ES2920954T3 - Detección de ácido nucleico en superficie con un dispositivo de flujo de convección de fluidos - Google Patents
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Abstract
La presente divulgación proporciona métodos, composición y dispositivos para realizar PCR basado en convección y amplificación no enzimática de secuencias de ácido nucleico. Las técnicas y reactivos empleados en estos métodos incluyen sondas de dedo del pie, reacciones de desplazamiento de la cadena, convección de rayleigh-benard, gradientes de temperatura, amplificación multiplexada, detección multiplexada y funcionalización de ADN, en sistemas abiertos y cerrados, para su uso en pruebas y ensayos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Detección de ácido nucleico en superficie con un dispositivo de flujo de convección de fluidos
Campo
La divulgación describe novedosos reactivos, instrumentos y métodos para la detección y la cuantificación de secuencias de ácidos nucleicos específicos para aplicaciones científicas de investigación y diagnóstico clínicos.
Antecedentes
La mayoría de los ensayos comerciales de ácidos nucleicos (AN) requieren el uso de enzimas para la amplificación molecular o de la señal. Se han optimizado enzimas tales como la polimerasa de ADN para que sean rápidas y específicas. La reconstitución de enzimas liofilizadas en unas condiciones con recursos limitados reduce la necesidad de una cadena de frío. Los ensayos isotérmicos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como NEAR, LAMP y NASBA, permiten realizar perfiles de ADN/ARN sin necesidad de complejos equipos con ciclos de temperatura. A pesar de estos numerosos avances, las tecnologías de detección de ácidos nucleicos existentes siguen enfrentándose a dificultades para la detección rápida de biomarcadores patógenos en el PoC (point of care, punto de atención), ya que es difícil diseñar/desarrollar enzimas que reúnan simultáneamente todas las propiedades deseables (por ejemplo, rapidez, alta fidelidad y robustez frente a los productos químicos/inhibidores).
Varias tecnologías de análisis de ácidos nucleicos existentes no contienen enzimas, incluyendo micromatrices, hibridación fluorescente in situ (FISH), dendrímeros de ADN ramificado (Panomics) y código de barras fluorescente (Nanostring). En estas estrategias, las moléculas objetivo de ADN o de ARN reclutan estequiométricamente, o se convierten en, un número limitado de grupos fluorescentes. A diferencia de la PCR, donde se amplifica una única molécula de ácido nucleico sin cesar para producir un número arbitrariamente elevado de moléculas de amplicón. Por consiguiente, para estos enfoques se necesitan equipos caros y voluminosos que permitan alcanzar la sensibilidad molecular necesaria para detectar y analizar las pequeñas cantidades de ADN o ARN objetivo presentes en las muestras biológicas, restringiendo su uso para aplicaciones de PoC y en unas condiciones con recursos limitados.
Otro grupo de técnicas de identificación de ácidos nucleicos emplea enfoques de amplificación de ADN sin enzimas en solución. Aquí, una molécula objetivo de ADN monocatenario puede liberar catalíticamente oligonucleótidos de ADN con una secuencia idéntica al objetivo a partir de complejos de detección de ADN preensamblados de forma ilimitada. Todavía no se han demostrado los límites de detección clínicamente relevantes para esta familia de enfoques. En estos sistemas, hay una amplificación falsa positiva debido a los eventos de "respiración" del ADN que dan como resultado la liberación de moléculas de amplicón en ausencia de detección de una secuencia objetivo.
Sumario
Por lo tanto, de acuerdo con la presente divulgación, se proporciona un dispositivo que no está reivindicado, que comprende una superficie que tiene una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos comprenden, cada uno:
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la superficie, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera secuencia de ADN e hibrida con la misma, en donde dicho segundo oligonucleótido de ADN no comprende un resto fluorescente y no está unido irreversiblemente a la superficie.
Cada una de dichas segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. La pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos puede estar situada en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. Los primeros oligonucleótidos pueden comprender un resto fluorescente, y cada uno de dichos segundos oligonucleótidos puede comprender un inactivador de la fluorescencia. Cada una de dichas regiones separadas espacialmente puede comprender además un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y una quinta secuencia de ADN, en donde la cuarta secuencia de ADN es complementaria de la tercera secuencia de ADN. Cada uno de los terceros oligonucleótidos puede comprender un resto inactivador de la fluorescencia. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida.
Cada una de las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos, o una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada una de las cuartas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos.
En otra realización, se proporciona una cámara de reacción de fluidos que comprende:
una primera superficie,
una segunda superficie que no está en contacto con la primera superficie, en donde dicha primera y segunda superficie están enfrentadas entre sí,
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite exterior de dicha cámara de reacción, y
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite interior de dicha cámara de reacción,
en donde la primera superficie comprende una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos comprenden, cada uno:
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la superficie, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera secuencia de ADN e hibrida con la misma, en donde dicho segundo oligonucleótido de ADN no está unido irreversiblemente a la primera superficie, y opcionalmente no comprende un resto fluorescente.
Cada una de dichas segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. Cada uno de dicha pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos puede estar situado en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. Cada uno de dichos primeros oligonucleótidos puede comprender un resto fluorescente. Cada uno de dichos segundos oligonucleótidos puede comprender un resto inactivador de la fluorescencia. Cada una de dichas regiones separadas espacialmente puede comprender además un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y una quinta secuencia de ADN, en donde la cuarta secuencia de ADN es complementaria de la tercera secuencia de ADN. Cada uno de los terceros oligonucleótidos puede comprender un resto inactivador de la fluorescencia. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida. La cámara de reacción de fluidos puede tener un primer puerto para suministrar la muestra, y opcionalmente otro puerto para permitir la salida de aire/fluido cuando se introduce la muestra en el primer puerto.
Cada una de las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada una de las cuartas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Los materiales que están en contacto con la primera y la segunda superficie que forman los límites interior y exterior de la cámara pueden tener un espesor de entre 40 micrómetros (40 pm) y 2 milímetros (2 mm).
La cámara de reacción de fluidos puede ser circular, ovalada, cuadrada, rectangular, triangular, hexagonal, octogonal, romboide o trapezoidal, o anular, como se define en el presente documento. La cámara de reacción de fluidos puede no estar a una temperatura uniforme, y la región más caliente de la cámara de reacción puede estar al menos a 10 °C más que la región más fría de la cámara de reacción. La región más fría de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 75 °C. La región más caliente de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 100 °C. La cámara de reacción de fluidos puede comprender además un fluido dispuesto dentro de la cámara de reacción de fluidos, comprendiendo dicha solución de fluidos una polimerasa de ADN, dNTP y tampón de PCR.
En otra realización más, se proporciona un método de amplificación de un ácido nucleico objetivo que comprende (a) proporcionar una cámara de reacción de fluidos de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha cámara de reacción de fluidos está en relación operativa con una primera y una segunda fuente de calor, en donde dicha primera y segunda fuente de calor son capaces de aplicar diferentes primer y segundo nivel de calor a dicha cámara anular, en donde dicho primer y segundo nivel de calor no son iguales; (b) introducir en dicha cámara de reacción de fluidos un fluido que comprenda una secuencia de ácido nucleico objetivo, una polimerasa de ADN, dNTP y un tampón para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y (c) aplicar un primer y un segundo nivel de calor a dicha cámara de reacción de fluidos. El método puede comprender además detectar la amplificación de dicho ácido nucleico objetivo.
Cada una de dichas segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. La pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos puede estar situada en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. Cada uno de dichos primeros oligonucleótidos puede comprender un resto fluorescente, y cada uno de dichos segundos oligonucleótidos puede comprender un resto inactivador de la fluorescencia. Cada una de dichas regiones
separadas espacialmente puede comprender además un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y una quinta secuencia de ADN, en donde la cuarta secuencia de a Dn es complementaria de la tercera secuencia de ADN. Cada uno de los terceros oligonucleótidos puede comprender un resto inactivador de la fluorescencia. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida.
Las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN tiene una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. La cámara de reacción de fluidos puede ser circular, ovalada, cuadrada, triangular, rectangular, hexagonal, octogonal, romboide o trapezoidal.
