조사 및 플라즈마 처리와 같은 후속 과정이 수행될 수 있다. 이에, 기판, 기판 상의 고분자 층 및 다양한 물질 층이 손상될 수 있음에 따라, 기판 상에 배치하는 단계(S120)는 바람직하게 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 제 1 레이어를 미리 제조한 뒤, 이를 기판 상에 조립되어 수행될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 기판 상에 배치하는 단계(S120)에서 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 이용함에 따라, 나노크기의 구조를 신속하고 경제적으로 제조할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 제 1 레이어와 동일한 방법으로 제 1 레이어 상에 제 2 레이어를 배치하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이때, 제 2 레이어는 추출 챔버 및 검출 챔버 중 적어도 하나와 대응되는 위치의 투입구를 포함할 수 있으며, 누름 영역, 및 누름 영역 하부에 제 2 레이어의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 제 2 레이어에 형성된 투입구를 통하여 검출 챔버에 루프-매개 등온증폭 혼합물을 주입하는 단계를 더 포함 수 있다. 이에, 액상 형태의 혼합물이 검출 챔버에 주입되어, 혼합물이 액상 형태로 챔버 내에 존재할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법은 전술한 과정을 통하여, 정교한 나노 또는 마이크로 단위의 형상 및 구조를 가진 현장진단용 미세유체 칩을 빠르고 경제적으로 제작하여 제공할 수 있다.
도 2는 전술한 과정을 통하여 제작된 현장진단용 미세유체 칩에 대한 분해 사시도이다. 이때, 설명의 편의를 위하여 도 3 내지 6을 참조하여 설명한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 핵산을 포함하는 시료 내의 핵산을 측정하기 위한 구조물로서, 기판(100) 및 제 1 레이어(200)를 포함할 수 있으며, 제 1 레이어(200) 상에 배치되는 제 2 레이어(300)를 더 포함할 수 있다.
먼저, 기판(100)은, 폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는, 유리일 수 있다.
예를 들어, 기판(100)은, 플라스틱에 의한 습기 흡수가 문제가 되지 않을 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 ABS, 아세탈(acetal), 아크릴섬유(acrylic), 아크릴로니트릴(acrylonitrile), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellulose), 알킬비닐 알코올(alkylvinylalcohol), 폴리아릴에테르에톤(polyaryletherketone), 폴리에테르에테르케톤(polyetheretherketone), 폴리에테르케톤(polyetherketone), 멜라민 포름알데히드(melamine formaldehyde), 페놀 포름알데히드(phenolic formaldehyde), 폴리아미드(polyamide, 예를 들면: 나일론6, 나일론 66, 나일론 12), 폴리아미드-이미드(polyamide-imide), 폴리디시클로펜타디엔(polydicyclopentadiene), 폴리에테르-이미드(polyether-imide), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 폴리이미드(polyimide), 폴리페닐렌옥사이드(polyphenyleneoxide), 폴리프탈아미드(polyphthalamide), 메틸메타크릴레이트(methylmethacrylate), 폴리우레탄(polyurethan), 폴리설폰(polysulfone), 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 및 비닐 포말(vinyl formal)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 습기 흡수가 문제가 될 경우, 바람직하게 구성되는 플라스틱류는 폴리스틸렌(polystyrene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리부타디엔(polybutadiene), 폴리부틸렌(polybutylene), 에폭시(epoxy), 테플론(Teflon), PAN(peroxyacetylnitrate), PET(polyethylene terephthalate), PTFE(polytetrafluoroethylene), 클로로-플루오로에틸렌(chloro-fluoroethylene), 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride), 액정 중합체(liquid crystal polymer), 폴리에스테르(polyester), LDPE(low-density polyethylene), HDPE(high density polyethylene), 폴리메틸펜틴(polymethylpentene), 폴리페닐렌 설파이드(polyphenylene sulfide), 폴리올페핀(polyolefin), PVC(polyvinyl chloride) 및 염소화 PVC를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 기판(100)은 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층(110a, 110b)을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 공중합체층에 대한 단량체가 도시된다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩이 표적하는 시료 내의 물질은 핵산일 수 있다. 이러한, 핵산은 음전하(-)를 가짐에 따라, 양전하(+)에 의하여 포집될 수 있다. 이에, 본 발명의 공중합체층은 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 포함함에 따라, 핵산을 포집할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 공중합체층(110a, 110b)은 측쇄 말단에 양전하의 1차 아민, 2차 아민, 또는 3차 아민기를 가지는 제 1 반복단위를 포함할 수 있다. 그러나, 음이온에 대한 고정능에 있어 3차 아민이 1차 및 2차 아민보다 우수하기 때문에, 본 발명의 공중합체층(110a, 110b)의 아민기는 바람직하게, 3차 아민일 수 있다.
따라서, 본 발명의 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위는, 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS), 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-dimethylaminoethyl methacrylate, DMAEMA), 1-비닐피롤리돈(1-vinylpyrrolidinone, 1-VP), 다이에틸아미노에틸 아크릴레이트(dimethylaminoethyl acrylate, DEAEA), 다이메틸아미노에틸 아크릴레이트(2-dimethylamino ethylacrylate, DMAEA) 및 다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트 (diethylaminoethyl methacrylate, DEAMA) 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는, 도 3의 (a)에 도시된, 3차 아민기를 포함하는 2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS)일 수 있다.
