CN109477136A

CN109477136A - 对流流动的流体装置中核酸基于表面的检测

Info

Publication number: CN109477136A
Application number: CN201780026551.7A
Authority: CN
Inventors: 德米特里·A·霍达科夫; 大卫·张
Original assignee: William Marsh Rice University
Current assignee: William Marsh Rice University
Priority date: 2016-03-29
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2019-03-15
Also published as: DK3436198T3; IL261980A; IL261980B1; CA3019422A1; KR20230004792A; AU2017241766A1; EP3436198A1; EP4063014A1; PT3436198T; EP3436198A4; KR20190021198A; WO2017172760A1; AU2023203972A1; IL261980B2; EP3436198B1; ES2920954T3; JP2023184748A; RU2018137800A; JP6998319B2; BR112018070197A2

Abstract

本公开提供了用于进行核酸序列的基于对流的PCR和非酶扩增的方法、组合物和装置。这些方法中所采用的技术和试剂包括在开放和封闭系统中用于核酸测试和测定的支点探针、链置换反应、瑞利‑贝纳尔对流、温度梯度、多重扩增、多重检测、以及DNA官能化。

Description

对流流动的流体装置中核酸基于表面的检测

优先权声明

本申请要求提交于2016年3月29日的美国临时申请序列号62/314,909的优先权的权益，该专利申请的全部内容以引入方式并入本文。

技术领域

本公开描述了用于科学和临床研究以及诊断应用的特异性核酸序列的检测和定量的新型试剂、仪器和方法。

背景技术

大多数商业核酸(NA)测定需要使用酶进行分子或信号扩增。酶诸如DNA聚合酶已被最优化为迅速和特异性的。在资源有限的条件下重构冻干酶减少了对冷链的需求。等温核酸扩增测定法诸如NEAR、LAMP和NASBA允许DNA/RNA作图而无需复杂的温度循环设备。尽管取得许多这类进展，但现有的核酸检测技术仍然面临着快速PoC(护理点)检测病原体生物标记的挑战，因为难以设计/发展出同时捕获所有所期望特性(例如，迅速、高保真、以及对于化学品/抑制剂的稳健性)的酶。

许多现有的核酸分析技术是无酶的，包括微阵列、荧光原位杂交(FISH)、支化DNA树枝状体(Panomics)和荧光条形码(Nanostring)。在这些方法中，DNA或RNA靶分子化学计量地募集或转化为有限数量的荧光基团。这不同于甚至单核酸分子被无限扩增而产生任意较高数量扩增子分子的PCR。因此，这些方法需要昂贵且体积庞大的设备来实现检测和分析生物样品中存在的少量DNA或RNA靶标所需的分子敏感性，从而限制其用于PoC应用和有限的资源条件。

另一类核酸鉴定技术采用基于溶液的无酶DNA扩增方法。此时，单链DNA靶分子能够以不受限制的方式催化从预装配的DNA检测复合物释放序列与靶标相同的DNA寡核苷酸。对于这一类方法，临床相关的检测限尚未得到证实。在这些系统中，存在由于DNA“呼吸”事件的假阳性扩增，这导致在不存在所检测的靶序列时释放扩增子分子。

发明内容

因此，根据本公开，提供了一种装置，该装置包括具有多个寡核苷酸复合物的表面，其中所述寡核苷酸复合物各自包含：

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一DNA序列以及使第一寡核苷酸与表面不可逆地连接的连接部分，以及

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中第二DNA序列与第一DNA序列互补并与其杂交，其中所述第二DNA寡核苷酸不包含荧光部分并且不与表面不可逆地连接。

所述第二DNA序列中的每者可以相同，或者可以不同。多个所述寡核苷酸复合物可位于所述表面上的空间离散区域中。第一寡核苷酸可包含荧光部分，并且所述第二寡核苷酸中的每者可包含荧光淬灭剂。所述空间离散区域中的每者还可包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中第四DNA序列与第三DNA序列互补。第三寡核苷酸可各自包含荧光淬灭剂部分。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

第一DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度，或介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第五DNA序列中的每者可具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。第四DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

在另一个实施方案中，提供了一种流体反应室，所述流体反应室包括：

第一表面，

第二表面，所述第二表面不接触第一表面，其中所述第一表面和第二表面彼此面对，

材料，所述材料接触第一表面和第二表面并形成所述反应室的外边界，以及

材料，所述材料接触第一表面和第二表面并形成所述反应室的内边界，

其中第一表面包含多个寡核苷酸复合物，其中所述寡核苷酸复合物各自包含：

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中第二DNA序列与第一DNA序列互补并与其杂交，其中所述第二DNA寡核苷酸不与第一表面不可逆地连接，并任选地不包含荧光部分。

所述第二DNA序列中的每者可以相同，或者可以不同。所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者可位于所述表面上的空间离散区域中。所述第一寡核苷酸中的每者可包含荧光部分。所述第二寡核苷酸中的每者可包含荧光淬灭剂部分。所述空间离散区域中的每者还可包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中第四DNA序列与第三DNA序列互补。第三寡核苷酸可各自包含荧光淬灭剂部分。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。流体反应室可具有：第一端口，用于递送样品；以及任选地第二另一个端口，以允许当将样品引入第一端口中时空气/流体排出。

第一DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第五DNA序列中的每者可具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。第四DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。形成室的内边界和外边界的接触第一表面和第二表面的材料可具有介于40微米(40μm)和2毫米(2mm)之间的厚度。

流体反应室可为圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形、八边形、菱形或梯形、或如本文所定义的环形。流体反应室可不处于均匀的温度，并且反应室的最温暖的区域可比反应室的最冷区域高至少10℃。反应室的最冷区域可介于约50℃和约75℃之间。反应室的最热区域可介于约80℃和约100℃之间。流体反应室还可包括设置在流体反应室内的流体，所述流体溶液包含DNA聚合酶、dNTP、以及PCR缓冲液。

在另一个实施方案中，提供了一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：(a)提供根据权利要求16所述的流体反应室，其中所述流体反应室与第一热源和第二热源可操作的关联，其中所述第一热源和第二热源能够向所述环形室施加不同的第一热度和第二热度，其中所述第一热度和第二热度不相同；(b)将包含靶核酸序列、DNA聚合酶、dNTP和聚合酶链反应(PCR)缓冲液的流体引入所述流体反应室中；以及(c)将第一热度和第二热度施加于所述流体反应室。该方法还可包括检测所述靶核酸的扩增。

所述第二DNA序列中的每者可以相同，或者可以不同。多个所述寡核苷酸复合物可位于所述表面上的空间离散区域中。所述第一寡核苷酸中的每者可包含荧光部分，并且所述第二寡核苷酸中的每者可包含荧光淬灭剂部分。所述空间离散区域中的每者还可包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中第四DNA序列与第三DNA序列互补。第三寡核苷酸可各自包含荧光淬灭剂部分。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

第一DNA序列可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。流体反应室可为圆形、椭圆形、正方形、三角形、矩形、六边形、八边形、菱形或梯形。

流体反应室不可处于均匀的温度，并且反应室的最温暖的区域可比反应室的最冷区域高至少10℃。反应室的最冷区域可介于约50℃和约75℃之间。反应室的最热区域可介于约80℃和约100℃之间。

在另一实施方案中，提供了一种装置，所述装置包括第一表面区域和第二表面区域，

所述第一表面区域包含：

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一DNA序列以及使第一寡核苷酸与第一表面区域不可逆地连接的连接部分，以及