La cámara de reacción de fluidos puede no estar a una temperatura uniforme, y la región más caliente de la cámara de reacción puede estar al menos a 10 °C más que la región más fría de la cámara de reacción. La región más fría de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 75 °C. La región más caliente de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 100 °C.
En otra realización adicional más, se proporciona un dispositivo que no está reivindicado, que comprende una primera región superficial y una segunda región superficial,
comprendiendo la primera región superficial
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de a Dn y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera, y
comprendiendo la segunda región superficial
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
en donde la cuarta secuencia es complementaria de la segunda secuencia, la tercera secuencia, o una combinación de al menos seis nucleótidos continuos de la segunda secuencia y seis nucleótidos continuos de la tercera secuencia, o un dispositivo que comprende una primera región superficial y una segunda región superficial, comprendiendo la primera región superficial
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de a Dn y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera, y
comprendiendo la segunda región superficial
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
un cuarto oligonucleótido que comprende una quinta secuencia de ADN y una sexta secuencia de ADN, en donde la quinta secuencia es complementaria de la cuarta secuencia, y
en donde la segunda secuencia es complementaria de la quinta secuencia o es complementaria de la sexta secuencia.
El primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un resto fluorescente, y el primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un inactivador de la fluorescencia. Las segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. La pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos puede estar situada en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida. La cámara de reacción de fluidos puede tener un primer puerto para suministrar la muestra, y opcionalmente otro puerto para permitir la salida de aire/fluido cuando se introduce la muestra en el primer puerto.
Cada una de las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada una de las cuartas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las sextas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre 5 y 80 nucleótidos.
En una realización adicional más, se proporciona una cámara de reacción de fluidos que comprende: una primera superficie,
una segunda superficie que no está en contacto con la primera superficie, en donde dicha primera y segunda superficie están enfrentadas entre sí,
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite exterior de dicha cámara de reacción, y
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite interior de dicha cámara de reacción, en donde
(a) la superficie comprende
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera, y
la segunda región superficial comprende
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
en donde la cuarta secuencia es complementaria de la segunda secuencia, la tercera secuencia, o una combinación de al menos seis nucleótidos continuos de la segunda secuencia y seis nucleótidos continuos de la tercera secuencia; o
(b) la primera región superficial comprende
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera, y
la segunda región superficial comprende
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
un cuarto oligonucleótido que comprende una quinta secuencia de ADN y una sexta secuencia de ADN, en donde la quinta secuencia es complementaria de la cuarta secuencia, y
en donde la segunda secuencia es complementaria de la quinta secuencia o es complementaria de la sexta secuencia.
El primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un resto fluorescente, y el primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un inactivador de la fluorescencia. Cada una de dichas segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. Cada uno de dicha pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos puede estar situado en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida. La cámara de reacción de fluidos puede tener un primer puerto para suministrar la muestra, y opcionalmente otro puerto para permitir la salida de aire/fluido cuando se introduce la muestra en el primer puerto.
Cada una de las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada una de las cuartas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las sextas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos.
La cámara de reacción de fluidos puede ser circular, ovalada, cuadrada, triangular, rectangular, hexagonal, octogonal,
romboide o trapezoidal, o anular, como se define en el presente documento. La cámara de reacción de fluidos puede no estar a una temperatura uniforme, y la región más caliente de la cámara de reacción puede estar al menos a 10 °C más que la región más fría de la cámara de reacción. La región más fría de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 50 °C. La región más caliente de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 51 °C y aproximadamente 100 °C. La cámara de reacción de fluidos puede comprender además un fluido dispuesto dentro de la cámara de reacción de fluidos, comprendiendo dicho fluido uno o más oligonucleótidos y un tampón de hibridación, y el fluido puede comprender además un colorante no específico para la tinción de ácidos nucleicos.
Una realización adicional más comprende un método de amplificación de un ácido nucleico objetivo que comprende (a) proporcionar una cámara de reacción de fluidos de acuerdo con la reivindicación 1 adjunta a continuación, en donde dicha cámara de reacción de fluidos está en relación operativa con una primera y una segunda fuente de calor, en donde dicha primera y segunda fuente de calor son capaces de aplicar diferentes primer y segundo nivel de calor a dicha cámara anular, en donde dicho primer y segundo nivel de calor no son iguales; (b) introducir en dicha cámara de reacción de fluidos un fluido que comprenda una secuencia de ácido nucleico objetivo; y (c) aplicar un primer y un segundo nivel de calor a dicha cámara de reacción de fluidos.
El método puede comprender además detectar la amplificación de dicho ácido nucleico objetivo. El primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un resto fluorescente, y el primer o el segundo oligonucleótido puede comprender un inactivador de la fluorescencia. Cada una de dichas segundas secuencias de ADN pueden ser idénticas o pueden no ser idénticas. Cada uno de dicha pluralidad de dichos complejos oligonucleotídicos está situado en regiones separadas espacialmente sobre dicha superficie. El resto de unión puede comprender un grupo alquino que incluya un alquino tensionado o un grupo azida.
Cada una de las primeras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las terceras secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las quintas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 nucleótidos. Cada una de las cuartas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos. Cada una de las sextas secuencias de ADN puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 80 nucleótidos.
La cámara de reacción de fluidos puede ser circular, ovalada, cuadrada, rectangular, triangular, hexagonal, octogonal, romboide o trapezoidal, o anular, como se define en el presente documento. La cámara de reacción de fluidos puede no estar a una temperatura uniforme, y la región más caliente de la cámara de reacción puede estar al menos a 10 °C más que la región más fría de la cámara de reacción. La región más fría de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 50 °C. La región más caliente de la cámara de reacción puede estar a entre aproximadamente 51 °C y aproximadamente 100 °C. El fluido comprende además un colorante no específico para la tinción de ácidos nucleicos.
Otra realización comprende un sistema que no está reivindicado, que comprende una cámara de reacción, que comprende
(a) una primera región y una segunda región, en donde un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos está funcionalizado con la primera región superficial, y un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos está funcionalizado con la segunda región superficial, y en donde la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos no son idénticas; (b) una solución tampón apta para la hibridación del ADN a una temperatura no uniforme, en donde la solución tampón entra en contacto con la primera región superficial y la segunda región superficial; (c) un tercer oligonucleótido que comprende una tercera secuencia de nucleótidos, en donde el tercer oligonucleótido está hibridado con el primer oligonucleótido; y (d) una primera zona de temperatura y una segunda zona de temperatura, en donde la primera zona de temperatura tiene una temperatura al menos 10 °C mayor que una temperatura de la segunda zona de temperatura.
La primera región superficial puede estar situada en una primera superficie y la segunda región superficial está situada en la primera superficie. La primera región superficial puede estar situada en una primera superficie y la segunda región superficial está situada en una segunda superficie, en donde la primera superficie y la segunda superficie son superficies diferentes. La primera secuencia de nucleótidos puede comprender una primera región de nucleótidos que no es complementaria de la tercera secuencia de nucleótidos. La tercera secuencia de nucleótidos puede comprender una segunda región de nucleótidos que no es complementaria de la primera secuencia de nucleótidos.
La solución tampón puede comprender al menos un 60 % en masa de agua y un catión a una concentración de al menos 1 mM. La longitud del primer oligonucleótido y la longitud del segundo oligonucleótido puede ser de entre 5 nucleótidos y 20000 nucleótidos. El primer oligonucleótido y la longitud del segundo nucleótido pueden ser de entre 5 nucleótidos y 200 nucleótidos. La longitud del tercer oligonucleótido puede ser de entre 5 nucleótidos y 20000
nucleótidos. El primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y el tercer oligonucleótido pueden ser idénticos o diferentes y pueden comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN, ARN, una análogo de nucleótido y cualquier combinación de los mismos.