한편, 이러한 DMAMS는 pH 8.5 미만에서 양성자화가 되며, 측쇄 말단에 양전하의 질소가 기판(100)의 위를 향하여 배치됨에 따라, DMAMS가 형성된 기판(100)의 표면은 양전하를 띄게 된다.
나아가, 본 발명의 공중합체층(110a, 110b)의 두께는, 증착 시간에 따라 변화할 수 있으며, 약 1 내지 1,000 nm, 바람직하게는 약 10 내지 500 nm, 보다 바람직하게는 약 100 내지 300 nm 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 공중합체층(110a, 110b)은, 전술한 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 고분자로서 안정적으로 기판(100)에 결합시키기 위하여, 가교제(cross-linking agent)를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 가교제는 아민기를 포함하는 단량체들을 서로 연결시켜 고분자로 형성시킬 수 있는 첨가제를 의미하며, 이를 통하여 아민기를 포함하는 단량체로부터 형성된 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위가 기판(100) 상에 보다 많이 배치할 수 있다. 결국, 많은 수의 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위가 기판(100) 상에 배치됨에 따라, 이의 양전하(+)의 세기가 보다 커져 보다 손쉽게 많은 양의 핵산을 포집할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 공충합체층(110a, 110b)은 가교제로서, 비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위를 더 포함할 수 있다. 비닐기(vinyl functional group)를 포함하는 단량체는 아민기를 포함하는 단량체의 관능기와 반응하여 3차원의 망상 구조를 가지는 고분자(network polymers)를 형성할 수 있다. 이러한 3차원적 망상 구조를 가지는 고분자는 가교제를 통하여 가교 밀도가 증가됨에 따라, 기계적 성질이 향상될 수 있다.
따라서, 본 발명의 비닐기를 포함하는 단량체는 디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE), 에틸렌글리콜 디비닐에테르(ethylene glycol divinyl ether), 프로필렌글리콜 디비닐에테르(propylene glycol divinyl ether), 부틸렌글리콜 디비닐에테르(butylene glycol divinyl ether), 1,3-디에테닐옥시 에톡시벤젠(1,3-di(ethenyloxy ethoxy)benzene), 1-메틸-1,2-디에테닐옥시 에탄(1-methyl-1,2-diethenyloxy ethane) 및 1,7-디에테닐옥시 에톡시나프탈렌(1,7-di(ethenyloxy ethoxy) naphthalene) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는, 도 3의 (b)에 도시된, 2개의 비닐기를 포함하는 디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE)일 수 있다. 이에, 본 발명의 공중합체층은 가교제로서, 양끝단에 이중으로 비닐기를 포함하는 DEGDVE이 이용됨에 따라, 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위의 밀도가 보다 증가될 수 있다.
이러한, 공중합체층(110a, 110b)은 개시제를 이용한 화학 기상 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)에 의하여 배치될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 단량체로부터 유래된 아민기가 작용기로서, 유지된 채 기판(100) 상에 배치될 수 있는 다양한 방법을 모두 포함할 수 있다.
다시 도 2를 참조하면, 기판(100)은, 검출층(130)을 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 검출층(130)은 루프-매개 등온증폭 혼합물을 건조하여 형성(배치)된 층으로서, 반고체 또는 고체의 혼합물이 고착되어 있을 수 있다. 예를 들어, 루프-매개 등온증폭 혼합물은 핵산의 증폭 과정에 필요한 물질들로 구성될 수 있으며, DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당 업계에서 핵산 증폭에 사용되는 프라이머, 삽입 염료, 프로브 및 역전사효소 등의 다양한 PCR 혼합제를 더 포함할 수 있다.
나아가, 검출층(130)은 전술한 바와 사용자가 가시적(육안)으로 직접 확인할 수 있도록 지시약을 포함할 수 있다. 이러한, 지시약은, 형광 염료가 아닌 발색 염료로서, 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet) 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 검출층(130)은 전술한 지시약뿐만 아니라, 형광 염료를 더 포함하거나, 전술한 지시약 및 형광 염료를 전혀 포함하지 않을 수 있다. 보다 구체적으로, LAMP 혼합물은 형광 염료인 calcein 또는 hydroxynaphtol blue을 포함할 수 있으며, 이러한 형광 염료는 Mn2+과 결합할 경우 각각 형광이 나오지 않거나, 보라색을 보일 수 있으며, 증폭 반응이 진행됨에 따라, dNTP에서 pyrophosphate가 생성될 수 있다. 이때, Mn2+는 calcein인 보다 pyrophosphate와의 결합이 훨씬 강하여, 반응이 진행됨에 따라, Mn-pyrophosphate 결합물이 형성되고, Mg-Calcein 또는 Mg-hydroxylnaphtol blue는 형광 세기의 증가 또는 파란색을 띠게 된다. 이에, 형광 강도를 하에 UV-lamp 육안으로 관찰하거나, 보라색의 진하기에 따라서 반응정도를 LAMP 파악할 수 있다.
또한, 지시약 및 형광 염료를 포함하지 않을 경우, 혼합물 내에 포함되어 있는 calcein은 Mn2+과 강하게 결합하고 있으며, 증폭이 진행됨에 따라, 생성된 pyrophosphate는 Mn2+ 또는 Mg2+ 과 결합하여 흰색 침전물을 형성할 수 있다. 이때, 증폭 산물인 흰색 침전물은 충분히 생성될 경우, 육안으로 관찰가능할 수 있음에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 별도의 지시약이 포함되지 않는 경우에도, 표적 유전자의 증폭 결과를 확인할 수 있다.