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中第二序列与第一序列互补，并且

所述第二表面区域包含：

第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含第四DNA序列以及使第三寡核苷酸与第二表面区域不可逆地连接的连接部分，并且

其中第四序列与第二序列、第三序列、或第二序列的至少六个连续核苷酸与第三序列的六个连续核苷酸的组合互补，

或者一种装置，所述装置包括第一表面区域和第二表面区域，

所述第一表面区域包含：

所述第二表面区域包含：

第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含第四DNA序列以及使第三寡核苷酸与第二表面区域不可逆地连接的连接部分，以及

第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含第五DNA序列和第六DNA序列，其中第五序列与第四序列互补，并且

其中第二序列与第五序列互补或者与第六序列互补。

第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光部分，并且第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光淬灭剂。第二DNA序列可以相同，或者可以不同。多个所述寡核苷酸复合物可位于所述表面上的空间离散区域中。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。流体反应室可具有：第一端口，用于递送样品；以及任选地第二另一个端口，以允许当将样品引入第一端口中时空气/流体排出。

第一DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第五DNA序列中的每者可具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。第四DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第六DNA序列中的每者可具有介于5个和80个之间的核苷酸的长度。

第一表面，

材料，所述材料接触第一表面和第二表面并形成所述反应室的内边界，其中

(a)所述第一表面包含：

所述第二表面区域包含：

其中第四序列与第二序列、第三序列、或第二序列的至少六个连续核苷酸与第三序列的六个连续核苷酸的组合互补；或者

(b)所述第一表面区域包含：

所述第二表面区域包含：

其中第二序列与第五序列互补或者与第六序列互补。

第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光部分，并且第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光淬灭剂。所述第二DNA序列中的每者可以相同，或者可以不同。所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者可位于所述表面上的空间离散区域中。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。流体反应室可具有：第一端口，用于递送样品；以及任选地第二另一个端口，以允许当将样品引入第一端口中时空气/流体排出。

第一DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第三DNA序列中的每者可具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。第五DNA序列中的每者可具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。第四DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。第六DNA序列中的每者可具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

流体反应室可为圆形、椭圆形、正方形、三角形、矩形、六边形、八边形、菱形或梯形、或如本文所定义的环形。流体反应室可不处于均匀的温度，并且反应室的最温暖的区域可比反应室的最冷区域高至少10℃。反应室的最冷区域可介于约10℃和约50℃之间。反应室的最热区域可介于约51℃和约100℃之间。流体反应室还可包括设置在流体反应室内的流体，所述流体包含一种或多种寡核苷酸和杂交缓冲液，并且流体还可包含非特异性核酸染色染料。

另一个实施方案包括一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：(a)提供根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述流体反应室与第一热源和第二热源可操作的关联，其中所述第一热源和第二热源能够向所述环形室施加不同的第一热度和第二热度，其中所述第一热度和第二热度不相同；(b)将包含靶核酸序列的流体引入所述流体反应室中；以及(c)将第一热度和第二热度施加于所述流体反应室。

该方法还可包括检测所述靶核酸的扩增。第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光部分，并且第一寡核苷酸或第二寡核苷酸可包含荧光淬灭剂。所述第二DNA序列中的每者可以相同，或者可以不同。所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。连接部分可包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

流体反应室可为圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形、八边形、菱形或梯形、或如本文所定义的环形。流体反应室可不处于均匀的温度，并且反应室的最温暖的区域可比反应室的最冷区域高至少10℃。反应室的最冷区域可介于约10℃和约50℃之间。反应室的最热区域可介于约51℃和约100℃之间。流体还包含非特异性核酸染色染料。

另一个实施方案包括一种包括反应室的系统，所述反应室包括：(a)第一区域和第二区域，其中包含第一核苷酸序列的第一寡核苷酸官能化至第一表面区域，并且包含第二核苷酸序列的第二寡核苷酸官能化至第二表面区域，并且其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不相同；(b)适于在非均匀温度下DNA杂交的缓冲溶液，其中缓冲溶液接触第一表面区域和第二表面区域；(c)包含第三核苷酸序列的第三寡核苷酸，其中第三寡核苷酸与第一寡核苷酸杂交；以及(d)第一温度区和第二温度区，其中第一温度区具有比第二温度区的温度高至少10℃的温度。

第一表面区域可位于第一表面上，并且第二表面区域位于第一表面上。第一表面区域可位于第一表面上，并且第二表面区域位于第二表面上，其中第一表面和第二表面是不同的表面。第一核苷酸序列可包含不与第三核苷酸序列互补的第一核苷酸区域。第三核苷酸序列可包含不与第一核苷酸序列互补的第二核苷酸区域。

缓冲溶液可包含至少60质量％的水以及至少1mM浓度的阳离子。第一寡核苷酸的长度和第二寡核苷酸的长度可介于5个核苷酸和20,000个核苷酸之间。第一寡核苷酸和第二核苷酸的长度可介于5个核苷酸和200个核苷酸之间。第三寡核苷酸的长度可介于5个核苷酸和20,000个核苷酸之间。第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸可相同或不同，并且可包含选自下列的核酸：DNA、RNA、核苷酸类似物、以及它们的任何组合。

核苷酸类似物可选自LNA、PNA、吗啉代-寡核苷酸、以及它们的任何组合。第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸中的至少一者可用化学部分官能化，其中化学部分允许检测寡核苷酸。化学部分可选自TAMRA、ROX、HEX、有机荧光基团、量子点、纳米粒子、亚甲蓝、电化学活性分子、以及它们的任何组合。

缓冲溶液可包含可检测分子，诸如选自SybrGreen染料、Syto染料和EvaGreen染料的可检测分子，其中相比于游离于溶液中时，可检测分子在非不可逆地结合于寡核苷酸时表现出不同的单位信号。第一表面和第二表面可相同或不同地选自玻璃、石英、塑料、聚合物、金属、复合材料、以及表面自组装单分子层。聚合物可为PDMS。

第一表面区域可包括比缓冲溶液的最大温度低10℃的温度，并且其中第二表面区域可包括比缓冲溶液的最大温度低10℃的温度。系统还可包括与第一表面区域和第二表面区域接触的至少一个加热/冷却元件。至少一个加热/冷却元件可选自热板、加热风扇、IR-加热器、以及水浴。热板可选自热阻加热器和珀耳帖元件。系统还可包含以模板指导方式(诸如酶促进核酸模板的模板指导的延伸的情况)修饰核酸的酶。

一种用于无酶扩增和检测核酸靶标的方法，所述方法包括：(a)使样品与组合物在反应室中接触，其中组合物包含：

适于DNA杂交的缓冲溶液；

第一表面区域和第二表面区域，其中缓冲溶液接触第一表面区域和第二表面区域；

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一寡核苷酸官能化至第一表面区域；

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二核苷酸序列，其中第二寡核苷酸官能化至第二表面区域；以及

第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含第三核苷酸序列，其中第三寡核苷酸与第一寡核苷酸杂交，

其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列不相同，并且其中第三核苷酸包含不与第一核苷酸序列互补的第一核苷酸区域；

(b)差温加热反应室的一部分，其中室区域的最高温度比室最低温度高至少10℃；以及(c)检测潜在扩增。

反应室可包含选自玻璃、石英、塑料、聚合物、金属、以及它们的任何组合的至少一种材料。聚合物可为PDMS。室区域的最大温度可介于60℃和100℃之间。室的最小温度可介于20℃和60℃之间。第一表面区域和第二表面区域不可加热至室区域的最大温度的10℃内。