El análogo de nucleótido puede seleccionarse del grupo que consiste en LNA, PNA, un morfolino-nucleótido y cualquier combinación de los mismos. Al menos uno del primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y el tercer oligonucleótido puede estar funcionalizado con un resto químico, en donde el resto químico permite la detección de oligonucleótidos. El resto químico puede seleccionarse del grupo que consiste en TAMRA, ROX, HEX, un fluoróforo orgánico, un punto cuántico, una nanopartícula, azul de metileno, una molécula electroquímicamente activa, y cualquier combinación de los mismos.
La solución de tampón puede comprender una molécula detectable, en donde la molécula detectable presenta una señal unitaria diferente cuando está unida de forma no irreversible a un oligonucleótido que cuando está libre en solución, tal como una molécula detectable seleccionada del grupo que consiste en un colorante SybrGreen, un colorante Syto y un colorante EvaGreen. La primera superficie y la segunda superficie pueden ser idénticas o seleccionadas diferentemente del grupo que consiste en vidrio, cuarzo, plástico, un polímero, metal, material compuesto y monocapas autoensambladas superficiales. El polímero puede ser PDMS.
La primera región superficial puede comprender una temperatura que está 10 °C por debajo de una temperatura máxima de la solución tampón, y en donde la segunda región superficial puede comprender una temperatura que está 10 °C por debajo de la temperatura máxima de la solución tampón. El sistema puede comprender además al menos un elemento de calentamiento/enfriamiento en contacto con la primera región superficial y la segunda región superficial. El al menos un elemento de calentamiento/enfriamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en una placa caliente, un ventilador de calentamiento, un calentador por IR y un baño de agua. La placa caliente puede seleccionarse del grupo que consiste en un calentador termorresistivo y un elemento Peltier. El sistema puede comprender además una enzima que modifique los ácidos nucleicos de una forma dirigida por molde, tal como cuando la enzima facilita la extensión dirigida por molde de un molde de ácido nucleico.
Un método de amplificación y detección sin enzimas de un objetivo de ácido nucleico, que comprende (a) poner en contacto una muestra con una composición en una cámara de reacción, en donde la composición comprende:
una solución tampón apta para la hibridación del ADN;
una primera región superficial y una segunda región superficial, en donde la solución tampón entra en contacto con la primera región superficial y la segunda región superficial;
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos, en donde el primer oligonucleótido está funcionalizado con la primera región superficial;
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos, en donde el segundo oligonucleótido está funcionalizado con la segunda región superficial; y
un tercer oligonucleótido que comprende una tercera secuencia de nucleótidos, en donde el tercer oligonucleótido está hibridado con el primer oligonucleótido,
en donde la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos no son idénticas, y en donde el tercer nucleótido comprende una primera región de nucleótidos que no es complementaria de la primera secuencia de nucleótidos;
(b) calentar diferencialmente una parte de la cámara de reacción, en donde una temperatura máxima de una región de la cámara es al menos 10 °C superior a una temperatura mínima de la cámara; y (c) detectar la potencial amplificación.
La cámara de reacción puede comprender al menos un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio, cuarzo, plástico, un polímero, metal y cualquier combinación de los mismos. El polímero puede ser PDMS. La temperatura máxima de una región de la cámara puede ser de entre 60 °C y 100 °C. La temperatura mínima de la cámara puede ser de entre 20 °C y 60 °C. La primera región superficial y la segunda región superficial pueden no estar calentadas dentro de 10 °C de la temperatura máxima de una región de la cámara.
La composición puede estar localizada en la cámara de reacción, y en donde la primera región superficial está situada en la primera superficie y la segunda región superficial está situada la primera superficie. La composición puede estar localizada en la cámara de reacción, en donde la primera región superficial puede estar situada en una primera superficie y la segunda región superficial puede estar situada en una segunda superficie, y en donde la primera superficie y la segunda superficie son superficies diferentes. La detección de la potencial amplificación puede comprender además la detección óptica de los cambios de fluorescencia a través de un dispositivo de detección seleccionado del grupo que consiste en un fotodiodo, un tubo fotomultiplicador, un microscopio de fluorescencia, una cámara CCD y cualquier otro dispositivo de detección óptica. La detección de la potencial amplificación puede comprender además la detección electroquímica a través de un potenciostato/galvanostato electroquímico. La detección de la potencial amplificación puede comprender, además, la medición de la masa de la primera región superficial mediante la técnica de microbalanza de cristal de cuarzo.
En una realización adicional más, se proporciona un método para la amplificación y la detección dependiente de
enzimas de un objetivo de ácido nucleico, que comprende (a) poner en contacto una muestra con una composición en una cámara de reacción, en donde la composición comprende:
una solución tampón apta para la hibridación del ADN;
una región superficial, en donde la solución tampón entra en contacto con la región superficial;
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos, en donde el primer oligonucleótido está funcionalizado con la región superficial;
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos; y una enzima que modifica los ácidos nucleicos de una forma dirigida por molde, en donde la segunda secuencia de nucleótidos comprende una región de nucleótidos que no es complementaria de la primera secuencia de nucleótidos;
(b) calentar diferencialmente una parte de la cámara de reacción, en donde una temperatura máxima de una región de la cámara es al menos 10 °C superior a una temperatura mínima de la cámara; y (c) detectar la potencial amplificación.
El primer oligonucleótido puede comprender una segunda región de nucleótidos que no es complementaria de la segunda secuencia de nucleótidos. La enzima puede seleccionarse del grupo que consiste en una polimerasa de ADN, una polimerasa de ARN, una transcriptasa inversa, una endonucleasa y una exonucleasa. La cámara de reacción puede comprender al menos un material seleccionado del grupo que consiste en vidrio, cuarzo, plástico, un polímero, metal y cualquier combinación de los mismos. El polímero puede ser PDMS.
La temperatura máxima de una región de la cámara puede ser de entre 80 °C y 100 °C. La temperatura mínima de la cámara puede ser de entre 20 °C y 80 °C. La región superficial no podrá calentarse dentro de 10 °C de la temperatura máxima de una región de la cámara. La detección de la potencial amplificación puede comprender además la detección óptica de los cambios de fluorescencia a través de un dispositivo de detección seleccionado del grupo que consiste en un fotodiodo, un tubo fotomultiplicador, un microscopio de fluorescencia, una cámara CCD y cualquier otro dispositivo de detección óptica. La detección de la potencial amplificación puede comprender además la detección electroquímica a través de un potenciostato/galvanostato electroquímico. La detección de la potencial amplificación puede comprender, además, la medición de la masa de la primera región superficial mediante la técnica de microbalanza de cristal de cuarzo.
En una realización de la presente divulgación, la funcionalización de los oligonucleótidos en la superficie puede realizarse mediante diversos métodos químicos y físicos que incluyen, pero no se limitan a, inmovilización covalente, interacción electrostática o inmovilización no covalente, tal como biotina-avidina (o sus análogos).
En una realización de la presente divulgación, la molécula objetivo de la detección puede ser ADN monocatenario, ADN bicatenario, ARN o sus mezclas.
En una realización de la presente divulgación, la detección de un amplicón y el seguimiento de la reacción se realiza mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a: fluorescencia (incluyendo resonancia de plasmones superficiales, SPR), absorbancia UV, detección electroquímica (incluyendo cambio de pH y transferencia de carga), microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)
En una realización de la presente divulgación, los enfoques propuestos pueden utilizarse para distinguir variantes de secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo variantes de un único nucleótido (SNV), que pueden ser indicativas de resistencia a fármacos o del pronóstico de la enfermedad.
En una realización de la presente divulgación, los enfoques propuestos pueden utilizarse para la cuantificación de una, varias o muchas moléculas objetivo en muestras biológicas específicas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "anular" puede utilizarse para hacer referencia a la forma de la cámara, como se ha analizado anteriormente, y puede tener su significado normal de redonda, ovalada o discoide. Sin embargo, en este contexto, anular también puede interpretarse como otras formas regulares o irregulares, siempre que la cámara constituya un circuito continuo sin principio ni final.
Como se utiliza en el presente documento, en la memoria descriptiva, "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más. Como se utiliza en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se utilizan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/a" pueden significar uno/a o más de uno/a.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y a "y/o". Como se utiliza en el presente documento, "otro/a" puede significar al menos un/a segundo/a o más.