이러한, 검출층(130)을 형성하는 루프-매개 등온증폭 혼합물은 기판(100) 상에 건조되어 형성되지 않고, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)이 모두 형성된 이후, 액상 형태로 주입되거나, 액상 형태로 주입된 이후, 건조 과정을 거쳐, 검출 챔버(250) 내에서, 분말 형태로 공급될 수 있다.
제 1 레이어(200)는 기판(100) 상에 배치될 수 있으며, 개폐부를 포함하는 공기압 유입부(210), 공기압 유입부(210)와 연통된 제 1 미세채널(220), 제 1 미세채널(220)과 연통되고, 공중합체층(110b)과 대응되는 추출 챔버(230), 추출 챔버(230)와 연통된 제 2 미세채널(240), 및 제 2 미세채널(240)과 연통되고, 루프-매개 등온 증폭 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 검출 챔버(250)를 포함할 수 있다.
그러나, 제 1 레이어(200)는 전술한 공기압 유입부(210), 제 1 미세채널(220), 추출 챔버(230), 제 2 미세채널(240) 및 검출 챔버(250)뿐만 아니라, 보다 핵산 추출에 있어 보다 정밀한 검출을 위하여, 전처리 과정을 기능적으로 수행하기 위한 구조 즉, 제 1 미세채널(220)과 연통된 용출 챔버(260), 용출 챔버(260)와 연통된 제 3 미세채널(270), 제 3 미세채널(270)과 연통된 세척 챔버(280), 및 세척 챔버(280)와 검출 챔버(250)와 연통된 제 4 미세채널(290)을 더 포함할 수 있다.
이러한, 제 1 레이어(200)는 전술한 모든 구성들이 모두 포함될 경우, 공기압 유입부(210), 제 1 미세채널(220), 용출 챔버(260), 제 3 미세채널(270), 세척 챔버(280), 제 4 미세채널(290), 추출 챔버(230), 제 2 미세채널(240) 및 검출 챔버(250) 순으로 일련의 배열을 가질 수 있다. 나아가, 제 1 레이어(200)는 각 구성들이 순서대로 일련의 배열을 가짐에 따라, 이들은 모두 연통되어, 순서대로 유체가 흐를 수 있다.
나아가, 제 1 레이어(200)는 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성될 수 있으며, 몰드를 이용한 소프트리소그래피의 방법에서 사용되는 몰드 즉, 스탬프에 사용되는 유기물로서, 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxan, PDMS)가 사용될 수 있음에 따라, 본 발명의 제 1 레이어(200)는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxan, PDMS)로 구성될 수 있다. 그러나, 제 1 레이어(200)의 구성 성분 즉, 소재로서 전술한 PDMS에 제한되는 것은 아니며, 몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 특정 구조물을 형성할 수 있는 다양한 폴리머가 모두 포함될 수 있다.
먼저, 공기압 유입부(210)는 제 1 레이어(200)에 포함되어 있는 제 1 미세채널(220), 추출 챔버(230), 제 2 미세채널(240), 검출 챔버(250) 내로 공급되는 유체가 유입될 수 있는 입구를 의미할 수 있다. 공기압 유입부(210)는 제 2 레이어(300)의 펌핑부(310)와 연결될 수 있으며, 외부로부터 유입된 유체의 역류 및 누출을 차단하기 위한 개폐 부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 개폐 부는 개폐 밸브와 동일한 의미일 수 있으며, 볼 밸브, 게이트 밸브 및 버터플라이 밸브 중 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 기판(100), 제 1 레이어(200) 및 제 2 레이어(300) 중 적어도 하나에 구조적으로 형성되어 압력에 의하여 개폐될 수 있는 형상을 모두 포함할 수 있다.
이때, 개폐 밸브(241)는 전술한 바와 동일한 기능을 수행하기 위하여, 제 2 미세 채널(240)에 더 포함될 수 있다. 이에, 제 2 미세 채널(240)은 개폐 밸브(241)를 포함함에 따라, 검출 챔버(250) 내로 유입된 유체가 역류 및 누출에 대한 위험없이 안정적으로 증폭될 수 있다.
그 다음, 제 1 미세채널(220)은 공기압 유입부(210) 및 추출 챔버(230) 사이에서 연통되어, 공기압 유입부(210)로부터 유입된 유체를 추출 챔버(230) 내로 유동시킬 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에 따른 제 1 레이어(200)는 전술한 바와 같이 전처리 과정을 위한 기능적 구조를 더 포함할 수 있음에 따라, 전처리 과정을 위한 기능적 구조가 더 포함될 경우, 제 1 미체채널은 공기압 유입부(210) 및 용출 챔버(260) 사이에서 연통되어, 공기압 유입부(210)로부터 유입된 유체를 용출 챔버(260) 내로 유동시킬 수 있다.