组合物可位于反应室中，并且其中第一表面区域位于第一表面，并且第二表面区域位于第一表面。组合物可位于反应室中，其中第一表面区域可位于第一表面上，并且第二表面区域可位于第二表面上，并且其中第一表面和第二表面是不同的表面。检测潜在扩增还可包括通过检测装置来光学检测荧光变化，所述检测装置选自光电二极管、光电倍增管、荧光显微镜、CCD摄像机、以及任何其它光学检测装置。检测潜在扩增还可包括通过电化学稳压器/恒流器进行电化学检测。检测潜在扩增还可包括使用石英晶体微量天平技术测量第一表面区域的质量。

在另一个实施方案中，提供了一种用于酶依赖性扩增和检测核酸靶标的方法，包括：(a)使样品与组合物在反应室中接触，其中组合物包含：

适于DNA杂交的缓冲溶液；

表面区域，其中缓冲溶液接触表面区域；

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一核苷酸序列，其中第一寡核苷酸官能化至表面区域；

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二核苷酸序列；以及酶，所述酶以模板指导方式修饰核酸，其中第二核苷酸序列包含不与第一核苷酸序列互补的核苷酸区域；

第一寡核苷酸可包含不与第二核苷酸序列互补的第二核苷酸区域。酶可选自DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、内切核酸酶和外切核酸酶。反应室可包含选自玻璃、石英、塑料、聚合物、金属、以及它们的任何组合的至少一种材料。聚合物可为PDMS。

室区域的最大温度可介于80℃和100℃之间。室的最小温度可介于20℃和80℃之间。表面区域不可加热至室区域的最大温度的10℃内。检测潜在扩增还可包括通过检测装置光学检测荧光变化，所述检测装置选自光电二极管、光电倍增管、荧光显微镜、CCD摄像机、以及任何其它光学检测装置。检测潜在扩增还可包括通过电化学稳压器/恒流器进行电化学检测。检测潜在扩增还可包括用石英晶体微量天平技术测量第一表面区域的质量。

在本公开的一个实施方案中，表面寡核苷酸官能化可通过各种化学和物理方法进行，包括但不限于共价固定、静电相互作用或非共价固定诸如生物素-亲和素(或它们的类似物)。

在本公开的一个实施方案中，检测靶分子可为单链DNA、双链DNA、RNA或它们的混合物。

在本公开的一个实施方案中，扩增子检测和反应监测通过包括但不限于以下的方法：荧光(包括表面等离振子共振，SPR)、UV吸光度、电化学检测(包括pH变化和电荷转移)、石英晶体微量天平(QCM)。

在本公开的一个实施方案中，所提出的方法可用于辨别核酸序列变异，包括可指示抗药性或疾病预后的单核苷酸变异(SNV)。

在本公开的一个实施方案中，所提出的方法可用于定量特异性生物样品中的一个、几个或多个靶分子。

如本文所用，术语“环形”可用于参考如上所述的室的形状，并且可具有圆形、椭圆形或盘状的其正常含义。然而，环形也可在该语境中解释为具有其它规则或不规则形状，只要该室构成无终端且无始端的连续回路。

如本说明书所用，“一个”或“一种”可意指一个或多个。如本权利要求中所用，当与词语“包含”一起使用时，词语“一个”或“一种”可意指多于一个。

虽然本公开支持仅指替代项和“和/或”的定义，但除非明确指示仅指替代项或者替代项是互相排斥的，权利要求书中使用的术语“或”用于指“和/或”。如本文所用，“另一个”可意指至少第二或更多。

贯穿本专利申请，术语“约”用于指这样的值，其包括装置和用于测定值的方法的误差的固有变化，或研究主体之间存在的变化。此类固有变化可为所述值±10％的变化。

贯穿本专利申请，术语“不可逆地连接”用于指示在预期应用的通常情况下稳定的化学相互作用。一些实施方案中不可逆的连接可指诸如通过叠氮化物-炔烃链接化学共价连接，并在其它实施方案中可指生物素-亲和素相互作用或其它非共价长期相互作用。

贯穿本专利申请，术语“PCR缓冲液”用于指示具有与经由聚合酶链反应(PCR)通过DNA聚合酶进行的DNA扩增相容的盐度和化学组成的水溶液。缓冲液可与DNA聚合酶本身、引物和/或dNTP一起使用。

贯穿本专利申请，术语“杂交缓冲液”用于指示具有与DNA杂交和通过互补DNA寡核苷酸形成的稳定DNA双链体相容的盐度和化学组成的水溶液。所有PCR缓冲液均可被视为杂交缓冲液，但反之亦然。

根据下述具体实施方式，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，具体实施方式和具体实施例在指出本发明的优选的实施方案的同时，仅仅以举例说明的方式给出，因为根据该具体实施方式在本发明的实质和范围内的各种变化和修改对本领域内的技术人员变得显而易见。

附图说明

以下附图构成了本说明书的部分，并包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合本文所示的具体实施方案的详细描述可以更好地理解本公开。

图1示出垂直安装于温差加热器上的流体芯片的一个实施方案的示意图。流体芯片包括反应室，该反应室具有用于官能化DNA寡核苷酸的表面。在一些实施方案中，该芯片用于进行对核酸的多重基于PCR的检测。

图2示出了系统的一个实施方案，其中流体芯片垂直安装于温差加热器上。水平安装的光源激发官能化至芯片的DNA上的荧光部分；荧光信号经由所示检测器定量。

图3示出流体芯片(左侧)、安装于加热器上的芯片(中间)和安装于加热器上的具有矩形室的芯片(右侧)的相机照片。

图4示出用DNA寡核苷酸官能化载玻片的化学方法的一个示例，以形成检测探针的一部分。该方法是PDITC(对亚苯基二异硫氰酸酯)活化的玻璃与叠氮基-PEG-胺(11-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一烷-1-胺)的两步反应，随后经由铜催化的炔烃-叠氮化物环加成反应与炔烃官能化寡核苷酸缀合，其导致通过亲水性PEG接头的寡核苷酸连接。官能化表面的亲水性防止反应组分诸如靶DNA、引物和酶的非特异性吸收。叠氮化物官能化表面与经位阻环炔烃改性的寡核苷酸的无铜反应也导致寡核苷酸与表面的稳定和高度特异性共价连接。

图5中示出官能化探针结构的示例。官能化至表面的寡核苷酸用荧光基团标记，并且与表面官能化探针杂交的寡核苷酸用淬灭剂标记。当检测靶标从表面置换淬灭剂标记的寡核苷酸时，表面的荧光强度增大。底图示出引入靶标之前和之后的荧光显微镜图像；此处点直径为1mm。寡核苷酸如下：

Alk-TMR-1 /5己炔基/tttt/i6-TAMN/tggatgctgaatacttgtgataataca(SEQ IDNO：1)

32-RQ ccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcca/3IAbRQSp/(SEQ ID NO：2)

54 tggatgctgaatacttgtgataatacacctctacgg(SEQ ID NO：3)

图6示出施加对流流动时基因组DNA(gDNA)模板在流体芯片内的聚合酶链反应(PCR)扩增的示意图；序列(10)指示正向引物，并且序列(11)指示反向引物。在正链中包含结构域10-15-16-17且在反链中包含结构域11-12-13-14的双链扩增子在95℃热区中变性，并且然后通过对流携载至60℃区，在该处其可置换淬灭剂标记的寡核苷酸，以在对应点中产生增大的荧光。