A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente del dispositivo, del método que se está empleando para determinar el valor o que existe variación entre los sujetos de estudio. Dicha variación inherente puede ser una variación de ±10 % del valor declarado.
A lo largo de esta solicitud, el término "unión irreversible" se utiliza para indicar una interacción química que es estable en las circunstancias habituales de la aplicación prevista. La unión irreversible puede referirse, en algunas realizaciones, a la unión covalente, tal como mediante la química clic de azida-alquino, y en otras realizaciones, puede referirse a las interacciones biotina-avidina o a otras interacciones no covalentes de larga duración.
A lo largo de esta solicitud, la expresión "tampón de PCR" se utiliza para indicar una solución acuosa con una salinidad y composición química compatibles con la amplificación del ADN por una polimerasa de ADN a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El tampón puede utilizarse junto con la propia polimerasa de ADN, cebadores y/o dNTPS.
A lo largo de esta solicitud, el término "tampón de hibridación" se utiliza para indicar una solución acuosa con una salinidad y composición química compatibles con la hibridación del ADN y la formación de dúplex de ADN estables mediante oligonucleótidos de ADN complementarios. Todos los tampones de PCR pueden considerarse tampones de hibridación, pero no a la inversa.
Otros objetos, características y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, dado que serán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención para los expertos en la materia a partir de esta descripción detallada. El alcance de invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación. La divulgación puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos junto con la descripción detallada de realizaciones específicas presentada en el presente documento.
La figura 1 muestra un esquema de una realización del chip fluido montado verticalmente sobre calentadores a temperaturas diferenciales. El chip fluido comprende una cámara de reacción con una superficie para funcionalizar oligonucleótidos de ADN. En algunas realizaciones, este chip se utiliza para realizar la detección de ácidos nucleicos basada en una PCR en multiplex.
La figura 2 muestra una realización del sistema, en la que el chip fluido se monta verticalmente sobre los calentadores a temperaturas diferenciales. Una fuente luminosa montada horizontalmente excita los restos fluorescentes del a Dn funcionalizado en el chip; la señal de fluorescencia se cuantifica a través del detector mostrado.
La figura 3 muestra imágenes de cámara del chip fluido (izquierda), el chip montado sobre calentadores (centro) y el chip con cámaras de forma rectangular montadas sobre los calentadores (derecha).
La figura 4 muestra un ejemplo del enfoque químico para la funcionalización del portaobjetos de vidrio con un oligonucleótido de ADN para formar parte de la sonda de detección. El proceso es una reacción en dos etapas del vidrio activado por PDITC (p-fenilén diisotiocianato) con una azido-PEG-amina (11-azido-3,6,9-trioxaundecan-1-amina), seguido de una conjugación con un oligonucleótido funcionalizado con alquinos a través de una cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre que da como resultado la fijación del oligonucleótido a través de un conector de p Eg hidrófilo. La hidrofilia de la superficie funcionalizada impide la absorción inespecífica de los componentes de la reacción, tales como ADN objetivo, cebadores y enzimas. La reacción sin cobre de la superficie funcionalizada con azida con oligonucleótidos modificados con cicloalquinos tensionados también da como resultado una fijación covalente estable y muy específica de los oligonucleótidos a la superficie.
La Figura 5 muestra un ejemplo de la estructura de una sonda funcionalizada. El oligonucleótido funcionalizado con la superficie está marcado con un fluoróforo, y el oligonucleótido hibridado con la sonda funcionalizada con la superficie está marcado con un inactivador. Cuando un objetivo de detección desplaza el oligonucleótido marcado con inactivador de la superficie, aumenta la intensidad de la fluorescencia de la superficie. Los paneles inferiores muestran imágenes de microscopia de fluorescencia antes y después de la introducción del objetivo; el diámetro de la mancha aquí es de 1 mm. Los oligonucleótidos fueron los siguientes:
Alk-TMR-1 /5Hexynyl/tttt/i6-TAMN/tggatgctgaatacttgtgataataca (SEQ ID NO: 1)
32-RQ ccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcca/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO: 2)
54 tggatgctgaatacttgtgataatacacctctacgg (SEQ ID NO: 3)
La figura 6 muestra un esquema de la amplificación mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un molde de ADN genómico (ADNg) dentro del chip fluido cuando se aplica el flujo de convección; la secuencia (10) indica el cebador directo, y la secuencia (11) indica el cebador inverso. El amplicón bicatenario, que comprende los dominios 10-15-16-17 de la hebra directa y los dominios 11-12-13-14 de la hebra inversa, se desnaturaliza en la zona caliente a 95 °C y, a continuación, se transporta por convección a la zona a 60 °C, donde puede desplazar un oligonucleótido marcado con inactivador para generar un aumento de la fluorescencia en la mancha
correspondiente.
La figura 7 muestra los resultados de la amplificación por PCR dentro del chip de convección. El panel izquierdo muestra una electroforesis en gel de agarosa de los productos de la amplificación. El carril 1 muestra el producto de la amplificación de 10 ng de molde de ADNg NA18562 amplificado durante 30 minutos en el chip de convección. Las concentraciones de los cebadores son de 600 nM para el cebador directo y de 200 nM para los cebadores inversos. El carril 2 muestra un control negativo con cebadores, polimerasa, dNTP y mancha de la sonda, pero sin adición de ADNg. La escalera es una escalera de 50 pb (New England Biolabs) como referencia. El panel derecho muestra la evolución temporal de la fluorescencia de la intensidad de la mancha a través de una reacción de amplificación. Las sondas y los cebadores para este experimento se diseñaron para el objetivo rs7517833 (véase la figura 20).
La figura 8 muestra el flujo de convección en el chip fluido. El panel superior izquierdo muestra una imagen de fluorescencia de perlas de seguimiento fluorescentes en ausencia de un gradiente de temperatura a través del chip (60 °C para ambos calentadores). El panel superior derecho muestra una imagen de fluorescencia de un periodo (2 segundos) de las perlas de seguimiento de la fluorescencia cuando se aplica un gradiente de temperatura (95 °C para el calentador izquierdo y 60 °C para el calentador derecho). El panel inferior resume la velocidad media del flujo de convección observada tomando como base el espesor de la cámara.
La figura 9 muestra un esquema de una lectura basada en una matriz de múltiples amplicones dentro del chip fluido. El panel derecho muestra una imagen de fluorescencia del chip con 24 manchas impresas. Las manchas marcadas con M son manchas de control positivo que carecen de oligonucleótidos marcados con inactivador. Otras manchas son, cada una, específicas de una secuencia de amplicón en particular.
La figura 10 muestra imágenes de fluorescencia del área de la matriz de sondas del chip fluido antes y después de la PCR por convección. Se introdujeron cebadores que generan amplicones correspondientes a las sondas en las manchas 2, 3 y 4 (600 nM de cada cebador directo, 200 nM de cada cebador inverso), junto con 10 ng de molde de ADNg. La alta fluorescencia de la mancha 14 no es deliberada, y puede ser el resultado de moléculas de sonda de ADN mal funcionalizadas o hibridadas.
La figura 11 muestra la evolución temporal de la fluorescencia para la amplificación por PCR de 9-plex en el chip fluido de convección. La intensidad de fluorescencia de cada mancha se cuantificó individualmente y se normalizó tomando como base la fluorescencia de fondo y de la intensidad de fluorescencia de las manchas marcadoras M. Cada concentración de cebador directo es de 200 nM y cada concentración de cebador inverso es de 100 nM, y la adición de ADNg es de 10 ng.