그 다음, 용출 챔버(260)는 시료가 주입되어, 시료 내에 존재하는 세포의 세포막을 파열시켜, 세포 내용물을 노출시키는 세포 용해(cell lysis)를 야기시킬 수 있다. 이에, 용출 챔버(260)는 세포 용해를 위한 용해 완충액울 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 용해 완충액은 리소자임(lysozyme)과 같은 효소가 포함되어, 세포막을 파열시켜 세포 내 핵산을 용출시킬 수 있다. 그러나, 용해 완충액에 효소가 포함되지 않을 경우, 용출 챔버(260)는, 기판(100) 상의 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층(110a)과 대응되는 위치에 배치함으로써, 양이온에 의하여, 세포막을 파열시킨 뒤, 세포 내 핵산을 용출시킬 수 있다. 이러한, 용출 챔버(260)는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)에 있어 필수적인 구성이 아니며, 시료가 기계적 또는 비기계적인 방법을 통하여, 미리 전처리된 경우, 용출 챔버(260)는 제 1 레이어(200)에 포함되지 않을 수 있다.
그 다음, 세척 챔버(280)는 제 3 미세채널(270)을 통하여, 용출 챔버(260)와 연통될 수 있으며, 핵산 이외의 세포막, 세포 소기관 및 세포 파편을 제거하기 위한, 세척 버퍼(washing buffer)를 포함할 수 있다. 이러한, 세척 챔버(280)은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)에 있어 필수적인 구성이 아니며, 시료가 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000) 내로 투입되기 전, 미리 전처리되거나, 용출 챔버(260)가 포함되지 않을 경우, 세척 챔버(280)는 포함되지 않을 수 있다.
그 다음, 추출 챔버(230)는 제 4 미세채널(290)을 통하여, 세척 챔버(280)와 연통될 수 있으며, 폐기부(231)를 더 포함할 수 있다. 이때, 추출 챔버(230)는 기판(100) 상의 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층(110b)과 대응되는 위치에 배치될 수 있으며, 이에 따라, 세척되어 주입된 시료로부터 핵산만을 포집할 수 있다. 보다 구체적으로, 세척 버퍼가 희석된 시료 내의 핵산은 추출 챔버(230) 하부에 형성(배치)되어 있는 공중합체층(110b)에 포집되고, 핵산 이외의 세포 물질은 폐기부(231)로 유동되어, 제거될 수 있다. 이러한, 폐기부(231)는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)에 있어 필수적인 구성이 아니며, 전술한 용출 챔버(260) 및/또는 세척 챔저가 포함되지 않을 경우, 폐기부(231)는 포함되지 않을 수 있다.
그 다음, 검출 챔버(250)는 제 2 미세채널(240)을 통하여, 추출 챔버(230)와 연통될 수 있다. 이때, 제 2 미세채널(240)은 개폐 밸부(241)를 더 포함함에 따라, 검출 챔버(250) 내로 유입된 유체가 역류 및 누출에 대한 위험없이 안정적으로 증폭될 수 있다.
또한, 검출 챔버(250)는 기판(100) 상의 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 혼합물을 포함하는 검출층(130)과 대응되는 위치에 배치될 수 있다. 이에 따라, 검출 챔버(250)는 추출 챔버(230)에서 포집되어 유입된 핵산 중 표적 핵산을 증폭할 수 있으며, 이의 증폭 산물을 가시적으로 확인할 수 있다.
제 2 레이어(300)는 제 1 레이어(200) 상에 배치될 수 있으며, 펌핑부(310) 및 투입구(330)를 포함할 수 있다.
먼저, 투입구(330)는 제 2 레이어(300)의 구성 성분 즉, 용출 챔버(260), 세척 챔버(280), 추출 챔버(230) 및 검출 챔버(250) 중 적어도 하나와 대응되는 위치에 배치될 수 있으며, 이에 따라, 전술한 제 2 레이어(300)의 구성 성분 내로 다양한 물질을 투입시킬 수 있다. 예를 들어, 시료 및 용해 완충액은 용출 챔버(260) 상에 배치되어 있는 투입구(330)를 통하여 주입될 수 있으며, 시료의 세척을 위한 세척 버퍼는 세척 챔버(280) 상에 배치되어 있는 투입구(330)를 통하여 주입될 수 있으며, 핵산을 증폭시키기 위한 LAMP 혼합물은 검출 챔버(250) 상에 배치되어 있는 투입구(330)를 통하여 주입될 수 있다.
나아가, 투입구(330)는 물질의 투입뿐만 아니라, 제 2 레이어(300)의 구성 성분 내에 포함되어 있는 다양한 물질을 배출시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산 포집이 완료된 후의 남은 시료들은 추출 챔버(230) 상에 배치되어 있는 투입구(330)를 통하여 배출될 수 있다.
그 다음, 펌핑부(310)는 제 1 레이어(200)에 포함되어 있는 구성 성분 내로 유체를 투입하여, 압력을 증가시킬 수 있는 구성 성분을 의미할 수 있으며, 제 2 레이어(300) 상에 형성될 수 있는 다양한 형태의 압력 펌프를 모두 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 펌핑부에 대한 측면도가 도시된다. 펌핑부(310)는 누름 영역(311), 및 누름 영역(311) 하부에 제 2 레이어(300)의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간(313)을 포함할 수 있다.
나아가, 누름 영역(311)은 제 2 레이어(300)의 겉 표면 상에서 일정 압력을 가하여, 제 2 레이어(300) 내측에 형성되어 있는 공간(313) 내부의 압력을 증가시킬 수 있다.
더 나아가, 공간(313)은 누름 영역(311)이 하강 압력을 받았을 경우, 공간(313) 내의 유체가 하강 압력에 비례하여, 개폐부(211)를 개방시킬 수 있는 유체가 수용가능한 체적을 가질 수 있다.