图7示出在对流芯片内的PCR扩增结果。左图示出扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。泳道1示出在对流芯片中10ng的NA18562 gDNA模板扩增30分钟的扩增产物。引物浓度对于正向引物为600nM，而对反向引物为200nM。泳道2示出阴性对照，具有引物、聚合酶、dNTP和探针点，但无gDNA输入。梯带为50bp梯带(New England Biolabs)作为参照。右图示出通过扩增反应的点强度的荧光时程。用于该实验的探针和引物被设计用于靶标rs7517833(参见图20)。

图8展示流体芯片中的对流流动。左上方图显示在不存在跨越芯片的温度梯度(对于两者加热器为60℃)时荧光跟踪珠的荧光图像。右上方图示出当施加温度梯度(对于左加热器95℃且对于右加热器60℃)时荧光跟踪珠的时延(2秒)荧光图像。底图汇总了所观察的基于室厚度的平均对流流速。

图9示出在流体芯片内多个扩增子的基于阵列的读出的示意图。右图示出具有24个点样的点的芯片的荧光图像。标记为M的点是缺乏淬灭剂标记的寡核苷酸的阳性对照点。其它点各自对特定扩增子序列是特异性的。

图10示出在对流PCR之前和之后的流体芯片的探针阵列区域的荧光图像。引入产生与点2、3和4处探针对应的扩增子的引物(各正向引物600nM，各反向引物200nM)以及10ng的gDNA模板。点14的较高荧光是无意的，并且可能由较差官能化或杂交的DNA探针分子所致。

图11示出对流流体芯片中9重PCR扩增的时程荧光。基于背景荧光和标记点M的荧光强度，对各个点的荧光强度分别定量和归一化。各个正向引物浓度为200nM且各个反向引物浓度为100nM，并且gDNA输入为10ng。

图12示出对于人、小鼠和大鼠DNA，对应于引物的对流流体芯片中的3重PCR扩增。此处，行中的所有点具有相同的序列同一性和相同的扩增子报告。顶行是阳性对照探针。在反应室中，各正向引物为600nM，各反向引物为200nM，并且gDNA模板为10ng。实验中使用的序列如下：

引物

h_ppia_fp gttaacagattggaggtagtagcatttt(SEQ ID NO：4)

h_ppia_rp tctatcaccaccccccaact(SEQ ID NO：5)

r_b2m_fp caggtattttggggtatgattatggtt(SEQ ID NO：6)

r_b2m_rp ccaacagaatttaccaggaaacaca(SEQ ID NO：7)

m_gadph_fp caatacggccaaatctgaaagacaa(SEQ ID NO：8)

m_gadph_rp ctgcaggttctccacacctat(SEQ ID NO：9)

臂

h_ppia_臂

agcagtgcttgctgttccttagaattttgccttgtgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg(SEQ ID NO：10)

r_b2m_臂

ctggttcttactgcagggcgtgggaggagcgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg(SEQ ID NO：11)

m_gadph_臂

gatagcctggggctcactacagacccatgagggcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg(SEQ ID NO：12)

淬灭剂

h_ppia_q/

5IAbRQ/acaaggcaaaattctaaggaacagcaagcactgctgcacgatcaggggt(SEQ ID NO：13)

r_b2m_q/gctcctcccacgccctgcagtaagaaccagaccccagcctttacac(SEQ ID NO：14)

m_gadph_q/

5IAbRQ/cctcatgggtctgtagtgagccccaggctatctcatgttcttcagagtgga(SEQ ID NO：15)

锚定剂

/DBCO/tttttcctgacccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcgc/ATTO-550/(SEQID NO：16)

图13A示出具有各自用不同的DNA寡核苷酸试剂官能化的两个表面区域的反应室的示意图。不同于图1，寡核苷酸试剂在序列上不独立，而是合理地设计用于无酶扩增。图13B示出了两个表面区域的两个可能实施方案：它们处于不同的表面上，或处于同一表面上但远离定位以防止直接相互作用。

图14A示出了具有第六序列(6)和第七序列(7)的靶核酸序列的线性扩增的机制。靶核酸序列催化具有第二序列(2)和第三序列(3)的多个寡核苷酸从表面区域1转移至表面区域2。热区中双链DNA分子的自发离解(23∶67)是允许快速代谢周转的关键。图14B示出图14A中所述方法的净反应，以及允许实时读出的荧光标记策略。图14C显示翻转5’/3’取向(半箭头表示3’端，如文献中定制)的替代的实施方式。

图15示出对照实验的机制，其中靶核酸序列诱导表面结合的寡核苷酸化学计量重排。

图16示出在引入各种浓度的靶核酸时表面区域1的时程荧光。线性扩增芯片中的荧光相比于化学计量转化芯片更快地减小，支持了无酶DNA扩增机制。

图17示出靶核酸序列的指数扩增的机制。

图18示出通过使用嵌入染料(诸如SybrGreen或EvaGreen)报告无酶扩增的视觉表示。表面区域1的荧光强度将在反应过程中减小，并且表面区域2的荧光强度将增大。

图19示出通过使用荧光基团官能化寡核苷酸报告无酶扩增的视觉表示。表面区域1的荧光强度将在反应过程中增大，并且表面区域2的荧光强度将在反应过程中保持较暗。

图20示出用于PCR扩增/检测的引物和探针(锚定剂+臂+淬灭剂)的列表。

具体实施方式

此处，发明人呈现用于DNA扩增测定的装置、系统和方法。本公开采用试剂的固相分离来防止导致假阳性的非预期分子事件，并且使用对流流动循环以允许双链扩增子自发离解。下文描述了相比于本发明的三种相关现有技术及其局限性。

1.对流流动PCR

液体在保持于非均匀温度且体积受限时将经由称为瑞利-贝纳尔(Rayleigh-Benard)对流流动[¹]的过程循环。瑞利-贝纳尔对流已用于分子诊断，以产生用于为PCR提供必要的温度循环的低成本装置(对流流动PCR，cf-PCR)[²，美国专利6,586,233 B2，美国专利8,735,103 B2，美国专利8,187,813 B2]。cf-PCR仅需要以约95℃的高温和约60℃的低温(退火/延伸温度)维持的静态温度梯度，从而消除对高能耗热循环仪器的需要。

cf-PCR已被证实用于单重[^3-5，美国专利8,187,813 B2]和多重检测特异性DNA序列[⁶]；多重方法利用终点电泳结果检测。因为cf-PCR缺乏传统qPCR测定的温度均匀性，cf-PCR难以用于需要高序列选择性的应用，诸如用于检测或绘制单核苷酸变异(SNV)的应用，因此尚未示出SNV特异性cf-PCR。cf-PCR的实时检测仅示于采用非特异性荧光染料(SYBRGreen I)检测方法的溶液相中[⁷]。该方法限制cf-PCR在多重设置中使用。同样，序列特异性实时检测方法诸如5’-核酸酶测定化学或杂交探针的应用将因荧光基团光谱重叠而允许同时检测不超过5-6个靶标。本公开与cf-PCR的不同之处在于本公开提供空间分辨的多重读出而无需开管步骤进行后续分析。此外，在本公开的无酶实施方案中，并不需要酶用于扩增。

2.微阵列

微阵列技术是用于多重筛选生物样品的主要技术之一。多个探针序列官能化至表面，并且特定点的荧光信号被视为对应序列的定量读出。该技术已被证明成功用于检测各种类型的生物分析物，诸如DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物和细胞[^8-12]。已发现应用的微阵列技术在核酸测试领域中得到最广泛的使用。微阵列技术已经示出用于全基因组杂交、从头测序、重测序、比较基因组学、转录物组杂交或鉴定单核苷酸变异的NA微阵列应用[^13-15]。所有前述NA应用都需要大量的NA靶标进行杂交，因此微阵列通常用作PCR扩增产物的最终读出。微阵列读出通常较缓慢，需要杂交过夜，并且还由于开管法而有扩增子污染的风险。