La figura 12 muestra la amplificación por PCR de 3-plex en el chip fluido de convección correspondiente a los cebadores para ADN humano, de ratón y de rata. Aquí, todas las manchas de una fila tienen la misma identidad de secuencia y se refieren al mismo amplicón. La fila superior son sondas de control positivo. En la cámara de reacción había 600 nM de cada cebador directo, 200 nM de cada cebador inverso y 10 ng de molde de ADNg. Las secuencias utilizadas en el experimento fueron las siguientes:
Cebadores
h_ppia_fp gttaacagattggaggtagtagcatttt (SEQ ID NO: 4)
h_ppia_rp tctatcaccaccccccaact (SEQ ID NO: 5)
r_b2m_fp caggtattttggggtatgattatggtt (SEQ ID NO: 6)
r_b2m_rp ccaacagaatttaccaggaaacaca (SEQ ID NO: 7)
m_gadph_fp caatacggccaaatctgaaagacaa (SEQ ID NO: 8)
m_gadph_rp ctgcaggttctccacacctat (SEQ ID NO: 9)
Brazos
h_ppia_arm
agcagtgcttgctgttccttagaattttgccttgtgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (SEQ ID NO: 10) r_b2m_arm
ctggttcttactgcagggcgtgggaggagcgcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (SEQ ID NO: 11) m_gadph_arm
gatagcctggggctcactacagacccatgagggcgatgctgaatacttgtgataatacacctctacgggtcagg (SEQ ID NO: 12)
Inactivadores
h_ppia_q /5IAbRQ/acaaggcaaaattctaaggaacagcaagcactgctgcacgatcaggggt (SEQ ID NO: 13)
r_b2m_q /gctcctcccacgccctgcagtaagaaccagaccccagcctttacac (SEQ ID NO: 14)
m_gadph_q /5IAbRQ/cctcatgggtctgtagtgagccccaggctatctcatgttcttcagagtgga (SEQ ID NO: 15)
Anclaje
/DBCO/tttttcctgacccgtagaggtgtattatcacaagtattcagcatcgc/ATTO-550/ (SEQ ID NO: 16)
La figura 13A muestra un esquema de la cámara de reacción con dos regiones superficiales, cada una funcionalizado con diferentes reactivos oligonucleotídicos de ADN. Al contrario que en la figura 1, los reactivos oligonucleotídicos no son independientes en su secuencia, sino que están diseñados racionalmente para la amplificación sin enzimas. La figura 13B muestra dos posibles realizaciones de las dos regiones superficiales: que se encuentran bien en superficies diferentes o bien en la misma superficie pero situadas distalmente para evitar la interacción directa.
La figura 14A muestra el mecanismo de amplificación lineal de una secuencia de ácido nucleico objetivo portadora de una sexta secuencia (6) y una séptima secuencia (7). La secuencia de ácido nucleico objetivo transfiere catalíticamente múltiples oligonucleótidos portadores de la segunda secuencia (2) y la tercera secuencia (3) desde la región superficial 1 hasta la región superficial 2. La disociación espontánea de la molécula de ADN bicatenario (23:67) en la zona caliente es fundamental para permitir una renovación rápida. La figura 14B muestra la reacción neta del proceso descrito en la figura 14A, así como una estrategia de marcaje fluorescente para permitir la lectura en tiempo real. La figura 14C muestra una implementación alternativa con la orientación 5'/3' invertida (la media punta de flecha indica el extremo 3', como es costumbre en la bibliografía).
La figura 15 muestra el mecanismo de un experimento de control en el que la secuencia de ácido nucleico objetivo induce un reordenamiento estequiométrico de los oligonucleótidos unidos a la superficie.
La figura 16 muestra la evolución temporal de la fluorescencia de la región superficial 1 cuando se introducen varias concentraciones de ácido nucleico objetivo. La fluorescencia en el chip de amplificación lineal disminuye más rápidamente que en el chip de conversión estequiométrica, manteniendo el mecanismo de amplificación del ADN sin enzimas.
La figura 17 muestra el mecanismo de amplificación exponencial de una secuencia de ácido nucleico objetivo. La figura 18 muestra una representación visual de la amplificación indicadora sin enzimas mediante el uso de un colorante intercalado, tal como SybrGreen o EvaGreen. La intensidad de fluorescencia de la región superficial 1 disminuirá durante el curso de la reacción, y la intensidad de fluorescencia de la región superficial 2 aumentará. La figura 19 muestra una representación visual de la amplificación indicadora sin enzimas mediante el uso de oligonucleótidos funcionalizados con fluoróforos. La intensidad de fluorescencia de la región superficial 1 aumentará durante el curso de la reacción, y la intensidad de fluorescencia de la región superficial 2 permanecerá oscura durante el curso de la reacción.
La figura 20 muestra la lista de cebadores y sondas (anclaje+brazo+secuenciador) utilizados para la amplificación/detección por PCR.
Descripción detallada
Aquí, los inventores presentan dispositivos, sistemas que no están reivindicados, y métodos para el ensayo de amplificación del ADN. La divulgación emplea una separación en fase sólida de los reactivos para evitar acontecimientos moleculares imprevistos que den como resultado falsos positivos, y utiliza la circulación del flujo de convección para permitir la disociación espontánea de los amplicones bicatenarios. A continuación se describen tres tecnologías de la técnica relacionadas y sus limitaciones en comparación con la presente invención.
1. PCR en flujo de convección
Cuando se mantiene un líquido a una temperatura no uniforme y confinado en un volumen, circulará a través de un proceso conocido como flujo de convección de Rayleigh-Benard [1]. La convección de Rayleigh-Benard se ha utilizado en el diagnóstico molecular para generar dispositivos de bajo coste que proporcionen los ciclos de temperatura necesarios para la PCR (PCR en flujo de convección, cf-PCR) [2, Patente de EE.UU. 6.586.233 B2, Patente de EE.UU.
8.735.103 B2, Patente de EE.UU. 8.187.813 B2]. La cf-PCR requiere únicamente un gradiente de temperatura estático mantenido con un máximo de aproximadamente 95 °C y un mínimo de aproximadamente 60 °C (temperatura de hibridación/extensión), eliminando la necesidad de instrumentos de termociclado de alto consumo energético.
La cf-PCR se ha demostrado para la detección tanto en monoplex [3-5, Patente de EE.UU. 8.187.813 B2] como en multiplex de secuencias específicas de ADN [6]; el enfoque multiplex utilizó el criterio de valoración del análisis de los resultados electroforéticos. Dado que la cf-PCR carece de la uniformidad de temperatura de los ensayos de qPCR tradicionales, la cf-PCR tiene dificultades en las aplicaciones que requieren una alta selectividad de secuencia, tales como aplicaciones para la detección o la identificación de variantes de un solo nucleótido (SNV), por lo tanto, aún no se ha demostrado ninguna cf-PCR específica de SNV. La detección en tiempo real de la cf-PCR se ha demostrado únicamente en fase de solución empleando el método de detección con colorante fluorescente inespecífico (SYBR Green I) [7]. Este enfoque restringe el uso de la cf-PCR en entornos multiplex. Asimismo, la aplicación de métodos de detección en tiempo real específicos de secuencia, tales como la química de ensayo de la 5'-nucleasa o las sondas de hibridación, permitiría detectar no más de 5-6 objetivos simultáneamente debido al solapamiento espectral de los fluoróforos. La presente divulgación se diferencia de la cf-PCR en que la presente divulgación ofrece una lectura multiplexada resuelta espacialmente sin requerir una etapa en tubo abierto para el análisis posterior. Adicionalmente, en la realización sin enzimas de la divulgación, no se requiere ninguna enzima para la amplificación.
2. Micromatrices
La tecnología de micromatrices es una de las principales técnicas de cribado multiplexado de muestras biológicas. Se funcionalizan múltiples secuencias de sonda con una superficie, y se toma la señal fluorescente de una mancha en particular como la lectura cuantitativa de la secuencia correspondiente. La tecnología ha sido demostrada con éxito para la detección de diversos tipos de analitos biológicos tales como ADN, ARN, proteínas, carbohidratos y células [8 12]. La aplicación de la tecnología de micromatriz ha encontrado su mayor uso en el campo de las pruebas de ácidos nucleicos. La tecnología de micromatriz ha demostrado la aplicación de las micromatrices de AN para la hibridación del genoma completo, la secuenciación de novo, la resecuenciación, la genómica comparativa, la hibridación del transcriptoma o la identificación de variaciones de un solo nucleótido [13-15]. Todas las aplicaciones de AN mencionadas anteriormente requieren grandes cantidades de objetivos de A n para la hibridación, en consecuencia, los micromatrices suelen utilizarse como lectura final de los productos de la amplificación por PCR. Las lecturas de las micromatrices suelen ser lentas, requiriendo una hibridación hasta el día siguiente, y también corre el riesgo de contaminación de los amplicones debido al proceso en tubo abierto.