또한, 공간(313)의 일부 영역은 제 1 레이어(200)에 형성되어 있는 개폐부(211)와 대응되는 위치에 배치될 수 있다. 이때, 개폐부(211)는 제 1 레이어(200)에 구조적으로 일측면이 부착되지 않고 돌출된 형태로 형성되어 있는 구성을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 제 1 레이어(200) 또는 제 2 레이어(300)에 배치되어, 압력에 의하여 유체를 유입 및 차단시킬 수 있는 다양한 개폐 밸브를 모두 포함할 수 있다.
이에, 도 4의 (a)를 참조하면, 누름 영역(311)이 하강 압력을 받았을 경우, 공간(313) 내의 압력이 증가함에 따라, 개폐부(211)는 개방되어, 제 1 레이어(200)의 공기압 유입부(210)로 유체를 유입시킬 수 있다. 또한, 공기압 유입부(210)로 유입된 유체에 의하여, 제 1 미세채널(220) 또는 추출 챔버(230) 내에 존재하는 유체가 유입 방향과 동일한 방향으로 이동될 수 있다.
나아가, 도 4의 (a)를 참조하면, 누름 영역(311)에 대한 하강 압력이 없을 경우, 개폐부(211)는 제 1 레이어(200)와 맞닿아 있는 제 2 레이어(300)의 밑면 중 일부 돌출 영역에 상접하여, 공기압 유입부(210)를 폐쇄할 수 있다. 이에, 공기압 유입부(210)에 체류하는 유체는 역류 또는 누출되지 않을 수 있다. 나아가, 공기압 유입부(210)와 연통되어 있는 제 1 미세채널(220) 또는 추출 챔버(230) 내에 존재하는 유체 또한, 역류 또는 누출되지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 전술한 구성을 포함함에 따라, 하나의 기재 상에서, 핵산 증폭 및 검출에 대한 일련의 반응을 모두 수행할 수 있다.
나아가, 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 상면도가 도시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 도 2 내지 4에서 전술한 바와 같은 시료 측정부(400) 뿐만 아니라, 이와 동일한 방법 및 구조를 포함하는 대조군 측정부(500)를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 대조군 측정부(500)는 변인에 대한 영향 및 측정 결과에 대한 타당성을 입증하기 위한 양성 대조군 측정부(500a) 및 음성 대조군 측정부(500b)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000) 내에서 시료 측정부(400), 대조군 측정부(500)의 배치는, 도 5에 도시된 바와 같이, 마주보도록 배치될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 각 측정부의 종류가 구별되도록 미세유체 칩(1000) 내에서 자유롭게 배치될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은, 대조군 측정부(500)를 더 포함함에 따라, 오염, 허위 음성, 변인에 대한 단점이 보완되어, 보다 신뢰성 높은 결과를 제공할 수 있다.
나아가, 도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 소형 온도 조절 장치의 예시도가 도시된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 고온이 요구되는 변성 과정을 포함하지 않는 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)에 기초하여, 표적 핵산을 증폭할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 루프-매개 등온 증폭에 요구되는, 60 내지 65 ℃의 온도에서 증폭 과정이 수행될 수 있으며, 이러한, 60 내지 65 ℃의 온도는 배터리(610)를 통한 소형의 온도 장치(600)에서도 제공될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 휴대성이 뛰어난 소형의 온도 장치(600)로 핵산 증폭을 수행할 수 있음에 따라, 공간에 제약없이 다양한 장소에서, 핵산을 증폭 및 이를 통한 진단이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 전술한 소형 온도 조절 장치(600)뿐만 아니라, 60 내지 65 ℃의 온도를 제공할 수 있는 다양한 기기를 통하여, 핵산을 증폭할 수 있다. 예를 들어, 60 내지 65 ℃의 온도를 일정하게 유지시킬 수 있는 항온 수조, 인큐베이터 및 건조기 등 다양한 기기 내에서 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 핵산을 증폭할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 핵산 증폭을 위한 온도 조절 장치를 추가적으로 구매하거나, 구비하지 않고, 특정 온도를 유지 및 제공할 수 있는 종래의 기기에서, 핵산 증폭 과정을 수행할 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법에 대한 순서도이다.
도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법은 시료를 추출 챔버 내로 주입시키는 단계(S710), 핵산의 바인딩을 위하여, 추출 챔버 내로 주입된 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계(S720), 누름 영역을 이용하여, 인큐베이팅이 끝난 시료를 검출 챔버 내로 주입시키는 단계(S730), 핵산의 증폭을 위하여, 검출 챔버 내로 이동된 시료를 루프-매개 등온증폭(LAMP)시키는 단계(S740), 및 루프-매개 등온증폭이 완료된 시료의 지시제 발색을 통하여, 시료 내의 표적 유전자에 대한 존재 여부를 확인하는 단계(S750)를 포함한다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 추출 챔버 및 검출 챔버뿐만 아니라, 용출 챔버 및 세척 챔버를 더 포함할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법은 용출 챔버 및 세척 챔버를 더 포함한 경우, 전술한 시료를 추출 챔버 내로 주입시키는 단계(S710) 이전에, 시료를 용출 챔버 내로 주입시키는 단계, 시료 내의 핵산의 용출을 위하여, 용출 챔버 내로 주입된 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계, 및 누름 영역을 이용하여, 인큐베이팅이 끝난 시료를 세척 챔버 내로 주입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 전술한 과정을 통하여, 손쉽게 표적 핵산을 검출할 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법은, 칩 내부에서 일련의 과정이 수행됨에 따라, 외부 오염의 오류를 최소화할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법은, 사용자의 핸들링에 의하여 수행되는 전처리 및 시약 제조 등이 포함되지 않음에 따라, 균일한 측정 결과를 도출할 수 있다.