3.支点(Toehold)探针和无酶扩增

支点介导的链置换反应[^19-21]是在不存在酶时发生的竞争性杂交过程，并且与本公开相关。已展示使用支点介导的链置换，DNA和RNA分析物序列在均匀溶液中的无酶扩增[^22-27](美国专利8,043810 B2，美国专利8,110,353 B2)。本公开的无酶扩增实施方案的不同之处在于，热对流流动用于自发地离解双链扩增子，并且表面官能化用于使反应性试剂彼此螯合以减少假阳性。将支点介导的链置换应用于表面官能化DNA寡核苷酸(美国专利8,630,809 B2)，以使靶分析物序列化学计量转化为其它序列。本公开在提供检测靶标的扩增方面有所不同。

4.申请入的技术

本公开描述了用于扩增和检测特异性核酸靶序列的试剂和装置。本公开利用了寡核苷酸试剂的固相官能化和螯合，以便防止导致假阳性的非预望分子事件，并且应用瑞利-贝纳尔热对流流动用于靶标再生并有利于DNA表面杂交动力学(更有效地混合反应混合物)。瑞利-贝纳尔对流流动方案可如下实现：在以定义角度倾斜的两个差分控制的热板(图1-3)之间放置反应室，该反应室由两个1mm厚水白玻璃显微镜载玻片组成，该载玻片被双面胶带分隔为250μm厚度的间隔件。间隔件的形状决定反应室的形状，并且可被改变以变更对流流速和轨迹。将玻璃选择为芯片材料，因为玻璃有利于维持整个室上的均匀温度梯度，并允许用合成寡核苷酸进行表面官能化。

将热板设定为维持两种不同的温度(分别为冷加热器和热加热器)，这引起在整个填充有液体反应混合物的反应室上的温度梯度。位于室的热部分附近的液体具有较高温度，并因此相比于位于温度较低的室的部分中的液体不太致密。液体密度在受限容积中的此类分布导致在浮力和重力(分别在热和冷加热器附近)之间的差值，这继而导致循环稳态对流流动机构。

溶解于液体中的所有分子均涉及对流流动所牵引的温度区之间的循环。沿着温度区行进，分子经历了周期性温度变化。例如，置入循环对流流动的双链DNA分子经历多个加热和冷却循环。如果热区中溶液的温度足以解开DNA双链体，并且冷区的温度有利于使给定核酸维持为双链形式，则核酸在该对流流动中的循环导致可重复的变性和退火循环。所观察的双链DNA变性和退火的多个循环可通过各种方法进行，例如使用荧光显微镜法通过记录与DNA样品一起置入反应混合物中的非特异性DNA染色染料的强度进行。

原型加热仪器由胶合到铝板的两个电阻Kapton箔加热器组成，并且可同时用于提供给至多五个流体芯片差温加热。两个低瓦数电源为加热器供电。所提出的扩增系统容许加热元件温度误差在±2℃范围内，并且不需要精确的计算机控制的硬件。

5.无酶线性扩增实施方案

本公开显示靶核酸的无酶扩增，其中扩增子浓度随时间呈线性增大(图14A)。使两个表面区域用两种DNA寡核苷酸即供体D(包含结构域1)和受体A(包含结构域4-5)不可逆地官能化。使官能化至表面区域1的供体寡核苷酸首先与包含结构域2-3(与结构域4-5互补)的单链S以使得单链结构域2暴露于溶液并发挥支点序列作用的方式杂交。受体链不可逆地官能化至表面区域2，并且初始表示单链寡核苷酸。表面区域1和2位于保持在35℃的温度区(35℃区)，其中D-S双链体被设计成在检测测定的时间尺度内高度稳定。将靶分子T(包含结构域6-7)引入反应溶液中，并将通过对流流动转移至反应室的35℃区。靶标T经由结构域7(“支点”结构域)结合信号S，并且结构域3经由支点介导的链置换机制从表面置换至溶液。随后，瑞利-贝纳尔对流流动将双链体携载至室的热区(保持于85℃)，在该热区双链体被离解。两个单链分子即靶链T和信号链S然后转移回室的35℃区中，其中链S与官能化至表面区域2的受体寡核苷酸A结合。同时，允许单链靶标T催化置换表面区域1的另一个信号S分子，从而完成催化循环。该触发应当连续进行直至信号分子S完全从表面区域1转移至表面区域2。

线性扩增方案展示同时使用固相螯合的寡核苷酸反应物和温度驱动的对流流动的益处。寡核苷酸试剂在不同的表面区域上的固定允许避免在不存在靶序列时假阳性信号分子释放(伪扩增)，同时除自发运输和改善的质量传递之外，热对流流动经由靶标-信号复合物(T-S)的解链而诱导靶标再生。相比之下，改变整个溶液的温度是不可取的，因为其将导致所有寡核苷酸从表面自发离解。

用荧光染料标记信号链S表示用于实时监测线性扩增过程的一种方法。所记录的表面区域1的荧光强度的减小，以及所记录表面区域2的荧光强度的增大可有效地反映出扩增反应如何进行反应。

6.化学计量检测实施方案

为了证明无酶扩增方法表现出多个代谢周转，发明人使用对流装置构造出相应的化学计量检测系统(图15)。化学计量系统也包括用包含结构域11-12的供体Ds链以及包含结构域16的受体As链官能化的两个表面区域。Ds链与由包含结构域14-15的桥接寡核苷酸Bs和包含结构域13的信号寡核苷酸Ss组成的信号复合物杂交。Bs链的结构域14和As链具有相同的序列。引入反应中的包含结构域17-18的靶分子T结合供体Ds的支点结构域11，并且然后将信号复合物置换到溶液中。在该过程期间，靶标T结合供体Ds并且不能在室的热区中再生，以便触发另一个信号复合物从表面区域1释放。经置换的信号复合物通过对流流动转移到85℃区中，在该区中其被离解。在离解之后，信号分子Ss转移回至35℃区，并且被官能化至表面区域2的受体寡核苷酸As捕集。因此，所捕集的信号链Ss的量等于引入系统中的靶标T的量。

化学计量检测系统的实时观测也可经由用荧光染料简单标记信号链Ss并记录表面区域2的荧光强度变化来进行。图16示出给出相同初始量的检测靶标，线性扩增和化学计量检测系统的荧光在表面区域1上基于时间的减小。相比于支持各个靶分子催化多个信号分子从表面1转移到表面2的设计机制的线性扩增测定，线性扩增系统中荧光信号更快地减小。

7.无酶指数扩增实施方案

图17示出本公开的一个实施方案，其中检测靶标触发浓度随时间呈指数增大的扩增子产物释放，直到试剂被消耗完(图17)。在该系统中，这两个表面区域用部分双链寡核苷酸复合物官能化：表面区域1具有由单结构域寡核苷酸1组成的复合物，该单结构域寡核苷酸1不可逆地连接至表面并以使得结构域3保持为单链且充当支点序列的方式与包含结构域3-2的寡核苷酸S1杂交。表面区域2反射表面区域1并且具有官能化至表面的寡核苷酸试剂的类似构造：包含结构域4的寡核苷酸不可逆地官能化至表面，并与包含结构域6-5的寡核苷酸S2杂交，其中结构域6表示单链支点。将包含结构域7和8(序列分别与结构域6和5相同)的靶链T注射到反应混合物中，导致寡核苷酸S1以双链扩增子形式从表面区域1释放。