3. Sondas de punto de apoyo y amplificación sin enzimas
La reacción de desplazamiento de la hebra mediada por puntos de apoyo [19-21] es un proceso de hibridación competitiva que se produce en ausencia de enzimas, y es relevante para la presente divulgación. Utilizando el desplazamiento de la hebra mediado por puntos de apoyo, se ha demostrado la amplificación sin enzimas de secuencias de analitos de ADN y ARN en soluciones homogéneas [22-27] (Patente de EE.u U. 8.043810 B2, Patente de EE.UU. 8.110.353 B2). La realización de amplificación sin enzimas de la divulgación es diferente porque se utiliza el flujo de convección térmica para disociar espontáneamente los amplicones bicatenarios, y se utiliza la funcionalización con la superficie para secuestrar los reactivos que son reactivos entre sí para reducir los falsos positivos. El desplazamiento de la hebra mediado por puntos de apoyo se ha aplicado a oligonucleótidos de ADN funcionalizados con la superficie (Patente de EE.UU. 8.630.809 B2) para la conversión estequiométrica de secuencias de analitos objetivo en otras secuencias. La presente divulgación difiere en que proporciona la amplificación del objetivo de la detección.
4. Tecnología de los solicitantes
Esta divulgación describe reactivos y dispositivos para la amplificación y detección de secuencias objetivo de ácidos nucleicos específicos. La divulgación utiliza una funcionalización en fase sólida y el secuestro de reactivos oligonucleotídicos, para evitar acontecimientos moleculares imprevistos que den como resultado falsos positivos, y la aplicación del flujo de convección térmica de Rayleigh-Benard para regenerar el objetivo y facilitar la cinética de hibridación en superficie del ADN (mezcla más eficiente de la mezcla de reacción). El régimen del flujo de convección de Rayleigh-Benard puede llevarse a cabo colocando una cámara de reacción, que consiste en dos portaobjetos de vidrio blanco de 1 mm de espesor separados por cinta adhesiva de doble cara como separador con un espesor de 250 |jm, entre dos placas calientes con control diferencial (figuras 1-3) inclinadas en el ángulo definido. La forma del separador determina la forma de la cámara de reacción y puede modificarse para alterar la velocidad y la trayectoria del flujo de convección. Se ha seleccionado el vidrio como material del chip porque el vidrio facilita el mantenimiento de un gradiente de temperatura uniforme a través de la cámara y permite la funcionalización de la superficie con oligonucleótidos sintéticos.
Las placas calientes se ajustan para mantener dos temperaturas diferentes (calentador frío y calentador caliente, respectivamente), que provocan un gradiente de temperatura a través de la cámara de reacción llena de una mezcla de reacción líquida. El líquido que está cerca de la parte caliente de la cámara tiene una temperatura más alta y, por lo tanto, es menos denso que el líquido que está en la parte de la cámara con menor temperatura. Dicha distribución de las densidades de los líquidos en el volumen confinado da como resultado una diferencia entre las fuerzas de flotación y de gravedad (cerca de los calentadores caliente y frío, respectivamente) que, a su vez, da como resultado la organización de un flujo de convección circular en estado estacionario.
Todas las moléculas disueltas en el líquido participan en la circulación entre las zonas de temperatura al ser arrastradas por el flujo de convección. Al desplazarse por las zonas de temperatura, las moléculas experimentan variaciones periódicas de temperatura. Por ejemplo, una molécula de ADN bicatenario colocada en el flujo de convección circular experimenta múltiples ciclos de calentamiento y enfriamiento. Si la temperatura de la solución en la zona caliente es suficiente para fundir el dúplex de ADN y la temperatura de la zona fría es favorable para mantener los ácidos nucleicos dados en una forma bicatenaria, entonces la circulación de los ácidos nucleicos en este flujo de convección da como resultado ciclos repetibles de desnaturalización e hibridación. La observación de los múltiples ciclos de desnaturalización e hibridación del ADNbc puede realizarse mediante diversos métodos, por ejemplo, mediante microscopia fluorescente, registrando la intensidad de los colorantes de tinción de ADN no específicos colocados en la mezcla de reacción junto con la muestra de ADN.
Un prototipo de instrumento de calentamiento consiste en dos calentadores resistivos de lámina de Kapton pegados a las placas de aluminio, y puede utilizarse simultáneamente para proporcionar un calentamiento diferencial para hasta
cinco chips fluidos. Dos fuentes de alimentación de baja potencia alimentan los calentadores. El sistema de amplificación propuesto es tolerante a las imprecisiones de temperatura del elemento calefactor en un intervalo de ±2 °C, y no requiere un equipo informático preciso.
5. Realización de amplificación lineal sin enzimas
La presente divulgación representa una amplificación sin enzimas del ácido nucleico objetivo, en la que la concentración de amplicones aumenta linealmente con el tiempo (figura 14A). Dos regiones superficiales están funcionalizadas irreversiblemente con dos oligonucleótidos de ADN, el donante, D (que comprende el dominio 1) y el aceptor, A (que comprende los dominios 4-5). El oligonucleótido donante funcionalizado con la región superficial 1 hibrida inicialmente con una hebra de señal S que comprende los dominios 2-3, que son complementarios de los dominios 4-5, de tal forma que el dominio monocatenario 2 queda expuesto a la solución y desempeña el papel de secuencia de punto de apoyo. La hebra aceptora está funcionalizada irreversiblemente con la región superficial 2 y representa inicialmente un oligonucleótido monocatenario. Las regiones superficiales 1 y 2 están situadas en la zona de temperatura mantenida a 35 °C (zona a 35 °C), en la que el dúplex D-S está diseñado para ser muy estable en la escala de tiempo de un ensayo de detección. La molécula objetivo T (que comprende los dominios 6-7) se introduce en la solución de reacción y será transferida por flujo de convección a la zona a 35 °C de la cámara de reacción. El objetivo T se une a la señal S a través del dominio 7 (el dominio de "punto de apoyo") y desplaza el dominio 3 de la superficie a la solución a través del mecanismo de desplazamiento de la hebra mediado por el punto de apoyo. A continuación, el flujo de convección de Rayleigh-Bernard lleva el dúplex a una zona caliente de la cámara (mantenida a 85 °C), donde el dúplex se disocia. Las dos moléculas monocatenarias, la hebra objetivo T y la hebra de señal S se transfieren de nuevo, a continuación, a la zona a 35 °C de la cámara, donde la hebra S se une al oligonucleótido aceptor A funcionalizado con la región superficial 2. Al mismo tiempo, permite que el objetivo monocatenario T desplace catalíticamente otra molécula de señal S de la región superficial 1, completando el ciclo catalítico. Este desencadenante debe proceder de forma continua hasta que las moléculas de señal S se transfieran completamente de la región superficial 1 a la región superficial 2.
El esquema de amplificación lineal demuestra las ventajas de utilizar simultáneamente el secuestro en fase sólida de reactivos oligonucleotídicos y el flujo de convección impulsado por la temperatura. La inmovilización de los reactivos oligonucleotídicos en las diferentes regiones superficiales permite evitar la liberación de moléculas de falsa señal positiva (falsa amplificación) en ausencia de la secuencia objetivo, mientras que el flujo de convección térmica, junto con el transporte espontáneo y la mejora de la transferencia de masa, induce la regeneración del objetivo a través de la fusión del complejo objetivo-señal (T-S). En cambio, la modificación de la temperatura de toda la solución no es deseable porque provocaría la disociación espontánea de todos los oligonucleótidos de la superficie.
El marcaje de la hebra de señal S con un colorante fluorescente representa un enfoque para el seguimiento en tiempo real del proceso de amplificación lineal. Una disminución de la intensidad de la fluorescencia registrada desde la región superficial 1, así como un aumento de la intensidad de la fluorescencia registrada desde la región superficial 2, pueden reflejar eficazmente cómo evoluciona la reacción de amplificación.