현장진단용 미세유체 칩에 대한 검증
이하에서는, 도 8 내지 12를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 검증에 대하여 설명한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 XPS 스펙트럼 결과이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 실시예 1 및 2는 모두 DMAMS를 포함하는 대조군과 동일하게, N1s에 대한 피크가 나타났으며, 이는 DMAMS로부터 유래된 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위가 현장진단용 미세유체 칩내에 안정적으로 배치되었다는 것을 의미할 수 있다.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 실시예 1 및 2는 모두 O1s에 대한 피크가 나타났으며, 이는 비닐기를 포함하는 단량체 즉, DEGDVE이 에테르 (R－O－R) 결합을 포함함에 따라, 비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위가 현장진단용 미세유체 칩내에 안정적으로 배치되었다는 것을 의미할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 아민기를 포함하는 단량체인 DMAMS 및 비닐기를 포함하는 단량체인 DEGDVE를 통하여, 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위 및 비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위를 포함하는 공중합체층이 안정적으로 포함되어 있다는 것을 의미할 수 있다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 DNA 추출 및 포집 능력에 대한 결과이다.
이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 DNA 추출 및 포집 능력 확인에 사용된 시료는 E.coli O157:H7 (이하, 대장균)의 DNA를 포함하는 시료이며, 각 농도의 시료는 10μL씩 용출 챔버 내로 주입되어 측정되었다. 나아가, 표준(Initial) 시료는 주입된 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 주입된 기준 DNA 시료를 의미하며, 용출(Eluted) 시료는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩 내의 추출 챔버에서 회수된 DNA 시료(추출 챔버 내 공중합체층 상에 포집되지 않은 DNA 시료)를 의미하며, 포집(Captured) 시료는 표준 시료에서 용출 시료가 제외된 DNA 시료(추출 챔버 내 공중합체층 상에 포집된 DNA)를 의미할 수 있다. 또한, 수집된 각각의 시료는 qPCR을 수행된 후 비교되었다. 나아가, 대장균의 DNA를 qPCR로 측정하기 위하여, 하기의 표 1에 도시된 서열을 포함하는 프라이머가 사용되었다.
Primer Sequence(5' to 3')
E. coli O157:H7
(Stx2 gene)		 Forward GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA
Reverse TGT TGC CGT ATT AAC GAA CCC
probe FAM-CTA TCA GGC GCG TT TGA CCA TCT TCG- TAMRA
도 9을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에서의, 주입된 표준 시료, 용출 시료 및 포집 시간 간의 농도 차이는 통계적으로 없는 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 10, 1, 0.1, 0.01 및 0.001 ng/μL 농도 모두에서 95 % 이상의 DNA 포집 효율을 갖으며, 0.001 ng/μL의 극미량의 DNA까지 포집하여 측정할 수 있다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 유체 이동 및 이에 따라 이동한 유체의 부피에 대한 결과이다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 주입에 주입된 시료는 10μL로, 용출 챔버 내로 주입되었다.
도 10의 (a)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 용출 챔버, 제 3 미세채널, 세척 챔버, 제 4 미세채널, 추출 챔버 및 검출 챔버를 포함할 수 있으며, 이러한 구성은 전술한 순서대로 일직선으로 나열되어 연통될 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 용출 챔버, 제 3 미세채널, 세척 챔버, 제 4 미세채널, 추출 챔버 및 검출 챔버는 서로 연결되어 통해져 있음에 따라, 펌핑부를 통하여 공급되는 압력에 의하여 전술한 구성의 순서대로 유체가 자유롭게 이송될 수 있다.
나아가, 도 10의 (b)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩의 용출 챔버, 세척 챔버, 추출 챔버 및 검출 챔버의 용적은 동일할 수 있으며, 이에 따라, 각 구성에 유입된 유체의 볼륨(Transported fluid volume)은 10μL로 동일한 것으로 나타난다. 나아가, 각각의 용출 챔버, 세척 챔버, 추출 챔버 및 검출 챔버 내의 유체의 볼륨이 동일함에 따라, 유체가 펌핑부에 의하여, 약 96% 이상 이송될 수 있다는 것을 의미할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 별도의 압력 장비 없이, 손가락과 같은 수동적인 방식으로 압력을 부여받아, 표적 핵산 측정을 위한, 일련의 과정을 수행할 수 있다.
도 11은 시료의 농도에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 대한 발색 결과를 도시한 것이다. 이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 발색에 의한 결과 확인을 위하여, 루프-매개 등온 증폭 혼합물에 페놀 레드(phenol red)을 포함하였다. 이에, 표적 핵산이 시료 내에 포함되어 있을 경우(positive), 표적 핵산이 증폭되어 pH가 낮아짐에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 의한 증폭 산물을 노란색(본 발명의 도면 내에서는 검은색으로 표시)을 띌 수 있다. 나아가, 표적 핵산이 시료 내에 포함되어 있지 않을 경우(negative), 표적 핵산에 따른 pH 변화가 없어, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩에 의한 증폭 산물을 붉은색(본 발명의 도면 내에서는 빗금 패턴으로 표시)을 띌 수 있다. 나아가, 핵산 검출을 위한 표적 시료로서, E.coli O157:H7이 사용되었다.