对流流动将双链体携载至85℃区，在该区双链体解链。现在，两种单链寡核苷酸即初始靶标T和释放的链S1流回至35℃区，在该区它们每者触发新的寡核苷酸物类从表面释放。具体地，靶寡核苷酸T催化第二链S1从表面区域1释放，同时初始释放的链S1触发链S2从第二表面区域释放。因此，在每个对流流动循环结束时，存在于溶液中的寡核苷酸物类的量加倍，导致溶液相中扩增子物类呈指数积聚。

8.替代的检测方法

图14B呈现用于测定反应进度的一种可能的检测机制。也利用荧光显微镜的替代的读出方法是可行的。可使用非序列特异性嵌入核酸染色染料(诸如SybrGreen和Syto染料)来指示所积聚的双链产物的总量(图18)。因为固定于表面区域2上的受体链A(结构域4-5)在反应开始时呈单链形式，因此嵌入染料将对链A具有较低亲和力。在反应过程中，越来越多的链S(结构域2-3)将与表面官能化链A(结构域4-5)杂交。新形成的复合物A-S现在将被染料有效地染色，导致表面区域2的荧光增大。可在表面区域1上潜在地观察到相反情况。

基于FRET的检测技术的应用示出指数扩增的示例(图19)。例如，在添加靶标之前，不可逆地标记有荧光染料的表面固定的链(结构域1标记示出)可有效地用淬灭剂官能化信号链(具有结构域2-3的链示出具有荧光淬灭剂)猝灭。靶标的添加将导致信号链从表面指数释放并使表面固定的链发光。

9.对流流动PCR的实时检测

本公开要求保护的组合物的另一个应用是组合物可用作基于表面实时监测在溶液中进行的酶促核酸扩增过程的有效方式。没有报道使用表面官能化探针实时监测基于对流的PCR的示例。

图6示出所要求保护的组合物用于实时监测在温度驱动的对流流动中进行的PCR反应的方法。最初，将位于60℃区内的表面区域1用包含结构域1和荧光染料的锚定剂寡核苷酸官能化。包含结构域3-2的臂寡核苷酸通过其2结构域与锚定剂寡核苷酸杂交。锚定剂-臂寡核苷酸复合物继而与包含结构域4和5和荧光猝灭剂的淬灭剂寡核苷酸通过该淬灭剂寡核苷酸的结构域4进行杂交；结构域5为单链。反应溶液包含用于酶促延伸寡核苷酸引物(结构域10和11)的试剂，诸如DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸的混合物、二价离子(Mg²⁺)。在注射靶分子(gDNA)之后，其在95℃自发地解链。然后，使解链的gDNA通过对流流动转移到60℃区中，在该处引物与其特异性靶序列退火并通过DNA聚合酶延伸，导致形成在正链中包含结构域10-15-16-17并在反链中包含11-12-13-14的双链扩增子分子。扩增子分子在95℃下解链并流回至60℃区，在该处正链10-15-16-17从表面官能化复合物锚定剂-臂置换淬灭剂寡核苷酸，导致表面区域1中记录的荧光信号增大。

10.多个靶序列的同时监测

本公开中所提出的组合物和方法允许同时监测多个核酸靶序列的扩增(无酶或基于酶)。不同的表面区域的不同的寡核苷酸探针的空间形态允许基于阵列或摄影机的读出，以提供关于每个靶标扩增反应的扩增子浓度的独立信息。

11.示例性寡核苷酸

以下寡核苷酸序列以举例的方式提供，但不限于以下：

线性扩增系统寡核苷酸

1/5己炔基/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT(SEQ ID NO：17)

2-3/56-TAMN/TGGATGCTG-AATACTTGTGATAATACACCTCTACGG(SEQ ID NO：18)

4-5/5己炔基/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA(SEQ ID NO：19)

6-7CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA(SEQ ID NO：20)

化学计量检测系统寡核苷酸

11-12/5己炔基/TTTTTTGTCAACC-ATCATCGTTCGTACCACAGTGTTCAG(SEQ ID NO：21)

13/56-TAMN/TGGATGCTGAATACTTGTGATAATACACCTCTACGG(SEQ ID NO：22)

14-15

CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCA-CTGAACACTGTGGTACGAACGATGA(SEQ IDNO：23)

16/5己炔基/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCA(SEQ ID NO：24)

17-18 CTGAACACTGTGGTACGAACGATGAT-GGTTGACA(SEQ ID NO：25)

12.参考文献

按照文献提供的补充本文所述内容的示例性程序细节或其它细节的程度，下列参考文献特别以引用方式并入本文。

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<151> 2016-03-29

<160> 66

<170> PatentIn版本 3.5

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

tttttggatg ctgaatactt gtgataatac a 31

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catcca 36

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 4

gttaacagat tggaggtagt agcatttt 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

tctatcacca ccccccaact 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

caggtatttt ggggtatgat tatggtt 27

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

ccaacagaat ttaccaggaa acaca 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

caatacggcc aaatctgaaa gacaa 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 9