6. Realización de la detección estequiométrica
Para demostrar que el método de amplificación sin enzimas presenta una renovación múltiple, los inventores construyeron el correspondiente sistema de detección estequiométrico utilizando el dispositivo de convección (figura 15). El sistema estequiométrico también incluye dos regiones superficiales funcionalizadas con un donante, la hebra Ds, que comprende los dominios 11-12, y una hebra aceptora As, que comprende el dominio 16. La hebra Ds hibrida con un complejo de señal que consiste en un oligonucleótido de puente Bs, que comprende los dominios 14-15, y un oligonucleótido de señal Ss que comprende el dominio 13. El dominio 14 de la hebra Bs y la hebra As poseen una secuencia idéntica. La molécula objetivo T, que comprende los dominios 17-18 introducidos en la reacción, se une al dominio de punto de apoyo 11 del donante Ds y, a continuación, desplaza el complejo de señal a la solución. Durante este proceso, el objetivo T se une al donante Ds y no puede regenerarse en la zona caliente de la cámara para desencadenar la liberación de otro complejo de señal desde la región superficial 1. El complejo de señal desplazado es transferido por el flujo de convección a la zona a 85 °C, donde se disocia. Después de la disociación, la molécula de señal Ss es transferida de nuevo a la zona a 35 °C y es capturada por el oligonucleótido aceptor As funcionalizado con la región superficial 2. Por lo tanto, la cantidad de hebra de señal capturada Ss es igual a la cantidad de objetivo T introducido en el sistema.
La observación en tiempo real del sistema de detección estequiométrico también puede realizarse mediante el simple marcaje de la hebra de señal Ss con un colorante fluorescente y el registro del cambio en la intensidad de fluorescencia de la región superficial 2. La figura 16 muestra la disminución de la fluorescencia con el tiempo en la región superficial 1 para los sistemas de amplificación lineal y de detección estequiométrica, con unas cantidades iniciales idénticas de objetivo de detección. La disminución de la señal fluorescente es más rápida en el sistema de amplificación lineal que en el ensayo de amplificación lineal, lo que respalda el mecanismo diseñado en el que cada molécula objetivo está transfiriendo catalíticamente múltiples moléculas de señal de la superficie 1 a la superficie 2.
7. Realización de amplificación exponencial sin enzimas
La figura 17 muestra una realización de la presente divulgación en la que el objetivo de detección desencadena la liberación de un producto amplicón cuya concentración aumenta exponencialmente con el tiempo, hasta que se consumen los reactivos (figura 17). En este sistema, las dos regiones superficiales están funcionalizadas con complejos oligonucleotídicos parcialmente bicatenarios: la región superficial 1 tiene un complejo que consiste en un oligonucleótido de dominio único 1 fijado irreversiblemente a la superficie e hibridado con un oligonucleótido S1 que comprende los dominios 3-2 de tal forma que el dominio 3 permanece monocatenario y actúa como secuencia de punto de apoyo. La región superficial 2 es un espejo de la región superficial 1 y tiene una arquitectura similar de un reactivo oligonucleotídico funcionalizado con la superficie: un oligonucleótido que comprende el dominio 4 está funcionalizado irreversiblemente con la superficie, e hibrida con un oligonucleótido S2 que comprende los dominios 6 5, en donde el dominio 6 representa un punto de apoyo monocatenario. La inyección de la hebra objetivo T, que comprende los dominios 7 y 8 (con una secuencia idéntica a los dominios 6 y 5, respectivamente), en la mezcla de reacción da como resultado la liberación del oligonucleótido S1 de la región superficial 1 en forma de amplicón bicatenario.
El flujo de convección lleva el dúplex a la zona a 85 °C, donde el dúplex se funde. Ahora, dos oligonucleótidos monocatenarios, el objetivo inicial T y la hebra liberada S1, fluyen de vuelta a la zona a 35 °C, donde cada uno de ellos desencadena una nueva liberación de especies oligonucleotídicas desde la superficie. En particular, el oligonucleótido objetivo T libera catalíticamente la segunda hebra S1 desde la región superficial 1, mientras que la hebra S1 liberada inicialmente desencadena la liberación de la hebra S2 desde la segunda región superficial. Por lo tanto, al final de cada ciclo de flujo de convección se duplica la cantidad de especies oligonucleotídicas presentes en solución, lo que da como resultado una acumulación exponencial de las especies de amplicones en fase de solución.
8. Métodos de detección alternativos
La figura 14B presenta un posible mecanismo de detección para evaluar el progreso de la reacción. Son posibles enfoques de lectura alternativos que también utilizan la microscopia fluorescente. Para indicar la cantidad total de producto bicatenario acumulado pueden utilizarse tintes de tinción de ácidos nucleicos intercalados no específicos de secuencia, tales como los tintes SybrGreen y Syto (figura 18). Dado que la hebra aceptora A (dominios 4-5) inmovilizada sobre la región superficial 2 está en forma monocatenaria al comienzo de la reacción, el colorante intercalado tendría una baja afinidad por la hebra A . En el transcurso de la reacción, cada vez más hebras S (dominios 2-3) hibridarán con la hebra A funcionalizada con la superficie (dominios 4-5). Los complejos A-S recién formados se teñirían ahora eficazmente con el colorante, lo que provocaría un aumento de la fluorescencia de la región superficial 2. Potencialmente puede observarse la situación opuesta en la región superficial 1.
La aplicación de la técnica de detección basada en FRET se ilustra en el ejemplo de amplificación exponencial (figura 19). Por ejemplo, marcadas irreversiblemente con un colorante fluorescente, las hebras inmovilizadas en la superficie (se muestra el dominio 1 marcado) pueden ser inactivadas eficazmente con hebras de señal funcionalizadas con un inactivador (se muestra la hebra con los dominios 2-3 con un inactivador fluorescente) antes de añadir el objetivo. La adición del objetivo dará como resultado la liberación exponencial de las hebras de señal desde la superficie y la iluminación de las hebras inmovilizadas en la superficie.
9. Detección en tiempo real de la PCR en flujo de convección
Otra aplicación de la composición reivindicada en la presente divulgación es que la composición puede utilizarse como un medio eficaz para el seguimiento en tiempo real en superficie de un proceso de amplificación enzimática de ácidos nucleicos que se desarrolla en la solución. No hay ejemplos notificados de seguimiento en tiempo real de la PCR basada en la convección utilizando sondas funcionalizadas en la superficie.
La figura 6 muestra un enfoque que utiliza la composición reivindicada para el seguimiento en tiempo real de la reacción de PCR realizada en el flujo de convección impulsado por la temperatura. Inicialmente, se funcionaliza una región superficial 1 que está en la zona a 60 °C con un oligonucleótido de anclaje que comprende el dominio 1 y un colorante fluorescente. Se hibrida un oligonucleótido de brazo que comprende los dominios 3-2 con el oligonucleótido de anclaje a través de su dominio 2. El complejo oligonucleotídico de anclaje-brazo se hibrida a su vez con un oligonucleótido inactivador que comprende los dominios 4 y 5 y un inactivador fluorescente a través de su dominio 4; el dominio 5 es monocatenario. La solución de reacción comprende reactivos para la extensión enzimática de los cebadores oligonucleotídicos (dominios 10 y 11), tales como una polimerasa de a Dn , una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato, iones divalentes (Mg2+). Tras la inyección de una molécula objetivo (ADNg), se funde espontáneamente en la zona a 95 °C. A continuación, el ADNg fundido se transfiere a la zona a 60 °C mediante el flujo de convección, donde los cebadores hibridan con sus secuencias objetivo específicas y se extienden mediante la polimerasa de ADN, lo que da como resultado la formación de moléculas de amplicón bicatenarias que comprenden los dominios 10-15 16-17 en la hebra directa y 11-12-13-14 en la hebra inversa. Las moléculas del amplicón se funden en la zona a 95 °C y vuelven a la zona a 60 °C, donde la hebra directa 10-15-16-17 desplaza al oligonucleótido inactivador del complejo funcionalizado en la superficie anclaje-brazo, lo que da como resultado un aumento de la señal fluorescente registrada desde la región superficial 1.