도 11을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 겔 전기영동 결과와 동일하게 5 ng/μL까지 검출가능한 것으로 나타난다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩은 종래의 PCR 방법과 동일 수준으로, 표적 핵산을 추출하여, 가시적으로 확인할 수 있다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 통한 병원체 검출 결과이다. 이때, E.coli O157:H7(Lysate)을 포함하는 10μL의 시료가 사용되었다. 나아가, 전술한 대장균 시료는 하기의 표 2에 표시된 서열을 포함하는 프라이머가 사용되어 LAMP 증폭이 수행되었다.
Primer Sequence(5' to 3')
E. coli O157:H7
(Stx2 gene)		 FIP TGACGATTTTATTGCGTTCATCAACGCTGTGGGGATCATCAAAC
BIP ATTGTGTCAGCGAATTGCCGTAAATAGAGATCGGCATTGAATG
LF ACCAAACACCGCTTCCA
LB TGCGCAATGCTGCGATA
F3 ATTGAGTCCAACAATAATCAGT
B3 CATTTTCCCGACACAGAAG
더 나아가, LAMP 증폭을 위하여, 50 μM의 KCl, 10 μM의 (NH4)2SO4, 8 μM의 MgSO4, 1.4 μM의 dNTP, 0.1 % Tween 20, 0.1 μM의 phenol red, 1.6 μM의 FIP, 1.6 μM의 BIP, 0.8 μM의 LF, 0.8 μM의 LB, 0.2 μM의 F3, 0.2 μM의 B3, 8U의 Bst 2.0 DNA Polymerase 및 12 % Trehalose가 사용되었으며, LAMP 증폭은 60 내지 65 ℃에서 15 내지 20 분간의 증폭(Amplification) 단계 및 90 내지 100 ℃에서 1 내지 5 분간의 종결(Termination) 단계로 수행되었다.
도 12를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)의 시료 측정부(400)는 1 * 103 CFU까지 병원체를 검출할 수 있음에 따라, 이의 검출 한계는 1 * 103 CFU인 것으로 나타난다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 현장진단용 미세유체 칩(1000)은 미량으로 포함되어 있는 병원체에 대해서도, 별도의 장비 없이 검출할 수 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
10 유체
100 기판
110 공중합체층
130 검출층
200 제 1 레이어
210 공기압 유입부
211 개폐부
220 제 1 미세채널
230 추출 챔버
231 폐기부
240 제 2 미세채널
241 개폐 밸브
250 검출 챔버
260 용출 챔버
270 제 3 미세채널
280 세척 챔버
290 제 4 미세채널
300 제 2 레이어
310 펌핑부
311 누름영역
313 공간
330 투입부
400 시료 측정부
500a 양성 대조군 측정부
500b 음성 대조군 측정부
600 소형 온도 장치
610 배터리
1000 현장진단용 미세유체 칩

Claims (29)

  1. 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 가지는 공중합체층을 포함하는 기판, 및
    개폐부를 포함하는 공기압 유입부,
    상기 공기압 유입부와 연통된 제 1 미세채널,
    상기 제 1 미세채널과 연통되고, 상기 공중합체층과 대응되는 추출 챔버(Extraction chamber),
    상기 추출 챔버와 연통된 제 2 미세채널, 및
    상기 제 2 미세채널과 연통되고, 루프-매개 등온 증폭(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 검출 챔버(Detection chamber)를 포함하고,
    상기 기판 상에 배치되는, 제 1 레이어(layer)를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 미세채널은,
    개폐 밸브를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 레이어는,
    상기 제 1 미세채널과 연통된 용출 챔버(Elution chamber),
    상기 용출 챔버와 연통된 제 3 미세채널,
    상기 제 3 미세채널과 연통된 세척 챔버(Washig chamber), 및
    상기 세척 챔버와 상기 추출 챔버와 연통된 제 4 미세채널을 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 레이어 상에 배치되는 제 2 레이어를 더 포함하고,
    상기 제 2 레이어는,
    상기 추출 챔버 및 상기 검출 챔버 중 적어도 하나와 대응되는 위치의 투입구를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제 2 레이어는,
    누름 영역, 및
    상기 누름 영역 하부에 상기 제 2 레이어의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간을 포함하는 펌핑부를 더 포함하고, 현장진단용 미세유체 칩.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 공간은,
    상기 누름 영역이 하강 압력을 받았을 경우,
    상기 공간 내의 유체가 상기 하강 압력에 비례하여, 개폐부를 개방시킬 수 있는 유체가 수용가능한 체적을 가지는, 현장진단용 미세유체 칩.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 개폐부는,
    상기 누름 영역에 대한 하강 압력이 없을 경우,
    폐쇄되어 상기 공기압 유입부에 체류하는 유체의 역류 및 누출을 차단하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 기판은,
    폴리프로필렌(polypropylene, PP), 폴리에틸렌 (polyethylene, PE), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride, PVC), 폴리카보네이트(polycarbonate, PC), 폴리에스테르(polyester), 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate, PET), 폴리우레탄(polyurethane, PU), 실리콘, 유리, 세라믹 및 테플론 중 적어도 하나의 소재로 이루어진, 현장진단용 미세유체 칩.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 레이어 및 제 2 레이어는,
    몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성된, 현장진단용 미세유체 칩.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 레이어 및 제 2 레이어는,
    폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxan, PDMS)로 구성된, 현장진단용 미세유체 칩.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위는,