ctgcaggttc tccacaccta t 21

<210> 10

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 10

agcagtgctt gctgttcctt agaattttgc cttgtgcgat gctgaatact tgtgataata 60

cacctctacg ggtcagg 77

<210> 11

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

ctggttctta ctgcagggcg tgggaggagc gcgatgctga atacttgtga taatacacct 60

ctacgggtca gg 72

<210> 12

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

gatagcctgg ggctcactac agacccatga gggcgatgct gaatacttgt gataatacac 60

ctctacgggt cagg 74

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 13

acaaggcaaa attctaagga acagcaagca ctgctgcacg atcaggggt 49

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

gctcctccca cgccctgcag taagaaccag accccagcct ttacac 46

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 15

cctcatgggt ctgtagtgag ccccaggcta tctcatgttc ttcagagtgg a 51

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

tttttcctga cccgtagagg tgtattatca caagtattca gcatcgc 47

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta tt 32

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 18

tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 19

tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta ttcagcatcc a 41

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 20

ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catcca 36

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 21

ttttttgtca accatcatcg ttcgtaccac agtgttcag 39

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 22

tggatgctga atacttgtga taatacacct ctacgg 36

<210> 23

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 23

ccgtagaggt gtattatcac aagtattcag catccactga acactgtggt acgaacgatg 60

a 61

<210> 24

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 24

tttttccgta gaggtgtatt atcacaagta ttcagcatcc a 41

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 25

ctgaacactg tggtacgaac gatgatggtt gaca 34

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 26

ccaggggctg tgcagaatgg a 21

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 27

tctaaaaata gagcatgaaa tggctcc 27

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 28

gaggtcatgt gcatttaaag ttgggttc 28

<210> 29

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 29

gcacgccccc ggc 13

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 30

ggcagctctg gagggcgc 18

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 31

actaacctgt taacttcgag ctga 24

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 32

cctgaggtgg gcactggact g 21

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 33

gtatggtttt gcttaatttc cctaacac 28

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 34

cttcagcaca aactccttct aagcaga 27

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 35

gttcgcaggg tttcacaaaa atag 24

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 36

gagccctact tttgaatccc caggta 26

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 37

ctgaagcatc ttagtgcttt taaattatag aatta 35

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 38

accacttaag atttgatttt tatcattaat tgtgatgc 38

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 39

gtatcagagc caagttcaat aagcatt 27

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 40

ggaaatgagg ttgggaccaa aagaaga 27

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 41

atcacctccc ccagatcact 20

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 42

actgcctgct tgtcaacagc tatc 24

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 43

acttccatgt tttaaagcat ctacgg 26

<210> 44

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 44

tgccacagcc agaaatcagc gcacggcgcg atgctgaata cttgtgataa tacacctcta 60

cgggtcagg 69

<210> 45

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 45

gagtctctta ggaccccagg gttctaaggc ccgcgatgct gaatacttgt gataatacac 60

ctctacgggt cagg 74

<210> 46

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 46

ggtgggaagg agggagcacg ggcttccgcg atgctgaata cttgtgataa tacacctcta 60

cgggtcagg 69

<210> 47

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 47

cagggttttc tctgattcgt gtgcttctct cccagcgatg ctgaatactt gtgataatac 60

acctctacgg gtcagg 76

<210> 48

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 48

cctccccaca agtgtatgag ggtggctgct gcgatgctga atacttgtga taatacacct 60

ctacgggtca gg 72

<210> 49

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 49

gcaaggaata acccctgtca aaccatcaga aagaagcgcg atgctgaata cttgtgataa 60

tacacctcta cgggtcagg 79

<210> 50

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 50

cagaaattgt actagatgct gaggactaaa gatacttaag tatcttatcg cgatgctgaa 60

tacttgtgat aatacacctc tacgggtcag g 91

<210> 51

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 51

tcttccctct tgctttgtca atcagttctc agtagcagcg atgctgaata cttgtgataa 60

tacacctcta cgggtcagg 79

<210> 52

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 52

gggctcaaaa gatggccagc agaagaagca tagtgcgatg ctgaatactt gtgataatac 60

acctctacgg gtcagg 76

<210> 53

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 53

aaaacaaggc agtcacaaag gctagcacta ccattggcga tgctgaatac ttgtgataat 60

acacctctac gggtcagg 78

<210> 54

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 54

aatgtctagc ccatagtgga tgccctgtta gtggtgcgat gctgaatact tgtgataata 60

cacctctacg ggtcagg 77

<210> 55

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 55

gccgtgcgct gatttctggc tgtggcagaa gagatgccta caa 43

<210> 56

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 56

gggccttaga accctggggt cctaagagac tcatcctgaa gccaag 46

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 57

ggaagcccgt gctccctcct tcccaccaca catggcacaa a 41

<210> 58

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 58

tgggagagaa gcacacgaat cagagaaaac cctgcaggga cagca 45

<210> 59

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 59

agcagccacc ctcatacact tgtggggagg gagcctccag c 41

<210> 60

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 60

gcttctttct gatggtttga caggggttat tccttgcaaa caaaacagac caaaa 55

<210> 61

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 61

gataagatac ttaagtatct ttagtcctca gcatctagta caatttctgg ttctttgtat 60

gcagt 65

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 62

tgctactgag aactgattga caaagcaaga gggaagacct ttctgaggcc 50

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 63

actatgcttc ttctgctggc catcttttga gcccacaggc agggaa 46

<210> 64

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 64

caatggtagt gctagccttt gtgactgcct tgttttgggc tgccatg 47

<210> 65

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 65

accactaaca gggcatccac tatgggctag acattgtcct aagcacttca 50

<210> 66

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 66

tttttcctga cccgtagagg tgtattatca caagtattca gcatcgc 47

Claims

1.一种装置，所述装置包括具有多个寡核苷酸复合物的表面，其中所述寡核苷酸复合物各自包含：

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一DNA序列以及使所述第一寡核苷酸与所述表面不可逆地连接的连接部分，以及

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中所述第二DNA序列与所述第一DNA序列互补并与其杂交，其中所述第二DNA寡核苷酸不包含荧光部分并且不与所述表面不可逆地连接。

2.根据权利要求1所述的装置，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

3.根据权利要求1所述的装置，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

4.根据权利要求2所述的装置，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

5.根据权利要求3所述的装置，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

6.根据权利要求1至5所述的装置，其中所述第一寡核苷酸中的每者包含荧光部分。

7.根据权利要求6所述的装置，其中所述第二寡核苷酸中的所述每者包含荧光淬灭剂。

8.根据权利要求4至5所述的装置，其中所述空间离散区域中的每者还包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中所述第四DNA序列与所述第三DNA序列互补。

9.根据权利要求8所述的装置，其中所述第三寡核苷酸各自包含荧光淬灭剂部分。

10.根据权利要求1所述的装置，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

11.根据权利要求1至10所述的装置，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

12.根据权利要求1至10所述的装置，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

13.根据权利要求12所述的装置，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

14.根据权利要求8所述的装置，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

15.根据权利要求8所述的装置，其中所述第四DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

16.一种流体反应室，所述流体反应室包括：

第一表面，

第二表面，所述第二表面不接触所述第一表面，其中所述第一表面和第二表面彼此面对，

材料，所述材料接触所述第一表面和所述第二表面并形成所述反应室的外边界，以及

材料，所述材料接触所述第一表面和所述第二表面并形成所述反应室的内边界，

其中所述第一表面包含多个寡核苷酸复合物，其中所述寡核苷酸复合物各自包含：

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中所述第二DNA序列与所述第一DNA序列互补并与其杂交，其中所述第二DNA寡核苷酸不与所述第一表面不可逆地连接，并任选地不包含荧光部分。

17.根据权利要求16所述的流体反应室，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

18.根据权利要求16所述的流体反应室，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

19.根据权利要求17所述的流体反应室，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

20.根据权利要求18所述的流体反应室，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

21.根据权利要求16至20所述的流体反应室，其中所述第一寡核苷酸中的每者包含荧光部分。

22.根据权利要求21所述的流体反应室，其中所述第二寡核苷酸中的所述每者包含荧光淬灭剂部分。

23.根据权利要求20至21所述的流体反应室，其中所述空间离散区域中的每者还包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中所述第四DNA序列与所述第三DNA序列互补。

24.根据权利要求23所述的流体反应室，其中所述第三寡核苷酸各自包含荧光淬灭剂部分。

25.根据权利要求16所述的流体反应室，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

26.根据权利要求16至25所述的流体反应室，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

27.根据权利要求16至25所述的流体反应室，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

28.根据权利要求27所述的流体反应室，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

29.根据权利要求23所述的流体反应室，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

30.根据权利要求16至29所述的流体反应室，其中形成所述室的所述内边界和外边界的接触第一表面和第二表面的所述材料具有介于40微米(40μm)和2毫米(2mm)之间的厚度。

31.根据权利要求16至30所述的流体反应室，其中所述流体反应室为圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形、八边形、菱形或梯形。

32.根据权利要求16至31所述的流体反应室，其中所述流体反应室不处于均匀的温度，并且其中所述反应室的最温暖的区域比所述反应室的最冷区域高至少10℃。

33.根据权利要求16至32所述的流体反应室，其中所述反应室的所述最冷区域介于约50℃和约75℃之间。

34.根据权利要求16至33所述的流体反应室，其中所述反应室的最热区域介于约80℃和约100℃之间。

35.根据权利要求16至34所述的流体反应室，所述流体反应室还包括设置在所述流体反应室内的流体，所述流体溶液包含DNA聚合酶、dNTP、以及PCR缓冲液。

36.一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：

(a)提供根据权利要求16所述的流体反应室，其中所述流体反应室与第一热源和第二热源可操作的关联，其中所述第一热源和第二热源能够向所述环形室施加不同的第一热度和第二热度，其中所述第一热度和第二热度不相同；