10. Seguimiento simultáneo de múltiples secuencias objetivo
Las composiciones y los métodos propuestos en esta divulgación permiten el seguimiento simultáneo de la amplificación (ya sea sin enzimas o con enzimas) de múltiples secuencias objetivo de ácidos nucleicos. El patrón espacial de diferentes sondas oligonucleotídicas en diferentes regiones superficiales permite que una lectura basada en una matriz o en una cámara proporcione información independiente sobre las concentraciones de amplicones de cada reacción de amplificación objetivo.
11. Ejemplos de oligonucleótidos
Las siguientes secuencias de oligonucleótidos se proporcionan a modo de ejemplo, pero sin limitación:
Sistema de amplificación lineal de oligonucleótidos
1 /5Hexinil/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT (SEQ ID NO: 17)
2-3 /56-TAMN/TGGATGCTG-AATACTTGTGATAATACACCTCTACGG (SEQ ID NO: 18)
4-5 /5Hexinil/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA (SEQ ID NO: 19)
6-7 CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATT-CAGCATCCA (SEQ ID NO: 20)
Sistema de detección estequiométrica de oligonucleótidos
11-12 /5Hexinil/TTTTTTGTCAACC-ATCATCGTTCGTACCACAGTGTTCAG (SEQ ID NO: 21)
13 /56-TAMN/TGGATGCTGAATACTTGTGATAATACACCTCTACGG (SEQ ID NO: 22)
14-15 CCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCACTGAACACTGTGGTACGAACGATGA (SEQ ID NO: 23)
16 /5Hexinil/TTTTTCCGTAGAGGTGTATTATCACAAGTATTCAGCATCCA (SEQ ID NO: 24)
17-18 CTGAACACTGTGGTACGAACGATGAT-GGTTGACA (SEQ ID NO: 25)
12. Referencias
Las siguientes referencias proporcionan detalles procedimentales ilustrativos u otros detalles complementarios a los expuestos en el presente documento.
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Claims (13)
1. Una cámara de reacción de fluidos que comprende:
una primera superficie,
una segunda superficie que no está en contacto con la primera superficie, en donde dichas primera y segunda superficies están enfrentadas entre sí,
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite exterior de dicha cámara de reacción, y
un material que está en contacto con la primera superficie y la segunda superficie y que forma un límite interior de dicha cámara de reacción, en donde
(a) la primera superficie comprende una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos están situados en ubicaciones separadas espacialmente de la primera región superficial, y cada uno comprende:
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia de ADN es complementaria de la primera, y
la segunda región superficial comprende una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos están situados en ubicaciones separadas espacialmente de la segunda región superficial, y cada uno comprende:
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
en donde la cuarta secuencia es complementaria de la segunda secuencia, de la tercera secuencia o de una combinación de al menos seis nucleótidos continuos de la segunda secuencia y seis nucleótidos continuos de la tercera secuencia; o
(b) la primera región superficial comprende una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos están situados en ubicaciones separadas espacialmente de la primera región superficial, y cada uno comprende:
un primer oligonucleótido que comprende una primera secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el primer oligonucleótido a la primera región superficial, y
un segundo oligonucleótido que comprende una segunda secuencia de ADN y una tercera secuencia de ADN, en donde la segunda secuencia es complementaria de la primera, y
la segunda región superficial comprende una pluralidad de complejos oligonucleotídicos, en donde dichos complejos oligonucleotídicos están situados en ubicaciones separadas espacialmente de la segunda región superficial, y cada uno comprende:
un tercer oligonucleótido que comprende una cuarta secuencia de ADN y un resto de unión para unir irreversiblemente el tercer oligonucleótido a la segunda región superficial, y
un cuarto oligonucleótido que comprende una quinta secuencia de ADN y una sexta secuencia de ADN, en donde la quinta secuencia es complementaria de la cuarta secuencia, y
en donde la segunda secuencia es complementaria de la quinta secuencia o es complementaria de la sexta secuencia.
2. La cámara de reacción de fluidos de la reivindicación 1, en donde el primer o el segundo oligonucleótidos comprenden un resto fluorescente.
3. La cámara de reacción de fluidos de la reivindicación 1, en donde el primer o el segundo oligonucleótidos comprenden un inactivador de la fluorescencia.
4. La cámara de reacción de fluidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada una de dichas segundas secuencias de ADN son idénticas.
5. La cámara de reacción de fluidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada una de dichas segundas secuencias de ADN no son idénticas.
6. La cámara de reacción de fluidos de cualquier reivindicación anterior, en donde cada una de las primeras secuencias de ADN tiene una longitud de entre 15 y 80 nucleótidos y/o cada una de las terceras secuencias de ADN tiene una longitud de entre 5 y 80 nucleótidos y/o cada una de las quintas secuencias de ADN tiene una longitud de entre 5 y 20 nucleótidos y/o cada una de las cuartas secuencias de ADN tiene una longitud de entre 5 y 80 nucleótidos y/o cada una de las sextas secuencias de ADN tiene una longitud de entre 5 y 80 nucleótidos.
7. La cámara de reacción de fluidos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde cada uno del primer y del segundo oligonucleótidos tiene una longitud de entre 5 y 200 nucleótidos; y el tercer oligonucleótido tiene una longitud de entre 5 y 20000 nucleótidos.
8. La cámara de reacción de fluidos de cualquier reivindicación anterior, en donde los materiales que están en contacto con la primera y la segunda superficie y que forman los límites interior y exterior de la cámara tienen forma de círculo, ovalada, cuadrada, rectángulo, triángulo, hexágono, octágono, rombo o trapecio, y proporcionan una distancia entre dichas primera y segunda superficies de entre aproximadamente 40 micrómetros (40 pm) y aproximadamente 2 milímetros (2 mm).
9. La cámara de reacción de fluidos de cualquier reivindicación anterior, en donde la cámara de reacción de fluidos no está a una temperatura uniforme, y en donde la región más caliente de la cámara de reacción está a entre aproximadamente 51 °C y aproximadamente 100 °C, y la región más fría de la cámara de reacción está a entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 50 °C.
10. La cámara de reacción de fluidos de cualquier reivindicación anterior, que comprende además un fluido dispuesto dentro de la cámara de reacción de fluidos, comprendiendo dicho fluido uno o más oligonucleótidos, tampón de hibridación, y opcionalmente, no comprende tinte de tinción de ácidos nucleicos no específico.
11. Un método de amplificación de un de ácido nucleico objetivo que comprende:
(a) proporcionar una cámara de reacción de fluidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha cámara de reacción de fluidos está en relación operativa con una primera y una segunda fuente de calor, en donde dichas primera y segunda fuentes de calor son capaces de aplicar diferentes primer y segundo niveles de calor a dicha cámara anular, en donde dichos primer y segundo niveles de calor no son iguales; (b) introducir en dicha cámara de reacción de fluidos un fluido que comprenda una secuencia de ácido nucleico objetivo, en donde la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende:
(i) una sexta secuencia que es capaz de hibridar con la segunda secuencia del segundo oligonucleótido como se define en la reivindicación 1(a), y una séptima secuencia que es capaz de hibridar con la tercera secuencia del segundo oligonucleótido como se define en la reivindicación 1(a); o
(ii) una séptima secuencia que es capaz de hibridar con la segunda secuencia del segundo oligonucleótido como se define en la reivindicación 1(b), y una octava secuencia que es capaz de hibridar con la tercera secuencia del segundo oligonucleótido como se define en la reivindicación 1(b);
y
(c) aplicar un primer y un segundo nivel de calor en dicha cámara de reacción de fluidos para provocar un gradiente de temperatura a través de la cámara de reacción de fluidos, en donde el fluido circula por flujo de convección.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende además detectar la amplificación de dicho ácido nucleico objetivo.
13. El método de las reivindicaciones 11 o 12, en donde el fluido de la etapa b) comprende además un colorante no específico para la tinción de ácidos nucleicos.
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