    2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS), 2-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트(2-dimethylaminoethyl methacrylate, DMAEMA), 1-비닐피롤리돈(1-vinylpyrrolidinone, 1-VP), 다이에틸아미노에틸 아크릴레이트(dimethylaminoethyl acrylate, DEAEA), 다이메틸아미노에틸 아크릴레이트(2-dimethylamino ethylacrylate, DMAEA) 및 다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트 (diethylaminoethyl methacrylate, DEAMA) 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위는,
    2-디메틸아미노메틸 스티렌(2-dimethylaminomethylstyrene, DMAMS)인, 현장진단용 미세유체 칩.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 공중합체층은,
    비닐기를 포함하는 단량체로부터 유래된 제 2 반복 단위를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 비닐기를 포함하는 단량체는,
    디에틸렌글리콜 디비닐에테르(di(ethylene glycol) divinyl ether, DEGDVE), 에틸렌글리콜 디비닐에테르(ethylene glycol divinyl ether), 프로필렌글리콜 디비닐에테르(propylene glycol divinyl ether), 부틸렌글리콜 디비닐에테르(butylene glycol divinyl ether), 1,3-디에테닐옥시 에톡시벤젠(1,3-di(ethenyloxy ethoxy)benzene), 1-메틸-1,2-디에테닐옥시 에탄(1-methyl-1,2-diethenyloxy ethane) 및 1,7-디에테닐옥시 에톡시나프탈렌(1,7-di(ethenyloxy ethoxy) naphthalene) 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 공중합체층은,
    개시제를 이용한 화학 기상 증착법(initiated chemical vapor deposition, iCVD)에 의하여 배치된, 현장진단용 미세유체 칩.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 루프-매개 등온 증폭 혼합물은,
    DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 지시약은,
    브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet) 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩.
  18. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 현장진단용 미세유체 칩을 이용하는 유전자 검출 방법으로서,
    시료를 상기 추출 챔버 내로 주입시키는 단계;
    핵산의 바인딩을 위하여, 상기 추출 챔버 내로 주입된 상기 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계;
    상기 누름 영역을 이용하여, 상기 인큐베이팅이 끝난 상기 시료를 상기 검출 챔버 내로 주입시키는 단계;
    상기 핵산의 증폭을 위하여, 상기 검출 챔버 내로 이동된 상기 시료를 루프-매개 등온증폭(LAMP)시키는 단계, 및
    상기 루프-매개 등온증폭이 완료된 상기 시료의 지시제 발색을 통하여, 상기 시료 내의 표적 유전자에 대한 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 시료를 상기 용출 챔버 내로 주입시키는 단계;
    상기 시료 내의 핵산의 용출을 위하여, 상기 용출 챔버 내로 주입된 상기 시료를 20 내지 30 ℃에서 적어도 10분 동안 인큐베이팅시키는 단계, 및
    상기 누름 영역을 이용하여, 상기 인큐베이팅이 끝난 상기 시료를 상기 세척 챔버 내로 주입시키는 단계를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩을 이용한 유전자 검출 방법.
  20. 기판 상에 아민기를 포함하는 제 1 반복 단위를 포함하는 공중합체층을 형성하는 단계, 및
    공기압 유입부, 제 1 미세채널, 적어도 하나의 추출 챔버, 제 2 미세채널, 적어도 하나의 검출 챔버를 포함하는 제 1 레이어를 상기 공중합체층과 상기 추출 챔버가 대응되도록 상기 기판상에 배치하는 단계를 포함하고,
    상기 검출 챔버는,
    루프-매개 등온증폭 혼합물을 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 공중합체층은,
    비닐기를 포함하는 제 2 반복 단위를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 공중합체를 형성하는 단계는,
    상기 아민기를 포함하는 단량체, 상기 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 주입하는 단계;
    상기 아민기를 포함하는 단량체, 상기 비닐기를 포함하는 단량체 및 개시제를 기화시키는 단계;
    상기 아민기를 포함하는 단량체 및 상기 비닐기를 포함하는 단량체가 라디칼 중합되어, 상기 기판 상에 증착되도록 가열하는 단계를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  23. 제 20항에 있어서,
    상기 공중합체를 형성하는 단계는,
    상기 루프-매개 등온증폭 혼합물을 포함하는 검출층을 형성하는 단계를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  24. 제 20항에 있어서,
    상기 제 1 레이어 상에 제 2 레이어를 배치하는 단계를 더 포함하고,
    상기 제 2 레이어는,
    상기 추출 챔버 및 상기 검출 챔버 중 적어도 하나와 대응되는 위치의 투입구를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 투입구를 통하여 상기 검출 챔버에 상기 루프-매개 등온증폭 혼합물을 주입하는 단계를 더 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 제 1레이어 및 상기 제 2 레이어는,
    몰드를 이용한 소프트리소그래피를 통하여 형성되는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 제 2 레이어는,
    누름 영역, 및
    상기 누름 영역 하부에 상기 제 2레이어의 하측면으로부터 내측으로 형성된 공간을 포함하는 펌핑부를 더 포함하고, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  28. 제 20항에 있어서,
    상기 루프-매개 등온증폭 혼합물은,
    DNA 중합효소, dNTPs, 완충액 및 지시약 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 지시약은,
    브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet) 중 적어도 하나를 포함하는, 현장진단용 미세유체 칩의 제조 방법.
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