(b)将包含靶核酸序列、DNA聚合酶、dNTP和聚合酶链反应(PCR)缓冲液的流体引入所述流体反应室中；以及

(c)将第一热度和第二热度施加于所述流体反应室。

37.根据权利要求36所述的方法，所述方法还包括检测所述靶核酸的扩增。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

39.根据权利要求36所述的方法，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

41.根据权利要求37所述的方法，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

42.根据权利要求36至40所述的方法，其中所述第一寡核苷酸中的每者包含荧光部分。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述第二寡核苷酸中的所述每者包含荧光淬灭剂部分。

44.根据权利要求42至43所述的方法，其中所述空间离散区域中的每者还包含含有第四DNA序列和第五DNA序列的第三寡核苷酸，其中所述第四DNA序列与所述第三DNA序列互补。

45.根据权利要求43所述的方法，其中所述第三寡核苷酸各自包含荧光淬灭剂部分。

46.根据权利要求36所述的方法，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

47.根据权利要求36至45所述的方法，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

48.根据权利要求36至45所述的方法，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

50.根据权利要求44所述的方法，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

51.根据权利要求36至120所述的方法，其中所述流体还包含非特异性核酸染色染料。

52.根据权利要求36至51所述的方法，其中所述流体反应室为圆形、椭圆形、正方形、三角形、矩形、六边形、八边形、菱形或梯形。

53.根据权利要求36至52所述的方法，其中所述流体反应室不处于均匀的温度，并且其中所述反应室的最温暖的区域比所述反应室的最冷区域高至少10℃。

54.根据权利要求36至53所述的方法，其中所述反应室的所述最冷区域介于约50℃和约75℃之间。

55.根据权利要求36至54所述的方法，其中所述反应室的最热区域介于约80℃和约100℃之间。

56.一种装置，所述装置包括第一表面区域和第二表面区域，

所述第一表面区域包含：

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含第一DNA序列以及使所述第一寡核苷酸与所述第一表面区域不可逆地连接的连接部分，以及

第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含第二DNA序列和第三DNA序列，其中所述第二序列与所述第一序列互补，并且

所述第二表面区域包含：

第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含第四DNA序列以及使所述第三寡核苷酸与所述第二表面区域不可逆地连接的连接部分，并且

其中所述第四序列与所述第二序列、所述第三序列、或所述第二序列的至少六个连续核苷酸与所述第三序列的六个连续核苷酸的组合互补。

57.一种装置，所述装置包括第一表面区域和第二表面区域，

所述第一表面区域包含：

所述第二表面区域包含：

第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸包含第四DNA序列以及使所述第三寡核苷酸与所述第二表面区域不可逆地连接的连接部分，以及

第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸包含第五DNA序列和第六DNA序列，其中所述第五序列与所述第四序列互补，并且

其中所述第二序列与所述第五序列互补或与所述第六序列互补。

58.根据权利要求56至57所述的装置，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光部分。

59.根据权利要求56至57所述的装置，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光淬灭剂。

60.根据权利要求56至59所述的装置，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

61.根据权利要求56至59所述的装置，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

62.根据权利要求60所述的装置，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

63.根据权利要求61所述的装置，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

64.根据权利要求56至57所述的装置，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

65.根据权利要求56至64所述的装置，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

66.根据权利要求56至65所述的装置，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

67.根据权利要求66所述的装置，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

68.根据权利要求56至67所述的装置，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

69.根据权利要求56至67所述的装置，其中所述第四DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

70.根据权利要求56至67所述的装置，其中所述第六DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

71.一种流体反应室，所述流体反应室包括：

第一表面，

材料，所述材料接触所述第一表面和所述第二表面并形成所述反应室的内边界，其中

(a)所述第一表面包含：

所述第二表面区域包含：

其中所述第四序列与所述第二序列、所述第三序列、或所述第二序列的至少六个连续核苷酸与所述第三序列的六个连续核苷酸的组合互补；或者

(b)所述第一表面区域包含：

所述第二表面区域包含：

72.根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光部分。

73.根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光淬灭剂。

74.根据权利要求71至73所述的流体反应室，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

75.根据权利要求71至73所述的流体反应室，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

76.根据权利要求74所述的流体反应室，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

77.根据权利要求75所述的流体反应室，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

78.根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

79.根据权利要求71至78所述的流体反应室，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

80.根据权利要求71至79所述的流体反应室，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

81.根据权利要求80所述的流体反应室，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

82.根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

83.根据权利要求80所述的流体反应室，其中所述第四DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

84.根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述第六DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

85.根据权利要求71至84所述的流体反应室，其中所述流体反应室为圆形、椭圆形、正方形、三角形、矩形、六边形、八边形、菱形或梯形。

86.根据权利要求71至85所述的流体反应室，其中所述流体反应室不处于均匀的温度，并且其中所述反应室的最温暖的区域比所述反应室的最冷区域高至少10℃。

87.根据权利要求71至86所述的流体反应室，其中所述反应室的所述最冷区域介于约10℃和约50℃之间。

88.根据权利要求71至87所述的流体反应室，其中所述反应室的最热区域介于约51℃和约100℃之间。

89.根据权利要求71至88所述的流体反应室，所述流体反应室还包括设置在所述流体反应室内的流体，所述流体包含一种或多种寡核苷酸和杂交缓冲液。

90.根据权利要求89所述的流体反应室，其中所述流体还包含非特异性核酸染色染料。

91.一种扩增靶核酸的方法，所述方法包括：

(a)提供根据权利要求71所述的流体反应室，其中所述流体反应室与第一热源和第二热源可操作的关联，其中所述第一热源和第二热源能够向所述环形室施加不同的第一热度和第二热度，其中所述第一热度和第二热度不相同；

(b)将包含靶核酸序列的流体引入所述流体反应室中；以及

(c)将第一热度和第二热度施加于所述流体反应室。

92.根据权利要求91所述的方法，所述方法检测所述靶核酸的扩增。

93.根据权利要求91至92所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光部分。

94.根据权利要求91至92所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含荧光淬灭剂。

95.根据权利要求91至94所述的方法，其中所述第二DNA序列中的每者是相同的。

96.根据权利要求91至94所述的方法，其中所述第二DNA序列中的每者是不相同的。

97.根据权利要求94所述的方法，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

98.根据权利要求95所述的方法，其中所述多个所述寡核苷酸复合物中的每者位于所述表面上的空间离散区域中。

99.根据权利要求91所述的方法，其中所述连接部分包含叠氮基团或包括位阻炔烃的炔烃基团。

100.根据权利要求91至99所述的方法，其中所述第一DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

101.根据权利要求91至100所述的方法，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述第三DNA序列中的每者具有介于约15个和约80个之间的核苷酸的长度。

103.根据权利要求91所述的方法，其中所述第五DNA序列中的每者具有介于约5个和约20个之间的核苷酸的长度。

104.根据权利要求101所述的方法，其中所述第四DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

105.根据权利要求91所述的方法，其中所述第六DNA序列中的每者具有介于约5个和约80个之间的核苷酸的长度。

106.根据权利要求91至105所述的方法，其中所述流体反应室为圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、六边形、八边形、菱形或梯形。

107.根据权利要求91至106所述的方法，其中所述流体反应室不处于均匀的温度，并且其中所述反应室的最温暖的区域比所述反应室的最冷区域高至少10℃。

108.根据权利要求91至107所述的方法，其中所述反应室的所述最冷区域介于约10℃和约50℃之间。

109.根据权利要求91至108所述的方法，其中所述反应室的最热区域介于约51℃和约100℃之间。

110.根据权利要求91至109所述的方法，其中所述流体还包含非特异性核酸染色染料。